JP2019506151A - ウイルス性出血性敗血症ウイルスの遺伝子変異の検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明はウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）のＮＶ（ｎｏｎ ｖｉｒｉｏｎ）遺伝子と特異的に結合するＰＮＡプローブ及びこの融解パターンの分析を利用したＶＨＳＶの判別及び変異を確認する方法に関するもので、水産生物伝染病の原因ウイルスの変異を簡単・迅速・正確に判別して、魚類の上記ウイルスの感染可否を検出することができ、ＮＶ遺伝子の変異を確認する効果がある。
Description
本発明はウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）のＮＶ（ｎｏｎ ｖｉｒｉｏｎ）遺伝子変異の検出方法に関するもので、さらに詳しくはＶＨＳＶの特定遺伝子と特異的に結合するＰＮＡプローブ及びこの融解パターン分析を利用したＶＨＳＶのＮＶ遺伝子の変異を確認する方法に関するものである。
ウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）は魚類のウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳ）の原因となるウイルスである。ＶＨＳＶの感染は魚種、魚の大きさ及び水温などの要因と関係があり、直接他の魚類に感染される水平感染と母の卵から感染される垂直感染の特徴を有している。
サケ科魚類でＶＨＳＶに感染されて疾病が発現される適水温は８℃前後であり、韓国のヒラメの場合は２０℃〜１５℃以下で発病され、秋から次の春までの低水温の時期に主に発生して水産業に大きな被害を与えている。
国内の場合２００１年、冬と春の低水温期に養殖ヒラメでＶＨＳＶによる被害の事例が学界に報告され、２００１年以後、毎年同じ時期に疾病症状が観察されたことによって、一般的なウイルス性疾病に分類された。韓国のヒラメにおいて、ウイルス性疾病としてはＶＨＳＶ、ヒラメラブドウイルス（Ｈｉｒａｍｅ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ，ＨＩＲＲＶ）、アクアビルナウイルス（Ａｑｕａｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）などがあり、これらのウイルス性疾病のうちＶＨＳＶは最も多い被害を与えている。また、ＶＨＳは水産生物疾病管理法で規定している法定疾病中の一つである。
ＶＨＳＶが生成する６つのウイルスタンパク質の中でＮＶ ｒｅｇｉｏｎは唯一に非構造タンパク質としてヒラメ細胞の細胞質に主に分布している。以前のいくつの研究結果で、ＮＶ ｐｒｏｔｅｉｎはＶＨＳの病理症状を見せる病原性タンパク質として機能することが明らかになっている。
一方、変異の検出のための代表的な方法では塩基配列の分析法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、マイクロアレイ法（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）など、多様な分析法がある。過去の遺伝子塩基配列の分析方法の場合、遺伝子増幅技術(ＰＣＲ)の原理を利用し、ｄＮＴＰと若干のｄｄＮＴＰを添加し、無作為的にｄｄＮＴＰが結合することで異なる長さのＤＮＡ鎖が重合されて、電気泳動を通じて分離し出しながら、長さによる順序の通りに整列される方式であった。しかしながら、現在は各々のｄｄＮＴＰに４個の異なる蛍光を付着した後ｄｄＮＴＰが結合すると、蛍光ｄｅｔｅｃｔｏｒを利用して、各々の塩基配列の情報を確認することができる。しかしながら、このような塩基配列の分析方法の場合、正確性は非常に優れる一方、これを分析するための時間が相当な部分に所要されて、試料の混合、試料の濃度などの外部的な条件は結果分析の短所として作用する。特に時間的所要は、危急な状況の発生の時、非常に重要な変数として作用することができる。例えば、遺伝子変異が頻繁なＲＮＡウイルスの場合、遺伝型の変異を早く予測確認することで初期に拡散防止に対応することができるが、従来の技術の場合、このような変異を迅速に検証できない問題点がある。
一方、最近には遺伝子塩基配列の分析の全体ではなく特定地域またはマーカーの分析が活発に応用されており、特に探針子（ｐｒｏｂｅ）を利用して容易く確認することができる方法が開発及び活用されている。しかしながら、既存の探針子（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｂｅ）の場合、遺伝情報を有している地域（ｒｅｇｉｏｎ）あるいはマーカー（ｍａｒｋｅｒ）のみを確認することができる技術的の限界点を有している。その他にも既存のプローブ方式の技術的の限界点は一つ目 、製作しようとする塩基配列の情報を知っていなければならず、二つ目、製作したプローブ地域の塩基変化の発生の時、その結果を確認することができなくて、結果の導出が不可能で、終わりに結果導出の時、確認しようとする遺伝子産物の長さを１００ｂｐ〜２００ｂｐ未満で製作しなければならないので事前に知っている塩基配列に対してｌｏｗ ｃｏｖｅｒａｇｅ検証であると言える。結局、塩基配列の分析装備を除外した既存のプローブ方法は遺伝子の塩基配列を分析するという意味よりは、事前に知っている塩基配列に対してｌｏｗ ｃｏｖｅｒａｇｅ検証（地域あるいはマーカーの存在可否）だけが可能であるという問題点がある。
従って、本発明者らは水産生物伝染病の原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）のＮＶ遺伝子位置の変異を効率的に検出するために、鋭意努力した結果、レポーター及び消光子が結合されたプローブをプローブと試料との融解パターンを比較して試料間の塩基配列の同一性、塩基配列の変異の可否及び塩基配列の変異位置を迅速で正確に判別することができることを確認して、本発明を完成するようになった。
本発明の目的はレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異を判別する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記ＰＮＡプローブを含むウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異された塩基配列の位置の確認用キットを提供することにある。
上記の目的を達成するため、本発明は（ａ）（ｉ）ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)または上記ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の部位を包含する標的核酸を含む試料及び（ｉｉ）上記ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の部位を含む標的核酸の塩基配列に相補的に結合するＰＮＡプローブを混合して、各ＰＮＡプローブを試料にハイブリダイズさせる段階；
（ｂ）温度を変化させながら上記ハイブリダイズされた産物と上記のＰＮＡプローブ間の融解温度を得る段階；
（ｃ）上記ハイブリダイズされた産物の融解温度をとそれぞれのＰＮＡプローブに対して各々区間化して、各区間にコードを付与する段階；及び
（ｄ）変異が予想される試料を上記（ａ）段階ないし（ｂ）段階と同一の条件で反応させて融解温度を取得し、当該融解温度を、上記（ｃ）段階によって付与されたコードに従ってコード化し、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の類型を判別する段階を含むレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異を判別する方法を提供する。
（ｂ）温度を変化させながら上記ハイブリダイズされた産物と上記のＰＮＡプローブ間の融解温度を得る段階；
（ｃ）上記ハイブリダイズされた産物の融解温度をとそれぞれのＰＮＡプローブに対して各々区間化して、各区間にコードを付与する段階；及び
（ｄ）変異が予想される試料を上記（ａ）段階ないし（ｂ）段階と同一の条件で反応させて融解温度を取得し、当該融解温度を、上記（ｃ）段階によって付与されたコードに従ってコード化し、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の類型を判別する段階を含むレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異を判別する方法を提供する。
本発明はまた、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が結合されており、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子に相補的に結合し、配列番号１〜６からなる群から選択される塩基配列を有する複数個のＰＮＡプローブを含む、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異された塩基配列の位置の確認用キットを提供する。
他の式で定義されない限り、本明細書で使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練された専門家によって、通常的に理解されるものと同一な意味を有する。一般的に本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られていて、通常的に使用されるものである。
本発明は一様態で、世界動物保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，ＯＩＥ）の水生動物衛生規約（Ａｑｕａｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｄｅ）の基準による水産生物伝染病の原因ウイルスであるＶＨＳＶのＮＶ遺伝子の塩基配列に対する変異の可否をシークエンシングの段階なしに変異を判別しようとする。その結果、ＶＨＳＶのＮＶ遺伝子に特異的塩基配列をペプチド核酸プローブ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ，ＰＮＡ ｐｒｏｂｅ)を利用してＶＨＳＶのＮＶ遺伝子の変異を判別／検出することができた。
したがって、本発明は一観点から、（ａ）（ｉ）ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)または上記ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の部位を包含する標的核酸を含む試料及び（ｉｉ）上記ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の部位を含む標的核酸の塩基配列に相補的に結合するＰＮＡプローブを混合して各ＰＮＡプローブを試料にハイブリダイズさせる段階；
（ｂ）温度を変化させながら上記ハイブリダイズされた産物の融解温度を得る段階；
（ｃ）上記ハイブリダイズされた産物の融解温度を、それぞれのＰＮＡプローブに対して各々区間化し、各区間にてコードを付与する段階；及び
（ｄ）変異が予想される試料を上記（ａ）段階ないし（ｂ）段階と同一の条件で反応させて融解温度を取得し、当該融解温度を、上記（ｃ）段階によって付与されたコードに従ってコード化し、これにより、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の類型を判別する段階を含むレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異を判別する方法に関するものである。
（ｂ）温度を変化させながら上記ハイブリダイズされた産物の融解温度を得る段階；
（ｃ）上記ハイブリダイズされた産物の融解温度を、それぞれのＰＮＡプローブに対して各々区間化し、各区間にてコードを付与する段階；及び
（ｄ）変異が予想される試料を上記（ａ）段階ないし（ｂ）段階と同一の条件で反応させて融解温度を取得し、当該融解温度を、上記（ｃ）段階によって付与されたコードに従ってコード化し、これにより、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の類型を判別する段階を含むレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異を判別する方法に関するものである。
本発明において、上記変異の類型は、変異の可否及び変異の位置を意味する。
本発明において、上記ＰＮＡプローブは配列番号１〜６の中、どれかひとつの配列で表示されることを特徴とすることができて、上記ＰＮＡプローブは配列番号１〜３で表示されるＰＮＡプローブのセットまたは配列番号４〜６で表示されるＰＮＡプローブのセットであることを特徴とすることができる。
本発明において、上記ＰＮＡプローブは、両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とレポーターの蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することのできる消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の蛍光物質が結合することができる。上記のレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’，−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＪＯＥ、Ｃｙ３及びＣｙ５で構成される群から選択される一つ以上であることができて、上記消光子はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙｌで構成される群から選択される一つ以上であることができるが、これに限定されることではない。
ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＰＮＡ)は核酸塩基がリン酸結合ではないペプチド結合で連結された類似ＤＮＡで、１９９１年にＮｉｅｌｓｅｎなどによって初めて合成された。ＰＮＡは自然界では発見されず、人工的で化学的な方法で合成される。
ペプチド核酸はＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｉｃｄ）またはＭＮＡ（Ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）とともに遺伝子認識物質の一つで人工的に合成し、基本骨格がポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）で構成されている。ＰＮＡは親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）と選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）が非常に優秀で、核酸分解酵素に対する安定性が高く、現存する制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）で分解されない。また、熱／化学的に物性及び安定性が高く、保管が容易で容易に分解されない長所がある。
ＰＮＡは相補的な塩基配列の天然核酸とハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を通じて二本鎖を形成する。長さが同じである場合ＰＮＡ／ＤＮＡの二本鎖はＤＮＡ／ＤＮＡの二本鎖より、ＰＮＡ／ＲＮＡの二本鎖はＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖より安定である。また、ＰＮＡは単一塩基不整合 （ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）のために二本鎖が不安定になる程度が大きいためにＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出する能力が天然核酸よりさらに優れている。
本発明によるＰＮＡ塩基配列の長さは特に制限されることはないが、ウイルスの種類による特定塩基配列（例えば、塩基変異または単一塩基多型性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ， ＳＮＰ））が含まれるように１２〜１８ｍｅｒの長さに製作することができる。この時、ＰＮＡプローブの長さを調節して望むＴｍ値を有するようにＰＮＡプローブをデザインすることもできて、同じ長さのＰＮＡプローブでも塩基配列に変化を与えて、Ｔｍ値を調節することも可能である。また、ＰＮＡプローブはＤＮＡより結合力が優秀で、基本的なＴｍ値が高いためにＤＮＡより短い長さでデザインが可能で、近く隣接した塩基変異またはＳＮＰでも検出が可能である。既存のＨＲＭ（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔ）方法によるとＴｍ値の差が約０．５℃で非常に少なく、このために２つ以上の塩基変異が現れる場合、塩基配列の変異と一致させることができないが、本発明によるＰＮＡプローブは塩基の位置によるＴｍ値の差が明らかで分析が可能である。
本発明の一様態で、上記標的核酸とＰＮＡプローブの間に付与されたコードと、変異型の標的核酸とＰＮＡプローブの間に付与されたコードは異なり得る。
本発明はまた、標的核酸の変異を判決するために標的核酸とプローブ間の融解温度及び上記標的核酸の変異とプローブ間の融解温度をコード化した情報を提供することができる。
本発明の一様態で、上記標的核酸と上記ＰＮＡプローブ間の融解温度及び上記標的核酸の変異と上記ＰＮＡプローブ間の融解温度はその溶解温度の区間が互いに異なるように区間化して別個のコードを付与することができる。
本発明の一実施例で、塩基配列の変異追跡コード法を利用してＶＨＳＶのＮＶ遺伝子の融解曲線を分析してみた結果、一つのＰＮＡプローブと結合する試料の塩基配列変異の可否によって融解温度は互いに同一であったり相違に示されたが、二つ以上のＰＮＡプローブを使用して同時に分析を進行する場合、ＶＨＳＶの試料の類型によって融解温度の組合は互いに相違であることを確認することができた。このような特徴を利用する場合、プローブを活用した参照コード（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｄｅ）を製作することができて、その結果は、表５のようにコードの付与が可能である。このようにＰＮＡプローブは試料の塩基配列と完全にハイブリダイズされないと、融解温度がダウンシフト（ｄｏｗｎ ｓｈｉｆｔ）されるために塩基配列の変化を追跡することができて、各々の塩基配列の変化による融解温度に一連のコードを付与する場合、多い量の試料でＶＨＳＶ感染の発生のとき試料の追跡管理が可能である長所がある。併せて、あらかじめ付与しておいた試料のコード法によって新たな試料の融解温度を分類すると試料の類型を容易に判断することができて、このような場合、塩基配列の変異が早く発生して急速に拡散される多様な伝染病の拡散防止対策を講究するのに非常に早くて効果的な方法で活用が可能である。
表６に示されたことのように、本発明のコード法を利用すれば、塩基配列の変異が頻繁に発生する塩基配列に相補的に結合する最小限のＰＮＡプローブを制作し、融解曲線をコード化することによって、追跡管理が必要な多様である伝染病に別途の分析プログラムが必要でない長所がある。
本発明の追跡法の場合、塩基配列の変化の可否によって一つのＰＮＡプローブが多様な融解温度を示してこれらを適切に組み合わせて数字で表記する場合、各々の試料の情報を確認することができて、融解温度の範囲を細分化して区間化するほど少ない数字のＰＮＡプローブで多くの試料の情報をコード化することができる。融解温度の区間化は融解曲線の測定が可能な温度である４０〜９５℃、装備によっては５〜９５℃の温度の範囲で区分が可能であると言える。しかしながら、塩基配列の変異の位置が異なるにもかかわらず、融解温度が同一に示される場合があることができて、この場合には追加的なＰＮＡプローブを製作して区分が可能であるようにすることができる。このようなコード法は緊急な状況で同一のコードに分類される場合、迅速な対処が必要な伝染病の予防及び防止対策を講じることにおいて多くの薬物及びワクチンを使用する必要なしに、参照コードで同一のコードに分類される試料に該当する薬物またはワクチンを選択的にまず使用して時間的、費用的浪費を予防することができる。
本発明はまた別の観点から、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が結合されていて、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＮＶ遺伝子に相補的に結合して、配列番号１〜６の中から選択される塩基配列を有する複数個のＰＮＡプローブを含むウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異された塩基配列の位置の確認用キットに関するものである。
本発明のキットはバッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのような標的核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットはまた多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー、試薬及びＤＮＡ重合酵素の活性を抑制する抗体を含むことができる。また、上記のキットは特定の反応で使用される試薬の最適量は、本明細書に開示事項を習得した当業者によって容易に決定されることができる。 典型的に、本発明の装備は、先に言及された構成成分を含む別途の包装または コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で制作されることができる。
上記キットを利用すると、ＰＮＡプローブによる溶解曲線の分析を通じて標的核酸の単一塩基の変異及び塩基の欠損または挿入による変異を効果的に検出することができて、これを通じてウイルスの変異検出が可能である。
本発明は他の様態で、ウイルス性出血性敗血症ウイルスに対してＰＣＲ産物に相応する遺伝子の塩基配列を比較分析して、配列番号７〜８の塩基配列で表示される検出用のプライマー組を利用して増幅されたＰＣＲ増幅産物に配列番号１〜配列番号６の塩基配列で表示されるＰＮＡプローブをハイブリダイズさせて得た融解曲線から融解温度（Ｔｍ）を確認してウイルス性出血性敗血症ウイルスのＮＶ遺伝子の変異を判別して検出することができる。
本発明において、上記混合物に含まれたウイルス性出血性敗血症ウイルスのＮＶ−遺伝子の塩基配列を含む配列断片を増幅する段階は配列番号７〜８で表示されるプライマー組を利用して遂行することを特徴とすることができる。
本発明で「試料」は多様な試料を含み、好ましくは、本発明の方法を利用して生物試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）を分析する。より好ましくは、本発明に記載されたウイルス種（ｓｐｅｃｉｅｓ）と混合された試料であったり、上記ウイルスに感染された個体（例えば、魚類など）の試料であることができて、植物、動物、ヒト、菌類、バクテリア及びウィルス起源の生物試料が分析されることができる。哺乳類またはヒト起源の試料を分析する場合、上記試料は特定の組織または器官から由来されることができる。組織の代表的な例としては、結合、皮膚、筋肉または神経組織が含まれる。器官の代表的な例としては、目、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。分析される生物試料は生物学的の根源から出たいかなる細胞、組織、流体液（ｆｌｕｉｄ）、または本発明によりよく分析されることができるいかなる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）も含み、これはヒト、動物、ヒトまたは動物の消費のために製造された食べ物から得た試料が含まれる。また、分析される生物試料は体液試料を含み、これは血液、血清、血漿、リンパ、母乳、小便、糞便、眼球乳液、唾液、精液、脳抽出物(例えば、脳の粉砕物)、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃腺の組織抽出物が含まれるが、これに限定されることではない。
本発明の「標的核酸」は検出の可否を判別しようとする核酸配列（塩基変異またはＳＮＰを含む）を意味し、生理・生化学的機能を有するタンパク質をコーディングする「標的遺伝子」の核酸配列の特定部位を包含して、ハイブリダイズ、アニーリングまたは増幅の条件下でプライマーまたはプローブとアニーリングまたはハイブリダイズされる。
本発明の「ハイブリダイズ」は相補的な一本鎖の核酸が二本鎖の核酸を形成することを意味する。ハイブリダイズは２つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）起こったり、または一部の不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の塩基が存在しても起こることができる。ハイブリダイズに必要な相補性の程度はハイブリダイズの条件によって変わることができて、特に温度により調節されることができる。
本発明において、上記融解曲線の分析はＦＭＣＡ （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ；蛍光融解曲線の分析)方法で遂行することを特徴とすることができる。
本発明のレポーター及び消光子が含まれたＰＮＡプローブは標的核酸とハイブリダイズされた後、蛍光信号が発生し、温度が上がることによって、プローブの適正融解温度で標的核酸と急速に融解されて蛍光信号が消光され、このような温度変化による上記蛍光信号から得られた高解像度の融解曲線の分析を通じて標的核酸の塩基変性（塩基変異またはＳＮＰ包含)の有無を検出することができる。上記ＰＮＡプローブは標的核酸の塩基配列と完全なハイブリダイズ（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）をなす場合、予想された融解温度(Ｔｍ)値を示すが、塩基変異が存在する標的核酸とは不完全なハイブリダイズ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）をなして予想より低い融解温度(Ｔｍ)値を示すことが特徴である。
本発明の「塩基変異」は標的核酸の塩基配列に変異が起こったことで、単一塩基多型性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）だけではなく、塩基の置換、欠失または挿入されて変異が起こったことを含むことを特徴として、本発明のＰＮＡプローブは標的核酸のＳＮＰまたは標的核酸の塩基が置換、欠失または挿入されて変異が起こったことを融解曲線の分析を通じて分析することができる。
ＰＮＡプローブのヌクレオチドとこれに相補的に結合するＤＮＡのヌクレオチドの違いによってもＴｍ値の変化を示し、これを利用したアプリケーション（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の開発が容易である。ＰＮＡプローブはＴａｑＭａｎプローブの加水分解方法（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）とは異なるハイブリダイズ方法(ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を利用して分析して同様な役割をするプローブは分子ビーコンプロブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅ)、スコーピオンプローブ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）などがある。
ＰＮＡプローブを利用した特定塩基配列（例えば、塩基変異またはＳＮＰ）の分析のためには、まず、特定塩基配列を認識する塩基が含まれたプローブとＰＣＲのための正方向／逆方向（Ｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーセット（従来プライマー組：ＯＩＥ（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｓ，世界動物保健機構）の基準に従う）及び上記プライマーセットによって増幅された遺伝子マーカーの塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）で一本鎖の遺伝子マーカーの配列断片を生成させるプライマーさえあれば十分である。上記ＰＣＲ条件は、既存の方法が使用可能であり、ＰＣＲが終わった後、溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）過程が必要で、０．５〜１℃ずつ増加するごとに、蛍光の強さを測定してＴｍ値を得る。特に一般的なリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）の装置は広く普及されており、ＨＲＭ（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ）のように付加的なプログラムの購入及び細密な温度変化を要求しない長所がある。
本発明の融解曲線の分析は標的核酸であるＤＮＡまたはＲＮＡとプローブで形成される二本鎖核酸の融解温度を解釈する方法である。このような方法は例えば、Ｔｍ解析、または上記二本鎖の融解曲線の解析によって行われるために、融解曲線の分析と呼ばれている。 検出対象（標的）の特定塩基配列（塩基変異またはＳＮＰ包含）に相補的なプローブを利用して、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと、上記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続けて、このハイブリッド形成体に加熱処理を実施して、温度の上昇によるハイブリッドの解離（融解）を、吸光度などのシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、特定塩基配列の有無を判断する方法である。Ｔｍ値はハイブリッド形成体の相同性が高いほど高く、相同性が低いほど低くなる。このために検出対象の特定塩基配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体に対して、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておいて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと上記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定して、測定値が評価基準値と同一な程度であればマッチ、即ち標的ＤＮＡに特定塩基配列が存在すると判断することができ、測定値が評価基準値より低いと、ミスマッチ、即ち標的ＤＮＡにＴａｒｇｅｔにする塩基配列がないか、変異があると判断することができる。
本発明の蛍光融解曲線の分析は蛍光物質を使用して融解曲線を分析する方法で、より具体的に、蛍光物質を含むプローブを利用して融解曲線を分析することができる。蛍光物質はレポーター及び消光子であることができ、インターカレートする蛍光物質であることができる。
本発明において、上記増幅はリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の方法で遂行することを特徴とすることができる。
本発明のリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の方法は、蛍光物質がＰＣＲ過程で二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ）のＤＮＡ鎖に結合（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｉｎｇ）されるようにしてＰＣＲ産物の増幅とともに、温度を高めてＤＮＡ二本鎖を解くことで、ＤＮＡ二本鎖の間に存在する蛍光物質の量が減ることになる融解曲線のパターン、特にＤＮＡが融解（変性）される温度（Ｔｍ）を分析して特定塩基配列（塩基変異、ＳＮＰ包含）の有無でウイルスの類型の検出及び／又は判別が可能である。
本発明の結果を最適化するための技術的方法では、Ｌｉｑｕｉｄ ｔｙｐｅ Ｕ−ＴＯＰ方法（シソンバイオマテリアルズ、韓国）で標的核酸の単一塩基配列の置換及び塩基の欠失または挿入を効果的に検出できるレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してハイブリダイズの過程後、洗浄する過程とＰＮＡプローブをプレートに固定させる必要がない液状型アレイ方法を活用することができる。
［実施例］
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることで解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
［実施例］
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることで解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
実施例１：ＶＨＳＶのＮＶ遺伝子変異の検出用ペプチド核酸の製造
国立水産科学院で保管中であるＶＨＳを起こしたウィルスの試料を利用してｃＤＮＡ鋳型に塩基配列を解析してＯＩＥ（国際貿易事務局）のガイドラインに告示された塩基配列との一致の可否を確認し、保管中である試料の中でＶＨＳＶであることが確認された試料を使用した。
国立水産科学院で保管中であるＶＨＳを起こしたウィルスの試料を利用してｃＤＮＡ鋳型に塩基配列を解析してＯＩＥ（国際貿易事務局）のガイドラインに告示された塩基配列との一致の可否を確認し、保管中である試料の中でＶＨＳＶであることが確認された試料を使用した。
塩基配列の分析を通じて、ＮＶ遺伝子の変異部分を確認し、総６つの主要の変異部分をＰＮＡプローブを用いて検出するためにデザインして、ｃＤＮＡから変異の診断を確認するためのプローブとＰＮＡプローブを作製した（表１）。
図３ないし図７は、本発明によるＶＨＳＶのＮＶ遺伝子の変異検出部位６個とＳＮＰ及びこれから導出されたＰＮＡプローブの塩基配列の一例を示すための遺伝子の位置図であり、ＰＮＡプローブの塩基配列は黄色の陰影で示して、変異の検出部位ＳＮＰは赤色のボールド体で表記した。
図８は本発明によるＶＨＳＶのＮＶ遺伝子上でＰＮＡプローブを含んでいる塩基変異部分の一例を説明するための遺伝子の位置図である。各塩基番号はＮＶタンパク質に発現することができるＮＶ遺伝子のＰＣＲ産物の大きさを基準に作成した。
［表１］ＶＨＳＶのＶＮ遺伝子変異の検出のためのプライマー、ＰＮＡプローブの塩基配列
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲの装備が一度に検出できる蛍光が制限的なので、二つのチューブに分けて検出に使用してチューブ当たりそれぞれ異なる蛍光のついたペプチド核酸が含まれている。Ｓｅｔ １の場合、配列番号１〜３であり、Ｓｅｔ２の場合、配列番号４〜６が含まれている。
本発明で使用したすべてのＰＮＡプローブはパナジン（Ｐａｎａｇｅｎｅ，韓国)でＨＰＬＣ精製方法を通じて合成して、合成されたＰＮＡプローブの純度は質量分析法を利用して確認した（標的核酸とのより効果的な結合のためにＰＮＡプローブの不要な二次構造は避ける）。
実施例２：ＶＨＳＶのＮＶ遺伝子変異の検出用ペプチド核酸を利用した増幅曲線及び融解曲線の導出
ＶＨＳＶはＲＮＡ ｖｉｒｕｓでｃＤＮＡで作製して実験に使用しており、ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ（登録商標） ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社、米国）を利用し、ｃＤＮＡはＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社、韓国）を利用して実験に使用した。
ＶＨＳＶはＲＮＡ ｖｉｒｕｓでｃＤＮＡで作製して実験に使用しており、ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ（登録商標） ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社、米国）を利用し、ｃＤＮＡはＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社、韓国）を利用して実験に使用した。
ＰＮＡプローブを利用してＶＨＳＶの試料の増幅曲線及び融解曲線を確認するため、ＣＦＸ９６（登録商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、米国)で増幅反応を遂行した。Ｓｅｔ別に同時進行して二つのチューブに同時製造して実験に使用した。ＰＣＲ用の反応物の造成は次のようである；２ｘｑＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ ｂｕｆｆｅｒ（シソンバイオマテリアルズ、韓国）１０μｌ、ＶＨＳＶ−１＿３Ｆ（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）１ｐｍｏｌ ０．５μｌ及びＶＨＳＶ−１＿４Ｒ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）１０ｐｍｏｌ ０．５μｌ、ＶＨＳＶ ｃＤＮＡ（試料）１μｌ、２．５ｐｍｏｌペプチド核酸０．５μｌ、２０ｘ ＳＳＢ ｂｕｆｆｅｒ（シソンバイオマテリアルズ、韓国）及び蒸留水で総ボリュームが２０μｌになるようにした。
図９は本発明によりＶＳＨＶ試料のｃＤＮＡサンプルを増幅させて、ハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物の温度を高める過程の一例を説明するためのグラフである。ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施して、反応条件は次のようである。９５℃で１０分間変性させた後、９５℃で３０秒、５５℃で４０秒（蛍光撮影）、７２℃で４０秒間反応させて、これを４５ｃｙｃｌｅ繰り返しながら増幅曲線を得た。その後ＰＮＡプローブとのハイブリダイズ及び融解曲線を得るために９５℃で５分、７５℃で１分、５５℃で１分、４５℃で１分の時間を与えた後、３０℃から８５℃まで１℃ずつ上昇させて、５秒間の停止状態を維持して蛍光を測定して融解曲線の分析を遂行した。
実施例３：ＶＨＳＶのＮＶ遺伝子変異の検出用ペプチド核酸を利用した増幅曲線及び溶解曲線の分析
実施例２を利用した増幅曲線の結果を図１０に示した。遺伝子増幅の可否を確認することができて、蛍光別にｓａｍｐｌｅが増幅されていることを確認することができる。
実施例２を利用した増幅曲線の結果を図１０に示した。遺伝子増幅の可否を確認することができて、蛍光別にｓａｍｐｌｅが増幅されていることを確認することができる。
図１１は、実施例２を利用した各ｓａｍｐｌｅ別の温度別の融解曲線グラフの一例である。最初のｔｕｂｅ（Ｓｅｔ１）の場合、配列番号１〜３であるＰＮＡプローブが混合されており、二番目のｔｕｂｅ（Ｓｅｔ２）の場合、配列番号４〜６であるＰＮＡプローブが混合されていて、一つのｓａｍｐｌｅ当たり二つの図で示してＳｅｔ１とＳｅｔ２で表記しておいた。各ＰＮＡプローブの融解曲線の融解温度を試料別に整理した（表２）。本発明によるＰＮＡプローブを適用した融解曲線は試料のＳＮＰごとに互いに異なる融解温度（Ｔｍ）を有していることを確認することができ、変異のある値は赤色で表記した。ＰＯ−３５５の場合、変異部分をｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈでデザインして高い温度の値が変異があることを示唆する。
［表２］ＶＳＨＶの１５個試料の融解温度の確認
試料別に融解温度が差異の出る理由が、塩基配列上で違いによるものであるかを確認するため、塩基配列と比較分析した（表３及び表４）。青色で表記したのは、主要変異の位置を表記したもので、赤色で表記したのはＰＮＡプローブと異なる塩基配列であることを表記したもので、塩基配列の差異によってＴｍ値に違いがあることを確認することができた。 各変異ごとにＴｍ値で差異があることを確認することができて、このような融解温度の違いを通じて塩基配列の変異を確認することができるといえる。これは本発明によるＰＮＡの塩基配列を構成する際に意図したものと一致する結果である。様々なｓａｍｐｌｅで同一な塩基配列であれば、同一のＴｍが出ることを確認することができて、これを基に同一のＴｍが出れば同一の塩基配列といえる。
［表３］ｓｅｔ１に含まれたＰＮＡ ｐｒｏｂｅの融解温度と塩基配列の関係
［表４］ｓｅｔ２に含まれたＰＮＡ ｐｒｏｂｅの融解温度と塩基配列の関係
実施例４：ＶＨＳＶの検出融解温度によるＮＶ遺伝子の変異検出方法
実施例２及び実施例３の結果を基に実際、ＶＨＳＶ資料のＮＶ遺伝子変異の検出できる判定表を作ることができて、これを利用してＮＶ遺伝子の変異検出が可能である。
実施例２及び実施例３の結果を基に実際、ＶＨＳＶ資料のＮＶ遺伝子変異の検出できる判定表を作ることができて、これを利用してＮＶ遺伝子の変異検出が可能である。
現在までに出た実験結果を基に二つの判定基準を作ることができる。図１２のＴｍ値を基準にしてバーコード化をする判定基準と図１３のバーコードを基準に塩基配列の変異を確認する判定基準である。
図１２の判定基準を利用して試料のＴｍ結果値をバーコード化した（表５）。バーコードを再び図１３の判定基準を利用すると、結果が含蓄されたバーコードで塩基配列の変異を確認することができる（表６）。併せて、上記のバーコードを利用した各試料から検出されるウイルスの変異を変異系統図で図１４のように表示することができる。
［表５］ ＰＮＡ ｐｒｏｂｅの融解曲線の値を判定表を利用したバーコード化
［表６］ バーコードで記入されたｄａｔａの変異検出
Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲの結果をＴｍ値の基準を利用してＰＮＡ ｐｒｏｂｅ別にバーコード化を通じて結果を含蓄することができて、バーコードを通じて含蓄された結果はバーコードの基準を通じて塩基配列に置換することができて、このような一連の過程を通じてＰＮＡプローブがＶＨＳＶのＮＶ遺伝子の変異を迅速に検出することができることである。
本発明は水産生物伝染病の原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルスのＮＶ遺伝子に特異的なペプチド核酸及びプライマーを利用して増幅及び融解曲線を示させることによって、水産生物伝染病の原因ウイルスの変異を簡単・迅速・正確に判別して、魚類の上記ウイルスの感染可否を検出することができて、ＮＶ遺伝子の変異を確認する効果がある。
以上で本発明の内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的の記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることではないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
Claims (8)
- 次の段階を含むレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたＰＮＡプローブを利用してウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)の非ビリオン（ＮＶ）遺伝子の変異を判別する方法：
（ａ）
（ｉ）ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)または上記ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の部位を包含する標的核酸を含む試料及び
（ｉｉ）上記ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の部位を含む標的核酸の塩基配列に相補的に結合するＰＮＡプローブ
を混合して各ＰＮＡプローブを試料にハイブリダイズさせる段階；
（ｂ）温度を変化させながら上記ハイブリダイズされた産物の融解温度を得る段階；
（ｃ）上記ハイブリダイズされた産物の融解温度を、それぞれのＰＮＡプローブに対して各々区間化し、各区間にコードを付与する段階；及び
（ｄ）変異が予想される試料を上記（ａ）段階ないし（ｂ）段階と同一の条件で反応させて変異融解温度を取得し、当該融解温度を、上記（ｃ）段階によって付与されたコードに従ってコード化し、これにより、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異の類型を判別する段階。 - 前記ＰＮＡプローブは配列番号１〜６の何れかひとつの配列で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記野生型の標的核酸とＰＮＡプローブの間に付与されたコードと、変異型の標的核酸とＰＮＡプローブの間に付与されたコードは異なることを特徴とする、 請求項１に記載の方法。
- 前記レポーターはＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’，−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）及びＣｙ５で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記消光子はＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチル−ローダミン）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙｌで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記ＰＮＡプローブは配列番号１〜３で表示されるＰＮＡプローブのセットまたは配列番号４〜６で表示されるＰＮＡプローブのセットであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- それぞれレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が結合されており、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子に相補的に結合し、配列番号１〜６からなる群から選択される塩基配列を有する複数個のＰＮＡプローブを含む、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(ＶＨＳＶ)のＮＶ遺伝子の変異された塩基配列の位置の確認用キット。
- 前記ＰＮＡプローブは配列番号１〜３で表示されるＰＮＡプローブのセットまたは配列番号４〜６で表示されるＰＮＡプローブのセットであることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
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