KR101909962B1 - 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 유전자 변이 검출방법 - Google Patents
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 유전자 변이 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 NV(non virion) 유전자와 특이적으로 결합하는 PNA 프로브 및 이의 융해패턴 분석을 이용한 VHSV의 판별 및 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것으로, 수산생물전염병 원인바이러스의 변이를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별하고, 어류의 상기 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있고 NV 유전자의 변이를 확인하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 NV(non virion) 유전자의 변이의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 VHSV의 특정 유전자와 특이적으로 결합하는 PNA 프로브 및 이의 융해패턴 분석을 이용한 VHSV NV 유전자의 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증(VHS)의 원인이 되는 바이러스이다. VHSV의 감염은 어종, 어체 크기 및 수온 등의 요인과 관계가 있으며, 직접 다른 어류로 감염되는 수평감염과 어미의 알로부터 감염되는 수직감염의 특징을 가지고 있다.
연어과 어류에서 VHSV에 감염되어 질병이 발현되는 적수온은 8℃ 전후이며, 우리나라 넙치의 경우는 20℃ 15℃이하에서 발병되며, 가을에서 다음 봄까지의 저수온 시기에 주로 발생하여 수산업에 큰 피해를 주고 있다.
국내의 경우 2001년, 겨울과 봄의 저수온기에 양식 넙치에서 VHSV에 의한 피해 사례가 학계에 보고되었으며, 2001년 이후 매년 비슷한 시기에 질병증상이 관찰됨에 따라서 일반적인 바이러스성 질병으로 분류되었다. 우리나라 넙치에 있어 바이러스성 질병으로는 VHSV, 히라메 랍도바이러스(Hirame rhabdovirus, HIRRV), 아쿠아비르나 버나 바이러스(Aquabirnavirus) 등이 있으며, 이들 바이러스성 질병 중 VHSV는 가장 많은 피해를 주고 있다. 또한 VHS는 수산생물질병관리법에서 규정하고 있는 법정질병중의 하나이다.
VHSV가 생성하는 6개의 바이러스 단백질들 중에서 NV region은 유일하게 비구조 단백질로서 넙치세포의 세포질에 주로 분포하고 있다. 이전의 몇 연구결과에서 NV protein은 VHS 병리증상을 보이는 병원성 단백질로서 기능함이 밝혀지고 있다.
한편, 돌연변이 검출을 위한 대표적인 방법으로는 염기서열 분석법, 중합효소 연쇄반응법(PCR), 마이크로어레이법(microarray) 등 다양한 분석법이 있다. 과거 유전자 염기서열 분석 방법의 경우 유전자 증폭기술(PCR)의 원리를 이용하여 dNTP와 약간의 ddNTP를 첨가하여 무작위적으로 ddNTP가 결합하면서 다른 길이의 DNA 사슬이 중합되고, 전기영동을 통해서 분리해 내면서 길이에 따라서 순서대로 정렬되는 방식이였다. 하지만 현재는 각각의 ddNTP에 4개의 서로 다른 형광을 부착한 후 ddNTP가 결합되면 형광 detector를 이용하여 각각의 염기서열의 정보를 확인할 수 있다. 하지만 이러한 염기서열 분석 방법의 경우 정확성은 매우 뛰어난 반면 이를 분석하기 위한 시간이 상당부분 소요되며, 시료의 혼합, 시료의 농도 등 외부적인 조건은 결과 분석의 단점으로 작용한다. 특히 시간적 소요는 위급한 상황 발생 시 매우 중요한 변수로 작용할 수 있다. 예컨대 유전자 변이가 빈번한 RNA 바이러스의 경우 유전형의 변이를 빠르게 예측 확인해야 초기에 확산 방지에 대응할 수 있으나, 종래 기술의 경우 이러한 변이를 신속히 검증하지 못하는 문제점이 있다.
한편, 최근에는 유전자 염기서열 분석 전체가 아닌 특정 지역이나 마커의 분석이 활발하게 응용되고 있으며, 특히 탐침자(probe)를 이용하여 손쉽게 확인할 수 있는 방법이 개발 및 활용되고 있다. 하지만 기존의 탐침자(hydrolysis method probe)의 경우 유전정보를 가지고 있는 지역(region) 혹은 마커(maker)만을 확인할 수 있는 기술적 한계점을 가지고 있다. 그 밖에도 기존 프로브 방식의 기술적 한계점은 첫 번째, 제작하고자 하는 염기서열의 정보를 알고 있어야 하며, 두 번째, 제작한 프로브 지역의 염기변화 발생 시 그 결과를 확인할 수 없어 결과 도출이 불가능하며, 마지막으로 결과도출 시 확인하고자 하는 유전자 산물의 길이를 100bp ~ 200bp 미만으로 제작해야 하므로 사전에 알고 있는 염기서열에 대해 low coverage 검증이라고 할 수 있다. 결국 염기서열 분석 장비를 제외한 기존의 프로브 방법은 유전자 염기서열을 분석한다는 의미보다는 사전에 알고 있는 염기서열에 대하여 low coverage 검증(지역 혹은 마커의 존재여부)만이 가능하다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 수산생물전염병의 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 NV 유전자 위치의 변이를 효율적으로 검출하기 위하여, 예의 노력한 결과, 리포터 및 소광자가 결합된 프로브를 프로브와 시료와의 융해패턴을 비교하여 시료 간의 염기서열 동일성, 염기서열 변이 여부 및 염기서열 변이 위치를 신속하고 정확하게 판별할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이를 판별하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 변이된 염기서열 위치 확인용 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) (i) 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 또는 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 표적핵산을 포함하는 시료 및 (ii) 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 표적핵산의 염기서열에 상보적으로 결합하는 PNA 프로브를 혼합하여 혼성화시키는 단계;
(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도를 얻는 단계;
(c) 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도를 각각 구간화 하여 코드를 부여하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계 내지 (b) 단계와 동일한 조건으로 반응시켜 얻은 돌연변이가 예상되는 시료의 융해온도를 상기 (c) 단계에 따라 코드화하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이의 유형을 판별하는 단계를 포함하는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자에 상보적으로 결합하고, 서열번호 1~6 중 선택되는 염기서열을 가지는 복수 개의 PNA 프로브를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 변이된 염기서열 위치 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 NV 유전자에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 수산생물전염병 원인바이러스의 변이를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별하고, 어류의 상기 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있고 NV 유전자의 변이를 확인하는 효과가 있다.
도 1은 PNA 프로브의 구조적 특징을 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 펩티드핵산을 이용한 혼성화 단계와 융해곡선을 얻는 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 3 내지 도 7은 본 발명에 따라 VHSV의 NV 유전자 일부와 SNP 및 이로부터 도출된 펩티드핵산의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이다.
도 8은 본 발명에 따른 VHSV NV 유전자 증폭 산물 상에서 펩티드핵산이 포함하고 있는 주요 염기변이 부분의 일례를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 9은 본 발명에 따라 VHSV cDNA 샘플을 증폭시키고, 혼성화시키며, 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이는 과정의 일례를 설명하기 위한 그래프이다.
도 10 은 본 발명에 따른 펩티드 핵산을 이용하여 VHSV cDNA 샘플에 대하여 적용하여 얻은 증폭 곡선 그래프의 일례 이다.
도 11은 본 발명에 따른 펩티드 핵산을 이용하여 VHSV cDNA 샘플에 대하여 적용하여 얻은 온도별 융해곡선 그래프의 일례 이다.
도 12은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 Tm값 기준으로 부터 바코드화 하는 일련의 과정을 나태 낸 것이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바코드를 기준으로부터 염기서열의 변이를 검출하는 일련의 과정을 나타 낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 의해 판정된 바코드를 이용한 VHSV의 변이 계통도를 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 펩티드핵산을 이용한 혼성화 단계와 융해곡선을 얻는 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 3 내지 도 7은 본 발명에 따라 VHSV의 NV 유전자 일부와 SNP 및 이로부터 도출된 펩티드핵산의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이다.
도 8은 본 발명에 따른 VHSV NV 유전자 증폭 산물 상에서 펩티드핵산이 포함하고 있는 주요 염기변이 부분의 일례를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 9은 본 발명에 따라 VHSV cDNA 샘플을 증폭시키고, 혼성화시키며, 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이는 과정의 일례를 설명하기 위한 그래프이다.
도 10 은 본 발명에 따른 펩티드 핵산을 이용하여 VHSV cDNA 샘플에 대하여 적용하여 얻은 증폭 곡선 그래프의 일례 이다.
도 11은 본 발명에 따른 펩티드 핵산을 이용하여 VHSV cDNA 샘플에 대하여 적용하여 얻은 온도별 융해곡선 그래프의 일례 이다.
도 12은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 Tm값 기준으로 부터 바코드화 하는 일련의 과정을 나태 낸 것이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바코드를 기준으로부터 염기서열의 변이를 검출하는 일련의 과정을 나타 낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 의해 판정된 바코드를 이용한 VHSV의 변이 계통도를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 양태에서 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code) 기준에 따른 수산생물전염병의 원인바이러스인 VHSV의 NV 유전자 염기서열에 대한 변이 여부를 시퀀싱 단계 없이 변이를 판별하고자 한다. 그 결과, VHSV의 NV 유전자에 특이적 염기서열을 및 펩티드핵산 프로브(peptide nucleic acid probe, PNA probe)를 이용하여 VHSV의 NV 유전자 변이를 판별/검출할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) (i) 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 또는 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 표적핵산을 포함하는 시료 및 (ii) 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 표적핵산의 염기서열에 상보적으로 결합하는 PNA 프로브를 혼합하여 혼성화시키는 단계;
(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도를 얻는 단계;
(c) 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도를 각각 구간화 하여 코드를 부여하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계 내지 (b) 단계와 동일한 조건으로 반응시켜 얻은 돌연변이가 예상되는 시료의 융해온도를 상기 (c) 단계에 따라 코드화하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이의 유형을 판별하는 단계를 포함하는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이 유형은 돌연변이 여부 및 돌연변이 위치를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1~6 중 어느 하나의 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1~3으로 표시되는 PNA 프로브 셋트 또는 서열번호 4~6으로 표시되는 PNA 프로브 셋트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.
펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다
본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이가 나타날 경우 염기서열의 변이와 일치 시킬 수 없지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 염기 위치에 따른 Tm 값의 차이가 뚜렷하여 분석이 가능하다.
본 발명의 일양태에서, 상기 표적핵산과 상기 PNA 프로브 간에 부여된 코드 및 상기 표적핵산의 돌연변이와 상기 PNA 프로브 간에 부여된 코드는 서로 상이한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 표적핵산의 돌연변이를 판결하기 위하여 표적핵산과 프로브간의 융해온도 및 상기 표적핵산의 돌연변이와 프로브 간의 융해온도를 코드화한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일양태에서, 상기 표적핵산과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도 및 상기 표적핵산의 돌연변이와 상기 PNA 프로브 간의 융해온도는 그 용해온도 구간이 서로 상이하도록 구간화하여 별개의 코드를 부여하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 염기서열 변이추적 코드법을 이용하여 VHSV의 NV 유전자의 융해곡선을 분석해본 결과, 하나의 PNA 프로브와 결합하는 시료의 염기서열 변이 여부에 따라 융해온도는 서로 동일하거나 상이하게 나타났으나, 둘 이상의 PNA 프로브를 사용하여 동시에 분석을 진행하는 경우 VHSV의 시료의 유형에 따라 융해온도의 조합은 서로 상이함을 확인할 수 있었다. 이러한 특징을 이용하는 경우 프로브를 활용한 참조 코드(Reference Code)를 제작할 수 있는데, 그 결과는 표 5와 같이 코드의 부여가 가능하다. 이처럼 PNA 프로브는 시료의 염기서열과 완전히 혼성화되지 않으면 융해온도가 다운 쉬프트(down shift)되기 때문에 염기서열 변화를 추적할 수 있으며, 각각의 염기서열 변화에 따른 융해온도에 일련의 코드를 부여할 경우, 많은 양의 시료에서 VHSV 감염 발생시 시료의 추적관리가 가능한 장점이 있다. 더불어 미리 부여해놓은 시료의 코드법에 따라 새로운 시료의 융해온도를 분류하면 시료의 유형을 용이하게 판단할 수 있으며, 이러한 경우 염기서열 변이가 빠르게 발생하여 급속히 확산되는 다양한 전염병의 확산 방지 대책을 강구하는데 매우 빠르고 효과적인 방법으로 활용이 가능하다.
표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 코드법을 이용하면 염기서열 변이가 빈번히 발생하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 최소한의 PNA 프로브를 제작하고, 융해곡선을 코드화함으로써 추적관리가 필요한 다양한 전염병에 별도의 분석 프로그램이 필요 없는 장점이 있다.
본 발명의 추적법의 경우 염기서열 변화 여부에 따라 하나의 PNA 프로브가 다양한 융해 온도를 나타내어 이들을 적절히 조합하여 숫자로 표기할 경우 각각의 시료의 정보를 확인할 수 있고, 융해온도의 범위를 세분화하여 구간화 할수록 적은 숫자의 PNA 프로브로 많은 시료의 정보를 코드화할 수 있다. 융해온도의 구간화는 융해곡선 측정이 가능한 온도인 40~95℃, 장비에 따라서는 5~95℃의 온도 범위에서 구분이 가능할 것이다. 그러나, 염기서열의 변이 위치가 다름에도 불구하고 융해온도가 동일하게 나타나는 경우가 있을 수 있으며, 이 경우에는 추가적인 PNA 프로브를 제작하여 구분이 가능하도록 할 수 있다. 이와 같은 코드법은 위급한 상황에서 동일한 코드로 분류되는 경우 신속한 대처가 필요한 전염병의 예방 및 방지 대책을 강구함에 있어서 많은 약물이나 백신을 사용할 필요없이 참조 코드에서 동일한 코드로 분류되는 시료에 해당하는 약물이나 백산을 선택적으로 우선 사용하여 시간적, 비용적 낭비를 예방할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자에 상보적으로 결합하고, 서열번호 1~6 중 선택되는 염기서열을 가지는 복수 개의 PNA 프로브를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 변이된 염기서열 위치 확인용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 바이러스의 변이 검출이 가능하다.
본 발명은 다른 양태에서, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대하여 PCR 산물에 상응하는 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 7~8의 염기서열로 표시되는 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 PCR 증폭산물에 서열번호 1~ 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 NV 유전자의 변이를 판별하고 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합물에 포함된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 NV-유전자 염기서열을 포함하는 서열단편을 증폭하는 단계는 서열번호 7~8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산'은 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.
본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe) 등이 있다.
PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5~1℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 Target하는 염기서열이 없거나 변이가 있다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하다.
본 발명의 결과를 최적화하기 위한 기술적 방법으로는 Liquid type U-TOP 방법(시선바이오머티리얼스, 한국)으로 표적 핵산의 단일 염기서열의 치환 및 염기의 결실 또는 삽입을 효과적으로 검출할 수 있는 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 혼성화 과정 후 세척하는 과정과 PNA 프로브를 판형에 고정시킬 필요가 없는 액상형 어레이 방법을 활용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: VHSV NV 유전자 변이 검출용 펩티드핵산의 제조
국립수산과학원에서 보관 중인 VHS를 일으킨 바이러스 시료를 이용하여 cDNA 주형으로 염기서열을 분석하여 OIE(국제무역사무국)의 가이드라인에 고시된 염기서열과의 일치여부를 확인하였고, 보관 중인 시료들 중에서 VHSV인 것을 확인된 시료를 사용하였다.
염기서열 분석을 통해, NV 유전자의 변이 부분을 확인 하였으며, 총 6개의 주요 변이 부분을 PNA 프로브를 이용해 검출하기 위해 디자인하였고, cDNA로부터 변이 진단을 확인하기 위한 프로브와 PNA 프로브를 제조하였다.(표 1)
도 3 에서 도 7는 본 발명에 따른 VHSV의 NV 유전자 변이 검출 부위 6개와 SNP 및 이로부터 도출 된 PNA 프로브 염기서열 일례를 나타내기 위한 유전자 위치도 이고, PNA 프로브 염기서열은 노란색 음영으로 나타냈으며, 변이 검출 부위 SNP는 붉은색 볼드체로 표기하였다.
도 8은 본 발명에 따른 VHSV의 NV 유전자상에서 PNA 프로브를 포함 하고 있는 염기변이 부분의 일례를 설명하기 위한 유전자 위치도이다. 각 염기 번호는 NV 단배질로 발현할 수 있는 NV 유전자의 PCR 산물의 크기를 기준으로 작성하였다.
| 타깃 유전자 | 구분 | 이름 | Sequence (5->3) | 서열번호 |
| NV gene | 프라이머 | VHSV-1_3F | AAAATGGCACCCCTGTGAG | 서열번호 7 |
| VHSV-1_4R | GTATTACCCCCTGTAGGG | 서열번호 8 | ||
| PNA 프로브 | PO-23 | dabcyl-ACACAGCACAACC-O-K(TxR) | 서열번호 1 | |
| PO-167 | dabcyl-AGTCTCAGAGGATC-O-K(HEX) | 서열번호 2 | ||
| PO-241 | dabcyl-AGAGGGAACTCAT-O-K(FAM) | 서열번호 3 | ||
| PO-262 | (HEX)-CTAAGGAATGTCCC-O-K(dabcyl) | 서열번호 4 | ||
| PO-350 | dabcyl-ACGAATGGCTCC-O-K(FAM) | 서열번호 5 | ||
| PO-355 | dabcyl-CTCCAAATCTCCCC-O-K(TxR) | 서열번호 6 |
Real-time PCR 장비가 한 번에 검출할 수 있는 형광이 제한적이라, 두 개의 튜브에 나누어 검출에 사용하고 튜브당 각기 다른 형광이 달린 펩티드핵산이 포함되어 있다. Set 1의 경우 서열번호 1~3 이며, Set 2 의 경우 서열번호4~6이 포함 되어 있다.
본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 PNA 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다(표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 PNA 프로브의 불필요한 이차구조는 피함).
실시예 2: VHSV NV 유전자 변이 검출용 펩티드핵산을 이용한 증폭곡선 및 융해곡선의 도출
VHSV는 RNA virus로 cDNA로 제작하여 실험에 사용하였으며, RNA의 추출은 TRIzolㄾ RNA Isolation Reagents(Thermo사, 미국)를 이용하였고 cDNA는 M-MLV Reverse Transcriptase(enzynomics사, 한국)를 이용하여 실험에 사용 하였다.
PNA 프로브를 이용하여 VHSV의 시료들의 증폭곡선 및 융해곡선을 확인하기 위해 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)에서 증폭반응을 수행하였다. Set 별로 동시 진행하여 두 개의 튜브에 동시 제조하여 실험에 사용하였다. PCR용 반응물의 조성은 다음과 같다; 2X qPCR PreMix buffer(시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, VHSV-1_3F(forward primer) 1 pmol 0.5㎕ 및 VHSV-1_4R(reverse primer) 10 pmol 0.5㎕, VHSV cDNA(시료) 1㎕, 2.5 pmol 펩티드핵산 0.5㎕, 20X SSB buffer (시선바이오머티리얼스, 한국) 및 증류수로 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다.
도 9는 본 발명에 따라 VSHV시료들의 cDNA 샘플을 증폭시키고, 혼성화시키며, 혼성화 산물의 온도를 높이는 과정의 일례를 설명하기 위한 그래프이다. real-time PCR을 실시하며 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 40초(형광 촬영), 72℃에서 40초 동안 반응시켰으며, 이를 45 cycle 반복하면서 증폭곡선을 얻었다. 그 이후 PNA 프로브와의 혼성화 및 융해곡선을 얻기 위하여 95℃에서 5분, 75℃에서 1분, 55℃에서 1분, 45℃에서 1분의 시간을 준 뒤 30℃에서 85℃까지 1℃씩 상승시키며 5초간 정지 상태를 유지하며 형광을 측정하여 융해곡선 분석을 수행하였다.
실시예 3: VHSV NV 유전자 변이 검출용 펩티드핵산을 이용한 증폭곡선 및 용해곡선의 분석
실시예 2를 이용한 증폭 곡선의 결과를 도 10에 나타내었다. 유전자 증폭이 되고 있는지 여부를 확인하는 할 수 있으며, 형광별로 sample 이 증폭 되고 있는 것을 확인 할 수 있다.
도 11은 실시예 2를 이용한 각 sample별 온도별 융해곡선 그래프의 일례이다. 첫 번째 tube(Set 1)의 경우 서열번호 1~3인 PNA 프로브가 혼합되어 있으며, 두 번째 tube(Set 2)의 경우 서열번호 4~6인 PNA 프로브가 혼합되어 있어 한 sample당 두 개의 그림으로 나타내며 Set 1과 Set 2로 표기해뒀다. 각 PNA 프로브의 융해곡선의 융해온도를 시료별로 정리하였다(표 2). 본 발명에 따른 PNA 프로브를 적용한 융해곡선은 시료의 SNP 마다 서로 다른 융해온도(Tm)를 가지고 있음을 확인할 수 있으며, 변이 있는 값은 붉은색으로 표기하였다. PO-355의 경우 변이 부분을 perfect match로 디자인 하여 높은 온도의 값이 변이가 있음을 시사한다.
시료별로 융해온도가 차이나는 이유가, 염기서열 상에서 차이로 인한 것인지를 확인하기 위해 염기서열과 비교 분석하였다(표 3 및 표 4). 파란색으로 표기한 것은 주요 변이 위치를 표기한 것이고, 붉은색으로 표기한 것은 PNA 프로브와 다른 염기서열임을 표기 한 것이며, 염기서열 차이로 인해 Tm 값에 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 각 변이 마다 Tm 값에서 차이가 있는 것을 확인 할 수 있었고 이러한 융해온도의 차이를 통하여 염기서열 변이를 확인 할 수 있는 것이다. 이는 본 발명에 따른 PNA의 염기서열을 구성할 때 의도한 것과 일치하는 결과이다. 여러 sample에서 동일한 염기서열 이면, 동일한 Tm이 나오는 것을 확인 할 수 있었고, 이를 바탕으로 동일한 Tm이 나오면 동일한 염기서열이라고 말 할 수 있다.
실시예 4: VHSV의 검출 융해온도에 따른 NV 유전자의 변이 검출 방법
실시예 2 및 실시예 3의 결과를 토대로 실제 VHSV 시료의 NV 유전자의 변이 검출 할 수 있는 판정표를 만들 수 있으며, 이를 이용하여 NV 유전자의 변이 검출이 가능 하다.
현재까지 나온 실험 결과를 바탕으로 두 가지 판정 기준을 만들 수 있다. 도 12 의 Tm 값을 기준으로 바코드화를 하는 판정 기준 과 도 13의 바코드를 기준으로 염기서열의 변이를 확인하는 판정 기준이다.
도 12의 판정 기준을 이용하여 시료들의 Tm 결과 값을 바코드화 하였다(표 5). 바코드를 다시 도 13의 판정 기준을 이용하면, 결과가 함축된 바코드에서 염기서열의 변이를 확인 할 수 있다(표 6). 아울러, 상기 바코드를 이용한 각 시료들에서 검출되는 바이러스의 변이를 변이계통도로 도 14와 같이 표시할 수 있다.
Real-Time PCR 결과를 Tm 값 기준을 이용해 PNA probe별로 바코드화를 통해 결과를 함축 할 수 있으며, 바코드를 통해 함축된 결과는 바코드 기준을 통해 염기서열로 치환할 수 있고 이러한 일련의 과정을 통해 PNA 프로브가 VHSV의 NV 유전자 변이를 신속하게 검출할 수 있는 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> National Institute of Fisheries Science
<120> Method for Detecting Genetic Variant of Virarl Hemorrhagic
Septicemia Virus
<130> P16-B229
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA Probe PO-23
<400> 1
acacagcaca acc 13
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA Probe PO-167
<400> 2
agtctcagag gatc 14
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA Probe PO-241
<400> 3
agagggaact cat 13
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA Probe PO-262
<400> 4
ctaaggaatg tccc 14
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA Probe PO-350
<400> 5
acgaatggct cc 12
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA Probe PO-355
<400> 6
ctccaaatct cccc 14
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
aaaatggcac ccctgtgag 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
gtattacccc ctgtaggg 18
Claims (8)
- 다음 단계를 포함하는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이를 판별하는 방법:
(a) (i) 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 또는 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 표적핵산을 포함하는 시료 및 (ii) 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 표적핵산의 염기서열에 상보적으로 결합하는 서열번호 1~6 중 어느 하나의 서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼합하여 혼성화시키는 단계;
(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도를 얻는 단계;
(c) 상기 혼성화된 산물과 상기 PNA 프로브 간의 융해온도를 각각 구간화 하여 코드를 부여하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계 내지 (b) 단계와 동일한 조건으로 반응시켜 얻은 돌연변이가 예상되는 시료의 융해온도를 상기 (c) 단계에 따라 코드화하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 돌연변이의 유형을 판별하는 단계.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 표적핵산과 상기 PNA 프로브 간에 부여된 코드 및 상기 표적핵산의 돌연변이와 상기 PNA 프로브 간에 부여된 코드는 서로 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 돌연변이를 판별하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1~3으로 표시되는 PNA 프로브 셋트 또는 서열번호 4~6으로 표시되는 PNA 프로브 셋트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자에 상보적으로 결합하고, 서열번호 1~6 중 선택되는 염기서열을 가지는 복수 개의 PNA 프로브를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 NV유전자의 변이된 염기서열 위치 확인용 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1~3으로 표시되는 PNA 프로브 셋트 또는 서열번호 4~6으로 표시되는 PNA 프로브 셋트인 것을 특징으로 하는 방법.
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| J. Fish Pathol., 26(3) : 149~161 |
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