KR101720483B1 - 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산(pna) 프로브 세트 및 이를 이용한 뱀장어 종 판별 방법 - Google Patents

뱀장어 종 판별용 펩티드핵산(pna) 프로브 세트 및 이를 이용한 뱀장어 종 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산(PNA) 프로브 세트 및 이를 이용한 뱀장어 종 판별 방법에 대한 것으로, 더욱 구체적으로는 서열번호 3 내지 서열번호 9로 이루어진 염기서열 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열 각각을 포함하여 이루어진 하나 이상의 펩티드핵산을 PCR로 증폭된 뱀장어 mitochondria cytochrome c oxidase subunit Ⅰ(COⅠ)유전자 지역 샘플과 혼성화(hybridization)시키고, 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻으며, 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 것이 특징이다. 이러한 본 발명은 DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산을 이용하여 뱀장어 종마다 서로 다른 융해온도를 나타내게 함으로서, 뱀장어 종을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.

Description

뱀장어 종 판별용 펩티드핵산(PNA) 프로브 세트 및 이를 이용한 뱀장어 종 판별 방법{Peptide nucleic acids set for identifying Anguilliformes species and identifying method of Anguilliformes species using the same}
본 발명은 뱀장어의 종을 판별하기 위한 펩티드핵산(Peptide nucleic acids : PNA) 프로브 세트, 키트 및 이를 이용한 뱀장어 종 판별 방법에 대한 것으로, 더욱 구체적으로는 DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산를 이용하여 뱀장어 종마다 서로 다른 융해온도를 나타내게 함으로서, 뱀장어 종을 간단, 신속, 정확하게 판별하기 위한 것이다.
펩티드핵산(PNA)은 인공핵산(artificial nucleotide)으로 DNA 또는 RNA와 상보적 결합력이 탁월하며, 물리화학적으로 매우 안정한 차세대 바이오 소재이다. 자연계 핵산의 골격구조가 폴리아미드(polyamide)로 대체된 펩티드핵산은 상보적인 DNA나 RNA에 결합하는 능력이 탁월하다. 이는 펩티드핵산의 화학구조가 자연계 핵산과는 달리 전기적 중성이기 때문에, 상보적인 핵산과 결합할 때 전기적 반발력이 줄어들기 때문으로 알려져 있다. 또한 이때, 상보적인 핵산과의 결합반응이 매우 빠르게 일어난다. 염기 개수 및 서열에 따라 정도의 차이는 있지만, 펩티드핵산-DNA 결합의 경우 DNA-DNA 결합보다 100~5,000배 정도 결합 반응 시간이 빠른 것으로 알려져 있다.
전기적으로 중성인 펩티드핵산의 특성은 펩티드핵산 올리고머를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism)의 검출을 가능하게 한다. 즉, 상보적인 염기가 서로 맞지 않는 경우의 Tm 값은 상호 완벽하게 맞는 펩티드핵산-DNA의 Tm 값보다 크게 낮기 때문에, 온도를 높여 서로 구분할 수가 있다. 이는 다른 인공핵산에서는 할 수 없는 펩티드핵산의 독보적인 특징이라고 볼 수 있다. 더불어, 펩티드핵산 올리고머는 화학적, 물리학적 및 생물학적 안정성이 탁월하다. 이는 골격구조가 폴리아미드 결합으로 이루어져 중성이기 때문에 다른 화학물질과 쉽게 반응이 일어나지 않으며, 또한, 골격구조의 변형으로 핵산분해효소나 단백질 분해효소에 의해 인지되지 않기 때문에 가능하다. 이러한 탁월한 안정성은 생물세포 안에서 효과를 오랫동안 지속시킬 수 있고, 제품의 유효기간을 대폭 연장할 수 있는 장점을 가져오게 된다.
뱀장어는 뱀장어목 뱀장어과에 속하는 민물고기로 바다에서 하천으로 이동하는 회유성 어종으로 다양한 서식환경과 염분농도에 적응하는 능력이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 동북아시아 문화권에서 선호도가 높은 강장식품이며 민물장어(Anguilla japonicus)가 특히 고가로 거래되고 있다.
국내로 수입이나 이식을 통해 양식·유통되는 뱀장어 품종은 민물장어(Anguilla japonicus) 뿐만 아니라 유럽뱀장어(A. angiulla ), 아메리카뱀장어(A. rostrata), 필리핀뱀장어(A. bicolor) 등이 여러 품종이 있으며 성어일 때는 외형적으로 구별이 가능하나 실뱀장어 시기에는 학술적으로는 전장, 등지느러미 기점길이, 척추골수의 수 꼬리 피부 착색 등을 통해 형태학적으로 종간 구별이 가능하다지만 백자단계와 흑자단계 등에 따라 구별하기는 쉽지 않아 뱀장어의 원산지 또는 품종을 간단하고 용이하게 판별할 수 있는 기술이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산을 이용한 유전자 분석으로 뱀장어의 종 판별용 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
(선행기술문헌) 대한민국 등록특허 제10-1395344호, 홍어 종 판별용 펩티드핵산 세트 및 이를 이용한 홍어 종 판별 방법, 등록일자 2014년 05월 08일
본 발명의 주된 목적은 뱀장어 종을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있는 펩티드핵산(PNA) 프로브 세트 및 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 시료에 포함된 뱀장어 종을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하나 이상의 펩티드핵산(PNA)을 포함하고, 상기 펩티드핵산은 서열번호 3 내지 서열번호 9로 이루어진 염기서열 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열 각각을 포함하여 이루어진 것이 특징인 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 세트를 제공한다.
여기서, 상기 펩티드핵산은 양말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 가지는 것이 바람직하다.
그리고, 상기 펩티드핵산 프로브 세트에서 판별할 수 있는 뱀장어는 본 발명의 펩티드핵산 프로브로 판별할 수 있는 뱀장어는 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 민물장어(Anguilla japonica), 유럽뱀장어(Anguilla anguilla), 필리핀뱀장어(Anguilla bicolor), 아메리카뱀장어(Anguilla rostrata), 아프리카뱀장어(Anguilla mossambica), 무태장어(Anguilla marmorata), 또는 인도뱀장어(Anguilla pacifica)일 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 뱀장어 DNA 샘플을 프라이머와 표적핵산을 혼합시켜 유전자를 증폭(PCR)시키는 단계; 상기 증폭된 유전자를 제1항에 따른 펩티드핵산 프로브 세트의 펩티드핵산과 혼성화(hybridization)시키는 단계; 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 변화시키면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 단계;를 포함하는 펩티드핵산을 이용한 뱀장어 종 판별 방법을 제공한다.
여기서, 상기 뱀장어 DNA 샘플은 뱀장어 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 CO1(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ) 유전자 부위을 포함하는 것이 바람직하다.
그리고, 상기 온도별 융해곡선을 얻는 단계는, 상기 얻은 온도별 융해곡선으로부터 온도별 융해피크곡선을 얻는 단계를 포함하고, 상기 뱀장어 종을 판별하는 단계는, 상기 얻은 융해피크곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 것이 가능하다.
또한, 상기 뱀장어 종을 판별하는 것은, 상기 융해온도를 기 알고 있는 뱀장어 종별 융해온도와 비교하여 뱀장어 종을 판별하는 것일 수 있다.
이와 함께, 본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기한 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로하는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 키트이다.
여기서, 상기 펩티드핵산 프로브 세트는 하나 이상의 펩티드핵산 프로브을 포함하는 1군 튜브와 2군 튜브를 포함하고, 상기 1군 튜브에 포함된 펩티드핵산 프로브가 가지는 하나 이상의 리포터 종류는 상기 2군 튜브에 포함된 펩티드핵산 프로브가 가지는 하나 이상의 리포터 종류와 동일한 것이 가능하다.
또한, 상기 1군 튜브는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 각각 포함하는 펩티드핵산을 포함하고, 상기 2군 튜브는 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열을 각각 포함하는 펩티드핵산을 포함하는 것이 바람직하다.
상기와 같은 본 발명은, DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산을 이용하여 뱀장어 종마다 서로 다른 융해온도(Tm)를 나타내게 함으로서, 뱀장어 종을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브 세트는 민물장어(Anguilla japonica), 유럽뱀장어(Anguilla anguilla), 필리핀뱀장어(Anguilla bicolor), 아메리카뱀장어(Anguilla rostrata), 아프리카뱀장어(Anguilla mossambica), 무태장어(Anguilla marmorata), 또는 인도뱀장어(Anguilla pacifica)을 포함한 뱀장어 종을 판별하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 뱀장어 mitochondria COI 유전자 상의 염기변이 부분에 따른 펩티드핵산 프로브 위치도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 8개의 뱀장어 검체 시료에 대한 mitochondria 16S rRNA 유전자 증폭(PCR) 결과를 나타낸 사진이다.
도 3는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 뱀장어 유전자 염기변이에 따른 U-TOP™ 방법을 이용한 융해곡선 분석 조건을 설명하기 위한 그래프이다.
도 4는 본 발명 바람직한 일 실시예에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 9 각각의 펩티드핵산 프로브를 8개의 뱀장어 검체 시료에 대하여 적용하여 얻은 U-TOP™ 융해곡선 그래프이다.
도 5는 본 발명 바람직한 일 실시예에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 9 각각의 펩티드핵산 프로브를 8개의 뱀장어 검체 시료에 대하여 적용하여 얻은 온도별 융해곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 이와 같은 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 이 용어들은 하나의 구성요소들을 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략 할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 '표적핵산'은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 '염기변이'는 표적핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 펩티드핵산 프로브는 표적핵산의 SNP 또는 표적핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산(PNA) 프로브 세트는, 하나 이상의 펩티드핵산을 포함하고, 상기 펩티드핵산은 서열번호 3 내지 서열번호 9으로 이루어진 염기서열 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열 각각을 포함하여 이루어진 것이 특징이다.
즉, 상기 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 프로브 세트는 1개 내지 7개의 펩티드핵산을 포함할 수 있고, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 가지는 펩티드핵산, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 펩티드핵산, 서열번호 5의 염기서열을 가지는 펩티드핵산, 서열번호 6의 염기서열을 가지는 펩티드핵산, 서열번호 7의 염기서열을 가지는 펩티드핵산, 서열번호 8의 염기서열을 가지는 펩티드핵산, 및/또는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 펩티드핵산를 이용하여, 뱀장어의 종을 판별하기 위한 것이다.
일반적으로, 펩티드핵산은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. 펩티드핵산는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. 펩티드핵산은 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 펩티드핵산/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, 펩티드핵산/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, 펩티드핵산은 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다.
펩티드핵산은 화학적으로 안정할 뿐만 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. 또한, 펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로서, 기본 골격이 폴리아미드로 구성되어 있다. 펩티드핵산은 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)가 매우 우수하고, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
또한, DNA-DNA 결합력 보다 펩티드핵산-DNA 결합력이 매우 우수하여, 펩티드핵산은 1개의 뉴클레오티드 miss match에도 융해온도(Tm)가 10~15℃ 가량 차이가 난다. 본 발명은 바로 이러한 결합력의 차이를 이용하여 단일염기 다형성(SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 감지할 수 있게 된다. 또한, 펩티드핵산은 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값이 변화를 나타내기 때문에, 본 발명은 이를 이용하여 뱀장어의 종을 판별하고자 한다. 또한, 펩티드핵산 프로브는 TaqMan 프로브의 하이드롤리시스법(hydrolysis method)와는 다른 혼성화법(hybridization method)를 이용하여 분석할 수 있으며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 molecular beacon probe, scorpion probe가 있다.
이를 위하여, 상기 펩티드핵산은 양말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 가지는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 양 말단에는 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 표적핵산과 혼성화 된 후 형광 신호를 발생시킬 수 있며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도(Tm)에서 표적핵산으로부터 빠르게 융해되어 형광신호를 소광시킨다. 본 발명은 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여, 표적핵산의 염기변이 유무를 검출할 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 표적핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명자들은 다양한 종류의 뱀장어 유전자들을 비교 분석하여, 서열번호 3 내지 서열번호 9으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열 각각을 포함하는 펩티드핵산 프로브를 제작하였고, 이러한 펩티드핵산를 이용하여 뱀장어 DNA 샘플로부터 융해곡선을 얻었으며, 상기 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인한 결과, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 뱀장어 종별로 서로 다른 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 본 발명은 DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산를 이용하여 뱀장어 종마다 서로 다른 융해온도(Tm)를 나타내게 함으로서, 뱀장어 종을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있는 것이다.
상기 본 발명에 따른 펩티드핵산 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 뱀장어 종의 SNP를 포함하는 9~15 mer 길이로 제작할 수 있다. 펩티드핵산 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 probe를 design 할 수도 있고, 같은 길이의 펩티드핵산 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm 값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 펩티드핵산은 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 감지할 수 있다. 기존의 High Resolution Melt(HRM) method에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 프로브 염기서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.
본 발명의 펩티드핵산을 이용한 뱀장어 종 판별 키트는 하기의 방법에 의해 분류되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 뱀장어 DNA 샘플을 프라이머와 표적핵산을 혼합시켜 유전자를 증폭(PCR)시키는 단계;
2) 상기 증폭된 유전자를 뱀장어 종 판별 펩티드핵산 프로브 세트의 펩티드핵산과 혼성화(hybridization)시키는 단계;
3)상기 혼성화시킨 산물의 온도를 변화시키면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계;
4)상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 뱀장어 DNA 샘플은 뱀장어 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 COⅠ(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ) 유전자 부위을 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로 mtDNA는 nuclear DNA(nDNA)에 비해 진화속도가 빠르고, 하나의 세포에 다수의 mtDNA를 갖고 있어서 특정 염기서열의 복제수가 낮은 핵 내의 DNA 보다 종 특이적 염기서열 분석에 더욱 효과적이다. 또한, 미토콘드리아는 모계유전으로 유전자 재조합이 일어나지 않아 종내(intraspecific) 및 종간(interspecific)의 점진적인 변화를 가지고 있으며, 분류군의 계통 유연관계를 밝히는 집단 유전적 다양성 분석에 유용하다. 특히, COⅠ유전자는 DNA 바코드로서 종 판별 마커로 유용하다. 상기 COⅠ 유전자의 전체 길이는 약 1,500bp이지만, 종 판별 분석에는 한 번의 분석으로 염기서열을 알 수 있어서, 충분한 종 식별 해상력을 갖고 있는 약 600bp만을 이용하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 펩티드핵산에 의해 종을 판별할 수 있는 뱀장어의 종류는 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 민물장어(Anguilla japonica), 유럽뱀장어(Anguilla anguilla), 필리핀뱀장어(Anguilla bicolor), 아메리카뱀장어(Anguilla rostrata), 아프리카뱀장어(Anguilla mossambica), 무태장어(Anguilla marmorata) 및 인도뱀장어(Anguilla pacifica)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다. 상기 뱀장어 종은 표시된 원산지에 국한되지 않고, 상기한 각 뱀장어와 동일하거나 유사한 유전자 서열을 갖는 모든 종이나 개체를 포함하는 개념이다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 상기 증폭된 뱀장어 유전자와 펩티드핵산과 혼성화시키는 단계는 U-TOP™ 방법을 이용하여 기존의 PCR 조건을 그대로 사용 가능하며 정확한 검출과 저렴한 비용으로 이용 가능하며, PNA U-TOP™는 Sanger sequencing 결과와 완벽하게 일치하는 결과를 보여 주어 1개의 염기서열 변이뿐만 아니라 염기의 치환, 결실 또는 삽입의 변화도 정확하게 구분할 수 있다는 장점이 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 상기 온도별 융해곡선을 얻는 단계는 뱀장어 DNA 샘플의 융해온도(Tm)를 얻기 위한 것이다. 이를 위하여, 단계 2)에서 혼성화시킨 산물의 온도를 높이면서 형광의 세기를 측정하여, 온도에 따른 형광세기 변화를 온도별 융해곡선으로 얻을 수 있다. 즉, Hybridization methode 분석 방법으로서 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용할 수 있고, 상기 FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 것이다. 예를 들어, 일반적인 real-time PCR 장치를 이용하여, 1℃ 증가시킬 때 마다 형광의 세기를 측정함으로서 Tm값을 얻을 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 뱀장어 종을 판별하는 단계는 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 것이다. 예를 들어, 상기 얻은 융해곡선의 융해온도를 기 알고 있는 뱀장어 종별 융해온도와 비교하여 뱀장어 종을 판별할 수 있다. 뱀장어 종마다 본 발명에 따른 펩티드핵산을 적용한 융해곡선은 서로 다른 융해온도(Tm)를 가지고 있고, 이러한 차이를 이용하여 뱀장어 종 판별이 가능하다.
한편, 본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기한 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 키트이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 유전자 증폭 반응(PCR)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함하는 것도 가능하다.
이러한 키트를 이용하면, 펩티드핵산 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 뱀장어의 종 판별이 가능하다.
여기서, 본 발명의 다른 특징은 상기 펩티드핵산 프로브 세트가 하나 이상의 펩티드핵산을 포함하는 1군 튜브와 2군 튜브를 포함하고, 상기 1군 튜브에 포함된 펩티드핵산이 가지는 하나 이상의 리포터(형광물질) 종류는 상기 2군튜브에 포함된 펩티드핵산이 가지는 하나 이상의 리포터 종류와 동일한 것이 가능하다. 즉, 상기 1군 튜브에 포함된 펩티드핵산은 서로 다른 리포터를 가지되, 상기 2군 튜브에 포함된 펩티드핵산과 동일한 종류의 리포터를 갖더라도, 상기 1군 튜브와 2군 튜브는 서로 구분되어 있는바, 사용하는 리포터 갯수를 최소할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서 상기 1군 튜브는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 각각 포함하는 펩티드핵산을 포함하고, 상기 2군 튜브는 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열을 각각 포함하는 펩티드핵산을 포함하는 것이 바람직하다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일실시예를 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
< 실시예 1> 뱀장어 종 판별용 프로브의 제조
본 실시예에서는, 다양한 8개의 종의 뱀장어 검체 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 PCR을 수행하기 위해 mitochondria COⅠ 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머(SSRaCDF01 및 SSRaCDR02)를 제조하였다.
SSRaCDF01: 5'-TCAGCCATCTTACCTGTGGC-3' (서열번호 1)
SSRaCDR02: 5'-GGGTGTCCGAAGAATCAGAA-3' (서열번호 2)
뱀장어 종 유전자들의 염기서열을 분석하고 비교를 통해 유의성을 보이는 SNP를 찾고 해당위치에 펩티드핵산 프로브의 염기서열을 결정하였고, 하기 표 1에 나타내었다.
구분 서열번호 명명 서열(5'→3')

1군		 서열번호 3 SNK-jap(3) Dabcyl-CGTATATCCTCCTCTAGC-O-K-(FAM)
서열번호 4 SNK-ang(2) Dabcyl-ACCCTATATCTCGTATTTG-O-K-(HEX)
서열번호 5 SNK-bic Dabcyl-CATGCCTTCGTAATGA-O-K-(Texas Rad)
서열번호 6 SNK-ros Dabcyl-CCTGTTCGTATGAG-O-K-(Cy5)

2군		 서열번호 7 SNK-mos(2) Dabcyl-GAGATGATCAAATTTA-O-K-(FAM)
서열번호 8 SNK-mar(2) Dabcyl-ATTTTCTCGCTTCACCTT-O-K-(HEX)
서열번호 9 SNK-pac Dabcyl-TACAATTATCAACATGAA-네O-K-(Texas Rad)
* 상기 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.
상기 펩티드핵산 프로브는 뱀장어 판별을 위하여 직접 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 펩티드핵산 프로브(FAM-labeled Dabcyl, Panagene, KOREA)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.
펩티드핵산 프로브의 조합은 SNK-jap(3), SNK-ang(2), SNK-bic 및 SNK-ros
은 1군으로 하였고, SNK-mos(2), SNK-mar(2) 및 SNK-pac은 2군으로 조합하였다. 각각의 조합에는 같은 형광이 포함되지 않도록 제작하였다.
염기의 변이 부분은 보통 표적핵산과 5℃이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 펩티드핵산 프로브 결합 부위 가운데에 위치하도록 디자인하지만, 융해온도(Tm)의 최적화를 위해 표적핵산과 펩티드핵산 프로브와 결합하는 염기서열의 중앙 부분에 mitochondria COⅠ유전자 염기서열과 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다.
또한, 뱀장어 종판별 유전자의 특이 SNP 위치 및 펩티드핵산 프로브 위치를 나타냈었으며, 각 염기 번호는 뱀장어 종 판별을 할 수 있는 mitochondria COⅠ 유전자의 PCR 결과물의 사이즈를 기준으로 작성하였다. 마지막으로 펩티드핵산 프로브가 Perfect match를 나타내도록 유도하여 제작하였다(그림 1).
< 실시예 2> 뱀장어 종 구별을 위한 대표서열의 유전자 증폭( PCR )
U-TOP™ 방법을 실행하기 위해 목적 유전자 증폭 여부를 아가로스 젤을 이용해 전기영동하여 목표 DNA의 크기를 통하여 확인하였다. 유전자 증폭에 사용할 8개의 종의 뱀장어 검체 시료의 경우 일반적인 DNA 추출 kit를 이용해 DNA 시료를 얻어 사용했다.
PCR은 2720 thermal cycler (Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다; qPCR PreMix (2X qPCR PreMixer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10 ㎕, 10 pmol forward primer 0.5 ㎕, 10 pmol reverse primer 0.5 ㎕ (상기 실시예 1에서 제조된 프라이머), 뱀장어 DNA 시료(10~50ng) 3 ㎕, 20X SSB 버퍼 1 ㎕ (20X SSB FMCA Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 증류수 4.5 ㎕를 첨가하여 총 볼륨이 20 ㎕가 되도록 한 다음 PCR을 실시하였다. PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 40초, 72℃에서 60초 동안 반응시켰으며, 이를 40 cycles 반복하고 72℃에서 10분간 시간을 준다.
PCR이 끝나면 반응물 2 ㎕를 따서 2% 아가로스 젤을 전기영동을 진행하여 DNA 크기를 확인 하였다(그림 2).
< 실시예 3> 뱀장어 종 판별을 위한 유전자 염기변이에 따른 U-TOP™ 방법을 이용한 융해곡선 분석
펩티드핵산 프로브를 이용한 융해곡선 분석을 위한 PCR은 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 모든 실험 조건은 표적핵산을 생성하기 위해 Real-Time PCR을 이용하였다. 두 개의 튜브에 나눠서 반응을 진행하며 들어가는 프로브가 차이가 난다. Real-Time PCR의 조건은 다음과 같다; 2X qPCR PreMix (2X qPCR PreMix, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10 ㎕, 1 pmol forward primer 0.5 ㎕, 및 10 pmol reverse primer 0.5 ㎕, 뱀장어 DNA 시료(10~50 ng) 3 ㎕, 20 pmol 프로브 0.5 ㎕씩 SNK-jap(3), SNK-ang(2), SNK-ros, SNK-bic 프로브 (상기 실시예 1에서 제조된 펩티드핵산 프로브) 4개를 2 ㎕씩 넣는다. 20X SSB 버퍼 1 ㎕(20X SSB FMCA Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국), 증류수 3 ㎕를 첨가하여 총 볼륨이 20 ㎕가 되도록 만들고, 다른 튜브는 2X qPCR PreMix (2X qPCR PreMix, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, 1pmol forward primer 0.5 ㎕, 및 10pmol reverse primer 0.5 ㎕, DNA 시료(10~50ng) 3 ㎕, 20 pmol 프로브 0.5 ㎕씩 SNK-mos(2), SNK-mar(2), SNK-pac 프로브(상기 실시예 1에서 제조된 펩티드핵산 프로브) 3개를 1.5 ㎕ 넣는다, 20X SSB 버퍼 1 ㎕ (20X SSB FMCA Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국), 증류수 3.5 ㎕를 첨가하여 만든다. 두 개 튜브 모두 Real-Time PCR을 실시하며 반응 조건은 동일하다. Real-Time PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 40초, 72℃에서 1분 동안 반응시켰으며, 이를 40 cycles 반복하였다. 그 이후 펩티드핵산 프로브와의 혼성화 및 융해곡선 분석을 위하여 95℃에서 5분, 75℃에서 1분, 55℃에서 1분, 45℃에서 1분의 시간을 준 뒤 20℃에서 85℃까지 1℃씩 상승시키며 형광을 측정하여 융해곡선 분석을 수행한다. 각 단계 사이마다 10초간 정지 상태를 유지하였다(그림 3). 7개의 펩티드핵산 프로브는 각각 4개, 3개씩 조합을 이루어 하나의 뱀장어 샘플 분석시 2개의 튜브에 실시하고 나온 결과를 합하여 측정하였다.
첫 번째 튜브에서 4개의 프로브를 혼합하여 실험을 진행했으며, 두 번째 튜브에서 3개의 프로브를 혼합하여 실험을 진행하였다. 첫 번째 튜브에 사용된 프로브는 combination 1로 표기 하고, 두 번째 튜브에 사용된 프로브는 combination 2로 표기했다. 결과 창은 같은 시료에 대해 두 개의 그림으로 나타내며 각각 combination1과 2이다(그림 4). 시료별로 융해곡선 분석을 진행하였으며(그림 5), 그림 5의 시료별 융해곡선 분석 결과를 토대로 얻어진 융해온도(Melting Temperature = Tm)는 해당하는 프로브와 완벽하게 붙으면 perfect match이며 PM이 mismatch이며 MM이라 표기했다. 따라서 프로브 별 얻어진 융해온도를 각각 표기하여 8개의 종의 뱀장어 검체 시료에 대한 종 판별 분석을 진행하였다(표 2).
Combination 1 Combination 2

Sample
number		 SNK-jap(3) SNK-ang(2) SNK-bic SNK-ros SNK-mos(2) SNK-mar(2) SNK-pac
융해온도
(℃)		 융해온도
(℃)		 융해온도
(℃)		 융해온도
(℃)		 융해온도
(℃)		 융해온도
(℃)		 융해온도
(℃)
1 66 PM 49 MM 49 MM 0 MM 0 MM 0 MM 0 MM
2 49 MM 59 PM 47 MM 0 MM 49 MM 50 MM 50 MM
3 0 MM 60 PM 49 MM 58 PM 47 MM 49 MM 48 MM
4 53 MM 48 MM 62 PM 0 MM 48 MM 48 MM 47 MM
5 55 MM 48 MM 62 PM 0 MM 50 MM 50 MM 62 PM
6 48 MM 0 MM 62 PM 0 MM 58 PM 49 MM 0 MM
7 52 MM 50 MM 48 MM 0 MM 48 MM 57 PM 48 MM
8 0 MM 60 PM 48 MM 52 PM_2 47 MM 48 MM 48 MM
< 실시예 4> 염기변이와 융해온도에 따른 뱀장어 종 판별 방법
본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브를 이용하여 미지의 뱀장어 DNA 시료에 대하여 종을 판별하고자 하는 경우, 아래와 같은 융해 온도별 스코어 표를 미리 만들어 놓고, 이를 활용하는 것이 가능하다(표 3).
구체적으로, 상기 실시예 3에서와 같이 펩티드핵산 U-TOP™ 방법을 이용하여 얻은 융해곡선 분석을 실시하고 얻은 Tm값을 아래 표 3에 나타난 바와 같이 perfect match 온도에 맞추어 바코드화하였다(표 4). 즉, perfect match(PM) 온도의 ±2℃ 범위를 만들고, 미지의 뱀장어 DNA 샘플에 대한 Tm값이 상기 범위 안에 들면 1 또는 2의 값을 주고 그렇지 않으면 0의 값을 주어서, 각 종마다 고유의 값을 주어 판별이 가능하도록 하였다.
Probe name PM(℃) Range(℃) Score
SNK-jap(3) 66 64∼68 1
SNK-ang(2) 60 58∼62 1
SNK-bic 62 60∼64 1
SNK-ros 58 56∼60 1
52 50∼54 2
SNK-mos(2) 58 56∼60 1
SNK-mar(2) 57 55∼59 1
SNK-pac 62 60∼64 1
Species SNK-jap SNK-ang SNK-bic SNK-ros
 SNK-mos SNK-mar SNK-pac Barcorde
A. japonica 1 0 0 0 0 0 0 0 1000000
A. anguilla 0 1 0 0 0 0 0 0 100000
A. rostrata 0 1 0 1 0 0 0 0 101000
A. bicolor 0 0 1 0 0 0 0 0 10000
A. pacifica 0 0 1 0 0 0 0 1 10001
A. mossambica 0 0 1 0 0 1 0 0 10100
A. marmorata 0 0 0 0 0 0 1 0 10
A. rostrata subtype 0 1 0 0 2 0 0 0 102000
최종적으로 각각 미지의 8개의 뱀장어 시료별 융해곡선 온도는 종판별 분석을 위하여 온도가 아닌 바코드화로 전환하여 시료별로 뱀장어의 종류를 확인할 수 있었다(표 5).
Sample number SNK-jap SNK-ang SNK-bic SNK-ros
 SNK-mos SNK-mar SNK-pac Distinction
1 1 0 0 0 0 0 0 0 A. japonica
2 0 1 0 0 0 0 0 0 A. anguilla
3 0 1 0 1 0 0 0 0 A. rostrata
4 0 0 1 0 0 0 0 0 A. bicolor
5 0 0 1 0 0 0 0 1 A. pacifica
6 0 0 1 0 0 1 0 0 A. mossambica
7 0 0 0 0 0 0 1 0 A. marmorata
8 0 1 0 0 2 0 0 0 A. rostrata subtype
<110> National Fishery Products Quality Management Service <120> Peptide nucleic acids set for identifying Anguilliformes species and identifying method of Anguilliformes species using the same <130> P150388PP <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSRaCDF01 primer <400> 1 tcagccatct tacctgtggc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSRaCDR02 primer <400> 2 gggtgtccga agaatcagaa 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-jap(3) probe <400> 3 cgtatatcct cctctagc 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-ang(2) probe <400> 4 accctatatc tcgtatttg 19 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-bic probe <400> 5 catgccttcg taatga 16 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-ros probe <400> 6 cctgttcgta tgag 14 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-mos(2) probe <400> 7 gagatgatca aattta 16 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-mar(2) probe <400> 8 attttctcgc ttcacctt 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNK-pac probe <400> 9 tacaattatc aacatgaa 18

Claims (10)

  1. 서열번호 3 내지 서열번호 9를 포함하여 이루어진 복수의 펩티드핵산(PNA)을 포함하고,
    상기 복수의 펩티드핵산은 극동뱀장어(Anguilla japonica), 유럽뱀장어(Anguilla anguilla), 필리핀뱀장어(Anguilla bicolor), 아메리카뱀장어(Anguilla rostrata), 아프리카뱀장어(Anguilla mossambica), 무태장어(Anguilla marmorata) 및 인도뱀장어(Anguilla pacifica)로 구성된 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 프로브 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드핵산은 양말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 가지는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 프로브 세트.
  3. 삭제
  4. 뱀장어 DNA 샘플을 프라이머와 표적핵산을 혼합시켜 유전자를 증폭(PCR)시키는 단계;
    상기 증폭된 유전자를 제1항에 따른 펩티드핵산 프로브 세트의 펩티드핵산과 혼성화(hybridization)시키는 단계;
    상기 혼성화시킨 산물의 온도를 변화시키면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
    상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 단계;를 포함하는 펩티드핵산을 이용한 뱀장어 종 판별 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 증폭시키는 뱀장어 유전자는 뱀장어 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 CO1(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ) 유전자 부위을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드핵산을 이용한 뱀장어 종 판별 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 온도별 융해곡선을 얻는 단계는, 상기 얻은 온도별 융해곡선으로부터 온도별 융해피크곡선을 얻는 단계를 포함하고,
    상기 뱀장어 종을 판별하는 단계는, 상기 얻은 융해피크곡선의 융해온도로부터 뱀장어 종을 판별하는 것을 특징으로 하는 펩티드핵산을 이용한 뱀장어 종 판별 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 뱀장어 종을 판별하는 것은, 상기 융해온도를 기 알고 있는 뱀장어 종별 융해온도와 비교하여 뱀장어 종을 판별하는 것을 특징으로 하는 펩티드핵산을 이용한 뱀장어 종 판별 방법.
  8. 제1항에 따른 펩티드핵산 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 펩티드핵산 세트는 하나 이상의 펩티드핵산을 포함하는 1군 튜브와 2군 튜브를 포함하고,
    상기 1군 튜브에 포함된 펩티드핵산이 가지는 하나 이상의 리포터 종류는 상기 2군 튜브에 포함된 펩티드핵산이 가지는 하나 이상의 리포터 종류와 동일한 것을 특징으로 하는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 1군 튜브는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 각각 포함하는 펩티드핵산을 포함하고,
    상기 2군 튜브는 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열을 각각 포함하는 펩티드핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107130032A (zh) * 2017-05-23 2017-09-05 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 基于多条dna条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法
KR20200013308A (ko) * 2018-07-30 2020-02-07 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법
CN110791575A (zh) * 2019-12-18 2020-02-14 集美大学 鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物和方法
KR20220078371A (ko) * 2020-12-03 2022-06-10 주식회사 바이오티엔에스 왕게 속(Paralithodes genus) 및 대게 속(Chionoecetes genus) 검출용 조성물
KR102656519B1 (ko) * 2024-02-07 2024-04-15 국립군산대학교 산학협력단 토종 뱀장어 식별용 lamp 프라이머 세트 및 이를 이용한 토종 뱀장어의 신속, 정확 식별방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100138208A (ko) * 2009-06-24 2010-12-31 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커
KR101395344B1 (ko) 2013-10-21 2014-05-16 대한민국 홍어 종 판별용 펩티드핵산 세트 및 이를 이용한 홍어 종 판별 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100138208A (ko) * 2009-06-24 2010-12-31 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커
KR101395344B1 (ko) 2013-10-21 2014-05-16 대한민국 홍어 종 판별용 펩티드핵산 세트 및 이를 이용한 홍어 종 판별 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BioChip J. 8(4), p310-316, 2014* *
PLOS ONE 6(11): E25715. *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107130032A (zh) * 2017-05-23 2017-09-05 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 基于多条dna条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法
CN107130032B (zh) * 2017-05-23 2020-08-07 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 基于多条dna条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法
KR20200013308A (ko) * 2018-07-30 2020-02-07 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법
KR102083306B1 (ko) 2018-07-30 2020-03-02 대한민국 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법
CN110791575A (zh) * 2019-12-18 2020-02-14 集美大学 鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物和方法
CN110791575B (zh) * 2019-12-18 2022-05-13 集美大学 鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物和方法
KR20220078371A (ko) * 2020-12-03 2022-06-10 주식회사 바이오티엔에스 왕게 속(Paralithodes genus) 및 대게 속(Chionoecetes genus) 검출용 조성물
KR102494434B1 (ko) 2020-12-03 2023-02-06 주식회사 바이오티엔에스 왕게 속(Paralithodes genus) 및 대게 속(Chionoecetes genus) 검출용 조성물
KR102656519B1 (ko) * 2024-02-07 2024-04-15 국립군산대학교 산학협력단 토종 뱀장어 식별용 lamp 프라이머 세트 및 이를 이용한 토종 뱀장어의 신속, 정확 식별방법

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