CN1706966A - 人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于临床病原体DNA检测方法，检测对象为乳头瘤病毒(Papillomavirus)，尤其是可以致癌的高危险型人乳头瘤病毒(HPV)。它包括如下步骤：①以简并引物对HPV目的基因扩增；②扩增产物DNA测序；③实时荧光定量PCR(Real－time PCR)病毒定量。本发明主要解决现有检测方法检测灵敏度低，无法对感染的HPV病毒亚型进行鉴别的技术问题，实现病毒的定量检测，并能对病毒的亚型进行定型。

Description

人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法

技术领域：

本发明属于临床病原体DNA检测方法，检测对象为乳头瘤病毒(Papillomavirus)，尤其是可以致癌的高危险型人乳头瘤病毒(HPV)。

背景技术：

乳头瘤病毒(Papillomavirus)：乳头瘤病毒是双股DNA小分子病毒，全长7KB左右，感染人类的主要是人乳头瘤病毒，分为皮肤型和粘膜型，后者感染生殖道是造成女性宫颈炎和男性前列腺炎的原因，并且证实高危型HPV持续感染是几乎所有宫颈癌和大部分前列腺癌的病因，同时越来越多的证据显示在口腔、食道癌中HPV也有致病作用。

致癌的高危险型人乳头瘤病毒(HPV)：高危型HPV的分型依据来自多年的流行病学资料，那些最常见于宫颈癌标本中的HPV类型成为高危型。国际上规定和各种已知HPV的全基因组序列差异大于10％的HPV可以称为独立的新亚型。现在确定的10种高危型HPV是16、18、31、33、35、45、51、52、58、59，为妇科临床、病毒和遗传专家所公认。

现有的检测方法：

巴氏涂片：PAP SMEAR是一种常用的细胞学宫颈检查，能发现癌前的不典型细胞和宫颈癌细胞，是预防和早期发现宫颈癌的主要普查方式，缺点是不能检测HPV，只能等到HPV感染发展至癌前病变，此时已经太晚。

基于杂交的检测：具代表性的是HC方法。缺点是灵敏度低，对少于10+E4病毒无法检测。操作复杂，从DNA结合、洗脱到测定需要严格的反应条件和复杂的检测设备，干扰因素多，常常带有较强的背景干扰，目的DNA在测定过程中易降解和丢失。得出的结果数据不确切，只能判断种属差异，需DNA序列大于30％，无法精确了解核苷酸构成信息，缺乏分型能力。

PCR即聚合酶链式反应，由K.B.Mullis发明(美国专利4683202)，可在短时间内使组织样本中含有的病毒DNA片段得到快速扩增。不过，常规的PCR技术由于产物检测技术和聚合酶热稳定性等因素的限制，对小于103拷贝数的HPV病原体难以发现。

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)，原理是将特殊的荧光标记的探针加入PCR体系中，探针5‘端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，长度约20～30核苷酸探针。PCR过程中，探针结合在目的基因片段上。Taq酶延伸到该处时切下5端荧光基团，释放后基团一经激发，发出荧光，根据荧光强弱，测定实时DNA含量，进而计算原始DNA模板的含量。

DNA测序(DNA sequencing)，即是对特定DNA序列进行测定的技术和过程。现代DNA测序都是通过自动化的DNA测序仪进行的。

发明内容：

本发明提供一种新的人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法，主要解决现有检测方法检测灵敏度低，无法对感染的HPV病毒亚型进行鉴别的技术问题，实现病毒的定量检测，并能对病毒的亚型进行定型

为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

一种人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法，其特征是包括如下步骤：

①以简并引物对HPV目的基因扩增；

②产物DNA测序；

③病毒的定量依靠实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。

该HPV简并引物包括：

①针对L1区的引物2对，

HPV-L1-F1：5’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’

HPV-L1-R1：5’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’

HPV-L1-F2：5’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’

HPV-L1-R2：5’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’

②针对E6E7区的引物(1对)，

HPV-E6E7-F1：5’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’

HPV-E6E7-R1：5’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’

其中：

R＝A，G     W＝A，T     M＝A，C     Y＝T，C     K＝G，T      S＝G，C

D＝A，G，T  H＝A，C，T  V＝A，C，G  B＝C，G，T  N＝A，C，G，T。

在DNA测序结果的基础上，选择的荧光探针是：

针对HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探针，

HPV-L1-P1：5’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’

针对HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探针，

HPV-L1-P2：5’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’

荧光定量PCR的内参照基因选择GAPDH

(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

GAPDH引物探针，

Human GAPDH-F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’

human GAPDH-R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’

human GAPDH-P 5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’。

使用本发明检测HPV具有以下优点：

1.适用于各种亚型的HPV病毒检测，对较常见的病毒亚型2、6、7、10、11、16、18、27、28、30、31、32、33、34、35、40、42、45、51、52、58、59、61、66、69、84、90等均可检测，其检测范围超过目前的杂交捕获方法(检测范围为16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和68型)。

2.检测灵敏度高，对于50例随机临床样品的检测结果表明，使用本发明检测灵敏度为95.2％，明显高于传统的巴氏涂片76％的水平

3.可以检测出整合型病毒，专有的E6E7引物可以检测已有方法无法检测的整合到人基因组上的病毒。

4.可以对感染的HPV病毒亚型进行鉴别，准确判定感染的病毒亚型。已有方法均不能对此进行准确判定。这对于了解病人的病状及预后判断均有重要意义。

具体实施方式：

本发明综合利用简并引物PCR、实时荧光定量PCR和DNA测序技术，显著提高HPV检测的灵敏度和特异性，实现病毒的定量检测，并能对病毒的亚型进行定型，这对于HPV感染状态的临床诊断和研究工作都有显著意义。

1、以简并引物对HPV目的基因扩增。

HPV是有中-高度进化速率的DNA病毒，目前已有近100多种亚型。在以往的PCR检验中，对于这种高变异病毒，特异性引物设计常常是难题。单一引物往往不能在所有亚型中保持一致的结合效率，因此使部分类型HPV无法检出。

解决方法是针对HPV的保守区设计简并引物。

病毒学研究现将HPV分为五个超级组，A超级组为生殖道HPV，包含10个组型，A1～A10。每组内有感染途径和致病能力相似的若干种HPV，其中A7和A9中有致宫颈癌的高危险型HPV16、18、31、33、45、52，但其他组中也有致癌HPV种。区分HPV的标准对象通常是L1和E6、E7基因。前者是病毒的外壳蛋白，相对保守。后者E6、E7是原癌基因，保守性低，但对区分高危或低危病毒有意义。

分析HPV基因序列，得到理想引物3对(其中L1引物2对，E6E7引物1对)：

HPV简并引物	R＝A，G  W＝A，T  M＝A，C     Y＝T，CK＝G，T  S＝G，C  D＝A，G，T  H＝A，C，TV＝A，C，G  B＝C，G，TN＝A，C，G，T
		针对L1区的引物(2对)
HPV-L1-F1：5’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’HPV-L1-R1：5’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’HPV-L1-F2：5’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’HPV-L1-R2：5’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’
		针对E6E7区的引物(1对)
HPV-E6E7-F1：5’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’HPV-E6E7-R1：5’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’

样品来源为阴道组织样品，通过传统的酚氯仿方法制备基因组DNA，作为PCR反应模板。

每次检测用3对引物对待测样品分别扩增。

PCR体系(50ul)：

10×Buffer               5u1

MgCl2(25mM)              4u1

dNTPs(10mM)              1ul

TAQ polymerase(5u/ul)    0.5ul

引物1(20mM)              0.5ul

引物2(20mM)              0.5ul

H2O                      34.5ul

PCR循环条件

95℃9min；

95℃1min，55℃1min，72℃1min，35cycles.

PCR产物通过琼脂糖电泳分析检测。

2、DNA测序

从特异性PCR产物扩增条带中选出较清晰的DNA条带，通过DNA凝胶回收试剂盒纯化后进行DNA测序。

测序采用ABI Bigdye Terminator试剂盒(ver3.1)及ABI 377型自动测序仪。

L1区的产物测序结果可用于病毒分型，并确定用于病毒定量的探针。E6E7扩增产物的测序结果则主要用于分析HPV类型，区分宫颈癌的高危或低危型HPV。使用DNA序列同源比较软件，不仅能区分HPV所属亚型，而且对于未知类型的HPV，尚能进行病毒分类和种系发生分析。

3、病毒的定量依靠实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。

在测序结果的基础上，选择合适的引物和荧光探针，保证探针结合温度的一致可比性。

测定的标准曲线通过对标准摸板系列稀释品的Real-time PCR测定结果绘制。

Real-time PCR反应体系

加样体积：

模板                          1ul

Buffer10×                                         5ul

Mgcl2(25mM)                   5ul

dNTP 10mM                     1ul

Primer F(20pmol/ul)           0.8ul

Primer R(20pmol/ul)           0.8ul

Probe(20pmol/ul)              0.4ul

Taq酶(5U/ul)                  0.5ul

H2O                           to 50ul

反应条件：

94℃2分钟

(94℃10秒 53℃30秒 72℃40秒)45个循环

探针序列如下：

HPV L1区探针
		针对HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探针
HPV-L1-P1：5’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’
		针对HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探针
HPV-L1-P2：5’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’

荧光定量PCR的内参照基因选择GAPDH

(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

GAPDH引物探针
	Human GAPDH-F    5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’human GAPDH-R    5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’human GAPDH-P    5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’

Claims (3)

1、一种人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法，其特征是包括如下步骤：

①以简并引物对HPV目的基因扩增；

②以DNA测序方法对HPV进行分型；

③荧光定量PCR(Real-time PCR)对病毒进行定量。

2、根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法，其特征是该HPV简并引物包括：

①针对L1区的引物2对，

HPV-L1-F1：5’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’

HPV-L1-R1：5’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’

HPV-L1-F2：5’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’

HPV-L1-R2：5’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’

②针对E6E7区的引物(1对)，

HPV-E6E7-F1：5’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’

HPV-E6E7-R1：5’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’

其中：

R＝A，G     W＝A，T     M＝A，C     Y＝T，C     K＝G，T    S＝G，C

D＝A，G，T  H＝A，C，T  V＝A，C，G  B＝C，G，T  N＝A，C，G，T。

3、根据权利要求2所述的人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法，其特征是在DNA测序结果的基础上，选择的荧光探针是：

针对HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探针，

HPV-L1-P1：5’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’

针对HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探针，

HPV-L1-P2：5’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’

荧光定量PCR的内参照基因选择GAPDH

(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

GAPDH引物探针，

Human GAPDH-F  5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’

human GAPDH-R  5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’

human GAPDH-P  5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’。