CN1706966A - 人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于临床病原体DNA检测方法,检测对象为乳头瘤病毒(Papillomavirus),尤其是可以致癌的高危险型人乳头瘤病毒(HPV)。它包括如下步骤:①以简并引物对HPV目的基因扩增;②扩增产物DNA测序;③实时荧光定量PCR(Real-time PCR)病毒定量。本发明主要解决现有检测方法检测灵敏度低,无法对感染的HPV病毒亚型进行鉴别的技术问题,实现病毒的定量检测,并能对病毒的亚型进行定型。
Description
技术领域:
本发明属于临床病原体DNA检测方法,检测对象为乳头瘤病毒(Papillomavirus),尤其是可以致癌的高危险型人乳头瘤病毒(HPV)。
背景技术:
乳头瘤病毒(Papillomavirus):乳头瘤病毒是双股DNA小分子病毒,全长7KB左右,感染人类的主要是人乳头瘤病毒,分为皮肤型和粘膜型,后者感染生殖道是造成女性宫颈炎和男性前列腺炎的原因,并且证实高危型HPV持续感染是几乎所有宫颈癌和大部分前列腺癌的病因,同时越来越多的证据显示在口腔、食道癌中HPV也有致病作用。
致癌的高危险型人乳头瘤病毒(HPV):高危型HPV的分型依据来自多年的流行病学资料,那些最常见于宫颈癌标本中的HPV类型成为高危型。国际上规定和各种已知HPV的全基因组序列差异大于10%的HPV可以称为独立的新亚型。现在确定的10种高危型HPV是16、18、31、33、35、45、51、52、58、59,为妇科临床、病毒和遗传专家所公认。
现有的检测方法:
巴氏涂片:PAP SMEAR是一种常用的细胞学宫颈检查,能发现癌前的不典型细胞和宫颈癌细胞,是预防和早期发现宫颈癌的主要普查方式,缺点是不能检测HPV,只能等到HPV感染发展至癌前病变,此时已经太晚。
基于杂交的检测:具代表性的是HC方法。缺点是灵敏度低,对少于10+E4病毒无法检测。操作复杂,从DNA结合、洗脱到测定需要严格的反应条件和复杂的检测设备,干扰因素多,常常带有较强的背景干扰,目的DNA在测定过程中易降解和丢失。得出的结果数据不确切,只能判断种属差异,需DNA序列大于30%,无法精确了解核苷酸构成信息,缺乏分型能力。
PCR即聚合酶链式反应,由K.B.Mullis发明(美国专利4683202),可在短时间内使组织样本中含有的病毒DNA片段得到快速扩增。不过,常规的PCR技术由于产物检测技术和聚合酶热稳定性等因素的限制,对小于103拷贝数的HPV病原体难以发现。
实时荧光定量PCR(Real-time PCR),原理是将特殊的荧光标记的探针加入PCR体系中,探针5‘端标记发光基团,3’端标记淬灭基团,长度约20~30核苷酸探针。PCR过程中,探针结合在目的基因片段上。Taq酶延伸到该处时切下5端荧光基团,释放后基团一经激发,发出荧光,根据荧光强弱,测定实时DNA含量,进而计算原始DNA模板的含量。
DNA测序(DNA sequencing),即是对特定DNA序列进行测定的技术和过程。现代DNA测序都是通过自动化的DNA测序仪进行的。
发明内容:
本发明提供一种新的人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法,主要解决现有检测方法检测灵敏度低,无法对感染的HPV病毒亚型进行鉴别的技术问题,实现病毒的定量检测,并能对病毒的亚型进行定型
为解决上述技术问题,本发明是这样实现的:
一种人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法,其特征是包括如下步骤:
①以简并引物对HPV目的基因扩增;
②产物DNA测序;
③病毒的定量依靠实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。
该HPV简并引物包括:
①针对L1区的引物2对,
HPV-L1-F1:5’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’
HPV-L1-R1:5’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’
HPV-L1-F2:5’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’
HPV-L1-R2:5’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’
②针对E6E7区的引物(1对),
HPV-E6E7-F1:5’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’
HPV-E6E7-R1:5’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’
其中:
R=A,G W=A,T M=A,C Y=T,C K=G,T S=G,C
D=A,G,T H=A,C,T V=A,C,G B=C,G,T N=A,C,G,T。
在DNA测序结果的基础上,选择的荧光探针是:
针对HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探针,
HPV-L1-P1:5’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’
针对HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探针,
HPV-L1-P2:5’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’
荧光定量PCR的内参照基因选择GAPDH
(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
GAPDH引物探针,
Human GAPDH-F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’
human GAPDH-R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’
human GAPDH-P 5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’。
使用本发明检测HPV具有以下优点:
1.适用于各种亚型的HPV病毒检测,对较常见的病毒亚型2、6、7、10、11、16、18、27、28、30、31、32、33、34、35、40、42、45、51、52、58、59、61、66、69、84、90等均可检测,其检测范围超过目前的杂交捕获方法(检测范围为16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和68型)。
2.检测灵敏度高,对于50例随机临床样品的检测结果表明,使用本发明检测灵敏度为95.2%,明显高于传统的巴氏涂片76%的水平
3.可以检测出整合型病毒,专有的E6E7引物可以检测已有方法无法检测的整合到人基因组上的病毒。
4.可以对感染的HPV病毒亚型进行鉴别,准确判定感染的病毒亚型。已有方法均不能对此进行准确判定。这对于了解病人的病状及预后判断均有重要意义。
具体实施方式:
本发明综合利用简并引物PCR、实时荧光定量PCR和DNA测序技术,显著提高HPV检测的灵敏度和特异性,实现病毒的定量检测,并能对病毒的亚型进行定型,这对于HPV感染状态的临床诊断和研究工作都有显著意义。
1、以简并引物对HPV目的基因扩增。
HPV是有中-高度进化速率的DNA病毒,目前已有近100多种亚型。在以往的PCR检验中,对于这种高变异病毒,特异性引物设计常常是难题。单一引物往往不能在所有亚型中保持一致的结合效率,因此使部分类型HPV无法检出。
解决方法是针对HPV的保守区设计简并引物。
病毒学研究现将HPV分为五个超级组,A超级组为生殖道HPV,包含10个组型,A1~A10。每组内有感染途径和致病能力相似的若干种HPV,其中A7和A9中有致宫颈癌的高危险型HPV16、18、31、33、45、52,但其他组中也有致癌HPV种。区分HPV的标准对象通常是L1和E6、E7基因。前者是病毒的外壳蛋白,相对保守。后者E6、E7是原癌基因,保守性低,但对区分高危或低危病毒有意义。
分析HPV基因序列,得到理想引物3对(其中L1引物2对,E6E7引物1对):
HPV简并引物 | R=A,G W=A,T M=A,C Y=T,CK=G,T S=G,C D=A,G,T H=A,C,TV=A,C,G B=C,G,TN=A,C,G,T |
针对L1区的引物(2对) | |
HPV-L1-F1:5’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’HPV-L1-R1:5’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’HPV-L1-F2:5’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’HPV-L1-R2:5’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’ | |
针对E6E7区的引物(1对) | |
HPV-E6E7-F1:5’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’HPV-E6E7-R1:5’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’ |
样品来源为阴道组织样品,通过传统的酚氯仿方法制备基因组DNA,作为PCR反应模板。
每次检测用3对引物对待测样品分别扩增。
PCR体系(50ul):
10×Buffer 5u1
MgCl2(25mM) 4u1
dNTPs(10mM) 1ul
TAQ polymerase(5u/ul) 0.5ul
引物1(20mM) 0.5ul
引物2(20mM) 0.5ul
H2O 34.5ul
PCR循环条件
95℃9min;
95℃1min,55℃1min,72℃1min,35cycles.
PCR产物通过琼脂糖电泳分析检测。
2、DNA测序
从特异性PCR产物扩增条带中选出较清晰的DNA条带,通过DNA凝胶回收试剂盒纯化后进行DNA测序。
测序采用ABI Bigdye Terminator试剂盒(ver3.1)及ABI 377型自动测序仪。
L1区的产物测序结果可用于病毒分型,并确定用于病毒定量的探针。E6E7扩增产物的测序结果则主要用于分析HPV类型,区分宫颈癌的高危或低危型HPV。使用DNA序列同源比较软件,不仅能区分HPV所属亚型,而且对于未知类型的HPV,尚能进行病毒分类和种系发生分析。
3、病毒的定量依靠实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。
在测序结果的基础上,选择合适的引物和荧光探针,保证探针结合温度的一致可比性。
测定的标准曲线通过对标准摸板系列稀释品的Real-time PCR测定结果绘制。
Real-time PCR反应体系
加样体积:
模板 1ul
Buffer10× 5ul
Mgcl2(25mM) 5ul
dNTP 10mM 1ul
Primer F(20pmol/ul) 0.8ul
Primer R(20pmol/ul) 0.8ul
Probe(20pmol/ul) 0.4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
H2O to 50ul
反应条件:
94℃2分钟
(94℃10秒 53℃30秒 72℃40秒)45个循环
探针序列如下:
HPV L1区探针 | |
针对HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探针 | |
HPV-L1-P1:5’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’ | |
针对HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探针 | |
HPV-L1-P2:5’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’ |
荧光定量PCR的内参照基因选择GAPDH
(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
GAPDH引物探针 |
Human GAPDH-F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’human GAPDH-R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’human GAPDH-P 5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’ |
Claims (3)
1、一种人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法,其特征是包括如下步骤:
①以简并引物对HPV目的基因扩增;
②以DNA测序方法对HPV进行分型;
③荧光定量PCR(Real-time PCR)对病毒进行定量。
2、根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法,其特征是该HPV简并引物包括:
①针对L1区的引物2对,
HPV-L1-F1:5’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’
HPV-L1-R1:5’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’
HPV-L1-F2:5’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’
HPV-L1-R2:5’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’
②针对E6E7区的引物(1对),
HPV-E6E7-F1:5’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’
HPV-E6E7-R1:5’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’
其中:
R=A,G W=A,T M=A,C Y=T,C K=G,T S=G,C
D=A,G,T H=A,C,T V=A,C,G B=C,G,T N=A,C,G,T。
3、根据权利要求2所述的人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法,其特征是在DNA测序结果的基础上,选择的荧光探针是:
针对HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探针,
HPV-L1-P1:5’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’
针对HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探针,
HPV-L1-P2:5’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’
荧光定量PCR的内参照基因选择GAPDH
(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
GAPDH引物探针,
Human GAPDH-F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’
human GAPDH-R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’
human GAPDH-P 5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’。
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