CN102312013B - 检测2型猪链球菌89k毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量pcr方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒。该引物和探针包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集。该方法包括选择引物探针序列集、实时荧光定量PCR反应。该试剂盒包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集和其它相关试剂。本发明的引物和探针、PCR方法及试剂盒可在在很短的时间内确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因，从而为应对疫情争取更多的时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒，属于生物工程技术领域。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)为革兰阳性兼性厌氧球菌，根据荚膜多糖的抗原性，猪链球菌可分为35个血清型，其中1、2、1/2、7、9和14型具有致病性，并以2型(S.suis 2)毒力最强，临床检出率最高。
2型猪链球菌是一种重要的人畜共患传染病病原体，不仅可导致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡，还可通过伤口和呼吸道等传播途径，导致人的感染发病和死亡。2型猪链球菌呈全球性分布，不仅给全世界养猪业造成巨大的经济损失，而且对相关从业人员的健康亦构成严重威胁，已成为重要的新发传染病病原体。2型猪链球菌根据致病力的强弱可分为强毒株，弱毒株或无毒株。然而，弱毒株或无毒株2型猪链球菌在健康猪扁桃体的带菌率可高达42.6％，这就给病猪诊断和肉品检测带来困难——在检疫检验时，检到2型猪链球菌后还必须鉴定其致病力，进而采取针对性的应对措施，从而防止疫情爆发和蔓延。
本专利申请人已针对2型猪链球菌主要毒力因子(CPS2、MRP、EF、Sly)建立了多重常规PCR体系检测2型猪链球菌，并研制出相应的试剂盒，在国内率先提供快速诊断的技术手段(研究成果发表在《中华流行病学杂志》2005年9月第26卷第九期)。
通常，2型猪链球菌在人群中只引起散发的急性脑膜炎和败血症。然而，1998年在江苏省以及2005年在四川省大规模爆发的两起2型猪链球菌感染人的突发公共卫生事件共导致了240人感染，52人死亡，病人出现链球菌中毒性休克综合征(STSS)的新临床型别，该型别患病致死率高达80％以上，为历史罕见。
本专利申请人率先对来自中毒休克综合症临床病人的1998年江苏分离株(98HAH12)和2005年四川分离株(05ZYH33)分别作了全序列基因测定，经对比分析，在全世界首次发现这两个中国强毒株比欧洲株多出一段89K序列片段，称为89K毒力岛(王长军，A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates.PLoS ONE，2007，Issue5，1-9)。本专利申请人在后续研究中发现，该89K毒力岛对菌株毒力因子起到全局性的调控作用(王长军，Inactivation of Dipeptidyl Peptidase IV Attenuates the Virulence of Streptococcus suis Serotype 2 that Causes Streptococcal Toxic Shock Syndrome.Curr Microbiol，2009，1-8)。在敲除89K毒力岛基因后，菌株的致病性显著降低，宿主症状显著改善，存活率显著提高(王长军，SalK/SalR，a Two-Component Signal Transduct ion System，Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2.PLoS ONE，2008，Volume3，Issue5，1-12)。上述研究表明，89K毒力岛应是这两次流行2型猪链球菌的一种重要致病基因，是引起我国人感染猪链球菌病中毒性休克综合症的关键致病基因。
含有89K毒力岛的2型猪链球菌的致病力远远超过传统的强毒株2型猪链球菌，但目前还没有一种能检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的技术手段，而这种技术手段对于应对由含89K毒力岛2型猪链球菌引起的传染病，特别是在中国突发公共卫生事件中早期应急处置由含89K毒力岛2型猪链球菌导致的疫情，进而抑制疫情爆发和蔓延具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针。
本发明的第二目的是：提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法。
本发明的第三目的是：提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂 盒。
申请人经研究发现，2型猪链球菌89K毒力岛的二元信号转导系统基因SalK和IV型分泌系统毒力基因virB4-89K均对2型猪链球菌的致病力起到关键的调节作用。
结合上述研究发现，实现本发明第一目的的技术方案如下：
一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，包括由引物对SalK-F和SalK-R、及探针SalK-probe组成的SalK引物探针序列集；其中，引物SalK-F的序列如SEQ ID No.1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No.2所示，探针SalK-probe的序列如SEQ ID No.3所示；所述探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
进一步地，还包括由引物对virB4-89K-F和virB4-89K-R、及探针virB4-89K-probe组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由引物对cps2J-F和cps2J-R、及探针cps2J-probe组成的cps2J引物探针序列集；其中，引物virB4-89K-F的序列如SEQ ID No.4所示，引物virB4-89K-R的序列如SEQ ID No.5所示，探针virB4-89K-probe的序列如SEQ ID No.6所示；引物cps2J-F的序列如SEQ ID No.7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No.8所示，探针cps2J-probe的序列如SEQ ID No.9所示；所述探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团。
2型猪链球菌普遍含有基因cps2J，采用cps2J引物探针序列集可以确认2型猪链球菌。
采用上述引物和探针进行实时荧光定量PCR反应，即可快速确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因。
实现本发明第二目的的技术方案如下：
一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征 是，包括以下步骤：
(1)选择引物探针序列集：选择由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集；其中，探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一；
(2)实时荧光定量PCR反应：以待测样品的基因组DNA为扩增模板，根据所选引物探针序列集的探针上所标记的报告荧光基团选择荧光通道，利用所选引物探针序列集的引物对和探针进行实时荧光定量PCR反应，同时记录荧光曲线和扩增循环数CT；
其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因SalK的阳性判断标准是：当CT≤35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。
进一步地，所述步骤(1)中还选择由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；
其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因virB4-89K、所述2型猪链球菌的基因cps2J的阳性判断标准均为：当CT≤35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。
更进一步地，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：
第一阶段：初期变性，93℃-95℃30秒-120秒；
第二阶段：PCR反应，93℃-95℃变性5-15秒，60℃退火并延伸28-40秒，同时监测荧光曲线；重复30-50个循环。
再进一步地，所述实时荧光定量PCR反应的体系由以下组分构成：体系终浓度为1.25U/20μl的Premix Ex Taq聚合酶，体系终浓度为5mmol/L的镁离子，体系终浓度为0.2μmol/L的各引物，体系终浓度为0.5μmol/L的各探针，体系终浓度为0.2μmol/L的ROX Reference Dye II，待测样品基因组DNA溶液 4μl，双蒸水适量；整个体系的总体积为20μl。
实时荧光定量PCR是通过荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可实时监控反应过程，具有特异性更好、假阳性低、灵敏度更高(是常规PCR的100倍以上)、操作简便、交叉污染和污染环境机会少等优点，而且整个反应可在0.5-2h内完成。多重实时荧光定量PCR是在同一个反应系中加入多个引物和荧光标记探针，同时检测多个目的基因的方法，该方法可以方便的进行一管多检，从而达到省时省力的目的。
采用上述方法可以在很短的时间内确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因，从而为应对疫情争取更多的时间。
实现本发明第三目的的技术方案如下：
一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒，其特征是，包括由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集；其中，探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
进一步地，还包括由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团。
更进一步地，还包括2×Premix Ex Taq聚合酶、25mM镁离子溶液、及50×ROX Reference Dye II。
采用上述试剂盒可快速确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因。
附图说明
图1为本发明实时荧光定量PCR方法的检测原理图。
图2为本发明实施例4的荧光曲线示意图。
图3为本发明实施例5的荧光曲线示意图。
图4为本发明实施例6的荧光曲线示意图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBROOK.J等编著的《分子克隆实验指南》第3版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；NEW York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中述及的条件，或参照制造厂商所建议的条件。
以下内容中涉及的实验材料和试剂，如未特别说明则为市售品。
实施例1.SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集
通过分析NCBI(美国国立生物技术信息中心)GenBank数据库中2型猪链球菌的SalK、virB4-89K、cps2J基因序列，使用Beacon Designer等多种生物学软件，结合经验判断和人工比对、修正，进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区域设计三对引物和探针(本发明采用的是TaqMan探针)。引物长度一般为20-30个碱基，探针的长度一般为15-30个碱基(均为DNA碱基)。引物间和引物内无互补序列，而且应分别特异性地针对各靶基因，相互间不存在交叉反应，可以在同一套反应体系中同时应用于检测和区分SalK、virB4-89K、cps2J三组基因。具体的引物对、探针序列见表1。
表1 引物对、探针序列
注：各引物名称中，含F表示上游引物，含R表示下游引物。
其中，SEQ ID No.1-3组成SalK引物探针序列集，SEQ ID No.4-6组成virB4-89K引物探针序列集，SEQ ID No.7-9组成cps2J引物探针序列集。
用荧光染料在探针的5′端标记报告荧光基团(Reporter，R)，用非荧光染料在探针的3′端标记淬灭荧光基团(Quencher，Q)。荧光基团和淬灭荧光基团构成能量转移结构：报告荧光基团所发射的荧光可被淬灭荧光基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，在Taq酶5′-3′外切酶的作用下，探针水解断裂，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量，从而进行2型猪链球菌中各靶基因的检测。检测反应原理见图1。
报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
如本领域技术人员所知，为确保检测结果的可靠性，在同一反应体系采用两个以上的上述引物探针序列集时，不同的探针上应标记有不同的报告荧光基团。
按常规方法获得所设计的引物对、探针后，将各引物对分别制成引物对工作液，并将各探针分别制成探针工作液。
实施例2.建立检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法
1.制备目标基因质粒标准品
从灭活的含89K毒力岛的2型猪链球菌中提取基因组DNA作为扩增模板；按常规方法，利用引物对SalK-F和SalK-R、引物对virB4-89K-F和virB4-89K-R、引物对cps2J-F和cps2J-R进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；其中，引物SalK-F的序列如SEQ ID No.1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No.2所示，引物virB4-89K-F的序列如SEQ ID No.4所示，引物virB4-89K-R的序列如SEQ ID No.5所示，引物cps2J-F的序列如SEQ ID No.7所示，引 物cps2J-R的序列如SEQ ID No.8所示；
将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到pMD18-T载体，转化，提取质粒DNA，从而获得各目标基因的质粒标准品；测定各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用。
优选地，含89K毒力岛的2型猪链球菌可采用从2005年四川猪链球菌病爆发疫情中分离出的中国强毒株05ZYH33。
优选地，提取基因组DNA的方法可选用：DNA提取液提取法、PCR反应液裂解提取法、或DNA提取试剂盒提取法，均属常规方法。
优选地，测定各目标基因的质粒标准品浓度的方法是：用紫外分光光度计定量，利用公式(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(DNA length×660)＝copies/μl计算浓度。
2.建立实时荧光定量PCR反应体系
分别对Premix Ex Taq聚合酶的用量、镁离子的浓度、引物的浓度、探针的浓度、目标基因质粒标准品的线性范围进行优化；其中，在反应体系中其它条件相同的情况下，将各目标基因质粒标准品的拷贝数分别从101copy/每反应体系至109copy/每反应体系作梯度连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定目标基因的质粒标准品拷贝数线性范围为101～108copy/每反应体系。
经上述各个条件的优化，最终确定所用三重实时荧光定量PCR反应体系为20μl体系，所需各组分及相应终浓度见表2。
表2 三重实时荧光定量PCR反应体系组分表
注：i.当三重实时荧光定量PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
ii.根据使用的仪器不同，应将反应参数和体系作适当调整。
iii.根据检测样本来源不同，应适当调整样本待测液的添加量。
3.建立检测待测样品的方法
(1)选择引物探针序列集：选择由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集，还可以选择由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中，探针SalK-probe、探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
(2)实时荧光定量PCR反应：以待测样品的基因组DNA为扩增模板，根据所选引物探针序列集的探针上所标记的报告荧光基团选择荧光通道，利用所选引物探针序列集的引物对和探针进行实时荧光定量PCR反应，同时记录荧光曲线和扩增循环数CT。
其中，2型猪链球菌89K毒力岛的基因SalK和基因virB4-89K、2型猪链球菌的基因cps2J的阳性判断标准均为：当CT≤35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。
其中，实时荧光定量PCR反应的程序为：(可根据使用的仪器不同，将下列反应参数作适当调整)
第一阶段：初期变性，93℃-95℃30秒-120秒(优选95℃30秒)；
第二阶段：PCR反应，93℃-95℃变性5-15秒(优选95℃变性6秒)，60℃退火并延伸28-40秒(优选60℃退火并延伸30秒)，同时监测荧光曲线；重复30-50个循环(优选重复40个循环)。
优选地，可使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(Generay Biotech公司产品，货号GK1071)来抽提待测模板中的细菌DNA，参照厂家的试剂盒说明书进行。
需要指出的是，本实施例建立的方法并非用于诊断目的，而是用于判断2 型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因，从而确认该2型猪链球菌是否具有很强的致病力。
实施例3.检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒
本实施例试剂盒包括由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集，还可以包括由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中，探针SalK-probe、探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
本实施例试剂盒还包括2×Premix Ex Taq聚合酶、25mM镁离子溶液、及50×ROX Reference Dye II。
使用时，按照实施例2表2所示的反应体系加入相应试剂即可。
本实施例试剂盒适用于2型猪链球菌的实时荧光PCR检测，从而确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因。
实施例4.含89K毒力岛2型猪链球菌的实时荧光定量PCR检测
(1)将实施例1所述的从2005年四川猪链球菌病爆发疫情中分离出中国强毒株05ZYH33灭活后，作为模拟阳性样品。提取模拟阳性样品的基因组DNA，得到待测液。
(2)选择由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集、由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集、以及由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中，探针SalK-probe的5′端以JOE标记，探针virB4-89K-probe的5′端以FAM标记，探针cps2J-probe的5′端以Cy5标记；上述探针的3′端均以BHQ标记。
将上述引物和探针分别配制成浓度为10μM的引物对工作液和探针工作液。
(3)采用实施例2表2的20μl实时荧光定量PCR反应体系：按表2加入除质粒标准品外的所有组分，然后加入4μl待测液；选择分别与报告荧光基团 JOE、FAM、Cy5对应的荧光通道；然后进行实施例2所述的实时荧光定量PCR反应程序，并记录荧光曲线和扩增循环数CT。
(4)荧光曲线如图2所示，各基因的荧光曲线均呈S形。各CT值分别为：cps2J，19.76；virB4-89K，20.87；SalK，24.42；均小于35。因此，SalK基因、virB4-89K基因以及cps2J基因的检测结果均为阳性。这与模拟阳性样品的实际情况相符。
上述步骤可完成对待测液的定性检测。
另外，在上述反应体系中，可设置由不同浓度质粒标准品(如实施例2所述)组成的工作曲线反应孔，反应结束后，计算数据以获得工作曲线；再将待测液反应孔的数据代入，即可完成对待测液的定量检测。
该试验结果表明，本发明设计的各引物对和各探针特异性和工作性能良好，可建立针对含89K毒力岛2型猪链球菌的三重实时荧光定量PCR检测方法。
需要说明的是，本实施例的步骤(2)中也可仅选择SalK引物探针序列集，或者选择SalK引物探针序列集和virB4-89K引物探针序列集，或者选择SalK引物探针序列集和cps2J引物探针序列集，相应的检测结果为在图2中去掉未选择序列集所对应基因的荧光曲线，因此，不再具体列出相应的应用实例。这些技术方案均属于本实施例的等同替换技术方案，根据这些技术方案，可建立针对含89K毒力岛2型猪链球菌的单重或双重实时荧光定量PCR检测方法。
实施例5.不含89K毒力岛2型猪链球菌的实时荧光定量PCR检测
(1)申请人从健康猪群中分离到弱(无)毒株2型猪链球菌——中国无毒株05JYS68，其中不含89K毒力岛，将上述菌株05JYS68灭活后，作为模拟阴性样品。
(2)选择由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集、由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集、以及由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中，探针SalK-probe的5′端以Cy3标记，探针virB4-89K-probe的5′端以TRAMA标记，探针cps2J-probe的5′端以TET标记；上述探针的3 ′端均以ECLIPSE标记。
将上述引物和探针分别配制成浓度为10μM的引物对工作液和探针工作液。
(3)采用实施例2表2的20μl实时荧光定量PCR反应体系：按表2加入除质粒标准品外的所有组分，然后加入4μl待测液；选择分别与报告荧光基团JOE、FAM、CY5对应的荧光通道；然后进行实施例2所述的实时荧光定量PCR反应程序，并记录荧光曲线和扩增循环数CT。
(4)荧光曲线如图3所示，仅cps2J基因的荧光曲线呈S形、且其CT值为16.43，小于35；其余基因均不符合标准。因此，SalK基因、virB4-89K基因的检测结果为阴性，cps2J基因的检测结果为阳性。这与模拟阴性样品的实际情况相符。注：图3中仅标出了呈阳性的cps2J基因，其它两个基因呈阴性，无需标出。
该试验结果表明，本发明设计的各引物对和探针特异性和工作性能良好，具有良好的特异性，能够将中国无毒株05JYS68与中国高致病株05ZYH33株区分开。
实施例6.本发明实时荧光定量PCR方法在实际检测中的应用
(1)申请人在日常工作中收到一份疑似含有2型猪链球菌的待测样品，提取该待测样品的基因组DNA，得到待测液。
(2)选择由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集、由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集、以及由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中，探针SalK-probe的5′端以JOE标记，探针virB4-89K-probe的5′端以ROX标记，探针cps2J-probe的5′端以HEX标记；上述探针的3′端均以BHQ标记。
将上述引物和探针分别配制成浓度为10μM的引物对工作液和探针工作液。
(3)采用实施例2表2的20μl实时荧光定量PCR反应体系：按表2加入除质粒标准品外的所有组分，然后加入4μl待测液；选择分别与报告荧光基团JOE、FAM、CY5对应的荧光通道；然后进行实施例2所述的实时荧光定量PCR反 应程序，并记录荧光曲线和扩增循环数CT。
(4)荧光曲线如图4所示，各基因的荧光曲线均呈S形。各CT值分别为：cps2J，26.00；virB4-89K，27.28；SalK，31.39；均小于35。因此，该样品中，SalK基因、virB4-89K基因以及cps2J基因的检测结果均为阳性，于是可以确定该样品中确实存在含89K毒力岛的2型猪链球菌，致病力很高。
需要说明的是，各实施例中均采用半对数图谱来表示荧光曲线，对于接近荧光信号本底的部分都采用间断曲线的形式来表示，这是本领域技术人员可以理解的内容。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒，其特征是，包括序列为SEQ ID No.1-2的引物salK-F和SalK-R，以及序列为SEQ ID NO：3的探针SalK-probe，其中，探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；
还包括：
序列为SEQ ID No.4-5的引物virB4-89-F和virB4-89K-R，以及序列为SEQID NO：6的探针virB4-89K-probe；
和/或序列为SEQ ID No.7-8的引物cps2J-F和cps2J-R，以及序列为SEQ IDNO：9的探针cps2J-probe；
其中，探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；
所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
2.根据权利要求1所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒，其特征是，还包括2×Premix Ex Taq聚合酶、25mM镁离子溶液、及50×ROX ReferenceDyeⅡ。
3.一组检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物，其特征是，包括引物对SalK-F和SalK-R，引物SalK-F的序列如SEQ ID No.1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No.2所示；
还包括引物对virB4-89K-F和virB4-89K-R，和/或引物对cps2J-F和cps2J-R；引物virB4-89K-F的序列如SEQ ID No.4所示，引物virB4-89K-R的序列如SEQ ID No.5所示；引物cps2J-F的序列如SEQ ID No.7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No.8所示。
4.一组检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的探针，其特征是，包括探针SalK-probe，探针SalK-probe的序列如SEQ ID No.3所示；所述探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；
还包括探针virB4-89K-probe和/或探针cps2J-probe；探针virB4-89K-probe的序列如SEQ ID No.6所示；探针cps2J-probe的序列如SEQID No.9所示；所述探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；
所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。
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| 王长军.SalK/SalR,a Two-Component Signal Transduct ion System,Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2.《PLoS ONE》.2008,第3卷(第5期), * |
| 蒋卉.猪链球菌2型可能毒力基因的鉴定及分析.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》.2009,(第8期), |
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