KR102025079B1 - 고병원성 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출방법 - Google Patents
고병원성 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물 및 이를 이용한 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 고병원성 VHSV(바이러스성출혈성패혈증 바이러스) 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물 및 이를 이용한 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.
국내 넙치 양식장에서 발생하는 상존 바이러스 질병인 VHS는 폐사율이 높은 고병원성 바이러스와 폐사율이 낮은 저병원성 바이러스가 혼재되어 있으나, VHS 확정 진단시 고병원성과 저병원성에 상관없이 일률적으로 방역조치가 이루어지고 있어 고병원성을 보일 때만 방역조치가 필요한 실정이다.
바이러스성출혈성패혈증 바이러스인, VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)는 RNA virus로서 family rhabdoviridae에 속하는 바이러스임. VHSV는 1980년대 중반까지 서유럽의 담수어에서만 발견되었는데 (Wolf, 1988) 이후 Pacific salmon에서 검출되었다가 (Winton et al., Am Fish Soc Fish Health News, 17: 2-3, 1989; Batts et al., Dis Aquat Org, 17: 61-71, 1993), 지금은 거의 전 세계에 걸쳐 다양한 어종에 감염하여 많은 피해를 주는 것으로 보고된다 (Meyers & Winton, Ann Rev Fish Dis, 5:3-24, 1995; Gagne et al., J Fish Dis 30: 213-223, 2007; Kent et al., J Aquat Anim Health, 10:211-219, 1998).
Rhabdovirus는 총알 모양의 구조를 지닌 바이러스로서 (-)sense single-stranded RNA를 게놈을 지니고 있으며 polymerase (L), glycoprotein (G), nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), 그리고 matrix protein (M) 등과 같은 단백질을 암호하고 있으며, 사람을 포함한 포유류, 어류, 곤충 그리고 식물 등에 감염하여 병을 유발한다.
이중 Genus Novirhabdovirus에 속하는 바이러스들인 IHNV(infectious hematopoietic necrosis virus), VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus) 등은 다른 속에 속하는 rhabdovirus들과 달리 non virion 단백질(NV)을 추가로 지니고 있으며, 어류에 감염하여 대량폐사를 유발하는 것으로 알려져 있다.
VHSV 감염에 의한 피해를 줄이기 위해서는 효과적인 백신이 필요한데, 아직까지 상용화 가능한 백신은 개발되어 있지 않은 상태이다. 따라서, VHSV에 대한 가장 좋은 대처 방안은 VHSV 확산을 방지하고, VHS 발생시 조기에 정확하게 진단하여 신속한 방역조치를 취하는 것이 유일한 방법이다.
우리나라 양식장에는 이미 VHSV가 유입되어 있으며, 대부분의 넙치 양식장에 상존하고 있다. 양식장에 상존하고 있는 VHSV에는 높은 폐사를 유발하는 고병원성 바이러스와 폐사를 유발하지 않거나 매우 낮은 폐사를 보이는 저병원성 바이러스가 존재한다. 양식장의 피해를 효율적으로 줄이기 위해서는 고병원성 VHSV에 대해서 적절한 방역조치를 취할 필요가 있다. 그러나 현재 VHSV 검출에 사용하는 PCR법, 그리고 OIE에서 제시하는 VHSV 표준검출방법인 세포배양법의 경우, 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV을 구별하여 진단할 수 없다.
따라서 효율적인 진단 및 방역조치가 이루어지기 위해서는 VHSV의 병원성을 결정하는 위험인자를 찾아내어 이를 바탕으로 고병원성 VHSV만을 진단하는 방법을 찾는 것이 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 고병원성 VHSV를 선별적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 저병원성을 나타내는 VHSV와 고병원성을 나타내는 VHSV에 대하여 전체 게놈 시퀀싱을 수행하여, 고병원성 바이러스에서만 특이적으로 P 유전자에서 변이가 존재하는 것을 확인하고, 이를 타겟팅할 경우 고병원성 VHSV를 효율적으로 검출할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고병원성 VHSV를 검출하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 고병원성 VHSV를 진단하기 위한 조성물을 이용한 고병원성 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 VHSV 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, VHSV 함유 샘플에서, VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 VHSV의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 양식장에 상존하는 VHSV가 양식어류의 높은 폐사를 유발하는 고병원성 바이러스인지 폐사를 나타내지 않는 저병원성 바이러스인지 효과적으로 판단하여, 고병원성 VHSV에 대해서 적절한 방역조치를 취하여, 양식사업의 피해를 줄일 수 있다.
도 1은 VHSV 바이러스가 속하는 Rhabdovirus의 게놈 구조 및 바이러스 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 20개 VHSV strains의 게놈에서 점돌연변이된 부위의 빈도를 나타낸 것이다.
도 3은 20개 VHSV strains의 게놈서열 전체를 기반으로한 계통유전학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 20개 VHSV strains의 단백질 N, M, G, NV 및 L의 아미노산 서열을 기반으로 한 계통수를 나타낸 것이다.
도 5는 20개 VHSV strains의 단백질 P의 아미노산 서열을 기반으로 한 계통수를 나타낸 것이다.
도 6은 20개 VHSV strains의 단백질 P의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 20개 VHSV strains의 단백질 P, G 및 L의 아미노산 서열 변이를 고변원성바이러스(붉은색) 및 저병원성 바이러스(하늘색) 별로 나타낸 것이다.
도 8은 HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 BF-2 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 FHM 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 제작한 재조합 VHSV를 도시한 것이다.
도 12는 14℃ 및 20℃에서 HINAE 세포에서 배양된 재조합 VHSV의 성장을 나타낸 것이다.
도 13은 저병원성 VHSV를 검출하는 PCR 프라이머 세트 VHSV-LV와 고병원성 VHSV를 검출하는 PCR primer set VHSV-HV를 사용하여 세포에 감염된 저병원성 VHSV strain #5와 고병원성 VHSV strain #19을 PCR로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 저병원성 VHSV를 검출하는 Real-time qPCR primer set VHSV-qLV와 고병원성 VHSV를 검출하는 Real-time qPCR primer set VHSV-qHV를 사용하여 세포에 감염된 저병원성 VHSV strain #5와 고병원성 VHSV strain #19을 Real-time qPCR로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 20개 VHSV strains의 게놈에서 점돌연변이된 부위의 빈도를 나타낸 것이다.
도 3은 20개 VHSV strains의 게놈서열 전체를 기반으로한 계통유전학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 20개 VHSV strains의 단백질 N, M, G, NV 및 L의 아미노산 서열을 기반으로 한 계통수를 나타낸 것이다.
도 5는 20개 VHSV strains의 단백질 P의 아미노산 서열을 기반으로 한 계통수를 나타낸 것이다.
도 6은 20개 VHSV strains의 단백질 P의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 20개 VHSV strains의 단백질 P, G 및 L의 아미노산 서열 변이를 고변원성바이러스(붉은색) 및 저병원성 바이러스(하늘색) 별로 나타낸 것이다.
도 8은 HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 BF-2 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 FHM 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 제작한 재조합 VHSV를 도시한 것이다.
도 12는 14℃ 및 20℃에서 HINAE 세포에서 배양된 재조합 VHSV의 성장을 나타낸 것이다.
도 13은 저병원성 VHSV를 검출하는 PCR 프라이머 세트 VHSV-LV와 고병원성 VHSV를 검출하는 PCR primer set VHSV-HV를 사용하여 세포에 감염된 저병원성 VHSV strain #5와 고병원성 VHSV strain #19을 PCR로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 저병원성 VHSV를 검출하는 Real-time qPCR primer set VHSV-qLV와 고병원성 VHSV를 검출하는 Real-time qPCR primer set VHSV-qHV를 사용하여 세포에 감염된 저병원성 VHSV strain #5와 고병원성 VHSV strain #19을 Real-time qPCR로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 우리나라 넙치 양식에서 높은 폐사율을 나타내는 원인 바이러스인 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV; Viral hemorrhagic septicemia virus)에 대하여, 고병원성을 나타내는 유전적 마커를 찾고자 하였으며, 수산과학원 방역과에서 보관중인 20종의 VHSV를 EPC 세포주에 접종하여, 20종 VHSV의 병원성 정도를 확인하였으며, 20종 VHSV에 대하여 전체 게놈 시퀀싱을 실시하고, 병원성과 유전적 변이의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, VHSV의 P 유전자의 변이가 고병원성 나타내는 데에 관련이 있다는 것을 확인하였다. VHSV의 N, M, G, NV, 및 L 유전자의 변이는 전반적으로 병원성과 연관성이 없음이 확인되었지만, 약하게라도 병원성과 연관성을 보이는 부위가 있는지 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 N, M, G, NV, 및 L 단백질 아미노산 서열을 비교분석하였으며, N, M 및 NV의 아미노산 서열 변이들은 병원성과 전혀 연관성이 없음이 확인되었고, G 및 L의 경우 특정 부위의 아미노산 잔기 변이와 병원성과 어느 정도 연관성이 있을 가능성이 있음이 확인되었다. 상기 변이들을 포함하는 재조합 VHSV를 제작하여 넙치유래 세포인 HINAE에 감염하여 세포독성을 확인한 결과, 단백질 P의 55번째 아미노산 서열의 변이만을 재조합 VHSV에서 높은 병원성을 나타내는 것 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 VHSV 검출용 조성물의 검체는 어류의 혈액, 어류의 조직, 양어장 수 및 해수로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질 P의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 단백질 G 및 단백질 L의 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 3에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브, 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV의 P 55번째 아미노산 잔기에 발생한 변이를 Real-time qPCR을 사용하여 선택적으로 검출하기 위하여 고병원성 VHSV P 55번째 proline 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qHV(서열번호 22 및 23)와 저병원성 VHSV 55번째 leucine 아미노산 잔기를 암호화 하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qLV(서열번호 20 및 21)를 제작하고, 고병원성 VHSV strain #19 혹은 저병원성 VHSV strain #5가 접종된 HINAE 세포의 RNA를 상기 프라이머를 이용하여 Real-time qPCR을 수행한 결과, 저병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qLV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR을 사용한 경우, 고병원성 VHSV strain #19의 P는 검출되지 않았으며 저병원성 VHSV strain #5 만 검출되었고, 고병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qHV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR의 경우, 저병원성 VHSV strain #5의 P는 검출되지 않았으며 고병원성 VHSV strain #19만 검출되는 것을 확인하였다.
본 발명에 "항체"는 항원과 특이적으로 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신으로 변이된 변이 단백질 P에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 변이 단백질 P의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol, 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 항체를 이용한 바이오마커의 검출방법으로는 방사성 면역분석, 면역조직화학 분석, 계내 (in situ) 혼성화 분석, 경쟁적-결합 분석, 웨스턴 블롯 (western blot) 분석, ELISA 분석, 및 유동 세포 측정 분석, 예를 들어 종양-연관 대식세포의 M2대 M1 표현형 결정을 위한 2색 FACS 분석을 포함한다 (Mantovani et al, (2002) TRENDS in Immunology 23:549-555).
본 발명에서 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991)"Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thyminesubstituted
polyamide" Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al, Nature 355(6360):5646(1992);Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine" J Mol Med 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library" Proc Natl Acad Sci USA 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, 상기 변이 단백질 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다. 본 발명에서 프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 변이 부위를 검출한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, qPCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
다른 관점에서 본 발명은 상기 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 VHSV 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 VHSV 함유 샘플에서, VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열의 검출은 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브, 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 제제를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: VHSV의 병원성 확인
우리나라 양식 넙치에서 분리하여, 수산과학원 방역과에서 보관중인 VHSV strain 20주를 대상으로 병원성 위험도를 확인하였다(도 1).
각 VHSV strain들을 EPC 세포주(ATCC® CRL2872TM)에 접종하여 3일간 배양 후 배양액을 수득하였다. 배양액을 원심분리 후 상등액을 취하여 바이러스를 수득하여 -80oC에 보관하였다. 수득된 20 strain의 VHSV 각각을 플라크 어세이법을 사용하여 titer를 결정하였다.
번호 | VHSV strain | 분리지역 |
1 | VHS2005 | 제주 |
2 | VHS2007 | 제주 |
3 | VHS2016-2 | 남태수산 |
4 | VHS2016-1 | 영림수산 |
5 | VHS2015-5 | 해광수산 |
6 | VHS2015-2 | 세현수산 |
7 | VHS2014-2 | 해룡수산 |
8 | VHS2014-5 | 대포수산 |
9 | VHS2014-4 | 유라수산 |
10 | VHS2013-1 | 대천수산2 |
11 | VHS2013-9 | 대경수산2 |
12 | VHS2013-4 | 동서수산 |
13 | VHS2013-3 | 제남수산 |
14 | VHS2013-2 | 대경수산1 |
15 | VHS2012-11 | 제이제이수산 |
16 | VHS2012-10 | 한동수산 |
17 | VHS2012-9 | 한라수산 |
18 | VHS2012-7 | 동양수산 |
19 | VHS2012-6 | 명진수산 |
20 | VHS2012-5 | 대천수산1 |
VHS 발병 경력이 없는 넙치 양식장에서 약 13~20g 넙치를 확보하여 병원성 실험에 사용하였다. 각 VHSV strain당 넙치 20마리를 사용하였다. 넙치의 복강에 바이러스 용액 0.1ml(1 x 104 TCID50 혹은 PFU VHSV)를 주사 후 11~13oC에서 20일간 배양하며 폐사율 분석하였다.
총 3-5회에 걸쳐 병원성 실험을 수행하였으며, 1회의 병원성 실험에서는 각 그룹당 10마리의 넙치를 사용하였으며, 나머지 4회 병원성 실험에서는 각 그룹 당 20마리의 넙치를 사용하였다. 그리고 처음 3회 실험의 경우 13 g ~ 16.6 g 의 넙치를 사용하였고, 마지막 2회의 실험에서는 16 g ~ 20 g 의 넙치를 사용하였다. 실험용 넙치 복강에 1 x 104 TCID50/fish 의 VHSV를 감염시킨 후 20일 동안의 누적 폐사율을 분석하였다. 총 3-5회의 병원성 실험결과 얻어진 20 VHSV strain들의 누적 폐사율 평균값은 표 2에 나타내었다.
번호 | 병원성 실험 회수 | 실험 개체수 | 평균 누적 폐사율 |
1 | 3 | 50 | 0 |
2 | 3 | 50 | 0 |
5 | 5 | 90 | 31.25 |
15 | 5 | 90 | 50 |
18 | 5 | 90 | 52.5 |
7 | 5 | 90 | 53.75 |
3 | 5 | 90 | 56.25 |
20 | 5 | 90 | 57.5 |
16 | 5 | 90 | 60 |
17 | 5 | 90 | 62.5 |
6 | 5 | 90 | 62.5 |
10 | 5 | 90 | 65 |
13 | 5 | 90 | 67.5 |
14 | 5 | 90 | 70 |
11 | 5 | 90 | 70 |
8 | 5 | 90 | 70 |
4 | 5 | 90 | 71.5 |
12 | 5 | 90 | 72.5 |
19 | 5 | 90 | 73.75 |
9 | 5 | 90 | 75 |
위 병원성 실험 결과를 바탕으로 병원성이 낮은 VHSV strain #5와 #20, 그리고 병원성이 높은 VHSV strain #8과 #19를 선정하여 바이러스 특성 분석을 수행하였다.
실시예 2: VHS 병원성과 유전자 변이의 상관관계 분석
실시예 1에서 사용한 20 VHSV strain들의 병원성이 VHSV의 게놈 염기서열 변화와 연관성이 있는지 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 전체 게놈 서열을 분석하였다. 20 VHSV strain들의 전체 게놈은 N(1,215 nt), P(669 nt), M(606 nt), G(1,524 nt), NV(369 nt) 및 L(5,955 nt)를 포함하는 단백질을 암호화하는 부위(coding region) 및 단백질을 암호화하지 않는 부위(non-coding region)인 NC1(166 nt), NC2(105 nt), NC3(117 nt), NC4(89 nt), NC5(74 nt), NC6(126 nt), NC7(153 nt) 등에 존재하는 변이를 관찰한 결과 부위별로 변이의 차이는 있었지만 전 부위에 걸쳐 2.41% ~ 11.76%의 변이가 관찰되었다 (도 2).
또한 20 VHSV strain들의 게놈서열로부터 각 VHSV strain들의 게놈에 암호화되어 있는 단백질들의 아미노산 서열을 확인하였다. 확인된 20 VHSV strain들의 게놈서열 및 아미노산 서열들을 바탕으로 계통수(phylogenetic tree)를 만들어 병원성과 게놈서열 변화와의 연관성을 분석하였다.
VHSV 게놈서열을 바탕으로 계통수를 그린 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 저병원성 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 7, 15, 18, 20)이 유전자 변이가 유사한, 하나의 그룹에 포함되었으며, 반면에 고병원성 VHSV strain들(4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)은 저병원성 VHSV strain들과는 다른 그룹에 포함되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 VHSV strain들의 병원성과 유전자 변이가 연관성 있다는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, VHSV genome이 암호화 하고 있는 유전자들인 N, P, M, G, NV, 및 L 들중 어느 유전자의 변이가 병원성과 연관성이 있는지 확인하기 위하여 이 유전자들이 암호화하고 있는 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 계통수를 그렸다. 그 결과 N, M, G, NV, 및 L의 아미노산 서열을 바탕으로 만든 계통수의 경우 고병원성 VHSV strain들과 저병원성 VHSV strain들이 서로 다른 그룹들로 분리되지 않고 섞여서 존재하는 반면, P의 아미노산 서열을 바탕으로 만든 계통수의 경우 고병원성 VHSV strain들과 저병원성 VHSV strain들이 서로 다른 그룹들에 분리되어 있음이 학인 되었다. 이상의 결과로부터 VHSV의 N, P, M, G, NV, 및 L 유전자들 중에 N, M, G, NV, 및 L 유전자의 변이는 병원성과 연관성이 없고 P 유전자의 변이는 병원성과 연관성이 있을 가능성이 있는 것을 알 수 있다.
실시예 3: VHSV의 병원성 관련 변이 확인
실시예 2의 결과를 통하여, VHSV의 P 단백질의 아미노산 변이가 병원성과 연관성이 있다는 것을 확인하였으며, VHSV P의 아미노산 서열 중 어느 부위의 변이가 병원성과 연관성이 있는 지를 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 P 단백질 아미노산 서열을 비교 분석하였다.
그 결과, VHSV P 아미노산 서열 중 55번째 잔기의 변이가 VHSV 병원성과 연관성을 보임이 확인되었다. 즉 고병원성을 보이는 모든 VHSV strain들(4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)이 55번째 아미노산 잔기에 leucine(L)을 지니는 반면, 저병원성을 보이는 모든 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 7, 15, 18, 20)은 55번째 아미노산 잔기에 proline(P)을 지니고 있는 것이 확인되었다. 이 결과로부터 VHSV의 병원성은 P 단백질의 55번째 아미노산 잔기의 변이에 의하여 결정될 가능성이 높음을 알 수 있었다.
Phylogenetic tree 분석 결과 N, M, G, NV, 및 L 유전자의 변이는 전반적으로 병원성과 연관성이 없음이 확인되었지만, 약하게라도 병원성과 연관성을 보이는 부위가 있는지 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 N, M, G, NV, 및 L 단백질 아미노산 서열을 비교분석하였다.
그 결과 N, M 및 NV의 아미노산 서열 변이들은 병원성과 전혀 연관성이 없음이 확인되었다. 반면에 G 및 L의 경우 특정 부위의 아미노산 잔기 변이와 병원성과 어느 정도 연관성이 있을 가능성이 있음이 확인되었다. G의 경우, 고병원성을 지니는 모든 고병원성 VHSV strain들((4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)은 71번째 아미노산 잔기로서 isoleucine(I)을 지니는 반면 대부분 저병원성 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 15, 18, 20)은 threonine(T)를 지니고 있음이 확인 되었다. 그리고 L의 경우 고병원성을 지니는 모든 고병원성 VHSV strain들(4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)은 1,079 번째 아미노산 잔기로서 arginine(R)을 지니는 반면 대부분 저병원성 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 15, 18, 20)은 glutamine(Q)를 지니고 있음이 확인 되었다.
위 결과들을 종합하면 VHSV 병원성을 결정하는 위험요소 결정 인자로서 가장 가능성 높은 것으로는 P 단백질의 55번째 잔기의 변이이며, 이 외에 G 단백질의 71번째 잔기, 그리고 L 단백질의 1,079번째 잔기의 변이도 위험요소 결정 인자로 작용할 가능성이 있다.
실시예 4: VHSV의 병원성에 따른 어류세포주에서의 VHS 성장률 비교
이전의 연구 결과, IFN system이 정상적으로 작동하는 세포주를 사용하였을 때, 병원성이 높은 바이러스들은 세포에서 잘 자라는 반면, 병원성이 낮은 바이러스는 성장 속도가 떨어진다는 보고들이 있다(O’'Farrell. et al., J Virol 76:8040, 2002).
본 실시예에서는 실시예 3에서 확인된, VHSV P 단백질의 변이가 실제 VHSV의 병원성을 결정하는 인자인지를 확인하기 위하여 VHSV 병원성과 비례하여 바이러스를 성장시키는 세포주를 확보하고자 하였다. 특히 20 VHSV strain들이 넙치에서 분리된 바이러스들로서 넙치에 감염하여 폐사를 유발하는 특성을 고려하였을 때, 넙치에서 유래된 세포주에서 VHSV가 병원성에 비례하여 성장 속도가 다름이 확인되면 이 세포주를 병원성 결정인자 확인 실험에 사용할 수 있을 것으로 판단되어, 넙치에서 유래된 세포주인 HINAE 세포를 사용하여 고병원성 및 저병원성 VHSV strain의 성장을 분석하였다.
먼저 HINAE 세포주(CVCL_R908)에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 그리고 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 moi=0.1, moi=1 및 moi=10로 접종한 다음 14℃에서 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.
그 결과, 고병원성 VHSV strain들과 저병원성 VHSV strain들 사이에 CPE 및 바이러스 성장에 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다.
고병원성 VHSV strain과 저병원성 VHSV strain 사이에 IFN에 대한 반응이 다른지를 확인하기 위하여 IFN inducer로 알려진 poly I:C를 처리한 HINAE 세포에 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV를 moi=0.1 접종하고 14℃에서 배양하면서 CPE를 관찰하였다.
그 결과, poly I:C를 바이러스 감염 전, 감염과 동시, 혹은 감염 후에 처리한 모든 실험에서 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV 사이에 유의성 있는 CPE 차이가 관찰되지 않았다.
숙주세포의 인터페론 등의 활성이 고병원성 및 저병원성 VHSV 성장 조절에 중요한 역할을 하는 경우 14℃는 넙치에서 유래된 HINAE 세포의 정상적인 생리 활성에 적합하지 않을 수 있다. 따라서 넙치 세포의 생리 활성이 활발할 것으로 예상되는 20℃에서 바이러스 성장 실험을 수행하였다. 즉, HINAE 세포주를 사용하여 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 그리고 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 moi=0.1 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와같이, 저병원성 VHSV strain에 비하여 고병원성 VHSV strain이 HINAE 세포에 더 심한 CPE를 유도하였으며 더 빠른 성장 속도를 보였다.
HINAE 이외에 다른 세포주에서도 고병원성 VHSV strain과 저병원성 VHSV strain의 성장에 차이가 있는 지를 확인하기 의하여 FHM(fathead minnow)(ATCC® CCL-42TM), BF-2(bluegill fry) (ATCC® CCL-91TM)등의 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 그리고 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 moi=0.1 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, BF-2 세포에서는 고병원성과 저병원성 VHSV strain들 사이에 바이러스 성장에서 큰 차이를 보이지 않았지만, 도 10에 나타난 바와 같이, FHM 세포에서는 고병원성 VHSV strain이 HINAE 세포에서보다 더 심한 CPE를 유도하였으며 더 빠른 성장 속도를 보였다.
이와 같은 결과로부터 20℃에서 배양하면, 넙치에서 유래된 HINAE 세포 이외에도 FHM을 사용하여도 고병원성과 저병원성 VHSV strain들 사이에 성장의 차이를 관찰할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: 병원성 결정 유전자를 포함하는 재조합 VHSV 합성
실시예 2에서 VHSV의 병원성을 결정하는 인자일 것으로 예상되는 P 단백질의 55번째 아미노산 잔기 변이, G 단백질의 71번째 아미노산 잔기 변이 및 L 단백질의 1,079번째 잔기 변이에 대하여, 실제 이들 부위의 변이가 VHSV 병원성을 결정하는 인자인지를 확인하기 위하여 이 부위가 다른 재조합 VHSV를 제조하였다.
저병원성 VHSV의 유전자 특성을 지니는 VHSV 전체 게놈의 pVHSV-wild를 주형으로 하여서 P gene, G gene 및 L gene의 병원성 결정인자로 예상되는 변이 부분의 핵산을 차례로 변이시켜 재조합 VHSV를 생산하였다. 변이는 SDM (Site-Directed Mutagenesis)방법으로 사용하였으며, Pfu Turbo™ DNA polymerase (2.5 U/μl QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit)를 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR에 사용된 프라이머와 조건은 표 3 및 표 4에 나타내었다.
프라이머 | 서열번호 | 서열(5′-3′) | |
P55-L SDM | F | 4 | CAAGCCCCAAGAAGAAATCCACTCTGACAACGCTCGAGGAGATCATTG |
R | 5 | CAATGATCTCCTCGAGCGTTGTCAGAGTGGATTTCTTCTTGGGGCTTG | |
G71-I SDM |
F | 6 | GTCCCCATGAGTTCGAGGACATAAACAAGGGCTTGGTCTCTGTCCCAG |
R | 7 | CTGGGACAGAGACCAAGCCCTTGTTTATGTCCTCGAACTCATGGGGAC | |
L1079-R SDM | F | 8 | GAAACACTCTGGTCGTGCTCAACCCGACAGGCCAAAAAACTCAGGG |
R | 9 | CCCTGAGTTTTTTGGCCTGTCGGGTTGAGCACGACCAGAGTGTTTC |
PCR 스텝 | 온도 | 반응시간 | 사이클 |
Pre-denaturation | 95℃ | 3 min | 1 |
Denaturation | 95℃ | 30 sec | 12 |
Annealing | 55℃ | 1 min | |
Extension | 68℃ | 14 min | |
Final extension | 72℃ | 7 min | 1 |
PCR 정제를 수행한 후 DpnI 37℃, 2 시간 동안 반응시키고, E. coli DH5α에 형질전환하여, 클론을 선별하여 Exprep Plasmid SV mini (GeneAll)를 이용하여 플라스미드를 분리하였다.
제작된 pVHSV 변이 벡터는 T7 RNA 폴리머레이즈 발현 EPC 세포(ATCC® CRL2872TM)가 80% 자랐을 때 pVHSV 변이체(2μg), helper 플라스미드 N(500ng), P(300ng) 및 L(200ng)를 첨가하여 FuGENE HD transfection reagent (Promega)를 사용하여 트랜스펙션하였다.
12시간 배양 후 15℃로 옮겨서 CPE가 보일 때까지 배양하고, 이후 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 바이러스 상층액을 수거하였으며, 수거한 바이러스 상층액을 EPC 세포에 접종하여 2번의 계대를 더 진행하여 최종 바이러스를 수득하였다. 수득된 바이러스는 -80℃에 보관하고 사용하였다.
재조합 바이러스를 확인하기 위하여, 바이러스를 접종한 각각의 세포 펠렛으로부터 RiboEX(GeneAll), Hybrid-R kit(GeneAll)을 사용하여 RNA 추출하였다. 추출된 RNA로부터 promega cDNA synthesis kit로 cDNA를 합성하였다. Hipi taq을 사용하여 cDNA로부터 PCR을 진행하였으며, 사용된 프라이머와 PCR 조건은 표 5 및 표 6에 나타내었다.
프라이머 | 서열 번호 |
서열(5′-3′) | ||
P55 | NP realtime | F | 10 | CGATGACGACTACCCAGGGGAC |
VHSV2690R | R | 11 | TAAGTCACACTCCCATGTCT | |
G71 | SEQ2401 | F | 12 | CCAGGTCGATAAGATCTGCATG |
VG-realtime-790R | R | 13 | CGGTCTTGATCCATTCTGTCC | |
L1079 | SEQ8176 | F | 14 | CCTCATCTCAAGACGTCTCAGTTG |
VHSL_SEQ_4490_Re | R | 15 | TGTCATTCTCCCCGAGTCCATTCT | |
PCR Step | 온도 | 반은시간 | 사이클 |
Pre-denaturation | 95℃ | 3 min | 1 |
Denaturation | 95℃ | 30 sec | 30 |
Annealing | 60℃ | 30 min | |
Extension | 72℃ | 1 min | |
Final extension | 72℃ | 7 min | 1 |
PCR 산물은 정제하여하여 T-vector에 라이게이션하였고 플라스미드로 분리한 후, 시퀀싱하여 확인하였다.
이와 같은 방법을 사용하여 rVHSV-P (P의 55번 아미노산 잔기만 변형), rVHSV-PG (P의 55번 아미노산 잔기 + G의 71번 아미노산 잔기 변형), rVHSV-PGL (P의 55번 아미노산 잔기 + G의 71번 아미노산 잔기 변형 + L의 1079번 아미노산 잔기 변형)의 염기서열을 확인한 결과 p55, G71, L1079 들이 순차적으로 변이되어 있는 것을 확인하였으므로, 최종적으로 도 11에 나타난 바와 같이 재조합 VHSV(VHSV-5,VHSV-19, rVHSV, rVHSV-P, rVHSV-PG 및 rVHSV-PGL)를 수득하였다.
실시예 6: 고병원성 재조합 VHSV의 성장조절기능 분석
실시예 5에서 제조한 재조합 VHSV를 사용하여 P, G, L 유전자에 발생한 변이가 VHSV 성장에 영향을 주는 지 분석하였다.
넙치 유래 세포주인 HINAE 세포주에 rVHSV, rVHSV-P, rVHSV-PG 및 rVHSV-PGL의 재조합 바이러스들을 MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 다음 14℃와 20℃에 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.
먼저 세포독성 실험 결과, MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃와 20℃에서 배양한 모든 경우에 있어서, rVHSV에 감염된 세포보다 rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL 감염된 세포에서 세포 독성이 빨리 관찰되었으며, 세포 독성의 정도도 더 심하게 진행되었다. 그러나 rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL 사이에서는 MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃(표 7)와 20℃(표 8)에서 배양한 모든 경우에 있어서, 세포 독성의 진행속도 및 독성의 정도 모두 거의 차이를 발견할 수 없었다.
-, CPE 0%; +, 20%; ++, 40%; +++, 50%; ++++, 60%; +++++, 80%; ++++++, 100%
-,, CPE 0%; +, 20%; ++, 40%; +++, 50%; ++++, 60%; +++++, 80%; ++++++, 100%
다음으로 일정 시간 간격으로 세포 배양액을 취한 후 배양액에 있는 감염성 있는 바이러스 titer를 플라그 어세이(plaque assay)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃와 20℃에서 배양한 모든 경우에 있어서, rVHSV보다 rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL들이 더 빨리 자라는 것이 확인되었으나, rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL 사이에서는 MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃와 20℃에서 배양한 모든 경우에 있어서, 바이러스 성장의 차이를 발견할 수 없었다.
이상의 결과를 종합하면, VHSV P의 55번 아미노산 잔기의 변이가 VHSV의 세포독성 및 바이러스 성장을 결정하는 인자임을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 고병원성 VHSV의 P 55번 아미노산 잔기의 변이 특이적인 프라이머를 이용한 고병원성 VHSV 검출
고병원성 VHSV과 저병원성 VHSV의 P 55번째 아미노산 잔기에 발생한 변이를 PCR을 사용하여 선택적으로 검출하기 위하여 고병원성 VHSV P 55번째 proline 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 지니는 PCR 프라이머 VHSV-HV(high virulence, 서열번호 18 및 19)와 저병원성 VHSV 55번째 leucine 아미노산 잔기를 암호화 하는 염기서열을 지니는 PCR 프라이머 VHSV-LV(low virulence, 서열번호 16 및 17)를 제작하였다(표 9).
HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #19 혹은 저병원성 VHSV strain #5를 MOI=0.1로 접종하였다. 14oC에서 24시간 배양한 후 RNA를 추출한 다음 표 10에서와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 아가로즈 겔에 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다.
프라이머 | 서열번호 | 서열(5′-3′) | |
VHSV-LV | F | 16 | CCCAAGAAGAAATCCACTCC |
R | 17 | GGCAGCTGTGGTTAGTCCTC | |
VHSV-HV |
F | 18 | CCCAAGAAGAAATCCACTCT |
R | 19 | GGCAGCTGTGGTTAGTCCTC |
PCR 스텝 | 온도 | 반응시간 | 사이클 |
Pre-denaturation | 95℃ | 5 min | 1 |
Denaturation | 94℃ | 30 sec | 28 |
Annealing | 59℃ | 30 sec | |
Extension | 72℃ | 30 sec | |
Final extension | 72℃ | 5 min | 1 |
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 저병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-LV 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 고병원성 VHSV strain #19의 P는 검출되지 않았으며 저병원성 VHSV strain #5 만 검출되었다. 반면, 고병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-HV 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 저병원성 VHSV strain #5의 P는 검출되지 않았으며 고병원성 VHSV strain #19만 검출되었다.
다음으로 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV의 P 55번째 아미노산 잔기에 발생한 변이를 Real-time qPCR을 사용하여 선택적으로 검출하기 위하여 고병원성 VHSV P 55번째 proline 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qHV(서열번호 22 및 23)와 저병원성 VHSV 55번째 leucine 아미노산 잔기를 암호화 하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qLV(서열번호 20 및 21)를 제작하였다(표 11).
HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #19 혹은 저병원성 VHSV strain #5를 MOI=0.1로 접종하고, 14oC에서 24시간 배양한 후 RNA를 추출하고, 표 12에 기재된 조건으로 Real-time qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 저병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qLV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR을 사용한 경우, 고병원성 VHSV strain #19의 P는 검출되지 않았으며 저병원성 VHSV strain #5 만 검출되었다. 반면에 고병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qHV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR의 경우, 저병원성 VHSV strain #5의 P는 검출되지 않았으며 고병원성 VHSV strain #19만 검출되었다.
프라이머 | 서열번호 | 서열(5′-3′) | |
VHSV-qLV | F | 20 | CCCAAGAAGAAATCCACTCC |
R | 21 | TGTCCGAGGGCCTTCGTGGC | |
VHSV-qHV |
F | 22 | CCCAAGAAGAAATCCACTCT |
R | 23 | TGTCCGAGGGCCTTCGTGGC |
PCR 스텝 | 온도 | 반응시간 | 사이클 |
Pre-denaturation | 94℃ | 10 min | 1 |
Denaturation | 94℃ | 15 sec | 45 |
Annealing/Extension | 60℃ | 60 sec |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> National Institute of Fisheries Sceince
<120> Composition for Detecting High Pathogenic Viral Hemorrhagic
Septicemia Virus and Method for Detecting High Pathogenic Viral
Hemorrhagic Septicemia Virus Using the Same
<130> P19-B017
<160> 23
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> VHSV P protein
<400> 1
Met Thr Asp Ile Glu Met Ser Glu Ser Leu Val Leu Ser His Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ala Asp Leu Asp Arg Arg Leu Asp Asn Ala Pro Lys Asp Thr Arg
20 25 30
Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Lys Gln Lys Pro Ser
35 40 45
Pro Lys Lys Lys Ser Thr Pro Thr Thr Leu Glu Glu Ile Ile Gly His
50 55 60
Phe Val Pro Glu Asp Leu Gln Leu Asp Ala Thr Lys Ala Leu Gly Gln
65 70 75 80
Leu Leu Arg Arg Ile Lys Leu Ser His Gln Glu Glu Leu Thr Gln His
85 90 95
Leu Glu Lys Val Asn Gly Glu Asn Arg Ala Lys Met Gly Ala Leu Leu
100 105 110
Glu Ser Gln Lys Glu Asn Gly Lys Lys Thr Asp Asn Ile Leu Ser Ile
115 120 125
Leu Ile Ser Met Arg Gly Glu Gly Ala Glu Asn Ala Ser Lys Lys Pro
130 135 140
Lys Val Leu Asp Gly Asp Gln Val Arg Asn Glu Arg Ala Leu Gly Phe
145 150 155 160
Asn Arg Gly Leu Thr Thr Ala Ala Ile Ala Met Lys Lys Phe Lys Leu
165 170 175
Glu Asp Pro Leu Val Leu Cys Lys Gly Ser Val Lys Arg Ala Ala Leu
180 185 190
Ser Ala Met Glu Lys Glu Glu Tyr Asp Gly Glu Arg Glu Thr Tyr Ser
195 200 205
Met Val Ser Lys Ala Ile Lys Ala Glu Leu Asp Lys Leu Glu
210 215 220
<210> 2
<211> 507
<212> PRT
<213> VHSV G protein
<400> 2
Met Glu Trp Asn Thr Phe Phe Leu Val Ile Leu Val Ile Ile Ile Lys
1 5 10 15
Ser Thr Thr Ser Gln Ile Thr Gln Arg Pro Pro Val Glu Asn Ile Ser
20 25 30
Thr Tyr His Val Asp Trp Asp Thr Pro Leu Tyr Thr His Pro Ser Asn
35 40 45
Cys Arg Lys Asn Ser Phe Val Pro Ile Arg Pro Asp Gln Leu Arg Cys
50 55 60
Pro His Glu Phe Glu Asp Ile Asn Lys Gly Leu Val Ser Val Pro Ala
65 70 75 80
Gln Ile Ile His Leu Pro Leu Ser Val Thr Ser Val Ser Ala Val Ala
85 90 95
Asn Gly His Tyr Leu His Arg Val Thr Tyr Arg Val Thr Cys Ser Thr
100 105 110
Asn Phe Phe Gly Gly Gln Thr Ile Glu Lys Thr Ile Leu Glu Ala Lys
115 120 125
Leu Ser Arg Gln Glu Ala Ile Asn Glu Ala Gly Lys Asp His Glu Tyr
130 135 140
Pro Phe Phe Pro Glu Pro Ser Cys Ile Trp Met Lys Asp Asn Val His
145 150 155 160
Lys Asp Ile Thr His Tyr Tyr Lys Thr Pro Lys Thr Val Ser Ile Asp
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Lys Phe Leu Asn Pro Asp Phe Ile Glu Gly Val Cys
180 185 190
Thr Thr Ser Pro Cys Pro Thr His Trp Gln Gly Val Tyr Trp Ile Gly
195 200 205
Ala Thr Pro Gln Ala His Cys Pro Thr Ser Glu Thr Leu Lys Gly His
210 215 220
Leu Phe Thr Arg Thr His Asp His Arg Val Val Lys Ala Ile Val Ala
225 230 235 240
Gly His His Pro Trp Gly Leu Thr Met Ala Cys Lys Val Thr Phe Cys
245 250 255
Gly Thr Glu Trp Ile Lys Thr Asp Leu Gly Asp Leu Ile Gln Val Thr
260 265 270
Gly Gln Gly Gly Ala Asn Lys Leu Ser Pro Lys Lys Cys Val Asn Thr
275 280 285
Asp Val Gln Met Arg Gly Ala Thr Asp Asp Phe Ser Tyr Leu Asn His
290 295 300
Leu Ile Thr Asn Met Ala Gln Arg Thr Glu Cys Leu Asp Ala His Ser
305 310 315 320
Asp Ile Thr Ala Ser Gly Lys Ile Ser Pro Phe Leu Leu Ser Lys Phe
325 330 335
Arg Pro Ser His Pro Gly Pro Gly Lys Ala His Tyr Leu Leu Asp Gly
340 345 350
Gln Ile Met Arg Gly Glu Cys Asp Tyr Glu Ala Val Val Ser Ile Asn
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Gln Tyr Lys Thr Val Asn Asn Ile Trp Lys Ser Trp
370 375 380
Asn Arg Ile Asp Asn Asn Thr Asp Gly Tyr Asp Gly Met Ile Phe Gly
385 390 395 400
Asp Lys Leu Ile Ile Pro Asp Ile Glu Lys Tyr Gln Ser Ile Tyr Asp
405 410 415
Ser Gly Met Leu Val Gln Arg Asn Leu Val Glu Ile Pro His Pro Ser
420 425 430
Ile Val Phe Val Ser Asn Thr Ser Asp Leu Ser Thr Asn Tyr Ile His
435 440 445
Thr Asn Leu Ile Pro Ser Asp Trp Ser Phe Asn Trp Ser Leu Trp Pro
450 455 460
Ser Leu Ser Gly Met Gly Val Val Gly Gly Ala Phe Leu Leu Leu Val
465 470 475 480
Leu Cys Cys Cys Cys Arg Ala Ser Pro Pro Pro Pro Ser Tyr Gly Ile
485 490 495
Pro Met Gln Gln Phe Ser Arg Ser Gln Met Val
500 505
<210> 3
<211> 1984
<212> PRT
<213> VHSV L protein
<400> 3
Met Glu Met Phe Glu Leu Asp Arg Glu Val His Gln Glu Arg Leu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Cys Ser Leu Asn Ser Pro Leu Asn Leu Ser Leu Ser Leu Gln
20 25 30
Leu Phe Gly Arg Leu Thr Pro Lys Thr Glu His Ile Arg Tyr Gln Ala
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Arg Trp Leu Thr Lys Gln Tyr Gln Ile Val His Leu
50 55 60
Lys Glu Leu Glu Ile Asp Ser Thr Arg Ile Gln Gly Tyr Leu Ile Pro
65 70 75 80
His Leu Leu Lys Thr Gln Ser Ser Glu Leu Gly Ser Ser Val Met Lys
85 90 95
Asn Trp Gly Met Val Ser Lys Tyr Tyr Leu Ser Leu Gly Tyr Thr Leu
100 105 110
Pro Pro Lys Asp Lys Phe Asp Phe Arg Glu Val Ala Pro Tyr Trp Asn
115 120 125
Leu Ala Ser Gln Leu Arg Glu Val Thr Leu Glu Ser Gln Lys Val Asp
130 135 140
Val Arg Gly Lys Gly Lys Arg Lys Leu Tyr Gln Val Glu Asp Val Glu
145 150 155 160
Phe Glu Phe Lys Glu Glu Val Val Val Ile Arg Ala Gly Pro Asn Gly
165 170 175
Leu Leu Asn Glu Phe Leu Gly Gly Lys Thr Leu Gly Ala Ile Thr Tyr
180 185 190
Val Glu Tyr Leu Ala Leu Phe Lys Ile Ile Asn Gln Arg Ala Gln Ala
195 200 205
Leu Leu Leu Thr Ala Ile Cys Gln Thr Leu Glu Pro Asp Leu Val Pro
210 215 220
Pro Cys Gly Gly Ile Leu Ser Val Tyr Ala Glu Val Asp Ser Val Leu
225 230 235 240
Arg Arg Ala Gly Gln Ser Ala Ile Asp Leu Leu Lys Leu Trp Glu Pro
245 250 255
Leu Val Leu Thr Lys Leu Gly Asp Val Leu Gly Asp Arg Phe Gly Leu
260 265 270
Glu Asp Asp Phe Lys Glu Thr Ile Arg Gly Glu Ala Asn Lys Leu Ala
275 280 285
Lys Lys Leu His Val Thr Arg Ser Tyr Glu Arg Met Met Lys Thr Leu
290 295 300
Glu Gln Glu Thr Arg Ala Gln Ala Leu Phe Gln Tyr Phe Gly Leu Phe
305 310 315 320
Lys His Phe Ala Tyr Pro Arg Val Tyr Ser Arg Glu Thr Ile Glu Ala
325 330 335
Ile Gln Glu Val Ser Asp Lys Pro Ser Asp Ser Ser Pro Leu Asn Tyr
340 345 350
Leu Ser Asp Gln Cys Lys Ile Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Arg Tyr Thr
355 360 365
Arg Ala Tyr His Arg Ala Pro Thr Met Asn Leu Gly Gln Leu Gly Gln
370 375 380
Gly Ser Tyr Leu Arg Gln Val Leu Glu Ala Gly Lys Ile Pro Asn Thr
385 390 395 400
Lys Asn Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Glu Trp Phe Phe Val Arg Phe Glu
405 410 415
Lys Ser Ile Glu Trp Pro Leu Ser Asp Thr Leu Ser Thr Phe Leu Ser
420 425 430
Asp Lys Ala Ile Thr Gln Asn Arg Asp Ile Trp Tyr Asp Gly Gly Ser
435 440 445
Ser Gly Arg Asp Thr Thr Glu Lys Arg Leu Leu Leu Lys Phe Ile Lys
450 455 460
Glu Asn Glu Asp Ser Val Glu Lys Val Ile Leu Lys Ala Asp Glu Ile
465 470 475 480
Tyr Asp Thr Lys Thr Asp Gln Ile Ile Ala Leu Lys Val Lys Glu Met
485 490 495
Glu Leu Lys Ile Lys Gly Arg Gly Phe Gly Leu Met Ala Phe Lys Pro
500 505 510
Arg Leu Leu Gln Val Leu Arg Glu Ser Ile Ala Lys Lys Thr Ser Lys
515 520 525
Leu Phe Pro Glu Ile Thr Met Thr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Lys Lys
530 535 540
Lys Lys Phe Gln Leu Ser Arg Lys Ser Asp Asp Arg Arg Gly Tyr Ile
545 550 555 560
His Ile Ser Lys Ser Leu Asp Ile Asn Lys Phe Cys Thr Ser Gln Arg
565 570 575
Gln Phe Asn Ser Leu Ala Val Phe Gln Ser Leu Asp Glu Leu Leu Gly
580 585 590
Thr Asp Gln Leu Phe Thr Arg Val His Glu Ile Phe Glu Lys Thr Trp
595 600 605
Ile Val Asp Gly Ser Ala Ser Asp Pro Pro Asp Leu Val Thr Phe Lys
610 615 620
Ala Arg Tyr Glu Glu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Glu Ala Pro His Val
625 630 635 640
Trp Ala Asp Gly Ala Phe Ser Gly Leu Met Gly Gly Ile Glu Gly Leu
645 650 655
Cys Gln Tyr Val Trp Thr Ile Cys Leu Leu Leu Arg Val Glu Arg Val
660 665 670
Leu Ala Ala Thr Gln Leu Thr His Phe Val Met Ala Gln Gly Asp Asn
675 680 685
Val Ile Ile Asn Leu Ile Ile Pro Val Glu Val Asp Arg Val Gly Gly
690 695 700
Val Val Glu Gly Glu Arg Ala Arg Ile Lys Asn Ile Ser Lys Asp Ile
705 710 715 720
Asp Ser Ala Leu Glu Arg Glu Leu Leu Arg Ser Gly Leu Thr Leu Lys
725 730 735
Ile Glu Glu Thr Leu Thr Ser Glu Asn Leu Ser Ile Tyr Gly Lys Asp
740 745 750
Leu His Cys Pro Gln His Leu Thr Leu Ala Val Lys Arg Ala Gly Ser
755 760 765
Val Ser Ile Ile Ser Ser Glu Gln Tyr Gln Asp Val Pro Thr Phe Leu
770 775 780
Ser Gly Leu Gly Thr Gly Met Glu Thr Ile Ser Glu Cys Val Asn Asn
785 790 795 800
Lys Val Ser Ala His Leu Phe Gly Val Ile Leu Gly Val Ala Gly Trp
805 810 815
Lys Ser Leu Ala Gln Arg Gln Thr Trp Lys Gly Trp Glu Tyr Pro Phe
820 825 830
Gln Ser Glu Thr Thr Arg Arg Gln Val Arg Ser Gln Gly Ile Ile Leu
835 840 845
Gln Lys Gly Glu Ser Thr Leu Val His Lys Glu Pro Glu Thr Asn Pro
850 855 860
Glu Lys Arg Thr Leu Glu Leu Leu Leu Val Ser Ser Leu Phe Gly Ser
865 870 875 880
Ala Leu Gly Met Leu Pro Phe Pro Thr Pro Ile Asp Leu Glu Lys Arg
885 890 895
Gly Val Gly Asp Tyr Ile Thr His Arg Leu Ser Ile Val Lys Met Ala
900 905 910
Leu Val Ser Lys Lys Leu Pro Asn Arg Met Val Lys Met Ile Val Ser
915 920 925
Thr Met Asn Leu Pro Leu Ser Arg Glu Gln Asp Leu Thr Lys Leu Phe
930 935 940
Asp Ser Pro Phe Ser Leu Asn Leu Ala Thr Glu Glu Asp Ala Ala Ser
945 950 955 960
Val Ile Lys Arg Leu Ala Arg Gly Thr Leu Arg Gly Leu Asp Ile Lys
965 970 975
Asn Lys Lys Leu Ala Asp His Ile Ala Thr Met Asp Gln Gly Ile Thr
980 985 990
Gln Ile Asp Asp Ala Leu Ala Ser Ala Asp Thr Ile Asn Pro Arg Ile
995 1000 1005
Ala Tyr Gln Ile Arg Asn Ile Thr Asp Gln Lys Glu Ser Glu Met Phe
1010 1015 1020
Val Thr Lys Phe Ala Thr Ala Lys Thr Met Arg Met Val Ala Leu Ser
1025 1030 1035 1040
Ser Ser Gln Asp Val Ser Val Val Gly Leu Leu Asn Lys Arg Ser Gln
1045 1050 1055
Ala Lys Glu Ile Tyr Thr Ile Trp Arg Thr Gln Arg Lys Glu Gly Thr
1060 1065 1070
Leu Trp Ser Cys Ser Thr Gln Gln Ala Lys Lys Leu Arg Asp Gln Ser
1075 1080 1085
Trp Gly Lys Asn Ile Ile Gly Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Glu Ala
1090 1095 1100
Thr Ser Phe Lys Leu Ile Asp Pro Ile Ser Trp Glu Glu Glu Lys Glu
1105 1110 1115 1120
Ala His Gln Phe Thr Ile His Tyr Tyr Leu Ser Lys Pro Ser Leu Ser
1125 1130 1135
Ser Lys Thr Ala His Thr Thr Arg Gly Pro Leu Val Pro Tyr Phe Gly
1140 1145 1150
Thr Gln Thr Lys Pro Leu Ile Ala Lys Ala Tyr Met Glu Leu Lys Gly
1155 1160 1165
Asn Pro Arg Thr Asn Lys Ala Leu Gln Leu Leu Ser Met Arg Glu Thr
1170 1175 1180
Met Ile Lys Ala Gly Ser Asn Leu Asp Lys Leu Leu Leu Ser Leu Cys
1185 1190 1195 1200
Ser Asn Ala Leu Asp Ile Asp Val Asn Ser Leu Pro Ser Leu Gln Ala
1205 1210 1215
Gln Glu Glu Ala Ser Ala Gly Glu Gly Ile Arg Gly Gly Ile Lys Glu
1220 1225 1230
Ser Met Ser Pro Val Gly Pro Asp Asn Leu Tyr Thr His Ile Thr His
1235 1240 1245
Lys Val Phe Glu Arg Gln Trp Leu Ser Glu Phe His Val Asn Ile Ala
1250 1255 1260
Asp Phe Ile Ile Trp Gly Ile Thr Lys Thr Arg Gln His Leu Gln Val
1265 1270 1275 1280
His Thr Asp Leu Gly Gly Ser Leu Pro Ile Cys Val Pro Ala Cys Thr
1285 1290 1295
Glu Cys Tyr Arg Glu Lys Glu Arg Val Phe Leu Asp Ile Pro Arg Glu
1300 1305 1310
Thr Gly Trp Val Ser Thr Ser Thr Thr Ser Asp Lys Ala Gln Thr Tyr
1315 1320 1325
Phe Ser Thr Trp Cys Asp Leu Pro Arg Val Ser Thr Leu Pro Ser Leu
1330 1335 1340
Asp Gln Glu Asp Ala Thr Arg Leu Met Gly Arg Ser Met Ala Ile Gln
1345 1350 1355 1360
Lys Ser Thr Pro Gly Glu Ser Ile Thr Lys Phe Tyr Ser Thr Ala Pro
1365 1370 1375
Asp Thr His Arg Leu Leu His Pro Val Asp Leu Val Leu Gly Tyr Ala
1380 1385 1390
Glu Gly Thr Ile Phe Ser Tyr Met Lys Ser Gln His Asn Ile His Gly
1395 1400 1405
Ser Leu Tyr His Pro His Ile Glu Glu Ile Glu Pro Ala Leu Glu Lys
1410 1415 1420
Tyr Val Ile Asp Thr Lys Thr Ser His Thr Lys His Leu Gly Tyr Leu
1425 1430 1435 1440
Phe Gln Asp Glu Asp Ser Leu Gln Glu Leu Leu Glu Thr Gly Leu Thr
1445 1450 1455
Pro Tyr Ile Pro Arg Ser Ile Pro Leu Thr Ile Thr Glu Leu Thr Ser
1460 1465 1470
Ala Cys Cys Met Thr Leu Ala Lys Ala Ile Ser Ile Ile Leu Arg Thr
1475 1480 1485
Gly Val Thr Ile Pro Leu Met Pro Glu Asn Gly Leu Gly Glu Asn Asp
1490 1495 1500
Ile Gln Val Ala Arg Leu Thr Ala Asn Ser Phe Ser Arg Leu Met Pro
1505 1510 1515 1520
Arg Gly Arg Ile Gln Leu Val Tyr Leu Asp Cys Asp Leu Thr Pro Gln
1525 1530 1535
Met Thr Ala Trp Val Pro Thr Ser Gln Pro Ser Val Leu Gly Ser Ile
1540 1545 1550
Asn Phe His Ile Glu Gly Ile Ala Ile Ser Leu Thr Ala Thr Glu Met
1555 1560 1565
Arg Val Gly Gln Glu Ser Trp Glu Glu Arg Lys Trp Thr Cys Ser Asn
1570 1575 1580
Asn Arg His Ile Ile Ala Lys Gly Val Lys Thr Lys Ser Leu Phe Ile
1585 1590 1595 1600
His Gln Ser Val Pro Glu Ile Ile Thr His Pro Pro Asp Leu Ile Val
1605 1610 1615
Val Ile Gly Gly Gly Leu Gly Gly Cys Val Val Pro Tyr Leu Gln Lys
1620 1625 1630
Trp Arg Asp Pro Gln Val Ile Phe Cys Thr Leu Phe Asp Glu Arg Glu
1635 1640 1645
Arg Ile Ser Glu Asp Gly Asp Leu Ile Ile Pro Pro Glu Leu Leu Val
1650 1655 1660
Arg Gly Leu Ala Gly Arg Met Val Glu Lys Glu Leu Leu Glu Ala Glu
1665 1670 1675 1680
Met Cys Asp Ile Thr Val Lys Gly Asn Arg Asp Leu Leu Ile Lys Val
1685 1690 1695
Val Gln Lys Trp Val Gln Pro Asn Glu His Val Leu Leu Ile Asp Glu
1700 1705 1710
Ile Glu Asn Arg Gly Asp Gln Glu Ser Val Leu Gln Ser Ser Ile Ser
1715 1720 1725
Glu Leu Leu Thr Arg Met Asp Ser Val Cys Asn Leu Thr Ser Val His
1730 1735 1740
Thr Ile Arg Glu Thr Gly Pro Arg Gln Phe Ala Gln Arg Val Asn Thr
1745 1750 1755 1760
Ile Arg Arg Gly Arg Lys Thr Ala Thr Leu His Trp Asn Gln Tyr Asn
1765 1770 1775
Arg Arg Asp Gln Val Glu Ala Leu Leu Leu Val Glu Ser His Thr Arg
1780 1785 1790
Lys Thr Glu Leu His Val Thr Ser Ser Val Val Gln Ala Ala Phe Arg
1795 1800 1805
Lys Ile Asp Glu Lys Leu Glu Ser Glu Ser Arg Leu Glu His Ser Lys
1810 1815 1820
Trp Ser Leu Pro Glu Leu Pro Pro Arg Glu Lys Asp Ile Leu Leu Gly
1825 1830 1835 1840
Tyr Val Ala Ser Val Phe Leu Lys Leu Gly Leu Val Val Thr Asp Arg
1845 1850 1855
His Met Ser Ala Ala Ala Leu Ile Thr Leu Leu Glu Glu Ala Gly Pro
1860 1865 1870
Lys Met Ile Ser Trp Asp Lys Lys Met Glu His Arg Ser Trp Ala Ser
1875 1880 1885
Pro Asp Ala Ile Thr Glu Lys Gly Ile Thr Gln Asp Gln Ile Phe Ser
1890 1895 1900
Leu Leu Cys Phe Ala Trp Ala Leu Arg Gly Leu Lys Ser Gly Asp Trp
1905 1910 1915 1920
Glu His Asp Ala Asp Ala Ile Ile Leu Gln Asp Val His Ile Val Thr
1925 1930 1935
Gly Pro Arg Leu Cys Gln Met Gly Glu Ser Pro Lys Lys Thr Phe Ala
1940 1945 1950
Ser Phe Arg Leu His Asn Thr Lys Lys Ala Glu Asp Leu Lys Gly Tyr
1955 1960 1965
Leu Gly Ala Leu Leu His Leu Glu Ser Phe Phe Pro Phe Gly Glu Gln
1970 1975 1980
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
caagccccaa gaagaaatcc actctgacaa cgctcgagga gatcattg 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
caatgatctc ctcgagcgtt gtcagagtgg atttcttctt ggggcttg 48
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gtccccatga gttcgaggac ataaacaagg gcttggtctc tgtcccag 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctgggacaga gaccaagccc ttgtttatgt cctcgaactc atggggac 48
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaacactct ggtcgtgctc aacccgacag gccaaaaaac tcaggg 46
<210> 9
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<212> DNA
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ccctgagttt tttggcctgt cgggttgagc acgaccagag tgtttc 46
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cgatgacgac tacccagggg ac 22
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taagtcacac tcccatgtct 20
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ccaggtcgat aagatctgca tg 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cggtcttgat ccattctgtc c 21
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cctcatctca agacgtctca gttg 24
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tgtcattctc cccgagtcca ttct 24
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tgtccgaggg ccttcgtggc 20
Claims (8)
- VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 VHSV 검출용 조성물의 검체는 어류의 혈액, 어류의 조직, 양어장 수 및 해수로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브 및 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 VHSV 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 VHSV 검출용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 고병원성 VHSV 검출용 키트.
- VHSV 함유 샘플에서, VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 VHSV의 검출방법.
- 제6항에 있어서, 상기 샘플은 어류의 혈액, 양어장 수 및 해수로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열의 검출은 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브 및 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR101595442B1 (ko) * | 2015-08-18 | 2016-02-18 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 지역 특이적 유전형 판별용 프로브 및 그 용도 |
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2019
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