KR101854760B1

KR101854760B1 - Pna 프로브를 이용하여 흰반점 바이러스를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR101854760B1
Application number: KR1020170059191A
Authority: KR
Inventors: 김영진; 김상조
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2018-05-04

Abstract

본 발명은 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 흰반점병 원인체인 흰반점바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

PNA 프로브를 이용하여 흰반점 바이러스를 검출하는 방법{Method for Detecting White Spot Syndrome Virus Using PNA Probes}

흰반점병(White Spot disease, WSD)의 원인체인 흰반점바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)는 수산물 검역에 있어서 50%이상을 차지하는 중요 질병이다. 고부가 가치의 양식 생물 중 하나인 새우에서 흰반점병 발생 시 양식이 거의 불가능할 정도로 치사율이 매우 높아 검사의 정확성이 매우 중요하며, 기본적으로 살아있는 생물에서 검사를 진행해 왔지만 최근 냉동에서도 검사를 확대할 계획을 가지고 있다.

현재 WSSV 진단 방법의 경우, OIE 매뉴얼에 따른 PCR 또는 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 진행하고 있으나, 전체 소요 시간이 길며, 진단 결과의 정확성이 떨어져 거의 활용되고 있지 않으며, 이를 대처하기 위하여 대만의 OIE 표준 실험실에서 개발한 'IQ2000'이라는 PCR 진단키트를 수입하여 사용하고 있다. 하지만 수입 제품의 경우 단가가 높으며, 수입에 따른 공급이 원활하지 못하여 검사 개체의 수량이 제한적이라는 단점을 가지고 있다. 따라서 시기적으로도 국내 원천기술을 이용한 WSSV 검사법의 확립 및 개발이 매우 중요함으로 정확성이 높으며, 저비용의 기술을 개발하고자 하였다.

이에, 본 발명자들은 WSSV를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 키트를 제작하고자 예의 노력한 결과, WSSV 의심 시료를 WSSV의 염기서열과 특이적인 PNA 프로브를 이용하여 리포터 및 소광자가 결합된 프로브를 프로브와 시료와의 융해패턴을 비교하는 경우, WSSV를 진단법의 효율을 극대화할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 흰반점바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 흰반점바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV) 유래 핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 함유하는 흰반점바이러스 검출용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) (i) 흰반점바이러스 또는 상기 바이러스 유래 핵산을 포함하는 시료 및 (ii) 상기 흰반점바이러스 유래 핵산서열에 상보적으로 결합하는 PNA 프로브를 혼합하여 혼성화시키는 단계;

(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브의 융해곡선을 얻는 단계; 및

(c) 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브의 융해온도를 확인하여 흰반점바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 흰반점바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 흰반점바이러스 유래 핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 PNA 프로브를 함유하는 흰반점바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여, 흰반점바이러스를 검출함으로서, WSV(white spot disease virus)를 검출하는 경우, 정확한 특이도를 나타내어, 기존의 실시간 유전자 증폭장치에서 발생되는 위양성을 줄여 검사의 정확성을 향상시킬 수 있다.

도 1은 흰반점병(WSD) 검출을 위한 바이러스의 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 TaqMan probe를 이용한 WSSV 검출 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 양성시료를 이용한 WSSV 검출 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 NTC 시료를 이용한 WSSV 검출실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 프라이머 농도를 달리한 WSSV 검출 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 PNA 프로브를 이용한 WSSV 검출 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 7은 PNA 프로브를 이용한 WSSV 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 PNA 프로브와 새롭게 디자인한 프라이머를 이용한 WSSV 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 TaqMan 프로브와 새롭게 디자인한 프라이머를 이용한 WSSV 검출 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 PNA 프로브를 이용한 WSSV 검출 Kit 성능 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 PNA 프로브를 이용한 WSSV 검출 Kit에 의한 결과분석 및 판정표를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 본 발명은 흰반점바이러스를 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 리얼타임 PCR을 수행하고, 융해온도를 통하여 융해곡선을 구하고, 흰반점바이러스를 검출하였다. 정확한 특이도를 나타내어, 기존의 실시간 유전자 증폭장치에서 발생되는 위양성을 줄여 검사의 정확성을 향상시켰다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) (i) 흰반점바이러스 또는 상기 바이러스 유래 핵산을 포함하는 시료 및 (ii) 상기 흰반점바이러스 유래 핵산서열에 상보적으로 결합하는 PNA 프로브를 혼합하여 혼성화시키는 단계;

(c) 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브의 융해온도를 확인하여 흰반점바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 흰반점바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 흰반점바이러스 유래의 특이 핵산과 상보적인 서열을 함유하며, 바람직하게는 서열번호 1~3 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스 유래 핵산은 서열번호 5 및 8로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 쌍을 이용하여 흰반점바이러스를 포함하는 시료를 증폭하여 수득하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 5 및 8로 표시되는 프라이머쌍을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 소광자(quenching)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

PNA(peptide nucleic acids)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA (Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며 기본 골격이 polyamide로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열·화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.

PNA-DNA 결합력은 DNA 간의 결합력에 비하여 매우 우수하여 1개의 뉴클레오타이드의 미스매치에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP 및 In/Del의 핵산의 변화를 검출 할 수 있게 된다.

PNA 프로브와 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 진단방법 개발이 용이하다. PNA probe는 TaqMan 프로브의 가수분해법과는 다른 혼성화 방법(hybridization method)을 염기서열의 차이를 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자비콘 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.

혼성화 분석 방법으로는 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용하며 FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 프로브 간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석한다. FMCA에 사용되는 PNA 프로브는 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9~15 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브에 변화를 주어 Tm값을 조절할 수 있다. PNA는 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM 방법은 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 분석이 가능하다.

PNA 프로브를 이용한 SNP 분석을 위해서는 SNP를 포함하는 부분의 염기를 이용한 프로브와 PCR을 위한 Forward / Reverse 프라이머 세트만 있으면 가능하다. PCR 조건은 기존의 사용하던 그대로 사용가능하며 PCR이 끝난 후 용해 과정(melting)이 필요하고 1℃ 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여, Tm값을 얻을 수 있으며, HRM (High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.

PNA 프로브를 이용한 결과의 최적화를 위하여는 Liquid type MeltingArray^TM방법 및 U-TOP^TM(Universal Temperature Of PNA)방법으로 표적핵산의 단일 염기서열의 치환 및 염기의 결실 또는 삽입을 효과적으로 검출하기 위하여, 리포터 (repoter) 및 소광자 (quencher)가 결합된 프로브를 이용하여 혼성화 과정 후 세척하는 과정과 프로브를 판형에 고정시킬 필요가 없는 액상형 어레이 방법을 활용하였다.

본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이가 나타날 경우 염기서열의 변이와 일치 시킬 수 없지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 염기 위치에 따른 Tm 값의 차이가 뚜렷하여 분석이 가능하다.

본 발명에서 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 '표적 핵산'은 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.

본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.

PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe) 등이 있다.

PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5~1℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.

본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 Target하는 염기서열이 없거나 변이가 있다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하다.

본 발명의 결과를 최적화하기 위한 기술적 방법으로는 Liquid type U-TOP 방법(시선바이오머티리얼스, 한국)으로 표적 핵산의 단일 염기서열의 치환 및 염기의 결실 또는 삽입을 효과적으로 검출할 수 있는 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 혼성화 과정 후 세척하는 과정과 PNA 프로브를 판형에 고정시킬 필요가 없는 액상형 어레이 방법을 활용할 수 있다.

본 발명의 상기 흰반점바이러스를 검출하는 방법은 검출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 흰반점바이러스 유래 핵산과 상보적인 염기서열을 포함하는 PNA 프로브를 함유하는 흰반점바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 키트는 서열번호 5 및 8로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: WSSV 검출용 PNA 프로브 및 프라이머의 제작

WSSV 검출용 프라이머 및 프로브의 경우 염기서열 분석을 통하여 OIE reference에 기재된 동일한 primer와 새롭게 제작한 primer를 혼합하여 사용하였으며, 상기 primer를 이용한 증폭산물 안에서 PNA 프로브를 제작하였다(도 1).

염기서열 분석 결과를 바탕으로 PNA 프로브 3종류를 제작하였으며, OIE reference 프라이머 이외의 프라이머 set를 추가적으로 제작하였다(표 1).

OIE reference 프라이머 및 새로 제작된 프라이머의 경우 코스모진텍(cosmogenetech, 한국)을 통하여 제작하였으며, OIE reference에 기재된 TaqMan 프로브의 경우 LT(AB, 미국)에서 제조하였다. 먼저 WSSV 검출을 위하여 직접 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. WSSV 검출을 위한 PNA 프로브의 융해온도가 72℃ 넘지 않도록 하여 PCR의 증폭에 영향을 주지 않도록 제작하였다.

WSSV 검출을 위한 PNA 프로브 및 프라이머

Name	Sequence 5`-3`	비고
WSS1011F	GGTCCCGTCCTCATCTCAG (서열번호 5)	OIE reference primer
WSS1079R	GCTGCCTTGCCGGAAATTA (서열번호 6)	OIE reference primer
WSD-1F	GAATCAATGGATTATGAAGATAGCG (서열번호7)	New design primer
WSD-1R	CTGGCGCATG AGGCGAATGG TAC (서열번호 8)	New design primer
WSD-P-1	Dabcyl-GAAGCCATGAAG-O-K (HEX) (서열번호 1)	PNA probe
WSD-P-2	Dabcyl-GCCGTCTATC-O-K (HEX) (서열번호 2)	PNA probe
WSD-P-3	Dabcyl-CATCTCAGAAGCCAT-O-K (HEX) (서열번호 3)	PNA probe
WSS-P1	FAM-AGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACA-TAMRA (서열번호 4)	TaqMan probe

표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.

실시예 2: OIE reference 방법을 이용한 WSD 검출 실험

OIE reference에 기재되어 있는 실험 방법을 통해 동일한 프라이머, 프로브, 실험 조건으로 WSSV 검출 실험을 진행하였다. 검출 실험에 사용한 시료의 경우, 가재로부터 검출이 확인된 시료로써 국립수산물품질관리원에서 보관하고 있는 양성시료 4개를 검출실험에 활용하였다. 실험 진행에 사용된 장비는 CFX96^TM(Bio-Rad, 미국)이며 실험 조성의 경우, 양성 시료 20ng, WSS1011F 프라이머 0.3μM, WSS1079R 프라이머 0.3μM, TaqMan 프로브 0.15μM, TaqMan Universal PCR Master MIX (PE Applied Biosyastems)를 첨가하여 최종 볼륨이 25μl이 되도록 하였으며, 실험의 조건은 도 2에 나타내었으며, 결과는 도 3에 나타내었다.

상기 OIE reference에 기재되어 있는 프라이머와 TaqMan 프로브를 이용하여 실시한 검출실험 확인 결과 양성대조군 모두 증폭곡선의 Ct값을 보였다. 하지만 음성대조군인 NTC (D.W)에서도 실제 양성 시료와 동일한 Ct값을 보여 위양성이 발생되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 검출실험 방법의 경우 OIE reference에 기재되어 있는 프라이머, NTC(D.W) 및 장비 내에서의 오염을 사전에 방지하고자 증류수(D.W)와 장비를 모두 달리하여 실험을 진행하였다.

상기 실험 결과를 바탕으로 NTC에 대한 검출 실험 결과 총 5번의 실험 중 하나의 NTC 시료를 제외하고 4개의 시료에서 증폭곡선이 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 상기와 같은 실험 결과는 동일한 염기서열의 프라이머, TaqMan 프로브를 다른 회사에 의뢰하여 제작하여 실험을 진행한 것으로 지속적으로 NTC 시료에서 위양성(false positive)이 확인되었다.

실시예 3: PNA 프로브를 이용한 WSSV 검출실험 방법

실시예 1에서 제조한 PNA 프로브를 이용한 WSSV 검출실험을 진행하였다. 검출 실험에 사용한 프라이머는 OIE reference에 기재되어 있는 프라이머 WSS1101F와 WSS1079R을 이용하였고, PNA 프로브는 최적의 검출 위치를 선별하기 위하여 증폭산물 내에 상보적으로 결합할 수 있도록 3개(WSD-P-1, WSD-P-2, WSD-P-3)의 probe를 제작하였다.

우선적으로 PNA 프로브를 이용한 검출 실험의 경우, 프라이머의 비율을 동량(symmetric)으로 진행하는 것이 아니라 비대칭(asymmetric)으로 실험을 진행해야 함으로 기존의 OIE reference에 기재되어 있는 동일한 조건으로 실험을 진행하되 프라이머의 양을 동량(WSS1011F 프라이머 0.3μM, WSS1079R 프라이머 0.3μM)과 비대칭 (WSS1011F 프라이머 0.3μM, WSS1079R 프라이머 0.03μM) 으로 조절하여 비교실험을 진행하였다(도 5).

실험에 사용한 시료의 경우, 양성시료 (blue line), NTC (D.W/red line), negative control (human gDNA/black line)을 이용하여 분석에 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, OIE reference에 기재되어 있는 동일한 조건으로 프라이머의 비율만을 달리하여 실험을 진행하였을 경우, 시료의 민감도에서 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 PNA 프로브를 WSD 검출실험 시 프라이머의 비율을 비대칭(asymmetric)으로 진행하여도 문제가 없음을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 바탕으로 PNA probe를 이용한 WSSV 검출 실험을 진행하기 위한 조성의 경우, 기존의 TaqMan probe 0.15μM 대신에 새롭게 제작된 PNA probe 3개(WSD-P-1, WSD-P-2, WSD-P-3) 0.25pmol을 사용하였으며, 실험 조건은 도 6에 나타내었으며, 상기 PNA 프로브를 사용한 검출실험 장비로는 CFX96^TM(Bio-Rad, 미국)을 사용하였다. 기존의 PreMix는 2X qPCR PreMix(시선바이오머티리얼스, 한국)을 사용하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었으며, 결과를 바탕으로 PNA probes를 이용한 WSSV 검출 결과에 대한 증폭곡선의 Ct값 및 융해곡선의 Tm(℃)를 표 2에 표기하였다.

도 7 및 표 2에 나타난 바와 같이, 검출을 위하여 제작한 PNA 프로브 3개 중 WSS-P-1와 WSS-P-3 프로브의 경우 융해곡선 온도가 특정 범위에서 모두 보였지만, WSS-P-2 프로브는 양성대조군에서 2개의 온도를 동시에 보였다. 또한 증폭곡선의 Ct값의 경우, WSS-P-1와 WSS-P-2 프로브에서 양성시료의 Ct값이 빠르게 나왔지만, WSS-P-3 프로브는는 양성시료의 Ct값이 뒤늦게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 특이하게도 모든 PNA 프로브에서도 음성 대조군과 NTC에서 양성시료와 동일하거나 조금 낮은 융해곡선 온도를 나타냈다.

전체적인 분석 결과 WSS-P-1 프로브가 WSD 검출에 가장 효율적인 PNA 프로브임을 확인할 수 있었지만, TaqMan 프로브의 결과와 마찬가지로 음성대조군과 NTC에서 증폭곡선 및 융해곡선을 보여 그 결과의 정확성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: PNA 프로브를 이용한 새로운 WSSV 검출실험 방법

PNA 프로브는 형광을 띄는 작동방법(working method)인 결합(hybridization)에 의하여 그 결과를 확인할 수 있다. 따라서, 도 7 및 표 2의 결과를 비춰볼 때 결국 Negative control과 NTC에서 어떤 이유에서든 WSSV 양성시료와 동일한 target이 존재한다는 근거가 될 수 있다. 따라서 상기 결과에 대한 문제점을 해결하기 위하여 가장 결과가 좋은 PNA 프로브인 WSS-P-1을 사용하여 새로운 프라이머를 제작하여 실험에 사용하였다.

새로운 프라이머의 경우, 기존의 OIE reference에 기재되어 있는 프라이머 위치보다 바깥쪽으로 포워드 프라이머 (WSD-1F)와 리버스 프라이머(WSD-1R)를 제작하였다.

실험은 프라이머의 조합을 달리하여 진행하였는데 첫 번째 WSS1011F(OIE Forward primer)와 WSD-1R(New design Reverse primer), 두 번째 WSD1F(New desgin Forward primer)와 WSD1079R(OIE Reverse primer)로 나눠서 실험을 진행하였다. WSD1F와 WSD1R의 조합의 경우, PCR 산물의 크기에 의하여 민감도에서 떨어질 수 있으므로 상기 조합은 제외하였다.

실험의 조성은 프라이머 2개 set에 2X qPCR PreMix(시선바이오머티리얼스, 한국) 10μl, 프라이머 2μl (포워드 프라이머 10pmol : 리버스 프라이머 3pmol), 타겟 DNA 3μl/1ng, WSD-P-1 PNA 프로브 0.5μl/5pmol을 사용하여 최종 volume이 20μl이 되도록 증류수(D.W)를 첨가하였다. 실험 조건은 도 6에 나타낸 조건으로 진행하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 양성시료(Blue line)를 제외한 Negative control(Black line), NTC(D.W/Red line)에서는 증폭곡선 및 융해곡선이 확인되지 않아 정확한 결과가 나오는 것을 확인할 수 있었다. 또한 프라이머 조합 중 WSS1101F와 WSD-1R의 조합이 WSD-1F와 WSS1079R 조합보다 양성대조군을 통하여 1/10 정도 민감도가 좋음을 확인할 수 있었다.

결과적으로 기존의 OIE reference에 기재되어 있는 프라이머 region의 경우 WSSV 검출에 있어서 정확한 결과를 도출할 수 없으며, 새롭게 디자인된 프라이머를 이용할 경우 결과의 정확성을 대처할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한 상기 프라이머 셋트의 조건으로 TaqMan probe를 이용하여 사용한 결과 Negative control과 NTC에서 증폭곡선이 발생하지 않아 새롭게 제작한 프라이머의 과학적 근거를 뒷받침 할 수 있었다(도 9).

실시예 5: PNA 프로브를 이용한 새로운 WSSV 검출 Kit의 제작

PNA 프로브와 실시예 4에서 제작한 WSD-1R 프라이머 및 기존의 OIE reference에 기재되어 있는 WSS1101F 프라이머를 이용하여 WSD 검출 Kit의 성능 시험을 실시하였다. 실험을 진행하기 위한 시료의 경우, 양성시료(3.4ng ~ 3.4ng x 10^-5), Negative control (VHSV 감염시료 10ng), NTC (D.W)를 사용하였으며, 장비는 CFX96^TM(Bio-Rad, 미국)을 사용하였고 실험 조건은 그림 6과 동일하게 진행하였다. 실험 조성은 실시예 4에서 진행한 것과 동일하게 PNA 프로브와 그 조성을 맞춰서 실시하였으며, 실험 결과는 도 10과 표 3에 정리하여 표기하였다.

그 결과, 도 10 및 표 3에 나타난 바와 같이, PNA 프로브를 이용하여 민감도 및 특이도 실험을 진행한 결과, 민감도의 경우 0.0034ng까지 검출이 가능한 것을 확인할 수 있었으며, Negative control 시료에서도 증폭곡선 및 융해곡선이 보이지 않아 특이도에서도 이상이 없음을 확인할 수 있었다.

상기 실험 결과를 바탕으로 PNA probe를 이용한 WSSV 검출실험에 대한 판정표를 제작하였다(도 11).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Fishery Products Quality Management Service <120> Method for Detecting White Spot Syndrome Virus Using PNA Probes <130> P17-B050 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaagccatga ag 12 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gccgtctatc 10 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catctcagaa gccat 15 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agccatgaag aatgccgtct atcacaca 28 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggtcccgtcc tcatctcag 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctgccttgc cggaaatta 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaatcaatgg attatgaaga tagcg 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctggcgcatg aggcgaatgg tac 23

Claims

다음 단계를 포함하는 흰반점바이러스를 검출하는 방법:
(a) (i) 흰반점바이러스 또는 상기 바이러스 유래 핵산을 포함하는 시료 및 (ii) 상기 흰반점바이러스 유래 핵산서열에 상보적으로 결합하고, 서열번호 1로 표시되고, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 혼합하여 혼성화시키는 단계;
(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브의 융해곡선을 얻는 단계; 및
(c) 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브의 융해온도를 확인하여 흰반점바이러스를 검출하는 단계.
삭제
제1항에 있어서, 상기 바이러스 유래 핵산은 서열번호 5 및 8로 표시되는 프라이머쌍을 이용하여 흰반점바이러스를 포함하는 시료를 증폭하여 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 1로 표시되는 PNA 프로브를 함유하는 흰반점바이러스 검출용 키트.
삭제
제6항에 있어서, 서열번호 5 및 8로 표시되는 프라이머쌍을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제6항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
제6항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 키트.