KR20170000262A

KR20170000262A - Pna 프로브를 이용한 인간혈소판항원 유전자형 판별방법

Info

Publication number: KR20170000262A
Application number: KR1020150089275A
Authority: KR
Inventors: 박재신; 박희경; 송민식
Original assignee: 주식회사 시선바이오머티리얼스
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2017-01-02

Abstract

본 발명은 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브 및 이를 이용한 인간혈소판항원 유전자형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간혈소판항원 관련 유전자인 ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2), CD109(Cluster of Differentiation 109) 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 인간혈소판항원 유전자형 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브 및 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍을 이용하면, 인간혈소판항원 관련 유전자 또는 그 변이체를 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 인간혈소판항원 관련 혈액관리에 유용하다.

Description

PNA 프로브를 이용한 인간혈소판항원 유전자형 판별방법{Method for Discriminating Human Platelet Antigen Genotype Using PNA Probe}

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 인간혈소판항원 유전자형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간혈소판항원 관련 유전자인 ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2), CD109(Cluster of Differentiation 109) 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 인간혈소판항원 유전자형 판별방법에 관한 것이다.

혈소판(platelets)은 핵이 없는 혈액 세포이며, 혈관 내피(blood-vessel endothelium)의 보존 및 유지에 필수적인 성분으로서 매우 중요한 기능을 한다. 이러한 기능은 혈소판의 당단백질(glycoprotein, gp)과 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 단백질 간의 상호작용을 통해 이루어진다.

혈소판 막(platelet membrane)의 당단백질에 존재하는 특이적인 동종항원(alloantigen)으로 알려진 혈소판항원(platelet antigen)은 동종항체(alloantibody)의 생성을 자극할 수 있으며, 이는 장기 이식(organ transplant) 시 거부반응을 유발하는 요소로 알려져 있다.

인간의 혈소판항원은 염기변이(Single-nucleotide polymorphism, SNP)에 따라 여러 종류의 인간혈소판항원(Human Platelet Antigen, HPA)으로 분류되어 명명되었다(Metcalfe P, et al ., Vox Sang, 85:240-245, 2003; Metcalfe P, Vox Sanguinsis, 87(Supp.1), S82-S86, 2004).

한편, 항암치료(via intensive chemotherapy)를 받는 대부분 환자 및 혈중 혈소판 감소증을 나타내는 환자의 경우 혈소판 수혈이 필요하다. 상기 환자들의 경우 수혈 시 혈소판이 지속해서 제공되어야 하지만 혈소판은 전혈(whole blood)과 달리 장기 보관이 어려운 단점을 가지고 있다.

환자에게 혈소판 수혈 시 반드시 인간혈소판항원 검사를 수행하는데, 혈소판의 당단백질 유전자를 대상으로 RAPD, RFLP와 같은 고전적인 분자생물학적 방법을 이용한다. 상기 방법들의 경우, 비용면에서 저렴한 장점이 있지만, 분석의 정확성 및 신속성에서는 매우 취약하다. 최근에는 상기 방법들을 보완하여 신속하고 정확하게 분석하는 방법들(BeadChip, IDCore+ 등)을 활용하고 있지만, 고가의 분석비용이 문제가 된다.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 간편·신속·정확하게 인간혈소판항원 유전자형을 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브를 디자인하고, 상기 PNA 프로브를 이용한 혼성화를 통해 얻은 융해곡선을 분석하여, 인간혈소판항원 관련 유전자 변이를 효율적으로 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍, PNA 프로브 및 이를 포함하는 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프리이머 쌍을 이용하여 증폭된 인간혈소판항원과 관련된 유전자 영역에 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 인간혈소판항원 유전자형에 맞는 Tm값을 얻어 인간혈소판항원 유전자형을 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 7과 서열번호 8; 서열번호 9과 서열번호 10; 서열번호 11과 서열번호 12; 서열번호 13과 서열번호 14; 서열번호 15과 서열번호 16 및 서열번호 17과 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 어느 하나의 PNA 프로브 및 상기 어느 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 gDNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 관련 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 인간혈소판항원 유전자형을 판별하는 단계를 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법을 제공한다.

본 발명에 따른 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브 및 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍을 이용하면, 인간혈소판항원 관련 유전자 또는 그 변이체를 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 인간혈소판항원 관련 혈액관리에 유용하다.

도 1은 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위한 5가지 유전자 내의 프로브 결합위치, 프라이머 결합위치 및 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브의 검증을 위한 DNA 올리고머의 PCR 증폭 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 6가지 인간혈소판항원 유전자형에 대한 PNA 프로브의 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위한 U-TOP^TM 방법의 인간혈소판항원 관련 유전자의 PCR 증폭 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 6가지 인간혈소판항원 유전자형의 PNA 융해곡선 및 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

펩티드핵산(peptide nucleic acid: PNA)은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection) 할 수 있게 된다.

본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA)을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다.

본 발명의 상기 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.

혼성화에 따른 분석 방법으로는 U-TOP^TM 방법 및 MeltingArray^TM 방법으로 형광의 융해곡선을 이용한 분석방법(Fluorescence Melting Curve Analysis: FMCA), 즉 PCR(Polymerase Chain Reaction)이 종료한 후 생성된 산물과 첨가된 PNA 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 판별하여 분석한다. 다른 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 검출용 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9~15mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브에 변화를 주어 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High resolution melting) 방법과는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어려운 반면 PNA 프로브의 프로브 서열은 SNP에 대해서 영향을 받지 않아 분석이 가능하다.

PNA 프로브를 이용한 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 분석을 위해서는 우선 SNP를 포함하는 부분의 염기를 이용한 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.

본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 변이(SNP 포함)를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이(SNP 포함)의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 돌연변이(SNP 포함)가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이(SNP 포함) 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.

본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위해 제조된 PNA 프로브의 검증을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 제작된 PNA 프로브(들)은 인간혈소판항원 HPA(1, 2, 3, 4, 5, 15)의 유의적인 판별이 가능하였으므로, 상기 PNA 프로브(들)은 모두 정상적으로 제조(합성)되었음을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위한 유전자 염기변이에 따른 U-TOP^TM 방법을 이용한 융해곡선 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 합성 DNA(또는 표적 핵산)를 주형으로 PCR 증폭되고, PNA 프로브로 혼성화된 합성 DNA의 산물을 융해곡선으로 분석 시 인간혈소판항원 유형(염기 치환)에 따른 융해온도(Tm)의 차이가 발생하는 것을 확인하였고, 6가지 인간혈소판항원 특이적인 융해곡선을 얻을 수 있었다. 도 5의 융해곡선은 인간혈소판항원 유형에 따라 a/a(PNA 프로브와 완벽하게 일치), b/b(PNA 프로브와 1개의 불일치) 또는 a/b(PNA 프로브와 일치와 불일치 동시 존재)로 분류할 수 있다. 즉, 표 4에 나타난 바와 같이, 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브의 융해온도 범위로 인간혈소판항원 유전자형의 판별이 가능함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인간혈소판항원 관련 유전자와 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PNA 프로브는 ITGB3(Integrin beta-3)의 176T>C 또는 506G>A, GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain)의 482C>T, ITGA2B(Integrin alpha-IIb)의 2621T>G, ITGA2(Integrin, alpha 2)의 1600G>A 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)의 2108C>A에 염기변이를 가지는 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 변이체와 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 명세서에서 A(adenine), T(thymine), G(guanine) 및 C(cytosine)는 뉴클레오티드(nucleotide)의 기호를 나타낸 것이며, 176T>C의 경우 DNA 염기서열 176번 위치(position)의 T(thymine)이 C(cytosine)으로 뉴클레오티드 변화(nucleotide change)한 것을 의미한다. 상기와 같은 형태로 506G>A, 482C>T, 2621T>G, 1600G>A 및 2108C>A도 뉴클레오티드 변화를 나타낸 것이다(P. Metcalfe, Vox Sanguinsis, 87(Supp.1), S82-S86, 2004).

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터 또는 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 인간혈소판항원 유전자형은 HPA-1a, HPA-1b, HPA-1a/b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-2a/b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-3a/b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-4a/b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-5a/b, HPA-15a, HPA-15b, 및 HPA-15a/b로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 7과 서열번호 8; 서열번호 9과 서열번호 10; 서열번호 11과 서열번호 12; 서열번호 13과 서열번호 14; 서열번호 15과 서열번호 16 및 서열번호 17과 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 프리이머 쌍은 ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인간혈소판항원 관련 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프리이머 쌍은 ITGB3(Integrin beta-3)의 176T>C 또는 506G>A, GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain)의 482C>T, ITGA2B(Integrin alpha-IIb)의 2621T>G, ITGA2(Integrin, alpha 2)의 1600G>A 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)의 2108C>A에 염기변이를 가지는 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 변이체를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기의 PNA 프로브 및 상기의 프라이머 쌍을 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기의 PNA 프로브 및 상기의 프라이머 쌍을 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기의 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 gDNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 관련 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 인간혈소판항원 유전자형을 판별하는 단계를 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체는 ITGB3(Integrin beta-3)의 176T>C 또는 506G>A, GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain)의 482C>T, ITGA2B(Integrin alpha-IIb)의 2621T>G, ITGA2(Integrin, alpha 2)의 1600G>A 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)의 2108C>A에 염기변이를 가지는 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 할 수 있고, 상기 프라이머는 서열번호 7과 서열번호 8; 서열번호 9과 서열번호 10; 서열번호 11과 서열번호 12; 서열번호 13과 서열번호 14; 서열번호 15과 서열번호 16 및 서열번호 17과 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 검체 시료는 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 HPA-1a: 62.0 ~ 66.0℃, HPA-1b: 50.0 ~ 54.0℃, HPA-1a/b: 50.0 ~ 54.0℃ 및 62.0 ~ 66.0℃, HPA-2a: 67.5 ~ 71.5℃, HPA-2b: 59.0 ~ 63.0℃, HPA-2a/b: 59.0 ~ 63.0℃ 및 67.5 ~ 71.5℃, HPA-3a: 66.0 ~ 70.0℃, HPA-3b: 49.5 ~ 53.5℃, HPA-3a/b: 49.5 ~ 53.5℃ 및 66.0 ~ 70.0℃, HPA-4a: 57.0 ~ 61.0℃, HPA-4b: 45.0 ~ 49.0℃, HPA-4a/b: 45.0 ~ 49.0℃ 및 57.0 ~ 61.0℃, HPA-5a: 64.0 ~ 68.0℃, HPA-5b: 48.0 ~ 52.0℃, HPA-5a/b: 48.0 ~ 52.0℃ 및 64.0 ~ 68.0℃, HPA-15a: 64.0 ~ 68.0℃, HPA-15b: 47.0 ~ 51.0℃, 또는 HPA-15a/b: 47.0 ~ 51.0 ℃ 및 64.0 ~ 68.0℃의 인간혈소판항원 유전자형 융해온도에 따라 인간혈소판항원 유전자형을 판별하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프로브의 제조

인간혈소판항원 중 HPA-1(a, b, a/b), HPA-2(a, b, a/b), HPA-3(a, b, a/b), HPA-4(a, b, a/b), HPA-5(a, b, a/b) 및 HPA-15(a, b, a/b) 유전자형을 판별하고자 인간혈소판항원의 특이적인 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 염기서열을 검출할 수 있는 6쌍의 프라이머와 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 제조하였다(표 1 및 표 2).

상기 PNA 프로브는 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위하여 직접 설계하였고, 표적 핵산과의 효과적인 결합을 위해 PNA 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 특히 염기의 변이 부분(SNP)은 보통 표적 핵산과 5℃ 이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 PNA 프로브 결합부위 중앙에 위치하도록 디자인하였고, 융해온도(Tm)의 최적화를 위해 표적 핵산과 PNA 프로브가 결합하는 염기서열의 중앙에 혈소판 항원 유전자 염기서열과 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다.

상기 PNA 프로브는 형광물질(FAM-labeled, Dabcyl)로 표지한 다음, HPLC 정제방법을 통해 합성하였고(Panagene, 한국), 상기 합성된 PNA 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다.

하기 표 1은 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브 서열을 나타낸 것이다. 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 나타낸 것이다.

하기 표 2는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 서열을 나타낸 것이다.

표 1 및 표 2에 인간혈소판항원 관련 유전자의 특이 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 사이트를 타입으로 나타내었다. 각 염기의 번호는 인간혈소판항원과 관련된 유전자 로커스(locus)의 대립인자(allele)를 기준으로 작성하였으며, PNA 프로브가 퍼펙트 매치(perfect match)를 나타내도록 유도하여 제작하였다(도 1).

실시예 2: 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위해 제조된 PNA 프로브의 검증

인간혈소판항원 유전자형 판별을 위해 실시예 1에서 제조(합성)된 PNA 프로브가 표적 핵산(예: 검출시료 gDNA(genomic DNA))에 대해 제대로 작동할 수 있는지 검증하기 위하여, 상기 PNA 프로브의 염기서열에 상보적인 DNA 올리고머를 인간혈소판항원 유형(type)에 따라 모두 제작하였다(표 3). 상기 DNA 올리고머는 인간혈소판항원인 유형을 판별할 수 있게, PM(Perfect Match)과 MM((Mismatch)으로 제조하였다. 이때, 상기 PM은 인간혈소판항원 a를, MM은 인간혈소판항원 b를 확인할 수 있게 제조되었으며, 인간혈소판항원 a/b의 확인을 위해 PM 올리고머와 MM 올리고머를 동량으로 혼합하여 이종의(Heterogeneous) 올리고머를 제조하였다.

하기 표 3은 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브의 검증을 위한 DNA 올리고머 염기서열을 나타낸 것이다.

인간혈소판항원 유전자형 판별을 위해 제조된 PNA 프로브의 검증을 위해서, 상기 DNA 올리고머 및 PNA 프로브를 혼합하여 융해곡선 분석 장비인 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PNA 프로브의 검증을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X MeltingArray 버퍼(2X MeltingArray Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, DNA 올리고머 1㎕/2.5pmol, PNA 프로브 0.5㎕/10pmol, 증류수 8.5㎕를 혼합한 다음, 도 2의 리얼타임 PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) 조건에서, 융해곡선 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 제작된 PNA 프로브(들)은 인간혈소판항원 HPA(1, 2, 3, 4, 5, 15)의 유의적인 판별이 가능하였으므로, 상기 PNA 프로브(들)은 모두 정상적으로 제조(합성)되었음을 확인하였다.

실시예 3: 인간혈소판항원 유전자형 판별을 위한 유전자 염기변이에 따른 U-TOP ^TM 방법을 이용한 융해곡선 분석

실시예 1에서 제조된 PNA 프로브 및 표적 핵산(예: 검출시료 gDNA(genomic DNA))를 이용하여 융해곡선 분석을 수행하고자 하였다. 우선 검출가능한 표적 핵산을 생성하기 위하여 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 단일가닥 표적 핵산을 생성하기 위해 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 도 4의 조건으로 수행하였다. 더욱 상세하게는, 2개의 튜브로 나눠 실험을 진행하였으며, 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 프리믹스 버퍼(2X SSB qPCR PreMix buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, forward 프라이머 및 reverse 프라이머 0.5㎕, 프로브 6종 0.5㎕, 증류수 3.5㎕, 3㎕ 합성 DNA(또는 표적 핵산)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 수행하였다.

인간혈소판항원의 유전자형을 판별하기 위한 PNA 프로브는 총 6가지로, 같은 파장의 형광 간섭을 피하기 위하여 2개의 튜브로 나눠서 실험을 진행하였다. 한 개의 튜브에서는 HPA(1, 2, 5)를 동시에 확인하였으며, 다른 튜브에서는 HPA(3, 4, 15)를 동시에 확인하였다. 리얼타임 PCR 과정은, 도 4에 나타난 바와 같이, 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 60℃에서 40초, 72℃에서 30초 동안 반응시켰으며, 이를 40 사이클 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 20℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 0.5초간 정지 상태를 유지하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 합성 DNA(또는 표적 핵산)를 주형으로 PCR 증폭되고, PNA 프로브로 혼성화된 합성 DNA의 산물을 융해곡선으로 분석 시 인간혈소판항원 유형(염기 치환)에 따른 융해온도(Tm)의 차이가 발생하는 것을 확인하였고, 6가지 인간혈소판항원 특이적인 융해곡선을 얻을 수 있었다. 도 5의 융해곡선은 인간혈소판항원 유형에 따라 a/a(PNA 프로브와 완벽하게 일치), b/b(PNA 프로브와 1개의 불일치) 또는 a/b(PNA 프로브와 일치와 불일치 동시 존재)로 분류할 수 있다. 상기 결과들은 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 분석을 통하여 모두 정확한 결과임을 확인하였다.

실시예 4: 염기변이와 융해온도에 따른 인간혈소판 항원 유전자형 판별

실시예 3의 U-TOP^TM 결과로 확인된 Tm값을 표 4에 나타내었다. 즉, PM(Perfect Match), MM((Mismatch), 또는 PM 및 MM이 동시에 존재 시 온도의 ±2℃ 범위를 만들고 이 범위 안에 포함되면 각각의 문자로 표기하여 고유의 표기법을 가지도록 하였다.

하기 표 4는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브의 융해온도 범위와 표기법을 나타낸 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seasunbiomaterials <120> Method for Discriminating Human Platelet Antigen Genotype Using PNA Probe <130> P15-B046 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA1-P <400> 1 cctctgggct ca 12 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA2-P <400> 2 gtggtcgtca g 11 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3-P <400> 3 gcccatcccc ag 12 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA4-P <400> 4 gtgagctttc gcat 14 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA5-P <400> 5 atgccctctt tgatag 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA15-P <400> 6 atcctgtaac ccatgt 16 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA1-F <400> 7 ctgccagcag tgcctggctg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA1-R <400> 8 gctgtctcca gagcccttg 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA2-F <400> 9 gaactccaag agctctacct g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA2-R <400> 10 caagttgttg ttagccagac 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3-F <400> 11 gacctgctct acatcctgg 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3-R <400> 12 gcttacgaga actggatcct g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA4-F <400> 13 cttgatggac ctgtcttact c 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA4-R <400> 14 cactctgctt cttcacttcc tc 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA5-F <400> 15 gcaccaatgt acatgagtga cc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA5-R <400> 16 gtggtgaacc aacaatcaca tc 22 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA15-F <400> 17 gaaggacata ttgtagatat tcatgac 27 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA15-R <400> 18 cagtagccac ccaagaagtg atag 24 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-1 PM <400> 19 tgagcccaga gg 12 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-1 MM <400> 20 tgagcccgga gg 12 <210> 21 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-2 PM <400> 21 ctgacgacca c 11 <210> 22 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-2 MM <400> 22 ctgatgacca c 11 <210> 23 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-3 PM <400> 23 ctggggatgg ggc 13 <210> 24 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-3 MM <400> 24 ctggggctgg ggc 13 <210> 25 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-4 PM <400> 25 atgcgaaagc tcac 14 <210> 26 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-4 MM <400> 26 atgcaaaagc tcac 14 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-5 PM <400> 27 ctatcaaaga gggcat 16 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-5 MM <400> 28 ctatcaaaaa gggcat 16 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-15 PM <400> 29 acatgggttc caggat 16 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA-15 MM <400> 30 acatgggtta caggat 16

Claims

서열번호 1 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인간혈소판항원 관련 유전자와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 ITGB3(Integrin beta-3)의 176T>C 또는 506G>A, GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain)의 482C>T, ITGA2B(Integrin alpha-IIb)의 2621T>G, ITGA2(Integrin, alpha 2)의 1600G>A 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)의 2108C>A에 염기변이를 가지는 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 변이체와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터 또는 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
제1항에 있어서, 상기 인간혈소판항원 유전자형은 HPA-1a, HPA-1b, HPA-1a/b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-2a/b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-3a/b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-4a/b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-5a/b, HPA-15a, HPA-15b, 및 HPA-15a/b로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 PNA 프로브.
서열번호 7과 서열번호 8; 서열번호 9과 서열번호 10; 서열번호 11과 서열번호 12; 서열번호 13과 서열번호 14; 서열번호 15과 서열번호 16 및 서열번호 17과 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍.
제8항에 있어서, 상기 프리이머 쌍은 ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인간혈소판항원 관련 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍.
제8항에 있어서, 상기 프리이머 쌍은 ITGB3(Integrin beta-3)의 176T>C 또는 506G>A, GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain)의 482C>T, ITGA2B(Integrin alpha-IIb)의 2621T>G, ITGA2(Integrin, alpha 2)의 1600G>A 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)의 2108C>A에 염기변이를 가지는 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 변이체를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍.
제8항에 있어서, 상기 인간혈소판항원 유전자형은 HPA-1a, HPA-1b, HPA-1a/b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-2a/b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-3a/b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-4a/b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-5a/b, HPA-15a, HPA-15b, 및 HPA-15a/b로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 프라이머 쌍.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별용 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
다음 단계를 포함하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법:
(a) 검체 시료로부터 gDNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
(b) ITGB3(Integrin beta-3), GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain), ITGA2B(Integrin alpha-IIb), ITGA2(Integrin, alpha 2) 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)로 구성된 군에서 선택되는 인간혈소판항원 관련 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 인간혈소판항원 유전자형을 판별하는 단계.
제15항에 있어서, 상기 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체는 ITGB3(Integrin beta-3)의 176T>C 또는 506G>A, GP1BA(Platelet glycoprotein Ib alpha chain)의 482C>T, ITGA2B(Integrin alpha-IIb)의 2621T>G, ITGA2(Integrin, alpha 2)의 1600G>A 및 CD109(Cluster of Differentiation 109)의 2108C>A에 염기변이를 가지는 인간혈소판항원 관련 유전자의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 7과 서열번호 8; 서열번호 9과 서열번호 10; 서열번호 11과 서열번호 12; 서열번호 13과 서열번호 14; 서열번호 15과 서열번호 16 및 서열번호 17과 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터 또는 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제19항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제19항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 인간혈소판항원 유전자형은 HPA-1a, HPA-1b, HPA-1a/b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-2a/b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-3a/b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-4a/b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-5a/b, HPA-15a, HPA-15b, 및 HPA-15a/b로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 검체 시료는 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.
제15항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 HPA-1a: 62.0 ~ 66.0℃, HPA-1b: 50.0 ~ 54.0℃, HPA-1a/b: 50.0 ~ 54.0℃ 및 62.0 ~ 66.0℃, HPA-2a: 67.5 ~ 71.5℃, HPA-2b: 59.0 ~ 63.0℃, HPA-2a/b: 59.0 ~ 63.0℃ 및 67.5 ~ 71.5℃, HPA-3a: 66.0 ~ 70.0℃, HPA-3b: 49.5 ~ 53.5℃, HPA-3a/b: 49.5 ~ 53.5℃ 및 66.0 ~ 70.0℃, HPA-4a: 57.0 ~ 61.0℃, HPA-4b: 45.0 ~ 49.0℃, HPA-4a/b: 45.0 ~ 49.0℃ 및 57.0 ~ 61.0℃, HPA-5a: 64.0 ~ 68.0℃, HPA-5b: 48.0 ~ 52.0℃, HPA-5a/b: 48.0 ~ 52.0℃ 및 64.0 ~ 68.0℃, HPA-15a: 64.0 ~ 68.0℃, HPA-15b: 47.0 ~ 51.0℃, 또는 HPA-15a/b: 47.0 ~ 51.0 ℃ 및 64.0 ~ 68.0℃의 인간혈소판항원 유전자형 융해온도에 따라 인간혈소판항원 유전자형을 판별하는 것을 특징으로 하는 인간혈소판항원 유전자형 판별방법.