KR20200044511A - 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별방법 - Google Patents

노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노인성 황반변성(Age-related Macular Degeneration; AMD) 관련 유전자 변이 판별용 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 23으로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 유전자의 변이 유무를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별방법을 통해 노인성 황반변성과 관련된 유전형을 신속 간단하게 판별할 수 있으며, ADAMTS9, APOC1, ARMS2, C2, C3, C6orf223, CETP, CFH, CFI, COL10A1, FGD6, FRK, LIPC, SKIV2L, SLC44A4, SLC16A8, TGFBR1 및 VEGFA 유전자의 유전형을 판별하여 노인성 황반변성의 위험도를 예측하는데 활용할 수 있어 유용하다.

Description

노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별방법{Probe for Discrimination of Genetic Variant related to Age-related Macular Degeneration(AMD) and Method Using the Same}
본 발명은 노인성 황반변성(Age-related Macular Degeneration; AMD) 관련 유전자 변이 판별용 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 프로브 및 이를 이용한 노인성 황반변성 유전자의 변이 유무를 판별하는 방법에 관한 것이다.
황반변성은 녹내장, 당뇨망막병증과 함께 주요 3대 실명질환으로 알려져 있다. 대부분 노화로 인해 황반변성은 녹내장, 당뇨망막병증과 함께 주요 3대 실명질환으로 알려져 있다. 대부분 노화로 인해 발생하여 노인성 질환으로 여겼으나 최근에는 청장년층에서도 발병이 증가하는 추세로, 2011-2015년의 황반변성 환자는 5년 사이에 49% 가량이 증가하였다(건강보험심사평가원). 황반변성의 주요 원인은 노화이며, 그 다음으로 유전적인 요인, 그리고 환경적 요인으로는 자외선, 흡연, 고지방·고열량의 서구화 식단 등이 꼽히고 있다.
수술법의 발전으로 인해 녹내장, 백내장에 의한 실명은 크게 감소하였으나, 여전히 황반변성은 실명 원인 1위를 유지하고 있으며 이는 건강한 노년의 삶을 위협하고 있다. 또한 실명 인구의 증가는 개인적, 사회적 부담을 높여 질환의 치료 및 예방에 대한 관심이 높아지고 있다.
개인 맞춤형 질병 예방을 위해 질병과 관련이 있는 유전자와 유전형(genotype) candidate들이 도출되고 있으며, 이를 이용하여 질병 진단 및 치료제 개발에 활용되고 있다. 질환의 선천적인 위험도를 인지하고, 생활 습관 등 외부적인 요인을 조절하여 질환을 예방하기 위해 개인 유전체 분석을 진행하고 있으며, 질환이 악화되기 전 치료가 가능하기 때문에 개인 유전체 분석 기술의 필요성이 높아지고 있다. 이러한 질병 예방을 위한 개인유전체 분석은 다수의 유전자 및 유전형을 분석할수록 예측력이 높아질 수 있어, 다수의 유전형을 동시 판별할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되는 상황이다.
현재까지 유전형 판별방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 결과물의 직접적인 염기서열 분석법(Direct sequencing), 제한효소절편길이다양성 분석법(PCR-RFLP), 라인 프로브 분석법(Line Probe assay), 제한효소절편질량다양성 분석법(PCR-RFMP) 및 multiplex PCR 방법과 DNA 칩을 이용한 검출 방법이 있다.
유전성 변이의 진단 방법으로는 DNA 칩(chip)이나 PCR을 통한 DNA 서열분석(sequencing) 위주로 진행되어 왔으나, DNA 칩 기술은 새로운 변이가 발견되면 칩 자체를 새롭게 제작해야 하는 제약이 있다. 따라서 대한민국 공개특허공보 2012-0067384호에 개시된 것과 같은 다수의 유전형을 저렴하고 정확하게 진단하는 기술이 필요하다.
최근 프로브를 이용한 검출방법은 감도(sensitivity)와 특이성(specificity)이 높아 각광받고 있다. 하지만, 복잡한 디자인 방식의 프로브 검출은 값이 비싸고 사용의 불편함이 있다. 따라서 보다 간편한 디자인을 통해 신속하고 정확성 높은 검출 기술의 개발이 절실히 요구되는 상황이다.
이에 본 발명자들은 신속하고 정확성 높은 노인성 황반변성 유전자의 유전형 판별방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 시료에서 노인성 황반변성 관련 유전자를 프라이머로 증폭한 다음, 유전자 변이 특이적 프로브로 혼성화 하여 융해 곡선을 분석할 경우, 신속하고 정확하게 노인성 황반변성 유전자의 변이 여부를 판별할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 노인성 황반변성 연관 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브를 이용한 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열쌍; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열쌍; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열쌍; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열쌍; 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열쌍; 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열쌍; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열쌍; 서열번호 38 및 서열번호 39의 염기서열쌍; 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열쌍; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열쌍; 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열쌍; 서열번호 46 및 서열번호 47의 염기서열쌍; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열쌍; 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열쌍; 서열번호 52 및 서열번호 53의 염기서열쌍; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열쌍; 서열번호 56 및 서열번호 57의 염기서열쌍; 서열번호 58 및 서열번호 59의 염기서열쌍; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열쌍; 서열번호 62 및 서열번호 63의 염기서열쌍; 서열번호 64 및 서열번호 65의 염기서열쌍; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열쌍; 및 서열번호 68 및 서열번호 69의 염기서열쌍;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 노인성 황반변성 연관 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브를 이용한 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 genomic DNA를 추출하는 단계; (b) ADAMTS9, APOC1, ARMS2, C2, C3, C6orf223, CETP, CFH, CFI, COL10A1, FGD6, FRK, LIPC, SKIV2L, SLC44A4, SLC16A8, TGFBR1 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 판별하는 단계를 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 노인성 황반변성의 위험도 예측이 가능하여 노인성 황반변성 질환 예방을 통해 사회적 비용을 감소시킬 수 있으며, 또한 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 Melting Array 방법은 간단하고 신속·정확하며 저비용으로 노인성 황반변성 연관 유전자 변이를 판별할 수 있다는 장점을 제공한다.
도 1은 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별 키트 PCR 조건을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 결과를 표준 실험(sanger sequencing)과 비교한 결과이다.
도 3은 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 PNA 프로브를 사용하여 다중 분석한 결과이다.
도 4는 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 PNA 프로브의 실험자간 재현성을 분석한 결과이다.
도 5는 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 PNA 프로브의 장비간 재현성을 분석한 결과이다.
도 6은 노인성 황반변성 관련 유전자 변이 판별용 PNA 프로브의 시험시간에 따른 재현성을 분석한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에서 표적핵산은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명에서는 노인성 황반변성 관련 유전자의 유전형 판별을 위한 빠르고 정확한 방법을 개발하고자 하였다.
본 발명에서는 노인성 황반변성 관련 유전자의 유전형을 PNA 프로브로 검출할 경우, 복잡한 과정을 거치지 않고 융해곡선의 분석만으로 유전형을 판별할 수 있음을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 노인성 황반변성 관련 유전자인 ADAMTS9, APOC1, ARMS2, C2, C3, C6orf223, CETP, CFH, CFI, COL10A1, FGD6, FRK, LIPC, SKIV2L, SLC44A4, SLC16A8, TGFBR1 및 VEGFA의 SNP에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 설계하고, 이를 이용하여 융해곡선을 분석할 경우, 추가적인 분석 작업 없이 융해 곡선의 분석만으로 상기 유전자의 유전형을 판별할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 노인성 황반변성(age-related macular degeneration; AMD) 연관 유전자 변이 판별용 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 PNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Morpholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃ 가량 융해온도(melting temperature; Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm 값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)을 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm 값을 조절할 수 있으며, 같은 길이의 PNA 프로브라도 probe에 변화를 주어 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm 값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm 값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 빠르고 정확한 분석이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 제한되지는 않으나 ADAMTS9 유전자의 rs6795735, APOC1유전자의 rs4420638, ARMS2 유전자의 rs10490924, C2유전자의 rs9332739, C3 유전자의 rs2230199, C6orf223 유전자의 rs2295334, CETP 유전자의 rs2303790, rs3764261, CFH 유전자의 rs800292, rs1061170, rs10737680, rs1329428, CFI 유전자의 rs10033900, rs4698775, COL10A1 유전자의 rs3812111, FGD6 유전자의 rs10507047, FRK 유전자의 rs1999930, LIPC 유전자의 rs920915, SKIV2L 유전자의 rs429608, rs116503776, SLC44A4 유전자의 rs12661281, SLC16A8 유전자의 rs8135665, TGFBR1 유전자의 rs334353 및 VEGFA 유전자의 rs943080으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자와 혼성화(hybridization)하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 리포터(reporter) 또는 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 프로브는 표적핵산과 혼성화 된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 표적핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.
본 발명에서 "PNA 프로브(probe)"는 표적핵산이 존재하는 경우 표적핵산에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적핵산이 없는 경우 내부컨트롤에 결합하여 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있으며, 내부컨트롤과 표적핵산 융해곡선 차이를 이용하여 위양성 및 위음성 시그널을 구분할 수 있다. PNA 프로브는 택맨 프로브(TaqMan probe)의 가수분해 방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비콘 프로브(molecular beacon probe) 및 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
본 발명의 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabcyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 표적핵산의 염기서열과 완전 혼성화(perfect match)일 때와 불완전 혼성화(mismatch)일 때 융해온도(melting temperature) 차이가 5℃ 내지 30℃인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 5℃ 내지 20℃, 더욱 바람직하게는 6℃ 내지 17℃인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해온도는 표적핵산의 염기서열과 완전 혼성화일 때 56℃ 내지 75℃이고, 불완전 혼성화일 때 38℃ 내지 62℃인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열쌍; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열쌍; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열쌍; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열쌍; 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열쌍; 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열쌍; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열쌍; 서열번호 38 및 서열번호 39의 염기서열쌍; 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열쌍; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열쌍; 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열쌍; 서열번호 46 및 서열번호 47의 염기서열쌍; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열쌍; 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열쌍; 서열번호 52 및 서열번호 53의 염기서열쌍; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열쌍; 서열번호 56 및 서열번호 57의 염기서열쌍; 서열번호 58 및 서열번호 59의 염기서열쌍; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열쌍; 서열번호 62 및 서열번호 63의 염기서열쌍; 서열번호 64 및 서열번호 65의 염기서열쌍; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열쌍; 및 서열번호 68 및 서열번호 69의 염기서열쌍;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 노인성 황반변성 연관 유전자 증폭용 프라이머 쌍(primer pair)에 관한 것이다.
정방향 프라이머(forward primer)로 서열번호 24, 역방향 프라이머(reverse primer)로 서열번호 25의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 26, 역방향 프라이머로 서열번호 27의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 28, 역방향 프라이머로 서열번호 29의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 30, 역방향 프라이머로 서열번호 31의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 32, 역방향 프라이머로 서열번호 33의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 34, 역방향 프라이머로 서열번호 35의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 36, 역방향 프라이머로 서열번호 37의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 38, 역방향 프라이머로 서열번호 39의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 40, 역방향 프라이머로 서열번호 41의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 42, 역방향 프라이머로 서열번호 43의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 44, 역방향 프라이머로 서열번호 45의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 46, 역방향 프라이머로 서열번호 47의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 48, 역방향 프라이머로 서열번호 49의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 50, 역방향 프라이머로 서열번호 51의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 52, 역방향 프라이머로 서열번호 53의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 54, 역방향 프라이머로 서열번호 55의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 56, 역방향 프라이머로 서열번호 57의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 58, 역방향 프라이머로 서열번호 59의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 60, 역방향 프라이머로 서열번호 61의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 62, 역방향 프라이머로 서열번호 63의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 64, 역방향 프라이머로 서열번호 65의 염기서열; 정방향 프라이머로 서열번호 66, 역방향 프라이머로 서열번호 67의 염기서열; 및 정방향 프라이머로 서열번호 68, 역방향 프라이머로 서열번호 69의 염기서열;인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 제한되지는 않으나 하나 이상의 상기 프라이머 쌍, 상기 프로브 및 FMCA 버퍼를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 PNA 프로브와 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍은 ADAMTS9 유전자의 rs6795735의 염기변이를, 서열번호 2의 PNA 프로브와 서열번호 26 내지 27의 프라이머 쌍은 APOC1 유전자 또는 rs4420638 염기 변이, 서열번호 3의 PNA 프로브와 서열번호 28 내지 29의 프라이머 쌍은 ARMS2 유전자의 rs10490924 염기변이, 서열번호 4의 PNA 프로브와 서열번호 30 내지 31의 프라이머 쌍은 C2 유전자의 rs9332739 염기 변이, 서열번호 5의 PNA 프로브와 서열번호 32 내지 33의 프라이머 쌍은 C3유전자의 rs2230199 염기변이, 서열번호 6의 PNA 프로브와 서열번호 34 내지 35의 프라이머 쌍은 C6orf223 유전자의 rs2295334 염기변이, 서열번호 7 내지 8의 PNA 프로브와 서열번호 36 내지 39의 프라이머 쌍은 CETP 유전자 또는 염기 변이(rs2303790, rs3764261), 서열번호 9 내지 12의 PNA 프로브와 서열번호 40 내지 47의 프라이머 쌍은 CFH 유전자의 rs1329428, rs800292, rs1061170, rs10737680 염기 변이, 서열번호 13 내지 14의 PNA 프로브와 서열번호 48 내지 51의 프라이머쌍은 CFI의 유전자 또는 그 변이(rs10033900, rs4698775), 서열번호 15의 PNA 프로브와 서열번호 52 내지 53의 프라이머 쌍은 COL10A1 유전자의 rs3812111 염기변이, 서열번호 16의 PNA 프로브와 서열번호 54 내지 55의 프라이머 쌍은 FGD6의 유전자 또는 염기변이(rs10507047), 서열번호 17의 PNA 프로브와 서열번호 56 내지 57의 프라이머 쌍은 FRK 유전자 또는 rs1999930 염기변이, 서열번호 18의 PNA 프로브와 서열번호 58 내지 59의 프라이머 쌍은 LIPC 유전자의 rs920915 염기변이, 서열번호 19의 PNA 프로브와 서열번호 60 내지 61의 프라이머 쌍은 SKIV2L 유전자 또는 rs429608 염기변이, 서열번호 20의 PNA 프로브와 서열번호 62 내지 63의 프라이머 쌍은 SLC16A8 유전자의 rs8135665 염기변이, 서열번호 21의 PNA 프로브와 서열번호 64 내지 65의 프라이머 쌍은 SLC44A4 유전자의 rs12661281 염기변이, 서열번호 22의 PNA 프로브와 서열번호 66 내지 67의 프라이머 쌍은 TGFBR1 유전자의 rs334353 염기변이, 서열번호 23의 PNA 프로브와 서열번호 68 내지 69의 프라이머 쌍은 VEGFA 유전자 또는 rs943080 염기변이의 검출용 PCR 조성물이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 2 이상의 표적핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적핵산의 염기변이를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 조성물 또는 키트는 다중 표적핵산 또는 단일 표적핵산의 염기변이를 분석하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 genomic DNA(gDNA)를 추출하는 단계; (b) ADAMTS9, APOC1, ARMS2, C2, C3, C6orf223, CETP, CFH, CFI, COL10A1, FGD6, FRK, LIPC, SKIV2L, SLC44A4, SLC16A8, TGFBR1 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 판별하는 단계를 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열쌍; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열쌍; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열쌍; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열쌍; 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열쌍; 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열쌍; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열쌍; 서열번호 38 및 서열번호 39의 염기서열쌍; 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열쌍; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열쌍; 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열쌍; 서열번호 46 및 서열번호 47의 염기서열쌍; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열쌍; 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열쌍; 서열번호 52 및 서열번호 53의 염기서열쌍; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열쌍; 서열번호 56 및 서열번호 57의 염기서열쌍; 서열번호 58 및 서열번호 59의 염기서열쌍; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열쌍; 서열번호 62 및 서열번호 63의 염기서열쌍; 서열번호 64 및 서열번호 65의 염기서열쌍; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열쌍; 및 서열번호 68및 서열번호 69의 염기서열쌍;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 판별방법은 타겟 DNA 또는 RNA가 존재하는 경우 타겟에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 타겟이 없는 경우 즉, 돌연변이의 경우, 융해온도(Tm) 값의 차이가 발생하는 것을 특징으로 하며, 이를 이용하여 노인성 황반변성 연관 유전형을 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 유전자의 변이체는 제한되지는 않으나 상기 ADAMTS9 유전자의 rs6795735, APOC1유전자의 rs4420638, ARMS2 유전자의 rs10490924, C2유전자의 rs9332739, C3 유전자의 rs2230199, C6orf223 유전자의 rs2295334, CETP 유전자의 rs2303790, rs3764261, CFH 유전자의 rs800292, rs1061170, rs10737680, rs1329428, CFI 유전자의 rs10033900, rs4698775, COL10A1 유전자의 rs3812111, FGD6 유전자의 rs10507047, FRK 유전자의 rs1999930, LIPC 유전자의 rs920915, SKIV2L 유전자의 rs429608. rs116503776, SLC44A4 유전자의 rs12661281, SLC16A8 유전자의 rs8135665, TGFBR1 유전자의 rs334353 및 VEGFA 유전자의 rs943080로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 시료는 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검체 시료는 제한되지는 않으나 모발, 구강상피세포, 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 DNA 시료일 수 있다.
본 발명에서 '검체 시료'는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(bio-sample)를 분석한다. 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 표준 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 절량 PCR, DNA 칩 및 DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실시간 PCR 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 이에 제한되지는 않으나, FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 타겟 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨 후, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한 다음, 이 검출 결과에 기초하여 Tm 값을 결정함으로써, 점 돌연변이(point mutation)의 유무를 판단하는 방법이다.
Tm 값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm 값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm 값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준 값보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 판별은 유전자 증폭 효율 또는 PCR 산물 검출 방법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 2 이상의 표적핵산을 사용하고, 프로브에 표지되는 리포터를 표적핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적핵산의 염기변이를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 다중 표적핵산 또는 단일 표적핵산의 염기변이를 분석하는데 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 노인성 황반변성 질환 예방을 위한 위험도 예측용 프로브의 제조
노인성 황반변성 질환 관련 유전자와 임상적인 연관성이 확인된 염기 변이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이 중 아시아 및 한국인에게 연관이 있는 돌연변이를 확보하였다. 노인성 황반변성과 관련된 18개 유전자, 23개의 SNP를 이용하여 노인성 황반변성 질환의 위험도를 예측할 수 있는 키트를 제작하였다(표 1).
염기 변이 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브는 wild type과 mutant type의 구분이 가능하게 설계되었으며, 표 2와 같이 디자인하여 제작하였다. PNA 프로브는 파나진(panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량 분석법을 이용하여 확인하였다. 또한 다중분석이 가능하도록 FAM, HEX, Texas Red, Cy5 형광 중에 선택을 하였으며, 불필요한 이차구조는 피하도록 제조하였다.
노인성 황반변성의 위험도 예측 키트는 사람의 혈액, 조직, 체액 등의 인체시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 PCR을 수행하며, 총 6개의 set로 구성하여 다중 분석을 진행하였다.
노인성 황반변성과 관련된 유전자 및 유전형 정보
No. Gene Nucleotide change Location Major allele Risk allele
1 ADAMTS9 rs6795735 Chr3:64719689 T T
2 APOC1 rs4420638 Chr19:44919689 A A
3 ARMS2 rs10490924 Chr10:122454932 G T
4 C2 rs9332739 Chr6:31936027 G G
5 C3 rs2230199 Chr19:6718376 C C
6 C6orf223 rs2295334 Chr6:44003090 G G
7 CETP rs2303790 Chr16:56983380 A G
8 rs3764261 Chr16:56959412 G A
9 CFH rs1329428 Chr1:196733680 G G
10 rs800292 Chr1:196673103 C C
11 rs1061170 Chr1:196690107 T C
12 rs10737680 Chr1:196710325 A A
13 CFI rs10033900 Chr4:109737911 C T
14 rs4698775 Chr4:109669323 T G
15 COL10A1 rs3812111 Chr6:116122572 T T
16 FGD6 rs10507047 Chr12:95210514 T T
17 FRK rs1999930 Chr6:116065971 G T
18 LIPC rs920915 Chr15:58396268 G C
19 SKIV2L rs429608 Chr6:31962685 G G
20 SLC44A4 rs12661281 Chr6:31874821 A T
21 SLC16A8 rs8135665 Chr22:38080269 C T
22 TGFBR1 rs334353 Chr9:99146083 T T
23 VEGFA rs943080 Chr6:43858890 T T
염기의 변이 부분은 보통 표적핵산과 5℃ 이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 PNA 프로브 결합 부위 가운데에 위치하도록 디자인하지만, 융해온도(Tm)의 최적화를 위해 표적핵산과 PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 중앙 부분에 유전자 염기서열과 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다(표 2). PNA 프로브는 소광자는 Dabcyl을 사용하였으며 O는 링커, K는 라이신(lysine)을 의미한다.
노인성 황반변성 관련 유전형 판별을 위한 PNA probe 서열
서열번호 프로브 염기서열
서열번호 1 ADAMTS9 Dabcyl-ATCCTTCATGTCAGA-O-K(HEX)
서열번호 2 APOC1 Dabcyl-CTTTTCCTAGTGTGGTCT-O-K(HEX)
서열번호 3 ARMS2 Dabcyl-CCAGCTGCTAAAATCC-O-K(TxR)
서열번호 4 C2 Dabcyl-TGACTGAGGTGATC-O-K(Cy5)
서열번호 5 C3 Dabcyl-TTGTTGCCCCCCTTT-O-K(FAM)
서열번호 6 C6orf223-2 Dabcyl-CTGTCATCCGCGGC-O-K(K(TxR)
서열번호 7 CETP-1 Dabcyl-TCTTCGACATCATCAA-O-K(HEX)
서열번호 8 CETP-2 Dabcyl-CATCTGGGTTGTCTGC-O-K(Cy5)
서열번호 9 CFH-1 Dabcyl-ATTCTAAAGCTCTTAG-O-K(FAM)
서열번호 10 CFH-2 Dabcyl-ATTATTACATTTCCAAG-O-K(HEX)
서열번호 11 CFH-3 Dabcyl-TCAAAATTATGGAAG-O-K(TxR)
서열번호 12 CFH-4 Dabcyl-CTGTCTCAGCGTATT-O-K(Cy5)
서열번호 13 CFI-1-1 Dabcyl-TTCTCGGAATGCTAA-O-K(K(TxR)
서열번호 14 CFI-2 Dabcyl-TGCTGTCCCTGGTC-O-K(Cy5)
서열번호 15 COL10A1 Dabcyl-ATTAAAGTTCTTACCT-O-K(TxR)
서열번호 16 FGD6 Dabcyl-GTCATCCTGGCAAG-O-K(FAM)
서열번호 17 FRK Dabcyl-TTTCCTTGTGATACAG-O-K(FAM)
서열번호 18 LIPC Dabcyl-AAGCACAGAACATTC-O-K(FAM)
서열번호 19 SKIV2L Dabcyl-ATTGACTCCCCAGTG-O-K(HEX)
서열번호 20 SLC16A8 Dabcyl-TCCCTGACCACCCTC-O-K(HEX)
서열번호 21 SLC44A4-2 Dabcyl-CGGAGGTCCCATG-O-K(FAM)
서열번호 22 TGFBR1 Dabcyl-GCATTCTTTTGTATCTA-O-K(TxR)
서열번호 23 VEGFA Dabcyl-GAGCTAATCTGCTGC-O-K(Cy5)
노인성 황반변성 관련 유전형 판별을 위한 primer 서열
서열번호 프라이머 염기서열
서열번호 24 ADAMTS9_F CAGTCACTTCTATGGTGGAA
서열번호 25 ADAMTS9_R CCACAAAGCTAACAGGCCCAAA
서열번호 26 APOC1_F ACTTGTATAAGGTCACACAGCCA
서열번호 27 APOC1_R AGAGAGTGAGTCTGCCTCAAAACA
서열번호 28 ARMS2_F GAGTTGGTGGAGAAGGAGCCA
서열번호 29 ARMS2_R ATTTCTTACCAGTGTCAGGTGGT
서열번호 30 C2_F3 GCTTTGAGATCAATGTGAGCGTT
서열번호 31 C2_R3 ATCACGTGATGACACCCGTACC
서열번호 32 C3_F1 TAGATGGTCTTGTCTGTCTGGAT
서열번호 33 C3_R TTGGAACAGACCCCTGACAAT
서열번호 34 C6orf223_F GCGAGAAGAAATTACAGGATTGCA
서열번호 35 C6orf223_R1 GCGTCTTAATTACGGCGCGTTGG
서열번호 36 CETP-1_F GCTCCCCAAGAAGGGCTGACTG
서열번호 37 CETP-1_R GTCACCCCAGGAATCCTGTCTG
서열번호 38 CETP-2_F CACTGTGTTGGTCCCTTCACCTG
서열번호 39 CETP-2_R2 GGTGGCTATGAAGAGTGAATGAG
서열번호 40 CFH-1_F AAGTGCTTACACACCCATATAAAA
서열번호 41 CFH-1_R CCACACAAACTTGAGTGCCCTAAC
서열번호 42 CFH-2_F GGATTAAGAGCAACCCATTCTCC
서열번호 43 CFH-2_R CCAGGCTATCTATAAATGCCGC
서열번호 44 CFH3_F3 GTCTTCAGTTATACATTATTTTTGG
서열번호 45 CFH-3_R5 TAGATTTACCCTGTACAAACTTTCT
서열번호 46 CFH-4_F1 TGGTGCCCTTGTGTTGATTAAAG
서열번호 47 CFH-4_R1 TCAGGTTCACATGCCCACTGTTT
서열번호 48 CFI-1_F2 GCTAGCAACAAATTCACTCAATTTT
서열번호 49 CFI-1_R TCTGAAATCATACAAGCAAGAAGT
서열번호 50 CFI-2_F GCTTCTGTAGTCTGGAATTAGGAG
서열번호 51 CFI-2_R2 CAGCCCTCTGAAGCGACTCTATGTG
서열번호 52 COL10A1_F TGCTGAACACAGGTTAGATTTTGGT
서열번호 53 COL10A1_R GGTCAAGTGAACTCACAGCTCTAT
서열번호 54 FGD6_F ACTCCTTTTCCCATTTTCCAGAGCCT
서열번호 55 FGD6_R CAGTTGCCACTTACAGCTTCCTAGTG
서열번호 56 FRK_F TTGCAATCGAACAAGAGTGAAAGTAG
서열번호 57 FRK_R GTGTTGTTTCCCCAAGCATATTGCCC
서열번호 58 LIPC_F AATGTATCTGTTCCATCATTTCTCC
서열번호 59 LIPC_R2 CAAGCTGTTAGTCACCTTTTTAGAT
서열번호 60 SKIV2L_F GACATCGTTGATATAGTGAACC
서열번호 61 SKIV2L_R AAGATGTGGCCGTTGTGGAGAGT
서열번호 62 SLC16A8_F CAACAAGCCCTGCCCATCCATGC
서열번호 63 SLC16A8_R GTGTCTTTCACTGTGCAGATGGC
서열번호 64 SLC44A4_F1 TCCCCAACAGTCTGTGAGAACT
서열번호 65 SLC44A4_R GTTCCAGCCCCTTAGTGTTCTCTC
서열번호 66 TGFBR1_F AGTGGTTGCTGTAGGTCTCTGTGG
서열번호 67 TGFBR1_R TGAAAGGAAGGGCACGAATATACT
서열번호 68 VEFGA_R1 GCCTCTGGGTGGAAGGAACAGC
서열번호 69 VEGFA_F GGAATTAAAGCTCCTGGCCTTC
또한 노인성 황반변성 질환 위험도를 예측할 수 있는 변이 부위를 증폭하기 위하여 양방향 프라이머를 디자인하였으며(표 3), PNA 및 다중 분석에서 불필요한 이차구조를 피하도록 제조하였다. 상기 분석 결과를 통해 유전자를 합성하여 표준물질로 사용하였다.
실시예 2: 노인성 황반변성 관련 유전형 판별을 위한 융해곡선 분석
노인성 황반변성 관련 유전형 판별을 위하여 사람의 genomic DNA를 증폭하여 분석을 진행하였으며, 염기 변이 부위를 판별하기 위해 융해곡선 분석을 실시하였다.
융해곡선 분석을 위한 단일 가닥 표적 핵산 생성은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였다. 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 PNA 프로브를 사용하였으며, PCR의 조건은 다음과 같다; 2ⅹqPCR PreMix(시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, 양방향 프라이머 각각 0.5㎕, PNA 0.5㎕, 3㎕ human genomic DNA(15ng/㎕)를 첨가한 다음 총 볼륨이 20㎕ 이 되도록 증류수를 첨가한 시료로 리얼타임 PCR을 실시하였다.
리얼타임 PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초 동안 반응시키는 과정을 45 cycle 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 온도를 점차적으로 내려 혼성화 시킨 후, 30℃에서 85℃까지 0.5℃씩 상승시켰으며 0.5초간 정지 상태를 유지하며 형광을 측정하는 융해곡선 분석을 수행하였다 (도 1).
사람의 genomic DNA를 주형으로 하여 융해곡선 분석을 수행한 결과, 염기 변이에 따른 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 확인하기 위하여 Sanger sequencing을 진행하였다(도 2).
노인성 황반변성 관련 위험도를 예측할 수 있는 키트의 다중분석 조건을 확립하였으며, 염기 변이에 따른 PNA 프로브의 Melting Temperature의 변화가 일치하였다(도 3).
노인성 황반변성 관련 위험도 예측을 위한 다중 분석 결과를 이용하여 판정표를 제작하였으며, 장비의 검출 한계에 따라 Melting Temperature가 달라질 수 있어 ±3℃의 판정 범위를 정하였다(표 4). 표 4에 나타낸 바와 같이, wild type의 경우 perfect match에 해당하며, mutant의 경우 AMD 위험도를 갖는 것으로 예측할 수 있다.
노인성 황반변성 관련 질환 위험도 예측 키트 판정표
Set Gene : Mutation Flour . Wild Mutant Heterozygote
1 set CFH:rs1329428 FAM 60 ± 3 ℃ 51 ± 3 ℃ 60 ± 3 ℃, 51 ± 3 ℃
CFH:rs800292 HEX 59 ± 3 ℃ 46 ± 3 ℃ 59 ± 3 ℃, 46 ± 3 ℃
CFH:rs1061170 T>C TxR 62 ± 3 ℃ 56 ± 3 ℃ 62 ± 3 ℃, 56 ± 3 ℃
CFH:rs10737680 Cy5 62 ± 3 ℃ 52 ± 3 ℃ 62 ± 3 ℃, 52 ± 3 ℃
2 set SLC44A4:rs12661281 FAM 72 ± 3 ℃ 56 ± 3 ℃ 72 ± 3 ℃, 56 ± 3 ℃
SLC16A8:rs8135665 HEX 68 ± 3 ℃ 53 ± 3 ℃ 68 ± 3 ℃, 53 ± 3 ℃
CFI:rs4698775 TxR 59 ± 3 ℃ 51 ± 3 ℃ 59 ± 3 ℃, 51 ± 3 ℃
CFI:rs10033900 Cy5 66 ± 3 ℃ 49 ± 3 ℃ 66 ± 3 ℃, 49 ± 3 ℃
3
set		 C3:rs2230199 FAM 61 ± 3 ℃ 47 ± 3 ℃ 61 ± 3 ℃, 47 ± 3 ℃
SKIV2L:rs429608 HEX 68 ± 3 ℃ 54 ± 3 ℃ 68 ± 3 ℃, 54 ± 3 ℃
C6orf223:rs2295334 TxR 71 ± 3 ℃ 59 ± 3 ℃ 71 ± 3 ℃, 59 ± 3 ℃
C2:rs9332739 Cy5 68 ± 3 ℃ 52 ± 3 ℃ 68 ± 3 ℃, 52 ± 3 ℃
4 set
 FRK:rs1999930 FAM 66 ± 3 ℃ 59 ± 3 ℃ 66 ± 3 ℃, 59 ± 3 ℃
CETP:rs2303790 A>G HEX 63 ± 3 ℃ 53 ± 3 ℃ 63 ± 3 ℃, 53 ± 3 ℃
COL10A1:rs3812111 TxR 64 ± 3 ℃ 48 ± 3 ℃ 64 ± 3 ℃, 48 ± 3 ℃
CETP:rs3764261 G>T Cy5 69 ± 3 ℃ 58 ± 3 ℃ 69 ± 3 ℃, 58 ± 3 ℃
5 set FGD6:rs10507047 FAM 66 ± 3 ℃ 58 ± 3 ℃ 66 ± 3 ℃, 58 ± 3 ℃
ADAMTS9:rs6795735 HEX 64 ± 3 ℃ 56 ± 3 ℃ 64 ± 3 ℃, 56 ± 3 ℃
TGFBR1:rs334353 TxR 60 ± 3 ℃ 51 ± 3 ℃ 60 ± 3 ℃, 51 ± 3 ℃
VEGFA:rs943080 Cy5 66 ± 3 ℃ 57 ± 3 ℃ 66 ± 3 ℃, 57 ± 3 ℃
6 set LIPC:rs920915 FAM 66 ± 3 ℃ 54 ± 3 ℃ 66 ± 3 ℃, 54 ± 3 ℃
APOC1:rs4420638 HEX 63 ± 3 ℃ 52 ± 3 ℃ 63 ± 3 ℃, 52 ± 3 ℃
ARMS2:rs10490924 G>T TxR 67 ± 3 ℃ 53 ± 3 ℃ 67 ± 3 ℃, 53 ± 3 ℃
A(adenine), T(thymine), G(guanine) 및 C(cytosine)는 뉴클레오티드(nucleotide)의 기호를 나타낸 것이며, rs1061170 T>C의 경우, 1번 염색체의 196690107번째 DNA 염기서열 위치(position)의 T가 C로 뉴클레오티드 변화(nucleotide change)한 것을 의미한다(P. Metcalfe, Vox Sanguinsis, 87(Supp.1), S82-S86, 2004). rs2303790 A>G의 경우, 16번 염색체의 56983380번째 DNA 염기서열 위치의 A가 G로 뉴클레오티드 변화한 것이며, rs3764261 G>T의 경우, 16번 염색체의 56959412번째 DNA 염기서열 위치의 G가 T로 뉴클레오티드 변화한 것이고, rs10490924 G>T의 경우, 10번 염색체의 56959412번째 DNA 염기서열 위치의 G가 T로 뉴클레오티드 변화한 것이다.
실시예 3: 노인성 황반변성 관련 유전형 판별 키트의 분석적 재현성 시험
노인성 황반변성 관련 유전형 판별 키트의 분석적 재현성을 확인하기 위하여, 실험자간, 장비간, 분석 시간에 따른 재현성이 유지되는지 확인하였다.
실험자간의 재현성을 확인하기 위하여 3명의 실험자가 독립적으로 실험을 수행하였으며(도 4), 모든 마커에서 재현성이 높은 것을 확인하였다.
사용하는 장비간의 재현성을 확인하기 위해 다른 3대의 CFX96 real-time PCR 장비를 이용하여 실험을 수행하였으며, 모든 마커의 Tm 값이 판정표에 있는 Tm값에 포함되는 것을 확인하였다(도 5).
시험 시간에 따른 재현성을 확인하기 위해 1주일 간격으로 3번의 시험을 진행하였으며, 모든 마커의 Tm 값이 판정 기준에 적합하였으며, 시험 시간에 따른 재현성이 높음을 확인하였다(도 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SeasunBio Materials <120> Peptide Nucleic Acid Probe for Discrimination of Genetic Variant related to Genotyping Age-related Macular Degeneration(AMD) and Method Using the Same <130> P18-B236 <160> 69 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 1 atccttcatg tcaga 15 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 2 cttttcctag tgtggtct 18 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 ccagctgcta aaatcc 16 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 tgactgaggt gatc 14 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 ttgttgcccc ccttt 15 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 ctgtcatccg cggc 14 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 tcttcgacat catcaa 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 8 catctgggtt gtctgc 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 9 attctaaagc tcttag 16 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 10 attattacat ttccaag 17 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 11 tcaaaattat ggaag 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 12 ctgtctcagc gtatt 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 13 ttctcggaat gctaa 15 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 14 tgctgtccct ggtc 14 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 15 attaaagttc ttacct 16 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 16 gtcatcctgg caag 14 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 17 tttccttgtg atacag 16 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 18 aagcacagaa cattc 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 19 attgactccc cagtg 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 20 tccctgacca ccctc 15 <210> 21 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 21 cggaggtccc atg 13 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 22 gcattctttt gtatcta 17 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 23 gagctaatct gctgc 15 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cagtcacttc tatggtggaa 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ccacaaagct aacaggccca aa 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 acttgtataa ggtcacacag cca 23 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 agagagtgag tctgcctcaa aaca 24 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gagttggtgg agaaggagcc a 21 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atttcttacc agtgtcaggt ggt 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gctttgagat caatgtgagc gtt 23 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 atcacgtgat gacacccgta cc 22 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tagatggtct tgtctgtctg gat 23 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ttggaacaga cccctgacaa t 21 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcgagaagaa attacaggat tgca 24 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gcgtcttaat tacggcgcgt tgg 23 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gctccccaag aagggctgac tg 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gtcaccccag gaatcctgtc tg 22 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cactgtgttg gtcccttcac ctg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ggtggctatg aagagtgaat gag 23 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 aagtgcttac acacccatat aaaa 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ccacacaaac ttgagtgccc taac 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ggattaagag caacccattc tcc 23 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ccaggctatc tataaatgcc gc 22 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gtcttcagtt atacattatt tttgg 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNA 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Claims (19)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 노인성 황반변성(age-related macular degeneration; AMD) 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 리포터(reporter)와 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3 및 Alexa680으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  5. 제3항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 표적핵산의 염기서열과 완전 혼성화(perfect match)일 때와 불완전 혼성화(mismatch)일 때 융해온도(melting temperature) 차이가 5℃ 내지 30℃인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  7. 제6항에 있어서, 상기 융해온도는 표적핵산의 염기서열과 완전 혼성화일 때 56℃ 내지 75℃이고, 불완전 혼성화일 때 38℃ 내지 62℃인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 프로브.
  8. 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열쌍; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열쌍; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열쌍; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열쌍; 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열쌍; 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열쌍; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열쌍; 서열번호 38 및 서열번호 39의 염기서열쌍; 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열쌍; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열쌍; 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열쌍; 서열번호 46 및 서열번호 47의 염기서열쌍; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열쌍; 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열쌍; 서열번호 52 및 서열번호 53의 염기서열쌍; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열쌍; 서열번호 56 및 서열번호 57의 염기서열쌍; 서열번호 58 및 서열번호 59의 염기서열쌍; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열쌍; 서열번호 62 및 서열번호 63의 염기서열쌍; 서열번호 64 및 서열번호 65의 염기서열쌍; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열쌍; 및 서열번호 68 및 서열번호 69의 염기서열쌍;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 노인성 황반변성 연관 유전자 증폭용 프라이머 쌍(primer pair).
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프로브 및 제8항의 프라이머 쌍을 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프로브 및 제8항의 프라이머 쌍을 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별용 키트.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  12. 다음 단계를 포함하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법:
    (a) 검체 시료로부터 genomic DNA(gDNA)를 추출하는 단계;
    (b) ADAMTS9, APOC1, ARMS2, C2, C3, C6orf223, CETP, CFH, CFI, COL10A1, FGD6, FRK, LIPC, SKIV2L, SLC44A4, SLC16A8, TGFBR1 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 판별하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열쌍; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열쌍; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열쌍; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열쌍; 서열번호 32 및 서열번호 33의 염기서열쌍; 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열쌍; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열쌍; 서열번호 38 및 서열번호 39의 염기서열쌍; 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열쌍; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열쌍; 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열쌍; 서열번호 46 및 서열번호 47의 염기서열쌍; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열쌍; 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열쌍; 서열번호 52 및 서열번호 53의 염기서열쌍; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열쌍; 서열번호 56 및 서열번호 57의 염기서열쌍; 서열번호 58 및 서열번호 59의 염기서열쌍; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열쌍; 서열번호 62 및 서열번호 63의 염기서열쌍; 서열번호 64 및 서열번호 65의 염기서열쌍; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열쌍; 및 서열번호 68및 서열번호 69의 염기서열쌍;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 검체 시료는 모발, 구강상피세포, 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 표준 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 절량 PCR, DNA 칩 및 DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계의 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계의 판별은 유전자 증폭 효율 또는 PCR 산물 검출 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성 연관 유전자 변이 판별방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023212273A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Genentech, Inc. Treatments for age-related macular degeneration

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