CN106868143B - 一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用 - Google Patents

一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用，所述的引物为：SS‑F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS‑R：AGATTCCGCATTTCCTCC。该引物能快速区分食品原料、食品、人或动物携带的猪链球菌中的爆发菌株和散发菌株。本发明通过基因组学和大数据分析方法对检测靶点进行了高通量筛选，在检测靶点的选择上进行了创新，极大提高了检测的准确性。方法简单易行，灵敏度高，反应时间短，成本低。

Description

一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用
技术领域
本发明属于食品安全检测或者病原微生物检测领域，更具体涉及一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用，本发明提供的引物适用于动植物性产品、制品、公共安全和动物疫病的快速检测。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患传染病病原。S.suis不仅导致猪出现脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎和败血症等症状，造成猪只大量死亡，给养猪业造成巨大的经济损失，还可以通过与感染猪、带菌猪肉直接接触而传染给人，导致人永久性听力丧失、败血症型休克甚至死亡，严重威胁着人类的身体健康和生命安全，已引起社会的高度关注。1998年在江苏南通S.suis造成病死猪10万余头，人群感染25例；2005年四川省S.suis造成死亡猪几千头，人群感染208例。同期广东、香港也有病例报导。猪链球菌病已成为泰国的重要传染病，猪链球菌也是香港引起脑膜脑炎的第三大病原(仅次于肺炎链球菌和结核分枝杆菌)和越南引起脑膜脑炎的第一大病原(Streptococcus suismeningitis:the newest serious infectious disease.J Med Assoc Thai.2008；91(5):654-658；Streptococcus suis infection and risk factors for mortality.JInfect.2008；57(5):392-396；Streptococcus suis:an emerging human threat.JInfect Dis.2009；199(1):4-6.)。尽管该病原在我国引起两次爆发事件，并且近年来连续报导人和猪感染猪链球菌病例，目前仍未有商业化的方法区分猪链球菌的爆发菌株和散发菌株。因此，亟需寻找可用于能够区分爆发菌株和散发菌株的检测靶点，并建立相应的检测方法，使得我们能够对该病原进行监测，防患于未然；也有助于在中国突发公共卫生事件中早期应急处置疫情，进而抑制疫情的爆发和蔓延。
目前猪链球菌的检测方法主要有微生物学方法、生化方法、免疫学方法和分子生物学方法等。微生物学方法和生化方法并不能用于区分不同菌株的致病性，更无法区分爆发菌株和散发菌株。免疫学方法只可用于检测部分公认的毒力因子，并且需要制备毒力因子相应的抗血清，对操作人员要求较高，这些要求一定程度上限制了该方法的应用。近年来分子生物学的检测方法的发展较大程度上提高了病原检测的特异性和灵敏度，减少了检测时间，已经成为重要的检测技术。目前常见的分子生物学检测方法如特异性的核酸探针，荧光实时定量PCR和PCR检测方法等。尽管不同的分子生物学检测方法各有利弊，共同需要解决的问题是检测靶点的选择。
我国学者对1998年和2005年爆发的菌株的基因组进行分析，发现两次爆发的中国强毒力菌株比欧洲菌株多出一段89kb的核酸片段，命名为为89K毒力岛(A Glimpse ofStreptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis2Chinese Isolates.PLoS ONE.2007Mar 21；2(3):1-9)。进一步研究发现位于89K毒力岛上的基因Di-peptidyl peptidase IV、SalK/SalR和VirD4-89K等均与爆发菌株的致病性密切相关(Inactivation of Dipeptidyl Peptidase IV Attenuates the Virulence ofStreptococcus suis Serotype 2that Causes Streptococcal Toxic ShockSyndrome.Curr Microbiol.2009Sep；59(3):248-55；SalK/SalR,a two-Component SignalTransduction System,Is Essential for Full Virulence of Highly InvasiveStreptococcus suis Serotype 2.PLoS ONE.2008May 7；3(5):e2080；Role of a TypeIV–Like Secretion System of Streptococcus suis 2 in the Development ofStreptococcal Toxic Shock Syndrome.J Infect Dis.2011；204(2):274-81.)。综上所述，89kb的核酸片段被公认是用于区分爆发菌株和散发菌株的重要标志，许多检测方法也建立在此基础上。
申请人经过10年的调查发现，89kb的核酸片段的许多区域存在于散发菌株中，即并非89kb毒力岛上的所有序列均适合成为检测靶点(Predominance of Streptococcussuis ST1and ST7 in human cases in China,and detection of a novel sequencetype,ST658.Virulence.2016Sep 30:1-5.)。因此，我们有必要对该区域进行深入分析，挖掘新型的检测靶点，提高检测的精确性。
通过检索有以下专利申请，CN101440400A公开了“含89K毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法，”该方法基于89kb的核酸序列直接设计引物和特异性核酸探针，容易出现上文描述的不准确现象。
CN102312013A公开了“检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒，”该方法基于样品中含SalK基因、virB4-89K基因以及cps2J基因，则认为该样品中存在致病力高的含89K毒力岛的2型猪链球菌。但SalK、virB4-89K、cps2J这些基因的部分序列也存在于散发菌株中。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供了一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用，所述的引物为：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。
本发明的另一个目的在于提供了一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物的应用，该引物可以用于制备成区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株试剂盒，用于食品、动物疫病和卫生检测中。简单易行，不需要提取基因组，节省时间，降低成本。对设备依赖程度低，反应时间短，仅需要3小时便可以完成整个检测过程，灵敏度高，能检测到fg级别的核酸。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人对近10年收集的30株猪链球菌散发菌株进行全基因组测序，结合数据库中已有的200株猪链球菌菌株，一共对230株菌株的基因组进行分析，最终筛选到能够用于精确区分检测爆发菌株和散发菌株的靶点，利用该靶点设计引物，最终获得了一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物，所述的引物为：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。
区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物的应用，包括利用该检测引物制备成区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株试剂盒，该试剂盒可用于食品、动物疫病和卫生检测领域中猪链球菌爆发菌株的检测。
所述的试剂盒，优选的，还包括：EasyTaq Buffer，dNTPs，EasyTaq DNA聚合酶，SYBR Green I荧光染料，阳性对照(猪链球菌SC19(Draft Genome Sequence ofHypervirulent and Vaccine Candidate Streptococcus suis Strain SC19.GenomeAnnounc.2017Jan 19；5(3).)，阴性对照(无菌去离子水)。
利用上述试剂盒区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的方法，包括：
(1)前处理：将从疑似被猪链球菌污染的生肉、肉制品或其他食品以及疑似感染动物的组织、血液或脑脊液中划线分离到的疑似菌落，或者增菌液进行离心集菌。将菌落或离心得到的菌体加入50μL 20mM Tris-HCl振荡混匀，再于100℃中水浴10分钟，完成待检样品前处理。
(2)猪链球菌的PCR扩增：
反应体系为：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶(5units/μL)、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待测样品，无菌去离子水补足至25μL；
反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃温育5min。
(3)结果判读：以下两种判定方法选其一则可。
(3.1)显色反应：取出PCR反应管，加入SYBR Green I荧光染料，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应。
(3.2)电泳检测：从PCR反应管中取出5μL样品与1μL 6*loading buffer混匀后直接点样于0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶中，80V-120V电泳30-40分钟后可在凝胶成像系统中观察到特异性条带(764bp)。
所述的食品包括但不限于超市或出入境的猪肉类食物，包括生猪肉、猪内脏以及腊肉、熏肉、灌肠等各种猪肉制品。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)准确性高：本发明通过基因组学和大数据分析方法对检测靶点进行了高通量筛选，在检测靶点的选择上进行了创新，极大提高了检测的准确性；
(2)简单易行：该方法简单易行，不需要提取基因组，节省时间，降低成本，对设备依赖程度低，仅需要3小时便可以完成整个检测过程；
(3)灵敏度高：能检测到fg级别的核酸。
附图说明
图1为本发明提供的检测引物对人源分离株的检测示意图；
其中图1中A为PCR扩增后的电泳图；图1中B为PCR扩增反应产物中加入显色液后在正常日光条件下的结果示意图；图1中C为PCR扩增反应产物中加入显色液后在紫外灯下显示结果示意图；
M为Maker，泳道1为阳性对照猪链球菌SC19、泳道2为阴性对照。
图2为本发明提供的检测引物对猪源分离株的检测示意图；
其中图2中A为PCR扩增后的电泳图；图2中B为PCR扩增反应产物中加入显色液后在正常日光条件下的结果示意图；图2中C为PCR扩增反应产物中加入显色液后在紫外灯下显示结果示意图；
M为Maker，泳道1为阳性对照猪链球菌SC19、泳道2为阴性对照。
图3为本发明提供的引物的特异性检测结果示意图：
图3中A为对待测菌株的PCR扩增后的电泳图；图3中B为在应用该检测试剂盒对待测菌株的PCR扩增反应产物中加入显色液后在正常日光条件下的结果示意图；图3中C为在应用该检测试剂盒对待测菌株的PCR扩增反应产物中加入显色液后在紫外灯下显示结果示意图；
M：Maker，泳道1为阳性对照猪链球菌SC19、泳道2为阴性对照，泳道3-10分别为ATCC13311、ATCC13076、ATCC29213、ATCC6538、83175、F18ac、ATCC33846、ATCC19114。
图4为利用本发明提供的引物对猪链球菌SC19的不同浓度的菌液检测结果示意图：
图4中A为PCR扩增后的电泳图；图4中B为PCR扩增反应产物中加入显色液后在正常日光条件下的结果示意图；图4中C为PCR扩增反应产物中加入显色液后在紫外灯下显示结果示意图；
M：Maker，泳道1-5分别为猪链球菌SC19的菌液浓度为3*105CFU/μL、3*104CFU/μL、3*103CFU/μL、3*102CFU/μL、30CFU/μL，泳道6为阴性对照。
图5为利用本发明提供的引物对猪链球菌SC19的不同浓度基因组检测结果示意图：
图5中A为PCR扩增后的电泳图；图5中B为PCR扩增反应产物中加入显色液后在正常日光条件下的结果示意图；图5中C为PCR扩增反应产物中加入显色液后在紫外灯下显示结果示意图；
M：Maker，泳道1-7分别为猪链球菌SC19的基因组浓度为7.4μg/μL、740pg/μL、74pg/μL、7.4pg/μL、740fg/μL、74fg/μL、7.4fg/μL，泳道8为阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实例，进一步阐明本发明，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，本发明所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的引物在制备检测试剂盒中的应用：
一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测试剂盒，包括：引物：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC，EasyTaq Buffer，EasyTaq DNA聚合酶，dNTPs，SYBR Green I的荧光染料。
利用所述试剂盒检测的PCR反应体系：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mMdNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶(5units/μL)、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待测样品，无菌去离子水补足至25μL；
所述的待测样品为菌液或基因组。
反应条件：在94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃温育5min条件下反应。
阳性对照是猪链球菌SC19；阴性对照是无菌去离子水。
结果判读：以下两种判定方法选其一则可。
(1)显色反应：取出PCR反应管，加入SYBR Green I荧光染料，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应。
(2)电泳检测：从PCR反应管中取出5μL样品与1μL 6*loading buffer混匀后直接点样于0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶中，80V-120V电泳30-40分钟后可在凝胶成像系统中观察到特异性条带(764bp)。
实施例2：
引物SS-F和SS-R对猪链球菌爆发菌株和散发菌株的区分：
本实施例所用菌株如下：
猪链球菌散发菌株：Stre08001、Stre08002、Stre09001、Stre09002、Stre11001、Stre11002、Stre13003、Stre13004、RA1、RA2、RA3(Loss of 89K Pathogenicity Island inEpidemic Streptococcus suis,China.Emerg Infect Dis.2016Jun；22(6):1126-7；人感染猪链球菌Ⅱ型菌株的毒力基因及分子分型特征分析.中国预防医学杂志.2016；17(3):202-206.)。
猪链球菌爆发菌株：SC19、05ZYH33和SC21(Draft Genome Sequence ofHypervirulent and Vaccine Candidate Streptococcus suis Strain SC19.GenomeAnnounc.2017Jan 19；5(3)；Theβ-galactosidase(BgaC)of the zoonotic pathogenStreptococcus suis is a surface protein without the involvement of bacterialvirulence.Sci Rep.2014Feb 21；4:4140；Trigger factor of Stre ptococcus suis isinvolved in stress tolerance and virulence.Microb Pathog.2011Jul-Aug；51(1-2):69-76.)。
其余菌株为本实验室分离的菌株。
(1)前处理：活化菌株，将菌落或离心得到的菌体加入50μL 20mM Tris-HCl振荡混匀，再于100℃中水浴10分钟，完成待检菌株前处理。
(2)猪链球菌的PCR扩增：
反应体系为：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待测菌液，无菌去离子水补足至25μL；
SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT，SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。
反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃温育5min。
(3)结果判读：
(3.1)电泳检测：从PCR反应管中取出5μL样品与1μL 6*loading buffer混匀后直接点样于0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶中，电泳后可在凝胶成像系统中观察。
本实施例将菌株分为了人源猪链球菌(图1)和猪源猪链球菌(图2)分别进行检测。
泳道1为阳性对照、泳道2为阴性对照，阳性对照是猪链球菌SC19；阴性对照是无菌去离子水。
结果如下：
图1中：泳道1、泳道4和泳道5为已知爆发菌株；泳道6-13和泳道16-18为已知散发菌株；其余泳道菌株为本实验室分离的菌株。
由图1中A可知，3株已知爆发菌株均扩出条带，11株已知散发菌株均未扩出条带，说明该检测引物能够区分爆发菌株和散发菌株且未出现漏检情况；
由本实验室自主分离的猪链球菌中，泳道21、23、24、25，均扩出条带，并且后期通过测序证实该4株菌株具有完整的89K毒力岛；泳道14、15、27扩出条带但不具有完整的89K毒力岛，推测该批菌株疑似爆发菌株，有待进一步研究；泳道3、19、20、22、26、28，均未扩出条带，推测该批菌株疑似散发菌株，有待进一步研究。
图2中：除泳道1阳性对照猪链球菌SC19和泳道2为阴性对照外，其余泳道菌株为本实验室分离的菌株。
结果分析：泳道3、4、5、7、8、9、10、11、12、14、15、17，均未扩出条带，推测该批菌株疑似散发菌株，有待进一步研究；泳道6、13、16、18，均扩出条带但不具有完整的89K毒力岛，推测该批菌株疑似爆发菌株，有待进一步研究。
说明该检测引物能够区分爆发菌株和散发菌株，无论是人源还是猪源均能准确区分，未出现漏检情况。
(3.2)显色反应：取出PCR反应管，加入1μL 10％(体积比)SYBR Green I的荧光染料，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应(图1中B、图2中B)。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应(图1中C、图2中C)。
实施例3：
引物SS-F和SS-R的特异性检测：
本实施例所用的菌株为：
1株猪链球菌菌株SC19(阳性对照)、2株沙门氏菌(ATCC13311、ATCC13076)、2株金黄色葡萄球菌(ATCC29213、ATCC6538)、2株大肠杆菌(83175、F18ac)、1株副溶血弧菌(ATCC33846)以及1株李斯特菌(ATCC19114)，共9株菌株。
(1)前处理：活化菌株，将菌落或离心得到的菌体加入50μL 20mM Tris-HCl振荡混匀，再于100℃中水浴10分钟，完成待检菌株前处理。
(2)猪链球菌的PCR扩增：
反应体系为：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待测菌液，无菌去离子水补足至25μL；
SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT，SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。
反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃温育5min。
(3)结果判读：
(3.1)电泳检测：从PCR反应管中取出5μL样品与1μL 6*loading buffer混匀后直接点样于0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶中，电泳后可在凝胶成像系统中观察。
其中图3中A中的泳道1为阳性对照、泳道2为阴性对照、泳道3-10为非猪链球菌菌株。除阳性对照菌株外的菌株均未扩出条带，说明该检测引物特异性良好。
阳性对照是猪链球菌SC19；阴性对照是无菌去离子水。
(3.2)显色反应：取出PCR反应管，加入1μL 10％(体积比)SYBR Green I的荧光染料，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应(图3中B)。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应(图3中C)。
实施例4：
引物SS-F和SS-R的灵敏度检测：
本实施例使用猪链球菌SC19进行检测。
(1)前处理：活化菌株，将菌落或离心得到的菌体加入50μL 20mM Tris-HCl振荡混匀，再于100℃中水浴10分钟，完成猪链球菌SC19的前处理。或使用基因组提取试剂盒提取猪链球菌SC19的基因组，将得到的基因组或是菌液进行梯度稀释，以用于以下引物灵敏度的检测。
(2)猪链球菌的PCR扩增：
反应体系为：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL猪链球菌SC19的不同浓度的菌液或基因组，无菌去离子水补足至25μL；
SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT，SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。
反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃温育5min。
(3)结果判读：
(3.1)电泳检测：从PCR反应管中取出5μL样品与1μL 6*loading buffer混匀后直接点样于0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶中，电泳后可在凝胶成像系统中观察。
由实验结果可知(图4中A、图5中A)，该检测引物可检测的SC19的最低菌液浓度为300CFU/μL、最低基因组浓度为74fg/μL，说明该检测引物灵敏度高。
阳性对照是猪链球菌SC19；阴性对照是无菌去离子水。
(3.2)显色反应：取出PCR反应管，加入1μL 10％(体积比)SYBR Green I的荧光染料，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应(图4中B、图5中B)。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应(图4中C、图5中C)。当猪链球菌SC19的菌液或基因组浓度较低时，在其PCR产物中加入荧光染料，在正常日光条件下呈橙红色但在紫外灯下可发出绿色荧光与电泳结果一致，说明在紫外灯下观察的结果更准确。
实施例5：
实施例1中的试剂盒在食品、动物疫病(病原)、公共卫生检测中的应用：
(1)前处理：将从被分别使用已知猪链球菌(散发菌株：RA1或爆发菌株：SC19)人工污染了的生肉、肉制品或其他食品以及动物的组织、血液或脑脊液中划线分离到的菌落，或者增菌液进行离心集菌。将菌落或离心得到的菌体加入含有50μL前处理液中振荡混匀，再于100℃中水浴10分钟，完成待检样品的前处理。
所述的前处理液为：20mM Tris-HCl；
(2)PCR扩增：
步骤1.根据待测样品个数，设置PCR反应管数N，N＝样品个数+2(含有1管阳性对照和1管阴性对照)；
所述的阳性对照为猪链球菌SC19；阴性对照为无菌去离子水。
步骤2.配制PCR反应体系：2.5μL 10×EasyTaq Buffer(200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、200mM KCl、20mM MgSO4)、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶(5units/μL)、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待测样品，无菌去离子水补足至25μL；
步骤3.依次向反应管中分别加入1μL阳性对照、阴性对照和待检样品，盖紧管盖并做好相应标记；
步骤4.PCR扩增过程。置于PCR仪上进行DNA扩增，94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃温育5min。
(3)结果判读：两种判定方法选其一则可。
(3.1)电泳检测：从PCR反应管中取出5μL样品与1μL 6*loading buffer混匀后直接点样于0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶中，电泳后可在凝胶成像系统中观察。使用已知猪链球菌爆发菌株污染的样品PCR扩增均得到了对应分子量大小的条带；使用已知猪链球菌散发菌株污染的样品PCR扩增均没有条带。说明该检测试剂盒能够很好地区分爆发菌株和散发菌株。
(3.2)显色反应：取出PCR反应管，依次加入1μL显色液，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应。
上述的一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测试剂盒在各种超市或出入境的生猪肉、猪内脏以及腊肉、熏肉、灌肠等各种猪肉制品中检测，其他疑似被污染的食品(猪链球菌有可能从肉类交叉污染到各种制品和蔬菜上)都可以通过该方法进行检测，检测的是病原。
上述的一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测试剂盒对疑似被猪链球菌感染的猪和人可以检测，检测的是病原。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用
<130> 一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taactgatac gcttggat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agattccgca tttcctcc 18

Claims (2)

1.一种区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株的检测引物，所述的引物为：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。
2.权利要求1所述的引物在制备区分猪链球菌爆发菌株和散发菌株试剂盒中的应用。
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CN101294144A (zh) * 2008-01-25 2008-10-29 中国人民解放军第三军医大学 2型猪链球菌sa1KR基因敲除突变株及其制备方法和应用
CN101440400B (zh) * 2008-12-04 2011-04-06 浙江省疾病预防控制中心 含89k毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法
CN102312013B (zh) * 2011-10-11 2013-08-14 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 检测2型猪链球菌89k毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量pcr方法及试剂盒
CN104404132B (zh) * 2014-10-14 2016-02-24 华中农业大学 一种猪链球菌2型的ss2-lamp检测试剂盒及应用

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