JP6544847B2 - 食品試料における志賀毒素産生大腸菌（ｓｔｅｃ）の存否を決定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、食品試料における志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）の存否を決定する方法、そのような方法に使用される反応カートリッジ、及び反応カートリッジを収容するための装置に関する。

ＳＴＥＣの菌株の中で、７つの血清群（即ち、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５）が、ヒトの重度の疾患と関連していることが確認されている。これらの血清群は、以下において、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７として称する。アメリカ合衆国農務省（ＵＳＤＡ）は、血清群Ｏ１５７に加えて上記で特定した６つのさらなる血清群を混和物として規定する、ある種の生の牛肉製品の分析に適用できる規制を実行している。

ＳＴＥＣのこれらの菌株の存否を決定する場合、一般的には、大腸菌が成長できる培養培地に食品試料を加えて、大腸菌の保存培地を生成する。

その後、保存培地中で大腸菌を溶解させることによって、大腸菌ＤＮＡ含有試料溶液を供給する。

次いで、試料中の上述した血清群を従来の方法を用いて、信頼のおける手法で検出するには時間がかかる。

主なＳＴＥＣの病原性遺伝子であるｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｅａｅ及び血清群特異的遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用は、ＩＳＯ１３１３６技術仕様書（ＩＳＯ／ＴＳ１３１３６：２０１２）の通りである。異なる遺伝子が、異なる菌株に属し得、偽陽性の結果に至ることがあるので、ＰＣＲの陽性試料は培養法で確認しなければならない。

本発明の目的は、より短い期間内で、食品試料における病原性ＳＴＥＣの存否に関して信頼のおける結果を導く方法を提供することである。

この目的は、請求項１に記載された方法によって解決される。

驚くことに、特定のワークフローのために、本発明による方法は、偽陽性の結果の割合の減少及びコロニーの分離の最適化の両方を可能にする。その結果、食品試料における志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）の１つ又は複数の特定の血清群の存否を決定することは、非常に単純化できる。

より詳細には、本発明は、培養培地中で食品試料をインキュベートすることによって、大腸菌の保存培地を得、保存培地に含まれる大腸菌を溶解させた後に、このＤＮＡ含有試料溶液に対して、特異的なプライマーを用いる第１の一連のＰＣＲを行う、食品試料において病原性が高いＳＴＥＣの存否を時間的に大変効率よく同定する方法及び確認する方法を提供する。これを第１のスクリーニングステップと呼ぶことがある。この第１のスクリーニングステップは、志賀毒素をコードするｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２病原性遺伝子、１つ又は複数の血清群に特異的に関連するインチミンをコードするｅａｅサブタイプ、並びに、各血清群のバイオマーカー遺伝子の同時検出を可能にする。

続いて、仮定に基づく陽性試料を確認しなければならないであろう。

ｅａｅサブタイプの検出により、偽陽性試料の数を大幅に減少することができる。

好ましい実施形態では、陽性試料に対して第２のスクリーニングステップを行い、大腸菌の保存培地に由来する免疫濃縮物をＰＣＲ分析で再度チェックする。

この第２のスクリーニングステップが陽性結果を生じる場合、免疫濃縮物の一部を色素培地に蒔いて、各ＳＴＥＣ菌株をコロニーとして分離する。

これらの分離されたコロニーに由来するＤＮＡに対してＰＣＲ試験を行って、ｓｔｘ及びｅａｅ病原性遺伝子の両方、並びに、任意選択で血清群バイオマーカー遺伝子の存在を確認してもよい。

陰性試料の場合、食品試料から始めて約１２時間以内に最終結果を入手することができる。陽性試料の場合、約２日間で、最終結果を入手することができる。

さらに、本発明は、上述した本発明の方法にて用いられるように設計された、請求項１３に記載の反応カートリッジに関する。

本発明の別の態様は、請求項１５にて定義された装置に属する。

好ましくは、本発明の方法は、
ＳＴＥＣの各血清群に対する抗体を用いて、各血清群に対してインキュベートした食品試料を有する培養培地の免疫濃縮を行うステップ；
免疫濃縮物からＤＮＡを分離するステップ；及び
下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、
各血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び
任意選択で、各血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子
を増幅させるプライマーを用いて、ＤＮＡに対して第２の一連のＰＣＲを行うステップ
を含む、ＳＴＥＣの１つ又は複数の特定の血清群の存在の確認するステップを含む。

さらに好ましくは、第２の一連のＰＣＲにて、ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２並びにｅａｅ遺伝子が増幅される場合、ＳＴＥＣの１つ又は複数の特定の血清群の存在を確認するステップが、
免疫濃縮物を色素培地に蒔いて、分離した大腸菌のコロニーを成長させ得るステップ；
分離したコロニーからＤＮＡを分離するステップ；及び
下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、
各血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び
任意選択で、各血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子
を増幅させるプライマーを用いて、ＤＮＡに対して第３の一連のＰＣＲを行うステップ
をさらに含む。

好ましくは、一連のＰＣＲは、増幅した遺伝子又はその断片の検出を可能にする特異的な特定の標識ＤＮＡプローブを用いて行われる。

本発明によれば、決定される特定の血清群（複数可）は、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５から選択されることが好ましい。

本発明の方法は、特定の血清群の１つ又は複数を同定し得るが、より好ましくは、この方法は、１つのステップで、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５の全ての血清群の存否を決定することを含む。

一連のＰＣＲにて増幅されるｅａｅ遺伝子のサブタイプは、Ｏ２６のｅａｅ−β、Ｏ１４５及びＯ１５７のｅａｅ−γ、Ｏ４５、Ｏ１０３及びＯ１２１のｅａｅ−ε、並びに、Ｏ１１１のｅａｅ−θから選択されることがさらに好ましい。

本発明の方法を実行する場合、特異的なバイオマーカー遺伝子は、各血清群のＯ抗原トランスポーター遺伝子から選択されることが好ましい。

本発明の方法は、広範囲の食品試料に適応できるが、食品試料は、生肉、生乳製品、又は、生の野菜製品、特に、スプラウトから選択されることが好ましい。

インキュベーションステップに用いられる培養培地は、任意選択でアクリフラビンを含む緩衝ペプトン水；任意選択でノボビオシンを含むトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）；及び、任意選択でノボビオシンを含む改変トリプチックソイブロス（ｍＴＳＢ）から選択されることが好ましい。

本発明の方法は、ＰＣＲに用いるデバイスが自動的評価及び最終結果の表示をすることができるように、それぞれの一連のＰＣＲを自動化した手法にて同時に行うことが好ましい。

本発明の方法の好ましい変形形態に従うと、免疫濃縮に用いられる抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体から選択される。

免疫濃縮物を蒔くために用いられる色素培地は、セフィキシム亜テルル酸ソルビットマッコンキー培地（ＣＴ−ＳＭＡＣ）；ノボビオシン、セフィキシム三水和物及び亜テルル酸カリウムを含む改変レインボーアガー（ｍＲＢＡ）；トリプトン胆汁酸Ｘ−グルクロニド培地（ＴＢＸ）；並びに、セフィキシム亜テルル酸ラムノースマッコンキー培地（ＣＴ−ＲＭＡＣ）から選択されることが好ましい。

本発明はまた、本発明の方法にて用いられるように特に構成された反応カートリッジに関する。

このような反応カートリッジは、ＤＮＡ含有試料溶液に対して一連のＰＣＲを行うために設計されており、複数の反応チャンバ及びリザーバを備える。試料溶液は、リザーバに供給し、各反応チャンバをリザーバに接続する導管を通して、反応チャンバへ均一に分配することができる。反応チャンバの少なくとも一部に、下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、
Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５から選択される１つ又は複数の血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び
任意選択で、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５から選択される１つ又は複数の血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子
を増幅させるプライマー及びプローブがプレロードされている。

さらに、本発明はまた、一連のＰＣＲを自動的に行うための装置に関し、この装置は、上述した反応カートリッジを収容するよう構成されている。装置は、
各プローブを用いて増幅された大腸菌遺伝子を検出するための検出手段；
ＰＣＲの実行を制御するための制御手段であって、ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、その血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び、任意選択で、その血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子の検出結果に応じて各血清群に対して最終結果が生じるように、アルゴリズムに従って、検出された大腸菌遺伝子を評価することができるソフトウェアが格納されている、制御手段；及び
各血清群の最終結果を、光学的に及び／又は音響的に示す表示手段
を備える。

本発明の前述した態様及び利点を、図面及び具体例と併せて以下にさらに詳細に開示する。

先行技術の方法（ＩＳＯ１３１３６技術仕様書）と比較した本発明の方法を示す； 他の先行技術の方法と比較した本発明の方法を示す； 本発明によるＰＣＲ分析のための装置の概略図を示す； 本発明のＰＣＲ反応カートリッジの断面図を示す； 本発明のＰＣＲ反応カートリッジの上面図を示す； ＰＣＲの結果の関数として最終結果を生じさせるためのアルゴリズムのフローチャートを示す。

ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７と表題を付した図１の左側に、本発明の方法の好ましいワークフローを示す。右側には、ＩＳＯ／ＴＳ１３１３６：２０１２に相当する従来のワークフローを示す。
どちらの方法も、結果的に富栄養試料（大腸菌の保存培地）となる、大腸菌が成長できる培養培地にてインキュベートされた食品試料を用いるところから始まる。

その後に、培養培地中で成長した大腸菌の溶解が、例えば、９６本のチューブの溶解プレート（図示せず）にて行われ、大腸菌ＤＮＡ含有試料溶液を得る。

ここまで、手順は本発明の方法及び従来のワークフローにおいて同じである。

本発明のワークフローによれば、試料溶液を、特定の大腸菌遺伝子又はその断片を増幅させるプライマー及びプローブを用いて、第１の一連のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかける。図１に示すように、ワークフローは、このステップにて、Ｔｏｐ７全て、即ち、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５のそれぞれのｅａｅバリアント（サブタイプ）及びバイオマーカー遺伝子の増幅を含む。これらの血清群のいずれも存在しない場合、本発明のワークフローは、約１２時間以下（インキュベーション及び溶解に約１１時間及びＰＣＲに約１時間）の期間内に終了する。

陽性結果が報告された場合、１つ又は複数の各血清群のＳＴＥＣに対する抗体を用いて、大腸菌の保存培地の免疫濃縮物を調製し、続いて、
免疫濃縮物からＤＮＡを分離し；
下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、
各血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び
任意選択で、各血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子
を増幅させるプライマーを用いて、ＤＮＡに対して第２の一連のＰＣＲを行う。

陰性結果が得られた場合、ワークフローを終了し得る。

陽性結果が得られた場合、免疫濃縮物を、さらに色素培地に蒔き、分離した大腸菌のコロニーを成長させることができる。さらなるステップにて、分離されたコロニーからＤＮＡを分離し、大腸菌遺伝子又はその断片を増幅させるプライマーを用いて、第３の一連のＰＣＲが行われる。それによって、病原性ＳＴＥＣの血清群が同定され得る。その場合、最終結果は、約２日以内にて入手することができる。

従来のＩＳＯ／ＴＳ１３１３６：２０１２によるワークフローは、第１のスクリーニングがｓｔｘ及び一般的なｅａｅ遺伝子に対して行われる点で、本発明の方法とは異なる。第２のスクリーニングステップにて、ＳＴＥＣのＴｏｐ５のみが対象とされるのに対して、本発明の方法では、Ｔｏｐ７の血清群を全て対象にし得る。

従来のワークフローは第１の段階にて陰性結果のみが得られる場合、約２４時間必要である。陽性結果を確認しなければならない場合、ワークフローは約４日間かかる。

図２は、陰性結果のみが得られる場合に約２４時間、陽性結果を確認するために約３日間必要である、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳ−Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、第３版、１９９８（ＭＬＧ５＆ＭＬＧ５Ｂ．０１）によって提案された方法と比較して、本発明の方法を示す。

図３は、本発明の方法のＰＣＲを実行するのに適している装置１０の概略図を示す。

装置１０は、複数の反応チャンバ又はウェル１４をその外周に備えた望ましくは円盤状の形状の反応カートリッジ１２、及び中央にリザーバ１６を備え、反応チャンバ１４は、放射状に広がる溝１８を介してリザーバと接続されている。

以下では「ジーンディスク（ＧｅｎｅＤｉｓｃ）」ともいうこのような好ましい反応カートリッジ１２を図４及び図５によってさらに詳細に示す。

反応カートリッジ１２のウェル１４の典型的な数は３６である。ウェル１４は、複数のセクター１９、例えば６つのセクターにグループ分けされ得る（ジーンディスクセクターともいう）。セクター１９のグループのウェル１４は、個々の溝１８を介して、リザーバ１６の共通隔壁２２と接続され得る。

そのようなカートリッジ１２は、本発明のカートリッジを提供するために改良され得、反応チャンバ１４の少なくとも一部に、ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、並びに、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５から選択される１つ又は複数の血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、又はそれぞれの遺伝子の断片を増幅させるプライマー及びプローブがプレロードされている。また、反応チャンバ１４は、１つ又は複数のこれら血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子を増幅させるためのプライマー及びプローブがプレロードされていることが好ましい。

装置１０は、望ましくは環状の加熱デバイス２４をさらに備え、加熱デバイス２４は、４つの異なる温度まで加熱され得る、４つの異なるゾーン（このうち３つのゾーン２６、２７、２８は見ることができる）を備えている。反応カートリッジ１２は、加熱デバイス２４の上面に設置される。反応カートリッジ１２のウェル１４は、加熱デバイス２４の近く又は接触して配置される。

装置１０は、反応チャンバ又はウェル１４の温度の周期変動を可能にするように、加熱デバイス２４に対して反応カートリッジ１２を回転させるための手段３０を備える。

加熱デバイス２４の各ゾーンの温度は、均一とすることができ、又は、必要であれば、温度は、勾配に沿って変化させることができる。

装置１０は各周期について、反応チャンバ１４の内容物の蛍光を励起し、測定するために、反応カートリッジ１２の上側に配置された蛍光励起検出手段３２をさらに備える。

このような装置１０は、国際公開第２００２／００９８７７号パンフレットに詳しく開示されており、ジーンディスクサイクラー（パールジーンディスク技術）として利用することができる。

通常、それぞれのＰＣＲサイクルは、ウェルを約９５℃の温度まで加熱して、標的ＤＮＡを変性させる第１段階、次いで、プライマーのアニーリングのために約５５℃〜約６５℃の温度を有する第２段階、及び、標準的には約７２℃で行われる、ＤＮＡ鎖の伸長のための第３段階を必要とする。しかし、本発明の方法によれば、各サイクルが２つの異なる温度だけを必要とする、アニーリング及び伸長が同じ温度で行われる簡易化されたサイクルを用いてＰＣＲが行われ得る。装置１０の加熱デバイス２４の個々のゾーンは、そのような温度を実現するように設定する。

好ましくは、増幅させる標的配列に対して特異的なプライマー及びプローブを反応チャンバ又はウェル１４に予め分配する。リザーバ１６又はその隔壁は、プライマー及びプローブを例外として、分析する核酸の試料及びポリメラーゼ連鎖反応増幅のために必要な試薬からなる液体を受け取ることを意図している。

好ましい変形形態では、分析する核酸の試料及びＰＣＲのために必要な試薬を含有する液体を、リザーバから、増幅させる標的核酸配列に対して特異的なプライマー及びプローブを含む複数の反応チャンバへ分配することが可能であり、並びに、反応チャンバ１４、及び、異なる温度まで加熱し得る４つの異なるゾーンを具備する加熱デバイス２４を備える反応カートリッジ１２の周期的な相対運動の手段により、反応チャンバの内容物を、複数回、異なる温度に途切れることなく連続的にさらすこと（即ち、これらは、変性、アニーリング及び伸長に必要である）によって増幅プロセスを引き起こすことが可能である。

必要であれば、反応チャンバ１４は、上述したプライマー以外にリアルタイムＰＣＲに必要な試薬を収容し得る。装置の好ましい実施形態においては、反応チャンバ１４はまた、プライマーに加えて、増幅させる配列に対して特異的な１つ又は複数のプローブを含む。反応チャンバ１４におけるプローブの分布は、ある反応チャンバが増幅させる配列に対して特異的なプローブを含み、他の反応チャンバが増幅させる配列を推測的に認識しない制御プローブを含むことも可能である。これらのプローブは標識することができ、複数のプローブ（例えば、増幅させる配列に対して特異的なプローブ及び制御プローブ）が１つの同じ反応チャンバに存在する場合、これらのプローブは、異なる蛍光色素分子を用いて標識することが好ましい。

好ましくは、ＰＣＲは、自動化した方法で、即ち、反応カートリッジ１２が装置１０に挿入された後、使用者が操作する必要なしに、装置１０によって、実行され、評価されることが好ましい。蛍光標識プローブを用いて、増幅した配列は上述した検出手段３２によって検出され得、それぞれの増幅した配列の結果は、使用者に表示され得る。

好ましい実施形態では、装置１０は、本発明に従って変更され、ＰＣＲの実行を制御するだけでなく、検出手段３２によって検出された増幅した配列を評価し、使用者に最終結果を提供する働きもする制御手段をさらに備える。

本発明の方法が行われる場合、ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２、血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び任意選択で血清群に対して特異的なバイオマーカー遺伝子の検出結果に応じて、各血清群に対して、変更した装置１０によって最終結果が生じるように、検出された大腸菌遺伝子に相当する検出手段３２からの入力信号がアルゴリズムに従って評価される。

変更した装置１０により実行される好ましいアルゴリズムの簡易化したフローチャートを図６に示す。この場合、与えられた血清群のｓｔｘ、ｅａｅバリアント（サブタイプ）、及びバイオマーカー遺伝子に対するＰＣＲの結果が評価される。ＰＣＲの結果は、「陽性」、「陰性」又は「使用不可」となり得る。ｅａｅ遺伝子及びバイオマーカー遺伝子に対するＰＣＲの結果がどのようなものであっても、志賀毒素をコードするｓｔｘ遺伝子に対するＰＣＲの陰性結果が陰性の最終結果をもたらすために、このアルゴリズムにおいては、志賀毒素をコードするｓｔｘ遺伝子は優先標的である。最終結果が「陽性」（ＳＴＥＣが存在する）、「陰性」（ＳＴＥＣが存在しない）又は「無効」（分析が繰り返されるべき場合）となり得る。陽性の最終結果は、３つ全ての標的遺伝子に対するＰＣＲの陽性結果を必要とする。

アルゴリズムは、本発明に従って、変更された装置１０の制御手段に格納されたソフトウェアによって行われる。

本発明の装置１０は、例えば、光学的に及び／又は音響的に示す（例えば、それぞれのＳＴＥＣの血清群の最終結果を表示する）表示手段（図示せず）である表示器をさらに備える。

試料の調製
４１．５±１℃で予め温めておいた、大腸菌が成長可能な従来の培養培地（例えば、緩衝ペプトン水）で、志賀毒素産生大腸菌の１つ又は複数の特定の血清群の存否を検査する食品試料をインキュベートし、富栄養試料（大腸菌の保存培地）を生じた。水で２０重量％に希釈したキレックス（Ｃｈｅｌｅｘ）１００を５００μＬ予め充填させた９６本のチューブを備えている予め充填された溶解プレートに、富栄養試料の一部である５０μＬを移した。アルミニウム板を用いてチューブに封をした後に、１０２±２℃まで予め加熱された熱いブロック（ｔｈｅｒｍａｌ ｂｌｏｃｋ）の中に、溶解プレートを１０分間置いた。溶解ステップが完了したら、アルミニウム板にチップを用いて穴を開け、６セクターディスク反応カートリッジへ移す溶解物の３６μＬのポーションを回収する。

後の検査ステップで使用するために、大腸菌の残りの保存培地を５±３℃で保存する。

ジーンディスク（ＧｅｎｅＤｉｓｃ）ＰＣＲ分析
溶解物を室温で５分間置き、次いで反応カートリッジに（即ち、１つの試料を１つのセクターに）投入する。このＳＴＥＣ Ｔｏｐ７ジーンディスクの各セクターは、１４個の標的遺伝子の検出を可能にする乾燥させたプライマー及びプローブを含む６つの個々のウェルを備える（血清群がそれぞれのバイオマーカー遺伝子を表す、表１及び表２を参照のこと）。

それぞれのウェルが２つ又は３つの遺伝子の増幅に用いられ得るように、蛍光色素分子（レポーター）ＦＡＭ（＝カルボキシフルオレセイン）及びＲＯＸ（＝カルボキシローダミン）の２つのうち１つを用いて標識化したプローブを用いることによって、ＰＣＲの生成物の蛍光検出を可能にする。

各試料について、ジーンディスクサイクラーに対して作動するソフトウェアによるアルゴリズムに従って、蛍光検出によって得られる、異なる標的遺伝子のＰＣＲの結果を評価する。表３は、得られた血清群のＰＣＲの結果の関数としてアルゴリズムの結果を示す。ｅａｅ遺伝子及びバイオマーカー遺伝子に対するＰＣＲの結果がどのようなものであっても、これら遺伝子のＰＣＲの陰性結果が陰性の最終結果をもたらすように、このアルゴリズムにおいては、ｓｔｘ１及びｓｔｘ２が優先標的である。

使用者が自ら、単一遺伝子のＰＣＲの結果を評価する必要がないように、完全に自動化されたＰＣＲの評価は、検出されたＳＴＥＣ Ｔｏｐ７の血清群のそれぞれの最終結果を示すことができ、特に表示することができる。最終結果は、色コードとして、即ち、ＳＴＥＣの血清群が存在しないと緑、ＳＴＥＣの血清群が存在すると赤、及び、無効の結果（分析が繰り返されるべき場合）に対して灰色として、表示されることが好ましい。

抑制制御のさらなる評価は、１：１０の希釈の後に分析が繰り返されるべき場合、ＰＣＲの抑制剤が試料溶液中に存在することを示し得る。

免疫濃縮−ＰＣＲ（ＩＭＣ−ＰＣＲ）
ジーンディスク分析にてＰＣＲが陽性結果の場合、推定される陽性のＳＴＥＣ Ｔｏｐ７の１つに対して特異的な抗体と共に、１００μＬ〜１ｍＬの富栄養試料をインキュベートし、免疫濃縮物を調製した。１〜４回の洗浄ステップの後、０．０５重量％のトゥーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢＳを用いて、濃縮された細胞（免疫濃縮物）を溶離した。細胞の半分をＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクプレートを用いたＰＣＲ分析に使用する。標的遺伝子に対して陽性結果の場合、特定の色を生じるアガー培地に、細胞の残りの部分を蒔く。最終確認のために、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクを用いて、６つまで分離されたコロニーを検査する。

生牛肉（２５ｇ及び３７５ｇ）及び生乳製品（２５ｇ）に対して、本発明の方法（以下、「ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクの方法」ともいう）で検査した。

実施例１：生牛肉（２５ｇ）
フランスの９２地方行政区画のスーパーマーケットにて収集した２，４７６の新鮮な牛ひき肉の試料に対して、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクの方法を評価した。各試料２５ｇを２２５ｍＬの緩衝ペプトン水と混合し、次いで、３７℃で１８時間〜２４時間インキュベートした。ＰＣＲスクリーニングの後に、ＩＳＯ１３１３６技術仕様書の提言に従って、直接焼き付けによって、ＰＣＲの陽性試料から細菌分離を行った。この研究の目的は、一般的なｅａｅ遺伝子の代わりに、ｅａｅバリアント（サブタイプ）を含むＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のスクリーニング法と、ＩＳＯ１３１３６技術仕様書（ｓｔｘ、ｅａｅ及び血清群）に記載されたスクリーニング法を比較することである。結果を表４にて報告する。

この実施例は、血清群をコードする遺伝子に関連するｅａｅバリアント遺伝子及びｓｔｘ遺伝子に対する第１のスクリーニングによって、ＰＣＲの陽性試料の数を８４から２９へ著しく減少することができることを証明する。実際、ＩＳＯ１３１３６の方法及びジーンディスクＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクの方法のＰＣＲの陽性試料の割合は、それぞれ３．４％及び１．２％であった。

実施例２：生乳製品（２５ｇ）
１，０７２の生乳試料及び３７６の生乳チーズを含む１，４４８個の生乳製品に対して、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクの方法を評価した。各試料２５ｇを、ノボビオシン（１０ｍｇ／Ｌ）を補った２２５ｍＬの緩衝ペプトン水で希釈した。試料を３７℃で１８時間±２時間インキュベートした。この実施例の目的は、一般的なｅａｅ遺伝子の代わりに、ｅａｅバリアントを含むＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のスクリーニング法と、ＩＳＯ１３１３６技術仕様書（ｓｔｘ、ｅａｅ及び血清群）に記載されたスクリーニング法を比較することであった。結果を表５にて報告する。

この結果は、第１のスクリーニングにてｅａｅバリアント遺伝子を検出することによって、生乳試料及び生乳チーズでそれぞれ３３．６％及び３５．０％までＰＣＲの陽性試料の割合を減少することができることを再び示した。ＩＭＣ−ＰＣＲに基づく、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７の方法の第２のスクリーニングのステップは、生乳試料及び生乳チーズ試料でそれぞれ７５．７％及び６５．３％まで仮定に基づく陽性試料の著しい減少を引き起こし、多くの試料において、異なる標的遺伝子が、異なる大腸菌の菌株によって実施されるべきことを示している。

実施例３：生牛肉（３７５ｇ）
方法全体の評価も、ＵＳの全域の４つの施設にて加工された４００の牛ひき肉の試料及び１５０のひき肉用牛肉の試料を含む、３７５ｇの生牛肉の試料であると理解した。本発明のジーンディスクの方法をＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ ＭＬＧ ５Ｂ．０１の方法と比較した。各試料の３７５ｇを１．５ＬのｍＴＳＢ又は９７５ｍＬのノボビオシンを含むｍＴＳＢ（ｍＴＳＢｎ）にて希釈した。試料を４２℃でインキュベートした。インキュベートする時間は、富栄養培養液に依存した：ｍＴＳＢでは１２時間、ｍＴＳＢｎでは１５時間であった。仮定に基づく陽性試料を参照方法（ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ ＭＬＧ５＆５Ｂ．０１）に従って確認した。結果を表６にて報告する。

４００の牛ひき肉の試料の中で、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクの方法を、富栄養ｍＴＳＢｎからの仮定に基づく陽性試料１つだけに行った。この仮定に基づく結果を培養方法によって確認した。ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ方法は、９つの陽性の可能性のある試料を検出した。１つのみが培養方法によって確認された。ＳＴＥＣのＯ１５７を用いて自然に汚染させた試料は、どちらの方法によっても検出され、培養によって確認された。

１５０のひき肉用牛肉の試料の中で、ジーンディスクの方法は、培養方法によって確認された、ｍＴＳＢ又はｍＴＳＢｎのいずれかで富栄養化させた陽性の可能性がある１つの試料を検出した。ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ ＭＬＧ５Ｂ．０１の方法により確認されなかった、ｍＴＳＢｎで富栄養化された陽性の可能性がある他の１つの試料を検出した。さらに興味深いことに、培養によって確認されたジーンディスクの方法による仮定に基づく陽性試料は、ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳ ＭＬＧ５Ｂ．０１の方法のＰＣＲのスクリーニングによって検出されなかった。

ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７のジーンディスクの方法及び参照方法は、それぞれ２及び１０の仮定に基づく陽性試料が結果として得られた。試料全てを培養による確認をすることによって、ＳＴＥＣ Ｔｏｐ７の分離物３つが得られ、このうち２つは、ジーンディスクの方法による仮定に基づく陽性試料として得られた（Ｏ１５７及びＯ２６）。参照方法によって得られた仮定に基づく陽性試料のうち、１つだけが確認された（Ｏ１５７）。
ジーンディスクの方法及びＵＳＤＡ−ＦＳＩＳの方法の有病率は、それぞれ０．３６％及び１．８２％であった。

表７は、本発明の方法とＩＳＯ／ＴＳ１３１３６：２０１２の方法との大きな違いの概要を説明する。

Claims (11)

1. 食品試料における病原性志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）の１つ又は複数の特定の血清群の存否を決定する方法であって、該方法が、
   （１）大腸菌が成長可能な培養培地中で食品試料をインキュベートして、大腸菌の保存培地を得るステップ、
   （２）保存培地中の大腸菌を溶解させて、大腸菌ＤＮＡ含有試料溶液を得るステップ、
   （３）下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
   （ｉ）志賀毒素１をコードするｓｔｘ１及び／若しくは志賀毒素２をコードするｓｔｘ２、
   （ｉｉ）決定する各ＳＴＥＣの血清群のための、インチミンをコードする血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ、及び
   （ｉｉｉ）決定する各ＳＴＥＣの血清群のための、その血清群に特異的なバイオマーカー遺伝子
   を増幅させるプライマーを用いて、試料溶液に対して第１の一連のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップ、
   並びに、
   （４）前記第１の一連のＰＣＲにおいて、ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２並びに少なくとも１つの血清群のためのｅａｅ遺伝子及び特異的なバイオマーカー遺伝子が増幅される場合：
   大腸菌の保存培地の濃縮物に対して第２の一連のＰＣＲを行うことによって、ＳＴＥＣの１つ又は複数の特定の血清群の存在を確認するステップ
   を含み、
   前記ＳＴＥＣの１つ又は複数の特定の血清群の存在を確認するステップが、
   （ａ）ＳＴＥＣの各血清群に対する抗体を用いて、各血清群に対して大腸菌の保存培地の免疫濃縮を行うステップ、
   （ｂ）免疫濃縮物からＤＮＡを分離するステップ、及び、
   （ｃ）下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
   （ｉ）ｓｔｘ１及び／若しくはｓｔｘ２、及び
   （ｉｉ）各血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ
   を増幅させるプライマーを用いて、ＤＮＡに対して前記第２の一連のＰＣＲを行うステップ
   を含む、方法。
2. 第２の一連のＰＣＲにて、ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２並びにｅａｅ遺伝子が増幅される場合、前記ＳＴＥＣの１つ又は複数の特定の血清群の存在を確認するステップが、
   （ｄ）免疫濃縮物を色素培地に蒔いて、分離した大腸菌のコロニーを成長させ得るステップ、
   （ｅ）分離したコロニーからＤＮＡを分離するステップ、及び
   （ｆ）下記の大腸菌遺伝子又はその断片：
   （ｉ）ｓｔｘ１及び／若しくはｓｔｘ２、及び
   （ｉｉ）各血清群のｅａｅ遺伝子のサブタイプ
   を増幅させるプライマーを用いて、ＤＮＡに対して第３の一連のＰＣＲを行うステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 色素培地が、セフィキシム亜テルル酸ソルビットマッコンキー培地（ＣＴ−ＳＭＡＣ）；ノボビオシン、セフィキシム三水和物及び亜テルル酸カリウムを含む改変レインボーアガー（ｍＲＢＡ）；トリプトン胆汁酸Ｘ−グルクロニド培地（ＴＢＸ）；並びに、セフィキシム亜テルル酸ラムノースマッコンキー培地（ＣＴ−ＲＭＡＣ）から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 一連のＰＣＲが、増幅された遺伝子又は断片の検出を可能とする特異的な標識ＤＮＡプローブを用いて行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 決定される特定の血清群（複数可）が、Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１１１、Ｏ１２１及びＯ１４５の全ての血清群の存否を決定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
7. 一連のＰＣＲにおいて増幅されるｅａｅ遺伝子のサブタイプが、Ｏ２６のｅａｅ−β、Ｏ１４５及びＯ１５７のｅａｅ−γ、Ｏ４５、Ｏ１０３及びＯ１２１のｅａｅ−ε、並びに、Ｏ１１１のｅａｅ−θから選択される、請求項５又は６に記載の方法。
8. 特異的なバイオマーカー遺伝子が、各血清群のＯ抗原トランスポーター遺伝子から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 食品試料が、生肉、生の乳製品、又は、生の野菜製品から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. インキュベーションステップでの培養培地が、緩衝ペプトン水；トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）；及び、改変トリプチックソイブロス（ｍＴＳＢ）から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. それぞれの一連のＰＣＲが、自動化手法にて同時に行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

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