KR102534528B1 - 신규한 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 코로나바이러스 감염 질환의 진단용 조성물 및 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 숙주세포 표면의 수용체와 상호작용하는 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크(spike) 당단백질 및 상기 단백질 내의 수용체 결합 도메인(RBD)이 바이러스 표면에서 실제로 어떠한 아미노산 서열 및 3차원 구조를 가지는지를 최초로 규명함으로써 보다 효과적인 백신 또는 항체 치료제의 생산에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 정확한 표면 항원의 구조에 기반하여 SARS-CoV-2 바이러스의 감염 여부를 면역학적 방법 또는 유전자 증폭 방법으으로 신속하게 판정하는 신뢰도 높은 진단방법을 제공한다. 아울러, 본 발명의 스크리닝 방법은 숙주세포의 수용체와 바이러스의 스파이크 단백질 간의 결합을 차단함으로써 바이러스 감염을 침투(penetration) 단계에서 조기에 제어할 수 있는 근원적인 치료제 후보물질을 정확하고 신속하게 탐색할 수 있다.

Description

신규한 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물{A Novel Composition for Preventing or Treating Coronavirus Infectious Diseases}

본 발명은 코로나바이러스, 구체적으로는 SARS-CoV-2가 발현하는 표면 항원의 신규한 스플라이스 변이체 및 이를 이용하는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

중증의 급성 호흡기 증후군을 야기하는 양성 단일가닥(positive sense single-stranded) RNA(+ssRNA) 바이러스인 코로나바이러스(SARS-CoV)는 거의 20년 전에 처음 보고되었다[1]. 사실, 베타 코로나바이러스(CoV)는 2002-2003년의 SARS-CoV, 2012년의 MERS-CoV 및 2019년 말에 시작된 SARS-CoV-2를 포함하여 지난 20년 간 세 번이나 동물성 전염병 또는 인간에서의 범유행을 야기한 바 있다. 그러나, 최근의 SARS-CoV-2는 전염성이 높고 중증의 호흡기 질환과 높은 치사율을 보이면서 지난 100년간 발발한 전염병 중 최악의 대유행을 유발하고 있다. 유효한 치료제나 백신이 없이 SARS-CoV-2는 2020년 8월 기준 약 2천7백2십만 명이 감염되어 88만 명의 사망자를 낳았다.

SARS-CoV2의 지놈 서열은 SARS-CoV와 약 80%가 동일하다. 또한, SARS-CoV2는 SARS-CoV와 숙주세포 표면의 동일한 세포 진입 수용체인 ACE2를 이용한다[2]. 바이러스 외막(envelope) 표면의 스파이크(spike) 당단백질은 SARS-CoV의 S 유전자에 의해 인코딩되며, 특정 숙주세포의 세포막 상에 존재하는 수용체를 인식한다. 스파이크 단백질은 SARS-CoV와 숙주세포 표면의 ACE2 수용체가 상호작용하는 동안 프로테아제에 의해 S1 및 S2 서브유닛으로 절단된다[3-6].

최근 연구는 슈도바이러스(pseudovirus) 시스템의 S 유전자 및 엔도사이토시스를 통해 스파이크 슈도바이러스가 침투한 293T/hACE2 세포를 이용하여 인간 ACE2가 SARS-CoV2에 대한 수용체임을 확인하였으며[7], SARS-CoV2의 스파이크 당단백질이 SARS-CoV의 것보다 덜 안정적이라는 사실도 알 수 있었다. 또한, SARS-CoV과 SARS-CoV2 사이에는 다클론 항-SARS S1 서브유닛 항체에 대한 교차반응성이 존재하지 않는다. 다클론 항체에 의해 SARS-CoV 스파이크 슈도비리온(pseudovirion)의 진입은 충분히 차단되었으나, 동일한 항체로 SARS-CoV2 감염은 차단되지 못했다. 또한, COVID-19 환자의 혈청이 제한적인 중화 효과만을 보여 1차 감염이 되어도 이후의 추가 감염을 방지할 수 없는 것으로 나타났다[7].

SARS-CoV 스파이크 단백질의 S1 서브유닛 내의 수용체 결합 도메인(RBD, 318-513 아미노산)은 SARS-CoV2의 RBD(331-527 아미노산)와 73%의 서열 상동성을 보이는데[8], 이는 ACE2와의 결합에 중요하다[9, 10]. S1 서브유닛의 RBD가 숙주세포 막 상의 ACE2의 펩티다아제 도메인(PD)과 결합하지만, S2 서브유닛의 절단된 부위는 숙주 프로테아제에 의해 추가적으로 절단되며, 이것은 SARS-CoV2 감염에 필수적인 과정이다[3, 5, 11]. SARS-CoV와 SARS-CoV2의 절단 부위를 비교한 최근 연구에 의하면 SARS-CoV와 SARS-CoV2의 S1 및 S2 서브유닛의 절단 양상이 상이하여 바이러스 감염성에 영향을 미치는 것으로 나타났다[12]. SARS-CoV2 스파이크 단백질의 세포외 도메인은 ACE2의 PD와 높은 친화도로 결합한다[13].

ACE2가 SARS-CoV2 수용체로 알려졌으나, 이의 숙주세포에서의 일차적인 역할은 혈관수축과 혈압을 조절하는 안지오텐신(Ang)을 프로세싱하는 것이다. ACE2는 광범위하게 발현되는 막단백질이나, 폐, 심장, 신장 및 장에서 주로 발현된다[14,15]. 세포에서 ACE2 발현의 감소는 심혈관 질환을 가속화한다[1,16]. ACE2 내의 PD의 갈고리 모양 구조와 SARS-CoV 스파이크 당단백질의 RBD 간의 복합체 구조는 스파이크 당단백질의 RBD와 ACE2의 PD 간의 결합부위에서의 분자적 상호작용에 의해 형성된다[6, 9, 10, 13, 15].

SARS-CoV의 수용체에 대한 최초 보고는 면역침강 및 면역조직화학 결과를 제외하고는 생화학적 실험결과가 결여되어 있어 명확한 내용이라 보기 어렵다[17]. 본 발명자들은 SARS-CoV2 S 유전자의 새로운 RBD를 생성하는 신규한 스플라이스 변이체를 동정하였다. SARS-CoV2 S 유전자의 독특한 RBD에 대한 정보는 백신 개발 및 SARS-CoV2 감염의 치료에 매우 중요한 정보이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국 등록특허공보 제9,884,895호

본 발명자들은 코로나바이러스, 구체적으로는 SARS-CoV-2가 발현하는 표면항원의 정확한 구조를 규명함으로써 SARS-CoV-2의 감염을 차단하고 이에 대한 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있는 우수한 예방 또는 치료제 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, SARS-CoV-2의 외막(envelope) 표면의 스파이크(spike) 당단백질을 인코딩하는 S 유전자가 N-말단 부위의 411개 아미노산 잔기가 제거된 스플라이스 변이체 형태로 발현된다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 코로나바이러스 감염 질환의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 14번 내지 1213번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 상기 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서, 상기 펩타이드는 28번 내지 438번 잔기의 삭제; 504번 잔기의 치환; 524번 잔기의 치환; 및 579번 잔기의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 코로나바이러스, 구체적으로는 SARS-CoV-2가 발현하는 표면항원의 정확한 구조를 규명함으로써 SARS-CoV-2의 감염을 차단하고 이에 대한 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있는 우수한 예방 또는 치료제 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, SARS-CoV-2의 외막(envelope) 표면의 스파이크(spike) 당단백질을 인코딩하는 S 유전자가 N-말단 부위의 411개 아미노산 잔기가 제거된 스플라이스 변이체 형태로 발현된다는 사실을 발견함으로써, 이러한 항원 구조를 기반으로 유효한 면역반응 유도는 물론 신뢰도 높은 SARS-CoV-2의 진단을 수행할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열은 SARS-CoV-2의 S 유전자가 코딩하는 전장 전장(1273 a.a) 아미노산 서열이다. 상술한 바와 같이, 본 발명자들은 S 유전자의 DNA 분자로부터 성숙한 mRNA로 전사되는 과정에서 상기 나열한 변이를 포함하는 스플라이스 변이체로 발현됨을 발견하였다. 본 발명의 스플라이스 변이체는 1273 a.a의 전장 펩타이드를 기준으로 상기 나열된 변이가 적용된 변이체일 수도 있으며, 또는 신호 펩타이드(1-13번 잔기) 및/또는 세포내 도메인(1214-1273번 잔기)이 제거된 1200a.a의 펩타이드에서 상기 나열된 변이가 적용된 변이체일 수도 있다.

본 발명은 스플라이스 변이체 단백질, 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 대상체에 투여하여 대상체 내에서 변이체 단백질에 대한 항체를 형성시키는 백신의 형태가 될 수도 있고, 스플라이스 변이체 단백질에 대한 분리·정제된 항체를 약리성분으로 하는 항체 치료제 형태로 이용될 될 수도 있다. 이에, 전자의 경우 용어“코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물”은“코로나바이러스 백신 조성물”과 같은 의미를 가진다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 포유류의 면역 체계에 의해 생성된, 항원의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하여 해당 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본 발명에서 스플라이스 변이체 단백질을 특이적으로 인식하는 항체로는 다클론 또는 단클론 항체가 모두 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에서 보고된 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 본 발명에서 새롬게 규명된 스파이크 단백질의 스플라이스 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 DNA 백신 또는 mRNA 백신의 형태로 이용될 수도 있으며, 보다 구체적으로는 성숙 mRNA 백신의 형태로 이용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명이 DNA 백신 또는 mRNA 백신 형태로 이용될 경우 본 발명의 스플라이스 변이체 유전자를 유전자 전달체(gene delivery system)에 삽입하여 대상체에서 발현시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.

본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체을 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하고, 발현조절 서열(예를 들어 프로모터, 시그널 서열, 전사조절인자 결합 위치의 어레이)에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절 서열과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태, 또는 (v) mRNA를 내포하는 리포좀 형태로 제작할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 504번 잔기는 Asp로, 524번 잔기는 Asp으로, 579번째 잔기는 Leu으로 각각 치환된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 변이는 614번 잔기의 치환을 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 614번 잔기는 Gly으로 치환된다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 스파이크 단백질의 실제 발현 형태인 스플라이스 변이체의 활성을 저해하거나 또는 이와 숙주세포 표면의 수용체 간의 결합을 효율적으로 억제함으로써 코로나바이러스 감염을 차단하거나, 이에 의한 증상을 억제, 제거 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 코로나바이러스 감염증의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.

본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 코로나바이러스 감염 질환은 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염 질환이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열 또는 서열목록 제2서열의 15번 내지 259번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 상기 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 항체, 이의 항원 결합 단편, 뉴클레오타이드 및 본 발명의 조성물을 이용하여 예방 또는 치료하고자 하는 코로나바이러스 감염 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 80번 잔기의 치환; 100번 잔기의 치환; 및 155번 잔기의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 80번 잔기는 Asp로, 100번 잔기는 Asp으로, 155번째 잔기는 Leu으로 각각 치환된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 190번 잔기의 치환을 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 190번 잔기는 Gly으로 치환된다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열은 SARS-CoV-2의 S 유전자 내의 수용체 결합 도메인(RBD)에 해당하는 아미노산 서열(259 a.a)이다. 본 발명자들은 S 유전자가 스플라이싱되는 과정에서 숙주 세포 표면의 수용체와 상호작용하는 RBD 영역도 위와 같이 변동됨을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열의 15번 내지 259번 잔기의 아미노산 서열은 상술한 신규 RBD(nRBD)에서 N-말단의 14개 잔기가 제거됨으로써 재조합적인 발현 과정에서 발현 효율이 더욱 증가된 nRBD의 유도체(nRBD-1)이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 백신 조성물로 제조될 경우, 본 발명의 항원과 다양한 형태의 적합한 어주번트가 선택적으로 조합된 하나의 바이얼 (vial) 또는 주사기 (prefilled syringe) 등에 포장되거나, 또는 각 항원과 어주번트가 별개의 바이얼에 포장되어 사용 직전에 이를 혼합하여(용시조제, bed side mixing) 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염 질환의 진단용 조성물로서, 상기 펩타이드는 28번 내지 438번 잔기의 삭제; 504번 잔기의 치환; 524번 잔기의 치환; 및 579번 잔기의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 서열목록 제1서열에 대한 변이 펩타이드 및 코로나바이러스 감염 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 코로나바이러스 감염 여부를 판단하기 위해 스파이크 단백질의 스플라이스 변이체 또는 이의 코딩 유전자(예를 들어 성숙 mRNA)의 발현량 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 스플라이스 변이체 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 코로나바이러스 감염 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이 경우 상술한 스플라이스 변이체 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 스플라이스 변이체 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석하여 개체의 시료에서 스플라이스 변이체 단백질에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 개체의 코로나바이러스에 감염된 것으로 판단된다.

본 발명은 또한 스플라이스 변이체를 유전자 수준에서 검출하는 유전자 진단 방법으로 적용될 수도 있다. 이 경우 스플라이스 변이체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 제제는 상기 뉴클레오타이드 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 명세서에서 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

28번 내지 438번 잔기가 삭제된 스플라이스 변이체를 특이적으로 검출하기 위해서는 27번 잔기와 439번 잔기가 연속적으로 연결된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산분자에 상보적인 서열을 가지는 프라이머를 이용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 프라이머는 본 발명에서 사용된 Cov2F-5 정방향 프라이머(5’ATTACCCCCTGCTAACAATCTTG)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 28번 내지 438번 잔기가 삭제된 본 발명의 스플라이스 변이체를 특이적으로 인식하도록 적절하게 설계된 프라이머라면 제한없이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 본 발명의 뉴클레오타이드 분자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’-말단 또는 5’-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2) 단백질을 발현하는 세포 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 시료 내 상기 ACE2 단백질과 상기 펩타이드의 결합을 측정하는 단계,

상기 ACE2 단백질과 상기 펩타이드의 결합이 저하되는 경우, 상기 후보물질은 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물로 판정한다.

본 발명에서 이용되는 서열목록 제2서열 및 이의 변이 펩타이드와 코로나바이러스 감염 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, ACE2 단백질을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“후보물질”은 ACE2 단백질 발현하는 세포와 본 발명에서 새롭게 규명된 nRBD 펩타이드를 포함하는 시료에 첨가되어 ACE2 단백질과 nRBD 펩타이드 간의 결합 형성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 ACE2 단백질과 nRBD 펩타이드 간의 결합을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, ACE2 단백질과 nRBD 펩타이드 간의 결합이 감소한 경우, 상기 시험물질은 바이러스의 숙주 세포 침투(penetration)를 차단하는 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물로 판정될 수 있다.

본 명세서에서 용어“결합의 저하”는 ACE2 단백질과 nRBD 펩타이드 간의 결합에 의해 개시되는 코로나바이러스의 감염이 측정 가능한 수준으로 억제될 정도로 이들 간의 상호작용이 감소하는 것을 의미한다. 이러한 결합의 감소는 시험물질이 nRBD 펩타이드에 경쟁적으로 결합하여 ACE2 단백질과의 상호작용을 방해함으로써 이루어질수도 있고, 또는 결합에 참여하는 두 단백질의 활성 또는 발현을 감소시킴으로써 이루어질 수도 있다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다. 구체적으로는 대조군에 비하여 결합이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 14번 내지 1213번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 펩타이드는 28번 내지 438번 잔기의 삭제; 504번 잔기의 치환; 524번 잔기의 치환; 및 579번 잔기의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

구체적으로는, 상기 펩타이드는 614번 잔기의 치환을 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제3서열은 28번 내지 438번 잔기의 삭제; 504번 잔기의 치환; 524번 잔기의 치환; 579번 잔기의 치환; 및 614번 잔기의 치환을 모두 포함하는, 본 발명에서 새롭게 규명된 nRBD 펩타이드의 아미노산 서열이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열 또는 서열목록 제2서열의 15번 내지 259번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 펩타이드는 80번 잔기의 치환; 100번 잔기의 치환; 및 155번 잔기의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

구체적으로는, 상기 펩타이드는 190번 잔기의 치환을 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열목록 제4서열의 아미노산 서열 또는 서열목록 제4서열의 15번 내지 259번 잔기을 가지는 펩타이드일 수 있다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제4서열 및 이의 15번 내지 259번 잔기의 아미노산 서열은 각각 80번 잔기의 치환; 100번 잔기의 치환; 155번 잔기의 치환; 및 190번 잔기의 치환을 모두 포함하는, 본 발명에서 새롭게 규명된 nRBD 펩타이드 및 nRBD-1 펩타이드의 아미노산 서열이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 코로나바이러스 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드를 특이적으로 인식하는 프라이머를 이용하여 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 유전자를 증폭하는 단계; 및

(b) 상기 증폭된 유전자의 크기를 확인하는 단계, 상기 증폭된 유전자 중 600bp 내지 800bp의 유전자가 검출될 경우, 상기 개체는 코로나바이러스 감염 질환을 가지는 것으로 판정한다.

본 발명에 따르면, 본 발명자들은 SARS-CoV2 S 유전자를 증폭할 경우 본 발명에서 새롭게 규명한 스플라이스 유도체 구조에 따른 새로운 S1 영역이 합성됨을 발견하였다. 이에, 종래에 알려진 바와 달리 2000bp 내외의 밴드가 아닌 600bp 내지 900bp 사이에서 밴드가 검출되는지 여부, 보다 구체적으로는 700bp 내지 800bp 사이에서 밴드가 검출되는지 여부를 근거로 코로나바이러스 감염 여부를 판단할 경우, 보다 신뢰도 높은 진단이 가능하다는 사실을 새로이 발견하였다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 펩타이드와 상기 후보물질의 결합을 측정하는 단계,

상기 펩타이드와 상기 후보물질 간 결합이 형성될 경우, 상기 후보물질은 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물로 판정한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 코로나바이러스 감염 질환의 진단용 조성물 및 코로나바이러스의 감염 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 숙주세포 표면의 수용체와 상호작용하는 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크(spike) 당단백질 및 상기 단백질 내의 수용체 결합 도메인(RBD)이 바이러스 표면에서 실제로 어떠한 아미노산 서열 및 3차원 구조를 가지는지를 최초로 규명함으로써 보다 효과적인 백신 또는 항체 치료제의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 본 발명은 또한 정확한 표면 항원의 구조에 기반하여 SARS-CoV-2 바이러스의 감염 여부를 면역학적 방법 또는 유전자 증폭 방법으로 신속하게 판정하는 신뢰도 높은 진단방법을 제공한다.

(d) 아울러, 본 발명의 스크리닝 방법은 숙주세포의 수용체와 바이러스의 스파이크 단백질 간의 결합을 차단함으로써 바이러스 감염을 침투(penetration) 단계에서 조기에 제어할 수 있는 근원적인 치료제 후보물질을 정확하고 신속하게 탐색할 수 있다.

도 1은 한국의 COVID-19 YN(영남) 환자의 SARS-CoV2 스파이크 유전자에 대한 RT-PCR 결과를 보여주는 그림이다. 도 1a는 S 유전자 구조를 보여주는 모식도로서, 아미노산 및 핵산 잔기 수와 역방향 및 정"??* 프라이머 결합 부위를 표시하였다. 도 1b는 4명의 한국 COVID-19 YN 환자의 RNA 시료에서 cDNA를 합성한 결과이다. 환자들의 cDNA를 주형으로 SARS-CoV2 S 유전자를 증폭하였다. 정방향(CoV2F-1) 및 역방향(CoV2R-1) 프라이머 쌍을 이용하여 FL S 유전자를 합성하였다. 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 PCR 결과는 하단에 표시하였다. 도 1c는 정방향(CoV2F-2) 및 역방향(CoV2R-3) 프라이머 쌍을 이용하여 SARS-CoV2 S 유전자의 S1 영역을 합성한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1d는 정방향(CoV2F-2) 및 역방향(CoV2R-4) 프라이머 쌍을 이용하여 S1 영역의 안쪽 부분을 합성한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1e는 정방향(CoV2F-4) 및 역방향(CoV2R-2) 프라이머 쌍을 이용하여 SARS-CoV2 S 유전자의 S2 영역을 합성한 결과를 보여주는 그림이다. 데이터는 2회의 독립적 실험에 대한 1개의 대표값으로 표시하였다.
도 2는 한국 COVID-19 YN2 환자의 SARS-CoV2 S 유전자에 대한 PCR 산물의 T&A 클로닝 결과를 보여주는 그림이다. YN2의 SARS-CoV2 S 유전자의 PCR 산물을 T&A 클로닝 플라스미드 벡터로 라이게이션하였다. 동일한 정방향(CoV2F-3) 및 역방향(CoV2R-4) 프라이머로 SARS-CoV2 S 유전자의 S1 영역을 증폭하였다. 도 2a는 콜로니 PCR 스크리닝으로 3개의 양성 클론인 cl1, cl2 및 cl6 클론을 동정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 2b는 SARS-CoV2 S 유전자 삽입부의 5’및 3’에서의 제한효소 Hind Ⅲ의 절단부위를 보여주는 다이아그램이다. 도 2c는 Hind Ⅲ 제한효소에 의해 SARS-CoV2 S 유전자를 방출함을 보여주는 결과이다. 3개의 양성 클론을 이용하여 DNA 서열을 분석하였다. 데이터는 2회의 독립적 실험에 대한 1개의 대표값으로 표시하였다.
도 3은 한국의 COVID-19 YN2 환자의 SARS-CoV2 S 유전자와 야생형 유전자의 부분적 아미노산 서열 정렬 결과를 나타낸 그림이다. 도 3a는 신규 스플라이스 변이체 S1 영역의 DNA 서열을 보여주는 그림이다. 정방향 및 역방향 프라이머 부위는 밑줄로 표시하였다. 도 3b는 신규한 스플라이스 변이체 S1 영역의 번역된 272개 아미노산 잔기를 보여준다. 13개의 소수성 신호 펩타이드는 회색으로 표시하고 성숙한 펩타이드의 259개 아미노산 잔기는 노란색으로 표시하였다. 도 3c는 한국 COVID-19와 야생형 SARS-CoV2 S 유전자의 아미노산 서열을 정렬한 결과로서, 알려진 D614G 돌연변이에 더하여 3개의 새로운 돌연변이(G504D/V524D/P579L)(붉은색 표시)를 가짐을 알 수 있다.
도 4는 크로마토그래피 데이터 of 한국 COVID-19 YN 환자에 대한 DNA 시퀀싱의 크로마토그래피 데이터를 보여주는 그림이다. D614G(도 4a), G504D(도 4b), V524D(도 4c) 및 P579L(도 4d) 돌연변이에 대한 대표적인 크로마토그래피 결과를 각각 나타냈다. 기준 서열의 코던은 상단에 붉은 글자로 표시하고 이로 인한 아미노산 잔기 변화는 하단에 표시하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험에 대한 1개의 대표값으로 표시하였다.
도 5는 새로운 스플라이스 변이체의 구조 모식도와 4명의 YN 환자로부터 새로운 스플라이스 변이체를 RT-PCR 로 증폭한 결과를 보여주는 그림이다. 도 5a는 FL의 구조 모식도(상단)와 N-말단 411개 아미노산이 삭제된 SARS-CoV2 S 유전자 S1 영역의 새로운 스플라이스 변이체의 구조 모식도(하단)를 각각 보여주는 그림이다. 원형의 cDNA(도 5b) 또는 CoV2F-1/CoV2R-1 증폭된 cDNA(도 5c)를 각각 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. 도 5a 하단에 표시된 스플라이스 변이체 특이적인 정"??* CoV2F-5를 이용하였다. 데이터는 2회의 독립적 실험에 대한 1개의 대표값으로 표시하였다.
도 6은 SARS-CoV2 지놈 및 스파이크 유전자 구조에 대한 모식도이다. 도 6a는 29,903bp의 SARS-CoV2 지놈(NCBI 접근번호: NC_045512)을 poly^+A서열을 가지는 12개 ORF 유전자로 표시한 물리적 매핑 그림이다. 3,822bp로 구성된 3번째 ORF 스파이크 유전자는“TAA” 종결 코던 포함 1,273 아미노산 잔기를 인코딩한다. 도 6b는 스파이크 유전자 내의 기능을 가지거나 기능이 없는 16개 서브도메인을 나타낸 그림이다. S1 및 S2 서브도메인 절단부위는 R685이다. 특정 돌연변이 부위는 검은색 선과 파란 글자로 표시하였다. 하단에 N-말단의 411 아미노산이 삭제되고 862 아미노산 잔기를 포함하는 S 유전자의 새로운 스플라이스 변이체를 표시하였다. 새로운 스파이크 스플라이스 변이체(nSpike)는 14 내지 272 잔기까지의 새로운 RBD (nRBD)로 프로세싱된다. S 유전자의 16개 도메인을 나열하였다; SP: 신호 펩타이드, NTD: N-말단 도메인, L1: Loop 1, RBD: 수용체 결합 도메인, SD1: 서브도메인 1, SD2: 서브도메인 2, L2: Loop 2, FP: 융합 펩타이드, CR: 연결 영역, HR: Heptad repeat, CH: Central helix, BH: b-헤파린, SD3: 서브도메인 3, SD4: 서브도메인 4, TM: 막관통 도메인, CT: 세포질 도메인.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험 윤리

본 발명의 연구는 영남대학교병원 생명윤리위원회의 승인(approval no. 2020-07-063) 하에 수행되었다.

시료 수집

환자의 SARS-CoV2 감염은 한국 질병관리본부의 가이드라인에 따라 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 확인하였다. 진단에 사용된 비인두 도말(nasopharyngeal swab) 시료를 모두 수집하여 추가 분석을 수행하였다.

SARS-CoV2 스파이크 유전자에 대한 RT-PCR

요약하면, COVID-19 환자의 RNA 주형을 이용한 cDNA 합성은 MMLV Reverse 전사체ion 킷(Millipore Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. SARS-CoV2의 S 유전자를 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 표 2에 정리하였다. 정규화를 위한 GAPDH 유전자는 다음의 프라이머가 사용되어다; 정방향: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′, 역방향: 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′.

TA 클로닝 및 제한효소 지도

SARS-CoV2의 S 유전자의 PCR 산물은 제조자(DonginBiotech, Seoul)의 설명서에 따라 yT&A 클로닝 벡터에 라이게이션되었다. 양성(positive) 플라스미드 벡터(0.8μg)를 Takara 완충액과 함께 Hind Ⅲ 제한효소(7.5 units)로 잘라 SARS-CoV2의 S 유전자를 방출하였다. S 유전자 cDNA의 삽입은 Vilber lourmat Electronic Ballast 트랜스일루미네이터(Millipore Sigma)로 촬영한 1% 아가로스(Biobase, Minneapolis, MN)로 검출하였다.

Mini-prep 및 DNA 서열 분석

PCR 콜로니에서 수득한 양성 클론을 3ml LB 브로스에서 37℃로 밤새 배양하였다. 박테리아 세포를 사용하여 제조자(Promega, Madison, WI)의 지시에 따라 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드를 Hind Ⅲ 제한효소로 잘라 SARS-CoV2 S 유전자의 cDNA가 삽입되었는지를 확인하였다. DNA 서열분석을 위해 양성 SARS-CoV2 S 유전자 플라스미드를 발송하였다(Cosmotech, Seoul, Korea).

실험결과

S1 영역에서 S 유전자의 짧은 전사체가 나타난다

환자의 비인두 도말 시료에서 RNA 샘플을 분리하여 SARS-CoV2 감염을 검사하였다. 영남대병원에서 제공받은 RNA 시료를 한국질병관리본부 가이드라인에 따라 RT-PCR로 검사하였다. 표 1의 ~Ct 값에 따라 SARS-CoV2 감염을 확인하였다.

4명의 한국인 COVID-19 YN 환자의 ~Ct 값

환자	RdRP/ORF1a에 따른 ~Ct 값
YN1	29.77
YN2	21.45
YN3	25.16
YN4	26.88

제조자의 설명서에 따라 수행한 qPCR 진단 결과 YN2 환자의 ~Ct 값이 가장 낮은 반면(21.45 사이클) YN1 환자는 가장 높았다(29.77 사이클).

본 발명자들은 4개의 양성 SARS-CoV2 RNA 시료를 이용하여 S 유전자를 분리하였다. 전장(FL) ORF(open reading frame)는 3,822개 염기쌍으로 구성되어 종결코던(“TAA”) 포함 1,273개 아미노산 잔기를 인코딩한다(도 1a). 표 2의 정방향(CoV2F-1) 및 역방향(CoV2R-1) 프라이머를 이용하여 SARS-CoV2의 FL S 유전자를 증폭하였다. 이들 프라이머 쌍은 3,822bp의 FL 스파이크 ORF를 증폭하지 못한 반면 하우스키핑 유전자인 GAPHD(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 증폭되었다(도 도 1b). 이는 SARS-CoV2 스파이크의 불안정한 RNA 전사체가 존재하거나 혹은 양성 단일가닥 RNA(+ssRNA SARS-CoV2)가 FL SARS-CoV2 S 유전자를 증폭할 수 있을 만큼 충분하지 않음을 말해준다.

이에, 본 발명자들은 614번 아스파르트산이 글리신으로 치환(D614G)된 S 유전자의 S(서브유닛) 1 영역에 주목하였다. 추가적인 2쌍의 프라이머는 SARS-CoV2 S 유전자의 S1 영역을 증폭하기 위해 설계되었다(표 2). 정방향 Cov2F-2/역방향 Cov2R-3 프라이머는 YN2 환자 시료에서만 2개의 밴드를 형성시켰다(도 1c). 정방향 CoV2F-3/역방향 CoV2R-4 프라이머를 이용한 추가적 실험에서도 유사한 결과가 나타났다. 도 1d의 하단 밴드는 SARS-CoV2 S 유전자의 알려진 전사체(상단 밴드)보다 더 다수를 차지하는 약 2,000bp의 짧은 전사체를 나타낸다. 이러한 결과 역시 새로운 SARS-CoV2 S 유전자 전사체의 존재를 뒷받침하는 것이다. 본 발명자들은 또한 정방향 CoV2F-4/역방향 CoV2R-2 프라이머로 S2 영역을 증폭하였으며 (표 2, 도 1a), YN2 환자에서만 예상되는 크기인 1,775bp의 S2 영역이 검출되었다(도 1e).

신규 S 유전자 전사체의 동정

YN2 환자의 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터에 라이게이션하고 이를 박테리아 세포에 형질전환하였다. 6개의 백색 박테리아 콜로니를 양성 플라스미드 클론 선별에 사용하였다. SARS-CoV2 S 유전자의 S1 영역을 포함하는 양성 플라스미드 클론을 동정하기 위한 PCR 스크리닝에 동일한 프라이머를 사용하였으며, 그 결과 6개의 백색 콜로니로부터 3개의 양성 클론이 검출되었다(도 2a). YN2 환자 유래의 3개의 양성 플라스미드를 선별하여 플라스미드 정제의 mini prep에 사용하였다. 도 2b에서 보는 바와 같이, Hind Ⅲ 제한효소 부위는 SARS-CoV2 S 유전자의 5’의 15bp 업스트림과 3’의 44bp 다운스트림에 모두 존재하였다. 분리된 cDNA 플라스미드를 Hind Ⅲ 제한효소로 분해하여 삽입된 S 유전자 cDNA를 방출시켰다. 그 결과, 59bp의 벡터 서열이 함께 방출되면서 729bp의 PCR 산물보다 조금 더 높은 밴드가 형성되었다(도 2c).

SARS-CoV2 S 스플라이스 변이체 유전자의 시퀀싱 데이터

DNA 시퀀싱 분석 결과 SARS-CoV2 S 유전자의 신규한 816bp 스플라이스 변이체가 밝혀졌다(도 3a). 이러한 새로운 전사체는 27번 알라닌과 439번 아스파라긴 사이의 411 잔기가 삭제된 272개 아미노산으로 번역된다(도 3b). 13개 잔기의 N-말단 소수성 신호 펩타이드는 회색 볼드체로 표시하였으며, 나머지 259개 잔기는 SARS-CoV2 S 유전자의 S1 영역이다.

S 유전자 cDNA의 시퀀싱 결과 알려진 D614G 돌연변이 외에 세 개의 추가적인 변이가 발견되었다. SARS-CoV2 스파이크 스플라이스 변이체를 야생형(WT) 아미노산 서열과 비교한 결과 2개의 추가적인 변이가 중요한 수용체 결합 도메인(RBD)에 존재하며 나머지 변이는 알려진 돌연변이 D614G와 매우 가까운 서브도메인(SD) 2에 위치함을 알 수 있었다(도 3c). 알려진 변이(D614G) 및 신규한 3개 변이 잔기는 붉은색으로 표시하였다.

SARS-CoV2 S 유전자 스플라이스 변이체에 대한 크로마토그래피 DNA 시퀀싱 결과

스파이크의 SD2의 D614G 돌연변이는 여러 연구진에 의해 보고되었다. 크로마토그래피 DNA 시퀀싱 결과 614번 아스파르트산 코던“GAT”(기준 서열)는 글리신 코던(“GGT”)으로 치환되어 있었다(도 4a). 4명의 환자에 대한 크로마토그래피 DNA 시퀀싱 결과 504번 글리신 코던“GGT”(기준 서열)가 아스파르트산(Asp) 코던“GAT”(G504D)로 치환되었음을 확인하였다(도 4b). 또한 524번 발린(Val) 코던“GTT”가 아스파르트산 코던“GAT”(V524D, 도 4c)로, 579번 프롤린(pro) 코던“CCA”가 류신(Leu) 코던“CTA”(P579L, 도 4d)로 각각 치환됨을 확인하였다.

환자 시료로부터 SARS CoV2S 유전자 스플라이스 변이체의 검출

본 발명자들은 SARS-CoV2 S 유전자의 스플라이스 변이체에 특이적인 정방향 CoV2F-5/역방향 CoV2R-4 프라이머를 설계하였다(도 5a 및 표 2). 흥미롭게도, 스플라이스 변이체 특이적인 CoV2F-5 프라이머는 4명의 YN 환자 모두의 짧은 스플라이스 변이체의 전사체를 성공적으로 검출하였다(도 5b). 4명의 YN 환자에게서 FL SARS-CoV2 S 유전자의 PCR 산물(1μl)을 주형으로 짧은 스플라이스 변이체 전사체를 다시 증폭하자 매우 유사한 결과를 얻었다(도 5c).

SARS-CoV2 S 유전자에 대한 PCR을 위한 정방향/역방향 프라이머

정방향
Cov2F-1	5’ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGC
Cov2F-2	5’GCCACTAGTCTCTAGTCAGTG
Cov2F-3	5’CAGTGTGTTAATCTTACAACC
Cov2F-5	5’ATTACCCCCTGCTAACAATCTTG
Cov2F-6	5’ AACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGG
역방향
Cov2R-1	5’TTATGTGTAATGTAATTTGACTCC
Cov2R-2	5’GACTCCTTTGAGCACTGGCTC
Cov2R-3	5’CCGCCGAGGAGAATTAGTCT
Cov2R-4	5’GTCTGAGTCTGATAACTAGCG

SARS-CoV2 S 유전자의 새로운 RBD

도 6a는 양성 단일가닥 RNA(+ssRNA) 바이러스인 SARS-CoV2의 29,903 bp의 유전자 지도를 보여준다. SARS-CoV2의 지놈은 독립적인 전사체를 인코딩하는 12개 ORF로 구성된다. S 유전자는 1,273 아미노산 잔기를 인코딩하는 3,822bp의 3번째 ORF에 위치한다(도 6a, 진한 녹색 박스). 큰 크기의 당단백질인 스파이크 단백질은 소수성 신호 펩타이드(SP) 및 막관통(TM) 도메인을 포함하는 16개 서브도메인으로 나뉜다. 각 서브도메인들의 정확한 잔기 번호는 최근 연구에서 보고되었으며, S 유전자의 S1 및 S2 절단부위는 붉은색으로 표시된 R685이다(도 6b). 알려진 돌연변이인 D614G과 세 개의 추가적인 돌연변이(G504D, V524D 및 P579L)는 파란색으로 표시하였다. 221개 아미노산 잔기의 RBD(307-527)는 자주색 박스로 표시하였다. N-말단이 삭제된 S 유전자의 짧은 스플라이스 변이체는 도 6b 하단에 표시하였다. 28Y에서 438S까지의 411개 아미노산의 삭제로 862개 잔기의 스플라이스 변이체가 형성되었으며, 이를 통해 특유의 RBD 도메인이 형성되었다(도 6b 하단). S 유전자의 이러한 259 아미노산 잔기의 신규한 RBD는 SARS-Cov2가 숙주 세포로 침투하는 과정에 연관되어 있을 것으로 보인다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val 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Val Glu Gly Phe Asn Cys 50 55 60 Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Asp 65 70 75 80 Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala 85 90 95 Pro Ala Thr Asp Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn 100 105 110 Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu 115 120 125 Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp 130 135 140 Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Leu Gln Thr Leu Glu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro 165 170 175 Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn 180 185 190 Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr 195 200 205 Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly 210 215 220 Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile 225 230 235 240 Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser 245 250 255 Pro Arg Arg <210> 5 <211> 3822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-coronavirus 2 spike <400> 5 atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60 agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120 aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180 aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240 aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300 ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360 aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420 ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480 tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540 ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600 tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660 tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720 ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780 ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840 gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900 tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960 caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020 gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080 tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140 ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200 gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260 tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320 cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380 ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440 aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500 aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560 ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620 ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680 cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740 acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800 ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860 cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920 aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980 gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040 cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100 gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160 agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220 tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280 acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340 gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400 aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460 ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520 cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580 ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640 acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700 caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760 aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820 acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880 acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940 ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000 cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060 tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120 gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180 gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240 atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300 cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360 tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420 ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480 tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540 aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600 caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660 atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720 tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780 tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822 <210> 6 <211> 2589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-coronavirus 2 mutated nspike <400> 6 atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60 agaactcaat taccccctgc taacaatctt gattctaagg ttggtggtaa ttataattac 120 ctgtatagat tgtttaggaa gtctaatctc aaaccttttg agagagatat ttcaactgaa 180 atctatcagg ccggtagcac accttgtaat ggtgttgaag gttttaattg ttactttcct 240 ttacaatcat atggtttcca acccactaat ggtgttgatt accaaccata cagagtagta 300 gtactttctt ttgaacttct acatgcacca gcaactgatt gtggacctaa aaagtctact 360 aatttggtta aaaacaaatg tgtcaatttc aacttcaatg gtttaacagg cacaggtgtt 420 cttactgagt ctaacaaaaa gtttctgcct ttccaacaat ttggcagaga cattgctgac 480 actactgatg ctgtccgtga tctacagaca cttgagattc ttgacattac accatgttct 540 tttggtggtg tcagtgttat aacaccagga acaaatactt ctaaccaggt tgctgttctt 600 tatcagggtg ttaactgcac agaagtccct gttgctattc atgcagatca acttactcct 660 acttggcgtg tttattctac aggttctaat gtttttcaaa cacgtgcagg ctgtttaata 720 ggggctgaac atgtcaacaa ctcatatgag tgtgacatac ccattggtgc aggtatatgc 780 gctagttatc agactcagac taattctcct cggcgggcac gtagtgtagc tagtcaatcc 840 atcattgcct acactatgtc acttggtgca gaaaattcag ttgcttactc taataactct 900 attgccatac ccacaaattt tactattagt gttaccacag aaattctacc agtgtctatg 960 accaagacat cagtagattg tacaatgtac atttgtggtg attcaactga atgcagcaat 1020 cttttgttgc aatatggcag tttttgtaca caattaaacc gtgctttaac tggaatagct 1080 gttgaacaag acaaaaacac ccaagaagtt tttgcacaag tcaaacaaat ttacaaaaca 1140 ccaccaatta aagattttgg tggttttaat ttttcacaaa tattaccaga tccatcaaaa 1200 ccaagcaaga ggtcatttat tgaagatcta cttttcaaca aagtgacact tgcagatgct 1260 ggcttcatca aacaatatgg tgattgcctt ggtgatattg ctgctagaga cctcatttgt 1320 gcacaaaagt ttaacggcct tactgttttg ccacctttgc tcacagatga aatgattgct 1380 caatacactt ctgcactgtt agcgggtaca atcacttctg gttggacctt tggtgcaggt 1440 gctgcattac aaataccatt tgctatgcaa atggcttata ggtttaatgg tattggagtt 1500 acacagaatg ttctctatga gaaccaaaaa ttgattgcca accaatttaa tagtgctatt 1560 ggcaaaattc aagactcact ttcttccaca gcaagtgcac ttggaaaact tcaagatgtg 1620 gtcaaccaaa atgcacaagc tttaaacacg cttgttaaac aacttagctc caattttggt 1680 gcaatttcaa gtgttttaaa tgatatcctt tcacgtcttg acaaagttga ggctgaagtg 1740 caaattgata ggttgatcac aggcagactt caaagtttgc agacatatgt gactcaacaa 1800 ttaattagag ctgcagaaat cagagcttct gctaatcttg ctgctactaa aatgtcagag 1860 tgtgtacttg gacaatcaaa aagagttgat ttttgtggaa agggctatca tcttatgtcc 1920 ttccctcagt cagcacctca tggtgtagtc ttcttgcatg tgacttatgt ccctgcacaa 1980 gaaaagaact tcacaactgc tcctgccatt tgtcatgatg gaaaagcaca ctttcctcgt 2040 gaaggtgtct ttgtttcaaa tggcacacac tggtttgtaa cacaaaggaa tttttatgaa 2100 ccacaaatca ttactacaga caacacattt gtgtctggta actgtgatgt tgtaatagga 2160 attgtcaaca acacagttta tgatcctttg caacctgaat tagactcatt caaggaggag 2220 ttagataaat attttaagaa tcatacatca ccagatgttg atttaggtga catctctggc 2280 attaatgctt cagttgtaaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggttgccaag 2340 aatttaaatg aatctctcat cgatctccaa gaacttggaa agtatgagca gtatataaaa 2400 tggccatggt acatttggct aggttttata gctggcttga ttgccatagt aatggtgaca 2460 attatgcttt gctgtatgac cagttgctgt agttgtctca agggctgttg ttcttgtgga 2520 tcctgctgca aatttgatga agacgactct gagccagtgc tcaaaggagt caaattacat 2580 tacacataa 2589 <210> 7 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-coronavirus 2 mutated nRBD <400> 7 cagtgtgtta atcttacaac cagaactcaa ttaccccctg ctaacaatct tgattctaag 60 gttggtggta attataatta cctgtataga ttgtttagga agtctaatct caaacctttt 120 gagagagata tttcaactga aatctatcag gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa 180 ggttttaatt gttactttcc tttacaatca tatggtttcc aacccactaa tggtgttgat 240 taccaaccat acagagtagt agtactttct tttgaacttc tacatgcacc agcaactgat 300 tgtggaccta aaaagtctac taatttggtt aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat 360 ggtttaacag gcacaggtgt tcttactgag tctaacaaaa agtttctgcc tttccaacaa 420 tttggcagag acattgctga cactactgat gctgtccgtg atctacagac acttgagatt 480 cttgacatta caccatgttc ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact 540 tctaaccagg ttgctgttct ttatcagggt gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt 600 catgcagatc aacttactcc tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa 660 acacgtgcag gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata 720 cccattggtg caggtatatg cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgg 777 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 8 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 9 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2F-1 primer <400> 10 atgtttgttt ttcttgtttt attgc 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2F-2 primer <400> 11 gccactagtc tctagtcagt g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2F-3 primer <400> 12 cagtgtgtta atcttacaac c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2F-5 primer <400> 13 attaccccct gctaacaatc ttg 23 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2F-6 primer <400> 14 aacaatcttg attctaaggt tggtgg 26 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2R-1 primer <400> 15 ttatgtgtaa tgtaatttga ctcc 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2R-2 primer <400> 16 gactcctttg agcactggct c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2R-3 primer <400> 17 ccgccgagga gaattagtct 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cov2R-4 primer <400> 18 gtctgagtct gataactagc g 21

Claims (26)

1. 서열목록 제1서열 중 28번 내지 438번 잔기가 삭제된 14번 내지 1213번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
   
2. 제 1 항에 있어서, 504번 잔기의 Asp으로 치환; 524번 잔기의 Asp으로 치환; 및 579번 잔기의 Leu으로 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 제 2 항에 있어서, 614번 잔기의 Gly으로의 치환을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
4. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열 또는 서열목록 제2서열의 15번 내지 259번 잔기의 아미노산 서열, 또는 서열목록 제3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 펩타이드는 80번 잔기의 Asp으로 치환; 100번 잔기의 Asp으로 치환; 및 155번 잔기의 Leu으로 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
6. 제 5 항에 있어서, 190번 잔기의 Gly으로의 치환을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드.
   
8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
   
9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환된 미생물.
   
10. 서열목록 제6서열 또는 제7서열의 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드.
    
11. 서열목록 제6서열 또는 제7서열의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
    
12. 서열목록 제6서열 또는 제7서열의 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물.
    
13. 다음의 단계를 포함하는 코로나바이러스 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 서열목록 제6서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드를 특이적으로 인식하는 프라이머를 이용하여 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 유전자를 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 유전자의 크기를 확인하는 단계,
    상기 증폭된 유전자 중 600bp 내지 900bp의 유전자가 검출될 경우, 상기 개체는 코로나바이러스 감염 질환을 가지는 것으로 판정한다.
    
14. 제 13 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열목록 제13서열의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
    
15. 제 14 항에 있어서, 서열목록 제18서열의 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머를 추가로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
17. 서열목록 제13서열의 프라이머.
    
18. 서열목록 제 13 서열의 프라이머 및 서열목록 제 18 서열의 프라이머를 포함하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
    
19. 제 18 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
    
20. 제18항의 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스 감염 진단용 조성물.
    
21. 제 20 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는 조성물.
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