JP2002515725A - カポジ肉腫および腹膜後繊維腫症に関連するガンマヘルペスウイルスのｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ガンマヘルペスウイルスの亜科の３つのメンバーのＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。２つは腹膜後繊維腫症に罹患したマカクザルから、残りはカポジ肉腫に罹患したヒトエイズ患者から得た。ＤＮＡポリメラーゼの活性部位付近の領域をコードする454塩基対の断片は、その３つのウイルスの間では69〜83％の同一性を有するが、他の公知ガンマヘルペス配列とは54〜68％の同一性を、アルファおよびベータヘルペス配列とは55％未満の同一性を有するにすぎない。また、RFHV/KSHV亜科の関連ウイルスからのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドも提供する。該配列データに従い製造したポリヌクレオチドは、関連配列を検出し特徴づけるための試薬として使用することができる。そのような試薬は、RFHV、RFHV2およびKSHVを含む（これらに限定されるものではない）RFHV/KSHV亜科のメンバーを検出するために使用してもよい。対応するポリペプチドおよびペプチド断片は、該ポリヌクレオチドを発現させることにより、あるいは化学合成により得ることができる。それらは、感染被験者の血清中に潜在的に存在する特異的抗体を検出するために使用してもよい。それらはまた、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することによりウイルス複製を抑制する医薬化合物を設計したりスクリーニングするために使用してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 カポジ肉腫および腹膜後繊維腫症に関連する ガンマヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ 関連出願の相互参照 本出願は、1995年７月14日付け出願の米国仮特許出願第60/001,148号および19 96年７月11日付け出願の米国特許出願（係属中、代理人名簿第29938-20001.00号 ）（これらの全体を、参考として本明細書に組込むものとする）の一部継続出願 である。連邦政府の援助による研究のもとでなされた発明に対する権利の説明 本発明の一部は、米国国立衛生研究所からの助成（RR00166-34）に援助された 研究を通じてなされたものであり、政府は本発明において一定の権利を有する。技術分野 本発明は、一般に、ウイルス学の分野、特にヘルペスファミリーウイルスに関 する。特に、本発明は、ヒトを含む霊長類における繊維増殖性および新生物形成 性状態に関連するメンバーを含むウイルスサブファミリーにおけるＤＮＡポリメ ラーゼの同定および特徴づけに関する。背景技術 カポジ肉腫は、外観を損ない致命的となりうる出血性肉腫の一形態である。そ れは、皮膚上に暗色の斑点または小結節として現れる多発性血管腫瘍を特徴とす る。組織学的レベルでは、それは、束および血管部位を形成する比較的均一な紡 錘状細胞の増殖を特徴とする。炎症性浸潤では、形質細胞、Ｔ細胞および単球の 証拠が認められることが多い。最終的に、胃腸病変からの又は関連リンパ腫から の出血により死に至ることがある（概論は、Martinら、FinesmIthらを参照され たし）。 この疾患は、かつてはそれほど注目されなかったが、エイズとの関連性から、 にわかに一般に注目されるようになった。あるエイズ罹患集団の20％もが、その 疾患の経過の間にカポジ肉腫になる。カポジ肉腫は、免疫不全に関連した他の状 態（例えば、腎臓透析、および治療での免疫抑制）においても生じる。しかしな がら、この疾患の疫学は、免疫不全が唯一の原因因子ではないことを示唆してい る。特に、カポジ肉腫が、ある性慣習と高い関連性を有することから、ヒト免疫 不全ウイルス以外の病原体の関与が示唆されている（Berelら）。 エイズ患者から得られたカポジ病変からの組織サンプルにおいて、ヘルペスウ イルス様ＤＮＡ配列が同定されている（Changら、Ambroziukらにより確認されて いる）。この配列は、罹患している組織と罹患していない組織からのＤＮＡを、 無関係なプライミングオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、ついで互いにハイブ リダイズさせてそれらの細胞の間の相違を引き出すレプレゼンテイショナル・デ ィファレンス分析（representational difference analysis）（Lisitsynら）に より得られた。この配列の一部は、エプスタインバーウイルスおよびリスザルヘ ルペスウイルスの公知配列と同一であった。それは、カプシドおよび外被タンパ ク質の２つの構成成分をコード化ていた。種々の起源からの組織を調べると、患 者のエイズの状態にかかわらず、カポジ肉腫病変の95％でその配列が見出された （Mooreら）。同じ患者の無関係な組織の21％が陽性であり、一方、対照集団か らのサンプルの５％が陽性であった。サンプル間で約0.5％の配列変異があった 。また、体腔リンパ腫（エイズ患者に特有に生じるＢ細胞遺伝型を有するリンパ 腫滲出）において、この配列がより高いコピー数で検出された（Cesarmanら）。 他のエイズ関連リンパ腫は陰性であった。 ヘルペスウイルスファミリーは、約100nmのサイズで脊椎動物に感染しうる多 数の多エンベロープウイルスを含む（一般的な概説としては、例えばEmeryら、F ieldsらを参照されたし）。二本鎖ＤＮＡゲノムは、異常に大きく、約88〜約229 キロベース長である。それは、該ウイルスの生活環の種々の段階で50以上の異な る転写物を産生する。その段階の１つにおいて、ウイルス複製に必要な多数のヌ クレオチドおよびポリヌクレオチドをプロセシングする酵素（例えば、ＤＮＡポ リメラーゼ、ＤＮアーゼ、dUTPアーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ウラシ ル−ＤＮＡグリコシラーゼおよびチミジンキナーゼ）が産生される。これらの機 能的タンパク質は、外部ウイルス成分と比べて、種の間で比較的よく保存されて いる傾向がある（Karlinら）。 ヘルペスウイルスファミリーは、いくつかのサブファミリーに分類されている 。それらの各カテゴリーへの分類は、もともとは生物学的特徴に基づくものであ ったが、ゲノム配列データの出現につれて改良されつつある。アルファサブファ ミリーは、広い宿主域、短い複製サイクルおよび知覚神経節に対する親和性を有 するウイルスを含む。それらは、ヒト単純ヘルペスウイルスおよび水痘・帯状疱 疹ウイルスを含む。ベータサブファミリーは、限局された宿主域を有するウイル スを含み、サイトメガロウイルスおよびヒトヘルペスウイルス６を含む。ガンマ サブファミリーは、一般にリンパ栄養性のウイルスを含む。そのＤＮＡは、高い GC含量の複数の縦列反復配列に隣接した低いGC含量を有する約110キロベースの セグメントを特徴とする。そのサブファミリーは、エプスタインバーウイルス（ EBV）、リスザルヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス２および５およびウ シヘルペスウイルス４を含む。 ヘルペスウイルスは、複雑な臨床経過を有する状態に関連している。多くのヘ ルペスウイルスの特徴は、宿主内で長期間潜伏状態に入る能力を有することであ る。アルファサブファミリーウイルスは、知覚および自律神経節中で潜伏形態を 維持し、一方、ガンマサブファミリーウイルスは、例えばリンパ球系統細胞中で 潜伏形態を維持する。潜伏は、あるウイルス遺伝子の転写と関連しており、その ウイルスが活性な複製を再開するのに最適な状態になるまで、潜伏が何十年も続 くことがある。そのような状態は、免疫不全を含むことがある。さらに、いくつ かのガンマサブファミリーのヘルペスウイルスは、それらが感染する細胞を遺伝 的に形質転換させる能力を有する。例えば、EBVは、Ｂ細胞リンパ腫、口内毛髪 状白斑、リンパ様間隙肺炎および鼻咽頭癌に関連している。 繊維増殖および前新生物形成細胞の生成に関与する他の多数の状態が、ヒトお よび他の脊椎動物で見出される。ヒトで見出される具体例としては、腹膜後繊維 症、結節繊維腫症、偽肉腫繊維腫症および硬化性腸間膜炎が挙げられる。地方病 性腹膜後繊維腫症（RF）として公知のもう１つの状態が、University of Washin gton Regional Primate Centerのマカクザルのコロニーで認められている（Gidd ensら）。その疾患の後期は、横隔膜を経由して鼡径管内におよび腹壁内に伸長 している腸間膜および腹膜腔の背面部の周囲の増殖性繊維組織を特徴とする。臨 床的に明らかとなれば、該疾患は１〜２ヵ月以内に常に死をもたらす。その状態 は、Ｄ型サルレトロウイルスSRV-2によるサル免疫不全（SAIDS）に関連している （Tsaiら）。しかしながら、他のコロニーは、SAIDSに罹患したサルの間で同じ 頻度のRFを示さず、WashingtonでのRFの頻度は近年減少してきている。 ヒト以外の霊長類におけるそのような状態の研究は、ヒトの状態のモデルとし て重要であるだけでなく、１つの霊長類種が、別の種に罹患するウイルスの保有 体として機能しうることからも重要である。例えば、リスザルヘルペスウイルス は、その天然の宿主であるリスザル（サイミリ・シウレウス(Saimiri sciureus) ）においては疾患を引き起こすことがないようであるが、他の霊長類、特にヨザ ルにおいては、ポリクローナルＴ細胞リンパ腫および急性白血病を引き起こす。 ヘルペスウイルス感染の検出および治療に用いる試薬および方法を開発するこ とが要求されている。 例えば、カポジ肉腫および同様の状態の診断および評価に使用できる試薬およ び方法を開発することが要求されている。新たな患者で病原体を検出できれば、 鑑別診断において助けとなるかもしれない。進行中の状態における該病原体のレ ベルを評価できれば、臨床処置において助けとなるかもしれない。この点で、Ch angらの外被をコードするポリヌクレオチドは、適用性が限定されているかもし れない。活性感染と潜在性感染とを識別しうるマーカーを得ることが望ましい。 また、免疫原性であり、抗体応答において現れる病原体に対する免疫学的暴露を 評価するために使用できるマーカーを得ることが望ましい。 第２に、カポジ肉腫および同様の状態に対する新規医薬の開発で使用できる試 薬および方法を開発することが要求されている。カポジ肉腫の現在の治療は、伝 統的な化学療法（例えばビンクリスチン）と組み合わせた照射である（Northfel t，Mitsuyasu）。病変はこれらの治療法に応答するが、その応答は一時的なもの であり、一般には、再び臨床経過が悪化し始める。サイトカインによる治療など の実験的な療法でさえ、疾患の原因でなく症状に向けられている。病原体に基づ く薬物スクリーニングおよび合理的なドラッグデザインを、長い間必要とされて きた、長期的効力を有する臨床治療計画に向けさせることができる。 第３に、他の繊維増殖性状態と関連したウイルス因子を同定するのに使用でき る試薬および方法を開発することが要求されている。Changらによるレプレゼン テイショナル・ディファレンス分析技術は複雑で困難であり、おそらく、一般的 なスクリーニング試験には適さないであろう。より望ましいのは、関連病原体を 含有している疑いのある種々の組織サンプルを調べるためのより日常的なアッセ イにおいて試薬として使用されるプライマーまたはプローブのセットである。好 ましくは、その試薬は、これまでに未記載のウイルス化合物を同定するのに十分 な程度に交差反応性であるが、目的としないウイルスまたは宿主の内因性成分の 同定を回避するのに十分な程度に特異的である。発明の開示 新規ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の産物に由来するか又はそれと反応しうる単離 されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を提供することが本発明の目 的である。その遺伝子は、繊維増殖性状態および新生物（特にヒトおよびヒト以 外の霊長類で生じるもの）に関連したヘルペスウイルス中に存在する。本発明の もう１つの目的は、ヘルペスウイルスファミリー、特にガンマヘルペスサブファ ミリーの任意のメンバーにおいてＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を検出し特徴づける ためのポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供することである。本発 明のもう１つの目的は、霊長類、特にヒトにおけるガンマヘルペスウイルス感染 症の診断および治療に使用するための、これらのポリヌクレオチド、ポリペプチ ドおよび抗体に基づく物質および方法を提供することである。 本発明の実施態様には以下のものが含まれる。 ・ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離され たポリヌクレオチドであって、配列番号１および配列番号３よりなる群から選ば れる配列のヌクレオチド27〜501に対して少なくとも69％の同一性を有する配列 （好ましくは475ヌクレオチド長）を含んでなるポリヌクレオチド。 ・前記実施態様に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼコード領域の 少なくとも18個、より好ましくは少なくとも約35個、さらに好ましくは少なくと も約50個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる単離されたポリヌクレオチ ドであって、該断片の配列が配列番号110または111に含有されないことを特徴と するポリヌクレオチド。好ましい具体例は、配列番号１、３、116または118に含 有される少なくとも18個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる単離された ポリヌクレオチドである。 ・ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離され たポリヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドLSGGA（配列番号107）に対し て少なくとも80％の同一性を有する26ヌクレオチドの配列を含んでなる前記ポリ ヌクレオチド。 ・ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離され たポリヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドCTDPA（配列番号108）に対し て少なくとも69％の同一性を有する29ヌクレオチドの配列を含んでなる前記ポリ ヌクレオチド。 ・ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離され たポリヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドKMLEA（配列番号22）に対し て少なくとも80％の同一性を有する32ヌクレオチドの配列を含んでなる前記ポリ ヌクレオチド。 ・ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離され たポリヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドGISPA（配列番号109）に対し て少なくとも69％の同一性を有する29ヌクレオチドの配列を含んでなる前記ポリ ヌクレオチド。 ・前記実施態様に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼコード領域の 少なくとも18個、より好ましくは少なくとも約35個、さらに好ましくは少なくと も約50個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる単離されたポリヌクレオチ ドであって、該断片の配列が配列番号110または111に含有されないことを特徴と する前記ポリヌクレオチド。 ・該ヘルペスウイルスが霊長類に対する感染能を有する、前記実施態様のいず れかに記載のポリヌクレオチド。好ましい具体例は、RFHV、KSHVおよびRFHV2で ある。 ・配列番号１のヌクレオチド27〜501または配列番号３のヌクレオチド27〜501 または配列番号116のヌクレオチド36〜2499または配列番号118のヌクレオチド１ 〜454の線状配列とは同一であるが、配列番号110または配列番号111のいずれか に含まれる線状配列とは同一でない少なくとも18ヌクレオチドの線状配列を含ん でなる単離されたポリヌクレオチド。この単離されたポリヌクレオチドは、好ま しくは、配列番号１のヌクレオチド27〜501または配列番号３のヌクレオチド27 〜501または配列番号116のヌクレオチド36〜2499または配列番号118のヌクレオ チド１〜454と実質的に同一な線状配列を含む。 ・本発明で具体化されるポリヌクレオチドのいずれかにコードされる単離され たポリペプチド。 ・配列番号２のアミノ酸10〜167または配列番号４のアミノ酸10〜167または配 列番号117のアミノ酸13〜833、または配列番号119〜123のいずれかに含まれる配 列と実質的に同一であるが、配列番号112または配列番号113に含有されない少な くとも11、好ましくは12、より好ましくは15アミノ酸の線状配列を含んでなる単 離されたポリペプチド。 ・第２のアミノ酸配列に結合した前記実施態様に記載の単離されたペプチドの アミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチド。 ・核酸結合活性、ヌクレオチド結合活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有す る、前記実施態様に記載の単離されたポリペプチド。 ・配列番号80、82、84、86、88および90〜103よりなる群から選ばれる配列と 同一であるアミノ酸の線状配列を含んでなる単離されたポリペプチド。 ・本発明で具体化されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ ド。 ・本発明で具体化されるポリペプチドをコードする非天然に生じるポリヌクレ オチド。 ・ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに直接結合した本発明で 具体化されるポリヌクレオチドを含んでなる、融合ポリペプチドをコードするポ リヌクレオチド。 ・配列番号２のアミノ酸10〜167または配列番号４のアミノ酸10〜167または配 列番号117のアミノ酸13〜833、または配列番号119〜123のいずれかの配列である が配列番号112または配列番号113には含有されない少なくとも11個、好ましくは 少なくとも12個、より好ましくは少なくとも15個の連続したアミノ酸のポリペプ チドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換えクローニングベクタ ー。 ．配列番号２のアミノ酸10〜167または配列番号４のアミノ酸10〜167または配 列番号117のアミノ酸13〜833、または配列番号119〜123のいずれかの配列である が配列番号112または配列番号113には含有されない少なくとも１個、好ましくは 少なくとも12個、より好ましくは少なくとも15個の連続したアミノ酸のポリペプ チドをコードし、制御ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合したポリヌクレ オチド配列を含んでなる組換え発現ベクター。 ・配列番号１、３、116または118には含まれるが配列番号110または111には含 まれない線状配列と同一である少なくとも18ヌクレオチドの線状配列を含んでな る組換えクローニングベクター。 ・本発明のポリヌクレオチド、クローニングベクターまたは発現ベクターのい ずれかにより遺伝的に改変された宿主細胞。 ・本発明のポリヌクレオチドの前記コード領域中にコードされるＤＮＡポリメ ラーゼに特異的なモノクローナル抗体または単離されたポリクローナル抗体。 ・本発明のペプチドに特異的なモノクローナル抗体または単離されたポリクロ ーナル抗体。 ・配列番号５〜16、21、22、104〜109および124〜152よりなる群から選ばれる オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド。 ・ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの増幅されたコピーの製 造法であって、該ポリヌクレオチドを本発明のオリゴヌクレオチド（これは、１ 型、２型または３型オリゴヌクレオチドであってもよい）と接触させ、そして該 ポリヌクレオチドと二重らせんを形成したオリゴヌクレオチドを伸長させる工程 を含んでなる前記製造法。好ましくは、該増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（PC R）である。該PCRは、好ましくは、アニーリングおよび伸長のサイクルの繰り返 しを含み、該アニーリングは少なくとも60℃の温度で行なう。 ・該PCRは、10〜30mM(NH₄)₂SO₄および１〜10mM MgCl₂を含有する緩衝液（例え ば、WB4緩衝液）中で行なう。 ・ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの増幅されたコピーの製 造法であって、増幅するポリヌクレオチドをまず、繊維芽細胞増殖およびコラー ゲン沈着により特徴づけられる疾患に罹患した個体から採取した生物学的サンプ ルから得ることを特徴とする前記製造法。 ・ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの増幅されたコピーの製 造法であって、増幅するポリヌクレオチドをまず、リンパ球系統の悪性疾患に罹 患した個体から採取した生物学的サンプルから得ることを特徴とする前記製造法 。また、増幅するポリヌクレオチドをまず、腹膜後繊維症、結節繊維腫症、偽肉 腫繊維腫症、繊維肉腫、硬化性腸間膜炎、急性呼吸疾患症候群、特発性肺繊維症 、びまん性増殖性糸球体腎炎、神経膠腫、グリア芽細胞腫、神経膠症、白血病お よびリンパ腫よりなる群から選ばれる状態に罹患した個体から採取した生物学的 サンプルから得ることを特徴とする前記製造法も含まれる。 ・霊長類に由来するサンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であ って、該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、本発明のポリヌクレオチドを含む プローブと接触させ（これは、配列番号１に示す配列を有するポリヌクレオチド および配列番号３に示す配列を有するポリヌクレオチドとは該プローブが安定な 二重らせんを形成するのを許容するが配列番号24〜29のいずれかの配列を有する ポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下で行なう）、そして工程a）で形 成した前記の安定な二重らせんの有無を検出する工程を含んでなる前記方法。言 及されている条件は、挙げられているすべての基準を満たす一組の反応パラメー ター（例えば、インキュベーション時間、温度、溶質濃度および洗浄工程）であ る。これらの条件下、該ポリヌクレオチドは、配列番号１を有するポリヌクレオ チドと接触すれば、安定な二重らせんを形成しうるであろう。また、配列番号３ を有するポリヌクレオチドと接触すれば、安定な二重らせんを形成しうるであろ う。配列番号24から配列番号29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドと接 触しても、安定な二重らせんを形成できないであろう。該試験条件下での安定な 二重らせんの形成が、示されている配列に依存する限り、所望により、該配列の みよりなるポリヌクレオチドと接触させることにより、あるいは別のヌクレオチ ドに結合した該配列を有するポリヌクレオチドと接触させることにより、該反応 条件を試験してもよい。また、本発明の他のポリヌクレオチドを用いる同様の方 法も含まれる。これは、該プローブと接触させる前に、該サンプルのＤＮＡまた はＲＮＡ上で増幅反応を行なうことを含む。該増幅反応は、本発明のオリゴヌク レオチドプライマーを用いて行なってもよい。 ・霊長類に由来するサンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であ って、該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、配列番号21、22、107、108または 109に示す配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させ（これは、配列番 号１に示す配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に示す配列を有する ポリヌクレオチドとは該プローブが安定な二重らせんを形成するのを許容するが 配列番号24〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドとはそれを許容しな い条件下で行なう）、そして形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出する 工程を含んでなる前記方法。 ・サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、該サンプル 中のＤＮＡまたはＲＮＡを、配列番号22、107、108または109に示す配列を含む オリゴヌクレオチドプローブと接触させ（これは、配列番号１に示す配列を有す るポリヌクレオチドおよび配列番号３に示す配列を有するポリヌクレオチドとは 該プローブが安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列番号23〜29のいず れかの配列を有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下で行なう）、 そして形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出する工程を含んでなる前記 方法。 ・サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、本発明のオ リゴヌクレオチドを増幅反応のプライマーとして用いて、該サンプル中のポリヌ クレオチド上で増幅反応を行い、そして該ポリヌクレオチドの増幅されたコピー の有無を検出する工程を含んでなる方法。 ・配列番号107、配列番号108およびそれらのそれぞれの相補的配列よりなる群 から選ばれる配列を含むオリゴヌクレオチドと安定な二重らせんを形成しうる（ これは、配列番号１に示す配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に示 す配列を有するポリヌクレオチドとは該オリゴヌクレオチドが安定な二重らせん を形成しうるが配列番号23〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドと はそれを形成しない条件下で生じる）単離されたポリヌクレオチド。 ・前実施態様に記載のポリヌクレオチド内にコードされる少なくとも11アミノ 酸、好ましくは少なくとも12アミノ酸、より好ましくは少なくとも15アミノ酸の 線状配列を含んでなる単離されたポリペプチド。 ・ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、該個体から得た生 物学的サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを、本発明で具体化される方法 により検出することを含んでなる前記方法。また、ヘルペスウイルスによる個体 の感染の検出方法であって、該個体から得た生物学的サンプル中のウイルスＤＮ ＡまたはＲＮＡを検出することを含んでなり、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検 出を、a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、本発明のポリヌクレオチドを 含むプローブと接触させ（これは、配列番号１、３、116または118よりなる群か ら選ばれる少なくとも１つの配列を有するポリヌクレオチドとは該プローブが安 定な二重らせんを形成するのを許容するが配列番号24〜29のいずれかの配列を有 するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下で行なう）、そしてb）工程a ）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出することを含む方法により行 なうことを特徴とする前記方法も含まれる。また、ヘルペスウイルスによる個体 の感染の検出方法であって、該個体から得た生物学的サンプル中のウイルスＤＮ ＡまたはＲＮＡを検出することを含んでなり、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検 出を、a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、本発明に記載のポリヌクレオ チドを含むプローブと接触させ（これは、配列番号116に示す配列を有するポリ ヌクレオチドとは該プローブが安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列 番号24〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条 件下で行なう）、そしてb）工程a）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を 検出することを含む方法により行なうことを特徴とする前記方法も含まれる。 ・適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中のヘルペスウイルス ポリヌクレオチドを検出するための診断キットであって、該試薬が本発明のポリ ヌクレオチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 ・適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中のヘルペスウイルス ポリヌクレオチドを検出するための診断キットであって、該試薬が本発明のオリ ゴヌクレオチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 ・ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、安定な抗原−抗体 複合体の形成を許容する条件下、該個体から得たサンプルからの抗体を本発明の ポリペプチドと接触させ、そして形成した前記の安定な複合体の有無を検出する 工程を含んでなる前記方法。 ・適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中に存在する抗ヘルペ スウイルス抗体を検出するための診断キットであって、該試薬が本発明のポリペ プチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 ・ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、安定な抗原−抗体 複合体の形成を許容する条件下、該個体から得たサンプルからの抗体を本発明の ポリペプチドと接触させ、そして形成した前記の安定な複合体の有無を検出する 工程を含んでなる前記方法。 ・適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中に存在する抗ヘルペ スウイルス抗体を検出するための診断キットであって、該試薬が本発明のポリペ プチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 ・ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、安定な抗原−抗体 複合体の形成を許容する条件下、該個体から得たサンプルからのポリペプチドを 本発明の抗体と接触させ、そして形成した前記の安定な複合体の有無を検出する 工程を含んでなる前記方法。 ・適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中に存在するヘルペス ウイルスポリペプチドを検出するための診断キットであって、該試薬が本発明の 抗体を含むことを特徴とする前記診断キット。 ・本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を含んでなる、ヘルペ スウイルス感染症の治療に使用するための組成物。 ・医薬候補がガンマヘルペス感染症の治療に有用であるか否かを決定する方法 であって、本発明のペプチドを該医薬候補と接触させ、そして該ポリペプチドの 生化学的機能が、該医薬候補により改変されるか否かを決定する工程を含んでな る前記方法。決定される該ポリペプチドの生化学的機能は、核酸に対する該ポリ ペプチドの結合性、またはＤＮＡポリメラーゼ活性であってもよい。 ・医薬候補がガンマヘルペス感染症の治療に有用であるか否かを決定する方法 であって、本発明のポリヌクレオチドを用いて細胞を遺伝的に改変し、そして該 細胞に対する該医薬候補の効果を、該ポリヌクレオチドで遺伝的に改変されてい ない細胞と比較して決定する工程を含んでなる前記方法。 ・ヘルペスウイルスに感染した個体を治療するのに使用する化合物の製造法で あって、核酸との相互作用に関与する本発明のポリペプチドの領域に結合しうる 化合物を作製し、該化合物が、該ポリペプチドの生化学的機能を阻害するか否か を決定する工程を含んでなる前記製造法。図面の簡単な説明 図１は、RFHVおよびKSHVの領域をコードするＤＮＡポリメラーゼから増幅され たポリヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチドを示す。プライマーDF ASAとGDTD1Bとの間の各ポリヌクレオチドの475塩基の断片に下線を付している。 また、増幅プライマーとして有用なオリゴヌクレオチドを小文字で示し、それに ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の対応領域を整列させている。DFASA、VYGAおよびGDT DIBは、任意のヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を増幅するのに使用 することができるコンセンサスおよび縮重セグメントを有するオリゴヌクレオチ ドである。LSGGA、CTDPA、PCLNA、KMLEAおよびGISPAは、ヘルペスウイルスのRFH V/KSHVサブファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドである。VASGA、ILPCA、PI EABおよびPEARBはRFHV特異的プライマーである。SGILA、CLNIA、IEASBおよびEAR FBはKSHV特異的プライマーである。コード配列の方向に増幅を開始するオリゴヌ クレオチド（「Ａ」で終わる表示を有するもの）は、5'→3'で記載されている。 コード配列の逆方向に増幅を開始するオリゴヌクレオチド（「Ｂ」で終わる表示 を有するもの）は、RFHVおよびKSHVポリヌクレオチドの対応配列との整列を示す ために、3'→5'で記載されている。 図２は、種の間で比較的保存されている領域を示す他のヘルペスウイルスＤＮ Ａポリメラーゼの既に公知のポリペプチド配列を示す。 図３は、保存されている領域２付近のヘルペスウイルスの既に公知のポリヌク レオチド配列を示し、オリゴヌクレオチドDFASAおよびDFQSA（それらの設計のも ととなった配列を有する）を整列させて示す。 図４は、保存されている領域３付近のヘルペスウイルスの既に公知のポリヌク レオチド配列を示し、オリゴヌクレオチドVYGA、VYGCAおよびVYGSQA（それらの 設計のもととなった配列を有する）を整列させて示す。 図５は、保存されている領域１付近のヘルペスウイルスの既に公知のポリヌク レオチド配列を示し、オリゴヌクレオチドGDTD1BおよびGDTDSQB（それらの設計 のもととなった配列を有する）を整列させて示す。 図６は、ガンマヘルペスウイルスサブファミリーのＤＮＡポリメラーゼのポリ ヌクレオチド配列の比較を示す。示されている断片は、DFASAおよびGDTD1Bのハ イブリダイズ部位の間の475塩基対である。 図７は、図６と同じウイルスの同じ断片のＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド 配列の比較を示す。また、この図は、可能な抗体結合領域（RFHV、KSHVまたはRF HV/KSHVサブファミリーに特異的なものを含む）の具体例を示す。 図８は、DFASAとGDTDIBとの間にコードされる断片のポリペプチド配列の、よ り広い範囲のヘルペスウイルスの間での比較である。配列は、アルファ、ベータ およびガンマサブファミリーのヘルペスウイルスおよび内因性哺乳動物ＤＮＡポ リメラーゼについて示されている。 図９は、図８に示すポリペプチド配列に基づくＤＮＡポリメラーゼの関係地図 である。 図10は、ガンマヘルペスウイルスサブファミリーのメンバーの、図６と同じ領 域のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を示す。この図は、オリゴヌクレオチドLSGGA、C TDPA、PCLNA、KMLEAおよびGISPAを整列させて、それらの設計のもととなった配 列と並べて示す。これらのオリゴヌクレオチドは、RFHV/KSHVウイルスサブファ ミリーからのＤＮＡポリメラーゼに特異的である。 図11は、VYGAとGDTD1Bとの間にコードされるRFHVのポリペプチド断片のHopp-W oods抗原性プロットである。下部に示されているのは、該配列中の疎水性および 抗原性の残基の領域である。 図12は、DFASAとGDTD1Bとの間にコードされるKSHVのポリペプチド断片のHopp- Woods抗原性プロットである。下部に示されているのは、該配列中の疎水性およ び抗原性の残基の領域である。 図13は、約3000ヌクレオチド長と推定されるKSHVのＤＮＡポリメラーゼコード 配列の約2511ヌクレオチド、およびアミノ酸翻訳を示す。図１に示すPCRセグメ ントからの5'および3'方向の追加的な配列データが提供されている。 図14は、KSHVＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の一部と他のヘルペスウイルス のものとの比較を示す。アステリスク（*）および黒丸（・）は、保存されている 残基または同類置換を示す。矢印（↑）は、他のヘルペスウイルスの間では保存 されているがKSHV配列では異なる残基を示す。 図15は、KSHVＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の公知変異体を示す。 図16は、RFHVMm（この図ではRFMmと称される）のＤＮＡポリメラーゼコード領 域から増幅されたポリヌクレオチド配列を示す。RFHVMmは、本発明の基準により 同定されたRFHV/KSHVヘルペスウイルスサブファミリーの第３のメンバーである 。比較のために、RFHV（RFMnと称される）およびKSHVのＤＮＡポリメラーゼコー ド領域を示す。 図17は、RFHVMmのＤＮＡポリメラーゼコード領域中にコードされるアミノ酸配 列と、RFHVMn、KSHVおよび他の３つのヘルペスウイルスの対応配列との比較を示 す。 図18は、図17のアミノ酸アライメントの統計的系統発生分析である。示されて いる数字は、100回の繰返しからのブートストラップ値である。 図19は、RFHV/KSHVサブファミリーのメンバーのＤＮＡポリメラーゼヌクレオ チド配列中の１型、２型および３型オリゴヌクレオチドプローブのおよそのハイ ブリダイズ位置を示す地図である。 図20は、ウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるネステッド増 幅アッセイにおける、エム・ネメストリナ（M．nemestrina）サル（レーンＡ〜 Ｄ、ＩおよびＪ）およびエム・ムラッタ（M．mulatta）サル（レーンＧおよびＨ ）でのRFHVMnおよびRFHVMmヘルペスウイルス配列の罹患率に関する代表的なスク リーニングである。発明を実施するための最良の形態 本発明者らは、ヘルペスウイルスのRFHV/KSHVサブファミリーの代表的メンバ ーであるRFHV、RFHV2およびKSHVからのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌ クレオチドを見出し特徴づけした。得られたポリヌクレオチド、関連ポリヌクレ オチドおよび対応するポリペプチドおよび抗体は、ヘルペスウイルス感染症およ び関連状態の診断、臨床的監視および治療において有用である。 RFHVおよびKSHVからのポリヌクレオチドの起源は、それぞれ腹膜後繊維腫症（ 「RF」）のマカク・ネメストリナ（Macaque nemestrina）サルおよびカポジ肉 腫（「KS」）のヒトから採取した罹患組織サンプルである。本発明者らは、これ らの状態が、いずれかの同時発生的免疫不全の原因ウイルスと異なるウイルスに 関連していると予想した。本発明者らは、RFおよびKS関連ウイルスが関連してい ることを、前もって知らなかった。 本発明者らは、両方の状態に関連しているウイルスがヘルペスウイルスファミ リーのメンバーであるという前提を確かめることにした。したがって、本発明者 らは、広範囲のヘルペスウイルスからのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌ クレオチドを得るための増幅反応で使用するオリゴヌクレオチドを設計した。既 に記載されているヘルペスウイルスのアミノ酸配列を比較することにより、３つ の保存領域を同定した。対応する公知ポリヌクレオチド配列を用いて、縮重セグ メントおよびコンセンサスセグメントを含むオリゴヌクレオチドを構築した。こ れらのオリゴヌクレオチドを、その２つの組織起源のそれぞれからのＤＮＡポリ メラーゼコードセグメントの断片を与える増幅反応でプライマーとして使用した 。 増幅反応の最終工程から得られたポリヌクレオチド断片の配列を図１に示す（ それぞれ配列番号１および配列番号３）。両配列は、他のヘルペスウイルスから のＤＮＡポリメラーゼ配列の領域に対して高度に相同な領域を含有するが、新規 である。エム・ネメストリナ（M．nemestrina）サルに感染するウイルスを、「 腹膜後繊維腫症ヘルペスウイルス」（「RFHV」）と称することにした。ヒト患者 に感染するウイルスを、「カポジ肉腫ヘルペスウイルス」（「KSHV」）と称する ことにした。示されているポリヌクレオチド配列は、この増幅で用いたDFASAお よびGDTDIBプライマーのハイブリダイズ領域に対応するセグメントを各末端に含 む。それらのプライマー間の475塩基対断片は、RFHVおよびKSHVのＤＮＡポリメ ラーゼ遺伝子の増幅された部分を表す。 それらのプライマーは広範囲のＤＮＡポリメラーゼを増幅するよう設計されて いたため、本発明者らは、これらの２つのＤＮＡポリメラーゼ配列が互いに、他 のあらゆる公知ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼより、見掛け上密接に関連 している（ヌクレオチトルベルで71％の同一性）ことを見出して驚いた。２番目 に密接に関連しているポリヌクレオチド配列は、ウマヘルペスウイルス２（eHV2 ）、リスザルヘルペスウイルス１（sHV1）およびエプスタインバーウイルス（EB V）からのものである。したがって、本発明者らは、RFHVおよびKSHVが共に、ヘ ルペスガンマサブファミリーのメンバーであると予想している。RFHVおよびKSHV は、異常な細胞性増殖または繊維症性増殖との関連性、および免疫異常（例えば 、免疫抑制およびＢ細胞形成異常）との関連性を、他のガンマヘルペスと共有し ている。しかしながら、RFHVおよびKSHVＤＮＡポリメラーゼ配列は、sHV1および EBVとはCpGジヌクレオチドの頻度の点で異なる。RFHVおよびKSHVＤＮＡポリメラ ーゼヌクレオチド配列およびそれに基づくオリゴヌクレオチドは、RFHV/KSHVサ ブファミリーを後記のとおり定義する。エム・ムラッタ（M．mulatta）サルに感 染するサブファミリーの第３のメンバー（RFHV2）のＤＮＡポリメラーゼ配列も 提供する。 ＤＮＡポリメラーゼ間の保存度は、本発明で具体化するポリヌクレオチドおよ びポリペプチドが、RFHVおよびKSHVの種々の株の間の信頼しうるマーカーである ことを意味する。それは隔離抗原であるため、ＤＮＡポリメラーゼは、逸脱突然 変異体（escape mutant）を形成する同程度の免疫学的圧力下には置かれていな い。さらに、これらの配列は、ＤＮＡポリメラーゼの触媒活性においてこれらの 領域が果たしている決定的な役割により制約される。したがって、本発明で具体 化するポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、RFHV、KSHVまたは同じサ ブファミリーの他のヘルペスウイルスによる個体のウイルス感染の検出などの用 途で有用である。また、本発明の実施態様は、ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラ ーゼの特徴づけおよび薬物療法の設計において有用である。 該ＤＮＡポリメラーゼは、ウイルス複製において重要な役割を果たしているた め、それは、薬理学的介入のための適当な標的である。その分子の特に感受性の 領域は、基質認識、鋳型結合、触媒および調節サブユニットとの結合に関与する 領域である。 RFHV/KSHVサブファミリーのポリヌクレオチド、関連するオリゴヌクレオチド プローブおよびプライマー、関連するポリペプチドおよび抗原、関連する特異的 抗体、これらの化合物の製造および用途、および関連する方法および産物は、以 下の節でより詳しく説明する。 略語 本発明では、ヘルペスウイルスの種、およびＤＮＡポリメラーゼをコードする それに由来するポリヌクレオチドおよび遺伝子を表すために、以下の略語を使用 する。 定義 「RFHV」および「KSHV」は、それぞれ、感染したマカク・ネメストリナ（maca que nemestrina）サルおよびヒトの組織サンプルで検出されるヘルペスファミリ ーウイルスである。これらのウイルスに感染した細胞は、本明細書に記載するそ れぞれのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する。「RFHV 」は、「RFHV1」、「RFHVMn」および「RFMn」なる語と同義である。RFHV/KSHVサ ブファミリーの第３のメンバーは、エム・ムラッタ（M．mulatta）サルで同定さ れたウイルスである。本発明では、このウイルスを「RFHV2」と称する。「RFHV2 」は、「RFHVMm」および「RFMm」なる語と同義である。 「RFHV/KSHVサブファミリー」は、脊椎動物種に感染しうるヘルペスウイルス を総称するために本発明で用いる用語である。このサブファミリーは、RFHVまた はKSHVの対応配列と密接に関連した配列を有するメンバーよりなり、その関連性 は、これらのウイルスと表１に記載の他のあらゆるウイルスとの関連性より密接 である。配列の比較は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれのレベル で行なってもよく、もとの遺伝子またはタンパク質との間、またはそれらの断片 との間で行なってもよい。該サブファミリーは本発明で用いられる場合には、RF HVまたはKSHVの対応領域に対する同一性が、これらのいずれかのウイルスと表１ のウイルスとの同一性より高いＤＮＡポリメラーゼコードポリヌクレオチドの一 部を含有するヘルペスウイルスを意味する。好ましくは、該ポリメラーゼをコー ドするポリヌクレオチドは、残基27〜501で、RFHV（配列番号１）またはKSHV（ 配列番号３）に対して少なくとも69％の同一性、またはオリゴヌクレオチドLSGG Aに対して少なくとも80％の同一性、またはオリゴヌクレオチドCTDPAに対して少 なくとも69％の同一性、またはオリゴヌクレオチドKMLEAに対して少なくとも8０ ％の同一性、オリゴヌクレオチドGISPAに対して少なくとも69％の同一性を有す るセグメントを含む。 本発明で用いる「ＤＮＡポリメラーゼ」は、鋳型として使用するポリヌクレオ チドに相捕的な配列とＤＮＡポリヌクレオチドとの集合を適当な条件下で触媒し うるタンパク質またはタンパク質類似体である。また、ＤＮＡポリメラーゼは、 3'−5'エキソヌクレアーゼ活性などの他の触媒活性を有することがあり、それら の活性のいずれかが優勢となりうる。ＤＮＡポリメラーゼは、その触媒機能を発 揮するために追加的なタンパク質または補因子との結合を必要とすることがある 。「ＤＮＡポリメラーゼ活性」は、ＤＮＡポリヌクレオチドの集合に向けられた 触媒活性を意味する。「ＤＮＡポリメラーゼ反応」は、基質、補因子および調節 サブユニットの結合、中間体の形成、および反応生成物の形成を含む、ヌクレオ チドの重合への経路上の反応機構における任意の工程である。 「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」なる語は、ＤＮＡポリメラーゼ反応が可能なポ リペプチドをコードする任意の遺伝子を包含する。それはまた、ＤＮＡポリメラ ーゼをコード化ていた祖先遺伝子に由来すると考えられる（これは、他のＤＮＡ ポリメラーゼ遺伝子との相同性または隣接遺伝子に対するその位置に基づくもの である）任意の遺伝子を包含し、そのような遺伝子は、非機能性ＤＮＡポリメラ ーゼ類似体、ＤＮＡポリメラーゼ断片または突然変異体をコードしていることが あり、あるいは、それは転写されなかったり、翻訳されなかったりすることがあ る。 ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第１ポリペプチドに対する「調節サブユニッ ト」は、第１ポリペプチドに結合してそのＤＮＡポリメラーゼ活性を調節する第 ２ポリペプチドである。UL42は、調節サブユニットの一例である。 「UL42」または「UL42サブユニット」は、いくつかのヘルペスウイルスのゲノ ム内でコードされる補助タンパク質である。それは、そのウイルスのＤＮＡポリ メラーゼと会合する能力を有する。ある条件下で、それは、ＤＮＡポリメラーゼ 遺伝子でコードされるポリペプチドのＤＮＡポリメラーゼ活性を増強し、そのウ イルスの複製に必要かもしれない。本発明で用いる定義は機能的なものであり、 対応する遺伝子の構造またはゲノム位置に左右されない。したがって、RFHVまた はKSHVのUL42サブユニットは、他のウイルスのUL42サブユニットと実質的に同一 でない配列を有することがある。 「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる語は、互換的に使用 され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれ らの類似体の任意のヌクレオチド長の重合形態を意味する。ポリヌクレオチドは 、任意の三次元構造を有していてもよく、公知または未知の任意の機能を発揮し てもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な具体例として、以下のものが挙げられ る：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポ リヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の 単離されたＤＮＡ、任意配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライ マー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体な どの修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチドの構造に対する 修飾が存在する場合、それは、該ポリマーの集合の前または後に付与されうる。 ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により分断されていてもよい。重合 後に、標識成分との結合などにより、ポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい 。 本発明で用いるポリヌクレオチドなる語は、互換的に一本鎖分子および二本鎖 分子を意味する。特に明示または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本 明細書に記載の本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態、および該二本鎖形態を 形成することが公知であるか予想される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれを 包含する。 ポリヌクレオチドの場合、「線状配列」または「配列」は、5'から3'への方向 のポリヌクレオチドのヌクレオチドの並びであり、この場合、配列内で互いに隣 接する残基は、そのポリヌクレオチドの一次構造において隣接している。「部分 配列」は、一方または両方の方向で追加的な残基を含むことが公知のポリヌクレ オチドの一部の線状配列である。 「ハイブリダイゼーション」は、１以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌク レオチド残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成する反応を意 味する。水素結合は、ワトソン・クリック型塩基対合、フーグスティーン型塩基 対合、または他の任意の配列特異的態様により生じうる。その複合体は、二重ら せん構造を形成する２本鎖、多鎖複合体を形成する３本以上の鎖、自己ハイブリ ダイズする一本鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。ハイ ブリダイゼーション反応は、PCRの開始、またはリボザイムによるポリヌクレオ チドの酵素的切断などの、より多種多様な方法の工程を構成することがある。 ハイブリダイゼーション反応は、種々の「ストリンジェンシー」の条件下で行 なうことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加さ せる条件は、当該分野において広く知られており、公開されている。例えば、Sa mbrook FritschおよびManiatisを参照されたし。適切な条件（ストリンジェンシ ーを増加させるためのもの）には、例えば、25℃、37℃、50℃および68℃のイン キュベーション温度；10×SSC、６×SSC、１×SSC、0.1×SSC（SSCは、0.15M Na Clおよび15mMクエン酸緩衝液である）の緩衝液濃度および他の緩衝系を用いるそ れらの等価物；０％、25％、50％および75％のホルムアミド濃度；５分〜24時間 のインキュベーション時間；および洗浄の持続時間の増加、頻度の増加または緩 衝液濃度の減少が含まれる。 「Tm」は、ワトソン・クリック塩基対合により逆平行方向に水素結合した相補 鎖よりなるポリヌクレオチド二重らせんの50％が実験条件下で一本鎖に解離する 摂氏の温度である。Tmは、標準的な式、例えば、 Tm＝81.5＋16.6log[Na⁺]+0.41(%G/C)−0.61(％F)−600/L ［式中、Na⁺はmol/L単位のカチオン（通常はナトリウムイオン）濃度であり、(% G/C)は二重らせん中の全残基の割合(％)としてのGおよびC残基の数であり、(％F )は溶液中のホルムアミドの割合(％)(wt/vol)であり、Lは二重らせんの各鎖内の ヌクレオチド数である］により予想することができる。 ポリヌクレオチドの「安定な二重らせん」または生化学的反応において任意の ２以上の成分の間で形成される「安定な複合体」は、該二重らせんまたは複合体 の形成およびそれに続く検出の間に十分に持続する程度に長く維持される二重ら せんまたは複合体を意味する。該二重らせんまたは複合体は、形成の時点または 検出の時点の間に存在または導入されいかなる条件（これらの条件は、行われて いるアッセイまたは反応と相関する）にも抵抗しうるものでなければならない。 所望により存在してもよく二重らせんまたは複合体を除去しうる介在条件には、 洗浄、加熱、反応混合物への追加的な溶質（例えば変性剤）または溶媒の添加、 および追加的な反応種との競合が含まれる。安定な二重らせんまたは複合体は、 不可逆的であっても可逆的であってもよいが、この定義の残りの条件を満足しな ければならない。したがって、反応混合物中で、一時的な複合体が生じてもよい が、それが自発的に、または新たに課された条件または検出前に導入される操作 の結果として解離する場合には、それは安定な複合体を構成しない。 ２つの二本鎖ポリヌクレオチドの間で、逆平行の立体配置の安定な二重らせん が形成されている場合（特に、高いストリンジェンシーの条件下）、そのような 鎖は、実質的に「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドか、もう１つのポリ ヌクレオチドと「相補的」となりうるのは、第１ポリヌクレオチドの鎖の１つと 第２のものとの間で安定な二重らせんが形成されうる場合である。一本鎖のポリ ヌクレオチドの配列から予想される相補的配列は、一般的に受け入れられている 塩基対合則により一本鎖ポリヌクレオチドと水素結合を形成すると予想される標 準的なヌクレオチドの最適な配列である。 「センス」鎖および「アンチセンス」鎖は、それらが同じ文脈で用いられる場 合には、互いに相補的である一本鎖ポリヌクレオチドを意味する。それらは、二 本鎖ポリヌクレオチドの対抗鎖であってもよく、一般的に受け入れられている塩 基対合則に従い、一方の鎖を他方の鎖から予想することができる。特に明示また は暗示しない限り、一方または他方の鎖の、「センス」または「アンチセンス」 としての割り当ては、任意のものである。 ヌクレオチドの線状配列が、もう一方の線状配列と「同一」となるのは、各鎖 内のヌクレオチドの順序が同じであり、置換、欠失または実質的な置換を伴わず に出現している場合である。同様の構造を有する含窒素塩基であるプリンおよび ピリミジンは、ワトソン・クリック型塩基対合の点で機能的に同等であり、含窒 素塩基（特にウラシルおよびチミン）などの相互置換、または含窒素塩基の修飾 （例えば、メチル化）は、実質的な置換を構成しないと理解される。ＲＮＡおよ びＤＮＡポリヌクレオチドが同一の配列を有するのは、ＲＮＡの配列がポリリボ ヌクレオチド内の含窒素塩基の順序を表し、ＤＮＡの配列がポリデオキシリボヌ クレオチド内の含窒素塩基の順序を表し、その２つの配列がこの定義の残りの要 件を満足する場合である。少なくとも１つの配列が、１つの塩基に拘束されない 残基を含む縮重オリゴヌクレオチドである場合、縮重オリゴヌクレオチドの代替 形態の少なくとも１つが、比較している配列と同一であれば、その２つの配列は 同一である。例えば、AYAAAがATAAAとACAAAとの混合物であれば、AYAAAはATAAA と同一である。 比較をポリヌクレオチド間で行なう場合、相補鎖が容易に生じ、比較している ポリヌクレオチド間の同一性を最大にするセンスまたはアンチセンス鎖が選択ま たは予想されると暗黙のうちに理解される。例えば、比較するポリヌクレオチド の一方または両方が二本鎖である場合、第１ポリヌクレオチドの一方の鎖が第２ ポリヌクレオチドの一方の鎖と同一であれば、それらの配列は同一である。同様 に、ポリヌクレオチドプローブがその標的と同一として記載されている場合、そ れは、該プローブと該標的との間のハイブリダイゼーション反応に関与する標的 の相補鎖であると理解される。 ヌクレオチドの線状配列がもう１つの線状配列と「実質的に同一」となるのは 、 両方の配列が、同じ相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重らせんを 形成しうる場合である。より大きなストリンジェンシーの条件下でハイブリダイ ズする配列がより好ましい。ハイブリダイゼーション反応は、ヌクレオチド配列 内の挿入、欠失および置換を受け入れうると理解される。したがって、ヌクレオ チドの線状配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応または一致 していない場合であっても、それらは実質的に同一となりうる。本発明において は、本発明により密接に対応または一致する配列が、比較的により好ましい。一 般に、約25残基のポリヌクレオチド領域が、もう１つの領域と実質的に同一とな るのは、それらの配列が、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、よ り好ましくは少なくとも約95％、より一層好ましくは100％同一である場合であ る。40残基以上のポリヌクレオチド領域が、もう１つの領域と実質的に同一とな るのは、相同部分のアライメントをとった後、それらの配列が少なくとも約75％ 、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも85％、さらに好まし くは少なくとも約90％、より一層好ましくは100％同一である場合であろう。 ポリヌクレオチド配列が実質的に同一であるか否かを判定する場合、比較対象 のポリヌクレオチドの機能を維持する配列が特に好ましい。機能は、種々のパラ メーターにより判定することができる。例えば、もう１つのポリヌクレオチドと のハイブリダイゼーションを含む反応でポリヌクレオチドを使用する場合、好ま しい配列は、同じ標的と同様の条件下でハイブリダイズしうる配列である。一般 に、ＤＮＡの二重らせんのTmは、ミスマッチ残基の位置に応じて、配列同一性が １％減少する毎に、200残基以上の二重らせんの場合には約１℃、40残基未満の 二重らせんの場合には約５℃低下する（例えば、Meinkothらを参照されたし）。 約100残基の実質的に同一な配列は、一般に、互いの各相補配列とTmより約20℃ 低い温度、好ましくは約15℃低い温度、より好ましくは約10℃低い温度、さらに 好ましくは約５℃低い温度、より一層好ましくはおよそTmで安定な二重らせんを 形成するであろう。もう１つの具体例において、ポリヌクレオチドでコードされ るポリペプチドが、その機能の重要な部分である場合は、好ましい配列は、同一 または実質的に同一なポリペプチドをコードする配列である。したがって、同類 アミノ酸置換を引き起こすヌクレオチドの相違が、非同類置換を引き起こすもの より好ましく、アミノ酸配列を改変しないヌクレオチドの相違がより好ましく、 同一のヌクレオチドがより一層好ましい。ポリペプチド内の挿入または欠失を引 き起こすポリヌクレオチド内の挿入または欠失が、同調しなくなっている下流の コード領域を与えるものがより好ましく、挿入または欠失を含まないポリヌクレ オチド配列がより一層好ましい。ハイブリダイゼーション特性の相対的な重要性 およびポリヌクレオチドのコード化ポリペプチド配列は、本発明の用途に左右さ れる。 あるポリヌクレオチドか、もう１つのポリヌクレオチドと同じ「特徴」を有す るのは、その両方が、ストリンジェンシーが最大となる同様の条件下で特定の第 ３のポリヌクレオチドと安定な二重らせんを形成しうる場合である。好ましくは 、同様のハイブリダイゼーション特性に加え、該ポリヌクレオチドは実質的に同 一なポリペプチドをもコードする。 ポリヌクレオチド配列の「保存」されている残基は、比較する２以上の関連し ている配列の同じ位置で、改変されずに存在する残基である。比較的保存されて いる残基は、それらの配列内の他の位置に出現する残基より関連のある配列の間 で保存されている残基である。 「関連」しているポリヌクレオチドは、同一な残基の有意な割合を共有してい るポリヌクレオチドである。 本発明で用いる「縮重」オリゴヌクレオチド配列は、以下のとおり、少なくと も２つの関連している起源ポリヌクレオチド配列に由来する設計された配列であ る。起源配列内で保存されている残基は、縮重配列内で保持されており、一方、 起源配列内で保存されていない残基は、縮重配列内でいくつかの代替物として与 えられうる。例えば、縮重配列AYASAは、起源配列ATACAおよびACAGA（式中、Yは CまたはT、およびSはCまたはGである）から設計することができる。YおよびSは 、「１つの塩基に拘束されない（アンビギュアスな）」残基の例である。縮重セ グメントは、縮重配列を含有するポリヌクレオチドのセグメントである。 縮重配列を含む合成オリゴヌクレオチドは、実際には、アンビギュアスな位置 を除き同一の配列を共有する密接に関連しているオリゴヌクレオチドの混合物で あると理解される。そのようなオリゴヌクレオチドは、通常、アンビギュアスな 位置のヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせの混合物として合成される。該 混合物中の各オリゴヌクレオチドは、「代替形態」と称される。該混合物中の形 態の数は、 （式中、ｋ_iは、各位置で許容される別のヌクレオチドの数である）に等しい。 本発明で用いる「コンセンサス」オリゴヌクレオチド配列は、以下のとおり、 少なくとも２つの関連している起源ポリヌクレオチド配列に由来する設計された 配列である。すべての起源配列内で保存されている残基は、コンセンサス配列内 で保持されるが、残基が保存されていない位置では、該起源配列からもう１つの 残基が選ばれる。一般に、選はれるヌクレオチドは、起源配列内で最大頻度で出 現するヌクレオチドである。例えば、コンセンサス配列AAAAAは、起源配列CAAAA 、AAGAAおよびAAAATから設計することができる。コンセンサスセグメントは、コ ンセンサス配列を含有するポリヌクレオチドである。 本発明で用いるポリヌクレオチドの「断片」または「挿入断片」は、完全長形 態のサブ領域を表すが、完全長ポリヌクレオチドの全体を含むこともある。 異なるポリヌクレオチドが、互いに「対応」するのは、一方が最終的にもう一 方から由来している場合である。例えば、メッセンジャーＲＮＡは、それが転写 される遺伝子に対応する。ｃＤＮＡは、逆転写反応またはＲＮＡ配列の知見に基 づくＤＮＡの化学合成などによりそれが産生される基礎になったＲＮＡに対応す る。また、ｃＤＮＡは、ＲＮＡをコードする遺伝子に対応する。また、ポリヌク レオチドが互いに対応するのは、それらが、比較する異なる種、株または変異体 において同様の機能（例えば、関連ポリペプチドのコード化）を発揮する場合で ある。 ポリヌクレオチド操作に関して用いる「プローブ」は、関心のあるサンプル中 に潜在的に存在する標的とハイブリダイズさせることにより該標的を検出するた めの試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを意味する。通常、プローブは標 識を含むか、あるいは、そのハイブリダイゼーション反応の前または後のいずれ かにおいて標識を結合しうる手段を含むであろう。適当な標識には、放射性同位 体、蛍光色素、化学発光化合物、染料およびタンパク質、例えば酵素が含まれる が、これらに限定されるものではない。 「プライマー」は、一般的には、遊離3'−OH基を有するオリゴヌクレオチドで あって、関心のあるサンプル中に潜在的に存在する標的とハイブリダイズするこ とにより該標的に結合し、ついで該標的と相補的なポリヌクレオチドの重合を促 進するオリゴヌクレオチドである。 同じポリヌクレチドの複製コピーを産生させる方法（例えば、PCRまたは遺伝 子クローニング）を、本発明では、「増幅」または「複製」と総称する。例えば 、同じ配列を有するもう１つのＤＮＡを形成させるために、一本鎖または二本鎖 ＤＮＡを複製することができる。ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ ラーゼにより、あるいはＤＮＡを逆転写し、ついでＰＣＲを行なうことにより複 製することができる。後者の場合、増幅されたＲＮＡのコピーは、同じ配列を有 するＤＮＡである。 「ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）」は、１以上のプライマーおよび重合触媒（ 例えば、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ、および特に耐熱性ポリメラーゼ 酵素）を用いて、複製コピーを標的ポリヌクレオチドから作製する反応である。 一般には、PCRは、以下の３工程の繰り返しを含む：増幅すべきポリヌクレオチ ドとオリゴヌクレオチドプライマーとが二重らせんを形成しうるよう温度を調節 する「アニーリング」、二重らせんを形成したポリヌクレオチドを鋳型として用 いて、二重らせんを形成したオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼで伸長す るよう温度を調節する「伸長」、およびそのポリヌクレオチドおよび伸長したオ リゴヌクレオチドが解離するよう温度を調節する「融解」。ついで、所望量の増 幅ポリヌクレオチドが得られるまで、そのサイクルを繰り返す。PCRの方法は、 米国特許第4,683,195号（Mullis）および4,683,202号（Mullisら）に記載されて いる。 遺伝子内の要素には、プロモーター領域、エンハンサー領域、レプレッサー結 合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、タンパク質コード 領域、イントロンおよびエキソン、および転写および翻訳の終結部位が含まれる が、これらに限定されるものではない。 「制御要素」または「制御配列」は、複製、重複、転写、スプライシング、翻 訳またはポリヌクレオチドの分解などのポリヌクレオチドの機能的調節に寄与す る分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。その調節は、その過程の 頻度、速度または特異性に影響を及ぼすことがあり、本質的に促進的であっても 抑制的であってもよい。制御要素は、当該分野で公知である。例えば、「プロモ ーター」は、制御要素の一例である。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリ メラーゼに結合し、該プロモーターの下流（3'方向）に位置するコード領域の転 写を開始しうるＤＮＡ領域である。 「作動可能的に結合している」は、遺伝的要素の配置であって、該要素が予想 どおりに作動しうる関係にある配置を意味する，っ例えば、プロモーターがコー ド配列の転写開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動可能的に結合 している。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間 に介在残基が存在していてもよい。 「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる語は、本発明では 、任意の長さのアミノ酸のポリマーを表すために互換的に使用する。ポリマーは 、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいても よく、非アミノ酸で分断されていてもよい。また、これらの語は、例えば、ジス ルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識 成分との結合などの他の任意の操作により修飾されているアミノ酸ポリマーをも 包含する。 ポリペプチドの場合、「線状配列」または「配列」は、Ｎ末端からＣ末端への 方向のポリペプチド内のアミノ酸の並びであり、この場合、配列内で互いに隣接 する残基は、そのポリペプチドの一次構造において隣接している。「部分配列」 は、一方向または両方向に追加的残基を含むことが公知のポリペプチドの一部の 線状配列である。 アミノ酸の線状配列がもう１つの線状配列と「実質的に同一」であるのは、そ の２つの配列が実質的な配列同一性を有する場合である。タンパク質のフォール ディングおよび生化学的機能は、アミノ酸配列内の挿入、欠失および置換を受け 入れうると理解される。したがって、アミノ酸の線状配列は、たとえヌクレオチ ド残基のいくつかが正確に対応または一致していない場合であっても、実質的に 同一である。本発明においては、本発明により密接に対応または一致する配列が 、より好ましい。また、いくつかのアミノ酸の置換は、より容易に許容されると 理解される。例えば、疎水性側鎖、芳香族側鎖、極性側鎖、正または負の電荷を 有する側鎖、または２以下の炭素原子を含む側鎖を有するアミノ酸が、同様の特 性の側鎖を有する別のアミノ酸により置換されていても、その２つの配列の実質 的な同一性を妨げるものではない。相同領域を決定し、相同性を算出する方法は 、当該分野でよく知られている。例えば、AltschulらおよびHenikoffらを参照さ れたし。十分に許容される配列の相違は、「同類置換」と称される。したがって 、同類置換を有する配列は、同し位置で他の置換を有する配列より好ましく、同 じ位置に同一の残基を有する配列が、より一層好ましい。一般に、約25残基のポ リペプチド領域が、もう１つの領域と実質的に同一となるのは、それらの配列が 、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも 約90％、さらに好ましくは少なくとも95％、より一層好ましくは100％同一であ る場合である。40残基以上のポリペプチド領域が、もう１つの領域と実質的に同 一となるのは、相同部分のアライメントをとった後、それらの配列が少なくとも 約70％同一である場合、好ましくは、それらが少なくとも約70％同一であり、同 一であるか同類置換のいずれかである少なくともさらに10％を含む場合、より好 ましくは、それらが少なくとも約80％同一であり、同一であるか同類置換のいず れかである少なくともさらに10％を含む場合、さらに好ましくは、それらが少な くとも約90％同一である場合、より一層好ましくは、それらの配列が100％同一 である場合である。 ポリペプチド配列が実質的に同一であるか否かを判定する場合、比較対象のポ リペプチドの機能を維持している配列が特に好ましい。機能は、種々のパラメー ター、例えば、酵素活性、基質−酵素または受容体−リガンド相互作用における 結合速度または親和性、抗体との結合親和性、およびＸ線結晶構造により判定す ることができる。 あるポリペプチドが、もう１つのポリペプチドと同じ「特徴」を有するのは、 それが、同じ生化学的機能（例えば、酵素活性、リガンド結合または抗体反応性 ）を示す場合である。ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ断片と関連 したポリペプチドの好ましい特徴は、ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ鋳型結合 性、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の結合性である。また、比較対象 のポリペプチドと同じ生化学的機能を示し、コンピューターでのモデル化により 予想したりＸ線結晶学により決定した場合に同様の三次元コンフォメーションを 有すると考えられるポリペプチドも好ましい。 ポリペプチドの「生化学的機能」または「生物活性」には、適当な実験調査に より検出可能なポリペプチドの任意の特徴が含まれる。「改変」された生化学的 機能は、例えば、分子量の測定、円二色性、抗体結合、示差分光法または核磁気 共鳴により検出可能なポリペプチドの一次、二次、三次または四次構造の変化を 意味することがある。それはまた、ある反応を触媒する能力または補因子、基質 、阻害剤、薬物、ハプテンまたは他のポリペプチドに結合する能力などの反応性 の変化を意味することもある。物質がこれらの任意の方法によりポリペプチドの 生化学的機能を変化させる場合、それは、ポリペプチドの生化学的機能を「阻害 」すると称されることがある。 「融合ポリペプチド」は、ある領域を配列内に、天然で見出されるものとは異 なる位置に含むポリペプチドである。その領域は、通常は、別々のタンパク質と して存在しうるが、融合ポリペプチドにおいては一緒になっている。あるいは、 通常は同じタンパク質内に存在しうるが、融合ポリペプチド内では新しい編成で 位置する。融合ポリペプチドは、例えば、化学合成により、あるいはペプチド領 域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチオドを作製し翻訳させること により作製することができる。 「抗体」（単数形および複数形で互換的に用いる）は、ポリペプチドなどの標 的に特異的に結合しうる免疫グロブリン分子であり、その結合は、該免疫グロブ リン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して生じる 。その用語は、本発明で用いる場合には、もとの抗体だけでなく、その断片、そ の突然変異体、融合タンパク質、ヒト化抗体、および要求される特異性の抗原認 識 部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾立体配置も包含する。 「免疫学的認識」または「免疫学的反応性」は、免疫グロブリンまたは関連分 子（例えば、Ｂ細胞受容体またはＴ細胞受容体）内の少なくとも１つの抗原認識 部位を介する、標的の特異的結合を意味する。 「抗原」なる語は、抗体が、その抗原認識部位を介して特異的に結合する標的 分子を意味する。抗原は、抗体の産生を刺激した免疫原と化学的に関連していて もよいが、必ずしもその必要はない。抗原は多価であってもよいし、あるいは一 価のハプテンであってもよい。抗体に認識されうる抗原の種類としては、例えば 、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、他の抗体分子、オリゴ糖、複合脂質、薬物 、化学物質などが挙げられる。 「免疫原」は、適当な宿主（通常は哺乳動物）に注入された場合に抗体産生を 刺激しうる抗原である。化合物を免疫原性にするのは、当該分野で公知の多数の 技術、例えば、結合価を増加させるための担体との架橋または結合、免疫応答を 増加させるためのマイトジェンとの混合、提示を増強するためのアジュバントと の合体により行なうことができる。 「ワクチン」は、特定の標的または標的群に対するある程度特異的な免疫学的 反応性を受容者に付与するために投与するヒトまたは動物用の医薬製剤である。 免疫学的反応性は、標的に対して免疫学的に反応性である抗体または細胞（特に Ｂ細胞、形質細胞、Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球、およびそれら の前駆体）、あるいはそれらの任意の組み合わせであってもよい。考えられる標 的としては、外来性または病因性化合物、例えは、外因性タンパク質、病原ウイ ルス、癌細胞により発現される抗原などが挙げられる。免疫学的反応性は、実験 目的、特定の状態の治療、特定の物質の除去または特定の状態または物質の予防 の場合に要求されるかもしれない。 「受動ワクチン」は、受容者の免疫応答の関与を要することなくその効果を発 揮するワクチンである。通常、それは、標的に対して反応性の抗体分子を含む。 抗体を、供与対象から得て、受容者に投与するのに十分な程度に精製してもよく 、あるいは、抗体は、例えば、ハイブリドーマ細胞の培養から、または抗体分子 をコードするポリヌクレオチドを遺伝子操作することによりインビトロで製造し て もよい。 「能動ワクチン」は、受容者内で特異的な免疫応答を惹起するために投与され 、標的に対する所望の免疫学的反応性を有するワクチンである。能動ワクチンは 、適当な免疫原を含む。望まれる免疫応答は、液性または細胞性、全身性または 分泌性、あるいはこれらの任意の組み合わせであってもよい。 「試薬」ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体は、反応のために提供さ れる、反応のためのいくつかの望ましい公知パラメーターを有する物資である。 また、反応混合物は、該試薬が反応しうるポリヌクレオチド、抗体、ポリペプチ ドなどの「標的」を含有していてもよい。例えば、いくつかの型の診断試験では 、サンプル中の標的の量は、試薬を加え、試薬と標的とを反応させ、反応生成物 の量を測定することにより測定することができる。臨床処置の場合、「標的」は 、細胞、細胞の集まり、または投与物質（例えば、医薬化合物）の対象器官であ ってもよい。 「単離」されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体または他 の物質は、該物質または同様の物質が天然に存在しているか又は最初に得られた 場合に存在する残りの成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物を意味する 。したがって、例えば、単離された物質は、起源混合物からそれを富化させる精 製技術を用いることにより調製することができる。富化度は、溶液の容量当たり の重量などの絶対的な基準に基づき測定することができるし、あるいは、それは 、起源混合物中に存在する第２の潜在的な阻害物質に関して測定することができ る。本発明の実施態様の富化度を増加させることが、より一層好ましい。したが って、例えば、２倍の富化が好ましく、10倍の富化がより好ましく、100倍の富 化がさらに好ましく、1000倍の富化がより一層好ましい。物質は、化学合成また は組換え発現などの人工的な集合方法により、単離された状態で得ることができ る。 反応で使用するポリヌクレオチド（例えば、ハイブリダイゼーション反応で使 用するプローブ、PCRで使用するプライマー、または医薬製剤中に存在するポリ ヌクレオチド）は、それが、意図される標的に対して、別の物質に対する場合よ り頻繁に、より迅速に、あるいはより長い持続時間でハイブリダイズまたは反応 する場合には、「特異的」または「選択的」であると称される。同様に、ポリペ プチドは、それが、意図される標的（例えば、リガンド、ハプテン、基質、抗体 または他のポリペプチド）に対して、別の物質に対する場合より頻繁に、より迅 速に、またはより長い持続時間で結合する場合には、「特異的」または「選択的 」であると称される。抗体は、それが、少なくとも１つの抗原認識部位を介して 、意図される標的に対して、別の物質に対する場合より頻繁に、より迅速に、あ るいはより長い持続時間で結合する場合には、「特異的」または「選択的」であ ると称される。ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体は、それが、特定の 基質の間の反応を、別の基質の間の反応の場合より著しい程度で、またはより長 い持続時間で抑制または阻害する場合、反応を「選択的に抑制」または「選択的 に阻害」すると称される。 「医薬候補」または「薬物候補」は、治療可能性を有すると考えられる、効力 に関して試験される化合物である。医薬候補の「スクリーニング」は、該候補の 効力および／または特異性を評価しうるアッセイを行なうことを意味する。この 場合、「効力」は、該候補を有益な方法で投与する細胞または器官に該候補が影 響を及ぼす能力（例えば、侵襲性ウイルスによる病変の抑制）を意味する。 医薬製剤の「エフェクター成分」は、標的細胞を保持する対象に投与された場 合に所望の方法で機能を改変することにより標的細胞を修飾する成分である。い くつかの改善された医薬製剤はまた、該エフェクター成分を標的部位へより有効 に送達するのを助ける抗体などの「標的化成分」を有する。所望の作用に応じて 、該エフェクター成分は、多数の作用様式の任意の１つを有していてもよい。例 えば、それは、細胞の正常な機能を維持または増強しうるし、細胞の異常な機能 を除去または抑制しうるし、あるいは細胞の表現型を改変しうる。あるいは、そ れは、ウイルス感染細胞などの病理学的特徴を有する細胞を殺したり、休止させ うる。エフェクター成分の具体例は、後の節で記載する。 「細胞系」または「培養」は、in vitroで増殖または維持される高等な真核細 胞を示す。細胞の子孫は、親細胞と完全に同一（形態、遺伝子型または表現型の いずれかについて）でなくてもよいと理解される。 「宿主細胞」は、外因性ポリヌクレオチドの投与により形質転換された又は形 質転換されうる細胞である。「宿主細胞」には、もとの形質転換体の子孫が含ま れる。 「遺伝的改変」は、自然の細胞分裂以外により、遺伝的要素が細胞内に導入さ れる過程を意味する。その要素は、該細胞に対して異種であってもよく、それは 、該細胞内に既に存在する要素の追加的コピーまたは改善型であってもよい。遺 伝的改変は、例えば、公知の任意の方法、例えばエレクトロポレーション、リン 酸カルシウム沈殿法、ポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触、またはＤ ＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入または感染によ り、組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクショ ンすることにより行なうことができる。該改変が該改変細胞の子孫に遺伝しうる ことが好ましいが、必ずしもその必要があるわけではない。 「個体」は、脊椎動物、特に、哺乳動物種のメンバーを意味し、家畜、愛玩動 物および霊長類（ヒトを含む）を含むが、これらに限定されるものではない。 本発明で用いる「霊長類」なる語は、哺乳動物種の最も高等な目の任意のメン バーを意味する。これは、キツネザル、スローロリスなどの原猿類；メガネザル などのメガネザル属動物；リスザル（サイミリ・シウレウス(Saimiri sciureus) ）、タマリンなどの新世界ザル；マカクなどの旧世界ザル（マカカカ・ネメスト リナ(Macaca nemestrina)、マカカ・ファシクラリス(Macaca fascicularis)およ びマカカ・フスカタ(Macaca fuscata)）；ギボン、フクロテナガザルなどのテナ ガザル属動物；オランウータン、ゴリラ、チンパンジーなどの類人猿；およびヒ トなどのヒトファミリー動物を含むが、これらに限定されるものではない。 ヘルペスウイルス感染により引き起こされる「病理」は、宿主の健康状態また は正常な生理を損なうあらゆるものである。これは、未だ感染していない細胞内 へのウイルスの破壊的侵襲、該細胞の正常な代謝を犠牲にするウイルスの複製、 ウイルスによる毒素または他の非天然分子の産生、細胞または細胞内構造物の不 規則な増殖（繊維症など）、感染細胞の正常でないまたは抑制された生化学的活 性、悪性形質転換、隣接細胞の正常な機能の阻害、炎症応答または免疫応答の悪 化または抑制、および他の病原生物または状態に対する感受性の増大を含むこと があるが、これらに限定されるものではない。 個体または細胞の「治療」は、個体または細胞の自然の経過を改変させるため の任意の型の介入である。例えば、個体の治療は、該個体に感染するヘルペスウ イルスにより引き起こされる病理を減少または抑制するよう行なってもよい。治 療は、医薬組成物などの組成物の投与を含み（これらに限定されるものではない ）、予防的または治療的に病理事象の開始または病原体との接触の後に行なうこ とができる。 臨床または生物学的「サンプル」は、対象から得られin vitro法（例えば、診 断試験）で有用な種々のサンプル型を包含すると理解される。その定義は、外フ ァミリー的切除物、病理標本または生検標本、組織培養またはそれに由来する細 胞およびその子孫、およびこれらの任意の起源から調製される切片またはスミア として得られる固形組織サンプルを包含する。非限定的な具体例は、感染部位、 繊維症部位、未罹患部位および腫瘍から得られるサンプルである。その定義はま た、血液、脊髄液、および生物由来の他の液体サンプルをも包含し、それらや液 体培地およびその溶質に懸濁された細胞または細胞断片のいずれかを意味するこ とがある。その定義はまた、ある成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質ま たは抗体）に関して可溶化または富化されたサンプルをも含む。 本明細書に記載するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、以下の とおり命名されている。その名称の最初の部分は、基礎となるＤＮＡポリメラー ゼの保存領域の一部（通常は４残基長）についての単一のアミノ酸コードである 。これに続くＡまたはＢの文字は、それぞれ、該オリゴヌクレオチドがＤＮＡポ リメラーゼコード領域のセンスまたはアンチセンス鎖と相補的であることを示す 。配列決定に用いる第２のコンセンサスオリゴヌクレオチドには、その名称の最 後にSQの文字が付されている。 一般的技術 本発明の実施においては、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内に含ま れる分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術を用いる。 そのような技術は、文献中に十分に記載されている。例えば、"Molecular Cloni nng:A Laboratory Manual",第２版（Sambrook，FritschおよびManiatis，1989） 、"Oligonucleotide Synthesis"（M.J．Gait編，1984）、“Animal Cell Cultur e”（R.I．Freshney編，1987）、"Methods in Enzymology"シリーズ（Acade mic Press，Inc.）、"Handbook of Experimental Immunology"（D.M．Weirおよ びC.C．Blackwell編）、"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"（J.M.M illerおよびM.P．Calos編，1987）、"Current Protocols in Molecular Biology "（F.M．Ausubelら編，1987）および"Current Protocols in Immunology"（J.E ．Coliganら編，1991）を参照されたし。 本明細書中で言及されている前記および後記のすべての特許、特許出願、文献 および刊行物を、参考として本明細書に組込むものとする。 ヘルペスウイルスRFHV/KSHVサブファミリーのＤＮＡポリメラーゼをコードす るポリヌクレオチド 本発明は、ヘルペスウイルス中に存在するＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に由来す る単離されたポリヌクレオチドセグメント好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ反応 の能力を有するポリペプチドのセグメントをコードするものを具体化する。提供 するポリヌクレオチドは、ヘルペスウイルスのRFHV/KSHVサブファミリーに由来 する。好ましいポリヌクレオチドは、RFHVまたはKSHVのいずれかからのＤＮＡポ リメラーゼの断片をコードするものである。好ましい断片は、以下の実施例で記 載するＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から増幅され単離されたものである。具体的な 断片は図１に示され、それぞれ、配列番号１および配列番号３と称される。RFH Ｖ配列（配列番号１）の残基27〜501の配列およひKSHV配列（配列番号３）の残 基27〜329の配列を含むポリヌクレオチドが、特に好ましい。 残基27〜501のRFHVとKSHVとのポリヌクレオチドセグメント（図１で下線が付 されている475塩基対断片）は、71％同一である。共有されている残基を図１で は"^*"により示す。このセグメント内においてRFHVとKSHVとの間で共有されてい る保存的塩基の最大数は17である。 RFHVおよびKSHVの475塩基対断片の互いの同一性は、それらのいずれかと、表 １の既に配列決定されているあらゆるヘルペスウイルスの対応セグメントとの同 一性より高い。２番目に密接な関連性を有する配列は、この領域内でRFHVまたは KSHVに対して約68％の同一性を有するeHV2ウイルスからのＤＮＡポリメラーゼで ある。第１の20塩基対のサブ断片（配列番号110）および第２の20塩基対のサブ 断片（配列番号111）（これは、eHV2とRFHVとの間で同一に共有されている）が 、 この領域内に含有されている。475塩基対領域は、RFHVまたはKSHVのいずれかと 、霊長類に感染しうるヘルペスウイルス（sHV1、EBVなど）からの残りの公知Ｄ ＮＡポリメラーゼ配列との間で、約65％未満の同一性を有する。RFHVまたはKSHV と、sHV1との間で同一に共有されている最長サブ断片は、約14塩基長である。RF HVまたはKSHVと、EBVとの間で同一に共有されている最長サブ断片は、約15塩基 長である。ポリヌクレオチド配列の保存性は、ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラ ーゼをコードする領域の間では、他のポリヌクレオチドに対する場合より高いと 予想される。したがって、eHV2と共有されているその２つのサブ断片を除き、18 塩基対以上のRFHVまたはKSHV配列の任意のサブ断片は、RFHV/KSHVサブファミリ ーまたはそのサブファミリーに含まれる個々のヘルペスウイルス種および変異体 に特有のものであると考えられる。 本発明は、RFHV/KSHVサブファミリーのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内に含有さ れている、好ましくは、図１に示す残基27〜501の475塩基対断片に対応する領域 内に含有されているサブ断片を具体化する。好ましくは、それらのサブ断片は、 少なくとも約16残基長、より好ましくは少なくとも18残基長、より好ましくは少 なくとも20ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約25ヌクレオチド長、よ り好ましくは少なくとも約35ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約50ヌ クレオチト長、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチト長、より好ましくは 100ヌクレオチド長以上である。また、それぞれの各ヘルペスウイルスＤＮＡポ リメラーゼの完全なオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドも本 発明で具体化する。 ＤＮＡポリメラーゼの生化学的機能においてコード化ペプチド断片が果たす役 割を予想するために、他のＤＮＡポリメラーゼとの比較を行なってもよい。種々 のヘルペスウイルスからのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列内の保存領域を、 図２に示す。エキソ１、エキソ２およびエキソ３と表示している領域は、3'−5' エキソヌクレアーゼ活性部位における金属リガンドに対する重要な結合部位であ ることが判明している（Derbyshireら，Bernardら(1989)，Simonら，Soengasら ）。領域１と表示されている領域は、重合活性、および薬物結合部位および重合 基質（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）結合部位としての機能に重要であ ることが判明している（Dorskyら(1988，1990)，Bernardら(1990)）。単純ヘル ペス（HSV）１ＤＮＡポリメラーゼのこの領域内でのアミノ酸のＧからＡへの突 然変異は、ウイルス感染細胞におけるポリメラーゼ活性を抑制する。ＦからＣ、 ＹまたはＭへの突然変異は、ヌクレオシドおよびピロリン酸類似体、アフィジコ リンなどの薬物に対して種々の感受性を与える。HSV1ＤＮＡポリメラーゼの領域 ２および領域３は、薬物および基質の認識に関与しているらしい（Gibbsら(1988 a，1988b)，Bascoら(1993)）。領域３は、ＤＮＡ鋳型に対する結合に関与してい る（Bascoら(1992)）。領域７は、重合活性に重要かもしれない（Bascoら(1993) ）。HSV1などのいくつかのヘルペスウイルスでは、Ｃ末端付近のアミノ酸が、UL 42として公知の調節サブユニットに対する結合に関与しており、これは、ヘルペ スゲノム内の他の場所でコードされており、ウイルス複製に関連したＤＮＡポリ メラーゼ活性に必須である（Dignardら，Stow）。 図１に示すRFHVおよびKSHVポリヌクレオチドは、該ＤＮＡポリメラーゼの機能 的に重要な部分をコードするポリヌクレオチドの領域付近にある。具体的には、 オリゴヌクレオチドDFASA、VYGAおよびGDTDIBは、それぞれ、領域２、領域３お よび領域１をマッピングしている。KSHVに関して得られたDFASAとGDTD1Bとの間 の断片は、完全な領域４および領域３の配列を包含し、領域２および領域１の配 列と重複する。 RFHV/KSHVサブファミリーは、RFHVまたはKSHVの対応配列に対して、RFHVまた はKSHVと表１に挙げている他の任意のウイルスとの同一性より高い同一性の配列 を有するメンバーよりなる。そのファミリーの好ましいメンバーは、図１に対応 する領域内のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列に基づき同定してもよい。表２は 、この領域における配列同一性の程度を示す。 配列同一性の割合は、まずコード化アミノ酸配列を並べ、コードするポリヌク レオチドの対応するアライメントを決定し、ついで、各整列位置で比較配列間で 共有されている残基数を計数することにより計算する。挿入または欠失の存在に 関してペナルティーは課されないが、挿入または欠失は、整列されている配列の １つにおいて、明らかに増加したアミノ酸残基数を収容することが要求される場 合に限り、許容される。単に配列アライメントを向上させるために挿入を補うこ とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれにレベルにおいても許容さ れない。したがって、ポリヌクレオチド配列内の任意の挿入が、３の倍数の長さ を有することになる。比較または参照配列内の残基と同一である試験配列内の残 基に関する割合が得られる。 表２のウイルス間の同一性の程度は、図１に示されているとおりに番号づけさ れているRFHVおよびKSHV配列のセグメントに関して計算されている。 本発明の好ましいＤＮＡポリメラーゼコードポリヌクレオチド配列は、RFHV/K SHVヘルペスウイルスサブファミリーに由来するものである。それらは、図１に 示す塩基27〜501でRFHVまたはKSHV配列と少なくとも69％同一である配列を含み 、より好ましくは、それらの配列は、少なくとも70％、より好ましくは少なくと も約72％、より好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約80％ 、より好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、より好 ましくは95％以上同一である。また、塩基27〜329でRFHV配列と少なくとも69％ 、より好ましくは70％、より好ましくは少なくとも72％、より好ましくは少なく とも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、よ り好ましくは少なくとも95％同一である配列も好ましい。また、塩基27〜329でK SHV配列と少なくとも72％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少 なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％ 以上同一な配列も好ましい。 他の好ましいＤＮＡポリメラーゼコードポリヌクレオチド配列は、以下の節で より詳しく説明するRFHV/KSHVサブファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドに 対する同一性の割合により同定してもよい。代表的オリゴヌクレオチドに対する RFHVおよびKSHVＤＮＡポリメラーゼの同一性の割合を、表３に示す。 表３に示す同一性の割合は、図６に示すとおり整列されているウイルス配列の 対応残基に関して計算した。 好ましいＤＮＡポリメラーゼ配列は、LSGGAに対して対応領域にわたり少なく とも約80％、より好ましくは少なくとも約83％、より好ましくは少なくとも約86 ％、より好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも95％同一であ る配列である。他の好ましいＤＮＡポリメラーゼ配列は、CTDPAに対して対応領 域にわたり少なくとも約69％、より好ましくは少なくとも約72％、より好ましく は少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なく とも約85％、より好ましくは少なくとも約95％同一である配列である。他の好ま しいＤＮＡポリメラーゼ配列は、PCLNAに対して対応領域にわたり少なくとも約9 5％同一である配列である。他の好ましいＤＮＡポリメラーゼ配列は、KMLEAに対 して対応領域にわたり少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約83％、よ り好ましくは少なくとも約86％、より好ましくは少なくとも約90％、より好まし くは少なくとも約95％以上同一である配列である。他の好ましいＤＮＡポリメラ ーゼ配列は、GISPAに対して対応領域にわたり少なくとも約69％、より好ましく は少なくとも約72％、より好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なく とも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約95 ％以上同一である配列である。 RFHVまたはKSHVのいずれかの配列またはサブファミリー特異的オリゴヌクレオ チドを用いる前記の配列比較のいずれかにより同定されるRFHV/KSHVサブファミ リーのメンバーからのＤＮＡポリメラーゼコード配列が等しく好ましい。RFHVお よびKSHVのＤＮＡポリメラーゼをコードする配列が特に好ましい。また、該サブ ファミリーのＤＮＡポリメラーゼコード配列の断片、およびそのようなポリヌク レオチド断片を含むより長いポリヌクレオチドも本発明で具体化する。 この節で説明するポリヌクレオチド配列は、後続の節で概説する合成オリゴヌ クレオチド、タンパク質および抗体を得るための基礎となる。これらの化合物は 、以下に説明するとおり、当業者に公知の標準的な技術により調製することがで き、多数の研究、診断および治療の目的に使用することができる。 ポリヌクレオチドの製造 本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の適 当な任意の方法により製造することができる。例えば、後記実施例３および実施 例５で記載するとおり、ヘルペスウイルス感染組織から得たＤＮＡのPCR増幅に おいて、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。あるいは、後 記実施例10で記載するとおり、ＤＮＡライブラリーの適当な細菌クローンを同定 するために、オリゴヌクレオチドを使用することができる。 ポリヌクレオチドはまた、本発明で提供する配列から直接、化学合成により製 造することができる。トリエステル法、亜リン酸法などのいくつかの合成方法が 当該分野で公知である。好ましい方法では、モノヌクレオシドホスホルアミダイ トカップリング単位を用いる固相合成によりポリヌクレオチドを製造する。例え ば、Horiseら、Beaucageら、Kumarらおよび米国特許第4,415,732号を参照された し。 典型的な固相合成は、脱保護、カップリング、キャッピングおよび酸化の４工 程の繰返しを含む。これにより、オリゴヌクレオチドの3'から5'方向への段階的 合成が生じる。 第１工程では、（-O-）基を介して固相に3'末端で結合している成長しつつあ るオリゴヌクレオチドを、5'末端で脱保護する。例えば、ピリジン中で4,4'−ジ メトキシトリチルクロリド（DMT-Cl）と反応させることにより形成した-ODMT基 により、5'末端を脱保護してもよい。この基は、塩基性条件下では安定であるが 、例えばジクロロ酢酸（DCA）またはトリクロロ酢酸（TCA）の存在下の酸性条件 下では容易に除去される。脱保護により5'-OH反応性基が生じる。 第２工程では、オリゴヌクレオチドを所望のヌクレオチドモノマー（それ自体 は、最初に、5'が保護された3'ホスホルアミダイトに変換されている）と反応さ せる。該モノマーの5'-OHは、例えば、-ODMTの形態で保護してもよく、3'-OH基 は、-OP(OR')NR₂［式中、Rはイソプロピル基-CH(CH₃)₂であり、R'は、例えば、- H（ホスホルアミダイトジエステルを与える）または-CH₃、-CH₂CH₃またはβ-シ アノエチル基-CH₂CH₂CN（ホスホルアミダイトトリエステルを与える）］などの ホスホルアミダイトに変換してもよい。該モノマーの5'-ホスホルアミダイト基 は、成長しつつあるオリゴヌクレオチドの5'-OH基と反応して、亜リン酸結合5'- OP(OR')O-3'（ホスホルアミダイトトリエステルを与える）を与える。該モノマ ーの３'-ホスホルアミジット基は、成長しつつあるオリゴヌクレオチドの5'-OH 基と反応して、亜リン酸結合5'-OP(OR')O-3'を与える。 第３工程では、不完全なポリマー形成を防ぐため、該モノマーとカップリング していないオリゴヌクレオチドを、さらなる合成から除く。これは、無水酢酸（ CH₃-C(O)-O-C(O)CH₃）と反応させることにより、アセタート（-OC(O)CH₃）の形 態で、残りの5'-OH基をキャッピングすることにより達成される。 第４工程では、新たに形成した亜リン酸基（すなわち、5'-OP(OR')O-3'）を、 例えば水性ヨウ素およびピリジンと反応させることにより、リン酸基（すなわち 、5'-OP(=O)(OR')O-3'）に酸化する。 この方法の終了時に得られるオリゴヌクレオチドは、5'-保護されており、第 １工程で用いるための準備が整っているため、ついでその４工程の方法を繰り返 す。所望の完全長オリゴヌクレオチドが得られたら、例えば、アルカリおよび熱 で処理することにより、それを固相支持体から切断することができる。この工程 は、リン酸トリエステル（すなわち、R'が-H以外の場合）をリン酸ジエステル（ -OP(=O)₂O-）へ変換するため、およびヌクレオチド塩基の塩基不安定性保護アミ ノ基を脱保護するために利用してもよい。 これらの任意の方法により製造したポリヌクレオチドを、PCR増幅または遺伝 子クローニングなどの標準的な任意の技術により複製して、より大きな供給量を 得ることができる。 ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローニングおよび 発現ベクター 本発明では、ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼまたは変異体またはそれら の断片をコードする配列を含むクローニングベクターおよび発現ベクターを提供 する。適当なクローニングベクターは、標準的な技術により構築することができ 、当該分野で入手可能な非常に多数のクローニングベクターから選択することが できる。選択するクローニングベクターは、使用しようとする宿主細胞により異 なることがあるが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製能を有し 、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し、トランスフェクシ ョ ンされたクローンを選択するのに使用しうるマーカーの遺伝子を保持しているで あろう。適当な具体例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えばpUC18、mp1 8、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージＤＮＡおよびシャトルベ クター、例えばpSA3およびpAT28が含まれる。 発現ベクターは、一般に、適当な転写および翻訳制御要素に作動可能的に結合 したポリペプチドをコードする複製可能なポリヌクレオチド構築物である。転写 制御要素としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位および 転写終結部位が挙げられる。翻訳制御要素としては、例えば、リボソーム結合部 位、翻訳開始部位および停止コドンが挙げられる。また、タンパク質プロセシン グ要素、例えば、ポリペプチドが膜を横切って移動したり細胞から分泌されたり するのに必要なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドおよびプロテアーゼ切 断部位をコードする領域が含まれることもある。用いる要素は、発現に用いる宿 主細胞内で機能しうるであろう。それらの制御要素は、ベクターで用いるのと同 じＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に由来するものであっでもよいし、あるいは異種の （すなわち、他の遺伝子および／または他の生物に由来する）ものであってもよ い。 ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段により宿主細胞中に挿入す ることができる。適当な宿主細胞には、細菌細胞、例えば大腸菌（E．coli）、 マイコバクテリア、他の原核微生物および真核細胞（真菌細胞、昆虫細胞、植物 細胞、動物細胞など）が含まれる。それらの細胞は、直接取込み、エンドサイト ーシス、トランスフェクション、f-接合またはエレクトロポレーションにより外 因性ポリヌクレオチドを挿入することにより形質転換する。ついで、その外因性 ポリヌクレオチドは、プラスミドなどの非組込みベクターとして該細胞内で維持 してもよいし、あるいはその代わりに宿主細胞ゲノム中に組込んでもよい。 クローニングベクターは、それに含まれるポリヌクレオチドの複製コピーを得 るため、あるいは、将来的な回収のために受託機関において該ポリヌクレオチド を保存する手段として使用することができる。発現ベクターおよび宿主細胞は、 それらに含まれるポリヌクレオチドにより転写されたポリペプチドを得るのに使 用することができる。それらはまた、元の細胞に該ポリペプチドの合成能を付与 するのが望ましいアッセイ、例えば薬物スクリーニングアッセイで使用すること ができる。 ハイブリダイゼーションプローブおよび増幅プライマーとして有用なヘルペス ウイルスＤＮＡポリメラーゼのための合成オリゴヌクレオチド 本発明で具体化するヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼの配列から設計され るオリゴヌクレオチドは、関連配列を同定するためのプローブとして、あるいは PCRなどの増幅反応におけるプライマーとして使用することができる。 種々の特性を有する種々のオリゴヌクレオチドを、以下の節で記載する。１型 と称されるオリゴヌクレオチドは、任意のヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼ をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするよう設計されており、既に 公知のヘルペスウイルス種を検出するのに使用することができる。それらはまた 、新規のヘルペスウイルス種を検出し特徴づけるのに使用することもできる。２ 型と称されるオリゴヌクレオチドは、未同定のメンバーを含むRFHV/KSHVサブフ ァミリーのＤＮＡポリメラーゼコードポリヌクレオチドとハイブリダイズするが 他のヘルペスウイルスのポリヌクレオチドとはハイブリダイズしないよう設計さ れている。３型と称されるオリゴヌクレオチドは、RFHVまたはKSHVのみからのＤ ＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする よう設計されている。 １型の好ましい具体例を、表４に挙げる。これらのオリゴヌクレオチドは、広 範囲のヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼコードポリヌクレオチドに対して 特異性を有する。 示されている配向は、ポリヌクレオチドのコード領域に対するものである。5' →3'配向を有するオリゴマーは、コード鎖に対してアンチセンスな鎖とハイブリ ダイズし、コード配列の方向で増幅を開始するであろう。3'→5'配向を有するオ リゴマーは、コード鎖とハイブリダイズし、コード配列の逆方向で増幅を開始す るであろう。 これらのオリゴヌクレオチドは、以下のいくつかの特性に留意して設計されて いる：１）標的ＤＮＡに対する感度（起源物質中に非常に低コピー数で存在する 場合であっても）、２）望まない配列（例えば、宿主中に存在する内因性ＤＮＡ ポリメラーゼ配列）とハイブリダイズするのを避けるのに十分な特異性、３）未 知標的とその設計に使用する配列との相違が、オリゴヌクレオチドが該標的と安 定な二重らせんを形成するのを妨げない程度に十分な交差反応性。 いくつかの適用では、特に有効な設計は、ポリヌクレオチド標的に対してある 程度保存されていると考えられる少なくとも２つの公知ポリヌクレオチドの領域 から設計される、3'末端に縮重セグメントを有するオリゴヌクレオチドである。 アンビギュアス残基の種々の順列は、オリゴヌクレオチドの他の形態の少なくと も１つが標的とハイブリダイズしうることを確保するのを助ける。形成しうる任 意の二重らせんを強化し、より高温で行なうハイブリダイゼーションまたは増幅 反応を許容するコンセンサスセグメントが、オリゴヌクレオチドの5'末端で縮重 セグメントに隣接している。その縮重セグメントは該分子の3'末端に位置してお り、ポリメラーゼ連鎖反応中に伸長が開始する部位においてオリゴヌクレオチド と標的との間の厳密な対合の可能性を増大させる。 該配列の縮重部分内のアンビギュアス残基は、以下の記号により示す。 表４に示す１型オリゴヌクレオチドは、一般に、ＤＮＡポリメラーゼをコード するポリヌクレオチドセグメントとハイブリダイズさせるのに有用である。これ は、該ポリヌクレオチドの存在を検出したり、あるいは該ポリヌクレオチドをさ らに特徴づけるよう増幅反応を引き起こすために行なってもよい。適当な標的に は、ヒトおよびヒト以外の霊長類を含む任意の脊椎動物に感染するアルファ、ベ ータおよびガンマヘルペスウイルスを含む広い範囲のヘルペスウイルスからのＤ ＮＡポリメラーゼの領域をコードするポリヌクレオチドが含まれ、該ポリメラー ゼまたは該ウイルスが既に公知であるかまたは記載されているか否かは無関係で ある。非限定的な具体例としては、表１に記載の任意のヘルペスウイルスからの ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。本発明者らは、 RFHV、KSHV、EBV、HSV1、HHV6およびHHV7（アルファ、ベータおよびカンマサブ ファミリーからの代表を含む一群）からのＤＮＡポリメラーゼのセグメントを得 るために、これらのオリゴヌクレオチドを使用した。 これらのオリゴヌクレオチドは、とりわけ、該オリゴヌクレオチドがハイブリ ダイズする部位から3'方向に標的ポリヌクレオチドの領域を増幅する反応を引き 起こさせるために使用してもよい。DFASA、DFQSA、VYGA、VYGCAおよびGDTD1Bは 、縮重セグメントに隣接したコンセンサスセグメントを有するオリゴヌクレオチ ドであり、その目的に有用であり、また、標的ＤＮＡ配列が未知の場合に使用し てもよい。オリゴヌクレオチドDFASAとDFQSAとの選択は、標的ポリヌクレオチド の配列に左右される。DFQSAは、HHV6様配列の増幅を、他の配列よりある程度良 好に促進する。DFASAは、HHV6様配列および非HHV6様配列の両方の増幅を促進す る。VYGAは、広い交差反応性を有し、DFASAなどの他のプライマーにより第１増 幅されたポリヌクレオチドを用いて行なう第２増幅反応のプライマーとして特に 有用である。VYGCAは、GCに富むVYGA類似体であり、それほど複雑でない増幅混 合物を産生し、より高温でハイブリダイゼーション反応が生じるのを可能とする 。VYGSQAおよびGDTDSQBは、とりわけ、それぞれVYGAまたはGDTD1Bを用いて得ら れた増幅産物を配列決定するため、あるいは縮重プライマーによる予備増幅の後 の標的ポリヌクレオチドのより特異的な増幅に使用することができる特異的な非 縮重オリゴヌクレオチドである。 表４のオリゴヌクレオチドの標的として使用するＤＮＡの好ましい起源は、ヘ ルペスウイルスを含むことが公知であるかまたはその疑いのある任意の生物学的 サンプル（固形組織および組織培養を含む）、特に脊椎動物由来のものである。 有機溶媒による抽出または高い塩濃度での沈殿などの当該分野で公知の任意の方 法により、その起源からＤＮＡを抽出する。 好ましい増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。一般的には、米国特許第 4,683,195号（Mullis）および米国特許第4,683,202号（Mullisら）を参照された し。ウイルス性ポリヌクレオチドへの適用に関しては、米国特許第5,176,995号 （Sninskyら）を参照されたし。増幅反応は、増幅すべき標的ポリヌクレオチド を、標的とハイブリダイズし重合反応のプライマーとして作用しうる短いオリゴ ヌクレオチドと組み合わせることにより行なってもよい。また、基質モノヌクレ オチドおよび耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq）を加える 。増幅反応に用いる条件は、一般に、当該分野で公知であり、RFHV、KSHV、EBV 、HSV1などの公知ウイルスの起源を用いて実験的に最適化することができる。条 件は、例えば、増幅サイクル（特にハイブリダイゼーション段階）の時間および 温度を変化させることにより、オリゴヌクレオチドプライマーのモル濃度を変化 させることにより、緩衝液濃度を変化させることにより、そして増幅サイクル数 を変化させることにより改変することができる。増幅条件の微調整は、当業者に とっては日常的なものである。 １つの方法では、第１プライマーから下流へそしてその逆方向に複製を開始す るために、所望により第２プライマー（例えば、ランダムプライマー）を用いる 増幅において、本発明の単一のプライマーを用いる。好ましい方法では、逆方向 に複製を開始するために、本発明のプライマーの少なくとも２つを同じ反応で使 用する。少なくとも２つの特異的プライマーの使用は、増幅反応の特異性を増大 させ、サンプル間での比較のための断片サイズを限定する。例えば、プライマー DFASAおよびGDTD1Bを用いて、増幅を行なってもよい。増幅を増強するためにネ スティド態様で合計３つのプライマーを使用するのがより好ましい。ネスティン グは、第３プライマーに対する結合部位を含む中間的な断片を含むプライマーを 用いて第１増幅を行なうことにより達成される。この後、その第３プライマーを 用いて第２増幅を行ない、それにより、その中間的な断片のサブ断片である最終 n断片を得る。特に好ましくは、プライマーDFASAおよびプライマーGDTD1Bを用い る第１増幅の後、プライマーVYGAおよびプライマーGDTD1Bを用いる第２増幅を行 なう。RFHVまたはKSHVのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からのポリヌクレオチド上で 行なう場合、断片のサイズは約236塩基である。 増幅されたポリヌクレオチドは、増幅反応の間の任意の段階で、例えばサイズ 決定により特徴づけることができる。好ましくは、これは、約１〜２％アガロー スのゲル上でポリヌクレオチドを移動させることにより行なう。ゲル内のポリヌ クレオチドは、十分な量が存在すれば、臭化エチジウムで染色し紫外線下で検出 することができる。あるいは、約６％ポリアクリルアミドのゲル上にローディン グする前に、該ポリヌクレオチドを、³²P、³⁵Sなどの放射性同位体で標識するこ とができ、ついで、該ゲルを使用してオートラジオグラムを得ることができる。 増幅されたポリヌクレオチドを標識する好ましい方法は、ポリヌクレオチドキナ ーゼおよびγ-[³²P]-ATPを用い、そして増幅を約５〜15サイクル継続して、VYGA 、VYGSQAなどのオリゴヌクレオチドプライマーを³²Pで末端標識するものである 。 所望により、増幅ポリヌクレオチドの製造の一工程としてサイズ分離を用いて もよい。これは、増幅混合物が種々のサイズの人工ポリヌクレオチド（これは、 例えば、望ましくない標的との交差反応性により生じうる）を含有することが判 明している場合に特に有用である。分離ゲル（例えば、前段落で記載したもの） を、ペーパーバッキング上で乾燥し、オートラジオグラムを得るのに使用する。 オートラジオグラム上の所望のバンドに対応するゲルの位置を切り出し、標準的 な技術により抽出する。ついで、抽出されたポリヌクレオチドを、直接特徴づけ し、クローニングし、またはさらなる増幅ラウンドに用いることができる。 また、増幅反応からの混合物中の目的としないポリヌクレオチドは、より特異 的なオリゴヌクレオチドプライマーにすることにより、比例的に減少させること ができる。例えば、増幅の最初の３〜５サイクルは、プライマーVYGAおよびGDTD 1Bを通常量の1/5〜1/25で用いて行なうことができる。ついで、モル過剰（例え ば、50pmol）のGDTDSQBおよび／またはVYGSQAを加え、増幅をさらに30〜35サイ クル継続する。これにより、増幅混合物中に存在するオリゴヌクレオチドの複雑 性が減少し、反応温度の上昇が可能となり、目的としないポリヌクレオチドの増 幅が減少する。 ２型オリゴヌクレオチドの好ましい具体例を、表６に挙げる。 LSGGA、CTDPA、PCLNA、KMLEAおよびGISPAはすべて、3'末端で縮重セグメント に直接結合した5'末端にコンセンサスセグメントを有するオリゴヌクレオチドで ある。それらは、RFHV、KSHVのいずれかからの、又はRFHV/KSHVサブファミリー の他のウイルスからのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有す る安定な二重らせんを形成しうる。それらは、そのような特異性が要求される任 意の目的（例えば、RFHV/KSHVサブファミリーからのポリヌクレオチドの検出ま たは増幅）に使用することができる。 １つの適用では、これらの２型オリゴヌクレオチドは、別個にまたは組み合わ せて、増幅プライマーとして使用する。この適用の一例では、該オリゴヌクレオ チドを、組織サンプルから得たＤＮＡ上で直接使用して、RFHV、KSHVまたは密接 に関連したウイルス（EBV、CMV、HSVなどの関連性がより低いウイルスではない ）に由来するＤＮＡポリメラーゼセグメントを得る。もう１つの具体例では、組 織サンプルからのＤＮＡをまず、それほど特異的でないプローブのセット（例え ば、DFASAまたはVYGAと、GDTD1Bとの組み合わせ）で増幅する。ついで、表６の オリゴヌクレオチドの１つを増幅の第２ラウンドで使用し、それにより、RFHV、 KSHVおよびRFHV/KSHVサブファミリーの他のメンバーに特異的な高感度のネステ ィド増幅アッセイが提供される。 もう１つの適用では、２型オリゴヌクレオチド、またはこれらの配列またはそ れらの断片を含むオリゴヌクレオチドを、検出アッセイにおいてプローブとして 使用する。例えば、それらに、³²Pなどの適当な標識を付け、ついで、DFASAおよ び／またはVYGAとGDTD1Bとを用いて増幅されたＤＮＡなどの適当な標的とのハイ ブリダイゼーションアッセイで使用することができる。 ３型オリゴヌクレオチドの好ましい具体例を、表７に示す。 これらは、特定のヘルペスウイルス、すなわちRFHVまたはKSHVのＤＮＡポリメ ラーゼをコードするポリヌクレオチドに対して特異的となるよう設計された非縮 重オリコヌクレオチトである。選択されたその特定の配列は、もう一方のウイル スのものとの違いが隣接セグメントより大きなコード領域のセグメントからのも のである。 VASGA、ILPCA、PIEABおよびPEARBは、RFHVDNAポリメラーゼに特異的な非縮重 オリゴヌクレオチドであり、高いストリンジェンシーで行なうハイブリダイゼー ション反応で使用することができる。例えば、それらは、RFHVＤＮＡポリメラー ゼをコードする標的ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして単独で または組み合わせて使用することができる。好ましくは、該増幅は、ネスティ ド態様で該オリゴヌクレオチドを用いて行なう。例えば、VASGAおよびPEARBをプ ライマーとして用いて第１増幅を行ない、ついでILPCAおよびPIEABをプライマー として用いて第２増幅を行なう。 同様に、SGILA、CLNIA、IEASBおよびEARFBは、KSHVＤＮＡポリメラーゼに特異 的な非縮重オリゴヌクレオチドであり、例えば増幅反応用プライマーとして同様 の態様で使用することができる。好ましくは、該増幅は、ネスティド態様にてオ リゴヌクレオチドを用いて行なう。例えば、SGILAおよびEARFBをプライマーとし て用いて第１増幅を行ない、ついでCLNIAおよびIEASBをプライマーとして用いて 第２増幅を行なう。これにより、KSHVＤＮＡポリメラーゼに特異的な非常の高感 度な増幅アッセイが提供される。 当業者であれば、ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの異なる 部分を増幅するために、１型、２型および３型のオリゴヌクレオチド（特に、表 ４、６および７に示しているもの）を、PCRにおいて互いに組み合わせて使用し うることを容易に認めることができるであろう。増幅反応の特異性は、一般に、 最小量の交差反応性を有するプライマーにより決定される。増幅された断片のサ イズおよび位置は、増幅の最終ラウンドで用いるプライマーにより決定される。 例えば、LSSGAはGDTD1Bと併用すると、RFHV/KSHVサブファミリーウイルスからの ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの約361塩基を増幅するであ ろう。同様に、VYGAをPEARBと併用すると、RFHVからのＤＮＡポリメラーゼをコ ードするポリヌクレオチドの約444塩基を増幅するであろう。適当な組み合わせ のオリゴヌクレオチドを、ネスティド態様で増幅プライマーとして用いてもよい 。 ポリヌクレオチド標的を特徴づけるための合成オリゴヌクレオチドの使用 前記の節で説明したとおり、本発明で具体化するオリゴヌクレオチドは、ヘル ペスウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの増幅のための プライマーとして、特にポリメラーゼ連鎖反応において使用することができる。 PCRを行なうための条件は、使用するオリゴヌクレオチドの性質に左右される 。特に、縮重セグメント、または標的の対応セグメントと一部のみが同じコンセ ンサスセグメントを含むオリゴヌクレオチドを使用する場合や、標的ポリヌクレ オチドが未知の配列を含む場合には、条件の選択が増幅の成功のために重要とな る かもしれない。新たなプライマーまたは新たなポリヌクレオチド標的のための条 件を最適化することは、当業者にとっては日常的なものである。以下は、その目 的達成の助けとなる１つの指標である。 第１に、PCRのアニーリング工程の温度を最適化して、増幅される標的ポリヌ クレオチドの量を、増幅される無関係なポリヌクレオチドの量より増加させる。 理想的には、その温度は、プライマーと標的配列とのハイブリダイズは許容する が、他の配列とのハイブリダイズは許容しない。コンセンサスセグメントを含む プライマーの場合、アニーリング工程の温度は、一般には、少なくとも約55℃、 好ましくは少なくとも約60℃である。ウイルスに特異的なプライマーがより選択 的であり、より広範囲の温度（50℃〜65℃）にわたり有効かもしれない。 第２に、緩衝条件を最適化する。本発明者らは、Taqポリメラーゼの市販の調 製物に供給する緩衝液は、マグネシウムイオン濃度に決定的に依存することなど から、使用が困難な場合があることを見出した。本発明のオリゴヌクレオチドを 用いて行なうPCRは、一般に、緩衝液（例えば、M．Wigler(Lisitsynら)により示 唆されているもの）を用いて、より容易に行われる。好ましくは、最終PCR反応 混合物は、主イオン源としてKClでなく(NH₄)₂SO₄を含有する。好ましくは、最終 反応混合物中の(NH₄)₂SO₄の濃度は、約５〜50mM、より好ましくは約10〜30mM、 より一層好ましくは16mMである。緩衝成分は、好ましくは最終濃度が約67mMでpH が約8.8の好ましくはトリスである。これらの条件下、MgCl₂濃度は、それほど重 要ではない。好ましくは、最終濃度は約１〜10mM、より好ましくは約３〜６mM、 所望により約４mMである。該反応混合物はまた、約10mMのβ-メルカプトエタノ ールおよび0.05〜１mg/mLのウシ血清アルブミンを含有する。特に好ましい緩衝 液は、WB4緩衝液（67mMトリス緩衝液(pH8.8)、４mM MgCl₂、16mM(NH₄)₂SO₄、10m Mβ-メルカプトエタノールおよび0.1mg/mLアルブミン）である。該反応を行なう ための好ましい条件は、以下の実施例３に記載する。 本発明の任意のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる増幅反応は、Ｄ ＮＡポリメラーゼの一部をコードするポリヌクレオチド断片を与える。これらの 断片は、当業者に公知の多数の技術により特徴づけることができる。断片を特徴 づけるためのいくつかの非限定的な方法は、以下のとおりである。 １つの方法では、MaxamおよびGilbert法、SallgerおよびNicholson法などの当 該分野で公知の任意の配列決定法により、断片を配列決定することができる。あ るいは、ポリヌクレオチドの配列決定サービスを提供している任意の商業的機関 に断片を提出してもよい。配列決定の前に、所望により、断片をクローニングお よび／または増幅してもよい。ヌクレオチド配列は、該断片によりコードされる アミノ酸配列を予想するために使用することができる。配列データは、ポリヌク レオチドまたはアミノ酸のいずれかのレベルで、配列決定された他のＤＮＡポリ メラーゼと比較するために使用して、もとの起源物質中に存在するヘルペスウイ ルスの種を同定することができる。配列データはまた、抗原領域または三次元構 造を予想するためのアルゴリズムのモデル化に使用することもできる。 特徴づけの第２の方法では、断片のサイズは、ポリアクリルアミドまたはアガ ロースゲル上を移動させたり、あるいは適当な密度勾配で遠心するなどの適当な 任意の方法により決定することができる。例えば、RFHVおよびKSHVの場合、VYGA とGDTD1Bとの間の断片は、約172塩基である。したがって、プライマー結合領域 を含む完全な増幅断片の長さは、約236塩基である。対応するEBV断片は、さらに ９塩基対を含有する。したがって、例えば、分離ゲルの隣接レーンのそれぞれか ら増幅されたポリヌクレオチド断片を移動させることにより、あるいは適当な分 子量標準と並べてEBV断片を移動させることにより、EBV断片を、RFHVまたはKSHV の断片から識別することができる。RFHVおよびKSHVの断片と同一サイズのポリヌ クレオチド断片は、これらのウイルスの１つの変異株または密接に関連している 種に由来しているかもしれない。サイズが実質的に異なる断片は、異なるヘルペ スウイルスに由来する可能性がより高い。 特徴づけの第３の方法では、断片とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリ ダイズを試みることにより、該断片を試験することができる。好ましい具体例で は、RFHVまたはKSHVのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域に対する関連性に関 して、断片を試験する。その試験は、ＤＮＡポリメラーゼをコードする領域の配 列またはその遺伝的相補体を含むプローブを用いて行なう。適当なプローブは、 RFHVまたはKSHVからの配列を含むポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチ ドの混合物、または表６に挙げたオリゴヌクレオチドなどのRFHVおよびKSHVに由 来する縮重配列を含むポリヌクレオチドである。 プローブの長さおよび性質並びにハイブリダイゼーション条件は、試験の目的 に応じて選択される。その目的が、小さな変異体を含むRFHVまたはKSHVからのポ リヌクレオチドのみの検出であれば、高いストリンジェンシーの条件下でハイブ リダイゼーションを行なう。それぞれのRFHVまたはKSHVＤＮＡポリメラーゼから の配列を使用する。長さがより長い配列は、その試験の特異性を向上させ、高い ストリンジェンシーの条件下で使用することができる。好ましくは、そのプロー ブは、少なくとも約30ヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼ配列を含み、より好ま しくは、その配列は、少なくとも約50ヌクレオチド長、より一層好ましくは少な くとも約75ヌクレオチド長である。 その目的が、RFHVまたはKSHVと関連しているポリヌクレオチドの検出（例えば 、スクリーニング試験またはこれまでに未記載のRFHV/KSHVサブファミリーウイ ルスをリクルートする試験の場合）であれば、異なる条件を選択する。RFHVまた はKSHVからの配列を使用してもよいが、その２つまたは縮重プローブの混合物が 一般に好ましい。配列の長さおよびハイブリダイゼーション反応の条件は、目的 としない配列を除外するのに十分な特異性が得られるよう、あるいは可能な標的 の中で最大の交差反応性が得られるよう選択する。適当な条件は、既に与えられ ている式を用いて、Tmを計算し、ついで許容されるミスマッチの程度が最大とな る対応温度を計算することにより予想することができる。条件の適合性は、ヘル ペスウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする公知の標的ポリヌクレオチドを含 有するサンプルとのプローブの交差反応性を試験することにより、実験的に試験 することができる。 安定な二重らせんがアッセイ条件下で形成するために要求される相補性の最小 の程度が、プローブとハイブリダイズするＤＮＡポリメラーゼ配列を決定するで あろう。例えば、ヒトまたはヒト以外の霊長類から得、図１の塩基330〜501に対 応する断片を産生するよう増幅し、ついでRFHVポリヌクレオチドの対応断片とプ ローブさせた標的を検討してみよう。表２のデータによれば、安定な二重らせん を形成するためにわずか約50％の同一性しか必要としない条件下でハイブリダイ ゼーション反応を行なえば、プローブは、配列決定された任意のガンマヘルペス ウイルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（EBVおよびsHV1を含む）からの標的とハイ ブリダイズするかもしれない。安定な二重らせんを形成するためにプローブと標 的との間で少なくとも約62％、好ましくは約65％、より好ましくは少なくとも約 68％、より一層好ましくは約70％の同一性を必要とする条件下で反応を行なえば 、アッセイは、RFHV、KSHVからの、または配列未決定の関連ヘルペスウイルスＤ ＮＡポリメラーゼからの標的ポリヌクレオチドを検出するであろう。EBVまたはs HV1からのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドが、これらの条件 下で安定な二重らせんを形成するとは予想されない。eHV2からのＤＮＡポリメラ ーゼをコードするポリヌクレオチドが、被検ＤＮＡ中に存在するとは予想されな い。なぜなら、eHV2は、霊長類に対する感染能を有さないと考えられているから である。 サイズによる特徴づけとハイブリダイゼーションによる特徴づけとを組み合わ せることが可能である。例えば、増幅したポリヌクレオチドを、アクリルアミド またはアガロースのゲル上で分離し、適当な物質（例えば、ニトロセルロース） の膜にブロッティングし、ついで適当な標識（例えば、³²P）を有するプローブ とハイブリダイズさせることができる。洗浄後の標識の存在は、サンプル中にハ イブリダイズしうる物質が存在することを表し、一方、適当な分子量標準と比較 した移動距離は、その物質のサイズを表す。高いストリンジェンシーの条件下で 前記プローブの１つとハイブリダイズするが予想外のサイズを有する断片の配列 は、プローブと高い同一性を有するがRFHVまたはKSHVとは異なるＤＮＡポリメラ ーゼ配列を示すものであろう。 ヘルペスウイルスの感染を検出するためのポリヌクレオチドおよびオリゴヌク レオチドの使用 本発明に含まれる、ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリ ヌクレオチドおよびこれらを基礎とする合成オリゴヌクレオチドはヘルペスウイ ルスの感染に関連する臨床症状の診断に有用である。例えば、臨床サンプル中の 検出可能なヘルペスＤＮＡポリメラーゼの存在は、対応するヘルペスウイルスが 症状の発現における発症因子として関与したことを示唆すると考えられる。周囲 の組織には存在しないポリメラーゼの特定の組織での存在は感染病変の局限化に 有効であると考えられる。臨床サンプル中のガンマヘルペスウイルスとその他の ヘルペスウイルスの識別、またはRFHV、KSHV、およびEBV間の識別は感染の臨床 経過の予測または治療に好適な薬剤の選択のために有用であると考えられる。 その上、ＤＮＡポリメラーゼはヘルペスウイルスの複製に積極的に関与するの で、ある種の応用においてその他のマーカーよりも好都合なこともある。ＤＮＡ ポリメラーゼはVaricella-Zosterヘルペスの潜伏期においては発現されないが、 複製期においては発現される（Meierら）。したがって、ＤＮＡポリメラーゼの アッセイは、ガンマヘルペスに感染した個体が現在その疾病の活動期にあるかど うかを判定するのに役立つと考えられる。あるHSV１株が眼から脳に移動する能 力はＤＮＡポリメラーゼ活性に関連する（Yeungら）。したがって、ＤＮＡポリ メラーゼのアッセイはガンマヘルペスの感染の攻撃性または侵襲性を予測するの に役立つと考えられる。 診断試験を実施するための操作法は当業界で周知であり、当業者にとって日常 的なものである。本発明の診断方法を実施するためには、一般に、臨床サンプル 中の標的を検出するため、これと反応する試薬として、本発明の組成物の１つが 提供される。例えば、ヘルペスウイルスに感染した細胞中に存在するかもしれな いＤＮＡまたはＲＮＡ標的を検出するための試薬として、本発明のポリヌクレオ チドを使用することができる。抗体分子または（ポリペプチドが受容体の場合） 対応するリガンドなどの標的を検出するため、これと特異的な複合体を形成する ことができる試薬として、本発明のポリペプチドを使用することができる。ウイ ルス感染した細胞によって発現されたポリペプチドなどの標的を検出するため、 これを特異的に認識する試薬として、本発明の抗体を使用することができる。 標的は、診断のパラメーターを測定する対象の個体から好適な組織サンプルを 得ることによって供給される。適切な試験サンプルはヘルペスウイルスを有する と推定される個体から得られるものである。この目的には多くの型のサンプルが 好適であり、これらにはバイオプシーまたは外科的剥離によって推定上の感染ま たは病原部位の近辺から得られるもの、これら由来の細胞のin vitro培養物、可 溶化抽出物、血液および血液成分が含まれる。必要ならば、アッセイを実施する 前に、標的をサンプルから部分的に精製するかまたは増幅してもよい。試薬およ び標的間で複合体が形成するような条件下で試薬とサンプルを接触させることに よって、反応を実施させる。反応は溶液中で、または例えば組織切片を使用した 固体組織サンプル上で実施することができる。複合体の形成を当業界で知られた 多くの手法によって検出する。例えば、試薬を標識して提供し、複合体から未反 応の試薬を除去してもよい。この結果、残存する試薬の量が形成された複合体の 量の指標となる。その他の、複合体の検出に関する詳細および変法を以下に記載 する。 形成された複合体の量がヘルペス感染した細胞または未感染の細胞のいずれを 表示するものかを判定するため、好ましくはアッセイの結果を対照サンプルで実 施する同様のアッセイと比較する。未感染起源で、それ以外は試験する臨床サン プルと組成が同様の対照サンプルを使用するのが一般的に好ましい。しかし、対 照中の標的の相対的量が既知であるか、または比較の目的のために使用すること ができる場合ならば、どんな対照サンプルも適合すると考えられる。試験サンプ ルおよび対照サンプルに対するアッセイを同時に実施するのが好ましい場合が多 い。しかし、形成される複合体の量を定量することができ、そして十分一貫性が ある場合は、試験サンプルと対照サンプルを別の日にまたは別の試験室でアッセ イすることも可能である。 こうして、生物サンプル中に存在するかもしれないガンマヘルペスウイルスポ リヌクレオチドを検出するため、RFHV/KSHVサブファミリーのＤＮＡポリメラー ゼをコードするポリヌクレオチド、および本発明に含まれる合成オリゴヌクレオ チドを使用することができる。特異的診断アッセイにおいてポリヌクレオチドを 使用するための一般方法は当業界で周知である。例えば、日本特許出願第530900 0号（latron）を参照されたい。 ポリヌクレオチド試薬を利用するアッセイは、例えば、１）特異的プローブと のハイブリダイズ反応を実施させる、２）特異的プライマーによる増幅を実施さ せる、または３）この２つを組み合わせることによって特異化することができる 。 特異的プローブとのハイブリダイズによって特異化されたアッセイを実施する ため、目的とする標的に対して必要な程度の相補性を有するポリヌクレオチドを 選択する。好ましいポリヌクレオチドには、RFHV、KSHV、またはRFHV/KSHVサブ ファミリーのメンバーのＤＮＡポリメラーゼの一部分をコードする、長さが約16 ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼをコード する領域の約18，20，25，30，50，または100ヌクレオチドを含むプローブにな るにしたがって、より好ましいものとなる。RFHV/KSHVサブファミリーのポリヌ クレオチドと安定な二重鎖を形成することができるが他のヘルペスウイルスのポ リヌクレオチドとは形成しない縮重プローブもまた好ましい。 このプローブは一般的に標識を伴って提供される。この型のアッセイにおいて よく使用される標識として、³²Ｐおよび³³Ｐなどの放射性同位体、化学発光体、 またはフルオレセインなどの蛍光試薬、ならびに着色溶質または沈殿物を生成す ることが可能な、アルカリホスファターゼなどの酵素が含まれる。標識としては 、試薬に固有のもの、直接化学的連結によって付着されたもの、またはビオチン −アビジン複合体のような一連の中間反応性分子もしくは一連の中間反応性ポリ ヌクレオチドを介して接続されたものがある。標識は標的ポリヌクレオチドとの ハイブリダイズ前に試薬に添加してもよいし、その後でもよい。アッセイの感度 を向上させるため、ハイブリダイズの結果、シグナルが増加するものが望ましい 場合が多い。これは各複合体中に複数の標識成分が組み込まれるような方法での ポリヌクレオチドまたは分枝ポリヌクレオチドの連続的ハイブリダイズの組合せ を使用することによって達成することができる。米国特許第5,124,246号（Urdea ら）を参照されたい。 所望によって、標的ポリヌクレオチドをサンプルから抽出し、そして部分的に 精製してもよい。ウイルス粒子を測定するためには、好ましくは調製物のＤＮＡ を富化させる。ＤＮＡポリメラーゼの活性転写を測定するためには、好ましくは 調製物のＲＮＡを富化させる。一般的に、臨床サンプル中のヘルペスウイルスの ポリヌクレオチドレベルは低いことが予想される。ポリメラーゼをコードするＤ ＮＡは、ウイルスが潜伏期の場合は１細胞中わずかに２，３コピーであり、ある いはウイルスが複製期の場合はＤＮＡは１細胞中数百コピーまでと考えられる。 ポリメラーゼが活発に発現している細胞中では、ポリメラーゼ遺伝子が不活性の 場合よりも、ｍＲＮＡレベルは高くなるはずである。したがって、ＤＮＡまたは ＲＮＡを増幅することによって、サンプル中の標的のレベルを強化することが望 ましいのである。好適な増幅方法はＰＣＲであり、これは好ましくはこの発明に 含まれる１以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。ＲＮＡ は逆転写酵素を使用してｃＤＮＡコピーを製造し、前記のプライマーを使用して ＰＣＲを実施することによって増幅することができる。 標的ポリヌクレオチドについて、場合によって、制限エンドヌクレアーゼによ る消化、例えばアガロースまたはポリアクリルアミド中での電気泳動によるサイ ズ別分離、ブロッティング材料などの反応マトリックスへの固定を含む、付随処 理の組合せを実施することができる。 標的ポリヌクレオチドを含有することが推測されるサンプルと試薬ポリヌクレ オチドを適当な反応条件下で混合することによってハイブリダイゼーションを行 なわせる。その後、未反応の試薬を除去するために洗浄または分離を行なっても よい。一般的に、相補的配列を効率的にハイブリダイズさせるため、標的ポリヌ クレオチドおよび試薬の両方を少なくとも部分的に単鎖型に平衡化しなければな らない。したがって、（特にＤＮＡ試験において）当業界で知られた標準的変性 手法によって、サンプルを調製するのが有益である。 ハイブリダイズ条件のために選択するストリンジェンシーレベルは試験の目的 如何による。試験をRFHVまたはKSHVに特異的にする必要がある場合ならば、対応 するＤＮＡポリメラーゼの１セグメントを含むプローブを選択して、高ストリン ジェンシ一条件下で反応を実施する。例えば、50ヌクレオチドまたはそれ以上の 好ましいプローブについて使用する好ましい条件セットは、50％ホルムアミド中 37℃で６×SSCで、その後低イオン強度で洗浄するものである。ここでは、安定 な二重鎖が形成されるためには、標的にポリヌクレオチドプローブと約90％以上 の同一性が必要である。使用するプローブの長さを増加させることによって、RF HVまたはKSHVに対する反応特異性もまた増加する。したがって、本発明のこの適 用に関しては、より長いプローブほど特に好ましい。 あるいは、試験にRFHVまたはKSHVに関連するガンマヘルペスウイルス類を検出 することができることが要求される場合は、より低いストリンジェンシーが使用 される。好適なプローブとして、RFHVまたはKSHVＤＮＡポリメラーゼからの断片 、それらの混合物、または表６に示すような縮重オリゴヌクレオチドが含まれる 。 プローブをこのプローブと所望の程度の同一性を有するＤＮＡポリメラーゼ配 列のみとハイブリダイズさせるため、適当なハイブリダイズ条件を決定する。必 要なストリンジェンシーはポリヌクレオチドプローブの長さ、およびプローブと 所望の標的配列間の同一性度如何による。例えば、ハイブリダイズ部位DFASAお よびGDTD1B間のKSHVポリヌクレオチド断片からなるプローブを考えてみる。最少 同一度55％を目的とする条件では、KSHV、RFHVおよびEBVに対応するポリヌクレ オチドとの安定な二重鎖が形成されるはずである。最少同一度63％を目的とする 条件では、KSHV、RFHVからのポリヌクレオチドまたは関連するポリヌクレオチド との安定な二重鎖が形成されるが、EBVからのものでは形成されないはずである 。最少同一度80％を目的とする条件では、KSHVからのポリヌクレオチドとの安定 な二重鎖が形成されるが、RFHVまたはEBVからのものでは形成されないはずであ る（表２参照）。 すでに得られている数式を使用して、条件にあらかじめ見当をつけることがで きる。好ましくは、アッセイにおいて検出する目的の、および検出しないつもり のポリヌクレオチドを含有することがわかっている別々のサンプルとともにプロ ーブを試験することによって正確な条件を確認する。こうしたサンプルは公知の 配列からポリヌクレオチドを合成するか、または相当するヘルペスウイルスに感 染していることが確実な組織からＤＮＡを抽出および増幅することによって、提 供される。ハイブリダイズ条件の決定は当業者にとって常套的な調整事項であり 、過度の実験を必要とするものではない。eHV2、sHV1およびEGVはアルファおよ びベータサブファミリーのメンバーよりもRFHVまたはKSHVに同一性が近接してい る ので、これらのウイルスのポリヌクレオチドを排除する条件は一般的に表１に示 すその他のヘルペスウイルスをも排除することになる。その上、（ヒト組織サン プル中におけるeHV2などの）ある種のウイルスが究極の判定においても試験する サンプル中に存在しないことが確実ならば、アッセイ条件を定める作業において 、それに対応する標的配列を場合によっては省略してもよい。こうして、LSGGA 、CTDPA、KMLEAまたはGISPAなどのオリゴヌクレオチドプローブが配列番号１お よび配列番号３を含むポリヌクレオチドの両方と安定な二重鎖を形成するが、配 列番号23から配列番号29までの群から選択される配列とは形成しないような条件 を決定することができる。PCLNA（配列番号21）などのオリゴヌクレオチドプロ ーブまたは配列番号１もしくは３の少なくとも18もしくはそれ以上に連続した塩 基を含む任意の好適な断片が配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号 ３を含むポリヌクレオチドの両方と安定な二重鎖を形成するが、配列番号23から 配列番号29までの１つを含むポリヌクレオチドとは形成しないような条件を決定 することもできる。 あるいは、特異的プライマーを使用して増幅することによって特異化されるア ッセイを実施するため、生物サンプルから前記のようにＤＮＡまたはＲＮＡを調 製する。場合によっては、表４に示すような、種特異性でないプライマーを使用 したＰＣＲにおいて、標的ポリヌクレオチドを予備増幅する。その後、表６また は７に示すような特異的プライマーを使用して、標的を増幅する。例えば、試験 をRFHVについて特異的にすることを所望する場合は、VASGA、ILPCA、PIEAB、PEA RB、またはこれらの組合せを使用することができる。試験をKSHVについて特異的 にすることを所望する場合は、SGILA、CLNIA、IEASB、EARFB、またはこれらの組 合せを使用することができる。試験をRFHVまたはKSHVに関連するガンマヘルペス ウイルスを検出することができるものにすることを所望する場合は、表６に示す ような縮重もしくは交差反応性プローブ、またはこれらの組合せを使用すること ができる。好ましい態様において、第１ラウンドにおいてはウイルス特異的また は非特異的、第２ラウンドにおいてはウイルス特異的なオリゴヌクレオチドプラ イマーを組み合わせた様式で、２ラウンドの増幅を実施する。これは感度が高く 括界的なアッセイを提供する。 必要な特異性を提供するためには、増幅中に特異的なプライマーを使用するだ けで十分である。陽性試験は、一連の増幅の最後の十分な反応生成物の存在が指 標となる。増幅されたポリヌクレオチドは、例えば、反応混合物をニトロセルロ ースなどの媒体上にブロッティングし、臭化エチジウムで染色することによって 、検出することができる。あるいは、最終増幅サイクル中に放射性標識基質を混 合物に添加してもよい。取り込まれた標識を取り込まれなかった標識から（例え ばブロッティングまたはサイズ分離によって）分離し、（例えば計数またはオー トラジオグラフィーによって）標識を検出することができる。アガロースまたは ポリアクリルアミドのゲルに通す場合は、生成物のサイズが増幅された断片の同 一性を確認する助けとなる。特異的増幅の後にはまた、当初計画したハイブリダ イズ反応のための標的源として先行操作で得られたこの増幅混合物を使用するこ とによって、特異的ハイブリダイズを実施することができる。 遺伝子治療のためのポリヌクレオチドの使用 活性成分としてウイルス特異性があるポリヌクレオチド、ポリペプチド、また は抗体を含む医薬が本発明に包含される。こうした組成物はウイルスもしくは感 染細胞の病原そのものを減少させるか、または非特異的医薬化合物による治療に 対してウイルスもしくは感染細胞を高感受性にすることができる。 例えば、感染した個体に遺伝子治療の目的で投与するため、本発明のヘルペス ウイルスＤＮＡポリメラーゼの一部分をコードするポリヌクレオチドを使用する ことができる（一般的には米国特許第5,399,346号：Andersonら、参照）。一般 的原理は、ポリヌクレオチドが遺伝子自体またはその遺伝子から転写されたＲＮ Ａと複合体化するなどによって対応する遺伝子の発現を妨害するような方法で、 そのポリヌクレオチドを投与するものである。ポリヌクレオチドの細胞中への進 入はポリペプチドを好適なベクターの形態で提供する、またはポリヌクレオチド をリポソーム内に封入するなどの当業界で公知の好適な手法によって実現される 。ポリヌクレオチドは全身的に注入するか、または抗原特異的ホーミング（homi ng）機構によって、もしくは直接の注射によって感染部位に提供することができ る。 遺伝子治療の好ましいモードは、ポリヌクレオチドが細胞の内部で複製されて 、 妨害効果が強化されて持続するような方法でポリヌクレオチドを提供するもので ある。このため、ポリヌクレオチドを対応する遺伝子の天然プロモーター、感染 細胞中で本来活性な異種プロモーター、または好適な薬剤によって導入すること が可能な異種プロモーターなどの好適なプロモーターに連結するように操作する 。好ましくは、操作してプロモーターに連結させたポリヌクレオチド配列が対応 する遺伝子の配列に相補的になるように、構築物を設計する。こうして、細胞ゲ ノム中に組み込まれた後は、投与されたポリヌクレオチドの転写物は遺伝子の転 写物に相補的であり、これとハイブリダイズすることが可能である。この手法は アンチセンス治療として知られている。 ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するRFHV/KSHVサブファミリーポリペプチドおよ びそれらの断片 図１に示すRFHVおよびKSHVポリヌクレオチドはそれぞれオープンリーディング フレームを１つ有する。コードされるポリペプチドはそれぞれ配列番号２および 配列番号４で表される。これらのポリペプチドはその他の配列決定されたヘルペ スウイルスのＤＮＡポリメラーゼに相同な相当数の残基を有する。これらはその 他の配列決定されたウイルスの対応する断片に対してよりも、互いの断片内同士 の方がより同一性が高い。この断片は完全なタンパク質のヌクレオチド基質結合 部位に近い残基を包含することが確実である。この領域はポリメラーゼの触媒活 性についてある役割を有すると考えられる。RDHV/KSHVサブファミリーのその他 のメンバーからのＤＮＡ活性を有するポリペプチドはこの領域範囲にわたって大 きな割合の同一残基を共有しているものと予想される。一般的に、RFHVおよびKS HV間で保存されている残基はこのサブファミリー内で比較的保存されているもの と予想される。 配列番号２のほぼ第89アミノ酸から開始する、RFHVおよびKSHVのＤＮＡポリメ ラーゼ間で同一で共通する約46残基の線状配列が存在する。配列番号２のほぼ第 88アミノ酸から開始する、RFHVおよびeHV2のＤＮＡポリメラーゼ間で共通する約 31残基の線状配列が存在する。このeHV2と共通する配列を配列番号112に別記す る。配列番号112中に、RFHVおよびsHV1間で共通する約26アミノ酸の配列１つ、 ならびにRFHVおよびEBV間で共通する約12アミノ酸の配列２つもまた含まれる。 配列番号４のほぼ第10アミノ酸から開始する、KSHVおよび各種のその他のガンマ ヘルペスウイルス間で共通する約15残基の線状配列が存在する。この共通する配 列を配列番号113に別記する。配列番号２または４には含まれるが配列番号112ま たは113に含まれない配列で、その他の既知のヘルペスウイルスＤＮＡポリメラ ーゼと共通する最長の配列は、アミノ酸の長さ10である。したがって、RFHVまた はKSHVＤＮＡポリメラーゼタンパク質配列からの11アミノ酸またはそれ以上の断 片で配列番号112または113中にないものは、いずれもRFHV/KSHvサブファミリー 、またはその中の種および変異体に特異的であることが確実である。 本発明はRFHV/KSHVサブファミリーのヘルペスウイルスからの完全なＤＮＡポ リメラーゼ、およびこのサブファミリーに対して特異的なこれらの任意の断片の 両方を包含する。本発明の好ましいＤＮＡポリメラーゼ断片は長さ11アミノ酸以 上であり、より好ましくは長さ約12アミノ酸てあり、より好ましくは長さ約15ア ミノ酸以上である。さらにより好ましくは、長さ約20アミノ酸であり、それ以上 により好ましいのは長さ約30アミノ酸以上である。 RFHVおよびKSHVＤＮＡポリメラーゼ断片のアミノ酸配列はウイルス特異的およ び交差反応性抗原領域を同定するために使用することができる。 原則として、特異的抗体は、配列間における、抗体が由来する種によっても共 有されていないなんらかのアミノ酸配列の差異を認識することができるものであ る。抗体の結合部位は一般的に抗原の5−9アミノ酸残基の範囲を含む程度に大き く、１つのアミノ酸の差異でも十分認識することが可能である。特異的抗体は、 そのＤＮＡポリメラーゼを発現するウイルスが感染した動物内で自然に発生する ポリクローナル応答の一部であると考えられる。特異的抗体は、完全ポリメラー ゼまたはポリメラーゼ断片のいずれかを実験動物に注射することによって、誘導 することもできる。 このように、RFHVまたはKSHVに特有の５アミノ酸またはそれ以上の任意のペプ チドは潜在的なウイルス特異的抗原であり、RFHVまたはKSHV特異的抗原によって 認識されることができるはずである。RFHVおよびKSHV間で共通するがEBV、eHV2 およびsHV1とは共通しない５アミノ酸以上のペプチドは、潜在的なRFHV/KSHVサ ブファミリー特異的抗原である。 好ましいペプチドの例をいくつか表８に示す。当業者は、列記したペプチドの 長さのわずかな変更、および／またはペプチドのフレームのいずれかの方向への ２、３残基の移動によって、同様の特異性を有する別のペプチドを設計すること ができることを、即時に認識するであろう。 表８に示すクラスＩペプチドはガンマヘルペスウイルスサブファミリーのすべ ての既知のＤＮＡポリメラーゼポリペプチド配列間で保存されている。これらの ＤＮＡポリメラーゼのこの領域の１つに対する抗体はその他のものと交差反応す るものと予想される。クラス11ペプチドはRFHVおよびKSHV間では保存されている がsHV1およびEBVでは保存されていない。この領域に対する抗体はRFHV、KSHVお よびRFHV/KSHVサブファミリーのその他のウイルス間で交差反応するものと予想 される。クラス111ペプチドはRFHVおよびKSHV間で異なっている。この領域、特 に同一でない残基に結合する抗体はRFHVＤＮＡポリメラーゼとKSHVＤＮＡポリメ ラーゼを識別するものと予想される。 クラスIIおよびIIIの特に好ましいペプチドは、ＱＧＲＫＭＬＥ、ＡＲＦＫＶ Ｉ、ＲＲＰＩＤＶＳ、ＱＲＰＩＥＡＳ、ＩＥＡＳＰＥＡおよびＩＤＶＳＰＤＡで ある。ＲＦＨＶおよび／またはＫＳＨＶ由来のＤＮＡポリメラーゼの完全な配列 がわかれば、その分子の他の領域に対するウイルス特異的ペプチドまたはサブフ ァミリー特異的ペプチドが、同様の分析により予測できる。ポリペプチドの調製 完全なタンパク質、タンパク質断片および抗原領域などの本発明のポリペプチ ドは、いずれも当業者には公知の、異なるいくつかの方法により調製できる。例 えば、全長ｃＤＮＡの適切な鎖を、好適なプロモーターに機能を発揮するように 連結し、好適な宿主細胞に入れてトランスフェクションすることができる。この 宿主細胞は次いで、転写および翻訳が生じ得る条件下で培養し、続いて、ポリペ プチドを回収する。S．cerevisiaeをトランスフェクションすることによるヘル ペスウイルスＤＮＡポリメラーゼの発現および回収の記載については、Haffeyら 、および特許出願EP 0337441を参照。哺乳動物細胞での別のヘルペスウイルスタ ンパク質の発現の記載に対しては、米国特許No．5,244,792（Buvkeら）を参照。 ポリペプチドはまた、化学合成により、配列データから直接調製することもで きる。いくつかの合成法が当技術分野で公知である。好ましい方法は、固相Merr ifield法である。あるいはまた、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドは、先に記載したいずれかの方法によって調製し、ウサギ網状赤血球系など のin vitro翻訳系を用いて翻訳することができる。例えば、Dorskyら、を参照。ヘルペスウイルス感染を評価するためのポリペプチドの使用 本発明に含まれるポリペプチドは、いくつかの異なる用途において個体でのヘ ルペスウイルス感染の状態を検出または評価するために使用することができる。 一つの用途では、ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼの一部をコードするポ リペプチドは、それを特異的に認識し得る抗体の存在を検出するためのアッセイ のための試薬となる。そのような抗体は、例えば、現在または過去にヘルペスウ イルス感染を受けた人の循環系に存在し得る。 循環系におけるＤＮＡポリメラーゼに対する抗体の存在は、病的症状を早期に 示し得る。Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼに対する抗体は、急性Ｂ型肝炎 ウイルス感染の早期指標である（WO 8904964:Fietelsonら）。ＤＮＡポリメラー ゼに対する抗体は、鼻咽頭癌の診断に有用である（Linら、Liuら）。同様に、そ の抗体は、カポジ肉腫病変が臨床的に現れる前の、ＨＩＶ感染したヒトのＫＳＨ ＶのＤＮＡポリメラーゼに対する抗体の存在をモニターするのに有用である可能 性がある。 抗体レベルの測定に好適な臨床サンプルとしては、γヘルペスウイルス感染の 疑いのある個体からの血清または血漿が挙げられる。抗体の存在は、例えばイム ノアッセイによって測定される。 ウイルスペプチドを使用して抗体を定量するための数多くのイムノアッセイ法 が当技術分野で確立されている（例えば、米国特許No.5,350,671:Houghtonらを 参照）。例えば、潜在的に特異的抗体を含む試験サンプルを、予め測定した非限 定量の試薬ポリペプチドと混合することができる。この試薬は、酵素または放射 性同位体などの、直接結合した標識を含んでもよい。液相アッセイの場合、未反 応の試薬は、濾過またはクロマトグラフィーなどの分離技術によって除去する。 あるいはまた、サンプル中の抗体は、まず、固相上で試薬による捕獲を行うこと ができる。これは、例えば、特異的ポリペプチド、抗免疫グロブリンまたはプロ テインＡであり得る。捕獲した抗体は、次いで、標識を結合した特異的ポリペプ チド、抗免疫グロブリンまたはプロテインＡなどの第二の試薬により検出する。 捕獲試薬または検出試薬の少なくとも一方は、特異的ポリペプチドでなければな らない。第三の方法では、ポリペプチドを含む細胞または組織片の上に、抗体を 含む試験サンプルを置き、次いで、標識した抗免疫グロブリンなどの検出試薬を 置く。これら全て例において、複合体中の捕獲された標識の量は、試験サンプル に存在する特異抗体の量と比例する。同様に、試験サンプル中の抗体を、標識し た抗体と、限定量の特異的ペプチドへの結合について競合させるアッセイが設計 できる。複合体中の標識の量は、この場合、試験サンプル中の特異的抗体の量と 反比例する。これらのアッセイのいずれかを使用して得られる結果を、試験サン プルと、未感染源由来の対照サンプルとの間で比較する。 試薬のポリペプチドを適切に選択することにより、所望の特異性を有する抗体 が検出され得る。例えば、完全なＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、または、 ヘルペスウイルス間で保存される領域を含む断片を使用する場合、試験サンプル において検出される抗体は、ウイルス特異性、交差反応性、またはその両方であ り得る。この性質を有する試薬は、ヘルペスウ．イルス感染に対する一般的スク リーニングアッセイに対して好ましい。アッセイをＲＦＨＶまたはＫＳＨＶに対 して特異的な抗体に対して特異的にするためには、、表８のクラスIIIに挙げた ような、適切なウイルスＤＮＡポリメラーゼの非保存領域を含む抗原ペプチドを 選択する。好ましくは、そのようなペプチドの混合物を使用する。ＲＦＨＶ、Ｋ ＳＨＶ、およびｓＨＶ１およびＥＢＶ以外のγヘルペスファミリーの密接に関連 したウイルスに対する抗体を同時に検出するためには、表８のクラスIIに挙げた 性質を有する抗原ペプチドを選択する。好ましくは、そのようなペプチドの混合 物を使用する。 ヘルペスウイルス感染中に刺激された抗体は、感染がいったん消散すると、退 くか、宿主の免疫学的記憶の一部として生き残り得る。後者の場合、現在の感染 による抗体は、抗体のクラスを調べることにより、免疫学的記憶による抗体と区 別できる。例えば、試験サンプル中の抗体を特異的ポリペプチドで捕獲し、次い で標識した抗−ＩｇＭまたは抗−ＩｇＧで展開させるアッセイを行うことができ る。試験サンプル中にＩｇＭクラスの特異的抗体が存在すれば、進行中の感染を 示し、一方、ＩｇＧ抗体のみが存在すれば、その活性が、以前の感染またはワク チンの免疫学的記憶によることを示す。 本発明の別の用途では、ヘルペスウイルスがコードされたＤＮＡポリメラーゼ をサンプルから単離し、その存在量を酵素的アッセイによって測定する。生物学 的サンプル中のＤＮＡポリメラーゼ活性についてのアッセイは、例えば、ポリメ ラーゼを抽出し、適切な重合アッセイを行うことにより行うことができる。ポリ メラーゼは、標準的技法により、固体組織サンプルまたは組織ホモジネートから 可溶化させることができ、例えば、TRITON^TM X-100またはデオキシコール酸塩な どの非イオン性界面活性剤を使用して行う。あるいはまた、ポリメラーゼを感染 細胞によって分泌させる場合は、血漿またはリンパ球などの液体サンプル上でア ッセイを行うことができるであろう。 ＤＮＡポリメラーゼアッセイを行うための方法は、当技術分野で公知である。 例えば、重合混合物を、推定上のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種の標識し たヌクレオチドを含むヌクレオチドの混合物、Ｍ１３ファージＤＮＡなどのＤＮ Ａ鋳型、および、必要であれば、調節サブユニットを含むように調製する。混合 物は、重合を生じさせるのに十分な時間、37℃でインキュベートする。ポリメラ ーゼ活性またはその欠損は、ポリヌクレオチドへの標識の混入量を測定すること により求める。ＤＮＡポリメラーゼアッセイを行うための最適条件は、当業者で あれば、過度の実験をすることなく、容易に確かめられる。例えば、ＨＳＶのＤ ＮＡポリメラーゼに対する条件は、O'Donnellらによって発表されている。ＲＦ ＨＶおよびＫＳＨＶ由来のＤＮＡポリメラーゼに対する最適条件は、同様である と予想される。活性ワクチンにおける成分としてのポリペプチドの使用 本発明に含まれるポリペプチドが治療において効果的に使用できる方法の一例 は、ワクチンによる。 この適用の一つの態様では、ポリペプチドを、病原生物（この場合、ＲＦＨＶ ／ＫＳＨＶサブファミリーのヘルペスウイルス）に対して反応する抗体を刺激す るために、活性ワクチンの一部として投与する。単離したヘルペスウイルス成分 からの活性ワクチンの開発は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許No,5 ,171,568（Berkeら）を参照。この種のワクチンは、特に、予防に有用である。 なぜならば、それによって刺激される抗体が、その後に遭遇する生物を、それら が宿主細胞を侵略して複製サイクルを開始する機会を有する前に中和することが できるからである。 ポリペプチドワクチンを調製し、投与する方法は当技術分野で公知である。ペ プチドは、自分で免疫反応を引き出すことができ、あるいは、ＫＬＨなどのタン パク質担体への交差連結または結合などの化学操作により、より免疫原性にする ことができる。好ましくは、ワクチンは、ミョウバン、ムラミルジペプチド、リ ポゾームまたはDETOX^TMなどのアジュバントも含む。ワクチンは、場合によって 、湿潤剤、乳化剤および有機または無機の塩または酸などの補助物質を含み得る 。また、活性成分と相溶性があり、投与経路に適する製剤上許容され得る賦形剤 も含む。ペプチドワクチンの望ましい用量は、一般に、10μg〜１mgであり、有 効範囲が広い。ワクチンは、好ましくは、まず初回量として投与し、次いで、再 度ブースター量として、通常は少なくとも４週間後に投与する。効果を高めるた めに、さらにブースター量を投与してもよい。用量と回数は、通常は、治療責任 者が決定する。 この用途の別の態様では、ポリペプチドは、特定の細胞毒性Ｔリンパ球を刺激 するように設計されたワクチンの活性成分である。この種のワクチンは、特に、 すでに患者に存在しているヘルペスウイルス感染の治療に有用である。ヘルペス ウイルスのＤＮＡポリメラーゼは、細胞毒性Ｔ細胞ワクチンの好適な標的である 。これは、その構造が比較的保存されているからだけでなく、それがウイルスの 重要な内部成分であるからである。ウイルスの外部成分は、完全なウイルスおよ び不完全ウイルス粒子を循環させることにより発現され、免疫系を感染した細胞 からそらす効力を有する。しかし、ウイルスの内部成分は、組織適合性クラスＩ 分子の関係においてそれらを提示する、ウイルス感染した細胞によってのみ細胞 外で発現される。そのような細胞は、ウイルス複製部位を提示し、従って、宿主 内でウイルスの最も害を受けやすい位置を提示するため、特定の細胞毒性Ｔ細胞 に対して理想の標的である。 細胞毒性Ｔ細胞ワクチンは、抗体の刺激に必要とされるものとは異なる抗原領 域を含み得る。Ｔ細胞エピトープは、抗体エピトープとは異なり、一般に、コン ホメーションの関係にはあまり依存せず、および／または、両親媒性α−ヘリッ クスに折り畳むことができるペプチドの領域から発生する。細胞毒性Ｔ細胞ワク チンはまた、Ｔ細胞集団に対するペプチドの提示を高め、および／または細胞毒 性Ｔ細胞系譜の細胞の漸増を助け得る、上記以外の活性成分またはサイトカイン も含み得る。 前記態様のいずれかの改変では、免疫感作ペプチドが、単離されたタンパク質 またはタンパク質断片としてではなく、発現ベクターの形態で提供される。ペプ チドをコードするポリヌクレオチドは、転写および翻訳の適切な制御要素に機能 を発揮するように連結した後、好適なベクターに入れてトランスフェクションす る。好適なベクターとしては、ワクチンウイルスまたはヘルペスウイルスの弱毒 化したものが挙げられる。抗−ウイルス薬を設計またはスクリーニングするためのポリペプチドの使用 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子または遺伝子産物を妨害することにより、感染経路 またはこの病気の進行が改変される。本発明の目的は、有用な薬剤組成物および γヘルペスウイルス感染の治療における該化合物の使用方法を開発し、試験する ことができる方法を提供することである。特に好ましいのは、ＲＦＨＶおよびＫ ＳＨＶによる感染の治療に有用な薬剤化合物である。好適な薬剤は、ＤＮＡポリ メラーゼ遺伝子の転写または翻訳を妨害するもの、およびその遺伝子によってコ ードされるポリペプチドの触媒機能を妨害するものである。妨害のメカニズムは 知られている必要はなく、その妨害が、感染経路と関係する反応に対して優先す ることが必要である。 好ましい薬剤としては、ＤＮＡポリメラーゼの、ＤＮＡ鋳型であるヌクレオチ ド三リン酸基質への結合を競合的に妨害するものが挙げられる。さらに、酵素に よって合成された重合鎖に組みこまれうるが、それ以上の重合は阻止する、端の 閉じた複合体を形成するヌクレオチド類似体も好ましい(Reardonら)。本明細書 に記載の方法によって試験できる好ましい薬剤のいくつかの例としては、アフィ ジコロン、アシクロビル、ガンシクロビア、ホスカネット、オースポレイン（oo sporein）、ＢＨＣＧ、ＰＭＥＡ、他のヌクレオチド類似体、これらの化合物の イソトレン（isotrene）、および列挙したものと構造または機能的に関連する他 の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。 また、ＤＮＡポリメラーゼと触媒活性に必要な調節サブユニットとの結合を妨 害する薬剤も好ましい。先に記載したように、ＵＬ４２サブユニットは、複製工 程中のＨＳＶのＤＮＡポリメラーゼ活性に必須である。ＵＬ４２配列から設計し た小さいペプチドは、ＵＬ４２とＤＮＡポリメラーゼとの間の結合を阻害し、ポ リメラーゼ活性の有効な阻害剤である（米国特許No．5,223,391:Coenら）。ＨＳ Ｖ ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端領域は、ＵＬ４２サブユニットの結合に寄与 する。従って、ある条件下（ウイルス複製に必要な条件など）では、全ポリメラ ーゼ活性を発現するためには、ＲＦＨＶおよびＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼは 、ＵＬ４２の類似体であってもなくてもよい調節サブユニットを必要とすると予 想される。すなわち、γヘルペスウイルスに対して適切に適合させた、U.S．5,2 23,391に記載のものと機能的に同等のペプチドは、阻害活性を有し、治療上有用 であることが予想される。 本発明は、薬剤候補物質をスクリーニングして、どれが臨床用途に適切である かを決定する方法を提供する。該方法は、現在公知の抗ウイルス化合物および将 来設計され得る化合物に適用できる。 該方法は、活性ＤＮＡポリメラーゼを薬剤候補物質と結合し、生化学機能が薬 剤候補物質によって変化するかどうかを決定することを含む。ＤＮＡポリメラー ゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＲＦＨＶまたはＫＳＨＶのＤＮＡポリメ ラーゼ遺伝子によってコードされる如何なる断片であってもよい。適する断片は 、分子の活性部位をコードする遺伝子操作したポリペプチドを発現するか、ＤＮ Ａポリメラーゼをプロテアーゼによって切断して活性断片を精製することにより 得ることができる。好ましい態様では、ＤＮＡポリメラーゼ全体が提供される。 反応混合物はまた、好適なＤＮＡ鋳型である、基質のデオキシリボヌクレオチド 三リン酸および反応の進行に必要な如何なる調節サブユニットも含む。スクリー ニング方の一つの態様は、ＤＮＡポリメラーゼアッセイをin vitroで行うことで ある。ＤＮＡポリメラーゼは、単離された形態で提供され、適切な緩衝液中で他 の反応化合物と混合させる。ＤＮＡポリメラーゼアッセイは、先の節で概説した ように行って、モニターする。反応混合物中の酵素１モルまたは１g当たりのポ リメラーゼ活性の量は、例えば、放射能標識したヌクレオチドが合成した鎖に組 み込まれる割合によって測定される。候補薬剤の効力は、二つの反応を、一方が 候補薬物を含むこと以外は共に同じである反応物質の混合物を使用して平行に行 うことにより測定できる。あるいはまた、候補薬剤の効果は、それを進行してい るポリメラーゼ反応に添加して、反応速度が変わるかどうかを調べることにより 測定できる。望ましい効果は、標識したＤＮＡの合成速度を消去するか、減少さ せるものである。 スクリーニング法の別の態様は、宿主細胞内でＤＮＡポリメラーゼの活性領域 をコードするポリヌクレオチドを発現することである。ポリヌクレオチドによる トランスフェクションは、宿主細胞の複製速度を高めることができ、その場合、 ポリメラーゼの活性は、細胞の複製速度を測定することによりモニターできる。 あるいは、ポリメラーゼの活性は、細胞内での標識したポリヌクレオチドなどの 産物の産生速度として測定できる。従って、薬剤の効力は、ＤＮＡポリメラーゼ 活性に対するその影響を追跡することにより測定できる。好適な対照実験として は、薬剤の不在下でのＤＮＡポリメラーゼ活性の測定および形質転換されていな い宿主細胞に対する薬剤の影響の測定が挙げられる。 スクリーニング法のさらに別の態様は、薬剤候補物質の単離したＤＮＡポリメ ラーゼまたはその断片への結合を測定することである。調節サブユニットの触媒 部位または結合部位に結合する化合物は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を妨害すると 予想される。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ全体または調節サブユニットの触媒 部位もしくは結合部位を含む断片を薬剤候補物質と混合させる。候補物質の結合 は、例えば、放射能標識した、または安定な同位体で標識した形態で候補物質を 提供することにより、直接測定できる。ポリメラーゼに結合した標識の存在は、 例えば、ポリメラーゼを好適な抗体により沈殿させるか、ポリメラーゼを固相に 結合させ、反応後に固相を洗浄することにより測定できる。候補物質のポリメラ ーゼへの結合は、ポリメラーゼにおけるコンホメーションの変化として認めるこ ともでき、それは、例えば示差分光法、核磁気共鳴または円二色性によって検出 できる。あるいは、結合は、競合アッセイで測定できる。例えば、ＤＮＡポリメ ラーゼを候補物質と混合した後、標識したヌクレオチドまたは調節サブユニット の断片を添加する。候補物質の生化学的に関連する部位への結合は、標識した化 合物のその後の結合を阻害するはずである。 本発明はまた、合理的な薬物設計によるヘルペス感染を治療するための薬剤の 開発を提供する。一般には、HodgsonおよびEricksonら、を参照。この態様では 、ＤＮＡポリメラーゼの三次元構造を、アミノ酸配列に基づく予測による模型製 作、または好ましくは実験による測定により決定する。実験法としては、抗体マ ッピング、突然変異分析および抗−イディオタイプの形成が挙げられる。特に好 ましいのは、Ｘ線結晶学である。プロテアーゼの三次元構造、特にヌクレオチド および調節サブユニット結合部位付近の重要なアミノ酸基の方向を知ることによ り、化合物が新しく設計されたり、既存の化合物が適切に改変される。設計した 化合物は、適切な電荷バランス、疎水性および／またはポリメラーゼの活性部位 付近への結合およびその部位の正常な生化学的機能の立体的阻害を可能にする形 状を有する。好ましくは、この方法によって設計した化合物は、続いて、上記で 概説したような薬物スクリーニングアッセイで試験する。ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体およびその作製 本明細書に含まれるヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、 それらの感染を受ける宿主にとって異質である。それらのポリメラーゼは、大き く、潜在的に多数の抗原領域を含む。それらは各々のウイルスのカプシド内に封 鎖され、恐らく宿主抗原の模倣はしていない。従って、これらのポリメラーゼは 、実質的に免疫原性であると予想される。抗体は、完全なヘルペスウイルスによ る感染中に脊椎動物の宿主によって自然に生じると考えられる。また、抗体は、 単離したＤＮＡポリメラーゼおよび適切に調製した断片の注入により実験動物に おいて高めることができると予想される。これらの予想は、実施例５および実施 例１０に記載の観察によって支持される。 ポリペプチドに対する抗体は、一般には、当技術分野で公知の方法により作製 する。動物において実験的に抗体産生を刺激するために、グルタルアルデヒドに よる重合、またはフロイントのアジュバントなどのアジュバントとの結合などの 技術により、ポリペプチドの免疫原性を高めるのがしばしば好ましい。免疫原は 、適切な実験動物、好ましくは、モクローナル抗体の作製には齧歯動物、ポリク ローナル抗体の作製には、ウサギまたはヒツジなどのより大きい動物、に注入す る。約４週間後に第二または追加の注入を行い、約１週間以内に抗体源の採取を 開始 するのが好ましい。 免疫感作した動物から採取した血清は、ポリクローナル抗体源を提供する。源 材料から特定の抗体活性を精製するための詳細な手法は、当技術分野で公知であ る。所望ならば、特定抗体活性は、プロテインＡクロマトグラフィー、硫安沈殿 、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび固体支持 体に結合した免疫感作ポリペプチドカラム上でのイムノアフィニティークロマト グラフィーなどの技術によりさらに精製することができる。 完全ＤＮＡポリメラーゼまたは保存配列を含む断片による免疫感作により高め られたポリクローナル抗体は、ヘルペスウイルス間で交差反応性であり得る。ウ イルスまたはサブファミリー特異的である抗体は、上記表８で挙げたような適切 な特異抗原で免疫感作することにより高めることができる。あるいは、より大き い断片に対して高められたポリクローナル抗体は、例えば、抗体を、それらのポ リメラーゼから作った吸着剤に通し、未結合画分を集めることによって、他のウ イルスＤＮＡポリメラーゼに対する望ましくない活性を取り除くことにより、特 異的にすることができる。 あるいは、脾臓細胞などの免疫細胞は、免疫感作した動物から回収し、モノク ローナル抗体産生細胞系の作製に使用することができる。例えば、Harrow & Lan e(1988)，米国特許No.4,472,500（Milsteinら）および米国特許No.4,444,887（H offmanら）を参照。 簡単に述べると、抗体産生系は、特に、細胞融合、またはエプスタイン−バー ルウイルスによる抗体産生細胞の形質転換、または癌遺伝子ＤＮＡによる形質転 換により産生できる。処理した細胞をクローン化し、培養して、所望の特異性の 抗体を産生するクローンを選択する。特異性の試験は、多くの技術、例えば、標 準的イムノアッセイにおける検出試薬としての免疫感作ポリペプチドの使用、ま たは免疫組織化学におけるポリペプチドを発現する細胞の使用により、培養上清 上で行うことができる。選択したクローンから供給されるモノクローナル抗体は 、大量の組織培養上清から、または、クローンを注入して適切に調製した宿主細 胞の腹水から精製できる。 この方法の有効な改変法としては、ポリペプチドによる免疫感作を単離した細 胞上で行う方法が挙げられる。抗体断片および他の誘導体は、抗体をタンパク質 分解酵素により分解するなどの標準的タンパク質化学の方法により、作製できる 。抗体を遺伝子操作した変異体は、抗体をコードするポリヌクレオチドを得て、 分子生物学の一般的方法を適用して突然変異を導入し、その変異体を翻訳するこ とにより作製できる。 完全なＤＮＡポリメラーゼまたは保存配列を含む断片を注入することにより高 められたモノクローナル抗体は、ヘルペスウイルス間で交差反応性であり得る。 ウイルスまたはサブファミリー特異的である抗体は、表８から選択できるような 適切な特異抗原により免疫感作して高めることができる。あるいは、ウイルス特 異的クローンは、スクリーニング工程において、表８から選択されるものなどの 適する抗原を使用することにより、クローン化したハイブリドーマから選択でき る。ＤＮＡポリメラーゼを検出するための抗体の生物学的サンプルにおける使用 抗体を使用して、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドならびに例えば固体組織サ ンプルおよび培養細胞中に存在し得るウイルス起源の断片を検出することができ る。そのような測定を行うための免疫組織学的技法は、当業者には周知である。 一般に、組織は、凍結、種々の溶媒への交換、パラホルムアルデヒドなどの物質 による固定、アルコールなどの物質による脱水乾燥、またはパラフィンもしくは ＯＣＴなどの市販の培地における包埋などの技術を組み合わせて保存する。サン プルの一片を適切に調製し、タンパク質に対して特異的な一次抗体で覆う。 一次抗体は、適切な標識とともに直接提供することができる。多くの場合、一 次抗体は、容易に作られ、または市販されている多数の展開試薬の一つを使用し て検出する。典型的には、これらの展開試薬は、抗−免疫グロブリンまたは蛋白 質Ａであり、それらは、それらに限定されないが、フルオレセインなどの蛍光マ ーカー、適切な化学化合物を析出させ得るペルオキシダーゼなどの酵素、金コロ イドなどの電子密度マーカー、または¹²⁵Ｉなどの放射性同位体などの標識を有 する。次いで、その片を適切な顕微鏡技術を使用して可視化し、標識の量を、ウ イルス感染の疑いある細胞と、感染領域の周囲の細胞または離れた部位から採取 した細胞などの対照細胞との間で比較する。 また、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質は、標準的 な定量イムノアッセイで検出することもできる。タンパク質が、適切な量で感染 細胞から分泌され、または放出される場合は、血漿または血清サンプルでの検出 が可能である。あるいは、標的タンパク質は、固体組織サンプルから可溶化し、 または抽出することができる。定量の前に、タンパク質は、所望により、ブロッ ト法または捕獲抗体の使用などにより固相に固定することができる。 定量を行うための多数のイムアッセイ法が確立されている。例えば、タンパク 質を、予め測定した、タンパク質に対して特異的な非限定量の試薬抗体と混合す る。試薬抗体は、酵素または放射性同位体など、直接結合した標識を含み、また は、抗−免疫グロブリンまたはプロテインＡなどの第二の標識試薬を添加しても よい。固相アッセイの場合、未反応試薬は、洗浄によって除去する。液相アッセ イの場合、未反応の試薬は、濾過またはクロマトグラフィーなどの他のいくつか の分離法によって除去する。複合体に捕獲される標識の量は、試験サンプルに存 在する標的タンパク質の量に比例する。この方法の改変法は競合アッセイであり 、標的タンパク質は、特異抗体上の結合部位に対して、標識した類似体と競合す る。この場合、捕獲される標識の量は、試験サンプルに存在する標的タンパク質 の量に反比例する。そのようないずれかのアッセイを使用して得られる結果を、 試験サンプルと、未感染源由来の対照サンプルとの間で比較する。 ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼに対する特異抗体は、開発、診断および 治療の研究において多数の用途がある。例えば、抗体は、薬物のスクリーニング （米国特許No.5,120,639を参照）または受動ワクチンの調製に使用できる。それ らはまた、以下の節に記載するように、生物学的サンプルにおけるヘルペスウイ ルスの検出および薬物のターゲッティングに使用することもできる。薬物のターゲッティングに対する抗体の使用 抗体がヘルペスウイルス感染の治療でどのように使用できるかの例は、エフェ クター成分の特定のターゲッティングにおけるものである。ウイルス感染した細 胞は一般に、組織適合クラスＩ抗原の関係において、それらの細胞表面上にウイ ルス（内部ウイルス成分を含む）のペプチドを提示する。従って、そのペプチド は、特異抗体が結合し得る感染細胞のマーカーとなる。従って、その抗体に結合 したエフェクター成分は、感染した細胞付近に集中して、それらの細胞に対する 効力は改善され、未感染細胞に対する効力が低下するようになる。さらに、その 抗体がエンドサイトーシスを誘導し得る場合は、エフェクターが細胞内部に入る のを高める。 ターゲッティングの目的の場合、ウイルスポリペプチド（この場合は、ＤＮＡ ポリメラーゼの一領域）に対して特異的な抗体は、適切なエフェクター成分と、 好ましくは共有結合または高親和結合により結合する。そのような組成物におけ る適切なエフェクター成分としては、¹³¹Ｉなどの放射性核種、毒性化学物質お よび毒性ペプチド（ジフテリア毒素など）が挙げられる。それ以外の好適なエフ ェクター成分は、場合によってはリポゾームでカプセル化した、アンチセンスポ リヌクレオチドである。 ヒトの治療における抗体分子のほとんどの用途では、ヒトモノクローナル抗体 または当技術分野で公知の技術によりヒト化した抗体を使用するのが好ましい。 こうすると、抗体分子自体が宿主の免疫系の標的となるのを防ぐのに役立つ。診断キット ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたは本発明の抗体を使用 する診断法は、診断検査室、実験研究所、開業医または個人によって行うことが できる。本発明はこれらの設定において使用可能な診断キットを提供する。個人 におけるヘルペスウイルスの存在は、その人から得た臨床サンプルにおいて、そ のサンプルに含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の変化として明らかにされる 。ヘルペスウイルスの存在から生じるこれらの成分の一つの変化は、健康な人の サンプルと比較した、成分の量の増加または減少、あるいは成分の形状の変化と いう形をとり得る。臨床サンプルは、場合により、検査する標的を濃縮するため の前処理を行う。使用者は次いで、診断成分における変化量または変化を検出す るために、キットに入っている試薬を適用する。 各キットには、必ず、その方法を特異的にする試薬が含まれている。すなわち 、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を検出するために使用するポリヌクレオチド試薬、標 的のタンパク質を検出するために使用する抗体試薬、または分析したいサンプル に存在し得る標的の抗体を検出するために使用するポリペプチド試薬である。試 薬 は、在庫の保存および後の検査を行うときの反応媒体への交換または添加に適す る固体形状または液体緩衝液で供給する。好適な包装が提供される。キットは、 場合により、その手法に有用な他の構成要素を提供し得る。これらの所望要素と しては、緩衝液、捕獲剤、展開剤、標識、反応表面、検出手段、対照サンプル、 取扱説明書および解説のための情報が挙げられる。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの他のメンバー ＲＦＨＶおよびＫＳＨＶは、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバーの 一例である。本発明は、本明細書で定義するように、そのサブファミリーの他の メンバーのＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。 ヒトを含めた霊長類を感染し得るいくつかを含む、そのサブファミリーの他のメ ンバーは、同定され、解析されるであろうと予想される。そのようなメンバーの 一つは、サルに感染する別のウイルスであり、ＲＦＨＶ２と命名されている。こ のウイルスの配列をコードするＤＮＡポリメラーゼのセグメントは、実施例１１ に記載するように、ニホンザル(Macaca mulatta)から得たＲＦ組織からクローン 化した。 このファミリーの他のメンバーを同定し性状解析するために、本発明の試薬お よび方法を、このようなウイルスに感染していることが疑われる組織試料から抽 出したＤＮＡに応用する。適切な供給源としては、ヒトおよび他の脊椎動物に存 在する広範囲の症状から得られる生物学的試料がある。好適なものは、ガンマヘ ルペスウイルスサブファミリーの他のメンバー（例えば、非ＥＢＶ起源の感染性 単核細胞症）のように、因子がリンパ親和性であることが疑われる症状である。 より好適なものは、その臨床的または組織学的特徴の少なくとも１つが、ＲＦＨ ＶまたはＫＳＨＶが関連する症状に類似している症状である。これらには、ａ） 線維増殖が疾患病理の一部である症状（特にコラーゲン沈着に関連するもの、そ して特に線維状組織が破壊されているもの）、ｂ）血管形成異常が関与する症状 、ｃ）悪性形質転換が関与する症状（特に、リンパ球系統の細胞があるがこれら に限定されない）、ｄ）基礎疾患である免疫不全症が疾患の頻度または重症度に 影響を与えている症状、ｅ）臓器または身体全体の複数の部位で突発的に起きる 症状、ｆ）疫学的データが、感染または環境因子が関与することを示唆する症状 がある。これらの基準の２つ以上を満足する症状が、さらに好ましい。特に好適 な症状の例としては、後腹膜線維症、結節性線維腫症、偽肉腫性線維腫症、線維 肉腫、硬化性腸間膜炎、成人型呼吸窮迫症候群、突発性肺線維症、種々の型の広 汎性増殖性糸球体腎炎、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠症、およびすべての型の 白血病やリンパ腫がある。 ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバーの同定方法は好ましくは、本発 明で提供される方法および試薬を単独または組合せで使用する。 １つの方法は、試料中のＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを 増幅および／または性状解析する。これは例えば、ＰＣＲのような反応でＲＦＨ Ｖ／ＫＳＨＶサブファミリー特異的オリゴヌクレオチド（例えば表６に記載のも の）を反応のプライマーとして用いて、ポリヌクレオチドを増幅することにより 達成される。増幅された反応生成物の存在は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリ ーのメンバーから得られた試料中のポリヌクレオチドを示唆する。 サブファミリーのメンバーはまた、適切なプローブを使用して試料のポリヌク レオチドについてハイブリダイゼーション測定を行うことにより同定される。試 験されるポリヌクレオチドは、例えばＰＣＲで表４または表６に示すオリゴヌク レオチドを使用して、ハイブリダイゼーション測定を行う前に随時増幅してもよ い。ハイブリダイゼーション測定の好適なプローブには、表６に記載のオリゴヌ クレオチドがある。他の好適なプローブは、ＲＦＨＶまたはＫＳＨＶからのＤＮ Ａポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの１６ヌクレオチドまたはそれ以 上の断片である（好ましくは配列番号１または配列番号３に含まれるもの）。ハ イブリダイゼーション反応は、プローブが配列番号２３〜２９のいずれかを含む ポリヌクレオチドと安定な２本鎖を形成しないが、配列番号１を含むポリヌクレ オチトまたは配列番号３を含むポリヌクレオチドのいずれか、好ましくは両方と 安定な２本鎖を形成する、最小の厳密性条件下で行われる。これらの条件下での 試験ポリヌクレオチドとの安定な２本鎖の形成は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファ ミリーのメンバーから得られる試料中のポリヌクレオチドの存在を示唆する。 サブファミリーのメンバーはまた、他の抗原（サブファミリーのメンバーでな いヘルペスウイルスにより産生されるものを含む）とは交差反応しないが、サブ ファミリーのメンバーにより産生される抗原と交差反応する特異性の試薬抗体を 使用して同定される。このような抗体を産生する方法は、前記節で概説された。 試験は例えば、前記した症状の個人から調製される組織切片の免疫組織学的試験 でこの抗体を使用することにより行われる。抗体による組織切片の染色が陽性で あることは、おそらく組織がウイルスに感染されているため、ＲＦＨＶ／ＫＳＨ Ｖサブファミリーのメンバーからの試料中にＤＮＡポリメラーゼが存在すること を示唆する。同様に、ＲＦＨＶまたはＫＳＨＶ抗原と交差反応するが他のヘルペ スウイルス抗原とは反応しない抗体が個人の循環流中に見つかれば、これは、Ｒ ＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバーへの個人の現在または過去の感染を 示唆する。 ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバーが生物学的試料中で疑われるな ら、図１のヌクレオチド３３０〜５０１に対応するＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の 断片を得ることが好ましい。標準的方法に従ってその断片の配列を決定して、こ のウイルスが本当に前記のようなＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバー であるかどうかを決定する。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバーの好 適な同定方法は、実施例１１と１２で後述される。 ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの新しいメンバーが同定されれば、本発明 の他の例を使用して、検出、診断、および薬剤開発を行うことができる。これら を新しいサブファミリーのメンバーに適するようにするための変更（もし必要な 場合）は、小さなものであることが予測され、新しい配列データに基づき明らか であり、日常的な調整の問題であろう。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーからのＤＮＡポリメラーゼの改変型 本発明はまた、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのＤＮＡポリメラーゼの改 変型を例示する。前記したように、他のヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ を用いる研究は、基質結合、ポリメラーゼ活性、または薬剤耐性に関与する分子 の活性領域および残基を正確に突き止めるのに役立った。記載された残基のある ものは、ポリメラーゼ分子の保存領域に出現し、ＲＦＨＶ、ＫＳＨＶ、およびこ れらが元々記載されたウイルスの間で同一である。ここから類推して、ＲＦＨＶ ／ＫＳＨＶサブファミリーのＤＮＡポリメラーゼ中の同じ残基の突然変異は、同 様の効果を有することが予測される。 表９中の残基の番号付けは、図１に記載のＫＳＨＶの全ＤＮＡポリメラーゼポ リヌクレオチド断片によりコードされる最初のアミノ酸から始まる（すなわち、 配列番号４の最初のアミノ酸）。 ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ヘルペスウイルスの複製に必須であると考えられ ている。従って、ＤＮＡポリメラーゼ活性を傷害すると予想される表９に示す突 然変異は、各ウイルスの弱毒化した型を作成するのに有用であるかも知れない。 他の突然変異は、抗ウイルス剤に対するＲＦＨＶまたはＫＳＨＶポリメラーゼの 耐性を上昇または低下させることもある。 ヘルペスウイルス（特に、弱毒化された型）は、治療目的のウイルスベクター を開発するのに有用である（Johnsonら、Wardら）。そのような用途の１つは、 多価ワクチンの開発である。特に開発途上国においては、数種類の病原体候補に 対して同時に免疫系を刺激することができる予防的ワクチンを提供することが好 ましい。いくつかの異なる病原体の免疫原性ペプチドを発現するように作成した ウイルスは、この目的を達成する。大きいゲノムは、ペプチドをコードする余分 のＤＮＡの数キロ塩基を容易に収容できるため、ヘルペスウイルスは特に適した ウイルスである。理想的には、ウイルスベクターは、ある生物活性を示し、かつ 宿主の免疫系の注意を喚起するのに充分に完全なものであり、一方同時に重大な 病原性を示さないように充分に弱毒化されている。すなわち、ＲＦＨＶ／ＫＳＨ Ｖサブファミリーの弱毒化されたウイルスは、同様の病原性の型に対するワクチ ンとして有用であり、追加のペプチドを発現し、免疫防御の範囲を拡大するよう に修飾されてよい。 ヘルペスウイルスの弱毒化型の別の用途は、遺伝子治療のための送達ビヒクル としてである（Latchmanら、Gloriosoら）。ポリヌクレオチドが遺伝子治療にお いて有効であるためには、標的組織部位に送達されなければならない。線維症、 悪性腫瘍および関連症状の治療において、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの 弱毒化されたウイルスベクターは、患部組織に対してターゲティングする手段を 有するため、他の標的機構（他のヘルペスウイルスを含む）より好ましい。本実 施態様において、ウイルスはまず弱毒化され、次に遺伝子治療に必要なポリヌク レオチド（例えば、前節で概説されているもの）を含有するように修飾される。 前記説明は特に、ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼコードする領域が同 定され、その配列が得られる方法の詳細な説明である。ＲＦＨＶおよびＫＳＨＶ のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の領域のポリヌクレオチド配列が提供される。 提供されるポリヌクレオチド配列は、本研究のために使用される組織試料中の ヘルペスウイルスのポリヌクレオチド中に含有される配列の正確な記載であると 考えられる。しかし、ＰＣＲのような増幅方法により得られる配列は、増幅の結 果として配列中に時々エラーがあることは認識されている。エラーの率は、単一 の測定については約０．４４％〜０．７５％の間であり、ｎ回の測定のコンセン サスについて√（ｎ−１）で割った率とほぼ同じ率である。それにもかかわらず 、エラーの率は２％またはそれ以上になる。増幅エラーのない配列は、関係のあ るクローンを選択するために表７に記載のようなオリゴヌクレオチドを使用して 、ヘルペスウイルスポリヌクレオチド配列のライブラリーを作成し、選択された クローン中のＤＮＡを配列決定することにより得られる。関連する方法は、当業 者に公知である（例えば、実施例９を参照）。 ヘルペスウイルスのアレル変種とエスケープ突然変異体が存在することは認識 されている。本発明の精神から逸脱することなく、天然に存在するか、または偶 然または故意に誘導される突然変異を取り込んだポリヌクレオチドとポリペプチ ドは、単離または誘導される。 以下の実施例は、当業者へのさらなる指針として提供されるものであり、決し て本発明を限定するものではない。実施例 実施例１：ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼのためのオリゴヌクレオチドプ ライマー 既知のヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、ＰＩＲタンパ ク質データベースから得たか、またはジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベ ースから得たＤＮＡ配列から得た。配列は、コンピューターによる整列プログラ ムおよび用手法で整列させた。いくつかの保存配列が明らかであった。最も保存 性の高い領域の３つを、増幅プライマーの設計のために選択した。選択した領域 は、領域１、領域２、領域３として図２に示す。 アミノ酸配列からの適切な保存領域を同定した後、これらの領域のＤＮＡ配列 を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。３’末端に１２〜１４塩基 対の縮重セグメント、そして５’末端に１８〜３０塩基のコンセンサスセグメン トを有するように、プライマーを設計した。これにより、最適の感度と特異性を 有するプライマーが得られる。 縮重セグメントは、ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼ配列の最も保存性の 高い領域にわたって延長し、最も少ない数の別コドンを包含する。従って縮重位 置に別ヌクレオチド残基を有するプライマーが合成され、最小数の組合せが得ら れる。得られるプライマーのそれぞれについて別の型は２５６以下であった。 コンセンサスセグメントは、ＤＮＡポリメラーゼ配列の対応する隣接（flanki ng）領域から得られた。一般にコンセンサスセグメントは、解析したすべてのＤ ＮＡポリメラーゼ配列の各位置の最も頻度の高いヌクレオチドを選択することに より得られた。しかし、安定な２本鎖を形成するプライマーの能力を最大にする ために、選択はＣまたはＧヌクレオチドの方に偏っていた。 結果を図３〜５に示し、表４に要約する。図３は、領域２の近くの既知のヘル ペスウイルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。これらの配列を用 いて、記載したオリゴヌクレオチドＤＦＡＳＡおよびＤＦＱＳＡを設計した。Ｐ ＣＲでは、これらのオリゴヌクレオチドが、コード鎖のアンチセンスである鎖と ハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼをコードする配列と同じ方向に重合を開 始することによりプライマーとして作用するであろう。図４は、領域３の近くの ＤＮＡ配列を示し、５’末端方向に重合を開始するためにオリゴヌクレオチドＶ ＹＧＡ、ＶＹＧＣＡおよびＶＹＧＳＱＡをここから設計した。図５は領域３の近 くのＤＮＡ配列を示し、オリゴヌクレオチドＧＤＴＤ１ＢとＧＤＴＤＳＱＢはこ こから設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、コード鎖とハイブリダイズし 、ＤＮＡポリメラーゼをコードする領域と反対の方向に重合を開始するであろう 。 設計した配列に従う合成オリゴヌクレオチドは、Oligos Etc，Inc.に注文して 得た。実施例２：ＤＮＡ抽出 ＡＩＤＳと診断されたヒト患者のカポシ肉腫病変から生検試料を得た。ワシン トン大学地域霊長類研究センター（the University of Washington Regional Pr imate Research Center）でマカカ・ネメストリナ（Macaca nemestrina）、マカ カ・ファスシキュラリス（Macaca fascicularis）、マカカ・フスカタ（Macaca fuscata）の集団の後腹膜線維腫症病変からも試料を得た。 試料をパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋し、これを通常の組 織学的検査のために処理した。 パラフィン試料の断片を、１．５mlのエッペンドルフ（登録商標）円錐遠心分 離管中で５００μlのキシレンで抽出した。試料を室温で５分間静かに揺すり、 管をエッペンドルフ（登録商標）卓上遠心分離機で１４，０００rpmで５分間遠 心分離した。パスツールピペットでキシレンを除去した後、５００μlの９０％ エタノールを加えて試料を再懸濁し、次に再度遠心分離した。エタノールを除去 し、洗浄工程を繰り返した。次に試料を約１時間空気乾燥した。５００μlのプ ロテイナーゼ−Ｋ緩衝液（０．５％ツイーン（登録商標）２０、界面活性剤；５ ０mMのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５０mM ＮａＣｌ）と５μlのプロテイナ ーゼＫ（２０mg/ml）を加え、試料を５５℃で３時間インキュベートした。プロ テイナーゼＫを９５℃で１０分間インキュベートして不活性化した。実施例３：ＲＦＨＶとＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼの増幅セグメントを得る 実施例１で得られたオリゴヌクレオチドを使用して、以下のプロトコールに従 って実施例２で抽出したＤＮＡを増幅した。 第一ＰＣＲ反応は、１μlのＤＮＡ鋳型、１μlのオリゴヌクレオチドＤＦＡＳ Ａ（５０pmol/μl）、１μlのオリゴヌクレオチドＧＤＴＤ１Ｂ（５０pmol/μl ）、１０μlの１０×ＷＢ４緩衝液（０．６７Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．８、４ ０mM ＭｇＣｌ₂、０．１６Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１Ｍ β−メルカプトエタ ノール、１mg/mlウシ血清アルブミン）、２．５mMずつのデオキシヌクレオチド 三リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する１μl、６６μlの蒸留水、および５０μlの鉱 物油を使用して行なった。混合物をパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）（モデ ル４８０）ＰＣＲ装置中で７５℃で加熱した。次に０．５μlのＴａｑポリメラ ーゼ（ＢＲＬ、５Ｕ/μl）と１９．５μlの水を加えた。以下の順序で３５サ イクルの増幅を行なった：９４℃で１分、６０℃で１分、および７２℃で１分。 第二ＰＣＲは以下のように行なった：前工程からの反応混合物１μlに、１０ μlの９〜１０×ＷＢ４緩衝液、１μlのｄＮＴＰ、０．５μlのＴａｑポリメラ ーゼ、８６．５μlの水、および５０μlの鉱物油を加えた。混合物を７５℃に加 熱し、１μlずつのオリゴヌクレオチドＶＹＧＡ（５０pmol/μl）およびオリゴ ヌクレオチドＧＤＴＤ１Ｂ（５０pmol/μl）を加えた。前記したように３５サイ クルの増幅を行なった。実施例４：２３６塩基断片の配列 各試料の最終増幅混合物のアリコートを、２％アガロースゲル電気泳動により 精製した。使用した９匹のマカカ・ネメストリナ（M．nemestrina）と１匹のマ カカ・ファスシキュラリス（M．fascicularis）のうち、４つのマカカ・ネメス トリナ（M．nemestrina）の試料が増幅生成物を与えた。増幅生成物はまた、ヒ トの試料からも得られた。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを 紫外線で可視化した。正しいサイズのバンドを、ＤＥＡＥペーパー上に溶出させ た。抽出した各ポリヌクレオチドをＰＧＥＭ−Ｔ（登録商標）ベクターに結合さ せ、コンピテントな細菌（大腸菌（E．coli）ＪＭ−１０９）に形質転換した。 増幅したＤＮＡを含有する細菌のコロニーを取り上げ培養した。細菌を溶解し、 フェノール−クロロホルムでＤＮＡを抽出し、次にエタノールで沈殿させた。Sa nger & Nicholsonのジデオキシヌクレオチド法によりＭ１３前進プライマーおよ び後退プライマーを用いて配列決定を行なった。 プライマーがハイブリダイズする領域の間の断片の長さは、１７２塩基対であ った。使用した４つのマカカ・ネメストリナ（M．nemestrina）試料について、 すべてが同じ配列データを与えた。残基の約７０％は、ＲＦＨＶとＫＳＨＶとの 間の断片が同一である。ヘルペスウイルスファミリーの最も密接に関連する既知 の配列と比較すると、配列間の差は、この断片の長さ全体に分布していた。任意 の２つの配列の間で同一の最も長い一続きのヌクレオチドは１１である。 この断片中にコードされているポリペプチドは、ＲＦＨＶとＫＳＨＶとの間で ８１％同一であり、このうち最初の２４残基は１００％同一であり、最初の３１ は９７％同一である。この配列中のＲＦＨＶまたはＫＳＨＶと他の既知のヘルペ スウイルスＤＮＡポリメラーゼの任意のものとの間で、同一の最も長い一続きの アミノ酸は１０である。実施例５：ＲＦＨＶとＫＳＨＶ特異的増幅測定法 ネスティッド（nested）ウイルス特異的増幅反応で使用されるＲＦＨＶとＫＳ ＨＶ ＤＮＡポリメラーゼのポリヌクレオチド断片の配列に基づき、４つのオリ ゴヌクレオチドを調製した。プライマーＶＡＳＧＡ、ＩＬＰＣＡ、ＰＩＥＡＢお よびＰＥＡＲＢはＲＦＨＶ配列に基づいており、プライマーＳＧＩＬＡ、ＣＬＮ ＩＡ、ＩＥＡＳＢ、およびＥＡＲＦＢはＫＳＨＶ配列に基づいていた（表７）。 ＲＦＨＶプライマーを使用して、マカーク（macaque）サルのＰＢＬから得たＤ ＮＡ試料を以下のように増幅した： ワシントン大学で集団中に生まれた２０匹のマカカ・ネメストリナ（M．nemes trina）から、凝固していない全血試料を集めた。野生のマカカ・ネメストリナ （M．nemestrina）から３０個の血液試料を得た。どのサルも顕著な線維腫症の 症状はなかった。血漿と血球を遠心して分離した。標準的血液分離法に従って密 度勾配により細胞を遠心分離して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。実 施例２の方法に従って、細胞からＤＮＡを抽出した。次にまずプライマーＶＡＳ ＧＡとＰＥＡＲＢを使用して、次にプライマーＩＬＰＣＡとＰＩＥＡＢを使用し て、ＤＮＡを増幅した。増幅条件は実施例３と同様であった。反応生成物をアガ ロースゲルに流し、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で観察した。 測定は二重測定で行い、ＰＣＲ反応生成物の交差汚染を防ぐ条件下で行なった 時、ＲＦ症状のないサルはこの測定法でいずれもその末梢血中にＤＮＡポリメラ ーゼをコードする検出できるレベルのＲＦＨＶポリヌクレオチドを有さないこと がわかった。 ＰＢＭＣはまた免疫組織学的方法で観察して、陽性ＰＣＲ生成物とＲＦＨＶ抗 原血症との間の相関を確認した。ＰＢＭＣを顕微鏡スライドにコーティングし、 ５０％メタノール、２０％アセトンおよび３０％水の混合液で固定した。これら に一次血清を重層し、洗浄し、ＦＩＴＣ−（ウサギ抗サルＩｇＧ）（ノルディク ラボズ（Nordic Labs））を重層し、再洗浄し、次に蛍光顕微鏡で観察した。 ＲＦＨＶ増幅測定の陽性結果を示すサル、またはＲＦＨＶもしくはＲＦＨＶ抽 出物で免疫したサルから、抗体含有血清が得られる。陰性の結果を示すサルから 得た血清は対照として使用できる。増幅試験で陽性結果を与えるサルからのＰＢ ＭＣはまた、ＲＦＨＶ抗原成分の抗原血症による陽性の免疫組織学的結果を示す 。 ＫＳＨＶについて増幅測定を行うために、ウイルスを有することが疑われる組 織（特に、カポシ肉腫病変および体腔Ｂ細胞リンパ腫のヒト患者からの生検試料 ）からＤＮＡを抽出する。２工程でＤＮＡを増幅する（第１工程ではプライマー ＳＧＩＬＡとＥＡＲＦＢを使用し、第２工程ではＣＬＮＩＡとＩＥＡＳＢを使用 する）。前記したように、臭化エチジウム染色を用いる検出により、反応生成物 中の豊富なポリヌクレオチドの存在により陽性結果が示される。実施例６：ＲＦＨＶとＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼの上流配列 追加の増幅反応で実施例３で使用したものと類似のカポシ肉腫組織からのＤＮ Ａを使用して、ＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のより長い断 片を得た。オリゴヌクレオチドＤＦＡＳＡとＧＤＴＤ１Ｂを使用して、実施例３ に記載のように第１段階の増幅反応を開始させ、反応生成物をアガロースゲルで 分離した。ＤＦＡＳＡ〜ＧＤＴＤ１Ｂへの断片のサイズ（現在は５３６塩基の長 さであることがわかっている）を、既知のｓＨＶ１とＥＢＶ配列から推定し、対 応するバンドをゲルから回収した。同じプライマーを使用して、抽出したポリヌ クレオチドに第２ラウンドの増幅を行なった。生成物を、実施例４のように大腸 菌（E．coli）にクローン化した。 適切な挿入体を含有するクローンを、組織から抽出したＤＮＡの３つの異なる 増幅物から同定した。クローン挿入体は、ベクター特異的オリゴヌクレオチド（ Ｍ１３前進および後退プライマー）を用いて両端から配列決定した。３つすべて の増幅物について、５’末端から約１６０のヌクレオチド（ＤＦＡＳＡハイブリ ダイズ領域を含む）と３’末端から約２３３ヌクレオチド（ＧＤＴＤ１Ｂハイブ リダイズ領域を含む）が配列決定された。断片の最も真ん中の部分を、３つの増 幅物の１つで配列決定した。 この断片のコンセンサス配列を、３回の測定の結果を適宜実施例４の結果と組 合せて得た。実施例４のＲＦＨＶ ＤＮＡポリメラーゼ断片について決定した配 列と比較して、データを図１に示す。両方の配列の番号付けは、プライマーＤＦ ＡＳＡの最初の位置で始まる。 ＤＦＡＳＡとＧＤＴＤ１Ｂのハイブリダイゼーション部位に対応する各配列の 領域は、標的配列の正確な反映ではないかも知れない。プライマーの間の断片は 、配列決定に使用されるポリヌクレオチドをそこから増幅したＤＮＡであると考 えられている。しかし、増幅の間に時々エラーが入っているかも知れない。ＫＳ ＨＶのコンセンサス配列を、組織から抽出されたＤＮＡの配列の正確な反映であ ると仮定して、５’末端方向へのヌクレオチド中の各増幅生成物の配列中に約０ ．７５％のエラー率があり、３’末端の方向への配列中に約０．４４％のエラー 率があった（プライマーとハイブリダイズする領域を含まず）。 対応するＲＦＨＶポリヌクレオチド配列を得るために、マカークサルの凍結Ｒ Ｆ組織からのＤＮＡを、まずＲＦＨＶ特異的プライマーＰＥＡＲＢとともに特異 性の広いＤＮＡポリメラーゼプライマーＤＦＡＳＡを使用し、次にＲＦＨＶ特異 的プライマーＰＩＥＡＢとともにＤＦＡＳＡにより増幅した。 方法は以下の通りであった：５μl（l）ＤＮＡ鋳型を各１μlのプライマー（ ５０pmol/μl）、１０μlの１０×ＷＢ４緩衝液、１μlの２．５mM ｄＮＴＰ、 ５９〜６５μlの水、および６０μlの鉱物油と混合した。温度を６０℃に上げ、 Ｔａｑポリメラーゼ（０．５μlを水で２０μlに希釈した）を加えた。ＤＮＡを 、９４℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で１分を３５サイクル行って増幅 した。２μlの増幅生成物を、１０μlの１０×ＷＢ４緩衝液、１μlの２．５mM ｄＮＴＰ、６６．５μlの水、０．５μlのＴａｑポリメラーゼ、および６０μ lの鉱物油に加えた。温度を６０℃に上げ、次に１μlのＰＩＥＡＢ（５０pmol/ μl）、２μlのＤＦＡＳＡ（５０pmol/μl）、および１８μlの水を加えた。増 幅サイクルは前記したように行なった。最後に第３ラウンドの増幅を行って放射 能標識を導入した。オリゴヌクレオチドＰＩＥＡＢは、ガンマ³²Ｐ−ＡＴＰで末 端標識し、１μlを、１μlの２．５mM ｄＮＴＰと１μlのＴａｑポリメラーゼ とともに前増幅工程からの２０μlの反応混合物に加えた。増幅は、前記したよ うに９４℃、５５゜Ｃ、および７２℃を５サイクル行なった。 放射能標識した反応生成物のアリコートを、６％ポリアクリルアミド配列決定 ゲルで電気泳動した。正しいサイズのバンド（ＫＳＨＶ配列との類推から予測さ れる）をオートラジオグラフィーにより同定し、乾燥ゲルから切り出した。ＤＮ Ａを５０μlの水中でインキュベートして溶出した。さらなる増幅反応は、２μl の溶出ＤＮＡ、１０μlの１０×ＷＢ４緩衝液、１μlの２．５mM ｄＮＴＰ、１ μlのＰＩＥＡＢ（５０pmol/μl）、１μlのＤＦＡＳＡ（５０pmol/μl）、０． ５μlのＴａｑポリメラーゼ、および８４．５μlの水を用いて行なった。増幅は 、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で６５秒を３５サイクルによ り行なった。増幅生成物をＱＵＩＡＥＸ（登録商標）ゲル抽出キットを使用して 単離し、ＤＮＡをｐＧＥＭ（登録商標）−ｔベクターにクローン化した。ＪＭ− １０９細胞をＤＮＡで形質転換し、挿入体を含有するコロニーを単離した。正し いサイズの挿入体を含有するコロニーを使用して、配列決定のためのＤＮＡを得 た。 これらの実験からのデータを、実施例４のデータと一緒にして、ＲＦＨＶとＫ ＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対応する５３６塩基対の配列を得た。最も 外側のプライマーとハイブリダイズする領域を除去して、４７５塩基対の各配列 を、ＲＦＨＶとＫＳＨＶについて決定されている。これらの配列を、他の配列決 定したガンマヘルペスウイルスからのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の対応する領域 と比較して図６に示す。ＲＦＨＶ配列と他のウイルスの任意のものとの間で同一 である最も長い領域は、最初の２０塩基対のサブ断片（配列番号１１０）であり 、第２の２０塩基対断片（配列番号１１１）はｅＨＶ２と共有した。 図７は対応するコードされたポリペプチド配列を示す。ＲＦＨＶとｅＨＶ２の ＤＮＡポリメラーゼ間で共有される配列番号２の真ん中に近い約３１残基の線状 配列がある。この共有される配列は、配列番号１１２に別に示す。２６アミノ酸 の配列は、同じ領域でＲＦＨＶとｓＨＶ１との間で共有され、１２アミノ酸の２ つの配列は、ＲＦＨＶとＥＢＶとの間で共有される。これらの相同性の領域は、 他のヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼ配列の保存された領域３の近くにマッ ピングされる（図２）。第２の共有配列は、ＫＳＨＶと他のガンマヘルペスウイ ルスとの間で配列番号４の初めの近くに存在する。この配列は、他のヘルペスウ イルスＤＮＡポリメラーゼ配列の保存された領域２の近くにマッピングされる。 ＫＳＨＶと他のガンマヘルペスウイルスの間で共有されるこの配列断片は、配列 番号１１３に別に示す。 図８は、ＲＦＨＶとＫＳＨＶについて本明細書において得られる４７５塩基対 の配列によりコードされる配列に対応する異なるヘルペスウイルスのスペクトル にわたるタンパク質配列の比較を示す。 配列間の同一性の程度を用いて、図９に示すようにＤＮＡポリメラーゼ間の関 連地図を作成することができる。種間の関係は、ポリペプチド間およびこれらを コードする生物の間の祖先の相対的親類関係を反映するかも知れない。この解析 に基づき、ＲＦＨＶとＫＳＨＶを、暫定的にヘルペスウイルスのガンマサブファ ミリー（これは、ｅＨＶ２、ｓＨＶ１およびＥＢＶも含む）に割り当てた。これ に基づきＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの他のウイルスは、ヘルペスウイル スガンマサブファミリーに割り当て可能である。実施例７：ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのオリゴヌクレオチドプライマー とプローブ ＲＦＨＶとＫＳＨＶについて得られた４７５塩基対のポリヌクレオチド断片の 配列に基づき、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーのメンバーのためにＰＣＲプ ライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用できる５つのオリゴ ヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを、ＬＳＧＧＡ、ＣＴＤ ＰＡ、ＰＣＬＮＡ、ＫＭＬＥＡ、およびＧＩＳＰＡと命名した。 これらのオリゴヌクレオチドをこれらが得られた配列とともに図１０に示す。 実施例１のオリゴヌクレオチドのように、これらは５’末端方向にコンセンサス 配列を有し、３’末端方向に縮重セグメントを有する。しかしこれらのオリゴヌ クレオチドはＲＦＨＶとＫＳＨＶ配列にのみ基づき、従ってＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ サブファミリーのＤＮＡポリメラーゼと安定な２本鎖を優先的に形成するであろ う。これらが、ＲＦＨＶまたはＫＳＨＶをコードするポリヌクレオチド断片と安 定な２本鎖を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件下で、これ らは、ＲＦＨＶまたはＫＳＨＶ配列の同等の長さのポリヌクレオチドが単独また は組合せで形成するより安定な２本鎖を、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの より多くのメンバーと形成することが予測される。 両方のオリゴヌクレオチドは同じ方向に向いている。ＰＣＲ増幅反応において 、これらのオリゴヌクレオチドのいずれかは、反対の配向のプライマー（例えば 、 ＧＤＴＤ１Ｂ）と組合せてプライマーとして使用されるかも知れない。実施例８：ＲＦＨＶとＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼの抗原性および免疫原性領 域 ＲＦＨＶとＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードする領域の４７５塩基対の ポリヌクレオチド配列に基づき、タンパク質のどの部位が各ウイルスにユニーク であるか、従ってウイルス特異的抗体の結合の可能な部位であるかを予測するこ とができる。 図７は、長さが６または７アミノ酸のペプチド例を示す。このペプチドのある ものは、対応するガンマヘルペスウイルスペプチドと比較してＲＦＨＶまたはＫ ＳＨＶ（クラスIII）、またはＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリー（クラスII） について独特である１つまたはそれ以上の残基を含む。これらのペプチドを表８ に示す。図７と表８のアミノ酸残基の番号付けは、ＶＹＧＡプライマーのハイブ リダイゼーション部位の後からコードされる第１のアミノ酸から始まる（図１の ヌクレオチド３３１位）。 ＤＮＡポリメラーゼの５７アミノ酸残基内に含有される領域が抗体により認識 されることを確認するために、コンピューター解析を行ってHopp and Woods抗原 性プロットを作成した。Hopp and Woods測定は、一部は連続のアミノ酸残基の相 対的親水性と疎水性に基づく（Hoppら）。 結果を図１１と図１２に示す。ＲＦＨＶの番号付けは、ＶＹＧＡプライマーの 後でコードされる最初のアミノ酸から始まる（図７のように）。図１２のＫＳＨ Ｖポリペプチド残基の番号付けは、ＤＦＡＳＡプライマーのハイブリダイゼーシ ョン部位の後でコードされる最初のアミノ酸から始まる（図１のヌクレオチド２ ８位）。 ＲＦＨＶとＫＳＨＶのいずれも、抗体標的部位であると予測されるいくつかの 領域を含有する。例えばＲＦＨＶは、アミノ酸配列に沿っていくつかの疎水性お よび抗原性パッチを示す。ＫＳＨＶは、残基２６、４４、５２、１２１および１ ５１で始まる疎水性パッチ、そして残基８、３７、４５、および９４で始まる抗 原性パッチを示す。これらの領域のいくつかに対応する図７のペプチドは、特に 抗原性である。実施例９：完全なＲＦＨＶとＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼコード領域の配列決 定 ＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードする領域の追加の配列データは、実施 例６に示すセグメントの５’および３’方向に得られている。 Ｋ−１２およびＫ−１５と呼ぶ２つのカポシ肉腫試料を使用して、実施例２の 方法に従ってＤＮＡを調製した。 すでに得られているＫＳＨＶ配列に隣接するヘルペスウイルスＤＮＡポリメラ ーゼ核酸配列とハイブリダイズするように、追加の１型オリゴヌクレオチドプラ イマーを設計した。例を表１０に示す。 ＰＣＲ増幅は以下の通りである：各試料からの１００ngのＤＮＡを５０μlの 全反応緩衝液中で以下の条件で増幅した：１×ＰＣＲ緩衝液（６７mMトリス緩衝 液、ｐＨ８．８、１６mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１０Ｍ β−メルカプトエタノール 、０．１mg/mlウシ血清アルブミン）、２mM ＭｇＣｌ₂、５０pmolずつのオリゴ ヌクレオチドＣＶＮ１ＡとＦＤＩＥＣ１Ｂ、各１００μMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（ＡＭＰＬＩＴＡＱ （登録商標）、パーキン・エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus））。増幅 は９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で３０秒を４５サイクルによ り行なった。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム 染色で可視化させた。 ＰＣＲ生成物をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＳＰＩＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（ キアゲン（Quiagen）、チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）を使 用して精製した。生成物をＰＴ７ＢＬＵＥ（登録商標）ベクター（，バゲン（No vagen）、マジソン、ウィスコンシン州にクローン化した。ＱＩＡＧＥＮ ＳＰ ＩＮ（登録商標）プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドを精製し た。精製したプラスミドを、ＡＢＩ自動配列決定法を用いてＭ１３前進および後 退プライマーを使用して配列決定した。Ｋ−１２とＫ−１５のそれぞれから５つ のクローンを配列決定した。 ２つの体腔リンパ腫細胞株（ＢＣ−１とＢＣ−２と呼んだ）を、下流の配列の 決定のためのＤＮＡ供給源として使用した。各株からの５×１０⁵細胞をＰＢＳ で洗浄し、別々にペレットにした。プロテイナーゼ−Ｋ緩衝液を各ペレットに加 え、６５℃で１時間インキュベートした。１：１（容量：容量）フェノール：ク ロロホルムでＤＮＡを２回抽出し、エタノールで沈殿させ洗浄し、１０mMのトリ ス緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。 ＢＣ−１とＢＣ−２細胞株からの約０．５μgの全ゲノムＤＮＡを、総量１０ ０μlの１×ＰＣＲ緩衝液中、２５pmolのオリゴヌクレオチドプライマ−ＣＶＮ ＶＡとＥＡＲＦＢ、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマ ンハイム（Boehringer-Mannheim））、２５０μMのｄＮＴＰ、および４mM Ｍｇ Ｃｌ₂とともに使用した。ＰＣＲ増幅は、７０℃で１分「ホットスタート」を使 用した後、Ｔａｑポリメラーゼを加え、９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、およ び７２℃で９０秒を３５サイクルにより行なった。ＰＣＲ生成物を２％アガロー スゲルで電気泳動し、臭化エチジウム染色で可視化させた。 前記したようにＰＣＲ生成物を精製し、ＰＴ７ＢＬＵＥ（登録商標）ベクター にクローン化した。精製したプラスミドを、ＡＢＩ自動配列決定法を用いてＫＳ ＨＶ配列特異的プライマーＲＤＳＷＡ、ＦＤＣＳＡ、ＹＳＴＬＢおよびＤＹＥＴ Ｂを使用して配列決定した。ＤＮＡ配列は、単一の整列オープンリーディングフ レームについてＧｅｎｅＰｒｏアルゴリズムを使用して解析した。複数の整列に ついてコンセンサス配列を決定するためにＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用 した。 得られたヌクレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列（配列番号１１７） とともに図１３（配列番号１１６）に示す。全部で２５１１ヌクレオチドを示し 、そのうち最初の３５はＣＶＮＶＡプライマーに対応し、最後の１２はＹＦＤＫ Ｂプライマーに対応する。配列番号１１７のアミノ酸１３〜８３３に対応する配 列番号１１６の塩基３６〜２４９９は、ＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼ配列であ る。 ＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の一部と他のヘルペスウイルスと の整列を、図１４に示す。星印（*）で示す残基は、記載したすべての配列で同 一である。黒点（・）で示す残基は、保存性アミノ酸置換を示す。矢印（↑）で 示す残基は、他のヘルペスウイルスで保存されているがＫＳＨＶでは異なるため 興味がある。これらの１つは、他のウイルスでアスパラギン酸の位置にあるＫＳ ＨＶ中のヒスチジンであり、これは非保存性の差である。矢印で示した残基は、 ＫＳＨＶまたはＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーに特異的な抗体または薬剤の 適切な標的かも知れない。 得られた４つのＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列の中で、４つ の位置で変化が認められた。これらは天然に存在するアレル変種であると考えら れる。ほぼヌクレオチド３１９で配列ＴＴＣＴＣＧは別にＴＴＴＴＣＧとして見 つかり、これはサイレント変化（コードされるタンパク質配列に影響を与えない ）である。ほぼヌクレオチド３４８で、配列ＡＡＣＣＣＧは別にＡＡＴＣＣＧと して見つかり、これもまたサイレント変異である。ほぼヌクレオチド１７９５ で、配列ＣＣＡＧＴＡは別にＣＣＡＡＴＡとして見つかり、これは−Ｐｒｏ−Ｖ ａｌ−から−Ｐｒｏ−Ｉｌｅへのコードされるペプチドの変化である。ほぼヌク レオチド１８２２で、配列ＴＴＣＡＡＧは別にＴＴＣＡＧＧとして見つかり、こ れは−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−から−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−へのコードされるペプチドの変 化である。ＫＳＨＶアミノ酸配列変種と他のヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラ ーゼ配列との整列を図１５に示す。 ＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列を他のヘルペスウイルスと比 較すると、追加の３型（ウイルス特異的）オリゴヌクレオチドが設計される（表 １１に示す）： 他のガンマヘルペスウイルスに基づき、ＫＳＨＶ ＤＮＡポリメラーゼ配列は 全部で約３０００塩基対を有し、示した配列の５’および３’方向の両方に追加 のヌクレオチドを有することが予測される。上流および下流の両方向にＤＮＡポ リメラーゼに隣接する遺伝子から配列決定するために１型オリゴヌクレオチドを 使用して、患部組織の試料について記載したアプローチを行って残りの配列を決 定した。 あるいは、患部組織からＤＮＡライブラリーを作成して完全なＤＮＡポリメラ ーゼ配列が得られる。ＲＦＨＶ配列について、実施例５の増幅測定からＲＦＨＶ ＤＮＡを含有することがわかっているマカークサルのＰＢＭＣからライブラリ ーを調製する。ＫＳＨＶ配列について、カポシ肉腫病変またはＢ細胞体腔リンパ 腫からライブラリーを調製する。 ＤＮＡ溶解物をプロテイナーゼ−Ｋで消化し、フェノール−クロロホルムを使 用してＤＮＡを抽出する。充分に透析した後、調製物をＳａｕ３ＡＩ制限エンド ヌクレアーゼで部分的に消化する。消化物をショ糖勾配で遠心分離し、約１０〜 ２３キロ塩基の断片を回収する。ＢａｍＨＩで切断して、ラムダＤＡＳＨ−２（ 登録商標）ベクターファージ（ストラタジーン（Stratagene））を調製する。次 にサイズ選択した断片をベクターと混合し、ＤＮＡリガーゼを使用して連結する 。 連結したベクターをストラタジーン（Stratagene）のパッケージング抽出物を 用いて製造業者の説明書に従って調製する。これはＸＬ１−ＢＬＵＥ（登録商標 ）ＭＲＡ細菌を感染するのに使用される。約２００，０００のファージ感染細菌 を、プレートあたり約２０，０００の密度で寒天上に蒔く。培養後、プレートに ニトロセルロースを重層し、ニトロセルロースを断片に切る。断片からファージ を溶出し、そのＤＮＡを適切なウイルス特異的プライマーを使用して増幅反応に かける。反応生成物をアガロースゲルに流し、臭化エチジウムで染色する。予測 されるサイズの増幅ＤＮＡを与えるプレートの領域からファージを回収する。回 収されたファージを使用して新しいＸＬ１細菌を感染させ、新鮮な培養物に再度 蒔く。この方法を限界希釈法で単一のクローンが得られるまで繰り返す。 次にこの方法により選択された各クローンを、制限ヌクレアーゼを用いてマッ ピングして、取り込まれた断片のサイズを確認する。全ＤＮＡポリメラーゼ配列 を取り込むのに充分な大きさの挿入体を、ベクター特異的プライマーを使用して 両端で配列決定する。配列を全ＥＢＶゲノムの既知のポリヌクレオチド配列と比 較して、断片が完全なＤＮＡポリメラーゼ配列全体にわたっているかとうかを決 定する。適当なクローンからＤＮＡが得られ、剪断され、標準的方法によりショ ットガンクローニングにより配列決定される。実施例１０：免疫原性部位を同定する ＲＦＨＶによる感染の自然の経過の間にどの抗体が作成されるかを同定するた めに、実施例５のようにＰＢＭＣを用いるＲＦＨＶ ＤＮＡポリメラーゼ増幅試 験で陽性結果を与える１０〜２０匹のマカークサルから連続的血清試料を得る。 ＫＳＨＶに対する抗体を試験するために、カポシ肉腫病変を有する１０〜２０匹 のＡＩＤＳ被験体、１０〜２０匹のＨＩＶ陽性症状の無症候被験体、および１０ 〜２０匹のＨＩＶ陰性対照から、血清試料を得る。最初の試験で、各集団の血清 を抗体解析のためにプールする。 １２残基の長さのペプチドを、適宜ＲＦＨＶまたはＫＳＨＶ配列に従って合成 する。全配列をカバーし８残基が重複する一連のペプチドを調製する。ゲノシス （Genosys）のＳＰＯＴＳ（登録商標）キットを使用して製造業者の説明書に従 って、標準的Ｆ−Ｍｏｃ化学によりナイロン膜支持体上でペプチドを調製する。 調製した膜に血清を重層し、洗浄し、β−ガラクトースが結合した抗サルＩｇＧ または抗ヒトＩｇＧを適宜重層する。基質Ｘ−ｇａｌを加えて試験物を発色させ る。陽性の染色は、対応するペプチドに対する血清中のＩｇＧ抗体反応性を示す 。実施例１１：ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの他のＤＮＡポリメラーゼ配列 を得る ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶヘルペスウイルスサブファミリーの第３のメンバーからＤ ＮＡポリメラーゼをコードする配列を以下のように得た： 後腹膜線維腫症のマカカ・ムラッタ（Macaca mulatta）サルの２つの凍結組織 試料からＤＮＡを抽出した。抽出は実施例１に従って行なった。抽出したＤＮＡ を担体として４０μgのグリコーゲンの存在下でエタノールで沈殿させ、７０％ エタノールで洗浄し、１０mMトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。 ＤＮＡポリメラーゼをコードする配列の１５１塩基対断片を、三重ネスティッ ド（nested）ＰＣＲを使用して増幅した：各試料の１００ngのＤＮＡをまず以下 の条件下で１００μlの全反応緩衝液中で増幅した：１×ＰＣＲ緩衝液（６７mM トリス緩衝液、ｐＨ８．８、１６mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１０mM β−メルカプト エタノール、０．１mg/mlウシ血清アルブミン）、４mM ＭｇＣｌ₂、２５pmolず つのオリゴヌクレオチドＶＹＧＡとＶＹＧＣＡおよび５０pmolのオリゴヌクレオ チドＧＤＴＤ１Ｂ、各２５μMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２ ．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-M annheim））。増幅は、７０℃で１分「ホットスタート」を使用した後、Ｔａｑ ポリメラーゼを加え、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３０秒 を４３サイクルにより行なった。第２の増幅は、前記したように５０μlの反応 容量中鋳型として２μlの一次ＰＣＲ生成物を使用したが、２５pmolの各オリゴ ヌクレオチドＰＣＬＮＡとＧＤＴＤＳＱＢおよび１．２５単位のＴａｑポリメラ ーゼを使用した。「ホットスタート」を使用し３５サイクルの前記と同じ条件を 使用して増幅を行なった。第３の増幅は、前記したように５０μlの反応容量中 鋳型として２μlの二次ＰＣＲ生成物を使用したが、２５pmolの各オリゴヌクレ オチドＫＭＬＥＡとＧＤＴＤＳＱＢおよび１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを 使用した。「ホットスタート」を使用し、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、お よび７２℃で３０秒を３５サイクルにより行なった。 最終ＰＣＲ生成物を３％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム染色で 可視化させた。ＰＣＲ生成物をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＳＰＩＮ（登録商標）ＰＣＲ 精製キット（キアゲン（Quiagen）、チャッツワース（Chatsworth）、カリホル ニア州）を使用して精製した。生成物をＰＣ７ＢＬＵＥ（登録商標）ベクター（ ノバゲン（Novagen）、マジソン、ウィスコンシン州）にクローン化した。ＱＩ ＡＧＥＮ ＳＰＩＮ（登録商標）プラスミドミニプレップキットを使用してプラ スミドを精製した。精製したプラスミドを、ＵＳＢシーケナーゼ（Sequenase） ７−デアザ−ｄＧＴＰキットによりＭ１３前進および後退プライマーを使用して 配列決定した。 １５１塩基対断片の配列に基づき、２つの配列特異的（３型）オリゴヌクレオ チドを設計し、ＫＶＩＹＢおよびＡＳＰＤＢと命名した。これらを１型オリゴヌ クレオチドＱＡＨＮＡを使用してネスティッド（nested）ＰＣＲ増幅により、４ ６８塩基対断片を得た。最初の増幅は、前記したように１００μlのＰＣＲ混合 物中約１μgの各ＤＮＡ試料を用いて行なったが、プライマーとして各５Ｏpmol のＱＡＨＮＡとＫＶＩＹＢを使用した。増幅は、「ホットスタート」を使用し、 ９４℃で３０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で６０秒を３５サイクルにより 行なった。第２の増幅は、１００μlの反応容量中鋳型として３μlの一次ＰＣＲ 生成物を使用しプライマーとして５０pmolのＱＡＨＮＡとＡＳＰＤＢを使用した 。増幅は、「ホットスタート」を使用し、９４℃で３０秒、６０℃で６０秒、お よび７２℃で６０秒を４０サイクルにより行なった。次にＰＣＲ生成物を２．５ ％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム染色で可視化させた。ＰＣＲ生 成物を前記したようにＰＣ７ＢＬＵＥ（登録商標）ベクターにクローン化し配列 決定した。 得られるヌクレオチド配列を図１６に示し、「ＲＦＭｍ］（配列番号１１８） と記載して示す。これは、本出願の別のところで「ＲＦＨＶＭｍ」または「ＲＦ ＨＶ２」と呼んだＤＮＡポリメラーゼをコードする配列に対応する。コードされ るタンパク質配列は図１７に示す（配列番号１１９）。 ＲＦＨＶＭｍのＤＮＡポリメラーゼ配列と他のヘルペスウイルスとの同一性解 析を表１２に示す。 ＰＨＹＬＩＰ解析パッケージで実施されるように、距離マトリックス、隣接結 合およびブートストラップ解析を使用して系統発生的試験を行なった。図１８は ブートストラップ解析の結果を示し、記載した番号は記載の分岐点を支持する１ ００のうちのスコアである。この解析は、他のガンマヘルペスウイルスからＲＦ ＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーを分離する分岐点を強く支持する。ＲＦＨＶＭｍ とＲＦＨＶＭｎは、いずれかがＫＳＨＶに対するより、互いにより密接に関連す る。 配列をまたＧ＋Ｃ含量について解析した。結果を表１３に示す。ＧｅｎｅＰｒ ｏソフトウェア（リバーサイド・サイエンティフィック（Riverside Scientific ））を使用して計算された、４５４塩基対のＲＦＨＶＭｍに対応する領域にわた るＧ＋Ｃの割合を記載する。カッコ内の値は、全ＤＮＡポリメラーゼ配列（わ かっている場合）について計算されたＧ＋Ｃ含量である。またモノヌクレオチド 組成を考慮して、ＣｐＧの観察された頻度：予測される頻度の比であるＣｐＧ比 も示す。 ＫＳとＲＦのＧ＋Ｃの頻度は互いによく似ており、ＥＢＶやｅＨＶ２の高Ｇ− Ｃ含量とｓＨＶ１の低Ｇ＋Ｃ含量の中間にある。ＫＳとＲＦのＣｐＧジヌクレオ チドの頻度はよく似ており、モノヌクレオチド組成に基づき予測された値（１． ００）に近い。これらの値は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリー外のガンマヘ ルペスウイルスより、アルファおよびベータヘルペスウイルスの値に近い。Ｃｐ Ｇデータは、ＲＦＨＶＭｎ、ＲＦＨＶＭｍおよびＫＳＨＶゲノムは分裂していな い細胞では潜伏しており、増殖しているリンパ芽球細胞で潜伏しているｓＨＶ１ やＥＢＶと対照的である。 系統発生的解析、ＣｐＧ解析、および３つのウイルスにより引き起こされる症 状の間の類似性は、ＫＳＨＶについてモデルとしてサルウイルス、およびヒトに 感染するかも知れないＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの他のメンバーの使用 を支持している。 ＲＦＨＶＭｍ特異的３型オリゴヌクレオチドの例を表１４に示す： 図１９は、ＤＮＡポリメラーゼをコードする配列に沿う本発明のいくつかのオ リゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの大体の相対的位置を示す地図であ る。ヌクレオチド残基の番号付けはおおまかであり、グリコプロテインＢをコー ドする領域の出発位置に基づき、これは上流の方向のＤＮＡポリメラーゼをコー ドする領域に隣接する。各オリゴヌクレオチドの表示の後に、オリゴヌクレオチ ドの型を小文字の略語で示す：ｈ＝すべてのヘルペスウイルス（１型）；ｓｑ＝ 追加の利用可能な配列決定テイル；ｇ＝ガンマヘルペスウイルス（１型）；ｆ＝ ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーヘルペスウイルス（２型）；ｍ＝ＲＦＨＶＭ ｍ特異的（３型）；ｎ＝ＲＦＨＶＭｎ特異的（３型）；ｋｓ＝ＫＳＨＶ特異的（ ３型）。 系統発生的解析、ＣｐＧ解析、およひ３つのウイルスにより引き起こされる症 状の間の類似性は、ＫＳＨＶについてモデルとしてサルウイルス、およびヒトに 感染するかも知れないＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの他のメンバーの使用 を支持している。 種々の生物学的試料中のＤＮＡポリメラーゼをコードする配列の存在を検出す るために、オリゴヌクレオチドプライマーをスクリーニング測定法で使用した。 結果を図２０に示す。マカカ・ネメストリナ（M．nemestrina）サル＃２、＃３ 、＃４、＃７、＃１および＃５のＲＦ試料の結果を、それぞれレーンＡ〜Ｄ、Ｉ 、およびＪに示す。マカカ・ムラッタ（M．mulatta）サルのＲＦ試料の結果を、 レーンＧとＨに示す。影響を受けていないＳＲＶ２陰性マカカ・ネメストリナ（ M．nemestrina）サルの末梢血リンパ球の結果を、レーンＥとＦに示す。試料を 以下のようにネスティッド（nested）ＰＣＲを使用して測定した：マカカ・ネメ ス トリナ（M．nemestrina）試料について、外部プライマーはＶＡＳＧＡとＰＥＡ ＲＢであり、内部プライマーはＰＥＡＲＢとＰＩＥＡＢであった。マカカ・ムラ ッタ（M．mulatta）試料について、外部プライマーはＦＶＥＧＡとＫＶＩＹＢで あり、内部プライマーはＳＰＫＤＡとＡＳＰＤＢであった。この実験および他の 実験において、我々は増幅生成物の存在は試料の供給源と２つの方法で相関する ことを見いだした。まず、増幅はウイルス特異的であった（ＲＦＨＶＭｎ特異的 オリゴヌクレオチドはマカカ・ムラッタ（M．mulatta）ＲＦ病変からの配列を増 幅できないが、ＲＦＨＶＭｍ特異的オリゴヌクレオチドは増幅した）。第２にＲ Ｆに関連する症状のないマカカ・ネメストリナ（M．nemestrina）試料は、他の ウイルスが存在する時でも反応生成物を与えなかった。種々の組織（胸腺、骨髄 、脾臓、唾液腺、肝臓、腸間膜リンパ節、回腸盲腸接合部、十二指腸、腎臓およ び当然ＳＲＶ−２で感染される生殖線）は、ＲＦＨＶＭｎの存在について陰性で あった。実施例１２：ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶサブファミリーの他のヒトに感染するガンマヘ ルペスＤＮＡポリメラーゼ配列 従来まだ記載されていないガンマヘルペスウイルスを含有することが疑われる ヒト組織試料（特に、線維増殖症状、リンパ悪性腫瘍、および免疫不全症や免疫 抑制に関連する症状、例えば成人型呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ））を、凍結によ り調製し、ＤＮＡを実施例２のように抽出する。３つのヘルペスウイルスオリゴ ヌクレオチドプライマー、ＤＦＡＳＡ、ＶＹＧＡおよびＧＤＴＤ１Ｂを用いて、 実施例３に従って２ラウンドのＰＣＲ増幅を行なう。あるいはサブファミリー特 異的（２型）プライマーは、ＲＦＨＶ２の発見で本実施例にすでに記載のように 使用される。 増幅したポリヌクレオチドをアガロースで電気泳動し、ナイロン膜にブロット する。ブロットを、ＤＮＡポリメラーゼをコードするＲＦＨＶポリヌクレオチド から得られ³²Ｐで標識したポリヌクレオチド断片（図１の残基３３０〜５０１） からなるプローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション反応は、プ ローブとヘルペスウイルスからのＤＮＡポリメラーゼの間で安定な複合体を形成 するがプローブと内因性真核生物ＤＮＡポリメラーゼとの間では形成しない条件 下で行われる。この条件には、プローブのハイブリダイズするセグメントと、安 定な複合体を形成する標的の間で約６０％の同一性が必要であろう。これらの条 件は、プローブの長さと配列および標的の対応する配列に依存して、前記した式 を使用して計算される。この条件は、ａ）６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 １５mMクエン酸ナトリウム緩衝液）中で室温でホルムアミドの非存在下でプロー ブが標的にハイブリダイズすることを可能にする、そしてｂ）新たに形成された ２本鎖を２×ＳＳＣ中で室温で短時間（５〜１０分）洗浄する、ことが予測され る。 これらの条件下で標識されたプローブにハイブリダイズする増幅されたポリヌ クレオチドは、さらなる性状解析のために選択される。予測されるサイズは、Ｒ ＦＨＶまたはＫＳＨＶに対して挿入または欠失がなく、内部プライマーとしてＶ ＹＧＡおよびＧＤＴＤ１Ｂを使用して増幅されたウイルスについて、プライマー 結合領域を含む増幅された内部断片について２３６塩基対である。この断片の配 列は、実施例４に記載のように決定される。ＲＦＨＶまたはＫＳＨＶとは異なる 断片を含有する試料は、実施例９に記載の方法と同様の方法により、全ＤＮＡポ リメラーゼ遺伝子配列の決定のために選択される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/12 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボシュ，マーニックス エル. アメリカ合衆国 98004 ワシントン州 ベルビュー，78ティーエイチ アベニュー エヌ．イー．2601 (72)発明者 ストランド，カート アメリカ合衆国 98027 ワシントン州 イッサクア，エス．イー．32エヌディー ストリート 22101 (72)発明者 トラド，ジョージ ジェイ. アメリカ合衆国 98112 ワシントン州 シアトル，15ティーエイチ アベニュー イースト 1940 【要約の続き】 被験者の血清中に潜在的に存在する特異的抗体を検出す るために使用してもよい。それらはまた、ＤＮＡポリメ ラーゼ活性を阻害することによりウイルス複製を抑制す る医薬化合物を設計したりスクリーニングするために使 用してもよい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離さ れたポリヌクレオチドであって、配列番号１および配列番号３よりなる群から選 ばれる配列のヌクレオチド27〜501に対して少なくとも69％の同一性を有するヌ クレオチド配列を含んでなる前記ポリヌクレオチド。 ２．請求項１に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼコード領域の少 なくとも18個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる単離されたポリヌクレ オチドであって、該断片の配列が配列番号110または111に含有されないことを特 徴とする前記ポリヌクレオチド。 ３．請求項１に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼコード領域の少 なくとも50個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる単離されたポリヌクレ オチド。 ４．核酸結合活性、ヌクレオチド結合活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有 するポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド 。 ５．ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする領域を有する単離さ れたポリヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドLSGGA（配列番号107）に対 して少なくとも80％の同一性を有する26ヌクレオチドの配列、またはオリゴヌク レオチドCTDPA（配列番号108）に対して少なくとも69％の同一性を有する29ヌク レオチドの配列、またはオリゴヌクレオチドKMLEA（配列番号22）に対して少な くとも80％の同一性を有する32ヌクレオチドの配列、またはオリゴヌクレオチド GISPA（配列番号109）に対して少なくとも69％の同一性を有する29ヌクレオチド の配列を含んでなる前記ポリヌクレオチド。 ６．請求項５に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼコード領域の少 なくとも18個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる単離されたポリヌクレ オチドであって、該断片の配列が配列番号110または111に含有されないことを特 徴とする前記ポリヌクレオチド。 ７．該ヘルペスウイルスが霊長類に対する感染能を有する、請求項１または２ に記載のポリヌクレオチド。 ８．該ヘルペスウイルスがRFHV、RFHV2またはKSHVである、請求項１または２ に記載のポリヌクレオチド。 ９．配列番号１のヌクレオチド27〜501または配列番号３のヌクレオチド27〜5 01または配列番号116のヌクレオチド36〜2499または配列番号118のヌクレオチド 1〜454の線状配列とは同一であるが、配列番号110または配列番号111のいずれか に含まれる線状配列とは同一でない少なくとも18ヌクレオチドの線状配列を含ん でなる単離されたポリヌクレオチド。 10．配列番号１のヌクレオチド27〜501または配列番号３のヌクレオチド27〜5 01または配列番号116のヌクレオチド36〜2499または配列番号118のヌクレオチト １〜454と実質的に同一な線状配列を含む、請求項９に記載の単離されたポリヌ クレオチド。 11．請求項３に記載のポリヌクレオチドにコードされる単離されたポリペプチ ド。 12．配列番号２のアミノ酸10〜167または配列番号４のアミノ酸10〜167または 配列番号117のアミノ酸13〜833、または配列番号119〜123のいずれかに含まれる 配列と実質的に同一であるが、配列番号112または配列番号113に含有されない少 なくとも12アミノ酸の線状配列を含んでなる単離されたポリペプチド。 13．核酸結合活性、ヌクレオチド結合活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有 する、請求項12に記載の単離されたポリペプチド。 14．第２のアミノ酸配列に結合した請求項12に記載の単離されたペプチドのア ミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチド。 15．配列番号80、82、84、86、88および90〜103よりなる群から選ばれる配列 と同一であるアミノ酸の線状配列を含んでなる単離されたポリペプチド。 16．請求項12に記載のポリペプチドをコードする単離されたまたは非天然に生 じるポリヌクレオチド。 17．ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに直接結合した請求項 ２に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、融合ポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド。 18．請求項12に記載のポリペプチドのアミノ酸と同一である少なくとも12個の 連続したアミノ酸のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでな る組換えクローニングベクター。 19．請求項12に記載のポリペプチドのアミノ酸と同一である少なくとも12個の 連続したアミノ酸のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでな る組換え発現ベクター。 20．ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼをコードする線状配列を含んでな る組換えクローニングベクターであって、該配列が、少なくとも18ヌクレオチド 長であり、配列番号１、３、116または118には含まれるが配列番号110または111 には含まれない線状配列と同一であることを特徴とする前記組換えクローニング ベクター。 21．請求項16に記載のポリヌクレオチドにより、または請求項18、請求項19ま たは請求項20に記載のベクターにより遺伝的に改変された宿主細胞。 22．請求項１に記載のポリヌクレオチドの前記コード領域中にコードされるＤ ＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体または単離されたポリクローナ ル抗体。 23．請求項12に記載のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体または単離 されたポリクローナル抗体。 24．モノクローナル抗体である、請求項22に記載の抗体。 25．単離されたポリクローナル抗体である、請求項22に記載の抗体。 26．配列番号５〜16、21、22、104〜109および124〜152よりなる群から選ばれ るオリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド。 27．ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドの増幅されたコピーの 製造法であって、 a）該ポリヌクレオチドを請求項26に記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、そ して b）該ポリヌクレオチドと二重らせんを形成したオリゴヌクレオチドを伸長させ る工程を含んでなる前記製造法。 28．ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行なうことを含む、請求項27に記載の製 造法。 29．該PCRがアニーリングおよび伸長のサイクルの繰り返しを含み、該アニー リングを少なくとも60℃の温度で行なう、請求項28に記載の製造法。 30．該PCRを、10〜30mM(NH₄)₂SO₄および１〜10mM MgCl₂を含有する緩衝液中で 行なう、請求項28に記載の製造法。 31．増幅するポリヌクレオチドをまず、繊維芽細胞増殖およびコラーゲン沈着 により特徴づけられる疾患に罹患した個体から採取した生物学的サンプルから得 る、請求項27に記載の製造法。 32．霊長類に由来するサンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法で あって、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、請求項２に記載のポリヌクレオチド を含むプローブと接触させ（これは、配列番号１に示す配列を有するポリヌクレ オチドおよび配列番号３に示す配列を有するポリヌクレオチドとは該プローブが 安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列番号24〜29のいずれかの配列を 有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下で行なう）、そして b）工程a）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出する工程を含んでな る前記方法。 33．該プローブと接触させる前に、該サンプルのＤＮＡまたはＲＮＡ上で増幅 反応を行なうことをさらに含む、請求項32に記載の方法。 34．請求項26に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該増 幅反応を行なう、請求項33に記載の方法。 35．霊長類に由来するサンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法で あって、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、配列番号21、22、107、108または109 に示す配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させ（これは、配列番号１ に示す配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に示す配列を有するポリ ヌクレオチドとは該プローブが安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列 番号24〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条 件下で行なう）、そして b）工程a）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出する工程を含んでな る前記方法。 36．サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、配列番号22、107、108または109に示 す配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させ（これは、配列番号１に示 す配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に示す配列を有するポリヌク レオチドとは該プローブが安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列番号 23〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下 で行なう）、そして b）工程a）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出する工程を含んでな る前記方法。 37．サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、 a）請求項26に記載のオリゴヌクレオチドを増幅反応のプライマーとして用いて 、該サンプル中のポリヌクレオチド上で増幅反応を行い、そして b）該ポリヌクレオチドの増幅されたコピーの有無を検出する工程を含んでなる 前記方法。 38．配列番号107、配列番号108およびそれらのそれぞれの相補的配列よりなる 群から選ばれる配列を含むオリゴヌクレオチドと安定な二重らせんを形成しうる （これは、配列番号１に示す配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に 示す配列を有するポリヌクレオチドとは該オリゴヌクレオチドが安定な二重らせ んを形成しうるが配列番号23〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドと はそれを形成しない条件下で生じる）単離されたポリヌクレオチド。 39．請求項38に記載のポリヌクレオチド内にコードされる12アミノ酸の線状配 列を含んでなる単離されたポリペプチド。 40．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、該個体から得た 生物学的サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを、請求項32に記載の方法に より検出することを含んでなる前記方法。 41．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、該個体から得た 生物学的サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを検出することを含んでなり 、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出を、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、請求項２に記載のポリヌクレオチド を含むプローブと接触させ（これは、配列番号１、３、116または118よりなる群 から選ばれる少なくとも１つの配列を有するポリヌクレオチドとは該プローブが 安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列番号24〜29のいずれかの配列を 有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下で行なう）、そして b）工程a）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出することを含む方法 により行なうことを特徴とする前記方法。 42．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、該個体から得た 生物学的サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを検出することを含んでなり 、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出を、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、請求項２に記載のポリヌクレオチド を含むプローブと接触させ（これは、配列番号116に示す配列を有するポリヌク レオチドとは該プローブが安定な二重らせんを形成するのを許容するが配列番号 24〜29のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドとはそれを許容しない条件下 で行なう）、そして b）工程a）で形成した前記の安定な二重らせんの有無を検出することを含む方法 により行なうことを特徴とする前記方法。 43．適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中のヘルペスウイル スポリヌクレオチドを検出するための診断キットであって、該試薬が請求項２に 記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 44．適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中のヘルペスウイル スポリヌクレオチドを検出するための診断キットであって、該試薬が請求項26に 記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 45．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、 a）安定な抗原−抗体複合体の形成を許容する条件下、該個体から得たサンプル からの抗体を請求項11または請求項12に記載のポリペプチドと接触させ、そして b）工程a）で形成した前記の安定な複合体の有無を検出する工程を含んでなる方 法。 46．適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中に存在する抗ヘル ペスウイルス抗体を検出するための診断キットであって、該試薬が請求項11また は請求項12に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする前記診断キット。 47．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、 a）安定な抗原−抗体複合体の形成を許容する条件下、該個体から得たサンプル からのポリペプチドを請求項22または請求項23に記載の抗体と接触させ、そして b）工程a）で形成した前記の安定な複合体の有無を検出する工程を含んでなる前 記方法。 48．適当な容器内に試薬を含んでなる、生物学的サンプル中に存在するヘルペ スウイルスポリペプチドを検出するための診断キットであって、該試薬が請求項 22または請求項23に記載の抗体を含むことを特徴とする前記診断キット。 49．請求項２に記載のポリヌクレオチドおよび適合する医薬賦形剤を含んでな る、ヘルペスウイルス感染症の治療に使用するための組成物。 50．医薬候補がガンマヘルペス感染症の治療に有用であるか否かを決定する方 法であって、 a）請求項11に記載のポリペプチドを該医薬候補と接触させ、そして b）該ポリペプチドの生化学的機能が、該医薬候補により改変されるか否かを決 定する工程を含んでなる前記方法。 51．工程b）で決定される該ポリペプチドの生化学的機能が、核酸に対する該 ポリペプチドの結合性である、請求項50に記載の方法。 52．工程b）で決定される該ポリペプチドの生化学的機能が、ＤＮＡポリメラ ーゼ活性である、請求項50に記載の方法。 53．医薬候補がガンマヘルペス感染症の治療に有用であるか否かを決定する方 法であって、 a）請求項２に記載のポリヌクレオチドで細胞を遺伝的に改変し、そして b）該細胞に対する該医薬候補の効果を、該ポリヌクレオチドで遺伝的に改変さ れていない細胞と比較して決定する工程を含んでなる前記方法。 54．ヘルペスウイルスに感染した個体を治療するのに使用する化合物の製造法 であって、 a）核酸との相互作用に関与する請求項11または請求項12に記載のポリペプチド の領域に結合しうる化合物を作製し、 b）該化合物が、該ポリペプチドの生化学的機能を阻害するか否かを決定する工 程を含んでなる前記製造法。