CN111548950A - 一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法 - Google Patents

一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，属于微生物技术领域。该方法主要包括细菌培养、细菌纯化、细菌鉴定和细菌保藏四个步骤。该方法简单、耗时短，成本低，鉴定结果准确、可靠。其中细菌培养及纯化依次采用EC肉汤培养基、伊红美蓝琼脂培养基和两次麦康凯琼脂培养基，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离；细菌鉴定主要包括：LB平板菌落形态初筛，扩增stx1或stx2基因阳性，扩增16s rDNA并将阳性扩增产物进行双向测序，最后将测序结果与NCBI数据库进行比较，最终确认纯化结果。

Description

一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法
技术领域
本发明微生物检测分离技术领域，具体涉及一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法。
背景技术
产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)是近年来发现的一种重要的并且能够引起人类潜在致命性疾病的食源性致病菌。人们感染STEC通常由于进食生的或未熟的肉类、生牛奶或被污染的蔬菜水果，也有在屠宰牲畜和生肉加工时被感染。被感染的人们常常伴有腹泻、出血性肠炎(Hemorrhagiccolitis，HC)等症状，并且容易引起继发性的溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)，严重可引发人类死亡。而感染STEC的主要宿主是反刍动物尤其是牛。但是牛缺乏志贺毒素受体，即使感染STEC后也不会出现临床症状，多表现为健康带菌，因此不少国家都很重视对动物，特别是牛群中STEC感染情况的流行病学调查。
为了解陕西省某奶牛场STEC的污染情况，我们对不同年龄及产量的奶牛的新鲜粪便进行了收集。在对牛粪样本STEC菌株分离时，我们发现stx1/2基因扩增为阳性的菌株，常常被一种菌膜覆盖，经初步判断怀疑STEC菌株被变形杆菌所污染。为了解STEC菌株的污染情况及菌株的分子特性，将被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌进行有效的纯化，是一个需要解决的问题。
因此，为了得到单一的STEC菌株，我们对被污染的STEC菌株进行纯化。鉴定步骤为：细菌培养→伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→LB平板活化→观察菌落形态初步鉴定→stx1/2基因鉴定→16s rDNA鉴定。该方法操作简单，菌落形态清晰，便于挑取分离，成本较低且准确性高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，可以快速、准确的将产志贺毒素大肠埃希氏菌从污染菌株中分离。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，具体按照以下步骤实施：
S1：细菌培养，将被污染的菌株接种于EC肉汤培养基中，过夜培养，备用；
S2：细菌纯化：将S1中培养后的细菌进行如下处理：伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→LB平板活化→纯化结果初步鉴定；
S3：细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16s rDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；
S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。
作为本发明进一步的方案：所述的S1中，每1ml无菌EC肉汤培养基中加入2～4μL菌液，培养温度为40～42℃，转速为180～220rpm，培养时间为18～24h。
作为本发明再进一步的方案：所述S2的详细步骤为：
S2.1，利用伊红美蓝平板选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于伊红美蓝平板，尽可能多的划出单菌落，35～37℃，培养18～24h；
S2.2，利用麦康凯平板首次纯化，
挑取S2.1中伊红美蓝平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；
S2.3，麦康凯平板二次纯化，
挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；
S2.4，LB平板活化，
挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于LB平板，尽可能多的划出单菌落；
S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，
观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖；若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验；若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。
作为本发明再进一步的方案：所述S2.1～S2.4中所述培养温度为35～37℃，培养时间都为18～24h。
作为本发明再进一步的方案：所述S3具体的鉴定方法为：
S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定，
S3.2，对S2中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，
S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S3.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤S3.1中的stx1/2基因鉴定的步骤为：
S3.1.1，DNA模板的制备；
S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275 μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；
S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
作为本发明再进一步的方案：所述的S3.2中16s rDNA鉴定的步骤为：
S3.2.1，DNA模板的制备，
S3.2.2，PCR扩增16s rDNA基因，进行PCR操作，反应体系为：DNA模板5μL，10× PCRBuffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；
S3.2.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
作为本发明再进一步的方案：所述的S4为，将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏，具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2mL 40％LB-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。
作为本发明再进一步的方案：所述的PCR扩增的具体步骤为：
(1)计算：按照所做样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)；
(2)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀；根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；
(3)分装：将PCR管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μL，然后将5μL DNA模板加入对应标号的PCR管中，记录编号；
(4)PCR：将PCR管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入PCR仪，再次确认每个PCR管盖子已盖好；设定PCR程序进行扩增。
作为本发明再进一步的方案：所述凝胶电泳及成像进行鉴别的方法，具体步骤为：
(a)配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入EB染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μL PCR产物，缓慢放入 0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲区，最后设定程序120V，90mA电泳35min；
(b)将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)采用细菌培养、细菌纯化，细菌鉴定和细菌保藏试验四步操作，该方法操作简单、成本低，鉴定结果准确、可靠。
(2)细菌纯化培养依次采用EC肉汤培养基、伊红美蓝琼脂培养基和两次麦康凯琼脂培养基进行选择性培养，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离。然后对选择培养后的单菌落活化在LB琼脂培养基，通过菌落形态初步进行判定，避免菌株不纯造成后续的无效工作，大大节省纯化时间。
(3)然后采用扩增stx1/2基因及16s rDNA可以快速、准确的鉴定纯化后的菌株，并通过双向测序后进行比对，进一步确定纯化后的菌株为产志贺毒素大肠埃希氏菌。
附图说明
图1为本发明方法中被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌LB平板培养图；
图2本发明方法中伊红美蓝平板纯化图；
图3本发明方法中麦康凯平板首次纯化图；
图4本发明方法中麦康凯平板二次纯化图；
图5本发明方法中LB平板活化图；
图6本发明方法中PCR扩增stx1/2基因电泳鉴定图；
图7本发明方法中PCR扩增16s rDNA电泳图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，实施例中这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特定细节仅仅是为了帮助全面理解本申请的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本申请的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，实施例中省略了对已知功能和构造的描述。
本发明实施例中，一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，具体按照以下步骤实施：
S1，细菌培养：将被污染的菌株接种于E.Coli(E.Coli,EC)肉汤培养基中，过夜培养，备用；每1ml无菌EC肉汤培养基中加入2～4μL菌液，培养温度为40～42℃，180～220rpm，培养18～24h，培养容器为50mL离心管。
S2，细菌纯化伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→ LB平板活化→纯化结果初步鉴定；
S2.1，利用伊红美蓝平板(Eosin-Methylene Blue,EMB)选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于EMB平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为35～37℃，培养时间为18～24h。
S2.2，麦康凯平板首次纯化，
挑取S2.1中EMB平板平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；培养温度为35～37℃，培养时间为18～24h。
S2.3，麦康凯平板二次纯化，
挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为35～37℃，培养时间为18～24h。
S2.4，LB平板活化，
挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为35～37℃，培养时间为18～24h。
S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，
观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖。若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验。若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。
S3，细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16s rDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；
S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定，
S3.1.1，DNA模板的制备；
S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275 μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
由于志贺毒素基因(stx1/2)为STEC菌株所共有，通过扩增stx1/2基因就可以验证纯化后的菌株是否为STEC菌株。stx1/2基因扩增选用的引物序列见表1，PCR反应体系及反应条件见表2。
S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别；
S3.2，对S2中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，具体步骤为：
S3.2.1，DNA模板的制备，
S3.2.2，PCR扩增16s rDNA基因，进行PCR操作，反应体系为：DNA模板5μL，10× PCRBuffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
S3.2.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
进行PCR扩增16s rDNA基因选用的引物如表3所示。
S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S3.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。
S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2mL 40％LB-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。
上述方法中，所采用的PCR扩增的具体步骤为：
(1)计算：按照所做样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)；
(2)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；
(3)分装：将PCR管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μL，然后将5μL DNA模板加入对应标号的PCR管中，记录编号；
(4)PCR：将PCR管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入PCR仪，再次确认每个PCR管盖子已盖好。设定PCR程序进行扩增。
上述方法中，所采用的DNA模板的制备方法为煮沸法，具体步骤为：
①挑取纯化后的菌体涮于装有130μL的无菌ddH2O(250μL PCR管)，涡旋振荡 5～10s；
②将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器/PCR仪，100℃加热煮沸15min；
②将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；
③用小离心机离心10min，吸取100μL上清即为PCR模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；
上述方法中采用的凝胶电泳及成像进行鉴别的方法，具体步骤为：
(a)配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入EB染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μL PCR产物，缓慢放入 0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲区，最后设定程序120V，90mA电泳35min；
(b)将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。
表1 stx1/2基因扩增引物
Figure BDA0002432589620000081
PCR反应体系及反应条件见表2。
表2 stx1/2基因PCR反应体系及反应条件
Figure BDA0002432589620000091
表3 16s rDNA基因扩增引物
Figure BDA0002432589620000092
将扩增阳性的PCR产物送至北京奥科鼎盛有限公司进行双向测序，测序得到的序列见序列表所示，对变形杆菌和产志贺毒素大肠埃希氏菌分别进行测序，然后再进行序列拼接，然后将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，对得到的菌株做进一步验证，结果表明测序结果与NCBI数据库有99％以上的相似性，故认为污染菌株为变形杆菌，纯化后的菌株为产志贺毒素大肠埃希氏菌。因此，本方法可以成功的将变形杆菌与产志贺毒素大肠埃希氏菌分离。根据上述的比对结果，不但可以证明纯化后的菌株是产志贺毒素大肠埃希氏菌，还可以证明是变形杆菌污染了产志贺毒素大肠埃希氏菌。
在本发明的纯化方法中，为了达到更好的纯化效果，在处理过程中，使用了多种培养基，利用各种培养基不同的适应性，进行组合，达到纯化的目的。
一、各种培养基的作用：
EC肉汤培养基：适用于大肠杆菌的测定，可以较好地抑制非大肠杆菌的繁殖；
伊红美蓝培养基：用于鉴别大肠杆菌；
麦康凯培养基：具有中等强度选择性，抑菌能力略强，主要抑制革兰阳性菌，但有少数革兰阴性菌也不生长，有利于大肠杆菌生长；
LB琼脂培养基：培养大肠杆菌的常用培养基。
二、进行纯化的过程时候各种培养基配合使用的设计原理：
首先用EC肉汤在40～42℃条件下培养被污染的菌株，EC肉汤具有选择性的抑制非目标菌株的生长，而40～42较高温度可以抑制非目标菌株生长，但对目标菌株不影响；然后利用EMB选择培养，鉴定大肠杆菌而抑制大部分非目标菌株生长，培养后的目标菌株菌落颜色为绿色有金属光泽；再用麦康凯平板培养，麦康凯平板具有更强的选择性，可以较好地抑制非目标菌株生长，但变形杆菌游动性较强，在首次挑菌时可能部分菌落仍然存在不纯情况，故而进行二次麦康凯培养，目标菌落颜色为粉红色或紫红色；最后进行LB 培养，挑取二次麦康凯目标菌落培养于LB平板，一方面可以使目标菌株很好生长，另一方面也可以通过菌落是否单一，是否存在菌膜覆盖而进一步判断纯化后的菌落是否单一。
另外，为了配合说明整体方法的实施过程和效果，申请人提供了一系列附图：
图1为被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌在LB平板培养状态，图中可以看出目标菌落(较大菌落)旁有一些较小菌落，且菌落颜色偏黄且有一层菌膜覆盖。
图2为被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌在EMB平板培养状态，图中除目标菌落(目标菌株菌落颜色为绿色有金属光泽)外，还存在一些其他杂菌。
图3为将EMB平板疑似菌落于麦康凯平板的培养状态，图中单菌落均一且颜色为粉红或者紫红色，但在第一笔划线处存在颜色偏黄的菌落，因此认为还存在有杂菌的可能，所以进行了二次麦康凯选择培养。
图4为将首次麦康凯平板疑似菌落于麦康凯平板的培养状态，图中平板颜色单一，菌落均一，故认为纯化较为理想。
图5为将二次麦康凯平板疑似菌落于LB平板的培养状态，图中菌落均一，无菌膜生长，则认为分离出单一的菌落。
经过纯化后，在进行LB活化的菌落形态如图5所示，从图中可以看出，菌落的大小均一，无菌膜覆盖，而图1中被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌在LB平板培养状态，图中可以看出目标菌落(较大菌落)旁有一些较小菌落，且菌落颜色偏黄且有一层菌膜覆盖。
图6为LB扩增stx1/2基因电泳图，图中阴性均未检出，阳性均有检出，试验纯化后的菌株扩增条带于阳性条带一致，故暂时认为纯化成功。
图7为扩增16s rDNA电泳图，扩增条带于引物大小一致，将鉴定判断后呈阳性的产物进行测序。
实施例1
一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，具体按照以下步骤实施：
S1，细菌培养：将被污染的菌株接种于E.Coli(E.Coli,EC)肉汤培养基中，过夜培养，备用；每1ml无菌EC肉汤培养基中加入2μL菌液，40℃，180rpm，培养18h，培养容器为50mL离心管。
S2，细菌纯化伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→ LB平板活化→纯化结果初步鉴定。
S2.1，利用伊红美蓝平板(Eosin-Methylene Blue,EMB)选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于EMB平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为35℃，培养时间为18h。
S2.2，麦康凯平板首次纯化，
挑取S2.1中EMB平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；培养温度为35℃，培养时间为18h。
S2.3，麦康凯平板二次纯化，
挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为35℃，培养时间为18h。
S 2.4，LB平板活化，
挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为35℃，培养时间为18h。
S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，
观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖。若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验。若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。
S3，细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16s rDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；
S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定，具体步骤为：
S3.1.1，DNA模板的制备；
S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275 μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
由于志贺毒素基因(stx1/2)为STEC菌株所共有，通过扩增stx1/2基因就可以验证纯化后的菌株是否为STEC菌株。stx1/2基因扩增选用的引物序列见表1，PCR反应体系及反应条件见表2。
S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别，
S3.2，对S2中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，具体步骤为：
S3.2.1 DNA模板的制备，
S3.2.2PCR扩增16s rDNA基因，进行PCR操作，反应体系为：DNA模板5μL，10× PCRBuffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
S3.2.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
进行PCR扩增16s rDNA基因选用的引物如表3所示。
S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S3.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。
S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2mL 40％LB-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。
上述方法中，所采用的PCR扩增的具体步骤为：
(1)计算：按照所做样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)；
(2)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；
(3)分装：将PCR管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μL，然后将5μL DNA模板加入对应标号的PCR管中，记录编号；
(4)PCR：将PCR管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入PCR仪，再次确认每个PCR管盖子已盖好。设定PCR程序进行扩增。
上述方法中，所采用的DNA模板的制备方法为煮沸法，具体步骤为：
①挑取纯化后的菌体涮于装有130μL的无菌ddH2O(250μL PCR管)，涡旋振荡5 s；
②将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器/PCR仪，100℃加热煮沸15min；
②将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；
③用小离心机离心10min，吸取100μL上清即为PCR模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；
上述方法中采用的凝胶电泳及成像进行鉴别的方法，具体步骤为：
(a)配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入EB染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μL PCR产物，缓慢放入 0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲区，最后设定程序120V，90mA电泳35min；
(b)将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。
实施例2
一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，具体按照以下步骤实施：
S1，细菌培养：将被污染的菌株接种于E.Coli(E.Coli,EC)肉汤培养基中，过夜培养，备用；每1ml无菌EC肉汤培养基中加入4μL菌液，培养温度为42℃，220rpm，培养24 h，培养容器为50mL离心管。
S2，细菌纯化伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→ LB平板活化→纯化结果初步鉴定；
S2.1，利用伊红美蓝平板(Eosin-Methylene Blue,EMB)选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于EMB平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为37℃，培养时间为24h。
S2.2，麦康凯平板首次纯化，
挑取S2.1中EMB平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；培养温度为37℃，培养时间为24h。
S2.3，麦康凯平板二次纯化，
挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为37℃，培养时间为24h。
S 2.4，LB平板活化，
挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为37℃，培养时间为24h。
S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，
观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖。若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验。若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。
S3，细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16s rDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；
S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定，具体步骤为：
S3.1.1，DNA模板的制备；
S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275 μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
由于志贺毒素基因(stx1/2)为STEC菌株所共有，通过扩增stx1/2基因就可以验证纯化后的菌株是否为STEC菌株。stx1/2基因扩增选用的引物序列见表1，PCR反应体系及反应条件见表2。
S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别，
S3.2，对S3中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，具体步骤为：
S3.2.1，DNA模板的制备，
S3.2.2，PCR扩增16s rDNA基因，进行PCR操作，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCRBuffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
S3.2.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
进行PCR扩增16s rDNA基因选用的引物如表3所示。
S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S4.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。
S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2mL 40％LB-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。
上述方法中，所采用的PCR扩增的具体步骤为：
(1)计算：按照所做样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)；
(2)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；
(3)分装：将PCR管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μL，然后将5μL DNA模板加入对应标号的PCR管中，记录编号；
(4)PCR：将PCR管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入PCR仪，再次确认每个PCR管盖子已盖好。设定PCR程序进行扩增。
上述方法中，所采用的DNA模板的制备方法为煮沸法，具体步骤为：
①挑取纯化后的菌体涮于装有130μL的无菌ddH2O(250μL PCR管)，涡旋振荡10 s；
②将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器/PCR仪，100℃加热煮沸15min；
④将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；
⑤用小离心机离心10min，吸取100μL上清即为PCR模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；
上述方法中采用的凝胶电泳及成像进行鉴别的方法，具体步骤为：
(a)配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入EB染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μL PCR产物，缓慢放入 0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲区，最后设定程序120V，90mA电泳35min；
(b)将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。
实施例3
一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，具体按照以下步骤实施：
S1，细菌培养：将被污染的菌株接种于E.Coli(E.Coli,EC)肉汤培养基中，过夜培养，备用；每1ml无菌EC肉汤培养基中加入3μL菌液，培养温度41℃，200rpm，培养21h，培养容器为50mL离心管。
S2，细菌纯化伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→ LB平板活化→纯化结果初步鉴定；
S2.1，利用伊红美蓝平板(Eosin-Methylene Blue,EMB)选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于EMB平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为36℃，培养时间为21h。
S2.2，麦康凯平板首次纯化，
挑取S2.1中EMB平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；培养温度为36℃，培养时间为21h。
S2.3，麦康凯平板二次纯化，
挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为36℃，培养时间为21h。
S2.4，LB平板活化，
挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，培养温度为36℃，培养时间为21h。
S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，
观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖。若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验。若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。
S3，细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16s rDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；
S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定，具体步骤为：
S3.1.1，DNA模板的制备；
S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275 μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
由于志贺毒素基因(stx1/2)为STEC菌株所共有，通过扩增stx1/2基因就可以验证纯化后的菌株是否为STEC菌株。stx1/2基因扩增选用的引物序列见表1，PCR反应体系及反应条件见表2。
S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别，
S3.2，对S3中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，具体步骤为：
S3.2.1，DNA模板的制备，
S3.2.2，PCR扩增16s rDNA基因，进行PCR操作，反应体系为：DNA模板5μL，10× PCRBuffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
S3.2.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
进行PCR扩增16s rDNA基因选用的引物如表3所示。
S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S3.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。
S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2mL 40％LB-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。
上述方法中，所采用的PCR扩增的具体步骤为：
(1)计算：按照所做样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)；
(2)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；
(3)分装：将PCR管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μL，然后将5μL DNA模板加入对应标号的PCR管中，记录编号；
(4)PCR：将PCR管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入PCR仪，再次确认每个PCR管盖子已盖好。设定PCR程序进行扩增。
上述方法中，所采用的DNA模板的制备方法为煮沸法，具体步骤为：
①挑取纯化后的菌体涮于装有130μL的无菌ddH2O(250μL PCR管)，涡旋振荡 5～10s；
②将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器/PCR仪，100℃加热煮沸15min；
⑥将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；
⑦用小离心机离心10min，吸取100μL上清即为PCR模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；
上述方法中采用的凝胶电泳及成像进行鉴别的方法，具体步骤为：
(a)配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入EB染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μL PCR产物，缓慢放入 0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲区，最后设定程序120V，90mA电泳35min；
(b)将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。
以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种被污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化及鉴定方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaatcgccat tcgttgacta cttct 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgccattctg gcaactcgcg atgca 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagtcgtcac tcactggttt catca 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggatattctc cccactctga cacc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 7
<211> 1225
<212> DNA
<213> 变形杆菌
<400> 7
ggcgggctac acatgcagtc gagcggtaac aggagaaagc ttgctttctt gctgacgagc 60
ggcggacggg tgagtaatgt atggggatct gcccgataga gggggataac tactggaaac 120
ggtggctaat accgcataat gtctacggac caaagcaggg gctcttcgga ccttgcacta 180
tcggatgaac ccatatggga ttagctagta ggtggggtaa aggctcacct aggcgacgat 240
ctctagctgg tctgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc 360
gtgtatgaag aaggccttag ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag gtgataaggt 420
taataccctt gtcaattgac gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgca 540
ggcggtcaat taagtcagat gtgaaagccc cgagcttaac ttgggaattg catctgaaac 600
tggttggcta gagtcttgta gaggggggta gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
agatgtggag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga cgctcaggtg 720
cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgctgt aaacgatgtc 780
gatttagagg ttgtggtctt gaaccgtggc ttctggagct aacgcgttaa atcgaccgcc 840
tggggagtac ggccgcaagg ttaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg 900
gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga catccagcga 960
atcctttaga ggatagagga gtgccttcgg gaacgctgag acaggtgttg catggctgcc 1020
gtcagctcgg gttgggaaat gttgggttaa gtcccgaacg gggggaaccc ttatcctttg 1080
ttgccacacc gtaatggtgg gaactcaaag gagactgccg gggaaaaccg gagggaaggg 1140
gggggattac ggcaaggcat aagggccctt acgagaaggg ttaccacggg ttacaagggg 1200
agatacaaag agaagggccc tccgg 1225
<210> 8
<211> 1144
<212> DNA
<213> 变形杆菌
<400> 8
ggtaatcaaa gtggtagcgc cctcccgaag gttaagctac ctacttcttt tgcaacccac 60
tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg tagcattctg 120
atctacgatt actagcgatt ccgacttcat ggagtcgagt tgcagactcc aatccggact 180
acgacagact ttatgagttc cgcttgctct cgcgaggtcg cttctctttg tatctgccat 240
tgtagcacgt gtgtagccct actcgtaagg gccatgatga cttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt atcaccggca gtctcctttg agttcccacc attacgtgct ggcaacaaag 360
gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacattt cacaacacga gctgacgaca 420
gccatgcagc acctgtctca gcgttcccga aggcactcct ctatctctaa aggattcgct 480
ggatgtcaag agtaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg 600
gtcgatttaa cgcgttagct ccagaagcca cggttcaaga ccacaacctc taaatcgaca 660
tcgtttacag cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc 720
tgagcgtcag tctttgtcca gggggccgcc ttcgccaccg gtattcctcc acatctctac 780
gcatttcacc gctacacatg gaattctacc cccctctaca agactctagc caaccagttt 840
cagatgcaat tcccaagtta agctcggggc tttcacatct gacttaattg accgcctgcg 900
tgcgctttac gcccagtaat tccgattaac gcttgcaccc tccgtattac cgcggctgct 960
ggcacggagt tagccggtgc ttcttctgcg ggtaacgtca attgacaaag ggtattaacc 1020
ttatcacctt cctccccgct tgaaagtact ttacaaaccc taaaggcctt cttcatacaa 1080
cgcggcatgg gttgcatcaa ggtttgcgcc cattgtgcaa aattccccac tgttgcctcc 1140
cgca 1144
<210> 9
<211> 1425
<212> DNA
<213> 变形杆菌
<400> 9
agtggtagcg ccctcccgaa ggttaagcta cctacttctt ttgcaaccca ctcccatggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gtagcattct gatctacgat 120
tactagcgat tccgacttca tggagtcgag ttgcagactc caatccggac tacgacagac 180
tttatgagtt ccgcttgctc tcgcgaggtc gcttctcttt gtatctgcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc tactcgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tatcaccggc agtctccttt gagttcccac cattacgtgc tggcaacaaa ggataagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac agccatgcag 420
cacctgtctc agcgttcccg aaggcactcc tctatctcta aaggattcgc tggatgtcaa 480
gagtaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcgattta 600
acgcgttagc tccagaagcc acggttcaag accacaacct ctaaatcgac atcgtttaca 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctgagcgtca 720
gtctttgtcc agggggccgc cttcgccacc ggtattcctc cacatctcta cgcatttcac 780
cgctacacat ggaattctac ccccctctac aagactctag ccaaccagtt tcagatgcaa 840
ttcccaagtt aagctcgggg ctttcacatc tgacttaatt gaccgcctgc gtgcgcttta 900
cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc ctccgtatta ccgcggctgc tggcacggag 960
ttagccggtg cttcttctgc gggtaacgtc aattgacaag ggtattaacc ttatcacctt 1020
cctccccgct gaaagtactt tacaacccta aggccttctt catacacgcg gcatggctgc 1080
atcaggcttg cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ctgatcatcc tctcagacca gctagagatc gtcgcctagg 1200
tgagccttta ccccacctac tagctaatcc catatgggtt catccgatag tgcaaggtcc 1260
gaagagcccc tgctttggtc cgtagacatt atgcggtatt agccaccgtt tccagtagtt 1320
atccccctct atcgggcaga tccccataca ttactcaccc gtccgccgct cgtcagcaag 1380
aaagcaagct ttctcctgtt accgctcgac tgcatgtgta gcccg 1425
<210> 10
<211> 1161
<212> DNA
<213> 产志贺毒素大肠埃希氏菌
<400> 10
gtcgcagtct acacatgcag tcgaacggta acaggcaaac agcttgctgc ttcgctgacg 60
agtggcggac gggtgagtaa tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga 120
aacggtagct aataccgcat aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg 180
ccatcggatg tgcccagatg ggattagcta gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac 240
gatccctagc tggtctgaga ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact 300
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc 360
cgcgtgtatg aagaaggcct tcgggttgta aagtactttc agcggggagg aagggagtaa 420
agttaatacc tttgctcatt gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca 480
gcagccgcgg taatacggag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac 540
gcaggcggtt tgttaagtca gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctga 600
tactggcaag cttgagtctc gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag 720
gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gtcgacttgg aggttgtgcc cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc 840
gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca 960
cggaaggttt cagagatgag aatgtgcctt cgggaaccgt gagacaggtg ctgcatggct 1020
tgccgcagct cgggttggga aatgttgggt taagtcccga acggggggaa cccttatcct 1080
ttgttgccag gggtccggcc ggaactcaaa ggagattgca gtgtaaaatt tggaggaaag 1140
ggggggataa cgtcaagtca t 1161
<210> 11
<211> 1153
<212> DNA
<213> 产志贺毒素大肠埃希氏菌
<400> 11
ttatcaaagt ggtagcgccc tcccgaaggt taagctacct acttcttttg caacccactc 60
ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgtg gcattctgat 120
ccacgattac tagcgattcc gacttcatgg agtcgagttg cagactccaa tccggactac 180
gacgcacttt atgaggtccg cttgctctcg cgaggtcgct tctctttgta tgcgccattg 240
tagcacgtgt gtagccctgg tcgtaagggc catgatgact tgacgtcatc cccaccttcc 300
tccagtttat cactggcagt ctcctttgag ttcccggccg gaccgctggc aacaaaggat 360
aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatttcac aacacgagct gacgacagcc 420
atgcagcacc tgtctcacgg ttcccgaagg cacattctca tctctgaaaa cttccgtgga 480
tgtcaagacc aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt 540
gtgcgggccc ccgtcaattc atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc 600
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tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctga 720
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<210> 12
<211> 1322
<212> DNA
<213> 产志贺毒素大肠埃希氏菌
<400> 12
ggcccgggaa cgtattcacc gtggcattct gatccacgat tactagcgat tccgacttca 60
tggagtcgag ttgcagactc caatccggac tacgacgcac tttatgaggt ccgcttgctc 120
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ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccagtt tatcactggc agtctccttt 240
gagttcccgg ccggaccgct ggcaacaaag gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 300
cccaacattt cacaacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtctca cggttcccga 360
aggcacattc tcatctctga aaacttccgt ggatgtcaag accaggtaag gttcttcgcg 420
ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag 480
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cgcctcaagg gcacaacctc caagtcgaca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 600
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ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac gcatttcacc gctacacctg gaattctacc 720
cccctctacg agactcaagc ttgccagtat cagatgcagt tcccaggttg agcccgggga 780
tttcacatct gacttaacaa accgcctgcg tgcgctttac gcccagtaat tccgattaac 840
gcttgcaccc tccgtattac cgcggctgct ggcacggagt tagccggtgc ttcttctgcg 900
ggtaacgtca atgagcaaag gtattaactt tactcccttc ctccccgctg aaagtacttt 960
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caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtggc 1080
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agctaatccc atctgggcac atccgatggc aagaggcccg aaggtccccc tctttggtct 1200
tgcgacgtta tgcggtatta gctaccgttt ccagtagtta tccccctcca tcaggcagtt 1260
tcccagacat tactcacccg tccgccactc gtcagcgaag cagcaagctg tttgcctgtt 1320
ac 1322

Claims (10)

1.一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
S1：细菌培养：将被污染的菌株接种于EC肉汤培养基中，过夜培养，备用；
S2：细菌纯化：将S1中培养后的细菌进行如下处理：伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→LB平板活化→纯化结果初步鉴定；
S3：细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16srDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；
S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。
2.根据权利要求1所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述的S1中，每1ml无菌EC肉汤培养基中加入2～4μL菌液，培养温度为40～42℃，转速为180～220rpm，培养时间为18～24h。
3.根据权利要求1所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述S2的详细步骤为：
S2.1，利用伊红美蓝平板选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于伊红美蓝平板，尽可能多的划出单菌落，35～37℃，培养18～24h；
S2.2，利用麦康凯平板首次纯化，
挑取S2.1中伊红美蓝平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；
S2.3，麦康凯平板二次纯化，
挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，
S2.4，LB平板活化，
挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；
S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，
观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖；若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验；若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。
4.根据权利要求3所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述S2.1～S2.4中所述培养温度为35～37℃，培养时间都为18～24h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述S3具体的鉴定方法为：
S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定
S3.2，对S2中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，
S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S3.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。
6.根据权利要求5所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述步骤S3.1中的stx1/2基因鉴定的步骤为：
S3.1.1，DNA模板的制备；
S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl21.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；
S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
7.根据权利要求5所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述的S3.2中16s rDNA鉴定的步骤为：
S3.2.1，DNA模板的制备，
S3.2.2，PCR扩增16s rDNA基因，进行PCR操作，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCRBuffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH2O 13.275μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；
S3.2.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。
8.根据权利要求1所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述的S4为，将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏，具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2mL 40％LB-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，
所述的PCR扩增的具体步骤为：
(1)计算：按照所做样本数量计算试剂总用量；
(2)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀；根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；
(3)分装：将PCR管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μL，然后将5μL DNA模板加入对应标号的PCR管中，记录编号；
(4)PCR：将PCR管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入PCR仪，再次确认每个PCR管盖子已盖好；设定PCR程序进行扩增。
10.根据权利要求1～8所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，
所述凝胶电泳及成像进行鉴别的方法，具体步骤为：
(a)配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入EB染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μL PCR产物，缓慢放入0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲区，最后设定程序120V，90mA电泳35min；
(b)将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。
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