KR102438017B1

KR102438017B1 - Pna 프로브를 이용한 돼지 f18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법 및 키트

Info

Publication number: KR102438017B1
Application number: KR1020200148500A
Authority: KR
Inventors: 변재원; 이기찬; 문보연; 김종완; 소병재
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2022-08-31
Also published as: KR20220062841A

Abstract

본 발명은 돼지 대장균증 진단방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지 대장균증의 병원성 인자들인 F18섬모유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 섬모유전자 및 시가독소 유전자 검출을 통한 돼지 대장균증 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는 기존의 PCR 방법에 비해 고민감도와 높은 정확도로 병원성 대장균(F18:stx2e E. coli)을 감별할 수 있을 뿐만 아니라, 위양성 판별도 용이하여, 양돈농가의 병원성 대장균 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

PNA 프로브를 이용한 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법 및 키트 {Method and Kit for Identifying F18 encoding enterotoxigenic and shigatoxin-producing Escherichia coli in Pigs using PNA probe}

본 발명은 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증의 병원성 인자들인 F18 섬모유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 섬모유전자 및 시가독소 유전자 검출을 통한 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법에 관한 것이다.

돼지 대장균증은 전세계적으로 발생하면서 설사 및 부종을 일으켜 막대한 피해를 입히는 질병이다. 돼지 대장균증은 포유부터 이유 및 육성구간까지 농장에서 지속발생하여 체중감소 등의 생산성 저하 및 폐사를 일으키는 대표적인 소모성 질병이다. 특히 여름철 사양관리 및 사료변화 등으로 설사 및 부종병 등이 발생하여 농가에 지속적인 피해를 주고 있다.

돼지의 대장균증은 크게 설사병과 부종병으로 구분하여 다양한 병원성인자들이 알려져 있다. 병원성 대장균은 병원성인자에 따라 장독소형 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장병원성 대장균(enteropathogenic E. coli, EPEC) 및 시가독소 생산형 대장균(shigatoxin-producing E. coli, STEC)으로 구분하며, 이러한 병원성인자들은 서로 대장균간에 이동하면서 다양한 병원성 패턴을 나타낸다.

장독소형 대장균은 소장 상피세포에 부착하기 위한 섬모인자(F4(K88), F5(K99), F6(987P), F41), F18) 또는 독소인자(LT, ST, EAST1)를 발현하여 설사를 일으키는 특징을 가지고 있다. 대장균설사병의 포유 및 이유자돈 등에서 탈수가 특징적인 설사를 하는 것이다. 이 시기는 다양한 바이러스성(PED, Rota 등) 및 원충성(콕시듐) 원인과 감별진단이 필요하다.

돼지에서 시가독소 생산형 대장균은 부종병과 연관성이 높으며, 농장에서 발생시 5~20%까지 다양한 폐사율을 나타내는 특징을 가지고 있다. 이 대장균 또한 병원성인자로 섬모(F18)인자 및 독소인자(Stx2e)인자를 생산하여 소장 및 대장의 상피세포에 부착한 후 시가독소를 생산하는데, 이 시가(베로)독소는 장관 상피세포보다 혈관으로 흡수되어 혈관 내피세포의 괴사를 일으켜 눈꺼풀 등에 부종을 일으켜 돼지 부종병의 증상을 나타내게 된다.

또한 부착인자(F18)의 아형에 따라 부종병 대장균과 설사병 대장균의 구분도 일부 가능하다. 이러한 부착인자에 따라 부종유발 병원성 대장균과 설사유발 대장균을 구분이 가능한 것으로 알려져 있다. 병원성대장균의 병원성인자를 확인하기 위하여 다양한 방법이 사용되고 있으나 설사 및 부종이 발생한 돼지에서 대장균을 분리하여 병원성인자를 유전자검사법인 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 진단하는 것이 일반적으로 활용되고 있다. 특히 돼지에서 부종을 일으키는 PCR 검사법은 배양법에 비하여 신속한 검사는 가능하나, 여러 가지 요인에 의한 비특이 반응 및 양성대조군 및 샘플간 교차오염의 가능성이 단점으로 지적되고 있다(Kazar J, Ann N Y Acad Sci. 2005, Vol. 1063, pp. 105-14.).

한편, PNA는 peptide nucleic acids의 약자로 LNA (Locked nucleic acid), MNA (Morpholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며 기본 골격이 전기적으로 중성인 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA의 경우 국내 원천특허로 국가 경쟁력을 가지는 소재로, PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소 (restriction enzyme)로 분해되지 않는 특징이 있다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. DNA-DNA 결합 대비 PNA-DNA 결합력이 우수하며 융해 온도(melting temperature)가 약 2배 이상 높으므로, 1개의 뉴클레오티드 미스매치(nucleotide miss match)에도 융해 온도에서 10～15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP 및 In/Del의 핵산 변화를 효과적으로 검출할 수 있게 된다.

PNA 프로브 혼성화 방법(Hybridization method)의 분석 방법으로는 FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis)를 주로 이용하는데, FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후, 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 방법이다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9～15 mer의 염기서열을 이용하여 제작하며, 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나, PNA 골격 gamma 위치에 Lysine, Glutamic acid 또는 Alanine 등 아미노산을 연결하여 Tm 값을 조절할 수 있다.

PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하고 따라서 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 기존의 HRM(High resolution melting) 방법은 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 정밀한 분석이 가능한 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, F18 섬모 유전자형과 시가독소 유전자를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 병원성 대장균의 F18 및 STX2e 유전자를 프라이머로 증폭한 다음, 유전자 특이적 PNA 프로브로 융해 곡선을 분석할 경우, 신속하고 정확하게 병원성 대장균을 구분할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e)를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 쌍을 이용한 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출을 통한 돼지 대장균증 진단방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 PNA 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, (i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는 (ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 증폭용 프라이머 쌍(primer pair)을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법을 제공한다:

(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

(b) 제6항의 프라이머 쌍을 이용하여 F18 섬모 유전자 또는 Stx2e 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;

(c) 상기 증폭산물을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e)를 검출하는 단계; 및

(e) 검출된 F18 섬모 유전자의 유전자형 및 시가독소 유전자의 검출 유무를 기반으로 돼지 대장균증 원인 대장균을 결정하는 단계.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 기존의 PCR 방법에 비해 고민감도와 높은 정확도로 병원성 대장균(F18:stx2e E. coli)을 감별할 수 있을 뿐만 아니라, 위양성 판별도 용이하여, 양돈농가의 병원성 대장균 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 프라이머 및 PNA 프로브의 대장균 F18(fedA) 유전자내 결합 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 내부 대조군의 프라이머 및 PNA 프로브의 결합 위치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 병원성 대장균(F18 positive E. coli) 의 특이 유전자의 증폭조건 및 융해곡선 분석 조건을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 표준균주 및 내부 대조군의 융해곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 PNA 프로브의 분석적 민감도를 표준균주를 이용하여 평가한 그래프이다.
도 6의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 임상시료를 이용하여 검출 민감도를 확인한 결과이며, (B)는 종래 PCR법과 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 진단법을 비교한 결과이다.
도 7의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 특이도를 확인하기 위한 균주 리스트이며, (B)는 확인 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 대장균 F18 양성균의 시퀀싱 및 PNA 프로브 검출 결과를 비교한 것이다.
도 9는 병원성 대장균의 계통수를 F18 유전자형에 따라 분류한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 돼지 병원성 대장균(F18 positive E. coli, FedA)를 PNA 프로브로 검출할 경우, 복잡한 과정을 거치지 않고 융해곡선의 분석만으로 병원성 대장균(F18:stx2e E. coli)을 검출할 수 있음을 확인하고자 하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 병원성 대장균(F18:stx2e E. coli)에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 설계하고, 이를 이용하여 융해곡선을 분석할 경우, 추가적인 분석 작업 없이 융해곡선의 분석만으로 상기 유전자의 유전형을 판별할 수 있다는 것을 확인하였다(도 4).

따라서, 본 발명은 일 관점에서,

서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 상기 PNA 프로브는 FedA 및 Stx2e로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자와 혼성화(hybridization)하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 FedA의 유전자형은 F18ab, F18ac 및 F18new 형으로 구분될 수 있으며, 도 9의 계통수에 따라 분류되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, 또는 Alexa680 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하고, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.

PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성 (selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합 대비 PNA-DNA 결합력이 우수하며 융해 온도(melting temperature)가 약 2배 이상 높으므로, 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃가량 융해온도(Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.

본 발명의 용어 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, LNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. PNA는 단일 염기부정합 때문에 이중가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에서 표적핵산은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.

혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절할 수 있으며, PNA 골격 gamma 위치에 Lysine, Glutamic acid 또는 Alanine 등 아미노산을 연결하여 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 빠르고 정확한 분석이 가능하다.

본 발명에서 "PNA 프로브(probe)"는 표적핵산이 존재하는 경우 표적핵산에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적핵산이 없는 경우 내부컨트롤에 결합하여 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있으며, 내부컨트롤과 표적핵산 융해곡선 차이를 이용하여 위양성 및 위음성 시그널을 구분할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는

(ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 증폭용 프라이머 쌍(primer pair)에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 프라이머 쌍은 병원성 대장균 유전자(FedA, Stx2e)를 특이적으로 증폭할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 내부대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍, 및 서열번호 5의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍은 내부대조물질을 증폭시키고, 서열번호 5의 PNA 프로브는 내부대조물질과 혼성화되어, 병원성 대장균의 존재 유무와는 상관없이 실시간 PCR(real-time PCR)의 성공 유무를 판별할 수 있다. 따라서, 상기 내부대조물질은 시료에 일반적으로 포함되는 유전자(예를 들어, 하우스 키핑 유전자) 또는 따로 주입하는 주형 핵산을 의미하는 것으로, 바람직하게는 병원성 대장균에 존재하지 않는 유전자(본 발명에서는 Cymbidium sinense 의 psbA 유전자) 부위인 것을 특징으로 할 수 있다. 이와 같은 맥락에서, 해당 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 유전자에 혼성화되는 프로브는, 본 발명에서 제시하는 프라이머 쌍 및 PNA 프로브 이외에도, 당업자가 용이하게 선택하여 적용할 수 있을 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서의 기재사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기 및 프라이머 또는 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.

상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법에 관한 것이다:

(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 F18 섬모 유전자 또는 Stx2e 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;

(c) 상기 증폭산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계;

본 발명에 있어서, 상기 돼지 대장균증은 시가독소 생산형 대장균(shigatoxin-producing E. coli, STEC) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC)에 의해 유발된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 시료는 병원성 대장균(F18:stx2e E. coli)을 검출하고자 하는 검체로부터 유래한 것으로, DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 것이고, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형태일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.

본 발명에서, 상기 시료는 자돈의 분변 또는 소장 내용물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 단계의 증폭은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 내부대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 내부대조물질의 증폭은 서열번호 10 및 11의 프라이머쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 5의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 융해곡선 분석은 타겟 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 핵산을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨 후, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한 다음, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 표적 핵산의 유무를 판단하는 방법이다.

Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 표적 핵산을 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준 값보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명에서 상기 (e) 단계의 돼지 대장균증 원인 대장균을 결정하는 단계는, F18ab 유전자형에 해당하는 융해곡선과, Stx2e 유전자형에 해당하는 융해곡선이 검출될 경우에는 F18ab 유전자형을 가지는 STEC 대장균으로 결정하고, F18ac 유전자형에 해당하는 융해곡선과, Stx2e 유전자형에 해당하는 융해곡선이 검출될 경우에는 F18ac 유전자형을 가지는 STEC 대장균으로 결정하며, F18new 유전자형에 해당하는 융해곡선과, Stx2e 유전자형에 해당하는 융해곡선이 검출될 경우에는 F18new 유전자형을 가지는 STEC 대장균으로 결정할 수 있다.

또한, F18 유전자형에 해당하는 융해곡선이 검출되고, Stx2e 유전자형에 해당하는 융해곡선이 검출되지 않을 경우에는 장독소형 대장균(ETEC)으로 결정할 수 있으나, 추가 분석이 필요할 수도 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 병원성 대장균(F18 positive E. coli) 진단용 프라이머 및 프로브 제작

병원성 대장균(F18 positive E. coli) 감염여부를 확인하기 위하여 병원성 대장균(F18 positive E. coli) 검출용 프라이어 및 프로브의 경우 병원성대장균 FedA (NCBI accession No.: M61713) 및 stx2e(ab252836) 유전자의 염기서열 분석을 통하여 고시에 표기된 프라이머와 새롭게 제작한 프라이머를 혼합하여 사용하였으며, 상기 프라이머를 이용한 증폭산물 안에서 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 제작하였다 (도 1, 표 1).

고시에 표기된 프라이머는 하기와 같다:

서열번호 12: F18F: TGGCACTGTAGGAGATACCATTCAGC

서열번호 13: F18R: GGTTTGACCACCTTTCAGTTGAGCAG

서열번호 14: Stx2e_F: CGGTATCCTATTCCCAGGAGTTTACG

서열번호 15: Stx2e_R: GTCTTCCGGCGTCATCGTATAAACAG

병원성대장균 구별에 사용한 프라이머 및 프로브 서열

서열번호	이름	Sequence (5'-3')	비고
1	F18ac	Dabcyl-ACAGCCGGTGCA-O-K (FAM)	프로브
2	F18_Comon	Dabcyl-AAACCGTGAACG-O-K (HEX)	프로브
3	F18ab	alexa680-CACAGGGGCA-O-K (BHQ3)	프로브
4	Stx2e	Dabcyl-GACCCCTCTTGAACA-O-K (Cy5)	프로브
5	IPC	Dabcyl-ATCCGAATTCTCGTTC-O-K(TxR)	내부대조 프로브
6	F18_F	AGGTTTTGCTAATCAAGGGGG	프라이머
7	F18_R	CGTAGTTGCTTTTGATGCATCGAAA	프라이머
8	Stx2e_F	CGACTCAACAAAGTTATGTATCTTCG	프라이머
9	Stx2e_R	GTATGATTAATAACGGATACCGATG	프라이머
10	IPC_F	GCTATCTTGTTGGGTTCAGGTGC	내부대조 프라이머
11	IPC_R	GGCACTTATCATTCATTGGCGGG	내부대조 프라이머

동물질병 표준검사법에 명시되어 있는 프라이머 및 새롭게 제작한 프라이머의 경우 코스모진텍(cosmogenetech, 한국)에서 합성하였고, 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다. 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 병원성 대장균(F18 positive E. coli)을 위한 PNA 프로브는 융해온도가 75℃넘지 않도록 하여 중합효소연쇄반응에 영향을 주지 않도록 제작하였다.

실시예 2. 대장균 F18 양성균의 시퀀싱 및 검사결과 비교 분석

PNA 프로브를 이용한 F18 양성 대장균의 진단을 위하여 대장균 FedA 염기서열 안에서 최적의 프라이머 및 PNA 프로브 위치를 선정하였다. 또한 실험 중 오염에 따른 위양성 판별 여부를 판단하기 위해 내부 대조군을 합성 제작하였다(도 2).

실험장비로는 CFX96TM (Bio-Rad, 미국)를 사용하였고, 실험 조성의 경우 하기 표 2와 같은 조성을 사용하였으며, 실시간중합효소연쇄반응 실험 조건은 도 3에서와 같이 진행하였다.

사용한 표준균주 각각의 출처는 하기와 같다:

E. coli 107/86:F18ab 및 2134P:F18ac : Dr. E. Cox (Ghent university, Belgium)

E. coli 1033:F18 ac: Dr. J.M. Fairbrother (EcL, E. coli reference Laboratory, Canada).

F18new variant: (QIA, Byun et al. The Veterinary Journal 198 (2013) 538-540)

실험 조성

물질	양(농도)
표준균주	3 ul (4x10⁵ copies)
서열번호 6 프라이머	0.5 ul (3 pmol)
서열번호 7 프라이머	0.5 ul (30 pmol)
서열번호 8 프라이머	0.5 ul (5 pmol)
서열번호 9 프라이머	0.5 ul (30 pmol)
서열번호 10 프라이머	0.5 ul (4 pmol)
서열번호 11 프라이머	0.5 ul (20 pmol)
서열번호 1 프로브	0.5 ul (3 pmol)
서열번호 2 프로브	0.5 ul (3 pmol)
서열번호 3 프로브	0.5 ul (3 pmol)
서열번호 4 프로브	0.5 ul (3 pmol)
서열번호 5 프로브	0.5 ul (2 pmol)
2X qPCR PreMix	10 ul
DW	1.5 ul
전체 부피	20 ul

융해곡선 분석 결과, 도 4에 기재된 바와 같이, F18ab 표준균주의 경우 Tm 값이 HEX: 59±2℃, Quasar 705: 71±2℃, F18ac 표준균주의 경우 FAM: 60±2℃, HEX: 59±2℃, F18new 표준균주의 경우 HEX: 46±2℃, Stx2e 표준균주의 경우 Cy5: 64±2℃, 내부 대조군의 경우 TxR: 61±2℃에서 피크를 보이는 융해곡선을 나타내어 본 발명에 따른 PNA 프로브가 내부대조군과 표준균주를 명확히 판별할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 3. PNA 프로브를 이용한 분석적 민감도, 임상적 민감도 확인

3-1. 분석적 민감도 확인

서열번호 6 내지 11의 프라이머 및 PNA 프로브 (서열번호 1 내지 5)를 이용하여 표준균주에서 분석적 민감도 실험을 진행하였다. 표준균주를 농도별(10pg/ul, 100fg/ul, 1fg/ul, 500ag/ul, 250 ag/ul)로 희석하고, 나머지 성분은 실시예 2와 동일한 조성으로 하여, 도 3과 동일한 조건으로 실험을 진행하였다.

그 결과, 증폭곡선 및 융해곡선 Threshold value를 각 RFU 200과 RFU 50을 기준으로 250 ag/㎕ (100 copies)까지 검출이 가능함을 확인할 수 있었다(도 5).

3-2. 임상적 민감도 확인

상기 표준균주를 이용한 분석적 민감도를 바탕으로 임상적 민감도를 확인하고자 하였다. 양성시료의 경우 농림축산검역본부 질병진단과 세균질병 진단실에서 분리한 F18 양성 대장균을 이용하였으며, 동물질병 표준검사법(농림축산검역본부)의 PCR법인 중합효소연쇄반응법을 상대적으로 비교 분석하였다. 실험은 실시예 2와 동일한 조성으로 하여, 도 3과 동일한 조건으로 진행하였다.

그 결과, 일반 PCR을 이용한 동물질병표준검사법의 경우 임상적 민감도가 6x10³ CFU/mL고, PNA 프로브를 이용한 검사법의 경우 임상적 민감도가 6x10¹ CFU/mL이다. 이는 기존의 검사법보다 약 100배 민감도가 뛰어나며, 표준시료를 이용한 분석적 민감도가 임상시료에서도 동일하게 재현되는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

실시예 4. PNA 프로브를 이용한 새로운 병원성 대장균 진단 Kit의 제작 및 성능 확인

병원성 대장균(F18 positive E. coli)을 검출하기 위하여 프라이어 및 PNA 프로브를 이용하여 제품을 제작하고자 하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 장비를 이용한 일반적인 검출 키트의 경우 반응액의 중합효소연쇄반응이 일어나는 데에 문제가 없음을 확인하기 위하여 IPC (Internal Positive Control)를 혼합하여 반응을 진행한다. 따라서 실질적인 제품 안에서 IPC를 첨가하였을 경우, 분석적 민감도 및 특이도의 이상여부를 확인하고자 하였다.

4-1 민감도 확인

실험 방법의 경우, 조건은 도 3과 동일하게 진행하였으며, 조성의 경우, 표2와 같은 조성으로 분석을 진행하였다.

그 결과, 병원성 대장균(F18 positive E. coli) 진단 Kit 안에 IPC를 첨가하여 분석적 민감도를 확인한 결과 250 ag/ul (1 x 10² copies)까지 표준시료로 검출이 가능한 것을 확인하였다(도 5).

사용한 IPC 서열은 서열번호 16과 같다

서열번호 16 IPC:

TGTTCTTAGAACAAGATATTGGGGGATTGCTATCTTGTTGGGTTCAGGTGCTTTTTGCTTCTCTATCCGAATTCTCGTTCTTTATCATAAAAGTTCTCCCCCGCCAATGAATGATAAGTGCCTAGGTGAAGCATAGTATAAGATAAGTCAGAAAAGTCTAAGTCTTATGAAAAAGAAAATAAAT

4-2 특이도 확인

임상시료를 이용한 동물질병표준검사법의 경우, DNA를 추출하는 과정 중 원인균 외에도 다양한 균, 그리고 검체대상의 조직 DNA가 혼재되어 있어 비특이 반응이 빈번하게 일어나 위양성의 결과를 보일 수 있다. 따라서, 상기 키트의 특이도를 확인하기 위하여 도 7의 (A)에 기재된 균주를 각각 3ul씩 첨가하고, 나머지 조성은 4-1과 같고, 반응 조건은 도 3과 같은 조건으로 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 기재된 바와 같이, 병원성 대장균 이외의 다른 균에서는 IPC를 제외한 모든 프로브에서 유의미한 TM 값이 나타나지 않는 것을 확인하여 본 발명에서 제작한 키트의 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과를 종합하여 IPC를 포함한 병원성 대장균(F18 positive E. coli) 진단 키트를 제작하는 경우, 표 3과 같은 병원성 대장균(F18 positive E. coli) 결정할 수 있다는 것을 확인하였다.

Type	Fluor.	Tm (℃)
F18ab**	HEX/Quasar *	59/71 ± 2
F18ac**	FAM/HEX *	60/59 ± 2
F18new**	HEX	46 ± 2
Stx2e**	Cy5	64 ± 2
IPC	TxR	61 ± 2

*: 두 형광에서 모두 Tm이 일치해야한다.

**: 모든 E. coli 타입은 반드시 46°C 또는 59°C ± 2°C 의 HEX 형광이 검출되어야 한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Method and Kit for Identifying F18 encoding enterotoxigenic and shigatoxin-producing Escherichia coli in Pigs using PNA probe <130> P20-B280 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18ac_probe <400> 1 acagccggtg ca 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18common_probe <400> 2 aaaccgtgaa cg 12 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18ab_probe <400> 3 cacaggggca 10 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx2e_probe <400> 4 gacccctctt gaaca 15 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC_probe <400> 5 atccgaattc tcgttc 16 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18_F_primer <400> 6 aggttttgct aatcaagggg g 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18_R_primer <400> 7 cgtagttgct tttgatgcat cgaaa 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx2e_F_primer <400> 8 cgactcaaca aagttatgta tcttcg 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx2e_R_primer <400> 9 gtatgattaa taacggatac cgatg 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC_F_primer <400> 10 gctatcttgt tgggttcagg tgc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC_R_primer <400> 11 ggcacttatc attcattggc ggg 23 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18F <400> 12 tggcactgta ggagatacca ttcagc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F18R <400> 13 ggtttgacca cctttcagtt gagcag 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx2e_F <400> 14 cggtatccta ttcccaggag tttacg 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx2e_R <400> 15 gtcttccggc gtcatcgtat aaacag 26 <210> 16 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC <400> 16 tgttcttaga acaagatatt gggggattgc tatcttgttg ggttcaggtg ctttttgctt 60 ctctatccga attctcgttc tttatcataa aagttctccc ccgccaatga atgataagtg 120 cctaggtgaa gcatagtata agataagtca gaaaagtcta agtcttatga aaaagaaaat 180 aaat 184

Claims

서열번호 1 내지 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 FedA 및 Stx2e로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자와 혼성화(hybridization)하는 것을 특징으로 하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터와 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, 또는 Alexa680 로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
삭제
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 증폭용 프라이머 쌍(primer pair);
를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
제7항에 있어서, 내부대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍, 및 서열번호 5의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 검출용 조성물.
제8항의 조성물을 포함하는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단용 키트.
다음 단계를 포함하는 돼지 F18 섬모형 장독소 및 시가독소형 대장균증 진단방법:
(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) (i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e) 증폭용 프라이머 쌍(primer pair);
을 이용하여 F18 섬모 유전자 또는 Stx2e 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화시키는 및;
(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 F18 섬모 유전자(FedA) 및 시가독소 유전자(Stx2e)를 검출하는 단계; 및
(e) 검출된 F18 섬모 유전자의 유전자형 및 시가독소 유전자의 검출 유무를 기반으로 돼지 대장균증 원인 대장균을 결정하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 내부대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균증 진단방법.
제11항에 있어서, 상기 내부대조물질의 증폭은 서열번호 10 및 11의 프라이머쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 5의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균증 진단방법.
제10항에 있어서, 상기 돼지 대장균증은 시가독소 생산형 대장균(shigatoxin-producing E. coli, STEC) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC)에 의해 유발된 것을 특징으로 하는 돼지 대장균증 진단방법.