CN100449006C - 应用于猪链球菌2型胞外因子(ef)荧光pcr检测的引物和探针序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对猪链球菌2型毒力因子—胞外因子(EF)编码基因设计的用于猪链球菌2型胞外因子(EF)荧光PCR检测的引物和探针序列。本发明针对EF基因设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，通过对反应的退火温度和镁离子浓度进行优化，建立了猪链球菌2型胞外因子(EF)多重实时荧光PCR的检测方法。

Description

应用于猪链球菌2型胞外因子(EF)荧光PCR检测的引物和探针序列

技术领域：

本发明涉及使用针对猪链球菌2型胞外因子(EF)编码基因设计的用于荧光PCR检测的引物和探针序列。

背景技术

猪链球菌病(Swine Streptococcosis)是危害养猪业发展的一种重要疾病是由猪链球菌(Streptococcus suis)侵害猪的上呼吸道、生殖道、消化道等组织而引起的一种疾病。猪链球菌2型是其中危害最大的一个血清型，国内外均有人、猪感染而死亡的报道。

对猪链球菌致病力的研究现阶段大多是用2型菌进行的，已知的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素、荚膜多糖以及44kDa蛋白、IgG结合蛋白、纤毛粘着素等。其中胞外因子是猪链球菌2型的一种重要毒力因子，并可作为判定菌株毒力强弱的重要指标。研究表明，溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)与猪链球菌2型的致病力有关。欧瑜、陆承平通过免疫印迹试验证实猪链球菌2型江苏分离株HA9801存在MRP和EF，并检测出猪链球菌2型有4种表型，其中表型MRP+EF+为强致病株，MRP+EF-为弱致病株，MRP-EF-为非致病株，未发现MRP-EF+表型。

采用常规的PCR检测方法，可以对病原菌的胞外因子EF的编码基因进行扩增以确定分离菌株的致病性。但是，荧光PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，灵敏度比常规PGR高出100倍以上，而且整个过程只需要0.5-2h，还可避免常规PCR操作时EB染色的危害及PCR后处理可能带来的假阳性，是目前为广大科研工作者所青睐的一种病原的快速鉴定方法。

本发明人根据胞外因子EF基因的公开序列设计引物进行PGR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，进行实时荧光PCR，反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而确定待检菌是否为猪链球菌2型，如果结合进行MRP基因的扩增则可对猪链球菌2型毒力进行判定。

发明内容：

本发明目的在于提供用于猪链球菌2型胞外因子检测用的荧光PCR检测的引物和探针序列。

本发明的目的通过下述技术方案实现：通过分析已报道猪链球菌2型胞外因子序列(GenBank No.A24023)的基础上，运用专业探针设计软件Beacon Desiner分别设计PCR引物和荧光探针。在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同DNA模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对猪链球菌2型胞外因子的检测。

一个方面，本发明提供了用于猪链球菌2型毒力因子-胞外因子(EF)检测的实时荧光PCR的引物对及探针。其中所述的特异性地针对EF编码基因的引物对和探针的核苷酸序列为：

EF正向引物序列为5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC，正向引物的反向互补序列为GCCTACTGCTTCTGCACTGT，反向引物序列为5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC，反向引物的反向互补序列为GGTTCAATCGCCCAAGATGTTC，以及该引物对的上游引物向5’延伸10个碱基、下游引物向3’延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列及互补序列；EF探针序列为5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC，探针的反向互补序列为GCAATCGGCAGAGGACAAAGGCGT以及该探针向5’延伸10个碱基、向3’延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。

EF的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特异性，结果见图1。结果表明EF引物和探针设计区域为猪链球菌2型EF因子所特有，没有发现同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。

所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。可用于本发明的报告荧光染料包括但不限于，例如，FAM、JOE和HEX。可用于本发明的报告荧光染料包括但不限于，例如，Eclipse和TAMRA。

在本发明的一个优选实验方案中，引物扩增产物长度为139bp，探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

猪链球菌2型EF(胞外因子)荧光PCR检测采用如下步骤进行：在权利要求所涉及序列及相应区域内设计引物对和探针，采用软件分析所设计引物对和探针的特异性，引物对和探针合成后分别进行稀释并确定反应需要量，通过调整反应体系中的镁离子浓度和对退火温度进行优化，以培养菌液或者带菌组织DNA为检测样本，确定荧光PCR检测培养菌液或者带菌组织中EF最佳反应体系和反应条件，采用倍比稀释的猪链球菌2型培养菌液及带菌组织DNA作为模板进行敏感性试验，采用其它的猪体致病菌为对照进行特异性试验，以确保所建立检测方法的实际应用效果。

另一方面，本发明提供了一种用于检测猪链球菌2型毒力因子EF基因的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)使用本发明所述的特异性地针对EF引物对及荧光素标记探针，与PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

2)向上述检测预混液中加入待检菌液或以待检组织提取的基因组DNA作为模板；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，按照本发明确立的反应条件进行荧光PCR扩增，反应结束后读取并记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；

5)根据各样本的反应Ct值，按照建立的判定标准判定待检样本中猪链球菌2型是否含有待检测的EF基因。

本发明所述方法可以直接对培养菌液进行检测，也可以对组织中携带的猪链球菌2型实施检测。在采用培养菌液作为检测材料时，菌体分离及培养须在P3实验室、按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。即采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，实验室内，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养后，灭活备用。在对带菌的组织，如猪扁桃体、肌肉等进行检测时，须首先采用商品化的基因组提取试剂盒提取其基因组DNA作为荧光PCR检测用模板。

在利用本发明所述方法对待检样本实施检测时，可直接取一定量的本发明所述检测试剂，按照确立的反应体系和条件进行检测并判定结果。

在本发明中，所述的猪链球菌2型EF基因是否存在的判定标准为：如果待检测基因的反应曲线呈对数增长而且Ct＜30，判定为阳性；30＜Ct＜40，判定为可疑，可加大模板量重复扩增，如果得到相同的试验结果，则判为阳性，否则为阴性；如果反应曲线Ct＞40或者为一条直线，则为阴性。

附图说明

图1.检测猪链球菌2型菌株EF基因的荧光PCR反应最佳退火温度的确定。图中各曲线代表不同的退火温度，曲线1-8依次分别为采用48℃、49℃、50℃、52℃、54℃、56℃、57℃和58℃作为退火温度时的反应曲线。

图2.猪链球菌2型EF基因的荧光PCR检测体系最佳Mg^2-浓度的确定(单位：mMol/l)。其中，图中曲线1-8依次分别代表体系中含有的Mg²⁺浓度分别为2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5和6mMol/l。

图3.荧光EF检测培养菌液中链球菌2型毒力因子EF的特异性试验结果

图4.荧光PCR检测组织中链球菌2型毒力因子EF的特异性试验结果

图5.荧光PCR检测培养菌液中猪链球菌2型毒力因子EF敏感性试验结果。图中曲线1-8依次分别为PCR扩增时作为模板的菌落数(CFU)为5000、1000、500、100、50、20、10和5时的扩增曲线。

图6.荧光PCR检测组织中链球菌2型毒力因子EF的敏感性结果。其中各曲线分别代表：1为阳性对照；曲线2-7依次分别表示荧光PCR反应体系中对应的组织中菌落数(CFU)为5×1000、1×1000、500、100、50和10，曲线8为阴性对照。

本发明的优点：

本发明的充分利用了PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否含有EF基因。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例1引物和探针的制备

1.1引物和探针的设计和合成

根据猪链球菌2型的毒力因子EF编码基因的公开序列(GenBank No.A24023)，采用探针设计软件Beacon Designer 2.1设计PCR引物对，引物对的序列为：正向引物P1：5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC-3’；反向引物P2：5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC-3’，扩增产物长度为139bp。针对待扩增序列间的高GC含量区设计EF探针，探针序列为5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC-3’，并且在探针5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA。合成的引物对及荧光标记探针用于下面的试验。

EF的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特异性。在线BLAST分析表明，EF引物和探针所锚定序列为猪链球菌2型毒力因子EF所特有，没有同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。

实施例2待检测样品制备

2.1菌体分离及培养

在中国人民解放军军事医学科学院P3实验室，按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，带回实验室后，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养48h后，革兰氏染色、显微镜检查后，灭活后记数备用。

2.2组织基因组DNA的提取

无菌采取待检猪及健康猪的扁桃体、肌肉等组织，实验室内，采用QIAGEN基因组提取试剂盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改进后分别提取其基因组DNA，具体步骤如下：

A.在无菌环境下(最好是在实验室生物安全柜中或超净工作台上进行操作)，将采集的组织样本(如淋巴结、扁桃体、肌肉等)除去包膜和其它结缔组织，选取内部实质部分，置玻璃匀浆器内充分磨成糊状后备用。

B.将研成糊状的20mg的动物组织，放入离心管中，加180μl的buffer ATL。

C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋涡混合器混匀，在55℃孵育直至组织完全消化(为保证试验结果，消化时间应保持在1小时以上，如时间允许，过夜消化)，在消化的过程中需每隔一段时间振荡混合一次。

D.旋涡15s，在样品中加入200μl的buffer AL，旋涡混匀，70℃孵育30min。

E.在样品中加入200μl的无水乙醇，旋涡混匀。

F.将试剂盒中的DNeasy Mini Spin Column安置于2ml的收集管上，将上述操作E中的溶液转移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)离心1min，弃去滤液和收集管。

G.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)离心1min，弃去滤液和收集管。

H.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)离心3min使DNeasy膜完全干燥，弃去滤液和收集管。

I.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的1.5ml的收集管上，将100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室温孵育1min，≥6000g(8000rpm)离心1min洗脱DNA。

实施例3.猪链球菌2型毒力因子EF荧光PCR检测体系及检测条件的建立和优化

3.1检测猪链球菌2型EF毒力因子的荧光PCR反应最佳退火温度的确定

为了提高检测的特异性和敏感性，参照引物设计软件推荐的退火温度(55℃)，本研究按照表1设置退火温度梯度进行PCR。实验表明(见图1)，退火温度对PCR反应有一定的影响，温度越高，反应的特异性越强，但是扩增效率则明显下降；反之，退火温度降低，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却受到影响。本研究选择55℃作为实际采用的退火温度，目的是兼顾反应的特异性和扩增效率。

表1.猪链球菌2型毒力因子EF的荧光PCR检测所采用的退火温度

采用的反应体系如下：

10×PCR缓冲液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl2 3.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探针0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl从组织中提取的基因组DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μl。

将样品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；(48-58)℃，10s，45个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线确定最佳退火温度。

3.2检测猪链球菌2型EF基因的荧光PCR反应体系最佳Mg²⁺浓度的确定

为了提高反应的敏感性而不影响其特异性，本研究对PCR反应体系中的Mg²⁺浓度按照表2的浓度梯度进行了优化。采用的反应体系如下：

10×PCR缓冲液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl2(2.5-6.0)μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探针0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μl。

将样品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR仪后，采用确定的最佳退火温度，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；55℃，10s；45个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线确定最佳Mg2+浓度。自图2可以看出，Mg2+浓度对PCR反应有明显的影响，Mg2+浓度越低，反应的特异性越强，但是扩增效率则明显下降；反之，Mg2+浓度升高，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却受到影响。本研究选择Mg2+浓度5mMol/l作为扩增EF基因实际采用的Mg2+浓度，目的是兼顾反应的特异性和扩增效率。

表2.猪链球菌2型毒力因子EF的荧光PCR检测所采用的Mg2+浓度

实施例4荧光PCR检测猪链球菌2型EF基因的特异性试验

4.1荧光PCR检测猪链球菌2型培养菌液的特异性试验

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行荧光PCR扩增，根据扩增产物的有无判定本方法是否是检测猪链球菌2型感染的特异性方法。结果如图3所示。自图3表明，以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行猪链球菌2型EF毒力因子的荧光PCR扩增，结果表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株均没有扩增，说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于猪链球菌2型EF毒力因子的检测。

4.2荧光PCR检测组织中猪链球菌2型EF基因的特异性试验

采用正常组织基因组DNA作为空白对照，以在扁桃体组织中定量掺入马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株后提取的DNA作为阴性对照，以掺入猪链球菌2型四川株的扁桃体组织DNA作为阳性对照，进行荧光PCR，以检验本研究所建立方法的特异性。荧光PCR检测组织样品中猪链球菌2型EF基因的特异性试验结果如图2。采用正常组织基因组DNA作为空白对照，以在扁桃体组织中定量加入马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株后提取的DNA作为阴性对照，以加入猪链球菌2型四川株的扁桃体组织DNA作为阳性对照，进行EF基因的荧光PCR结果表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株和阴性对照均没有扩增(见图4)，说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于组织样品中猪链球菌2型EF毒力因子的检测。

实施例5检测猪链球菌2型感染的荧光PCR方法的敏感性确定

5.1荧光PCR检测猪链球菌2型培养菌液的敏感性试验

A.菌液样品稀释：以猪链球菌2型四川株培养菌液作为待检菌液，记数后，采用血清肉汤培养液按照如下梯度稀释。

表3.荧光PCR检测培养菌液中的猪链球菌2型毒力因子EF的菌液浓度

B.PCR反应体系：10×PCR缓冲液(Mg²⁺Free)2.5μl，25mM MgCl₂ 3μl，2.5mM dNTP2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探针0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl梯度稀释的菌液作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μl，充分混匀。

C.PCR反应条件：将样品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR仪后，采用如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；55℃，10s；45个循环。每个循环结束后采集数据。PCR扩增完成后，以Ct＝40作为检测低限，确定本方法可以检测的最少菌数。荧光PCR检测培养菌液中猪链球菌2型EF因子的敏感性试验结果结果如图5所示。自图5中可以看出，第7管的Ct值为36.2，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的实时PCR方法检测培养菌液中猪链球菌2型EF基因的敏感性为10CFU。

5.2荧光PCR检测组织中猪链球菌2型EF基因的敏感性试验

按照试剂盒组织用量说明，称取10mg扁桃体组织，在其中加入按照如下梯度稀释的猪链球菌2型培养菌液，按照DNA提取试剂盒操作提取其中的基因组DNA，并取1μl作为模板，按照5.1的反应体系和程序进行荧光PCR，PCR同时设置阳性对照。扩增后，分析Ct值，以Ct＝40作为检测低限，确定本方法可以检测的组织中猪链球菌2型的最低数量。荧光PCR检测组织样品中猪链球菌2型EF基因的敏感性试验结果如图7所示。自图6中可以看出，第6管的Ct值为36.2，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，采用本研究所建立的实时PCR方法检测组织中EF基因的敏感性为50 CFU。

表4.荧光PCR检测组织中的猪链球菌2型毒力因子EF的对应菌数

Claims (6)

1.用于猪链球菌2型毒力因子-胞外因子检测的实时荧光PCR的引物对及探针，其中所述引物对的序列为：

正向引物P1：5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC-3’

反向引物P2：5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC-3’

所述探针的序列为：5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC-3’

该探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

2.权利要求1所述的引物对及探针，其中所述的报告荧光染料选自FAM、JOE和HEX。

3.权利要求2所述的引物对及探针，其中所述的报告荧光染料为FAM。

4.权利要求1所述的引物对及探针，其中所述的淬灭荧光染料选自Eclipse和TAMRA。

5.权利要求4所述的引物对及探针，其中所述的淬灭荧光染料为TAMRA。

6.一种用于检测猪链球菌2型毒力因子-胞外因子基因的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)使用权利要求1-5中任一项所述的引物对及探针，与PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

2)向上述检测预混液中加入待检菌液或以待检组织提取的基因组DNA作为模板；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，按照如下反应条件进行荧光PCR扩增：95℃预变性3分钟，然后采用二步法进行反应，94℃5秒，55℃10秒，45个循环，Mg²⁺浓度为5mMol/l，反应结束后读取并记录各检测样本的PCR扩增循环数；

5)根据各样本的反应扩增循环数值，按照建立的判定标准判定待检样本中猪链球菌2型是否含有待检测的胞外因子基因；

其中所述的判定标准为：如果待检测基因的反应曲线呈对数增长而且扩增循环数＜30，判定为阳性；30＜扩增循环数＜40，判定为可疑，加大模板量重复扩增，如果得到相同的试验结果，则判为阳性，否则为阴性；如果反应曲线扩增循环数＞40或者为一条直线，则为阴性。

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