KR19990063761A - 헤르페스 비루스에 속하는 rfhv/kshv 아과의 당단백질b - Google Patents

헤르페스 비루스에 속하는 rfhv/kshv 아과의 당단백질b

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KR19990063761A
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seq
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엠. 로즈 티모시
엘. 보쉬 마닉스
스트랜트 커트
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엘. 데이예를 카렌.
유니버시티 오브 워싱톤
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Abstract

본 발명은 감마 헤르페스 비루스의 RFHV/KSHV 아과 유래의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 이것의 3가지 구성원이 상세하게 특성규명되었다. DNA 추출물은 복막후 섬유종증(RF)에 걸린 머카크 내매스트리나 및 머카크 뮬라타 원숭이와, 카포시 육종(KS)에 걸린 인간 AIDS 환자에게서 얻었다. 이 추출물은 감마 헤르페스 비루스의 공지 단백질 및 DNA 서열로부터 디자인한 콘센서스-축퇴 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 증폭시켰다. 319개 염기쌍 단편으로 이루어진 뉴클레오티드 서열은 RFHV1 및 KSHV 간에 약 76% 동일하였고, RFHV/KSHV 아과 이외의 가장 근연성이 큰 감마 헤르페스 비루스와는 약 60 내지 63% 동일하였다. 이 단편들내에서 암호된 단백질 서열은 RFHV1과 KSHV 사이에서는 약 91% 동일하지만 다른 감마 헤르페스 비루스의 서열과는 <~65% 동일하였다. 완전한 길이의 KSHV 당단백질 B 서열은 N-말단 부근에 경막 도메인과, 세포외 도메인중에 가능성이 큰 다수의 항원성 부위를 포함한다. 또한, 본 발명은 비제한적으로 RFHV1, RFHV2 및 KSHV 펩티드를 포함하여 RFHV/KSHV 아과의 구성원 유래의 당단백질 B 암호 영역을 특성규명하기 위한 물질 및 방법을 제공하며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 항체는 감염 진단용으로서, 그리고 당단백질 B에 대한 면역 응답 반응을 유인하기 위한 용도로 사용할 수 있다.

Description

헤르페스 비루스에 속하는 ＲＦＨＶ/ＫＳＨＶ 아과의 당단백질 Ｂ
카포시 육종은 출혈성 육종의 매우 치명적이고 손상된 형태이다. 이것은 암색 반점이나 혹으로 피부상에 나타나는 다발성 혈관 종양을 특징적으로 나타낸다. 조직학적 측면에서 살펴볼 때, 그 특징으로서 소속 및 혈관 세극을 형성하는 비교적 균일한 방추형 세포의 증식을 나타낸다. 종종 염증 침윤물에 혈장 세포, T 세포 및 단핵구가 나타나기도 한다. 결국에는 위장 병변부나 관련 림프종으로부터의 출혈로 인해 죽음에 이르게 된다(일반적으로 문헌 Martin et al., Finesmith et al. 참조).
일단 비교적 불확실한 질병은 AIDS와의 관련성 때문에 급격히 대중적인 관심을 얻게 된다. 특정 AIDS-감염 개체군중 20% 정도는 그 질병 과정동안 카포시 육종을 획득한다. 카포시 육종은 신장 투석과 치료적 면역억제를 비롯하여 면역 결핍과 관련있는 다른 질환에서도 나타난다. 하지만, 이 질환의 역학은 면역결핍이 유일한 원인 인자가 아니라는 것을 암시했다. 특히, 특정 성 관계와 카포시 육종간의 높은 관련성은 인간 면역결핍 비루스가 아닌 다른 병인 인자가 관련이 있다는 것을 암시한다(Berel et al.).
헤르페스 비루스와 유사한 DNA 서열은 AIDS 환자에게서 얻은 카포시 병변부 유래의 조직 샘플중에서 동정되었다(Chang et al., Ambroziuk et al.에 의해 확인됨). 이 서열은 감염 조직과 비감염 조직에서 얻은 DNA를 관련이 없는 개시 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시키고, 그 다음 함께 하이브리드하여 세포간의 차이를 규명하는 대표 차이 분석(Lisitsyn et al.)으로 얻었다. 이 서열은 엡스타인 바아 비루스 및 헤르페스비루스 사이미리의 공지 서열과 부분적으로 동일하였다. 이것은 비루스 내부에 격리된 2가지 구조 성분인 캡시드 및 외피 단백질을 암호했다. 각종 근원으로부터 얻은 조직을 연구한 결과, 상기 서열은 환자의 HIV 상태와는 무관하게 카포시 육종 병변부의 95%중에서 발견되었다(Moore et al. 1995a). 또한, 동일 환자에서 얻은 무관련 조직중 21%도 양성인 한편, 대조용 개체에서 얻은 샘플중 5%도 양성이었다. 샘플들간의 서열 편차는 약 0.5% 였다.
이 서열은 AIDS 환자중에서 고유하게 발생하는 B-세포 특징을 가진 체강 림프종, 림프종 삼출액중에서 높은 복제수로 검출되었다(Cesarman et al.). 복제수는 카포시 육종에 비해 체강 림프종에서 더 높았다. 다른 AIDS-관련 림프종은 음성이었다. 또한, 이 서열은 캣슬맨 질환에 걸린 환자의 말초 혈액 단핵 세포에서 발견되었다(Dupin et al.). 상기 질환은 혈관여포성 과형성의 형태학적 특성을 특징으로 하며, 열, 선증 및 비종대를 수반한다. 상기 서열이 유래하는 추정상의 비루스는 카포스 육종 관련 헤르페스 비루스(KSHV)라고 알려져 있다.
동일계내 하이브리드화에 PCR를 사용하여 보쇼프(Boshoff) 등은 카포시 육종에서 종양 세포를 나타내는 것으로 사료되는 세포 형태의 KSHV 폴리뉴클레오티드 서열을 검출해냈다. 또한, 혈청학적 증거는 카포시 육종의 병인에 KSHV가 중요한 역할을 한다는 것을 지지하고 있다(O'Leary). 케데스(Kedes) 등은 KSHV로 잠복 감염된 B 세포에서 잠복성 관련 핵 항원에 대한 항체를 검측하는 면역형광성 혈청 분석법을 개발하였고, KSHV 혈청양성이 카포시 육종에 걸린 환자내에서 높다는 것을 발견하였다. 가오(Gao) 등은 AIDS 개시 바로 이전에 카포시 육종에 걸리지 않은 40명의 동성애자중 단지 7명이 면역블롯 분석시 KSHV 항원에 대한 항체에 양성을 나타낸 반면, 카포시 육종에 걸린 40명의 환자중, 32명이 양성을 나타냈다. 밀러(Miller)등은 KSHV 및 엡스타인 바아 비루스의 게놈을 함유하는 체강 림프종 세포주로부터 KSHV 항원을 제조했다. p40이라고 하는 한 항원에 대한 항체는, 카포시 육종에 걸리지 않고 HIV-1 감염된 환자 54명중 단지 7명에서만 확인된데 반해, 카포시 육종에 걸리고 HIV-1 감염된 환자 48명중 32명에서 확인되었다.
종(Zhong)등은 감염 조직내에 존재하는 KSHV 서열의 발현을 전령 RNA 수준에서 분석하였다. 이 KSHV 게놈으로부터 전사된 다량의 비루스 특이적인 RNA를 나타내는 2가지 작은 전사체를 발견하였다. 제1 전사체는 작은 막 단백질을 암호하는 것으로 추정되었고, 제2 전사체는 핵내에 축적하여 단백질 암호 서열을 가질 수 없는 특이적인 폴리-A RNA인 것으로 추정되었다. 전령 RNA는 게놈 DNA의 람다 라이브러리로부터 ∼120 kb의 KSHV 게놈에 전개된 복수의 중첩 KSHV 게놈 단편을 클로닝하여 분석하였다. 이 클론들을 노던 분석의 프로브로서 사용하였으나, 그 서열은 확인하지 못하였다.
무어(Moore)등은 체강 림프종에서 얻은 KSHV 게놈 단편의 특성을 부분적으로 규명하였다. 이 게놈중 20.7 kb 영역을 서열 분석하였지만 개시된 바는 없다. 상기 단편내에는 캡시드 성숙 유전자 및 티미딘 키나제 유전자를 비롯하여 다른 공지의 감마 헤르페스 비루스 유전자와 서열 및 위치 상동성을 가진 유전자를 제외하고 17개의 부분 또는 완전 오픈 리딩 프레임이 있다. 계통발생학적 분석 결과, KSHV가 엡스타인 바아 비루스보다 말의 헤르페스 비루스 2 및 사이미리 비루스와 근연성이 더 큰 것으로 밝혀졌다. 상기 20.7 kb 영역은 당단백질 B 또는 DNA 폴리머라제를 암호하는 서열을 함유하고 있지 않다.
일반적으로, 헤르페스 비루스과는 크기가 약 100 nm이고 척추동물을 감염시킬 수 있는 많은 다중-엔벨로프형 비루스를 포함한다(개론은 문헌 Emery et al., Fields et al.을 참조하라). 이 이본쇄 DNA 게놈은 특이적으로 크다 - 길이가 약 88 내지 약 229 kb 이다. 이 비루스는 생활환중의 각종 단계에서 50가지 이상의 상이한 전사체를 생산할 수 있다. 비루스 표면에서는 다수의 당단백질이 발현되어, 그 비루스에 의한 표적 세포의 인식과 세포내로의 비루스 투과에 관여한다. 이러한 표면 단백질은 내부 비루스 성분에 비하여 종간마다 비교적 변화가 심하다(Karlin et al.). 또한, 동일한 표면 단백질도 상기 비루스가 거주하는 세포 생산의 결손 비루스 입자상에 존재한다. 이러한 비감염성 형태의 하나는 외피와 비루스 엔벨로프를 포함하지만 뉴클레오캡시드는 결실된 L-입자이다.
헤르페스 비루스과는 여러 아과로 나뉘어진다. 이러한 각 카테고리의 지정은 본래 생물학적 성질을 기본으로 하였고, 게놈 서열의 데이터가 제공됨에 따라 수정되고 있다. 알파 아과는 광범위한 숙주 범위, 짧은 복제 사이클 및 감각 신경절에 대한 친화성을 가진 비루스를 포함한다. 이러한 비루스에는 인체 단순 비루스 및 바리셀라-조스터(대상 수두) 비루스를 포함한다. 베타 아과는 제한된 숙주 범위를 가진 비루스를 포함하며, 시토메가로비루스 및 인체 헤르페스 비루스 6이 있다. 감마 아과는 일반적으로 림프친화성인 비루스를 포함한다. 이 DNA는 GC 함량이 낮은 약 110 kb의 단편과, 이에 인접해 있는 GC 함량이 높은 복수의 직렬형 반복체를 특징으로 한다. 이 감마아과에는 엡스타인 바아 비루스(EBV), 헤르페스 비루스 사이미리, 말 헤르페스 비루스 2 및 5, 및 소 헤르페스 비루스 4를 포함한다.
헤르페스 비루스는 복잡한 임상 과정을 갖는 질환과 연관이 있다. 많은 헤르페스 비루스의 특징은 장시간에 걸쳐 숙주내에서 잠복 상태에 있는 성질이다. 알파 아과의 비루스는 감각 및 자율 신경절에서 잠복 형태를 유지하는 반면, 감마 아과의 비루스는 예컨대 림프구 계통의 세포중에서 잠복 형태를 유지한다. 잠복성은 특정 비루스 유전자의 전사와 관련이 있고, 비루스가 활성적인 복제를 개시하기에 적당한 조건이 될 때까지 수십년동안 존속할 수도 있다. 이러한 질환으로는 면역결핍증을 포함한다. 또한, 감마 아과의 일부 헤르페스 비루스는 감염된 세포를 유전자적으로 형질전환시키는 성질을 가지고 있다. 예컨대, EBV는 B 세포 림프종, 구강 융모성 백반, 림프양 간질성 폐염 및 비인두 종양과 관련이 있다.
섬유증식 및 종양발현전 세포 발생을 포함하고 있는 인체와 다른 척추동물에는 다른 많은 질환들이 일어날 수 있다. 인체에서 발생하는 질환의 예로는 복막후 섬유증, 소결절성 섬유종증, 가육종 섬유종증 및 경화성 장간막염이 있다. 동물지방병성 복막후 섬유종증(RF)이란 질환은 워싱턴대학 지역 영장류 연구 센터(Giddens et al.)에 있는 머카크 원숭이의 콜로니에서 관찰되었다. 이 질환의 후기 단계들은 장간막과 복강의 배측부 주위로 섬유상 조직이 증식하고, 서혜관으로 신장하여, 횡격막을 통해 복벽으로 신장하는 것을 특징으로 한다. 이러한 임상적 증상이 뚜렷하면 이 질병은 1 내지 2 개월내에 틀림없이 치명적이 된다. 이 질환은 D 형의 시미안 레트로비루스인 SRV-2에 의한 시미안 면역결핍증(SAIDS)과 관련이 있다(Tsai et al.). 하지만, 다른 콜로니들은 SAIDS에 걸린 원숭이 중에서 동일한 빈도수의 RF를 나타내지 않으며, 워싱톤에서 연구된 RF의 빈도수는 최근 감소하고 있다.
비인체 영장류중에서 이러한 질환의 연구는 인체 질환의 모델로써 뿐만 아니라 하나의 영장류 종이 다른 종을 감염시키는 비루스 저장원으로서 작용할 수 있기 때문에 중요하다. 예컨대, 헤르페스 비루스 사이미리는 이것의 천연 숙주인 다람쥐 원숭이(사이미리 시우레우스)중에서는 어떤 질병도 일으키지 않는 것으로 나타나지만, 다른 영장류, 특히 올빼미 원숭이중에서는 폴리클로널 T-세포 림프종과 급성 백혈병을 일으킨다.
따라서, 헤르페스 비루스 감염을 검측하고 치료하는데 사용하기 위한 시약과 방법의 개발이 필요로 된다. 혈청학적 증거로 확인된 KSHV와 카포시 육종간의 병인학적 연관성은 이러한 필요성이 중요하다는 것을 나타낸다.
예컨대, 첫째 카포시 육종 및 유사 질환을 진단 및 평가하는데 사용할 수 있는 시약과 방법의 개발이 요구되고 있다. 신규 환자의 병인 인자를 검측할 수 있다면 여러 진단에 도움을 줄 수 있는데, 즉 개시 질환에 있어서 상기 병인 인자의 정도를 평가할 수 있다면 임상 처치에 도움을 줄 수 있다. 바람직한 마커로는 B형 간염의 HBsAg와 유사한, 비루스 감염의 활성 형태와 잠복 형태의 존재를 나타내는 매우 민감한 지표를 제공하는 마커를 포함한다. 또한, 바람직한 마커로는 면역원성이며, 항체 응답시에 명백히 나타나는 바와 같이 비루스 인자에 대한 면역학적 노출을 평가하는데 사용할 수 있는 마커를 포함한다. 특히 이러한 특성을 가진 마커로서 상기 비루스 엔벨로프 유래의 당단백질 항원이 적합하다. 이 항원들은 비루스 복제 형태 뿐만 아니라 비루스 감염된 세포 생산의 L-입자상의 표면 부근에서 높은 수율로 발현될 수 있다.
둘째, 예방적이거나 비루스 챌린지 후 비루스 감염 치료에 사용할 수 있는 시약 및 방법의 개발이 요구된다. 이러한 시약으로는 상기 비루스에 대하여 일정 수준의 면역성을 부여하는 백신을 포함한다. 항-비루스 항체를 포함하는 백신과 같은 수동 백신은 직접 방어를 제공하거나 또는 최근 비루스 노출된 개체내에서의 비루스 복제 및 세포 투과를 억제하는데 사용할 수 있다. 면역원성 비루스 성분을 포함하는 백신과 같은 활성 백신은 개체중의 활성 개시 면역 반응을 유도하는데 사용할 수 있다. 활성 백신으로 유도되는 항체는 생 비루스에 의한 연속적인 챌린지에 대하여 개체를 보호하는데 도움을 줄 것이다. 활성 백신으로 유도되는 세포독성 T 세포는 비루스 복제에 연관있는 숙주 세포를 제거하여 동시 감염을 근절시키는데 도움을 줄 수 있다. 예방적 면역 반응의 적합한 표적, 특히 항체는 비루스 입자의 표면상에 노출된 단백질 항원이며, 표적 세포와 비루스의 융합에 연관된 것이다.
세째, 카포시 육종 및 유사 질환에 대한 신규 약제 개발시 사용될 수 있는 시약과 방법의 개발이 요구된다. 카포시 육종에 대하여 현재 사용되는 치료법은 전통적인 화학치료법, 예컨대 빈크리스틴과 함께 병용되는 방사선요법이다(Northfelt, Mitsuyasu). 병변부가 이러한 양식에 응답하는 동안에, 응답은 일시적이며, 일반적으로 하향하는 임상 과정이 재개된다. 시토킨으로의 치료와 같이, 실험적 치료법조차도 질병의 원인보다는 질병의 증상에 대한 치료법이다. 병인 인자에 근거를 둔 약물 선별과 적당한 약물 디자인은 장기간 효능을 가진 임상 섭생에 대한 오랜 필요성에 대하여 초점을 둘 수 있다. 이러한 약제의 적합한 표적은 숙주 세포의 인식 및 투과와 연관있는 비루스 성분이다. 그 예로는 비루스 엔벨로프의 당단백질 성분을 포함한다.
네째, 다른 섬유증식 질환과 관련이 있을 수 있는 비루스제를 동정하는데 사용할 수 있는 시약과 방법의 개발이 요구된다. 창(Chang) 등에 의해 사용된 대표 차이 분석법은 매우 복잡하며, 따라서 일반적인 선별 시험법으로는 적당하지 않을 것이다. 보다 바람직한 것은 관련 병인 인자를 함유하는 것으로 추정되는 각종 조직 샘플을 연구할 수 있는 보다 통상적인 분석법에 이용하기 위한 시약으로서 사용할 수 있는 일군의 올리고뉴클레오티드 프로브, 펩티드 및 항체이다. 이 시약은 관련성은 있으나 종래 개시된 바 없는 비루스 병원체를 동정하기에 충분하게 교차반응성이며, 관련이 없는 비루스와 숙주의 내인성 성분은 동정하지 않을 정도로 충분히 특이적인 것이 바람직하다.
본 발명은 개괄적으로 비루스학 분야, 구체적으로 헤르페스과의 비루스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간을 비롯한 영장류의 섬유증식성 및 종양 질환과 관련있는 헤르페스 비루스의 당단백질 B 분자를 동정하고 특성규명하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 RFHV 및 KSHV의 당단백질 B 암호 영역으로부터 증폭된 폴리뉴클레오티드 서열의 목록이다. 잔기 36 내지 354 사이의 319개 염기의 폴리뉴클레오티드 분절은 밑줄이 그어진 부분으로, 이것을 증폭시키는데 사용된 프라이머들 사이의 각각의 비루스 유전자 분절을 나타낸다. 이 폴리뉴클레오티드 서열과 함께, 하이브리드화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 정렬시켜 기재하였다. 타입 1 올리고뉴클레오티드는 감마 헤르페스 콘센서스 서열을 포함하고, 감마 헤르페스 비루스의 당단백질 B 유전자 분절을 증폭시키는데 사용할 수 있다. 도시된 예는 NIVPA와 TVNCB이다. 타입 2 올리고뉴클레오티드는 RFHV/KSHV 아과 유래의 콘센서스 서열을 포함하고, 이아과에 속하는 비루스의 당단백질 B 유전자 분절을 증폭시키는데 사용할 수 있다. 그 예는 SHMDA, CFSSB, ENTFA 및 DNIQB이다. 도시된 다른 올리고뉴클레오티드는 타입 3 올리고뉴클레오티드이다. 이것은 RFHV 또는 KSHV 서열로부터 직접 취한 서열을 포함하고, 각각의 비루스 유래의 서열에 특이적이다. 암호 서열 방향으로 증폭을 개시(끝에 "A"로 표시함)하는 올리고뉴클레오티드에는 5'→3'라고 나타내었다. 암호 서열의 방향과 반대 방향(끝에 "B"라고 표시함)으로 증폭을 개시하는 올리고뉴클레오티드에는 3'→5'라고 나타내었다. 또한, 도 1은 RFHV 및 KSHV 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호된 폴리펩티드를 도시하고 있다. 이 두 서열에 있어서 뉴클레오티드 238 내지 240에 의해 암호된 아스파라긴은 다른 헤르페스 비루스에도 보존되는 잠재적 N-결합 글리코실화 부위이다.
도 2는 KSHV 게놈 및 RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들에 포함될 것으로 사료되는 당단백질 B 암호 DNA 서열의 지도이다. 이 도면에서는 본원에 기술된 KSHV 당단백질 B 서열의 대략적인 위치를 도시하고 있다. 또한, 감마 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B 서열을 프로브하고 증폭시키는데 유용한 타입 1 콘센서스/축퇴 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화 부위를 나타내는 추정상의 보존성 분절을 도시하고 있다.
도 3은 완전한 KSHV 당단백질 B의 단백질 서열과 RFHV1 및 RFHV2의 단편을 정렬시킨 종래 공지된 일부 헤르페스 비루스 당단백질 B 단백질 서열의 목록이다. 박스가 그려진 영역은 추정상의 프로세싱전 시그널 서열과 경막 도메인을 나타낸다. 시스테인 잔기에는 밑줄이 그어져 있다. 헤르페스 비루스 당단백질 B 서열중에서 고도로 보존성인 잔기들에는 아래에 별표(*)를 표시하였고, KSHV 당단백질 B에서만 고유하게 나타나는 시스테인에는 아래에 점(·)을 표시하였다.
도 4는 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 FRFDA를 도시한 것이다.
도 5는 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 NIVPA 및 NIVPASQ를 도시한 것이다.
도 6은 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 TVNCA, TVNCB 및 TVNCBSQ를 도시한 것이다.
도 7은 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 FAYDA를 도시한 것이다.
도 8은 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 IYGKA 및 IYGKASQ를 도시한 것이다.
도 9는 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 CYSRA 및 CYSRASQ를 도시한 것이다.
도 10은 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 NIDFB 및 NIDFBSQ를 도시한 것이다.
도 11은 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 FREYA, FREYB 및 NVFDA를 도시한 것이다.
도 12는 보존 영역을 나타낸, 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열 목록과, 이로부터 디자인된 타입 1 올리고뉴클레오티드 GGMA를 도시한 것이다.
도 13은 감마 헤르페스 비루스의 종래 공지된 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열과 정렬시킨, RFHV와 KSHV 유래의 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 목록이다.
도 14는 폴리뉴클레오티드 서열내에 존재하는 NIVPA 및 TVNVB의 하이브리드화 부위사이에서 암호된 각종 감마 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B의 폴리펩티드 서열을 비교하는 목록이다. 밑줄이 그어져 있는 클래스 II 서열의 단편은 RFHV-KSHV 교차 반응성 항원 펩티드인 것으로 추정된다. 소문자로 표시된 클래스 III 서열은 RFHV 또는 KSHV 비루스-특이적인 펩티드인 것으로 추정된다.
도 15는 감마, 베타 및 알파 아과에 속하는 보다 광범위한 헤르페스 비루스 전반에 걸친 당단백질 B의 폴리펩티드 서열을 정렬시켜 도시한 것이다.
도 16은 도 15에 도시한 폴리펩티드 서열을 기초로 한 당단백질 B의 관련 지도이다.
도 17은 예시적인 타입 2(아과-특이적) 올리고뉴클레오티드와, 이로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 정렬시켜 도시한 목록이다.
도 18은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하이브리드화 위치를 보여주는, KSHV 게놈에서 나타나는 것과 같은 당단백질 B와 DNA 폴리머라제 암호 영역의 대략적인 지도이다.
도 19는 도 1의 서열에서 업스트림과 다운스트림에 위치한 단편을 증폭시켜 얻은 KSHV DNA 서열의 목록이다. 캡시드 성숙 유전자와 DNA 폴리머라제의 오픈 리딩 프레임들이 인접 위치해 있는 완전한 KSHV 당단백질 B 서열의 오픈 리딩 프레임이 도시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열중 추정상의 당단백질 B 프로모터에는 밑줄을 그어나타냈다.
도 20은 NIVPA와 TVNCB 사이에서 암호된 RFHV의 106개 뉴클레오티드 당단백질 B 폴리펩티드 단편에 대한 호프-우드스 항원성 플롯이다. 이 플롯 아래에는 서열중의 소수성 잔기와 항원성 잔기들간의 간격이 표시되어 있다.
도 21은 NIVPA와 TVNCB 사이에서 암호된 KSHV의 106개 뉴클레오티드 당단백질 B 폴리펩티드 단편에 대한 호프-우드스 항원성 플롯이다.
도 22는 KSHV 유래의 완전한 당단백질 B에 대한 호프-우드스 항원성 플롯이다.
도 23은 RFHV2라고 표시한, RFHV/KSHV 아과의 제3의 구성원이 가진 당단백질 B 단편의 DNA 및 단백질 서열 목록이다. 잔기 36 내지 354 사이에 존재하는 319개 염기 폴리뉴클레오티드 분절에는 밑줄이 그어져 있고, 이들을 증폭시키는데 사용된 프라이머들 사이의 당단백질 B 암호 분절이 나타나있다.
바람직한 양태에 대한 설명
본 발명자들은 헤르페스 비루스의 RFHV/KSHV 아과 유래의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 발견하고 특성규명하였다. 이와 같이 얻은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체는 헤르페스 비루스 감염 및 관련 질환의 진단, 임상 모니터링 및 치료에 유용하다.
RFHV 당단백질 B의 폴리뉴클레오티드 공급원으로는 복막후 섬유종증("RF")에 걸린 머카크 내매스트리나 원숭이에서 채취한 감염 조직 샘플을 사용하였다. 또한, KSHV 당단백질 B의 폴리뉴클레오티드 공급원으로는 카포시 육종("KS")에 걸린 인간에서 채취한 감염된 조직 샘플을 사용하였다. 본 발명에 사용된 조직들은 이들이 종래 해당 DNA 폴리머라제 암호 단편들을 클로닝하는데 성공적으로 사용된 바 있기 때문에 RFHV 또는 KSHV 유래의 유전자 물질을 포함하는 것으로 알려져 있다. DNA 폴리머라제 영역의 증폭에 대해서는 본 출원인이 소유권을 갖고 있는 미국 특허 출원 60/001,148호에 기재되어 있다.
이들 샘플 유래의 당단백질 B 서열을 증폭시키기 위하여, 본 발명자들은 다른 헤르페스 비루스의 당단백질 B로부터 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 당단백질 B는 이들이 비루스 엔벨로프의 외부에 노출되어 있고 따라서 이들이 감염시킨 숙주의 면역계로부터 선택적인 압력하에 있기 때문에 헤르페스 비루스들간에 있어서 보존성이 적은 것으로 예상되었다. 따라서, RFHV 및 KSHV와 가장 관련성이 큰 것으로 생각되는 헤르페스 비루스들의 서열로부터 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 이들 두 비루스는 그 DNA 폴리머라제 서열로부터 가장 근연성이 큰 감마형 헤르페스 비루스인 것으로 알려져 있다.
올리고뉴클레오티드는 기본적으로 4가지 감마 헤르페스 비루스, sHV1, eHV2, bHV4, mHV68 및 hEBV로 종래 알려진 당단백질 B 서열로부터 디자인하였다. 이들 4가지 당단백질 B 분자의 아미노산 서열 비교 결과, 9개의 비교적 보존성인 영역을 밝혀냈다. 이 서열 자료를 기초로 하여, 하기 기술되는 바와 같은 축퇴 분절과 콘센서스 분절을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 작제하였다. 이 올리고뉴클레오티드중 3개는 RF 및 KS 조직으로부터 RFHV 및 KSHV 당단백질 B 암호 분절의 단편을 생성하는 증폭 반응에 프라이머로서 사용된 바 있다.
최종 증폭 단계 후 얻은 RFHV 및 KSHV 폴리뉴클레오티드 서열 단편을 도1에 도시하였다(각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3). 이 서열에는 증폭 반응에 사용된 NIVPA 및 TVNCB 프라이머의 하이브리드 영역에 상응하는 분절을 각 말단에 포함하고 있다. 프라이머 결합 분절사이의 단편은 길이가 391개의 염기쌍(잔기 36 내지 354)으로서, RFHV 및 KSHV 게놈의 각각의 당단백질 B 암호 영역의 서열을 정확하게 반영하는 것으로 생각된다.
RFHV 유래의 319개 염기쌍으로 된 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드 분절은 RFHV/KSHV 아과 이외의 비루스 유래의 서열중에서 가장 근연성이 큰 서열인 sHV1 및 bHV4의 서열과 단지 60%만이 동일하였다. KSHV 유래의 319개 염기쌍으로 된 폴리뉴클레오티드 분절은 sHV1 및 bHV4의 서열과 63%만이 동일하였다. 상기 분절들은 RFHV와 KSHV 간에는 76%의 동일성이 있다.
또한, 대응하는 추정상의 아미노산 서열을 도시하였다(서열 번호 2 및 서열 번호 4). 이 폴리펩티드 서열은 신규하며, 다른 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B 서열과 부분적 상동성이 있다. 도시된 단편들은 전체 당단백질 B 서열의 약 1/8인 것으로 예상된다. 이 단편들은 프로세싱전의 단백질중 추정상의 N-말단 메티오닌으로부터 약 80개 아미노산 다운스트림에서 개시된다. 아미노산 서열의 위치 80에는 서열 Asn-Xaa-(Thr/Ser)을 따라 잠재적 N-결합 글리코실화 부위가 존재한다. 이 부위는 RFHV와 KSHV 간에 보존성이며, 또한 다른 공지의 감마 헤르페스 비루스들간에도 보존성이다. 또한, 감마, 베타 및 알파 아과의 헤르페스 비루스들을 따라서 보존성인 위치 58에 존재하는 시스테인 잔기는 단백질의 입체 구조를 유지하는데 중요한 역할을 할 것이다.
증폭 프라이머들 사이에 존재하는 319 염기쌍들에 의해 암호된 당단백질 B의 106개 아미노산 분절은 RFHV 및 KSHV간에는 91% 동일하지만, RFHV/KSHV 아과 이외에서 가장 근연성이 있는 서열인 bHV4와 KSHV 서열간에는 65%만이 동일하였다.
RFHV/KSHV 헤르페스 비루스 아과에 의해 형질발현된 당단백질 B 분자는 다른 헤르페스 비루스의 당단백질 B에서 나타나는 많은 특성들을 가진 것으로 예상된다. 당단백질 B 분자는 일반적으로 약 110 kDa의 크기로서, 약 800 내지 900 아미노산 또는 약 2400 내지 2700 염기쌍에 해당한다. 소수성 플롯은 다음과 같은 순서로 나열된 N 말단에서 부터 C 말단까지의 영역을 나타낸다: 막-지향성 선도 서열에 해당하는 소수성 영역; 세포외 도메인에 해당하는 복합 극성 영역; 경막 도메인에 해당하는 소수성 영역; 및 세포질 도메인에 해당하는 또다른 복합 극성 영역.
도 19에 도시한 KSHV 당단백질 B의 총 서열을 통해 다음을 확인할 수 있다: 이 유전자는 시그널 펩티드와 C 말단 부근의 경막 영역을 포함하여 약 845개의 아미노산을 암호한다. 시스테인 잔기는 다른 당단백질 B 서열에서도 보존성이며, 또다른 잠재적 이황화 결합이 입체 구조의 안정화를 도울 수 있다.
당단백질 B는 일반적으로 감염성인 결손 비루스 입자의 엔벨로프 및 감염 세포의 표면상에서 발현된다. 이것은 일반적으로 글리코실화되어 있으며, 5개 내지 20개의 글리코실화 부위 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 또한, 당단백질 B는 일반적으로 비루스가 발아하기 이전에 숙주 세포의 표면으로 전위하는 동안 조합되는 단백질 이량체로서 발현된다. 이량체화 가능성이 큰 부위는 대략 아미노산 475와 막 내재 분절사이에 위치하는 것으로 나타난다(Navarro 등).
종래 연구 결과, 당단백질 B 분자의 여러 영역들에 대하여 감염성과 관련있는 여러 생화학적 기능을 지도화하였다. 당단백질 B 및 당단백질 C는 모두 표적 세포에 대한 HSV1 및 소 헤르페스 비루스 1의 개시 결합과 관련이 있다(Herold 등, Byrne 등). 당단백질 B에 의해 인식되는 세포상의 부는 헤파란 설페이트인 것으로 나타나는데, 즉 결합은 유동상의 헤파린에 의해 억제될 수 있다. 당단백질 C가 결실된 돌연변이체는 여전히 표적 세포에 결합할 수 있지만, 당단백질 C 와 당단백질 B가 모두 결실된 돌연변이체는 세포에 도달하는 성질이 심하게 손상되어 있다.
다른 분명히 중요한 기능은 막 융합과 세포로 비루스의 도입을 촉진시키는 당단백질 B의 성질이다. 인체 CMV에 있어서, 푸소겐(fusogen)의 역할은 당단백질 B의 제 1 소수성 도메인을 지도작성하는 것으로 나타나며, 이 영역내의 보존성 글리신 잔기에 결합될 수 있다(Reschke 등). HSV1 돌연변이에 있어서, 합포체 형성을 촉진하는 당단백질 B의 역할은 C 말단 부근에 있는 상기 단백질의 세포질 도메인에 존재하는 다중 부위를 지도작성하는 것이다(Kostal 등).
이와 같은 다소 복잡한 기능을 일부 수행하기 위하여, 당단백질 B는 제2의 당단백질 B 분자뿐만 아니라 비루스에 의해 암호된 다른 성분들에도 결합하는 것으로 추정된다. 예를 들면, UL45 유전자 생성물은 당단백질 B 유도 융합에 필요한 것으로 나타난다(Haanes et al.). 또한, 당단백질 B는 표적 세포의 표면에서 소수성 융합 소공을 형성하는 다른 표면 단백질과 공동작용한다고 가정된 바 있다(Pereira 등). 당단백질 B는 본래의 비루스를 중화시킬 수 있는 강력한 항체 반응을 유인하는 것으로 밝혀졌다. 중화 활성을 가진 모노클로널 항체는 당단백질 B 분자상의 많은 상이한 부위들에 대하여 유도될 수 있다.
결론적으로, 당단백질 B 분자는 표적 세포와 상호작용하고, 프로모터 융합을 보조하며, 다른 비루스 단백질에 결합하는 부위를 갖고 있는 것으로 추정된다. 또한, RFHV/KSHV 아과 비루스의 당단백질 B 분자는 다른 헤르페스 비루스종 유래의 당단백질 B 기능을 대부분 수행하며 일부 동일한 성질을 가진 활성 영역도 가지고 있을 것으로 생각된다. 이러한 활성 영역중 임의의 영역을 약물, 항체 또는 돌연변이에 의해 간섭하면 비루스 감염이나 독성을 상실시킬 수 있을 것이다.
RFHV 및 KSHV의 당단백질 B의 발견에 이어, 마카카 뮬라타(Macaca mulatta)에 감염된 조직 샘플중에서 RFHV/KSHV 아과의 제3군을 발견하였다(실시예 12). 이 당단백질 B는 RFHV와 근연성이 크나 동일하지는 않으므로 RFHV2라고 표시하였다. 따라서, 인간에 대해 병원성인 것을 비롯하여 RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들이 존재할 것으로 예상된다. 본 명세서에는 상기 아과에 속하는 새로운 구성원들을 검출하고 특성규명하는 방식을 교시하고 있다.
RFHV/KSHV 아과에 속하는 당단백질 B 서열간의 상동성은 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드가 상기 아과의 여러 균주들중에서 믿을 만한 표지인자라는 것을 의미한다. 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체는 RFHV, KSHV 또는 이 아과중의 다른 헤르페스 비루스들에 의한 개체의 비루스 감염을 검측 및 치료하기 위한 용도등에 유용하다. 이러한 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 프로브, 폴리펩티드, 항체 및 당단백질 B 관련 백신 조성물, 및 이 화합물들의 제법 및 용도는 이하에 상세하게 설명할 것이다.
약어
하기 표 1에 기술되는 약어는 본원에 사용된 헤르페스 비루스 종 및 폴리뉴클레오티드와 이로부터 유래된 폴리펩티드를 나타낸 것이다:
헤르페스 비루스 균주에 대한 약어
약어 비루스 임시 아과 지정
RFHVKSHVmHV68bHV4eHV2sHV1hEBV 시미안 복막후 섬유종증-관련 헤르페스비루스인체 카포시 육종-관련 헤르페스비루스쥐 헤르페스비루스 68소 헤르페스비루스 4말 헤르페스비루스 2사이미리 원숭이 헤르페스비루스 1인체 엡스타인-바아 비루스 감마-헤르페스비루스
hCMVmCMVgpCMVhHV6 인체 시토메가로비루스쥐 시토메가로비루스기니아 피그 시토메가로비루스인체 헤르페스비루스 6 베타-헤르페스비루스
hVZVHSV1hHSV2sHVSA8eHV1iHV1 인체 바리셀라-조스터 비루스인체 헤르페스 단순 비루스 1인체 헤르페스 단순 비루스 2시미안 헤르페스비루스 A8말 헤르페스비루스 1익타루리드 캣피시 헤르페스비루스 알파-헤르페스비루스
정의
"당단백질 B"는 비루스 게놈내에서 암호된 헤르페스 비루스의 특정 단백질 성분으로서, 본래의 비루스 표면에서 발현되는 것으로 추정된다. 헤르페스 비루스의 특정 종, 특히 HSV1, hCMV 및 소 헤르페스비루스 1을 사용한 기능 연구 결과, 당단백질 B가 비루스 감염과 관련된 다수의 생화학적 기능에 연루된 것으로 밝혀졌다. 그 예로는 헤파란 설페이트와 같은 표적 세포의 표면에 대한 성분들의 결합, 표적 세포의 막과 비루스 막의 융합, 세포로 비루스 캡시드의 투과 및 다핵성 합포체 세포의 형성을 포함한다. 당단백질 B는 동종이량체로서 관찰되었으며, 일부 생화학적 기능을 수행하기 위하여 다른 비루스 표면 단백질과 상호작용할 수 있다. 여러 생화학적 기능, 특히 헤파란 설페이트 결합과 막 융합은 당단백질 B 분자의 여러 부분을 지도작성하는 것으로 나타난다. RFHV/KSHV 아과의 구성원을 비롯하여 다른 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B 분자는 상기 기능을 모두 수행할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 당단백질 B란 용어에는 비글리코실화 형태, 부분 글리코실화 형태 및 완전 글리코실화 형태와, 단량체 및 중합체를 모두 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 당단백질 B 단편, 영역, 또는 분절은 당단백질 B 분자의 단편 또는 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드의 준영역의 전사체를 포함한다. 본래의 당단백질 B 분자 또는 완전 전사체는 전술한 바와 같은 비루스 활성과 관련된 생화학적 기능을 발휘할 것이다. 이러한 기능중 일부 또는 전체는 그 단편에서 보존성일 수 있거나, 자체적으로는 그 기능을 수행할 수 없는 본래 분자로부터 유래된 일부분일 수 있다.
"당단백질 B 활성"은 당단백질 B의 모든 생화학적 기능을 의미하거나, 또는 당단백질 B에 의한 헤르페스 비루스의 모든 생물학적 활성을 의미한다. 그 예로는 세포, 헤파란 설페이트와 같은 세포 수용체 및 수용체 유사체에 대한 상기 단백질의 결합, 즉 세포에 대한 비루스 결합 또는 세포로의 비루스 투과 또는 세포 융합을 포함할 수 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
"당단백질 B 유전자"는 전술한 바와 같은 당단백질 B 분자를 암호하는 서열을 포함하는 유전자를 의미한다. 당단백질 B 유전자는 비제한적으로 시그널 또는 선도 서열을 가지고 있거나 가지고 있지 않은 당단백질 B 형태, 절두 또는 내부 결실 형태, 다량체 형태 및 상이한 글리코실화 정도의 형태를 비롯하여 가공 및 변화된 해독 생성물을 생성할 수 있는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 "DNA 폴리머라제"는 적당한 조건하에서 주형으로서 사용된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열과 DNA 폴리뉴클레오티드의 어셈블리를 촉매할 수 있는 단백질 또는 단백질 유사체이다. 또한, DNA 폴리머라제는 다른 촉매 활성, 예컨대 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있으며; 활성들중 임의의 활성이 모두 우세할 수 있다. DNA 폴리머라제는 그 촉매 기능을 발휘하기 위하여 부가 단백질이나 보조인자와 결합될 필요가 있을 수 있다.
"RFHV"는 복막후 섬유종증(RF)에 걸린 머카크 내매스트리나 원숭이의 조직 샘플에서 검측된 헤르페스 과의 비루스이다. RFHV는 "RFHV1", "RFHVMn" 및 "RFMn"과 동의어이다. "KSHV"는 카포시 육종(KS)에 걸린 인체의 조직 샘플중에서 검출된 헤르페스 비루스 과의 비루스이다. RFHV/KSHV 아과의 제3군은 엠.뮬라타 원숭이에서 동정된 비루스이다. 이 비루스는 "RFHV2"로 나타내었다. "RFHV2"는 "RFHVMm" 및 "RFMm"과 동의어이다.
"RFHV/KSHV 아과"는 척추동물 종을 감염시킬 수 있는 헤르페스 비루스의 집합물을 나타내기 위해 본원에서 사용된 용어이다. 이 아과는 sHV1, eHV2, bHV4, mHV68 및 hEBV를 비롯한 기타 다른 헤르페스 비루스의 해당 서열보다도 RFHV 또는 KSHV의 해당 서열과 밀접한 관련성이 큰 당단백질 B 서열을 가진 구성원으로 이루어진다. 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 잔기 36 내지 354 사이에 존재하는, RFHV(서열 번호 1) 또는 KSHV(서열 번호 3)의 서열과 65% 이상이 동일한 분절; 올리고뉴클레오티드 SHMDA와 약 74% 이상이 동일한 분절; 또는 올리고뉴클레오티드 CFSSB와 약 73% 이상이 동일한 분절; 또는 올리고뉴클레오티드 ENTFA와 약 72% 이상이 동일한 분절; 또는 뉴클레오티드 DNIQB와 약 80% 이상이 동일한 분절을 포함하는 것이 바람직하다. RFHV 및 KSHV는 RFHV/KSHV아과의 예시적 구성원이다. RFHV/KSHV 아과는 감마 헤르페스 비루스 아과의 아군을 나타낸다.
"폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 상호교환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체이든지 간에 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 예는 다음과 같으며, 이것에 국한되는 것은 아니다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 분리된 DNA, 임의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같이 수사된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드가 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 수사는 중합체의 어셈블리 이전이나 이후에 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드 서열에는 비뉴클레오티드 성분이 개재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 표지 성분과의 결합등에 의해 추가 수사될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드란 용어는 이본쇄 및 일본쇄 분자를 의미한다. 별다른 표시가 없는 한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 모든 양태는 이본쇄 형태 및 이러한 이본쇄 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예상되는 2개의 상보적인 일본쇄 형태 각각을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
폴리뉴클레오티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열내에서 서로 이웃하는 잔기가 폴리뉴클레오티드의 일차 구조에서 인접해 있는 5' 에서 3' 방향으로의 폴리뉴클레오티드중의 뉴클레오티드의 순서이다. "부분 서열"은 한 방향이나 양 방향으로 추가 잔기를 포함하는 것으로 알려진 폴리뉴클레오티드 일부의 선형 서열이다.
"하이브리드화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기들 간에 수소 결합을 통해서 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 의미한다. 수소 결합은 와슨-크리크 염기쌍, 후그스틴 결합, 또는 다른 모든 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 이 복합체는 이본체 구조를 형성하는 2 가닥, 다본쇄 복합체를 형성하는 3 가닥 이상, 자가-하이브리드하는 일본쇄 또는 이들의 모든 복합체를 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 보다 총괄적인 방법에서, 예컨대 PCR의 개시나 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은 일 단계로 구성될 수 있다.
하이브리드화 반응은 여러 "스트린젠시" 조건하에서 수행할 수 있다. 하이브리드화 반응의 스트린젠시를 증가시키는 조건은 널리 알려져 있으며 당해 기술분야에 공지된 것이다: 예컨대 Sambrook Fritsch & Maniatis를 참조하라. 관련 조건들의 예(스트린젠시를 증가시키기 위함)는 다음과 같다: 항온처리 온도 25℃, 37℃, 50℃ 및 68℃; 완충액 농도 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC(여기에서 SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 구연산염 완충액임) 및 다른 완충액계를 이용한 등가농도; 포름아미드 농도 0%, 25%, 50% 및 75%; 항온 시간 5분 내지 24시간; 1회, 2회 또는 그 이상의 세척 단계; 1분, 5분 또는 15분의 세척 항온 처리 시간; 세척 용액 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC 또는 탈이온수.
"Tm"은 와슨-크리크 염기쌍에 의해 역평행 방향으로 수소결합된 상보 가닥으로 이루어진 폴리뉴클레오티드 이본체의 50%가 실험 조건하에서 일본쇄로 해리하는 온도(℃)이다. 이 Tm은 표준 수학식 1에 따라 예측할 수 있는데, 그 예는 다음과 같다:
T = 81.5 + 16.6 log[Na+] + 0.41(%G/C) - 0.61(%F) - 600/L
여기에서, [Na+]는 양이온 농도(보통 나트륨 이온), mol/L이고; (%G/C)는 이본체내의 총 잔기에 대한 G + C 잔기의 수를 %로 나타낸 것이며; (%F)는 용액중의 포름아미드(wt/vol) %이고; L은 이본체 각 가닥내의 뉴클레오티드의 수이다.
폴리뉴클레오티드의 "안정한 이본체" 또는 생화학 반응중 임의의 2가지 이상의 성분들간에 형성된 "안정한 복합체"는 이본체 또는 복합체의 형성과 이의 연속된 검측 단계 사이에도 지속되기에 충분한 장기-지속적인 이본체 또는 복합체를 의미한다. 이 이본체 또는 복합체는 형성 순간과 검측 순간 사이에 어떤 조건이 존재하거나 형성될지라도 지속될 수 있어야만 하고, 이러한 조건은 수행되는 분석이나 반응의 함수이다. 선택적으로 존재할 수 있고 이본체 또는 복합체를 해리시킬 수 있는 개재 조건으로는 세척, 가열, 반응 혼합물에 추가 용질이나 용매의 첨가(예컨대 변성제) 및 다른 반응 종과의 경합을 포함함다. 안정한 이본체 또는 복합체는 비가역적이거나 가역적일 수 있으나, 이러한 정의의 다른 필요 조건을 충족해야만 한다. 따라서, 순간 복합체는 반응 혼합물중에서 형성될 수 있으나, 자발적으로 해리하거나 검측하기 이전에 제공된 새로이 노출된 조건이나 조작의 결과로서 해리된다면 안정한 복합체를 구성하지 못한다.
안정한 이본체가 특히 높은 스트린젠시 조건하에서 2개의 일본쇄 폴리뉴클레오티드 사이에 역평행 배열로 형성된 경우에는, 이 가닥들은 본질적으로 "상보성"인 것이다. 이본쇄 폴리뉴클레오티드는, 이 제 1 폴리뉴클레오티드 가닥중 하나와 또다른 제 2 폴리뉴클레오티드의 가닥중 하나 사이에 안정한 이본체를 형성할 수 있다면, 다른 폴리뉴클레오티드에 상보성일 수 있다. 일본쇄 폴리뉴클레오티드 서열로부터 예상되는 상보 서열은 일반적으로 허용되는 염기쌍 규칙에 따라 일본쇄 폴리뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 것으로 예상되는 표준 뉴클레오티드들로 이루어진 최적 서열이다.
이와 관련하여 사용되는 "센스" 가닥 및 "안티센스" 가닥이란 용어는 서로 상보적인 일본쇄 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이것은 이본쇄 폴리뉴클레오티드의 대향 가닥이거나, 또는 제 1 가닥을 제 2 가닥으로부터 일반적으로 허용되는 염기쌍 규칙에 의거하여 추론할 수 있다. 별다른 표시가 없는 한, 제 1 가닥이나 제 2 가닥을 "센스" 또는 "안티센스"로 지정하는 것은 임의적인 것이다. 폴리뉴클레오티드의 폴리펩티드-암호 분절과 관련하여 "센스" 가닥은 일반적으로 암호 분절을 포함하는 가닥이다.
동일성의 정도에 대해 폴리뉴클레오티드들 간에 비교를 하는 경우에는, 상보성 가닥은 용이하게 만들어지며, 비교되는 폴리뉴클레오티드간의 동일성의 정도를 최대화하는 센스 또는 안티센스 가닥을 선택하거나 예상할 수 있다는 것은 분명한 것이다. 예를 들면, 비교되는 폴리뉴클레오티드들중 하나 또는 둘 모두가 이본쇄인 경우에는, 제 1 폴리뉴클레오티드의 한 가닥이 제 2 폴리뉴클레오티드의 한 가닥과 동일하다면 그 서열들은 동일한 것이다. 이와 유사하게, 폴리뉴클레오티드 프로브가 그 표적과 동일한 것으로 설명되었다면, 프로브와 표적 사이의 하이브리드 반응에 관여하는 것은 표적의 상보 가닥이다.
양 서열이 하이브리드하여 동일한 상보성 폴리뉴클레오티드와 이본체를 형성할 수 있다면, 한 뉴클레오티드의 선형 서열은 다른 선형 서열과 "본질적으로 동일"하다. 스트린젠시 조건이 보다 큰 조건하에서 하이브리드하는 서열이 보다 바람직하다. 하이브리드화 반응은 뉴클레오티드 서열에 삽입, 결실 및 치환을 가질 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드의 선형 서열은 뉴클레오티드 잔기의 일부가 정확하게 상응하거나 정렬하지 않을지라도 본질적으로 동일할 수 있다. 본 명세서에 개시된 발명에 보다 밀접하게 상응하거나 정렬하는 서열은 비교적 보다 바람직하다. 일반적으로 약 25개의 잔기를 가진 폴리뉴클레오티드 영역은 다른 영역과, 서열간의 동일성이 약 85% 이상인 경우; 보다 바람직하게는 동일성이 약 90% 이상인 경우; 보다 더 바람직하게는 동일성이 약 95% 이상인 경우; 가장 바람직하게는 서열이 100% 동일한 경우에는 본질적으로 동일한 것이다. 40개 이상의 잔기를 가진 폴리뉴클레오티드 영역은 다른 영역과, 상동성 부를 정렬한 후, 그 서열들이 약 75% 이상 동일한 경우; 보다 바람직하게는 약 80% 이상 동일한 경우; 보다 더 바람직하게는 약 85% 이상 동일한 경우; 보다 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상 동일한 경우; 가장 바람직하게는 서열이 100% 동일한 경우에는 본질적으로 동일한 것이다.
폴리뉴클레오티드 서열이 본질적으로 동일한지를 결정하는데 있어서, 특히 바람직한 것은 비교되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 보존하는 서열이다. 기능은 여러 매개변수로 측정될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하는 단계를 포함하는 반응에 사용되어야만 한다면, 바람직한 서열은 유사한 조건하에서 동일한 표적에 하이브리드하는 서열이다. 일반적으로, DNA 이본체의 Tm은 부정합 잔기들의 위치에 따라 서열 동일성이 1% 감소할 때마다 200개 또는 그 이상의 잔기를 가진 이본체의 경우 약 1℃씩; 또는 40개 미만의 잔기를 가진 이본체의 경우에는 약 5℃씩 감소한다(예컨대, Meinkoth et al. 참조). 약 100개의 잔기를 가진 본질적으로 동일한 서열은 일반적으로 Tm보다 약 20℃ 낮은 온도에서; 바람직하게는 약 15℃ 낮은 온도에서; 보다 바람직하게는 약 10℃ 낮은 온도에서; 보다 더 바람직하게는 약 5℃ 낮은 온도에서; 가장 바람직하게는 대략 Tm에서 서로 각각의 상보 서열과 안정한 이본체를 형성할 것이다. 또다른 예로서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호된 폴리펩티드가 그 기능에 중요한 역할을 한다면, 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호하는 서열이 바람직한 서열이다. 따라서, 보존적 아미노산 치환을 유발하는 뉴클레오티드 차이는 비보존적 치환을 유발하는 차이보다 바람직하고, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 뉴클레오티드 차이가 보다 바람직하며, 동일한 뉴클레오티드가 보다 더 바람직하다. 폴리펩티드에 삽입이나 결실을 일으키는 폴리뉴클레오티드의 삽입이나 결실은 다운스트림 암호 영역을 이상 상태로 나타나게 하는 삽입이나 결실보다 바람직하고; 삽입이나 결실이 전혀 없는 폴리뉴클레오티드 서열이 보다 더 바람직하다. 하이브리드화 성질의 상대적인 중요성과 폴리뉴클레오티드의 암호된 폴리펩티드 서열은 본 발명의 용도에 따라 다르다.
한 폴리뉴클레오티드와 또다른 폴리뉴클레오티드는 유사한 최대의 스트린젠시 조건하에서 특정한 제 3의 폴리뉴클레오티드와 안정한 이본체를 형성할 수 있다면 동일한 "특징"을 가진 것이다. 바람직하게는, 유사한 하이브리드화 성질외에도, 또한 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 "보존" 잔기는 비교되는 2개 이상의 관련 서열의 동일한 위치에서 변화되지 않은 상태로 유지되는 잔기이다. 비교적 보존되는 잔기는 서열중의 다른 위치에서 나타나는 잔기보다 동일성이 큰 잔기이거나 관련성이 큰 서열중에서 보존되는 잔기이다.
"관련" 폴리뉴클레오티드는 동일한 잔기를 상당한 비율로 공유하는 폴리뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 바와 같은, "축퇴성" 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같이 2개 이상의 관련 있는 발원성 폴리뉴클레오티드 서열에서 유래된 디자인된 서열이다: 발원성 서열내에서 보존되는 잔기는 축퇴성 서열에서도 보존되고, 발원성 서열에서 보존되지 않는 잔기는 축퇴성 서열에서도 여러 대안 잔기들로서 제공될 수 있다. 예컨대, 축퇴성 서열 AYASA는 발원성 서열 ATACA 및 ACAGA로부터 디자인될 수 있으며, 여기에서 Y는 C 또는 T이고 S는 C 또는 G이다. Y 및 S는 "불확실한" 잔기의 예이다. 축퇴성 분절은 축퇴성 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 분절이다.
축퇴성 서열을 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드는 사실상 불확실한 위치의 잔기를 제외하고는 동일한 서열을 공유하는 밀접한 관련성이 있는 올리고뉴클레오티드의 혼합물이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 불확실한 위치에 있는 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합체의 혼합물로서 합성된다. 혼합물에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 각각은 "대안 형태"라고 하기도 한다. 혼합물에 존재하는 형태의 수는 다음과 같은 수학식 2에 상당한다:
이 식중에서 ki는 각 위치에 존재가능한 대안 뉴클레오티드의 수이다.
본원에 사용된 바와 같은 "콘센서스" 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같이 2개 이상의 관련있는 발원성 폴리뉴클레오티드 서열에서 유도하여 디자인한 서열이다: 즉, 모든 발원성 서열중에서 보존되는 잔기들은 콘센서스 서열에도 보존시키고, 잔기가 보존되지 않는 위치의 잔기는 하나의 택일 잔기를 발원성 서열들중에서 선택한다. 일반적으로 선택되는 뉴클레오티드는 발원성 서열에서 최대의 빈도수로 발생하는 것이다. 예를 들면, 콘센서스 서열 AAAAA는 발원성 서열 CAAAA, AAGAA 및 AAAAT로부터 디자인할 수 있다. 콘센서스 분절은 콘센서스 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 분절이다.
본원에 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 "단편" 또는 "삽입체"는 일반적으로 총길이 형태의 준영역을 나타내나, 또한 전체 총길이의 폴리뉴클레오티드도 포함될 수 있다.
폴리뉴클레오티드들은 한 폴리뉴클레오티드가 궁극적으로 다른 폴리뉴클레오티드에서 유도되거나 또는 공통 조상에서 유래된다면 서로 "대응"하는 것이다. 예컨대, 여러 비루스들의 유전자에서 암호 영역은 이들이 상당한 동일성 정도를 갖고 있다면 그 서열이 대응하거나, 게놈의 동일한 위치에 지도작성되거나 또는 유사한 생화학적 기능을 수행하는 단백질을 암호한다. 전령 RNA는 이것이 전사되는 유전자에 대응한다. cDNA는 이로부터 생성되는 RNA에 대응하며, 이 RNA를 암호하는 유전자에 대응한다. 단백질은 이를 암호하는 폴리뉴클레오티드에 대응하고, 이 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 대응한다.
폴리뉴클레오티드 조작과 관련하여 사용된 "프로브"는 표적과 하이브리드하여 관심있는 샘플내에 존재할 가능성이 큰 표적을 검측하는 시약으로서 제공되는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 일반적으로, 프로브는 하이브리드화 반응 이전이나 이후에 표지가 부착될 수 있는 수단이나 표지를 함유할 것이다. 적당한 표지로는 방사능동위원소, 형광크롬, 화학발광성 화합물, 염료 및 효소를 비롯한 단백질을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
"프라이머"는 표적과 하이브리드하여 관심있는 샘플내에 존재할 가능성이 큰 표적에 결합하고, 그 다음 표적에 상보성인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진하는 일반적으로 자유 3'-OH 기를 가진 올리고뉴클레오티드이다.
PCR이나 유전자 클로닝과 같이 동일한 폴리뉴클레오티드의 복제 복사체를 생산하는 방법들은 본원에서 "증폭" 또는 "복제"라고 집합적으로 명명하기도 하였다. 예컨대, 일본쇄 DNA 또는 이본쇄 DNA는 복제하여 동일 서열을 가진 다른 DNA를 형성할 수 있다. RNA는, 예컨대 RNA-유도성 RNA 폴리머라제를 사용하거나, 또는 DNA를 역전사한 다음 PCR을 수행하여 복제할 수 있다. 후자의 경우에, RNA의 증폭 복사체는 동일 서열을 가진 DNA이다.
"폴리머라제 사슬 반응"(PCR)은 복제 복사체가 하나 이상의 프라이머 및 역전사 효소 또는 DNA 폴리머라제 및 특히 열안정한 폴리머라제 효소와 같은 중합 촉매를 사용하여 복제 복사체를 표적 폴리뉴클레오티드로 만드는 반응이다. 일반적으로, PCR은 반복적으로 이루어지는 3 단계를 포함한다: 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 증폭될 폴리뉴클레오티드와 이본체를 형성할 수 있도록 온도를 조정하는 "어닐링" 단계; 이본체를 형성한 올리고뉴클레오티드가 이들이 이본체를 형성했던 폴리뉴클레오티드를 주형으로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장할 수 있도록 온도를 조정하는 "신장" 단계; 및 신장된 올리고뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드가 해리되도록 온도를 조정하는 "융해" 단계이다. 그 다음 증폭된 폴리뉴클레오티드의 바람직한 양이 얻어질 때까지 상기 사이클을 반복한다. PCR 방법은 미국 특허 제4,683,195호(Mullis) 및 제4,683,202호(Mullis et al.)에 교시되어 있다.
"조절 인자" 또는 "조절 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제, 중복, 전사, 결찰, 해독, 또는 분해를 비롯하여 폴리뉴클레오티드의 작용적 조절에 기여하는 분자의 상호작용과 관련된 뉴클레오티드 서열이다. 이러한 조절은 진행 과정의 빈도수, 속도 또는 특이성에 영향을 미치며 본질적으로 억제성이거나 증강성일 수 있다. 조절 인자는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, "프로모터"는 조절 부재의 일 예이다. 프로모터는 특정 조건하에서 RNA 폴리머라제를 결합시켜, 그 프로모터로부터 다운스트림에 위치한(3' 방향) 암호 영역의 전사를 개시할 수 있는 DNA 영역이다. "작동적으로 결합된"은 유전자 인자들이 예상된 방식으로 작동할 수 있는 관계에 있는 유전 인자들의 병렬형을 의미한다. 예를 들면, 프로모터가 암호 서열의 전사 개시를 돕는다면 프로모터는 암호 영역에 작동적으로 결합된 것이다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 암호 영역 사이에는 개재 잔기가 있을 수 있다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 임의 길이를 가진 아미노산의 중합체를 의미하는 것으로 상호교환적으로 본원에 사용되고 있다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 또한 수사된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산이 개재할 수도 있다. 또한, 이 용어들은 예컨대, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지 성분의 결합에 의하여 자연적으로 수사되거나 개재된 아미노산 중합체를 포함한다.
폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열"이나 "서열"은 서열내에서 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩티드의 일차 구조내에서 인접해있는 N-말단에서 C-말단 방향으로의 폴리펩티드중의 아미노산 순서이다. "부분 서열"은 한 방향이나 양 방향으로 부가 잔기를 포함하는 것으로 알려진 폴리펩티드의 일부 선형 서열이다.
아미노산의 선형 서열은 두 서열이 실질적인 정도의 서열 동일성을 갖고 있다면 다른 서열과 "본질적으로 동일"하다. 단백질의 폴딩 및 생화학적 기능은 아미노산 서열의 삽입, 결실 및 치환을 허용할 수 있다. 따라서, 아미노산 선형 서열은 일부 잔기가 정확하게 대응하거나 정렬하지 않을지라도 본질적으로 동일할 수 있다. 본원에 개시된 본 발명과 보다 밀접하게 정렬하거나 대응하는 서열이 보다 바람직하다. 또한, 일부 아미노산 치환은 허용되기가 보다 쉽다. 예컨대, 소수성 측쇄, 방향족 측쇄, 극성 측쇄, 양성이나 음성 전하를 가진 측쇄, 또는 2개 또는 그 이하의 탄소 원자를 함유하는 측쇄를 가진 아미노산을, 유사한 성질의 측쇄를 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것은 두 서열의 본질적 동일성을 혼란시킴이 없이 일어날 수 있다. 상동성 영역을 측정하고 상동성 정도를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다; 예컨대 Altschul et al. 및 Henikoff et al.을 참조하라. 허용성이 큰 서열 차이는 "보존적 치환"이라고 한다. 따라서, 보존적 치환을 가진 서열이 동일한 위치내의 다른 치환을 가진 서열에 비해 바람직하며; 동일한 위치에 동일한 잔기를 가진 서열이 보다 더 바람직하다. 일반적으로 폴리펩티드 영역과 다른 영역은 그 상동성 부를 정렬시킨 후, 그 서열의 동일성이 약 92% 이상인 경우; 바람직하게는 서열 동일성이 약 95% 이상인 경우; 보다 바람직하게는 서열 동일성이 약 95% 이상이고, 동일하거나 보존적 치환이 이루어진 서열이 추가 2% 이상이라면; 보다 바람직하게는 서열 동일성이 약 97% 이상인 경우; 보다 더 바람직하게는 서열 동일성이 약 97% 이상이고, 동일하거나 보존적 치환이 이루어진 서열이 추가 2% 이상인 경우; 보다 더욱 더 바람직하게는 서열 동일성이 약 99% 이상인 경우; 가장 바람직하게는 서열 동일성이 100%인 경우에, 본질적으로 동일한 것이다.
폴리펩티드 서열이 본질적으로 동일한지를 측정하는데 있어서, 비교되는 폴리펩티드의 기능을 보존하는 서열이 특히 바람직하다. 기능은 여러 매개변수, 예컨대 효소 활성, 기질-효소나 수용체-리간드 상호작용시의 결합 속도 또는 친화성, 항체와의 결합 친화성 및 X선 결정 구조를 통해 설정될 수 있다.
폴리펩티드는 효소 활성, 리간드 결합 또는 항체 반응성과 같이 동일한 생화학적 작용을 나타낸다면 제2의 폴리펩티드와 동일한 "특징"을 가진다. 당단백질 B 또는 당단백질 B 단편과 관련된 폴리펩티드의 바람직한 특징은 다른 헤르페스 종의 당단백질 B에 의해 결합된 세포 표면 수용체의 유사체에 결합하는 성질, 표적 세포와의 막 융합을 촉진하는 성질, 숙주 세포의 비루스 투과를 촉진하는 성질이다. 또한, 비교되는 폴리펩티드와 동일한 생화학적 작용을 나타내는 폴리펩티드가 바람직한데, 이들은 X선 결정학과 같은 기법에 의한 측정이나 컴퓨터 모델링으로 예상되는 바와 같이 유사한 입체 구조를 가질 것으로 예상된다.
폴리펩티드의 "생화학적 작용", "생물학적 작용" 또는 "생물학적 활성"은 적절한 실험 연구로 측정할 수 있는 폴리펩티드의 모든 특징을 포함한다. "변화된" 생화학적 작용은 폴리펩티드의 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조의 변화를 의미할 수 있으며; 예컨대 분자량 측정, 환형 이색성, 항체 결합, 차동 분광학 또는 핵자기 공명으로 검측할 수 있다. 또한, "변화된" 생화학적 작용은 반응성의 변화, 예컨대 특정 반응을 촉매하는 작용이나, 보조인자, 기질, 억제제, 약물, 헵텐 또는 다른 폴리펩티드에 대한 결합성의 변화를 의미할 수 있다. 한 물질이 임의의 방식으로 폴리펩티드의 생화학적 작용을 변화시킨다면 그 물질은 폴리펩티드의 생화학적 작용을 "방해"하는 것이라고 말할 수 있다.
"융합 폴리펩티드"는 천연적으로 발생하는 것과 달리 서열내의 다른 위치에 영역들을 함유하는 폴리펩티드이다. 이 영역들은 일반적으로 분리된 단백질에 존재할 수 있으며 함께 결합하여 융합 폴리펩티드를 만들거나; 또는 일반적으로 동일 단백질에 존재할 수 있으나 융합 폴리펩티드중에서 새로운 배열로 배치되기도 한다. 융합 폴리펩티드는 예컨대 화학적 합성법이나 펩티드 영역들이 바람직한 관계로 암호되어 있는 폴리뉴클레오티드를 만들고 이를 해독하여 얻을 수 있다.
"항체"(복수 형태로 상호교환적으로 사용됨)는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 폴리펩티드와 같은 표적에 특이적인 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된 이 용어에는 본래의 항체 뿐만 아니라 그 단편, 그 돌연변이체, 융합 단백질, 인체화된 항체 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 수사 형태도 포함된다.
"면역학적 인식" 또는 "면역학적 반응성"은 면역글로불린이나 관련 분자, 예컨대 B 세포 수용체 또는 T 세포 수용체내에 존재하는 하나 이상의 항원 인식 부위를 통한 표적의 특이적인 결합을 의미한다.
"항원"이란 용어는 항원 인식 부위를 통해 항체에 특이적으로 결합된 표적 분자를 의미한다. 항원은 항체 생산을 자극하는 면역원과 화학적 관련이 있을 수 있으나, 반드시 화학적 관련이 있을 필요는 없다. 항원은 다가일 수 있거나, 또는 일가 헵탄일 수 있다. 항체에 의해 인식될 수 있는 항원 종류로는 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다른 항체 분자, 올리고사카라이드, 복합 지질, 약물 및 화합물을 포함한다.
"면역원"은 포유류와 같이 적당한 숙주에 주입했을 때 항체 생산을 자극할 수 있는 화합물이다. 이러한 성질을 가진 화합물은 "면역원성"이라고 한다. 화합물은 원자가를 증가시키는 담체와의 가교 또는 결합, 면역 반응을 증가시키는 유사분열물질과의 혼합 및 발현을 증가시키는 보조제와의 결합을 비롯하여 당해 기술 분야에 공지된 많은 기법에 의하여 면역원성이 될 수 있다.
"백신"은 특정 표적이나 표적 군에 대하여 특이적인 면역학적 반응성의 정도를 수용체에게 부여하기 위한 의도로 투여되는 인간이나 동물용 약제이다. 면역학적 반응성은 표적에 대하여 면역학적으로 반응성인 항체 또는 세포(특히 B 세포, 혈장 세포, T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 림프구 및 이들의 전구체)나 이의 임의의 복합체일 수 있다. 가능한 표적으로는 외인성 단백질, 병원성 비루스 또는 암세포에 의해 발현되는 항원과 같은 이종 또는 병리학적 화합물을 포함한다. 면역학적 반응성은 실험용, 특정 질환의 치료용, 특정 물질의 제거용 또는 특정 질환이나 물질에 대한 예방용으로 바람직할 수 있다. 본원에 사용된 백신은 다른 표시가 없는 한 수동 백신 또는 활성 백신이거나, 이 두 성질을 모두 가질 수 있다.
"수동 백신"은 그 효과를 발휘하기 위하여 수용체의 면역 반응의 관여를 필요로 하지 않는 백신이다. 일반적으로, 이것은 표적에 대하여 반응성인 항체 분자를 포함한다. 항체는 공여 검체로부터 얻어서, 수용체에 투여할 수 있도록 충분히 정제하거나, 또는 예컨대 하이브리도마 세포 배양물로부터 시험관내에서 제조하거나 또는 항체 분자를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 유전자 조작하여 제조할 수 있다.
"활성 백신"은 수용체내의 특정 면역 반응을 유도하기 위하여 투여되며, 즉 표적에 대하여 바람직한 면역학적 반응성을 가진 백신이다. 활성 백신은 적합한 면역원을 포함한다. 바람직한 면역 반응은 체액성이거나 세포성, 조직성이거나 분비성, 또는 이의 임의의 복합성일 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체 "시약"은 반응에 제공된 물질, 즉 반응의 일부 공지되고 바람직한 매개변수를 가진 물질이다.
또한, 반응 혼합물은 시약이 반응할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 폴리펩티드와 같은 "표적"을 함유할 수 있다. 예컨대, 일부 진단 시험 형태에 있어서, 샘플내 존재하는 표적의 양은 시약을 첨가하고, 이 시약과 표적을 반응시킨 뒤, 반응 생성물의 양을 측정하여 결정한다. 또한, 임상 처리와 관련하여 "표적"은 투여된 물질, 예컨대 약학적 화합물의 대상인 세포, 세포 집합물, 조직 또는 기관일 수 있다. 비루스 감염에 표적인 세포는 비루스가 잠복 형태로 복제 또는 형질 전환 하기에 바람직하게 국재화하고 있는 세포이다.
"분리된" 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 다른 물질은 이 물질이나 유사 물질이 천연적으로 발생한 것이거나 처음 얻어진 경우 존재할 수 있는 다른 성분들이 적어도 약간이라도 없는 물질 제조물을 의미한다. 따라서, 예컨대 분리된 물질은 공급 원료 혼합물로부터 그 물질을 농축시킬 수 있는 정제 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 농축은 절대 기준, 예컨대 용액 부피당 중량으로 측정하거나, 또는 공급 원료 혼합물중에 존재하는 제2의 방해 물질과 비교하여 측정할 수 있다. 본 발명의 양태들의 증가 농축이 점차 더 바람직하다. 따라서, 예컨대 2배 농축이 바람직하고, 10배 농축은 더 바람직하며, 100배 농축은 더욱 더 바람직하고, 1000배 농축은 보다 더욱 더 바람직하다. 또한, 물질은 인위적인 어셈블리법, 예컨대 화학적 합성법이나 재조합 발현에 의해 분리된 상태로 제공할 수 있다.
반응에 사용된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 하이브리드화 반응에 사용된 프로브, PCR에 사용된 프라이머, 또는 약제에 존재하는 폴리뉴클레오티드는 이들이 목적 표적과, 다른 물질보다도 더 보다 빈번하게, 보다 빠르게 또는 보다 오랫동안 하이브리드하거나 반응한다면 "특이적" 또는 "선택적"이라고 한다. 이와 유사하게, 폴리펩티드는 이것이 목적 표적, 예컨대 리간드, 헵텐, 기질, 항체 또는 다른 폴리펩티드에, 다른 물질보다도 더 보다 빈번하게, 보다 빠르게 또는 보다 오랫동안 결합한다면 "특이적" 또는 "선택적"이라고 한다. 항체는 이것이 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 목적 표적에 다른 물질보다도 더 보다 빈번하게, 보다 빠르게 또는 보다 오랫동안 결합한다면 "특이적" 또는 "선택적"이라고 한다. 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체는 이것이 다른 물질 사이의 반응에 대한 것보다 특정 기질들 사이의 반응을 보다 큰 정도로 또는 보다 오랫동안 억제하거나 방해한다면 반응을 "선택적으로 억제" 또는 "선택적으로 방해"한다고 한다.
"약학적 시험물질" 또는 "약물 시험물질"은 효능에 대해 시험되어야만 하는 치료적 가능성을 가진 것으로 추정되는 화합물이다. 약학적 시험물질의 "선별"은 시험물질의 효능 및/또는 특이성을 평가할 수 있는 분석을 수행하는 것을 의미한다. 이와 관련하여, "효능"은 바람직한 방식으로 투여된 세포 또는 기관에 영향을 미치는 시험물질의 작용, 예컨대 침습성 비루스에 의한 병상을 제한하는 것을 의미한다.
약제의 "작동인자 성분"은 표적 세포를 가진 검체에 투여했을 때 바람직한 방식으로 그 세포의 작용을 변화시켜 표적 세포를 수사하는 성분이다. 또한, 일부 개선된 약제는 작동인자 성분을 보다 효능적으로 표적 부위로 전달하는 것을 돕는 항체와 같은 "표적화 성분"을 가지고 있다. 필요한 작용방식에 따라, 작동인자 성분은 많은 작용 방식중 하나의 방식을 가질 수 있다. 예컨대, 세포의 정상 기능을 복원하거나 향상시키거나, 세포의 비정상적 기능을 제거하거나 억제시키거나 또는 세포의 표현형을 변화시킬 수 있다. 대안적으로, 병리 특징을 가진 세포, 예컨대 비루스 감염 세포를 사멸시키거나 비활성 상태로 만들 수 있다. 작동인자 성분의 예는 하기에 기재한다.
"세포 주" 또는 "세포 배양물"은 시험관내에서 증식되거나 유지되는 고등 진핵 세포를 나타낸다. 이 세포의 계대주들은 모세포와 완전히 동일(형태적, 유전자형적 또는 표현형적으로 동일)할 수는 없다.
"숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 투여시 형질전환되었거나 형질전환될 수 있는 세포이다. "숙주 세포"에는 발원성 형질전환체의 계대주도 포함한다.
"유전자 변화"는 유전 인자가 천연 세포 분열 이외의 다른 방식으로 세포로 도입되는 과정을 의미한다. 이 인자는 세포에 대해 이종성이거나, 또는 세포에 이미 존재하는 인자의 부가 복사체이거나 개선된 변형체일 수 있다. 유전자 변화는 예컨대 세포를 재조합 플라스미드 또는 다른 폴리뉴클레오티드로 당해 기술 분야의 공지 방법, 예컨대 전기침투, 인산 칼슘 침전법으로 형질감염시키고, 폴리뉴클레오티드-리포좀 복합체와 접촉시키거나, 또는 DNA 또는 RNA 비루스 또는 비루스 벡터를 형질도입시키거나 감염시켜 실시할 수 있다. 이러한 변화는 이와 같이 변화된 세포의 계대주에도 유전되는 것이 바람직하나, 반드시 유전될 필요는 없다.
"개체"란 척추동물, 특히 포유류 종의 구성원을 의미하고, 가축, 돌연변이 동물 및 인간을 비롯한 영장류를 포함하나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "영장류"란 용어는 포유류 종중 최고의 목에 속하는 모든 구성원을 의미한다. 그 예로는 여우원숭이 및 늘보원숭이와 같은 원원류; 안경원숭이와 같은 타르시오이드(tarsioid); 다람쥐 원숭이(사이미리 쉬우레우스) 및 비단원숭이 일종과 같은 서반구 원숭이; 머카크(마카카 내매스트리나, 마카카 페시큘라리스 및 마카카 푸스카타 포함)와 같은 동반구 원숭이; 기번 및 시아망과 같은 하일로바티드(hylobatid); 오랑우탄, 고릴라 및 침판지와 같은 유인원; 및 인간을 포함하는 호미니드를 포함하나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
헤르페스 비루스 감염에 의해 유발되는 "병상"은 숙주의 안녕이나 정상적인 생리를 손상시키는 모든 것이다. 그 예로는 이전에 감염된 적이 없는 세포로의 비루스의 파괴적 침투, 세포의 정상적인 대사 대신에 비루스의 복제, 비루스에 의한 독소나 다른 비천연 분자의 생성, 세포나 세포내 구조(섬유증 포함)의 불규칙적인 성장, 감염 세포의 불규칙적이거나 억제된 생물학적 활성, 악성 형질전환, 이웃 세포의 정상 작용의 방해, 염증 반응이나 면역학적 반응의 악화 또는 억제, 및 다른 병원성 개체 및 질환에 대한 증가된 이환성을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
개체 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 천연 과정을 변화시키기 위한 시도로서 모든 종류의 개입이다. 예컨대, 개체의 치료는 개체를 감염시키는 헤르페스 비루스에 의해 유발되는 병상을 감소시키거나 제한하기 위하여 수행되는 것이다. 치료로는 조성물, 예컨대 약학 조성물의 투여를 포함하나, 이것에 국한되는 것은 아니며, 예방적으로 수행되거나 또는 병상 상태 개시나 병인 인자와의 접촉에 이어 치료적으로 수행될 수 있다.
임상 또는 생체 "샘플"은 진단 시험과 같이 시험관내 절차에 유용하고 검체에서 얻은 각종 종류의 샘플을 포함한다. 이러한 정의에는 외과적 분리로 얻어진 순수 조직 샘플, 병상 표본, 또는 생검 표본, 이로부터 유래되는 조직 배양물이나 세포 및 이의 계대주, 및 이러한 공급원에서 제조된 절편이나 도말표본을 포함한다. 이것의 예로는 감염 부위, 섬유증 부위, 비감염 부위 및 종양에서 얻은 샘플을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또한, 이 정의에는 생물 기원의 혈액, 척수액 및 다른 체액 샘플을 포함하며, 여기에 현탁된 세포 또는 세포 단편이나, 액성 매질 및 그 용질을 의미할 수도 있다. 또한, 이 정의에는 특정 성분, 예컨대 DNA, RNA, 단백질 또는 항체가 용해되어 있거나 농축되어 있는 샘플도 포함한다.
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 다음과 같이 명명하였다: 명칭의 처음 부분은 기초가 된 폴리펩티드가 가진 보존 영역의 일부에 대한 단일 아미노산 코드로서, 일반적으로 4 잔기 길이이다. 그 다음에는 문자 A 또는 B가 오며, 이것은 각각 올리고뉴클레오티드가 암호 영역의 센스 또는 안티센스 가닥에 상보적임을 나타낸다. 서열결정에 사용된 제2의 콘센서스 올리고뉴클레오티드는 명칭 말단에 문자 SQ를 가지고 있다.
일반적 기법
본 발명은 별다른 기재가 없는 한, 당해 기술 분야에 속하는 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 그 예로는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition(Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989), "Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed., 1984), "Animal Cell Culture"(R.I.Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" 전집(Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology"(D.M.Weir & C.C. Blackwell, eds.), "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(J.M. Miller & M.P.Calos, eds., 1987), "Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel et al., eds., 1987); 및 "Current Protocols in Immunology"(J.E.Coligan et al., eds., 1991)을 포함한다.
본원에 기재된 모든 특허, 특허 출원, 문헌 및 간행물은 본원에 참고문헌으로 포함되는 것이다.
헤르페스 비루스 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 당단백질 B 폴리펩티드의 단편을 암호하는 헤르페스 비루스중에 존재하는 당단백질 B 유전자에서 유래된 분리된 폴리뉴클레오티드 단편을 제공한다. 제공된 폴리뉴클레오티드는 헤르페스 비루스의 RFHV/KSHV 아과에서 유래된 것이다. 예시적인 폴리뉴클레오티드는 RFHV 또는 KSHV 유래의 당단백질 B 단편을 암호하는 것이다. 바람직한 단편으로는 하기 실시예에 기술된 바와 같이 얻어지는 도 1에 도시된 단편 및 이의 준단편을 포함한다. 특히 바람직한 것은 서열번호 1, 3 또는 96중 잔기 36 내지 354 사이에 위치한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 92에 포함된 폴리뉴클레오티드이다.
잔기 36 내지 354 사이에 있는 RFHV 및 KSHV의 폴리뉴클레오티드 분절들은 76% 동일하다. 도 1에서 공유된 잔기는 "*"로 표시하였다. 이 분절내에 존재하는 RFHV와 KSHV 간에 동일하게 공유된 최장의 준영역은 그 길이가 15, 17 및 20개의 뉴클레오티드이다.
증폭 프라이머 결합 부위 사이에 있는 RFHV와 KSHV의 319개 염기 쌍 단편들은 이들중 어느 하나가 종래 서열결정된 헤르페스 비루스중 어느 하나의 대응 단편에 대한 동일성보다도 상기 단편들 서로에 대한 동일성이 보다 크다. 그 다음으로 가장 밀접한 관련성이 있는 서열은 KSHV의 대응 서열에 대해 63% 동일하고 RFHV의 대응 서열에 대해 60% 동일한 sHV1 및 bHV4이다. 상기 당단백질 B 단편과 종래 서열 결정된 비루스의 임의의 서열 사이에 공유된 최장의 연속 염기 수는 14이다. 따라서, 16개 염기쌍 이상의 RFHV 또는 KSHV 서열의 임의의 준단편은 RFHV/KSHV 아과, 또는 이 아과에 속하는 특정 헤르페스 비루스 종과 변이체에 고유한 것이라고 생각된다.
본 발명은 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B 유전자에 포함된, 바람직하게는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 96중 잔기 36 내지 354 사이에 있거나, 서열 번호 92중에 있는 319 염기 쌍 단편에 대응하는 영역에 함유된 준단편을 제공한다. 바람직하게는, 이 준단편은 길이가 약 16개 이상인 뉴클레오티드; 보다 바람직하게는 길이가 18개 이상인 뉴클레오티드; 이 보다 더 바람직하게는 길이가 21개 이상인 뉴클레오티드; 이 보다 더 바람직하게는 길이가 약 25개 이상인 뉴클레오티드; 이보다 더 바람직하게는 길이가 약 35개 이상인 뉴클레오티드; 이보다 더 바람직하게는 길이가 약 50개 이상인 뉴클레오티드; 이보다 더 바람직하게는 길이가 약 75개 이상인 뉴클레오티드 및 이보다 더 바람직하게는 길이가 100개 이상인 뉴클레오티드이다. 또한, 본 발명은 각각의 헤르페스 비루스 당단백질 B의 전체 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
RFHV/KSHV 아과는 RFHV 또는 KSHV가 표 1에 기재된 어떤 다른 비루스에 대한 동일성 보다 RFHV 또는 KSHV의 대응 서열과 보다 밀접한 동일성이 있는 서열을 가진 구성원으로 이루어진다. 이 과의 바람직한 구성원은 도 1의 서열에 대응하는 영역내에 존재하는 당단백질 B 유전자의 서열을 기초로 하여 확인할 수 있다. 표 2는 이 영역내의 서열 동일성의 정도를 제공한다.
KSHV 및 다른 헤르페스 비루스의 당단백질 B간의 서열 동일성
당단백질 B 서열 서열 번호 폴리뉴클레오티드 단편에 대한 동일성
RFHV(서열번호 1) 염기 36 내지 354 KSHV(서열 번호 3) 염기 36 내지 354
RFHV/KSHV 아과 RFHV 1 (100%) 76%
KSHV 3 76% (100%)
다른 감마 헤르페스 비루스 sHV1 5 60% 63%
bHV4 6 60% 63%
eHV2 7 52% 54%
mHV68 8 56% 54%
hEBV 9 <50% 52%
알파 및 베타 헤르페스 비루스 hCMV 10 <50% <50%
hHV6 11 <50% <50%
hVZV 12 <50% <50%
HSV1 13 <50% <50%
서열 동일성의 %는 먼저 암호된 아미노산 서열을 정렬하고, 이 암호 폴리뉴클레오티드의 대응 정렬을 측정한 다음, 각 정렬된 위치에 존재하는 비교되는 서열 사이에 공유된 잔기들의 수를 계수하여 계산하였다. 삽입이나 결실의 존재에 대해서는 어떤 패널티도 부과하지 않았으나, 정렬된 서열들중 하나의 서열에서 분명히 증가된 수의 아미노산 잔기를 가질 필요가 있다면 삽입이나 결실이 허용된다. 단지 서열 정렬을 개선하기 위한 보충 삽입은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 준위에서는 허용되지 않는다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 서열내의 모든 삽입체는 3의 배수인 길이를 가질 것이다. 퍼센트(%)는 비교 또는 대조 서열내의 잔기와 동일한 시험 서열중의 잔기로서 제공된다.
본 발명의 바람직한 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드 서열은 RFHV/KSHV 헤르페스 비루스 아과에서 유래된 것이다. 이 서열은 염기 36 내지 354 사이의 RFHV 또는 KSHV 서열과 65% 이상 동일한 서열; 바람직하게는 67% 이상 동일한 서열; 보다 바람직하게는 약 70% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 약 75% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 약 80% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 약 85% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 약 90% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 95% 이상 동일한 서열을 포함한다. 또한, 상기 서열에는 제시된 동일성 기준을 충족시키는 영역의 업스트림이나 다운스트림에 당단백질 B 암호 영역도 포함한다.
다른 바람직한 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 단락에서 보다 상세히 설명되는 RFHV-KSHV 아과-특이적인 올리고뉴클레오티드(타입 2 올리고뉴클레오티드)와의 동일성%로 확인할 수 있다. 예로 제시된 타입 2 올리고뉴클레오티드와 RFHV 및 KSHV 당단백질 B의 동일성 %는 표 3에 기재하였다.
선택된 헤르페스 비루스의 당단백질 B와 RFHV/KSHV 아과 특이적인 올리고뉴클레오티드간의 서열 동일성
당단백질 B 서열 서열 번호 SHMDA(서열 번호 41)에 대한 동일성 CFSSB(서열 번호 43)에 대한 동일성 ENTFA(서열 번호 45)에 대한 동일성 DNIQB(서열 번호 46)에 대한 동일성
RFHV 1 91% 91% 89% 91%
KSHV 3 100% 85% 89% 97%
sHV1 5 71% 70% 66% 66%
bHV4 6 57% 64% 69% 74%
eHV2 7 57% 61% 54% 60%
mHV68 8 <50% 55% 54% 77%
hEBV 9 57% 55% 60% 51%
hCMV 10 57% 55% 60% 51%
hHV6 11 <50% 52% 60% 57%
hVZV 12 54% 58% 66% 57%
HSV1 13 57% 60% 54% 54%
동일성 %는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 정렬시키기 위한 목적으로 그 중에 갭을 허용치 않고 상기 길이의 올리고뉴클레오티드에 대하여 계산하였다. 본원을 통해, 비교되는 두 서열중 적어도 하나의 서열이 불확실한 잔기를 함유하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드인 경우에는 두 서열이 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 대안적 형태들중 하나 이상이 비교되는 서열과 동일하다면 동일한 것이다. 예컨대, AYAAA는 ATAAA와 ACAAA의 혼합물이므로 AYAAA는 ATAAA와 100% 동일하다.
바람직한 당단백질 B 암호 서열은 대응 영역에 있어서 SHMDA와 약 72% 이상 동일한 서열; 보다 바람직하게는 약 74% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 77% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 80% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 85% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 약 91% 이상 동일한 서열이다. 다른 바람직한 당단백질 B 암호 서열은 대응 영역에 있어서, CFSSB와 약 71% 이상 동일한 서열; 보다 바람직하게는 약 73% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 77% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 80% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 85% 이상 동일한 서열이다. 또다른 바람직한 당단백질 B 암호 서열은 대응 영역에 있어서 ENTFA와 70% 이상 동일한 서열; 보다 바람직하게는 72% 이상 동일한 서열; 이 보다 바람직하게는 약 75% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 80% 이상 동일한 서열; 이 보다 바람직하게는 약 85% 이상 동일한 서열; 이 보다 더 바람직하게는 약 89% 이상 동일한 서열이다. 다른 바람직한 당단백질 B 암호 서열은 대응 영역에 있어서 DNIQB와 약 78% 이상 동일한 서열; 보다 바람직하게는 80% 이상 동일한 서열; 이보다 바람직하게는 약 85% 이상 동일한 서열; 이보다 더 바람직하게는 약 91% 이상 동일한 서열이다. 또한, 상기 동일성 기준을 충족시키는 영역의 업스트림 또는 다운스트림에 당단백질 B 암호 영역도 포함한다.
RFHV 또는 KSHV 서열중 어느 하나의 서열이나 아과-특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용한 전술한 서열 비교들에 의해 확인된 RFHV/KSHV 아과의 구성원으로 부터 유래된 당단백질 B 암호 서열은 동등하게 바람직하다. 그 서열의 예는 RFHV 및 KSHV의 당단백질 B 암호 서열이다. 또한, 본 발명은 상기 아과의 당단백질 B 암호 서열의 단편 및 이러한 폴리뉴클레오티드 단편을 함유하는 보다 긴 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 단락에서 기술된 폴리뉴클레오티드 서열은 이하 단락에서 개략되는 합성 올리고뉴클레오티드, 단백질 및 항체를 얻기 위한 기본 사항을 제공한 것이다. 이 화합물들은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 표준 기법으로 제조할 수 있으며, 이하 기술되는 바와 같이 많은 연구용, 진단용 및 치료용으로 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 제법
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 실시예 3 및 실시예 11에서와 같이 헤르페스 비루스 감염된 조직에서 얻은 DNA의 PCR 증폭에 사용할 수 있다. 또는, 올리고뉴클레오티드는 이하 실시예 8에 기재된 바와 같이 DNA 라이브러리의 적합한 박테리아 클론을 동정하는데 사용할 수 있다.
또한, 폴리뉴클레오티드는 화학 합성법으로 본원에 제공된 서열로부터 직접 제조할 수 있다. 트리에스테르법 및 아인산염법을 비롯하여 여러 합성법들이 당해 기술분야에 알려져 있다. 바람직한 방법에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 모노뉴클레오시드 포스포아미디트 커플링 단위를 사용하는 고상 합성법으로 제조한다. 예컨대, 문헌 Horise et al., Beaucage et al., Kumar et al., 및 미국 특허 제4,415,732호를 참조하라.
일반적인 고상 합성법은 반복적인 4단계를 포함한다: 보호기제거 단계, 커플링단계, 캡핑 단계 및 산화 단계. 이에 따라 올리고뉴클레오티드는 3' 에서 5' 방향으로 단계적으로 합성된다.
제 1 단계에서, 고상 지지체에 (-O-)기를 통해 3'-말단에 결합된 성장하는 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 보호기제거된다. 예컨대, 5' 말단은 피리딘중에서 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(DMT-Cl)와 반응시켜 형성된 -ODMT 기에 의해 보호될 수 있다. 이 기는 염기성 조건하에서 안정하나, 산성 조건, 예컨대 디클로로아세트산(DCA) 또는 트리클로로아세트산(TCA)의 존재하에서 쉽게 제거된다. 보호기제거는 5'-OH 반응성기를 제공한다.
제 2 단계에서, 올리고뉴클레오티드는, 먼저 5'-보호된 3'-포스포아미디트로 자체 전환시킨 바람직한 뉴클레오티드 단량체와 반응시킨다. 이 단량체의 5'-OH는 예컨대 -ODMT기의 형태로 보호될 수 있고, 3'-OH기는 -OP(OR')NR2와 같이 포스포아미디트로 전환될 수 있으며, 여기에서 R은 이소프로필 기 -CH(CH3)2이고; R'는 예컨대 -H(포스포아미디트 디에스테르를 산출함), 또는 -CH3, -CH2CH3, 또는 베타-시아노에틸기 -CH2CH2CN(포스포아미디트 트리에스테르를 산출함)이다. 이 단량체의 3'-포스포아미디트기는 성장하는 올리고뉴클레오티드의 5'-OH기와 반응하여 아인산염 결합 5'-OP(OR')O-3'을 산출한다.
제 3 단계에서, 단량체와 커플링되지 않은 올리고뉴클레오티드는 불완전한 중합체의 형성을 방지하기 위하여 추가 합성에서는 제거된다. 이것은 예컨대 아세테이트(-OC(O)CH3) 형태인 나머지 5'-OH 기를 아세트산 무수물(CH3C(O)-O-C(O)CH3)과 반응시켜 캡핑하므로써 이룰 수 있다.
제 4 단계에서, 새로 형성된 아인산염 기(즉, 5'-OP(OR')O-3')는 예컨대 수성 요오드와 피리딘과의 반응에 의해 인산염기(즉, 5'-OP(=O)(OR')O-3')로 산화된다.
이 4 단계 방법은 그 다음 반복할 수 있는데, 그 이유는 이 방법의 마지막에 얻어지는 올리고뉴클레오티드가 5'-보호되어 있어 제 1 단계에 사용가능하기 때문이다. 바람직한 총길이 올리고뉴클레오티드가 얻어지면, 이것을 예컨대 알칼리와 열로 처리하여 고상 지지체로부터 절단할 수 있다. 또한, 이 단계는 포스페이트 트리에스테르(즉, R'가 -H가 아님)를 포스페이트 디에스테르(-OP(=O)2O-)로 전환시키고 뉴클레오티드 염기의 염기-불안정하게 보호된 아미노기의 보호기를 제거하는 작용을 한다.
이러한 방법들중 어느 하나의 방법으로 제조된 폴리뉴클레오티드는 임의의 표준 기법, 즉 PCR 증폭 또는 유전자 클로닝에 의해 복제하여 보다 다량으로 공급될 수 있다.
당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클로닝 및 발현 벡터
본 발명은 헤르페스 비루스 당단백질 B 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호하는 서열을 함유하는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 제공한다. 적합한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라 작제되거나, 또는 당해 기술분야에서 입수용이한 많은 클로닝 벡터로부터 선택할 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용되는 숙주 세포에 따라 다를 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터란 일반적으로 자가 복제성을 갖고, 특정 제한 효소에 대하여 하나의 표적을 소유하며, 형질감염된 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커 유전자를 가진 것이다. 적합한 예로는 플라스미드 및 박테리아 비루스를 포함하며, 예컨대 pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA 및 pSA3 및 pAT28과 같은 셔틀 벡터를 포함한다.
발현 벡터는 일반적으로 적합한 전사 및 해독 조절 부재에 작동적으로 결합된 폴리펩티드를 암호하는 복제성 폴리뉴클레오티드 작제물이다. 전사 조절 부재의 예로는 프로모터, 증강인자, 전사 개시 부위 및 전사 종지 부위를 포함한다. 해독 조절 부재의 예로는 리보솜 결합 부위, 해독 개시 부위 및 종지 코돈이 있다. 또한, 단백질 프로세싱 인자를 포함할 수 있는데, 그 예로는 막을 따라 폴리펩티드의 전좌 및 세포로부터의 분비에 필요한 선도 또는 시그널 펩티드 및 프로테아제 절단 부위를 암호하는 영역이 있다. 이용된 인자는 발현용으로 사용된 숙주 세포내에서 작용성일 것이다. 조절 인자는 벡터에 사용된 동일한 당단백질 B 유전자에서 유래하거나, 또는 이종성일 수 있다(즉, 다른 유전자 및/또는 다른 개체에서 유래됨).
폴리뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 이.콜리, 미코박테리아와 같은 박테리아 세포, 다른 원핵 미생물 및 진핵 세포(곰팡이 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포 포함)를 포함한다. 이 세포들은 직접 흡수, 엔도시토시스, 형질감염, f-교배 또는 전기침투에 의하여 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입하므로써 형질전환된다. 이어서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합 벡터로서 세포내에 보유하거나 또는 대안적으로 숙주 세포 게놈에 통합될 수도 있다.
클로닝 벡터는 이들이 함유하는 폴리뉴클레오티드의 복제 복사체를 얻기 위하여, 또는 미래에 회수하기 위하여 수집소에 폴리뉴클레오티드를 보관하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 발현 벡터와 숙주 세포는 이들이 함유하고 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 전사된 폴리펩티드를 얻는데 사용할 수 있다. 또한, 이들은 이 폴리펩티드를 합성할 수 있는 본래 세포를 얻는데 필요한 분석법, 예컨대 약물 선별 분석법에 사용할 수 있다.
감마 헤르페스 비루스 당단백질 B의 합성 타입 1 올리고뉴클레오티드
본 발명에서 제공된 헤르페스 비루스 당단백질 B의 서열로부터 디자인된 올리고뉴클레오티드는 관련 서열을 동정하기 위한 프로브로서 또는 PCR과 같은 증폭 반응에 프라이머로서 사용할 수 있다.
상이한 성질을 가진 여러 올리고뉴클레오티드들은 하기 단락에 기술한다. 타입 1로서 표시한 올리고뉴클레오티드는 종래 공지된 감마 헤르페스 비루스 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열로부터 디자인한 것이다. 이것은 임의의 감마 헤르페스 비루스 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드할 수 있도록 디자인 한 것으로, 종래 공지된 감마 헤르페스 비루스 종을 검측하는데 사용할 수 있다. 타입 2로 나타낸 올리고뉴클레오티드는 RFHV 및 KSHV 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열을 함께 사용하여 디자인한 것이다. 이것은 비제한적으로 RFHV 및 KSHV를 비롯하여 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드할 수 있도록 디자인한 것이다. 타입 3으로 표시한 올리고뉴클레오티드는 개개의 비루스에 비교적 고유한 RFHV 또는 KSHV 당단백질 서열로부터 디자인한 것이다. 이것은 RFHV 또는 KSHV 및 이것과 근연성이 큰 비루스 균주 유래의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드와만 특이적으로 하이브리드하도록 디자인한 것이다.
타입 1 올리고뉴클레오티드의 일부 바람직한 실시예는 표 4에 기술하였다. 이 올리고뉴클레오티드들은 광범위한 헤르페스 비루스의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드에 대하여 특이성을 가지고 있다.
당단백질 B를 암호하는 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드의 검측,증폭 또는 특성규명에 사용된 타입 1 올리고뉴클레오티드
표적: 헤르페스 당단백질 B, 특히 감마 헤르페스 비루스 유래
명명 서열(5'에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
FRFDA GCTGTTCAGATTTGACTTAGAYMANMCNTGYCC 33 256 센스 13
NIVPANIVPASQ GTGTACAAGAAGAACATCGTGCCNTAYATNTTYAAGTGTACAAGAAGAACATCGTGCC 3223 641 센스 1415
TVNCBTVNCBSQ AACATGTCTACAATCTCACARTTNACNGTNGTAACATGTCTACAATCTCACA 3220 1281 안티센스 1617
FAYDA AATAACCTCTTTACGGCCCAAATTCARTWYGCNTAYGA 38 64 센스 18
IYGKAIYGKASQ CCAACGAGTGTGATGTCAGCCATTTAYGGNAARCCNGTCCAACGAGTGTGATGTCAGCC 3821 641 센스 1920
CYSRACYSRASQ TGCTACTCGCGACCTCTAGTCACCTTYAARTTYRTNAARTTTGCTACTCGCGACCTCTAGTCACC 3824 641 센스 2122
NIDFBNIDFBSQ ACCGGAGTACAGTTCCACTGTYTTRAARTCDATRTTTGTCACCTTGACATGAGGCCA 3621 481 안티센스 2324
FREYA TTTGACCTGGAGACTATGTTYMGNGARTAYAA 32 64 센스 25
FREYB GCTCTGGGTGTAGTAGTTRTAYTCYCTRAACAT 33 16 안티센스 26
NVFDB TCTCGGAACATGCTCTCCAGRTCRAAMACRTT 32 32 안티센스 27
GGMA ACCTTCATCAAAAATCCCTTNGGNGGNATGYT 32 128 센스 28
TVNCA TGGACTTACAGGACTCGAACNACNGTNAAYTG 32 128 센스 29
표 4에 표시된 배향은 폴리뉴클레오티드의 암호 영역에 상대적인 것이다. "센스" 배향을 가진 올리고머는 암호 가닥에 대해 안티센스인 가닥에 하이브리드하여 암호 서열의 방향으로 증폭을 개시할 것이다. "안티센스" 배향을 가진 올리고머는 암호 가닥에 하이브리드하여 암호 서열에 반대 방향으로 증폭을 개시할 것이다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 여러 성질을 가진 것으로 디자인하였다: 1) 원료물에 매우 낮은 복제수로 존재할지라도 표적 DNA에 대하여 충분한 감수성을 갖는 성질; 2) 바람직하지 않은 서열, 예컨대 한정된 유사성을 가진 숙주 서열과 하이브리드하지 않는 충분한 특이성; 3) 미지의 표적과 이것을 디자인하는데 사용된 서열간의 차이로 인하여 올리고뉴클레오티드가 표적과 안정한 이본체를 형성하지 못하지 않는 충분한 교차 반응성.
일부 용도에 특히 효과적인 디자인은 폴리뉴클레오티드 표적에 다소 보존되는 것으로 추정되는 2개 이상의 공지된 폴리뉴클레오티드의 영역으로부터 디자인된 3' 말단에 축퇴성 분절을 가진 올리고뉴클레오티드이다. 불확실한 잔기들의 다양한 과돌연변이는 이 올리고뉴클레오티드의 대안 형태들중의 하나 이상이 표적과 하이브리드할 수 있도록 돕는다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있는 축퇴성 분절의 인접 부위에는 고온에서 하이브리드화 또는 증폭 반응이 수행될 수 있도록 하며, 형성할 수 있는 임의의 이본체를 강화시키는 콘센서스 분절이다. 축퇴성 분절은 분자의 3' 말단에 위치하여, 폴리머라제 사슬 반응동안 신장이 시작하는 부위에서 표적과 올리고뉴클레오티드간에 밀접한 정합의 가능성을 증가시킬 수 있다.
서열의 축퇴성 부분에 있는 불확실한 잔기들은 다음과 같은 코드로 표시하였다.
불확실한 위치에 대한 일문자 코드
코드 표현
RYWSMKBDHVN A 또는 G(퓨린)C 또는 T(피리미딘)A 또는 TC 또는 GA 또는 CG 또는 TC 또는 G 또는 T(A는 아님)A 또는 G 또는 T(C는 아님)A 또는 C 또는 T(G는 아님)A 또는 C 또는 G(T는 아님)A 또는 C 또는 G 또는 T
표 4에 기재된 타입 1 올리고뉴클레오티드는 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드 분절과 하이브리드하는데 일반적으로 유용하게 사용된다. 이것은 폴리뉴클레오티드의 존재를 검측하거나, 폴리뉴클레오티드가 추가로 특성규명될 수 있도록 증폭 반응을 개시시키는데 이용될 수 있다. 적합한 표적으로는 RFHV/KSHV 아과의 구성원을 비롯하여 광범위한 감마 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B의 일정 영역을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 적합한 것은 인간 및 비인간 영장류를 비롯하여 임의의 척추동물을 감염시키는 것을 포함하며, 상기 당단백질 B나 비루스가 종래 공지되었거나 개시되었는지의 여부에는 상관이 없다. 구체적인 예로는 표 1에 기재된 임의의 감마 헤르페스 비루스에서 얻은 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
이 올리고뉴클레오티드들은 특히 이 올리고뉴클레오티드가 하이브리드하는 부위로부터 3' 방향에 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 일정 영역을 증폭시키기 위한 반응을 개시시키는데 사용할 수 있다. FRFDA, HIVPA, TVNCB, FAYDA, IYGKA, CYSRA, NIDFB, FREYA, FREYB, NVFDB, GGMA 및 TVNCA는 축퇴성 분절에 인접한 콘센서스 분절을 가진 올리고뉴클레오티드로서 상기 용도에 유용하게 사용된다.
도 2는 전술한 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 하이브리드할 것으로 예상되는 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열을 따른 위치를 도시한 것이다. 이 지도는 일정 크기로 도시한 것은 아니지만, 당단백질 B 암호 가닥을 따라 5' 에서 3' 방향으로 예상되는 하이브리드화 부위의 순서를 정확하게 나타내고 있다. 또한, 증폭 반응에 다양한 프라이머 세트를 사용하여 생성할 수 있는 적당한 길이의 증폭 생성물을 나타내고 있다. 도시된 길이의 생성물은 각 말단에 프라이머 결합 부위와 이들 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
표 4의 올리고뉴클레오티드에 대한 표적으로 사용할 수 있는 DNA의 바람직한 공급원은 특히 헤르페스 비루스를 수용하는 것으로 알려지거나 예상되는 척추동물 기원의 임의의 생물학적 샘플(순수 조직 및 조직 배양물 포함)이다. DNA는 유기 용매로의 추출법이나 고염 농도에서의 침전법을 비롯하여 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 공급원으로부터 추출한다.
증폭의 바람직한 방법은 폴리머라제 사슬 반응이다: 일반적으로 미국 특허 제4,683,195호(Mullis) 및 미국 특허 제4,683,202호(Mullis 등)을 참조하고; 비루스 폴리뉴클레오티드에 사용하는 경우에는 미국 특허 제5,176,995호(Sninsky 등)을 참조하라. 증폭 반응은 증폭시킬 표적 폴리뉴클레오티드를, 이 표적과 하이브리드하여 중합 반응의 프라이머로서 작용할 수 있는 짧은 올리고뉴클레오티드와 결합시키므로써 수행할 수 있다. 또한, 여기에는 기질 모노뉴클레오티드와 열안정한 DNA-의존적인 당단백질 B, 예컨대 Taq를 첨가한다. 증폭 반응에 사용된 조건들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 공지의 비루스 공급원, 예컨대 RFHV, KSHV, hEBV 또는 HSV1을 사용하여 실험적으로 최적화할 수 있다. 조건은 예컨대 증폭 사이클, 특히 하이브리드화 단계의 시간과 온도를 변화시키고; 올리고뉴클레오티드 프라이머의 몰량을 변화시키며; 완충액 농도를 변화시키고; 그리고 증폭 사이클의 회수를 변화시켜 바꿀 수 있다. 증폭 조건의 미세조정은 당해 기술분야의 숙련가에게는 일상적인 문제이다.
일 방법에 있어서, 본 발명의 단일 프라이머는 선택적으로 제 2 프라이머, 예컨대 랜덤 프라이머와 함께, 제 1 프라이머로부터 하류로 그리고 반대 방향으로 복제를 개시하기 위하여 증폭에 사용된다. 바람직한 방법에 있어서, 본 발명의 프라이머들중 2개 이상은 동일 반응에서 반대 방향으로 복제를 개시시키기 위하여 사용한다. 2개 이상의 특이적인 프라이머들의 사용은 증폭 반응의 특이성을 향상시키고, 샘플 마다 비교되는 단편의 크기를 한정한다. 예컨대, 증폭은 프라이머 NIVPA 및 TVNCB를 사용하여 수행할 수 있다. 보다 바람직한 것은 증폭을 향상시키기 위하여 네스트형(nested) 방식으로 모두 3개의 프라이머를 사용하는 것이다. 네스팅(nesting)은 부가 프라이머에 대한 하나 이상의 내부 결합 부위를 포함하는 중간체 생성물을 만드는 프라이머들을 사용하여 제 1 증폭을 수행하므로써 실시한다. 그 다음에는 상기 세트의 프라이머중 한 프라이머에 결합된 새로운 하나의 프라이머를 사용하거나, 또는 2개의 새로운 프라이머를 사용하여 제 2 증폭반응을 실시한다. 따라서, 제 2 증폭반응의 생성물은 제 1 생성물의 준단편이다. 필요하다면, 또다른 프라이머를 사용하여 증폭 반응을 더욱 실시할 수 있다.
따라서, 네스팅 증폭 반응은 센스 배향으로 한 종류 이상의 프라이머와 안티센스 배향의 하나의 프라이머를 함유하는 3종류 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 임의의 조합체를 사용하여 수행할 수 있다. 프라이머는 중간 증폭 생성물로서 약 2000개 이하의 염기쌍을 제공하는 것을 선택하는 것이 바람직하고; 보다 바람직하게는 약 1500개 이하의 염기쌍; 이 보다 더 바람직하게는 약 750개 이하의 염기쌍을 제공하는 것을 선택하는 것이다. 가장 중심부의 프라이머는 최종 증폭 생성물로서 약 1200개 이하의 염기쌍을 제공하는 것이 바람직하고; 보다 바람직하게는 약 750개 이하의 염기쌍; 이 보다 더 바람직하게는 약 500개 이하의 염기쌍을 제공하는 것이다. 따라서, 바람직한 조합은 FAYDA, IYGKA, CYSRA, NIDFB, NVFDB 및 FREYB중에서 선택되는 3개 이상의 프라이머이다. 또다른 바람직한 조합은 FRFDA, NIVPA, TVNCA, NIDFB, NVFDB 및 FREYB중에서 선택되는 3개 이상의 프라이머이다.
특히 바람직한 것은 프라이머 FRFDA 및 TVNCB를 사용하여 제1 증폭을 실시한 후, 프라이머 NIVPA 및 TVNCB를 사용하여 제2 증폭을 실시하는 것이다. KSHV의 당단백질 B 유전자 유래의 폴리뉴클레오티드에 대해 증폭을 실시한 결과, 프라이머 결합 영역을 포함하는 최종 단편의 크기는 약 386 염기였다.
증폭된 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응동안 임의의 단계에서, 예컨대 크기 측정등으로 특성규명할 수 있다. 이것은 상기 폴리뉴클레오티드를 약 1 내지 2% 아가로스 겔상에서 진행시켜 수행하는 것이 바람직하다. 겔내의 폴리뉴클레오티드가 충분한 양으로 존재한다면, 그 폴리뉴클레오티드는 에티디움 브로마이드로 염색되어 자외선하에서 검측할 수 있다. 또는, 폴리뉴클레오티드는 약 6% 폴리아크릴아미드의 겔에 장입하기 이전에32P 또는35S와 같은 방사선동위원소로 표지한 다음, 이 겔을 사용하여 방사선사진촬영할 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드를 표지하는 바람직한 방법은 NIVPA와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 폴리뉴클레오티드 키나제 및 감마-[32P]-ATP를 사용하고 약 5 내지 15 사이클동안 증폭을 지속시켜32P로 말단 표지하는 것이다.
바람직하다면, 또한 크기 분리는 증폭된 폴리뉴클레오티드의 제조에 일단계로서 사용할 수 있다. 이것은 특히 증폭 혼합물이 예컨대 바람직하지 않은 표적과의 교차 반응성을 통해 발생할 수 있는 여러 크기의 가공 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 밝혀졌을 때 특히 유용하다. 이전 문단에서 기재한 바와 같은 분리 겔은 종이 백킹상에서 건조시킨 뒤 방사선사진촬영한다. 그 다음 방사선사진위에 나타난 바람직한 밴드에 해당하는 겔의 위치를 절단하고 표준 기법으로 추출한다. 이와 같이 추출된 폴리뉴클레오티드는 그 다음 직접 특성규명하거나, 클로닝하거나 또는 추가 증폭 과정에 사용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 NIVPASQ, TVNCBSQ, IYGKASQ, CYSRASQ 및 NIDFBSQ는 각각 콘센서스-축퇴 타입 1 올리고뉴클레오티드에서 유래되는 것이다. 이 서열들은 축퇴 분절은 없으나 콘센서스 분절을 갖고 있다. 특히, 이 서열들은 콘센서스-축퇴형 올리고뉴클레오티드를 사용하여 성공적으로 증폭시킨 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 단편을 서열 분석하는데 유용하다.
또한, 이러한 종류의 프라이머를 사용하면 증폭 반응으로부터 혼합물중에 생성되는 바람직하지 않은 폴리뉴클레오티드를 비례적으로 감소시킬 수 있다. 예컨대, 증폭의 초기 3 내지 5회 사이클을, 프라이머 NIVPA 및 TVNCB를 사용하는 경우, 규정 양의 1/5 내지 1/25로 사용하여도 수행할 수 있다. 그 다음 NIVPASQ 및/또는 TVNCBSQ를 과량의 몰량(예컨대 50 pmol)으로 첨가하면, 추가 30 내지 35회 사이클동안 증폭을 실시할 수 있다. 이것은 증폭 혼합물에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 복잡성을 감소시키며, 바람직하지 않은 폴리뉴클레오티드의 증폭을 감소시키기 위하여 반응 온도를 증가시킬 수 있다.
RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B에 대한 타입 2 올리고뉴클레오티드 프라이머
타입 2 올리고뉴클레오티드는 RFHV/KSHV 아과의 모든 비루스의 당단백질 B에 대한 증폭 반응이나 검측에 사용하기 위한 것이다. 이것은 RFHV 및 KSHV 간에는 비교적 보존성이 있으나, 다른 종래 서열결정된 감마 헤르페스 비루스에는 보존적이지 않은 당단백질 B 암호 영역의 분절로부터 디자인한 것이다. 바람직한 예를 표 6에 나타낸다.
당단백질 B를 암호하는 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드를 검측, 증폭 또는 특성규명하는데 사용되는 타입 2 올리고뉴클레오티드
표적: 헤르페스 비루스의 RFHV/KSHV 아과에서 얻은 당단백질 B
명명 서열 (5'에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
SHMDASHMDASQ AGACCCGTGCCACTCTATGARATHAGYCAYATGGAAGACCCGTGCCACTCTATGA 3520 241 센스 4142
CFSSBCFSSBSQ GTTCACAACAATCTTCATNGARCTRAARCAGTTCACAACAATCTTCAT 3018 321 안티센스 4344
ENTFA GTCAACGGAGTAGARAAYACNTTYACNGA 29 128 센스 45
DNIQBDNIQBSQ ACTGGCTGGCTAAAGTACCTTTGAATRTTRTCNGTACTGGCTGGCTAAAGTACCTTTG 3523 161 안티센스 4647
타입 2 올리고뉴클레오티드는 RFHV/KSHV 아과 특이성이 필요한 많은 용도에 사용될 수 있다. 이러한 용도의 예로는 RFHV/KSHV 아과의 공지 비루스에서 유래된 당단백질 B의 검측이나 증폭 또는 상기 아과의 신규 구성원들에서 유래된 당단백질 B의 특성규명을 포함한다.
SHMDA, CFSSB, ENTFA 및 DNIQB는 RFHV 또는 KSHV중 어느 한 종류와도 동일하지 않은 RFHV/KSHV 아과의 폴리뉴클레오티드를 포함하여 PCR 증폭의 개시 프라이머로서 사용할 수 있는 축퇴성 3' 말단을 가진 콘센서스-축퇴성 올리고뉴클레오티드이다. SHMDASQ, CFSSBSQ 및 DNIQBSQ는 콘센서스 분절만을 포함하며, 예컨대 콘센서스-축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 미리 증폭시킨 폴리뉴클레오티드를 표지화 또는 서열결정하는데 사용할 수 있다.
일 용도로서, 이러한 타입 2 올리고뉴클레오티드는 증폭 프라이머로서 각각 사용하거나 또는 조합하여 사용한다. 본원의 일예로서, 올리고뉴클레오티드는 조직 샘플에서 얻은 DNA에 직접 사용하여, 동일 조직내에 존재할 수도 있는 hEBV, hCMV 또는 HSV1과 같이 다소 근연성이 먼 비루스 유래가 아닌 RFHV/KSHV 아과 유래의 당단백질 B를 얻을 수 있다. 따라서, SHMDA 및 DNIQB는 NIVPA 및 TVNCB와 같은 타입 1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 선택적으로 예비증폭시킨 PCR에 프라이머로서 사용할 수 있다. 다른 조합도 또한 적합하다. 또다른 예로서, 표 6에 기재된 타입 2 올리고뉴클레오티드중 하나를 상기 기술된 적합한 타입 1 올리고뉴클레오티드와 함께 조합하여 사용할 수도 있다. 따라서, NIVPA는 DNIQB와 조합하여 사용할 수 있거나, 또는 SHMDA는 PCR의 프라이머로서 TVNCB와 조합하여 사용할 수도 있다. 이러한 DNA 공급원은 NIVPA 및 TVNCB를 사용하여 선택적으로 예비증폭시킬 수 있다. 또한, 다른 조합도 적합하다.
다른 용도에서, 타입 2 올리고뉴클레오티드, 또는 이 서열이나 이의 단편을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 검측 분석법에 프로브로서 사용한다. 예를 들면,32P와 같은 적당한 표지를 제공한 다음, TVNCB와 함께 FRFDA 및/또는 NIVPA를 사용하여 증폭시킨 DNA와 같이 적당한 표적을 사용하여 하이브리드화 분석에 사용한다.
RFHV 또는 KSHV의 당단백질 B에 특이적인 타입 3 올리고뉴클레오티드 프라이머
타입 3 올리고뉴클레오티드는 특정 비루스에 특이적인 증폭 반응이나 검출 반응에 사용하고자 하는 것이다. 이것은 RFHV 또는 KSHV의 당단백질 B 암호 영역의비축퇴성 분절로서, 이 영역의 다른 분절들 보다 RFHV 또는 KSHV 간에 그리고 다른 헤르페스 비루스들에 대하여 비교적 가변성이 크다. 바람직한 예는 표 7과 하기 실시예에 나타낸다.
당단백질 B를 암호하는 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드를 검측, 증폭 또는 특성규명하는데 사용되는 타입 3 올리고뉴클레오티드
표적: RFHV에서 얻은 당단백질 B
명명 서열 (5'에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
GMTEBAAITB TGCTGCTTCTGTCATACCGCGTATTTGTTTGTGATTGCTGCT 2121 11 안티센스안티센스 4849
GMTEAKYEIATDRDBVEGLB GCGGTATGACAGAAGCAGCAAAACAAATATGAGATCCCCAGGTCATCCCGATCGGTGAACGTATTGTCAGTTAGACCTTCGACG 21212121 1111 센스센스안티센스안티센스 50515253
VEGLAPVLYA CCCGTCGAAGGTCTAACTGACAGCCAACCAGTACTGTACTCT 2121 11 센스센스 5455
표적: KSHV에서 얻은 당단백질 B
명명 서열 (5'에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
GLTEBTNKYB TGATGGCGGACTCTGTCAAGCGTTCATACTTGTTGGTGATGG 2121 11 안티센스안티센스 5657
GLTEAYELPAVNVNBTFTDV GGGCTTGACAGAGTCCGCCATACAAGTATGAACTCCCGAGACACCCCGTTGACATTTACCTTCTCGTCTCTGTCAGTAAAGTG 21212121 1111 센스센스안티센스안티센스 58596061
TVFLASQPVA CCACAGTATTCCTCCAACCAGGGTACTTTAGCCAGCCGGTCA 2121 11 센스센스 6263
GMTEB, AAITB, GMTEA, KYEIA, TDRDB, VEGLB, VEGLA 및 PVLYA는 RFHV 당단백질 B의 특이적인 비축퇴성 올리고뉴클레오티드이며, RFHV 기원의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 검출에 사용할 수 있다. 증폭은 네스트형 방식으로 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 예컨대 프라이머로서 GMTEA 및 VEGLB를 사용하여 제1 증폭을 수행하고; 그 다음 프라이머로서 KYEIA 및 TDRDB를 사용하여 제2 증폭을 수행한다. 이것은 RFHV 당단백질 B에 특이적인 가장 민감한 증폭 분석법을 제공한다. GMTEB 및 AAITB는 상기 단편의 5' 말단 부근에서 하이브리드하며, 타입 1 올리고뉴클레오티드에 하이브리드하는 업스트림과 함께 사용하여 5' 방향으로 서열을 증폭 또는 검출할 수 있다. VEGLA 및 PVLYA는 상기 단편의 3' 말단 부근에서 하이브리드하며, 타입 1 올리고뉴클레오티드에 하이브리드하는 다운스트림과 함께 사용하여 3' 방향으로 서열을 증폭 또는 검출할 수 있다.
이와 유사하게, GLTEB, TNKYB, GLTEA, YELPA, VNVNB, ENTFB, SQPVA 및 TVFLA는 KSHV 당단백질 B의 특이적인 비축퇴성 올리고뉴클레오티드로서, 예컨대 증폭 반응에 프라이머로서 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 증폭은 상기 올리고뉴클레오티드를 네스트형 방식으로 사용하여 수행한다: 예컨대, 제 1 증폭은 프라이머로서 GLTEA 및 ENTFB를 사용하여 수행하고; 그 다음 제 2 증폭은 프라이머로서 YELPA 및 VNVNB를 사용하여 수행한다. 이 증폭반응은 KSHV 당단백질 B에 특이적인 감수성이 큰 증폭 분석법이다. GLTEB 및 TNKYB는 상기 단편의 5' 말단 부근에서 하이브리드하며, 타입 1 올리고뉴클레오티드에 하이브리드하는 업스트림과 함께 사용하여 5' 방향으로 서열을 증폭 또는 검출할 수 있다. SQPVA 및 TVFLA는 상기 단편의 3' 말단 부근에서 하이브리드하며, 타입 1 올리고뉴클레오티드에 하이브리드하는 다운스트림과 함께 사용하여 3' 방향으로 서열을 증폭 또는 검출할 수 있다.
당업자라면 타입 1, 2 및 3의 올리고뉴클레오티드(특히, 표 4, 6 및 7에 나타낸 것)가 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드의 다른 구역을 증폭시키기 위한 PCR에 서로 조합하여 사용할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 이러한 증폭 반응의 특이성은 일반적으로 최소한의 교차 반응성을 가진 프라이머를 사용하여 측정한다. 증폭된 단편의 크기와 위치는 최종 증폭 과정에 사용된 프라이머를 가지고 측정한다. 예를 들면, SQPVB와 함께 사용된 NIVPA는 KSHV와 근연성이 큰 비루스에서 얻은 약 310 염기의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 것이다. 올리고뉴클레오티드의 적당한 조합은 증폭 프라이머로서 네스트형 방식으로 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 표적을 특성규명하기 위한 합성 올리고뉴클레오티드의 용도
상기 단락에서 개시한 바와 같이, 본 발명에서 구현된 올리고뉴클레오티드는 헤르페스 비루스 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드의 증폭에 프라이머로서, 특히 폴리머라제 사슬 반응에 프라이머로서 사용할 수 있다.
PCR을 수행하기 위한 조건은 사용되는 올리고뉴클레오티드의 성질에 따라 다르다. 특히, 축퇴성 분절 또는 표적의 해당 분절과 단지 부분적으로 동일한 콘센서스 분절을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우 및 표적 폴리뉴클레오티드가 미지 서열을 함유하는 경우에는 조건의 설정이 증폭 반응의 성공을 좌우하는 중요 인자일 수 있다. 신규 프라이머 또는 신규 폴리뉴클레오티드 표적에 대한 조건을 최적화하는 것은 당업자에게는 일상적인 일이다. 이러한 목적을 돕기 위하여 다음과 같은 지침을 제공한다.
첫째, PCR의 어닐링 단계의 온도는 관련이 없는 폴리뉴클레오티드의 증폭 양보다 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 양이 증가하도록 최적화한다. 이 온도는 프라이머가 다른 서열이 아닌 표적 서열과 하이브리드하도록 만드는 것이 이상적이다. 콘센서스 분절을 함유하는 프라이머(타입 1)의 경우에, PCR 반복 사이클에서의 어닐링 단계 온도는 일반적으로 약 45℃ 이상이고, 바람직하게는 약 50℃ 이상이다. 또한, PCR의 처음 몇 사이클을 보다 고온에서, 예컨대 55℃ 또는 심지어 60℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 고온은 반응 사이클 동안 어닐링 단계가 보다 서열 특이적이 되도록 하고 관련이 없는 서열의 배경 증폭을 감소시킬 것이다. 그 다음의 반응 사이클의 어닐링 단계는 보다 스트린젠시가 적은 조건하에서 실시하여 증폭 속도를 증진시킬 수 있다. 특히 바람직한 절차는, 제1 PCR 증폭 사이클이 60℃에서 수행되는 약 1분간의 어닐링 단계를 포함하는 것이다. 그 다음 증폭 사이클중의 어닐링 단계는 온도가 50℃에 도달할 때까지 각 반응 사이클마다 2℃씩 저하된 온도에서 수행한다. 그 다음 증폭 사이클의 어닐링 단계는 목적하는 정도의 증폭이 얻어질 때까지 50℃에서 어닐링 단계를 수행한다.
비루스-특이적이고 콘센서스 분절을 함유하지 않는 프라이머(타입 3)는 선택성이 보다 크고, 보다 넓은 온도 범위에 걸쳐 효과적일 수 있다. PCR 증폭 사이클에서 어닐링 단계의 바람직한 온도는 50℃ 내지 65℃ 사이이다.
둘째, 완충액 조건을 최적화한다. 본 발명자들은 Taq 폴리머라제의 시판용 제제로 공급된 완충액이 부분적으로 마그네슘 이온 농도에 대한 상당한 의존성으로 인하여 때로는 사용하기 어렵다는 것을 발견하였다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행한 PCR은 일반적으로 M.Wigler(Lisitsyn et al.)에 의해 제안된 바와 같은 완충액을 사용하여 보다 용이하게 수행할 수 있다. 최종 PCR 반응 혼합물에는 주요 이온원으로서 KCl 대신에 (NH4)2SO4를 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 최종 반응 혼합물중의 (NH4)2SO4의 농도는 약 5 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 약 10 내지 30 mM이며, 보다 더 바람직하게는 16 mM이다. 완충액의 성분은 바람직하게는 약 67 mM의 최종 농도와 약 8.8의 pH를 가진 트리스가 바람직하다. 이러한 조건하에서, MgCl2농도는 중요하지 않다. 이의 최종 농도는 바람직하게는 약 1 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 약 3 내지 6 mM이며, 최적으로는 약 4 mM인 것이다. 또한, 이 반응 혼합물은 약 10 mM의 β-머캅토에탄올 및 0.05 내지 1 mg/mL의 소혈청 알부민을 함유할 수 있다. 특히 바람직한 완충액은 WB4 완충액(67 mM Tris 완충액 pH 8.8, 4 mM MgCl2, 16 mM (NH4)2SO4, 10 mM β-머캅토에탄올 및 0.1 mg/mL 알부민)이다. 반응을 수행하는데 바람직한 조건은 하기 실시예 3에 기술하였다.
PCR 반응을 수행하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 4가지 데옥시뉴클레오티드, 적합한 완충액, 증폭될 DNA 및 열안정한 DNA-의존적 DNA 폴리머라제를 포함하는 혼합물을 제조한다. 그 다음 이 혼합물을 목적하는 정도의 증폭이 얻어질 때까지 어닐링, 신장 및 용융 단계의 온도 사이클로 진행시킨다. 생성된 DNA의 양은 예컨대 에티디움 브로마이드로 염색한 뒤, 선택적으로 아가로스 겔로 증폭 단편을 분리한 후 측정할 수 있다.
증폭 반응의 가능한 문제점은 올리고뉴클레오티드 프라이머 자체의 이량체화 및 증폭이다. 이것은 아가로스 겔에서 저분자량(<100 염기쌍)의 단편으로서 용이하게 검출할 수 있다. 증폭된 프라이머는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 분리로 분리할 수 있다. 증폭된 이량체 양은 반응 조건, 특히 어닐링 단계의 온도를 약간 조정하여 감소시킬 수 있다. 또한, 프라이머, 데옥시뉴클레오티드 및 완충액을 예비혼합하고, 증폭될 DNA를 첨가하기 이전에 혼합물을 80℃로 가열한다.
프라이머로서 본 발명의 모든 올리고뉴클레오티드를 사용하는 증폭 반응은 일부 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드 단편을 생성한다. 이 단편들은 당업자에게 공지된 많은 기법을 사용하여 특성규명할 수 있다. 단편의 특성을 규명하는 일부 방법은 다음과 같으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
제 1 방법으로서, 단편은 맥삼 길버트법(Maxam & Gilbert) 또는 생거 니콜슨법(Sanger & Nicholson)을 비롯하여 당해 기술분야에 공지된 임의의 서열 결정법에 따라 서열결정할 수 있다. 또는, 단편은 폴리뉴클레오티드 서열결정 서비스를 제공하는 영리 기관에 제공하여 서열 결정할 수도 있다. 단편은 선택적으로 서열결정 이전에 클로닝 및/또는 증폭시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 그 단편에 의해 암호된 아미노산 서열을 예측하는데 사용할 수 있다. 서열 데이터는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 준위에서 다른 서열결정된 당단백질 B들과 비교하여 본래의 원료 물질에 존재하는 헤르페스 비루스의 종을 동정할 수 있다. 또한, 서열 데이터는 항원 영역이나 입체 구조를 예측하기 위한 알고리듬 모델링에 사용할 수 있다.
특성규명하는 제 2 방법으로서, 단편의 크기는 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔 처리 또는 적당한 밀도 구배를 통한 원심분리에 의하여 결정할 수 있다. 예컨대, RFHV 및 KSHV의 경우에, NIVPA와 TVNCB 사이의 단편은 약 319개 염기이다. 따라서, 프라이머 결합 영역을 비롯하여 전체 증폭된 단편의 길이는 약 386 염기이다. 대응하는 sHV1 단편은 추가 6개의 염기쌍을 포함한다. 따라서, sHV1 단편은 예컨대 분리용 겔의 이웃 레인에 증폭된 각 폴리뉴클레오티드 단편을 전개시키거나 또는 적당한 분자량 표준물질 옆에 sHV1 단편을 전개시켜 RFHV 또는 KSHV와 구별할 수 있다. RFHV 및 KSHV 단편과 크기가 동일한 폴리뉴클레오티드 단편은 동일 종 또는 관련있는 비루스 종에서 얻을 수 있다. 크기가 실질적으로 다른 단편은 다른 헤르페스 비루스에서 유래할 가능성이 크다.
특성 규명의 제 3 방법으로서, 단편은 이것을 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드하도록 시도하므로써 시험할 수 있다. 바람직한 예로서, 단편을 RFHV 또는 KSHV의 당단백질 B 암호 영역과의 관련성에 대하여 시험한다. 이 시험은 당단백질 B 암호 영역의 서열을 함유하는 프로브나 이의 유전자 보체를 사용하여 수행한다. 적합한 프로브는 RFHV 또는 KSHV로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 표 7에 기재된 타입 3 올리고뉴클레오티드이다.
프로브의 길이와 성질 및 하이브리드화 조건은 시험 목적에 따라 선택한다. 목적이 소수의 변이주를 비롯하여 RFHV 또는 KSHV에서 유래된 폴리뉴클레오티드만을 검측하는 것이라면, 하이브리드화는 높은 스트린젠시 조건하에서 수행한다. 여기에서는 각각의 당단배질 B에서 유래된 서열을 사용한다. 보다 길이가 긴 서열은 시험의 특이성을 증진시키고 보다 높은 스트린젠시 조건하에서 사용될 수 있다. 프로브는 길이가 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드를 가진 당단백질 B 서열; 보다 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드를 가진 서열; 보다 더 바람직하게는 약 75개 이상의 뉴클레오티드를 가진 서열을 포함할 것이다.
목적이 선별 시험이나 RFHV/KSHV 아과의 종래 개시되지 않은 비루스를 수집하기 위한 시험과 같이 RFHV 또는 KSHV와 근연성은 있으나 동일하지는 않은 폴리뉴클레오티드를 검측하는 것이라면, 다른 조건을 선택한다. 즉, RFHV 또는 KSHV의 서열을 사용할 수 있으나, 이 2가지의 혼합물이나 축퇴 프로브가 일반적으로 바람직하다. 하이브리드화 반응의 조건과 서열의 길이는 바람직하지 않은 서열을 제외시키기에 충분한 특이성을 제공하나, 가능성있는 표적들중에서 최대의 교차 반응성을 제공하는 것으로 선택한다. 적당한 조건은 수학식 1에 따라 Tm을 계산하고 그 다음 허용되는 최대 부정합 정도에 대한 해당 온도를 계산하여 예측할 수 있다. 이러한 조건의 적합성은 헤르페스 당단백질 B를 암호하는 공지의 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플과 프로브의 교차반응성을 시험하여 실험적으로 시험할 수 있다.
이러한 분석 조건하에서 안정한 이본체를 형성하는데 필요한 최소의 상보성 정도는 어느 당단백질 B 서열이 프로브와 하이브리드하는지를 측정할 수 있을 것이다. 예컨대, 표적을 인체 또는 비인체 영장류에서 얻고, 서열 번호 3의 염기 36 내지 354에 해당하는 단편을 만들기 위해 증폭시킨 다음, KSHV 폴리뉴클레오티드의 해당 단편으로 프로브하였다고 가정해보자. 표 2의 데이터에 따르면, 하이브리드화 반응이 안정한 이본체를 형성하기 위하여 단지 약 50%의 동일성을 필요로 하는 조건하에서 수행된다면, 프로브는 hEBV 및 sHV1을 비롯하여 서열결정된 감마 헤르페스 당단백질 B 유전자중 임의의 유전자 유래의 표적과 하이브리드할 수 있다. 반응을 프로브와 표적 간의 동일성이 약 65% 이상인 조건; 바람직하게는 약 67% 이상인 조건; 보다 바람직하게는 약 70% 이상인 조건; 보다 더 바람직하게는 약 75% 이상인 조건하에서 수행하여 안정한 이본체를 형성시키고자 한다면, 이 분석법은 RFHV/KSHV 아과, 즉 RFHV, KSHV 또는 아직 서열결정되지 않은 당단백질 B 폴리뉴클레오티드를 가진 근연성이 큰 헤르페스 비루스에서 유래된 표적 폴리뉴클레오티드를 검측할 수 있을 것이다. 따라서, 안정한 이본체를 형성하는데 약 50 내지 55%의 동일성만을 필요로 하는 하이브리드화 조건에서는 양성 반응으로 bHV4, eHV2 또는 mHV68의 존재를 확인할 수 없는데, 그 이유는 이들 비루스들이 영장류를 감염시킬 수 있을 것으로 생각되지 않기 때문이다.
크기에 의한 특성 규명과 하이브리드화에 의한 특성 규명을 복합시키는 것도 가능하다. 예를 들면, 증폭된 폴리뉴클레오티드를 아크릴아미드 또는 아가로스 겔상에서 분리하고, 니트로셀룰로스와 같이 적합한 물질의 막에 블롯팅한 다음,32P와 같이 적합한 표지를 가진 프로브와 하이브리드할 수 있다. 세척후 표지의 존재는 샘플내에 하이브리드화 물질의 존재를 반영하며, 적당한 분자량의 표준물질과 비교된 이동 거리를 통해 그 물질의 크기를 알 수 있다. 예상치 않은 크기를 가지지만 높은 스트린젠시 조건하에서 전술한 프로브중의 하나와 하이브리드하는 단편 서열은 RFHV 또는 KSHV와는 상이하나 프로브와 높은 동일성을 가진 당단백질 B 서열을 나타내는 것이다.
헤르페스 비루스 감염을 검측하기 위한 폴리뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 용도
본원에서 구현된 바와 같은, 헤르페스 비루스 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 기초로 한 합성 올리고뉴클레오티드는 헤르페스 비루스 감염과 관련된 임상 조건의 진단에 유용하다. 예컨대, 임상 샘플중에 존재하는 검측성 헤르페스 당단백질 B의 존재는 각각의 헤르페스 비루스가 질환 진행중의 병인 인자로서 참여했음을 암시하는 것이다. 주위 조직이 아닌 특정 조직내에 존재하는 비루스 당단백질 B의 존재는 감염된 병변부를 편재화하는데 유용할 것이다. 임상 샘플내에 존재하는 감마 헤르페스 비루스와 다른 헤르페스 비루스들간의 차별화는 감염의 임상과정을 예측하거나 치료에 적합한 약물을 선택하는데 유용할 것이다. 당단백질 B는 복제 비루스, L입자 및 감염 세포에 의해 발현되므로, 본 발명자들은 이 당단백질 B가 상기와 같은 임의의 형태로의 그 단백질 발현과 관련 있는 질환의 활성 단계 및 휴지 단계를 검측할 수 있는 유용한 마커로서 작용할 것으로 예상하였다.
진단 시험을 수행하는 절차는 당해 기술분야에 널리 알려져 있고, 당업자에게는 일상적인 것이다. 일반적으로 본 발명의 진단 방법을 수행하는데에는 본 발명의 조성물중의 하나를 이것과 반응하는 임상 샘플중의 표적을 검측하기 위한 시약으로서 제공한다. 예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 헤르페스 비루스로 감염된 세포내에 존재할 수 있는 것과 같이 DNA 또는 RNA 표적을 검측하기 위한 시약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체 분자 또는 해당 리간드(폴리펩티드가 수용체인 경우)와 같이 특정 복합체를 형성할 수 있는 표적을 검측하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 비루스 감염 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드와 같이 항체가 특이적으로 인식하는 표적을 검측하기 위한 시약으로서 사용할 수 있다.
표적은 진단 매개변수를 측정해야만 하는 개체에서 얻은 적합한 조직 샘플을 얻어서 공급한다. 관련 시험 샘플은 헤르페스 비루스를 수용할 것으로 예상되는 개체에서 얻은 것이다. 이러한 목적에는 많은 종류의 샘플이 적합하고, 그 예로는 감염이나 병상이 의심되는 부위 부근을 생검이나 외과 절개하여 얻은 샘플, 이로부터 유래되는 시험관내 세포 배양물, 가용화된 추출물, 혈액 및 혈액 성분을 포함한다. 필요하다면, 표적은 분석을 수행하기 이전에 샘플로부터 부분 정제하거나 증폭시킬 수 있다. 반응은 시약과 표적 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 샘플과 시약을 접촉시켜 수행한다. 반응은 용액중이나, 예컨대 조직 절편을 사용하는 순수 조직 샘플상에서 수행할 수 있다. 복합체의 형성은 당해 기술분야에 공지된 많은 기법으로 검측한다. 예컨대, 시약은 표지와 함께 공급한 뒤, 복합체로부터 미반응 시약을 제거할 수 있다; 이에 따라 남아있는 표지의 양은 형성된 복합체의 양을 나타낸다. 복합체 검측에 대한 보다 세부사항과 대안양태는 하기 설명을 통해 제공한다.
형성된 복합체의 양이 감염 세포 또는 비감염 세포를 대표할 수 있는지를 측정하기 위하여, 분석 결과를 대조 샘플에 대하여 수행한 유사 분석법과 비교하는 것이 바람직하다. 일반적으로 비감염 세포에서 유래된 대조용 샘플을 이용하는 것이 바람직하고, 그렇지 않다면 시험되는 임상 샘플과 조성이 유사한 대조용 샘플을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 대조군중에 존재하는 표적의 상대적인 양이 알려져 있거나 비교용으로 사용할 수 있다면 어떤 대조용 샘플도 적합하다. 종종 시험 샘플과 대조용 샘플을 동시에 사용하여 분석을 수행하는 것이 바람직하기도 하다. 그러나, 형성된 복합체의 양이 정량가능하고 충분히 일정하다면 시험 샘플과 대조 샘플을 다른 날이나 다른 실험실에서 분석할 수도 있다.
따라서, RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명에서 구현된 합성 올리고뉴클레오티드는 생체 샘플에 존재할 수 있는 감마 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드를 검측하는데 사용할 수 있다. 특정 진단 분석법에 폴리뉴클레오티드를 사용하기 위한 일반적인 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다: 예컨대 특허 출원 JP 5309000(Iatron)을 참조하라.
폴리뉴클레오티드 시약을 이용하는 분석은 예컨대, 1) 특정 프로브와의 하이브리드화 반응을 수행하거나; 2) 특정 프라이머와의 증폭 반응을 수행하거나; 또는 3) 이 두가지 반응의 조합으로 특이성을 부여할 수 있다.
특정 프로브와의 하이브리드화에 의하여 특이적인 분석법을 수행하기 위하여, 폴리뉴클레오티드는 목적 표적에 필요한 정도의 상보성을 가진 것을 선택한다. 바람직한 프로브로는 RFHV, KSHV 또는 RFHV/KSHV 아과의 일군에서 유래된 당단백질 B의 일부를 암호하는 길이가 약 16개 이상의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 보다 점차 바람직한 것은 당단백질 B 암호 영역중 약 18개, 21개, 25개, 30개, 50개 또는 100개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 프로브이다. 또한, 다른 헤르페스 비루스의 폴리뉴클레오티드와는 이본체를 형성하지 않지만 RFHV/KSHV 아과의 폴리뉴클레오티드와는 안정한 이본체를 형성할 수 있는 축퇴성 프로브가 바람직하다.
프로브는 일반적으로 표지된 것으로 제공한다. 이러한 종류의 분석에 종종 사용되는 표지의 예로는32P 및33P과 같은 방사능동위원소, 플루오레세인과 같은 형광 또는 화학발광 시약 및 유색 용질이나 침전물을 생성할 수 있는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소를 포함한다. 표지는 이 시약 자체이거나, 직접 화학 결합을 통해 결합되어 있거나, 또는 일련의 중간 반응 분자, 예컨대 비오틴-아비딘 복합체, 또는 일련의 상호 반응성 폴리뉴클레오티드를 통해 연결될 수 있다. 표지는 표적 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 이전이나 이후에 시약에 첨가할 수 있다. 분석의 감도를 증가시키기 위하여, 하이브리드화 이후 시그널을 증가시키는 것이 바람직하다. 이것은 복수의 표지 성분이 각 복합체에 병입될 수 있도록 연속 하이브리드화 폴리뉴클레오티드 또는 분지형 폴리뉴클레오티드의 조합물을 사용하여 수행할 수 있다. 미국 특허 제5,124,246호(Urdea et al. 참조)를 참조하라.
필요하다면, 표적 폴리뉴클레오티드는 샘플에서 추출하여, 부분 정제할 수 있다. 비루스 입자를 측정하기 위해서는 제조물중의 DNA를 농축시키고, 당단백질 B의 활성 전사를 측정하기 위해서는 제조물중의 RNA를 농축시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 헤르페스 비루스중의 폴리뉴클레오티드의 농도는 임상 샘플중에서는 낮을 것으로 예상된다. 즉 비루스가 잠복성인 경우에는 세포당 당단백질 B 암호 DNA가 단지 몇몇 복사체로만 존재하거나, 또는 비루스가 복제성인 경우에는 세포당 DNA가 수백개 이하의 복사체로 존재할 것이다. mRNA의 농도는 그 유전자가 불활성인 경우보다 단백질이 활성적으로 발현되는 세포에서 더 높을 것이다. 따라서, DNA 또는 RNA를 증폭시켜 샘플중에 존재하는 표적의 농도를 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 적합한 증폭 방법은 PCR이며, 이것은 본 발명에서 구현된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. RNA는 역전사효소를 사용하여 cDNA 복사체를 제조하고, 그 다음 전술한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하므로써 증폭시킬 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 제한 효소 절단, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 전기영동등에 의한 크기 분리, 및 블롯팅 물질과 같은 반응 기질에 대한 고착을 비롯한 추가 처리를 임의 조합하여 수행할 수 있다.
하이브리드화는 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 생각되는 샘플과 폴리뉴클레오티드 시약을 적합한 반응 조건 하에서 혼합하므로써 수행할 수 있다. 이후, 세척 또는 분리를 수행하여 미반응 시약을 제거할 수 있다. 일반적으로, 표적 폴리뉴클레오티드와 시약은 둘 다 일본쇄 형태로 적어도 부분적으로 평형화되어, 상보 서열이 효율적으로 하이브리드할 수 있어야만 한다. 따라서, 당업계에 공지된 표준 축퇴성 기법을 이용하여 샘플을 제조하는 것이 유용할 수 있다(특히, DNA에 대한 테스트에서 유용함).
하이브리드 조건으로 선택된 스트린젠시 수준은 테스트의 목적에 따라 달라진다. 테스트가 RFHV 또는 KSHV에 특이적인 것이 바람직한 경우, 각 당단백질 B의 분절을 포함하는 프로브를 사용하고, 반응은 매우 높은 스트린젠시 조건 하에서 수행한다. 예를 들어, 50개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 바람직한 프로브와 함께 사용하기에 바람직한 일군의 조건은 37℃에서 50% 포름아미드중의 6 x SCC를 사용하고, 및 이어서 낮은 이온 세기에서 세척하는 것이다. 이는 일반적으로 안정한 이본체를 형성시키기 위한 폴리뉴클레오티드 프로브와 약 90% 이상 동일성을 가진 표적을 필요로 한다. 또한, 당해의 특정 비루스에 대한 반응의 특이성은 사용하는 프로브의 길이를 증가시키므로써 증가시킬 수 있다. 따라서, 보다 긴 프로브가 본 발명의 용도에 특히 적합하다. 대안으로, 테스트가 KSHV와 관련있는 다른 헤르페스 비루스를 검출할 수 있는 것이어야만 하는 경우, 낮은 스트린젠시를 사용한다. 적합한 프로브로는 KSHV 당단백질 B 폴리뉴클레오티드에서 유래된 단편, 이의 혼합물 또는 표 7에 나타낸 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
적합한 하이브리드화 조건은 프로브와 소정의 동일성을 보유하는 당단백질 B 서열에만 그 프로브가 하이브리드할 수 있도록 조정한다. 요구되는 스트린젠시는 폴리뉴클레오티드 프로브의 길이 및 상기 프로브와 소정의 표적 서열과의 동일성 정도에 따라 달라진다. 예를 들어, NIVPA와 TVNCB의 하이브리드 부위 사이에 있는 KSHV 폴리뉴클레오티드 단편으로 이루어지는 프로브를 고찰해보자. 최소 동일성 60%를 필요로 하는 조건은 sHV1과 같은 다른 감마 헤르페스 비루스와 KSHV의 상응하는 폴리뉴클레오티드와만 안정한 이본체를 형성시킬 것이며; 최소 동일성 90%를 필요로 하는 조건은 KSHV 및 이와 관련성이 큰 변이체 유래의 폴리뉴클레오티드와만 안정한 이본체를 형성할 것이다. 최소 동일성 65 내지 70%를 필요로 하는 중간 스트린젠시의 조건은 감마 헤르페스 비루스 eHV2, sHV1, mHV68, bHV4, EBV 및 hCMV, hHV6, hVZV와 HSV1 같은 다른 인체 병원균을 비롯하여 다른 공지된 헤르페스 비루스의 해당 폴리뉴클레오티드와는 이본체를 형성시키지 않고, KSHV 및 RFHV/KSHV 아과의 일부 다른 구성원들로부터 유래한 당단백질 B 폴리뉴클레오티드와 이본체를 형성시킬 수 있을 것이다.
조건은 전술한 방식을 이용하여 사전에 설정할 수 있다. 정확한 조건은 폴리뉴클레오티드, 즉 분석시 검출하려고 하는 바람직한 폴리뉴클레오티드와 검출되지 않는 것이 바람직한 폴리뉴클레오티드 둘 다를 함유하는 것으로 알려진 개개의 샘플을 이용하여 프로브를 테스트하므로써 확인하는 것이 바람직하다. 이러한 샘플은 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드를 합성하거나, 각각의 헤르페스 비루스로 감염된 것으로 생각되는 조직으로부터 DNA를 추출 및 증폭하므로써 제공할 수 있다. 하이브리드화 조건의 결정은 당업자에게는 일상적인 일이며, 과도한 실험을 요구하지는 않는다. eHV2, sHV1, mHV68, bHV4 및 EBV는 알파 및 베타 아과의 헤르페스 비루스 보다는 RFHV/KSHV와 더 동일하기 때문에, RFHV/KSHV 아과 이외의 감마 헤르페르 비루스를 배제하는 조건은 또한 표 1에 나타낸 기타 헤르페스 비루스를 제거할 수 있을 것이다. 또한, 최종 결정에서 특정 비루스가 테스트하려는 샘플내에 존재하지 않을 것으로 생각되면(예를 들어, 인간 조직 샘플내의 eHV2, mHV68 또는 bHV4), 해당 표적 서열이 분석 조건의 수행시에 선택적으로 빠질 수도 있다. 따라서, 표 6에 기재된 올리고뉴클레오티드와 같은 타입 2 올리고뉴클레오티드 프로브가 서열 번호 5 내지 서열 번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열이 아닌 서열 번호 1 또는 서열 번호 3을 포함하는 폴리펩티드와 안정한 이본체를 형성할 수 있도록 조건이 설정될 수 있다. 또한, 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 21개 이상의 연속 염기를 포함하는 임의의 적합한 단편이 서열 번호 5 내지 서열 번호 13중 어느 한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 아니라, 서열 번호 1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 3을 포함하는 폴리뉴클레오티드 둘 다와 안정한 이본체를 형성할 수 있는 조건도 설정할 수 있다.
대안으로, 특이성 프라이머를 이용하는 증폭 때문에 특이적인 분석을 수행하기 위해, DNA 또는 RNA는 이전과 같이 생체 샘플로부터 제조한다. 필요에 따라, 표적 뉴클레오티드는 표 4에 나타낸 바와 같이 종 특이성이 아닌 프라이머를 이용하는 PCR에서 예비증폭시킨다. 이어서, 상기 표적은 표 7에 기재된 바와 같은 특정 프라이머 또는 표 4, 6 및 표 7에 나타낸 바와 같은 프라이머 조합과 같은 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시킨다. 바람직한 구체예에서, 네스트형(nested) 방식으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 증폭을 2회 수행한다: 1차 증폭은 비루스 특이성 또는 비루스 비특이성 증폭으로, 2차 증폭은 비루스 특이성 증폭으로 수행한다. 이는 민감하고, 특이성인 분석을 제공한다.
증폭중 특이성 타입 3 프라이머의 사용은 필요로 하는 특이성을 제공하기에 충분하다. 양성 테스트는 일련의 증폭 마지막에 충분한 반응 생성물의 존재를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, 증폭된 폴리뉴클레오티드는 반응 혼합물을 니트로셀룰로즈와 같은 매체에 블로팅하고, 에티디움 브로마이드로 염색하므로써 검출할 수 있다. 대안으로, 방사능 표지된 기재는 최종 증폭 사이클 중에 상기 혼합물에 첨가할 수 있으며; 혼입된 표지는 혼입되지 않은 표지와 분리할 수 있으며(예를 들어, 블로팅 또는 크기 분리법에 의해), 상기 표지는 검출될 수 있다(예를 들어, 계수 및 자동방사능사진법). 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전개하는 경우, 상기 생성물의 크기는 증폭된 단편의 본질을 확인하는 데 도움을 줄 수 있다. 또한, 특이적 증폭 다음에는 이미 개략적으로 설명한 하이브리드화 반응을 위한 표적원으로서 전술한 방법으로 수득한 증폭 혼합물을 이용하는 특이적 하이브리드화를 수반할 수 있다.
유전자 요법을 위한 폴리뉴클레오티드의 이용
본 발명은 활성 성분으로서 비루스-특이적 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 비루스 또는 감염된 세포의 병원성을 감소시키거나, 상기 비루스 또는 감염된 세포를 비특이적 약제 화합물을 이용하는 치료에 감수성을 더 높혀줄 수 있다.
예를 들어, 헤르페스 비루스 당단백질 B의 일부분을 암호하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법용으로서 감염된 개체에 투여할 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,399,346호; Anderson 등). 일반 원리는 상기 폴리뉴클레오티드를 투여하여 암호된 폴리펩티드의 발현을 촉진시키거나 감쇠시키는 것이다.
유전자 요법의 바람직한 형태는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 복제하고, 그 효과를 증강 및 연장시킬 수 있도록 상기 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 해당 유전자의 천연 프로모터, 표적 조직 형태의 세포 내에서 원천적으로 활성인 이종 프로모터, 또는 적합한 인자에 의해 유도될 수 있는 이종 프로모터와 같은 적합한 프로모터에 작동가능하게 결합된다. 이 폴리뉴클레오티드를 세포내로 도입하는 방법으로서, 예컨대 상기 폴리뉴클레오티드를 비루스 발현 벡터와 같은 적합한 벡터 형태에 제공하거나, 상기 폴리뉴클레오티드를 리포좀내에 캡슐화하는 방법과 같이 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용한다. 폴리뉴클레오티드는 전신 주입하거나, 항원-특이적 호밍(homing) 기작에 의해 감염 부위에 투여하거나, 또는 직접 주입할 수 있다.
다른 하나의 예는, 폴리뉴클레오티드가 헤르페스 비루스 감염 과정동안 전사되는 가닥과 같은 배향으로 폴리뉴클레오티드 가닥에 결합된 프로모터를 포함하는 것이다. 암호되는 당단백질 B는 외부 성분, 경막 성분 및 표면으로 수송하기 위한 시그널 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 종류의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 비루스 감염 세포는 그 세포 표면에 증가량의 당단백질 B를 발현할 것으로 추정된다. 이와 같은 방식의 당단백질 B 발현의 증가는 항체(및 항체 의존적 작동인자, 예컨대 ADCC) 및 비루스 특이적 세포독성 T 세포를 비롯하여 면역계의 성분들에 의한 상기 세포의 인식율을 증가시킬 것이다.
또다른 하나의 예는, 폴리뉴클레오티드가 헤르페스 비루스 감염 과정동안 전사되는 가닥과 반대 배향의 폴리뉴클레오티드 가닥에 결합된 프로모터를 포함하는 것이다. 이러한 종류의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 비루스 감염 세포는 감소된 양의 당단백질 B를 발현할 것으로 추정된다. 또한, 전사체는 비루스 유전자에 의해 전사된 상보 가닥과 하이브리드하여 전사체가 해독되지 못하게 하는 것 같다. 이러한 방법을 안티센스 요법이라 한다.
당단백질 B 활성을 보유하는 RFHV/KSHV 아과 폴리펩티드 및 이의 단편
도 1에 나타낸 RFHV 및 KSHV 폴리뉴클레오티드 서열은 각각 오픈 리딩 프레임을 갖고 있다. 암호된 폴리펩티드는 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4로 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 서열을 얻는데 사용된 프라이머 NIVPA 및 TVNCB의 하이브리드 영역 사이에서는 RFHV와 KSHV 간에 91% 동일한 당단백질 B 분자의 106개 아미노산 단편이 암호된다. KSHV 당단백질 B의 완전한 단백질 서열은 서열 번호 94에 나타내었다. RFHV/KSHV 아과의 제3 구성원인 RFHV2의 당단백질 B 단편은 서열 번호 97에 나타내었다.
상기 폴리펩티드는 기타 서열결정된 헤르페스 비루스의 당단백질 B 분자와 상동성인 다수의 잔기를 보유한다. 기타 다른 헤르페스 비루스의 공지 서열에는 포함되어 있지 않지만 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 포함된 최장 서열은 길이가 9개의 아미노산이며, 단 2가지(서열 번호 64 및 65)는 예외이다. 이보다 더 긴 정합부는 당단백질 B 아미노산 서열내의 다른 위치에서 발견되었다. 가장 긴 서열은 서열 번호 99에 기재된 bHV4 유래의 21개 아미노산 서열이며; 나머지는 모두 16개 아미노산 또는 그 이하의 길이이다. 서열 번호 99를 제외한 다른 서열들에서는, 17개 또는 그 이상의 아미노산 길이인 RFHV 및 KSHV 당단백질 B의 단백질 서열의 모든 단편이 각각 RFHV 또는 KSHV에, 또는 다른 근연성이 큰 균주들에 특이적인 것으로 추정된다. 정합 분절을 가진 bHV4와 다른 비루스들은 영장류를 감염시킬 수 있을 것으로 생각되지 않으므로, 서열 번호 4에 포함되어 있는 영장류내에서 발견된 약 10개 이상의 아미노산의 임의의 단편은 KSHV와 근연성이 큰 감염 인자의 존재를 나타낼 것이다.
본 발명은 RFHV/KSHV 아과의 헤르페스 비루스에서 유래한 천연 당단백질 B 및 상기 아과에 특이적인 이의 임의의 단편을 모두 제공한다. 본 발명의 바람직한 당단백질 B 단편의 길이는 10개 이상의 아미노산이며, 더 바람직하게는 약 13개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 약 17개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 약 20개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 약 25개 이상의 아미노산이고, 더욱 더 바람직하게는 약 30개 이상의 아미노산이다.
서열 번호 2, 4, 94 및 96에 기재된 RFHV 및 KSHV 당단백질 B 단편의 아미노산 서열을 이용하여 비루스-특이성 영역 및 교차 반응성 항원성 영역을 확인할 수 있다.
원칙적으로, 특이적 항체는 항체가 유도된 종들간에는 공유되지 않는 서열사이의 임의의 아미노산 차이를 인식할 수 있다. 항체 결합 부위는 일반적으로 항원의 5 내지 9개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있을 정도로 충분히 크며, 단일 아미노산 차이를 잘 인식할 수 있다. 특이적 항체는 상기 당단백질 B를 발현하는 비루스로 감염된 동물에서 동시에 발생하는 폴리클로널 반응의 일부분일 수 있다. 또한, 특이 항체는 천연 당단백질 B 또는 당단백질 B 단편을 실험용 동물에게 주사하므로써 유도할 수도 있다.
따라서, KSHV에 고유한 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 임의의 펩티드는 강력한 비루스-특이적 항원으로서, KSHV-특이적 항체에 의해 인식될 수 있을 것이다. 다른 헤르페스 비루스에는 공유되지 않지만 RFHV/KSHV 아과내에서는 공유되는 충분한 길이의 모든 펩티드는 강력한 RFHV/KSHV 아과 특이적 항원들이다.
몇몇 바람직한 펩티드의 예는 표 8에 나타냈다. 상기 펩티드의 길이에 약간의 변화를 가하고(또는), 상기 펩티드 프레임을 어느 한쪽 방향으로 몇몇 잔기 이동시키므로써 유사한 특이성을 보유하는 다른 펩티드를 제조할 수 있음은 당업자라면 쉽게 인식할 수 있을 것이다.
표 8에 나타낸 제I군의 펩티드는 감마 헤르페스 비루스 아과의 다른 특정 구성원들의 당단백질 B와 KSHV의 당단백질 B간에 보존적인 것이다. 따라서, 이 영역내의 상기 1종류의 당단백질 B에 대하여 유도되는 항체는 다른 일부 당단백질 B 와도 교차반응할 수 있을 것이다. 제II군의 펩티드는 RFHV 및 KSHV의 당단백질 B 사이에서 보존되나, 다른 감마 헤르페스 비루스에서는 보존되지 않는다. 이 영역에 대해 지향성인 항체는 RFHV, KSHV 및 RFHV/KSHV 아과의 다른 비루스들간에는 교차 반응하는 것으로 생각되지만, 이 아과 이외의 다른 헤르페스 비루스와는 교차 반응하지 않는다. 제III군의 펩티드는 RFHV, KSHV 및 다른 공지의 감마 헤르페스 비루스 당단백질 B 간에 상이한 것이다. 이 영역, 특히 이 영역중의 동일하지 않은 잔기에 대한 항체 결합은 RFHV 와 KSHV의 당단백질 B를 서로 구별하고, 근연성이 먼 헤르페스 비루스의 당단백질 B를 구별하는데 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
항원 펩티드
특이성 서열 길이 서열번호
제I군:RFHV/KSHV 아과와 일부 다른 감마 헤르페스 비루스중에 공유되는 펩티드 공유 서열 YRKIATSVTVYRG 13 64
bHV4
bHV4, mHV68 RYFSQP 6 66
bHV4 IYAEPGWFPGIYRVRIYAEPGWFPGIYRVRTTVNCE 1521 6599
mHV68 VLEELSRAWCREQVRD 16 100
제II군:RFHV/KSHV 아과중에 공유되는 펩티드 VTVYRG 6 67
AITNKYE 7 68
SHMDSTY 7 69
VENTFTD 7 70
TVFLQPV 7 71
TDNIQRY 7 72
제III군:비루스 특이성 펩티드1 특이 서열 RGMTEAARGLTESA 77 7375
RFHVKSHV
RFHVKSHV PVLYSEPPVIYAEP 77 7476
1 -임의의 기타 서열 결정된 헤르피스 비루스에 공유되지 않음; 몇몇 서열 결정되지 않은 RFHV/KSHV 아과 비루스 내에 존재할 수 있음.
제III군에서 특히 바람직한 펩티드는 하기 실시예 기술된 바와 같은 항원 에피토프에 대해 적당한 극성 특징을 가진 당단백질 B 의 영역을 포함하는 것이다. KSHV 및 RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들 유래의 당단백질 B의 완전한 서열이 제공되는 경우, 비루스-특이적 또는 아과-특이적 펩티드는 유사한 분석으로 그 분자의 기타 다른 영역도 예측할 수 있을 것이다.
폴리펩티드의 제조
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 몇몇 상이한 방법으로 제조할 수 있다.
예를 들어, 길이가 약 5 내지 50개 아미노산의 짧은 폴리펩티드는 서열 데이터로부터 화학 합성법으로 편리하게 제조할 수 있다. 바람직한 방법은 메리필드 고상법이다. 대안적으로, 목적 폴리펩티드를 암호하는 전령 RNA는 상기 기술된 방법중 하나의 방법을 사용하여 분리 또는 합성한 뒤, 토끼 망상적혈구계 같은 시험관내 해독 시스템을 사용하여 해독할 수 있다. 예컨대 문헌[Dorsky 등]을 참조 바란다.
전체 당단백질 B를 포함하는 보다 장쇄의 폴리펩티드는 적합한 발현 시스템으로 편리하게 제조할 수 있다. 예컨대, 총길이 cDNA의 암호 가닥은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결한 뒤, 발현 벡터에 삽입한 다음 적합한 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이어서, 상기 숙주 세포는 전사 및 해독이 가능한 조건 하에서 배양하고, 생성된 폴리펩티드를 회수한다. 다른 헤르페스 비루스 종으로부터 당단백질 B를 발현하고 회수하는 방법의 예는 미국 특허 제4,642,333호(Person); 제5,244,792호(Burke 등); Manservigi 등을 참조하라.
대부분의 목적에는, 세포 표면으로 수송하기 위한 시그널을 암호하는 영역은 포함하나, 단백질의 경막 도메인을 암호하는 영역은 결실된 재조합 당단백질 B 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 특히 편리하다. 이 폴리뉴클레오티드는 경막 암호 영역에 대해 5' 절두상이거나, 또는 세포외 암호 영역과 세포질 암호 영역은 모두 포함하나 경막 영역은 결실되어 있을 수 있다. 이러한 특성의 작제물은 세포로부터 용해성 형태로 분비될 수 있을 것이다. 당단백질 B 단편을 단량체로 얻는 것이 바람직한 경우에는 재조합체는 단백질의 처음 475 아미노산에 대하여 해독이 제한되도록 디자인할 수 있다.
예컨대, 효모중에서 상기 임의의 형태의 당단백질 B를 발현시키기 위해서는 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈수소효소(GAPDH) 프로모터 영역과 종결인자 영역을 사용하여 카세트를 제조할 수 있다. GAPDH 유전자 단편은 효모 라이브러리에서 동정하고, 분리하여 적당한 형태로 결찰시킨다. 이 카세트를 pBR322에 클로닝하고, 분리한 뒤 DNA 서열분석하여 확인한다. 또한, 당단백질 B 삽입체와 GAPDH 프로모터 및 종결인자 영역을 함유하는 pCI/I 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드를 사용하여 효모 균주 에스.세레비지에를 형질전환시킨다. 이것을 배양한 후, 효모 세포를 원심분리하여 수거하고, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 0.1㎍/㎖ 펩스타틴과 같은 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액에 재현탁시킨다. 이렇게 세척한 세포를 유리 비드를 사용하여 볼텍싱하여 붕괴시킨 뒤 재원심분리한다. 상청액내에 정확한 크기의 당단백질 B의 존재는, 예컨대 하기 단락에서 기술하는 바와 같이 제조된 당단백질 B에 대해 지향성인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 확인할 수 있다. 또한, 당단백질 B는 이온 교환 크로마토그래피, 항체 또는 기질을 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피를 비롯한, 표준 단백질 화학 기법을 조합하여 상청액으로부터 정제할 수 있다.
포유류 세포내에서 당단백질 B를 발현시키기 위해서는, 예컨대 pSV1/dhfr과 같은 포유류 발현 벡터를 사용할 수 있다. 이 벡터는 암피실린 내성 베타 락타메이스 유전자, 선택성 포유류 세포 표지인자, SV40 초기 프로모터에 결합된 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 가지고 있다. 이 pSV1/dhfr 벡터에 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 평활 말단 단편을 결찰시킨 뒤, 엔도뉴클레아제로 절단하여 SV40 프로모터, 당단백질 암호 영역 및 SV40 접목 부위와 폴리아데닐화 부위를 함유하는 카세트를 제공한다. 이 플라스미드를 사용하여, 예컨대 dhfr이 결실된 CHO 세포를 형질전환시키고, 형질감염체를 선택한다. 당단백질 B를 발현하는 세포는 예컨대 1차 항체로서 항-당단백질 B를 사용하는 면역형광법으로 확인할 수 있다.
또다른 예로서, 당단백질 B를 발현하는 재조합 플라스미드는 로우스 육종 비루스 장말단 반복 서열의 조절하에 에피솜 복제 벡터 pRP-RSV에 클로닝한다. 이 플라스미드는 복제 오리진과 인체 파포바비루스 BK의 초기 영역, 뿐만 아니라 dhfr 내성 마커를 함유한다. 그 다음 이 벡터는, 예컨대 인체 293 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 경막 내재 도메인이 결실된 당단백질 B 암호 영역을 사용하면, 배양 배지중으로 당단백질 B 폴리펩티드는 0.15 내지 0.25 pg/세포/일의 농도로 구성적으로 분비된다. 0.6 내지 6μM의 메토트렉세이트의 존재하에서는 에피솜 재조합체의 증폭으로 인하여 생산량이 10 내지 100배 증가할 것이다. 이러한 방식으로 제조된 당단백질 B는 특히 진단용으로서, 그리고 신규 및 재발성 헤르페스 비루스 감염에 대한 예방 백신 제조용으로 적당하다(Manservigi 등).
헤르페스 비루스 감염을 평가하기 위한 폴리펩티드의 이용
본 발명에서 구체화된 폴리펩티드는 수차례 상이한 방식으로 개체 내의 헤르페스 비루스 감염 상태를 검출 또는 평가하는데 사용할 수 있다.
한 방법으로서, 헤르페스 비루스 당단백질 B의 일부분을 암호하는 폴리펩티드를 이를 특이적으로 인식할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 분석용 시약으로서 공급한다. 예를 들어, 이러한 항체는 현재 헤르페스 비루스에 감염된 개체 또는 과거에 헤르페스 비루스에 감염되었었던 개체의 혈행에 존재할 수 있다.
혈행내에 당단백질 B에 대한 항체의 존재는 비루스 감염의 민감한 초기 징후를 제공할 것이다. 당단백질 B는 비루스 엔벨로프의 작용성 성분이므로 비루스 입자내에 격리된 다른 전사체들보다 다량으로 생산된다. 그 분포도 비루스 생활사중에 단지 일시적으로 나타나는 전사체들보다 광범위하다. 또한, 당단백질 B는 천연 비루스 뿐만 아니라 L 입자와 같은 비루스 감염 세포의 비감염성 생성물에 의해 발현될 수 있다. 각종 헤르페스 비루스중에서 유래된 당단백질 B는 강한 면역원성인 것으로 알려져 있다. 따라서, 개체중의 당단백질 B에 대한 항체의 검출은 개시된 활성 헤르페스 비루스 감염, 잠복 감염, 비루스 감염 노출 경력, 또는 당단백질 B 백신으로의 처리 징후일 수 있다.
항체 농도를 측정하기에 적합한 임상 샘플로는 감마 헤르페스 비루스에 감염된 것으로 생각되는 개체로부터 유래한 혈청 또는 혈장을 포함한다. 예를 들어, 상기 항체의 존재는 면역분석법으로 결정할 수 있다.
비루스 펩티드를 이용하는 항체의 정량 분석을 수행하기 위한 다수의 면역분석법은 당업계에 공지되어 있다(미국 특허 5,350,671; Houghton 등). 예를 들어, 특이 항체를 잠재적으로 보유하는 테스트 샘플은 비제한적인 소정량의 시약 폴리펩티드와 혼합할 수 있다. 상기 시약은 효소 또는 방사성 동위원소와 같은 직접 부착된 표지를 함유할 수 있다. 액상분석에서, 미반응 시약은 여과 또는 크로마토그래피와 같은 분리 기법으로 제거한다. 대안으로, 샘플내의 항체는 고체 상에서 시약으로 먼저 포획시킨다. 예를 들어, 이는 특이적 폴리펩티드, 항-면역글로불린 또는 단백질 A 일 수 있다. 이어서, 포획된 항체는 제 2 시약, 예를 들어 부착된 표지를 보유하는 특이적 폴리펩티드, 항-면역글로불린 또는 단백질 A를 이용하여 검출한다. 1종 이상의 포획 시약 또는 검출 시약은 특이적 폴리펩티드이어야 한다. 제 3 변형예에서, 상기 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 조직 절편은 항체를 함유하는 테스트 샘플로 일차로 도포할 수 있으며, 그 후 표지된 항-면역글로불린과 같은 검출 시약로 도포할 수 있다. 이들 모든 예에서, 상기 복합체 내에 포획된 표지의 양은 테스트 샘플 내에 존재하는 특이 항체의 양과 정(+)의 관계가 있다. 이와 유사한 분석법으로서 테스트 샘플 내의 항체가 제한된 양의 특이적 펩티드에 결합하기 위해 표지된 항체와 경쟁시키는 방법도 있다. 상기 복합체 내의 표지의 양은 테스트 샘플내 특이적 항체의 양과 부(-)의 관계가 있다. 이들 분석법중 임의의 분석법을 이용하여 획득한 결과를 테스트 샘플 사이에서 비교하고, 감염되지 않은 공급원에서 취한 대조용 샘플과도 비교한다.
시약 폴리펩티드를 적절하게 선택하므로써, 바람직한 특이성을 갖는 항체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 천연 당단백질 B 또는 헤르페스 비루스 사이에 보존된 영역을 포함하는 단편을 사용하는 경우, 상기 테스트 샘플 내에서 검출된 항체는 비루스 특이적이거나, 교차 반응성이거나 또는 둘 다일 수 있다. 다중-에피토프 시약은 헤르페스 비루스 감염에 대한 일반적인 항체 선별 분석법에 바람직하다. RFHV 또는 KSHV에 대해 유도된 항체에 특이적인 분석법을 제공하기 위해, 적합한 당단백질 B 분자의 비보존된 영역을 포함하는 항원 펩티드, 예를 들어 표 8의 제III군에 나타낸 펩티드를 선택한다. 이들 펩티드의 혼합물의 사용도 바람직하다. RFHV, KSHV 및 sHV1과 EBV가 아닌 감마 헤르페스 과와 매우 밀접한 비루스에 대한 항체를 동시에 검출하기 위해, 항원 펩티드는 표 8의 제II군에 나타낸 펩티드의 특성을 보유하는 것으로 선택한다. 이들 펩티드의 혼합물이 바람직하다.
헤르페스 비루스 감염 중에 자극된 항체는 일단 감염이 치유되면 감퇴하거나, 숙주의 면역학적 기억의 일부로 유지될 수 있다. 후자의 경우, 항체의 군을 결정하므로써 현재의 감염으로 인한 항체는 면역학적 기억에 의한 항체와 구별할 수 있다. 예를 들어, 테스트 샘플 내의 항체는 특이성 폴리펩티드를 이용하여 포획하고, 이어서 표지된 항-IgM 또는 항-IgG로 발색하는 분석법을 수행할 수 있다. 테스트 샘플 내에 있는 IgM 군의 특이 항체의 존재는 감염의 개시를 암시하지만, IgG 항체만의 존재는 이 활성이 이전 감염의 면역학적 기억 또는 백신접종에 기인하는 것임을 나타낸다.
항-비루스 제제를 디자인하거나 선별하기 위한 폴리펩티드의 이용
당단백질 B 유전자 또는 유전자 생성물을 이용한 방해는 감염 과정 또는 이 질병의 진전을 변화시킨다. 본 발명의 목적은 감마 헤르페스 비루스 감염의 치료에 유용한 약학 조성물 및 이러한 화합물을 사용하는 방법을 개발 및 테스트할 수 있는 방법을 제공함에 있다. RFHV, KSHV 및 RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들에 의한 감염의 치료에 유용한 약학적 화합물이 특히 바람직하다. 적합한 약제는 당단백질 B 유전자의 전사 또는 해독을 방해하는 것 및 상기 유전자에 의해 암호된 폴리펩티드의 생물학적 작용을 방해하는 것이다. 방해 기작이 공지되어야만 할 필요는 없으며; 단지 방해가 감염 과정과 관련된 반응보다 우선적인 것으로 충분하다.
바람직한 약물의 예로는 헤파란 설페이트 및 그 유사체 같은 표적 세포상의 기질에 대한 당단백질 B의 결합을 경쟁적으로 방해하는 약물을 들 수 있다. 또한, 비루스가 표적 세포의 투과와 같은 하나의 생물학적 기능을 발휘하는데 필요한 다른 비루스 엔벨로프 성분에 대한 당단백질 B의 모든 상호작용을 경쟁적으로 방해하는 약물이 바람직하다. 또한, 당단백질 B를 가교시키거나 또는 고정화시켜 이 당단백질 B가 기질에 결합하지 못하도록 하거나 비루스 감염에 큰 역할을 하는 모든 생물학적 작용을 수행하지 못하도록 하는 분자가 바람직하다.
본 발명은 임상적 용도로 사용하기에 적합한 약제를 결정하기 위해 대상(candidate) 약제들을 선별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 현재 알려진 항비루스 화합물 및 미래에 개발될 수 있는 항비루스 화합물에 대해 적용할 수 있다.
상기 방법은 활성 당단백질 B와 약제 시험 제제를 혼합하는 단계 및 이 약제 시험 제제에 의한 생화학적 기능의 변화 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 당단백질 B는 당단백질 B 활성을 보유하는 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B 유전자에 의해 암호된 임의의 단편일 수 있다. 적합한 단편은 상기 분자의 활성 부위를 암호하는 유전자적으로 조작된 폴리펩티드를 발현시키거나, 또는 프로테아제를 이용하여 상기 당단백질 B를 절단하고 활성 단편을 정제하므로써 수득할 수 있다. 바람직한 구체예에서는 완전한 당단백질 B를 제공하는 것이다. 또한, 상기 반응 혼합물은 단백질의 생물학적 활성을 측정하는데 필요한 다른 성분을 포함할 것이다. 예컨대, 기질 결합을 측정하는 분석법에는, 결합 반응을 용이하게 측정할 수 있도록 고상 지지체에 결합시킬 수 있는 헤파란 설페이트 또는 그 유사체를 구비할 수 있다.
선별 방법의 제 1 양태는 분리된 당단백질 B 또는 그 단편에 직접적인 약제 시험 제제의 결합을 직접 측정하는 것이다. 분자의 활성 부위에 결합하는 화합물은 당단백질 B 활성을 방해할 것으로 생각된다. 따라서, 전체 당단백질 B 또는 그 활성 부위를 포함하는 단편을 시험 제제와 혼합한다. 시험제제의 결합성은, 예컨대 이 시험제제를 방사능표지 형태 또는 안정한 방사능동위원소 표지된 형태로 제공하여 직접 측정할 수 있다. 당단백질 B에 결합된 표지의 존재는 예컨대 당단백질 B를 적합한 항체로 침전시키거나 또는 고상에 부착된 분자를 제공한 뒤, 반응 후 그 고상을 세척하여 측정할 수 있다. 당단백질 B에 대한 시험제제의 결합은 또한 형태적 변화로서 관찰할 수 있는데, 예컨대 차동 분광광도법, 핵 자기 공명 또는 환상 이색성에 의해 검출할 수 있다. 대안으로, 결합은 경쟁 분석으로 결정할 수 있으며; 예를 들어, 당단백질 B는 약제 시험 제제와 혼합한 후, 조절 서브유니트의 표지된 뉴클레오티드 또는 이의 단편을 첨가한다. 생화학적으로 관련된 부위에 대한 상기 대상 약물의 결합은 표지된 화합물의 후속 결합을 억제한다.
선별 방법의 제 2 양태는 기질 또는 기질 유사체에 대한 당단백질 B의 결합을 억제하는 약제 시험제제의 특성을 측정하는 것이다. 바람직한 유사체는 SepharoseTM비드와 같은 고상 지지체에 결합된 헤파린이다. 억제는 예컨대 당단백질 B에 방사능표지를 제공하고, 이것을 약제 시험 제제와 항온처리한 후, 여기에 친화성 수지를 첨가한 다음, 수지를 세척 및 계수하여 시험 제제가 결합된 방사능활성의 양을 감소시키는지를 결정하므로써 측정할 수 있다. 또한, 약학적 시험제제는 당단백질 B와 다른 헤르페스 비루스 단백질간의 상호작용을 경쟁적으로 방해하는 성질에 대해 시험할 수 있다.
선별 방법의 제 3 양태는 당단백질 B에 의해 매개되는 비루스 입자와 같은 활성 입자의 활성을 억제하는 약제 시험제제의 성질을 측정하는 것이다. 입자는 같은 기능을 매개할 수 있는 다른 성분이 아닌 당단백질 B를 발현하도록 조작한다. 그 다음 기질 결합이나 막 융합과 같은 생물학적 기능을 발현하는 입자의 성질을 약제 시험제제의 존재 및 부재하에 적당한 표적을 제공하여 측정한다.
또한, 본 발명은 이상적인 약물 설계에 의해 헤르페스 감염 치료를 위한 약제의 개발에 관한 것이다(참조: 예를 들어, Hodgson 및 Erickson 등). 본 구체예에서, 당단백질의 3차원 구조는 아미노산 서열에 기초한 예상 모델화 또는 바람직하게는 실험적 방법으로 결정할 수 있다. 실험적인 방법으로는 항체 지도화, 돌연변이 분석 및 항-유전자형의 형성을 들 수 있다. 특히 바람직한 방법은 X-선 결정학이다. 상기 당단백질의 3차원 구조, 특히 기질 결합 부위 주위의 중요한 아미노산기의 배향을 알고 있는 경우, 화합물은 새롭게 디자인하거나, 기존의 화합물을 적합하게 변화시킬 수 있다. 디자인된 화합물은 적합한 전하 평형, 소수성 및/또는 형태를 보유하여 당단백질 B의 활성 부위 주위에 부착할 수 있으며, 그 부위의 정상적인 생화학적 작용을 입체적으로 방해한다. 상기 방법에 의해 디자인된 화합물은 상기한 바와 같은 약물 선별 분석으로 후속적으로 시험하는 것이 바람직하다.
당단백질 B에 대한 항체 및 이의 제조
본 명세서에서 구체화한 당단백질 B 분자의 아미노산 서열은 감염된 숙주에게는 이종 물질이다. 다른 헤르페스 비루스 종 유래의 당단백질 B는 포유동물내에서 강한 면역원성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 예컨대, hCMV에 의한 감염의 일반적인 결과로서 항-당단백질 B가 인체내에서 형성된다. 이로부터 유추해볼때, RFHV, KSHV 및 RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들의 당단백질 B도 인체를 비롯한 포유동물내에서 면역원성일 가능성이 있을 것으로 추정된다. 이러한 추정은 하기 실시예에 기재되는 관찰들로 지지된다.
폴리펩티드에 대한 항체는 일반적으로 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조된다. 실험적으로 동물 내에서 항체 생성을 자극하기 위해서는, 글루타르알데히드와의 중합이나, 또는 프로인트 보조제와 같은 보조제와의 병용과 같은 기법에 의해 폴리펩티드의 면역원성을 증강시키는 것이 종종 바람직하다. 면역원은 적합한 실험 동물 내로 주입하는데, 모노클로널 항체의 제조를 위해서는 설치류에 주입하는 것이 바람직하고, 폴리클로널 항체를 제조하기 위해서는 토끼나 양과 같은 더 큰 동물에 주입하는 것이 바람직하다. 약 4주 후, 제 2 또는 추가 자극을 위한 주입을 수행하는 것이 바람직하며, 약 1주후에 항체원의 수거를 개시한다.
면역화된 동물로부터 수거된 혈청은 폴리클로널 항체원을 제공한다. 원료로부터 특이적 항체 활성을 정제하는 구체적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 필요에 따라, 상기 특이적 항체 활성은 단백질 A 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 및 고형 지지체에 커플링된 면역화 폴리펩티드의 칼럼에서 수행하는 면역 친화성 크로마토그래피와 같은 공지된 기법을 이용하여 추가 정제할 수도 있다.
천연 당단백질 B 또는 보존된 서열을 포함하는 단편으로 면역화하므로써 생성된 폴리클로널 항체는 헤르페스 비루스와 교차 반응성일 수 있다. 비루스 또는 아과 특이성인 항체는 적합하게 특이성인 항원, 예를 들어 표 8에 나타낸 항원으로 면역화하여 생성할 수 있다. 대안으로, 더 큰 단편에 대해 생성된 폴리클로널 항체는 예를 들어 이들 당단백질 B로부터 제조된 흡수제 상으로 항체를 통과시키고, 미결합 분획을 수집하므로써 기타 비루스 당단백질 B에 대한 원하지 않는 활성을 제거하므로써 특이성을 부여할 수 있다.
대안으로, 비세포(脾細胞)와 같은 면역 세포는 면역화된 동물로부터 회수할 수 있으며, 이를 사용하여 모노클로널 항체 생성 세포주를 제조할 수 있다(예를 들어, Harrow & Lane(1988) 미국 특허 4,472,500(Milstein 등) 및 미국 특허 4,444,887(Hoffman 등)).
개략적으로, 항체 생성 세포주는 특히 세포 융합 또는 항체 생성 세포를 EBV로 형질전환시키거나, 암유발성 DNA로 형질전환시키므로써 제조할 수 있다. 처리된 세포는 클로닝 및 배양하고, 바람직한 특이성의 항체를 생성하는 클론을 선택한다. 특이성 테스트는 배양 상청액에서 수행하는데, 표준 면역분석법에 검출 시약으로서 면역화 폴리펩티드를 사용하거나 또는 면역 조직 화학 분석에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포를 이용하는 것과 같은 다수의 기법을 이용하여 수행한다. 선택된 클론으로부터 모노클로널 항체의 공급은 다량의 조직 배양 상청액 또는 상기 클론을 주입한 숙주 동물로부터 적합하게 제조된 복수로부터 정제할 수 있다.
상기 방법의 효과적인 변형 방법으로는 상기 폴리펩티드를 이용하는 면역화를 분리된 세포에서 수행하는 방법을 들 수 있다. 항체 단편 및 기타 유도체는 상기 항체를 단백질 분해 효소를 이용하여 절단하는 것과 같은 표준 단백질 화학 방법으로 제조할 수 있다. 유전자적으로 조작된 항체의 변이체는 상기 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 수득한 뒤, 돌연변이를 도입하고 변이체를 해독하기 위한 분자생물학의 일반적인 방법을 적용하여 제조할 수 있다.
천연 당단백질 B 또는 보존 서열을 포함하는 단편을 주입하여 생성된 모노클로널 항체는 헤르페스 비루스 간에 교차반응성일 수 있다. 비루스 또는 아과 특이성인 항체는 적절하게 특이성인 항원, 예를 들어 표 8에서 선택할 수 있는 항원으로 면역화하므로써 생성할 수 있다. 대안으로, 비루스-특이성 클론은 선별 과정에서 표 8의 제III군에서 선택된 것과 같은 적합한 항원을 이용하여 클로닝된 하이브리도마로부터 선별할 수 있다.
헤르페스 비루스 당단백질 B에 대한 특이적 항체는 개발, 진단 및 치료 연구에 다양한 용도를 가지고 있다. 예컨대, 상기 항체는 약물 선별에 사용할 수 있다(미국 특허 제5,120,639호 참조). 또한, 항체는 수동 백신의 성분으로서, 또는 하기 단락에 기술하는 바와 같이 약물 표적화 및 생물학적 샘플중의 헤르페스 비루스 검출에 사용할 수 있다.
또한, 당단백질 B에 관한 항-유전형도 제조할 수 있다. 이것은 먼저 전술한 방법에 따라 당단백질 B 항체, 일반적으로 모노클로널 항체를 제조하여 실시한다. 그 다음 항체를 시험 지원자나 실험 동물중에 면역원으로서 사용하여 항-유전형을 유발시킨다. 이 항-유전형은 모노클로널 또는 폴리클로널일 수 있으며, 일반적으로 상기 제 1 항체에 사용했던 방법에 따라 생성시킨다. 항-유전형 또는 항-유전형을 발현하는 하이브리도마 클론의 선별은 양성 선택인자로서 면역원 항체를 사용하고, 음성 선택인자로서 무관련 특이성을 가진 항체를 사용하여 실시한다. 일반적으로, 음성 선택인자 항체는 폴리클로널 면역글로불린 제조물이거나 이 면역글로불린 군 및 그 아군에 속하는 모노클로널 면역글로불린을 함유하는 수집물, 및 면역원 항체와 동일한 종일 수 있다. 항-유전형은 당단백질 B에 대한 활성 백신의 대안적인 성분으로서 사용할 수 있다.
생물학적 샘플에 존재하는 당단백질 B를 검출하기 위한 항체의 이용
당단백질 B에 특이적인 항체는 예를 들어, 순수 조직 샘플 및 배양된 세포내에 존재할 수 있는 비루스 기원의 당단백질 B 폴리펩티드 및 이의 단편을 검출하는데 이용할 수 있다. 이러한 결정을 수행하기 위한 면역조직학적 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 조직은 동결, 여러 용매 교환, 파라포름알데히드와 같은 제제를 이용한 고정, 알콜과 같은 제제를 이용한 건조 또는 파라핀 또는 OCT와 같은 시판되는 매질내의 매립을 포함할 수 있는 기법을 병용하여 보존한다. 상기 샘플의 절편을 적절히 제조하고, 상기 단백질에 특이성인 일차 항체로 도포한다.
상기 일차 항체는 적합한 표지와 함께 직접 제공될 수 있다. 더 높은 빈도로 사용되는 방법은 용이하게 제조되거나, 시판되는 다수의 발색 시약중 하나를 이용하여 상기 일차 항체를 검출하는 방법이다. 전형적으로, 이들 발색 시약은 항-면역글로불린 또는 단백질 A이고, 이들은 플루오레세인과 같은 형광 마커, 적합한 화학 물질을 침전시킬 수 있는 퍼옥시다제와 같은 효소, 콜로이드성 금과 같은 전자 조밀한 마커 또는125I와 같은 방사성동위원소를 포함하는(그러나, 상기한 것으로 제한되지 않음) 표지를 보유한다. 이어서, 상기 절편을 적합한 현미경 기법을 이용하여 가시화하고, 표지화 수준을 감염 부위 주위에서 취한 세포 또는 멀리 떨어진 위치에서 취한 세포와 같은 대조용 세포와 비루스 감염이 예상된 세포사이에서 비교한다.
또한, 당단백질 B 유전자에 의해 암호된 단백질은 표준 정량적 면역 분석법으로 검출할 수 있다. 상기 단백질이 감염된 세포로부터 임의 인지가능한 양으로 분비 또는 발산되는 경우, 혈장 또는 혈청 샘플중에서 검출할 수 있다. 대안으로, 상기 표적 단백질은 순수 조직 샘플로부터 용해 또는 추출할 수 있다. 정량하기 전에, 상기 단백질은 필요에 따라 블롯 기법 또는 포획 항체의 이용법과 같이 고체 상에 부착할 수 있다.
정량을 위해 종래 기술에서 확립된 다수의 면역 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 상기 단백질에 특이성인 비제한적인 소정량의 시약 항체와 혼합할 수 있다. 상기 시약 항체는 효소 또는 방사성동위원소와 같이 직접 부착된 표지를 함유하거나, 항-면역글로불린 또는 단백질 A와 같은 제 2의 표지된 시약이 첨가될 수 있다. 고체상 분석법에 있어서, 미반응 시약은 세척하여 제거한다. 액체상 분석법에 있어서, 미반응 시약은 몇몇 다른 분리 기법, 예를 들어 여과 또는 크로마토그래피를 이용하여 제거한다. 상기 복합체 내에 포획된 표지의 양은 테스트 샘플내에 존재하는 표적 단백질의 양과 정의 관계가 있다. 상기 기법의 변형 기법은 경쟁 분석법이며, 여기에서 상기 표적 단백질은 특이 항체상의 결합 위치에 대하여 표지된 유사체와 경쟁한다. 이 경우, 포획된 표지의 양은 테스트 샘플내에 존재하는 표적 단백질의 양과 부의 관계에 있다. 이러한 분석법으로 수득한 결과는 테스트 샘플 및 감염되지 않은 공급원으로부터 취한 대조용 샘플간에 비교한다.
약물 표적화를 위한 항체의 이용
헤르페스 비루스 감염 치료에 항체를 사용할 수 있는 방법의 한 예는 작동인자 성분의 특이적 표적화이다. 일반적으로 비루스 감염된 세포는 비루스의 펩티드, 특히 비루스 엔벨로프 외측에 발현되는 단백질을 나타낸다. 따라서, 이 펩티드는 특정 항체가 결합할 수 있는 감염 세포에 대한 마커를 제공한다. 따라서, 상기 항체에 부착된 작동인자 성분은 감염된 세포 주위로 집중되며, 상기 세포에 대한 효과를 개선하며, 감염되지 않은 세포에 대한 효과는 감소시킨다. 또한, 상기 항체가 엔도시토시스를 유도할 수 있다면, 이는 상기 세포내로 작동인자의 도입을 증강시킬 것이다.
표적화를 위해, 비루스 폴리펩티드에 특이성인 항체(이 경우, 당단백질 B의 일정 영역)는 적합한 작동인자 성분과, 바람직하게는 공유 결합 또는 친화성인 높은 결합에 의해 결합한다. 상기 조성물내의 적합한 작동인자 성분은131I와 같은 방사성핵종, 독성 화학물질 및 디프테리아 독소와 같은 독성 펩티드를 포함한다. 다른 적합한 작동인자 성분은 안티센스 폴리뉴클레오티드, 필요에 따라 리포좀 내에 캡슐화된 안티센스 폴리뉴클레오티드이다.
진단 키트
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 또는 항체를 이용하는 진단 방법은 진단실, 실험실, 개업의 또는 개인에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 이들을 일괄하여 사용할 수 있는 진단 키트를 제공한다. 개체 내에 헤르페스 비루스의 존재는 개체로부터 취한 임상 샘플에서 그 샘플 내에 함유된 DNA, RNA, 단백질 또는 항체의 변화로 확인할 수 있다. 헤르페스 비루스의 존재로 귀착되는 이들 성분중 하나의 변화는 상기 건강한 개체로부터 취한 샘플내의 성분의 수준과 비교한, 상기 성분의 농도 증가나 감소 형태, 또는 상기 성분 형태의 변화로 나타난다. 상기 임상 샘플은 필요에 따라 테스트하려는 표적을 농축하기 위해 전처리할 수도 있다. 이어서, 사용자는 상기 키트내에 함유된 시약을 사용하여 진단 성분의 변화 또는 그 수준을 검출할 수 있다.
각 키트는 반드시 시험 과정에 특이성을 부여하는 시약을 포함한다: 표적 DNA 또는 RNA를 검출하기 위해 사용되는 시약 폴리뉴클레오티드; 표적 단백질을 검출하기 위해 사용되는 시약 항체; 또는 분석하려는 샘플 내에 존재할 수 있는 표적 항체를 검출하기 위해 사용되는 시약 폴리펩티드. 상기 시약은 상품 저장에 적합하고, 차후에 테스트를 수행하는 경우 반응 매질 내로 교환 또는 첨가하기에 적합한 고체 형태 또는 액체 완충액 형태로 공급된다. 또한, 적합한 포장이 제공된다. 상기 키트는 필요에 따라 상기 방법에 유용한 추가 성분을 보유할 수 있다. 이들 추가 성분으로는 완충액, 포획 시약, 발색 시약, 표지, 반응 표면, 검출 수단, 대조용 샘플, 지시문 및 사용 정보 등을 들 수 있다.
RFHV/KSHV 아과의 기타 구성원
RFHV 및 KSHV는 RFHV/KSHV 아과의 예시적인 구성원이다. 본 발명은 본 명세서에 기술한 바와 같은 상기 아과에 속하는 기타 구성원의 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열도 제공한다. 이러한 RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들에서 유래한 대응 폴리뉴클레오티드 단편을 특성 규명하는 데에는 본원에 기술된 콘센서스-축퇴성 감마 헤르페스 비루스 올리고뉴클레오티드 타입 1 및 2의 프라이머를 적합하게 디자인한다. 이러한 구성원은 원숭이를 감염시키는 RFHV2로 칭하는 다른 비루스이다. 이 비루스를 위한 서열을 암호하는 당단백질의 분절은 실시예 12에 기술하는 바와 같이 마카카 뮬라타(Macaca mulatta) 원숭이로부터 수득한 RF 조직으로부터 클로닝한다.
상기 과의 기타 다른 구성원을 동정 및 특성규명하기 위해, 본 발명의 시약 및 방법은 상기 비루스로 감염된 것으로 생각되는 조직 샘플로부터 추출한 DNA에 적용한다.
이러한 목적에 적합한 DNA 공급원으로는 인간 및 기타 척추동물에서 발생하는 광범위한 질환으로부터 수득한 생물학적 샘플을 들 수 있다. 이러한 인자가 감마 헤르페스 비루스 아과의 기타 구성원과 유사한 림프친화성인 것으로 생각되는 질환, 예를 들어 EBV 기원이 아닌 감염성 단핵종이 바람직하다. 더 바람직한 질환은 그들의 임상적 또는 조직학적 특징중 하나 이상이 RFHV 또는 KSHV와 관련된 질환인 것이다. 이들은 (a) 섬유증식이 질병 병인의 일부분이고, 특히 콜라겐 침전과 관련있는 질환, 및 섬유 조직이 와해되는 경우의 질환; (b) 혈관 형성 장애와 관련된 질환; (c) 악성 형질전환, 특히 림프구 계통의 세포에 제한되지 않는 악성 형질전환에 연루된 질환; (d) 질병의 빈도와 중함에 기여하는 면역결핍을 기초로하는 질환; (e) 기관 또는 전신의 다수 위치에서 특발적으로 발생하는 질환; (f) 유행 전염병학적 자료가 감염성 제제 또는 환경 제제와 관련된 질환을 포함한다. 이들 기준중 하나 이상의 기준을 충족시키는 질환이 더 바람직하다. 특히 바람직한 질환의 몇몇 예로는 복막후 섬유증, 결절성 섬유종증, 가성육종성 섬유종증, 섬유육종, 경화성 장간막염, 급성 호흡기 질환 증후군, 특발성 폐 섬유증, 여러 유형의 확산 증식성 사구체신염, 신경교종, 신경아세포종, 신경교증 및 모든 유형의 백혈병 및 림프종을 들 수 있다.
사용된 조직 샘플의 종류는 질환의 임상적 증후에 따라 달라질 것이다. 그 질환과 관련된 비루스를 함유할 가능성이 큰 샘플은 그 질환의 병리학과 관련된 부위 또는 비루스 지향성의 일부 다른 증거가 나타나는 부위로부터 채취할 수 있다. 또한, 감염된 개체의 말초 혈액 단핵 세포는 RFHV/KSHV 아과 비루스의 캐리어로서 작용할 수 있다. KSHV는 카포시 육종(Moore 등, 1995b) 및 캣슬맨 질환(Dupin 등)의 PBMC에서 검출되었다. 다른 적합한 공급원은 이 공급원으로부터 발생된 세포 배양물 및 이 공급원에서 얻은 비루스의 집적 또는 분리 제조물이다. 음성 대조 샘플로서, 동일 개체의 명백한 비감염 부위 또는 그 질환을 명백하게 앓고 있지 않은 정합성 개체로부터 얻을 수 있다.
RFHV/KSHV 아과의 구성원의 동정 방법은 본 발명의 방법 또는 시약을 단독 사용하거나 병용하여 수행하는 것이 바람직하다.
한 방법은 샘플에서 추출한 DNA로부터 헤르페스 비루스 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 방법이다. 이 방법은 예를 들어, PCR 과 같은 반응에서 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 실시할 수 있다. 제1 변형예로서, 증폭 반응은 표 4에 기재된 바와 같은 특이성이 광범위한 콘센서스-축퇴성 타입 1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 개시한다. 이 방법은 주로 감마형의 헤르페스 비루스를 증폭시킬 것이다. RFHV/KSHV 아과는 감마 헤르페스 비루스의 아군이므로,이 변형법으로 검출된 당단백질 B 서열은 더욱 특성규명하여 이것이 RFHV/KSHV 아과에 속하는지를 측정할 필요가 있다. 제2 변형예로서, 증폭을 표 7에 기재된 바와 같은 RFHV 또는 KSHV 특이적 타입 3 올리고뉴클레오티드 또는 이 비루스들에서 채취한 다른 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 분절을 사용하여 개시한다. 증폭은 올리고뉴클레오티드가 관련있는 비루스 종과 교차-하이브리드하도록 중간 내지 낮은 스트린젠시의 조건하에서 수행한다. 보다 바람직한 제3 변형예로서, 증폭 반응을 표 6에 기재된 바와 같은 RFHV/KSHV 아과 특이적인 타입 2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 개시한다. 적당한 하이브리드화 조건하에서, 이들 프라이머들은 이 아과에 속하는 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B를 우선적으로 증폭시킬 것이다.
당단백질 B 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 검출된 상기 아과의 바람직한 구성원들은 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 잔기 36 내지 354 사이에 있는 RFHV 또는 KSHV 당단백질 B 뉴클레오티드 서열과 65% 이상 동일한 것이다. 보다 바람직한 것은 약 67% 이상 동일한 것이고; 이보다 더 바람직한 것은 약 70% 이상 동일한 것이며; 이보다 더 바람직한 것은 약 80% 이상 동일한 것이고; 가장 바람직한 것은 약 90% 이상 동일한 것이다.
또한, 이 아과에 속하는 구성원들은 적합한 프로브를 사용하여 샘플의 폴리뉴클레오티드에 대해 하리브리드화 분석을 수행하여 동정할 수 있다. 시험되는 폴리뉴클레오티드는 임의적으로 하이브리드화 분석을 수행하기 이전에, 예컨대 타입 1 또는 타입 2 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 증폭시킬 수 있다. 그 다음, 적합하게 표지된 프로브와의 하이브리드화 반응으로 표적을 시험한다. 프로브는 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 RFHV 또는 KSHV 당단백질 B 서열에 함유된, 바람직하게는 21개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 25개 이상의 뉴클레오티드, 이 보다 더 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 것이 바람직하다. 이 보다 더 바람직하게는 프로브가 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 36 내지 354의 서열을 포함하는 것이다. 다른 바람직한 프로브는 표 6에 기재된 바와 같은 타입 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 하이브리드화 조건은 상기 프로브가 종래 서열결정된 헤르페스 비루스, 즉 특히 sHV1, bHV4, eHV2, mHV68, hEBV, hCMV, hHV6, hVZV 및 HSV1이 아닌 RFHV/KSHV 아과 비루스 유래의 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 서열과 하이브리드할 수 있는 조건을 선택한다. 이러한 조건하에서 시험 폴리뉴클레오티드와 안정한 이본체가 형성된다는 것은 RFHV/KSHV 아과의 구성원에서 유래된 폴리뉴클레오티드가 샘플중에 존재한다는 것을 암시하는 것이다.
또한, 이러한 아과의 구성원들은 제II군의 항체를 사용하여 동정할 수 있는데, 그 항체의 제조방법은 전술한 바와 같다. 제II군 항체는 RFHV/KSHV 아과의 구성원에 의해 생성된 항원들간에는 교차반응하나, 이 아과의 구성원이 아닌 헤르페스 비루스에 의해서 생성된 항원을 비롯하여 다른 항원들과는 교차반응하지 않는다. 새로운 아과의 구성원들에 대한 시험은, 예컨대 전술한 조건을 갖춘 개체로부터 제조한 조직 절편의 면역조직학적 연구에 상기 항체를 사용하여 수행한다. 조직 절편이 상기 항체에 의해 양성 염색되는 것은 아마도 그 조직의 비루스 감염에 기인하는, 샘플내에 RFHV/KSHV 아과의 구성원 유래의 당단백질 B의 존재를 암시하는 것이다. 또한, 조직 절편이 RFHV 및 KSHV 특이적인 제III군 항체와 비반응성인 경우에는, 조직내의 당단백질 B는 그 아과의 다른 구성원에서 유래하는 것일 수 있다. 이와 유사하게, 제II군 항체가 한 개체의 혈행중에서 발견된 경우에, 그 개체는 현재 또는 과거에 RFHV/KSHV 아과의 구성원으로 감염되었었음을 추정할 수 있다.
추정상의 새로운 비루스를 전술한 방법중 임의의 방법으로 동정한 경우에, RFHV/KSHV 아과중에서의 그 위치는 그 비루스의 당단백질 B 유전자의 일정 영역을 얻어 서열분석한 뒤, 그 서열을 아과 정의에 따라 RFHV 또는 KSHV의 서열과 비교하여 확인할 수 있다. RFHV/KSHV 아과의 새로운 구성원들에 대해서는 검출, 진단 및 약제 개발을 위해 본 발명의 다른 양태를 실시할 수 있다. 필요에 따른 새로운 아과의 구성원들에 대한 본 발명의 양태의 개조는 성질에는 미소한 변화를 나타내지만, 새로운 서열 자료에 의하면 명백한 것이거나, 통상적인 조정 측면에서는 분명한 것이다.
RFHV/KSHV 아과로부터 취한 당단백질 B의 변이 형태
또한, 본 발명은 RFHV/KSHV 아과에서 얻은 당단백질 B의 변이 형태를 제공한다.
HSV1 및 hCMV의 당단백질 B의 자연 발생 돌연변이 및 유도된 돌연변이에 대한 다수의 연구는 각종 생화학적 기능에 대한 그 분자의 특정 영역의 역할을 규명하기 위한 것이다. 예컨대, Reschke 등과 Baghian 등은 융합에 있어서 카르복시-말단 아미노산의 역할을 논하고 있고; Shiu 등 및 Pellett 등은 항체를 중화하기 위한 에피토프에 대해 논하고 있으며; Gage 등은 합포체 형성에 관련된 분자의 영역들에 대해; Navarro 등(1992)은 비루스 투과와 세포-세포간 전파와 관련된 영역에 대해; Quadri 등 및 Novarro 등(1991)은 생합성중의 당단백질 B의 세포내 수송과 관련된 영역에 대해 논하고 있다.
기재된 잔기들의 일부는 종래 연구된 비루스들의 당단백질 B 분자와 본원에 개시된 당단백질 B 분자 사이에 보존적일 수 있다. 이로부터 유추해볼 때, RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B에서 동일 잔기가 돌연변이되면, 다른 비루스들에서 개시된 바와 같은 유사한 효과를 나타낼 것으로 추정된다. 또는, 여러 당단백질 B 분자의 작용성 영역을 결합시켜 변화된 기능을 가진 당단백질 B 재조합체를 생성할 수도 있다. 예컨대, 병원성 비루스의 당단백질 B 유전자를 비병원성 비루스의 당단백질 B 유전자로 치환시키면 재조합체의 병원성을 감소시킬 수 있을 것이다(Kostal 등). RFHV/KSHV 헤르페스 비루스 아과의 당단백질 B의 돌연변이 및 재조합은 감염성, 복제 활성 또는 병원성중 어느 하나가 감소된 약독화 균주로 유도할 수 있다. 이러한 효과를 가진 당단백질 B 서열의 변화는 본 발명에 포함되는 것이다.
약독화된 헤르페스 비루스 균주는 예컨대 다가 백신을 개발하는데 유용한 것이다. 특히 개발국에서는, 몇가지 유효 병원체에 대한 면역 시스템을 동시에 자극할 수 있는 예방 백신의 제공을 요구하고 있다. 몇가지 상이한 병원체의 면역원성 펩티드를 발현시키도록 유전자 조작을 한 비루스로 상기 목적을 달성할 수 있다. 헤르페스 비루스는 거대 게놈이 펩티드를 암호하는 여분의 DNA 몇 킬로베이스를 용이하게 수용할 수 있기 때문에 특히 적절한 벡터일 수 있다. 비루스 벡터는 일부 생물학적 활성을 나타내고 숙주의 면역 시스템의 주의를 끌 수 있도록 충분히 손상되지 않은 것인 반면, 동시에 심각한 병을 유발시키지 않도록 충분히 약독화되어 있는 것이 이상적이다. 따라서, RFHV/KSHV 아과의 약독화된 비루스는 유사한 독성 형태에 대한 백신으로 유용할 수 있으며, 추가의 펩티드를 발현시키고 면역 보호 범위를 확장시키기 위해서 변형될 수 있다.
헤르페스 비루스의 약독화 형태의 또 다른 용도는 유전자 요법용 전달 매개체로서의 용도이다(Latchman 등, Glorioso 등). 효과적이기 위해서는 유전자 요법의 폴리뉴클레오티드가 표적 조직 부위로 전달되어야 한다. 섬유증 질병, 악성 종양 및 관련 증상의 치료시에는 기타 헤르페스 비루스를 비롯하여 RFHV/KSHV 아과의 약독화된 비루스 벡터가 감염된 조직을 표적화하는 수단을 갖기 때문에 기타 표적화 기작에 바람직하다. 이러한 일양태는, 비루스를 우선 약독화시킨 후, 전단락에서 요약한 바와 같이 유전자 요법을 위해 꼭 필요한 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변형시키는 것이다.
RFHV/KSHV 아과 백신중의 당단백질 B
감염성 비루스 및 감염 세포의 엔벨로프에 우위적으로 존재함으로 인한 당단백질 B는 면역 작동인자의 유용한 표적인 것으로 추정된다. 일반적으로 헤르페스 비루스 당단백질 B는 비루스를 중화시킬 수 있고 비루스가 복제 단계로 진행되지 못하도록 할 수 있는 항체를 생성시키는 면역원성이다. 또한, 당단백질 B는 숙주 세포내의 비루스 복제 부위를 공격하여 개시되는 비루스 감염의 근절을 도울 수 있는 T-세포 응답반응을 유인할 수 있다.
본 발명은 백신 조성물 및 RFHV/KSHV 아과 유래의 비루스에 의한 감염 방지 및 처리에 사용하기 위한 백신 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
일련의 양태들은 활성 백신에 관한 것이다. 이 조성물들은 당단백질 B에 대하여 치료받는 개체내의 면역 반응을 자극하도록 디자인하였다. 이 조성물들은 일반적으로 당단백질 B 분자, 이의 면역원성 단편 또는 그 변이체, 또는 당단백질 B 분자를 발현시킬 수 있는 세포 또는 입자를 포함한다. 대안적으로, 이 조성물들은 면역원성의 당단백질 B 단편(Horn et al.)을 암호하는 폴리뉴클레오티드를, 바람직하게는 발현 벡터 형태내에 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 백신은 선택적으로 리포좀 또는 비루스 벡터 입자와 같은 전달 매개체를 포함하거나, 또는 DNA 자체로서 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 면역원성 단편이 적당한 면역 세포 종류의 증식 및/또는 생물학적 기능을 자극하도록 제공된 형태로 디자인한다. 항체 응답 반응을 유도하는 것이 지향성인 조성물은 B 세포 에피토프를 포함하거나 암호하며, 또한 항원-발현 세포에 의한 흡수 및 발현을 향상시키거나, T 세포 도움을 복구시키는 다른 성분들을 포함하거나 암호할 수 있다. 헬퍼 T 세포, 특히 CD4+세포를 유인하는 것이 지향성인 조성물은 일반적으로 제II군 조직화합성 분자 측면에서 제공될 수 있는 T 세포 에피토프를 포함한다. 세포독성 T 세포와 이들의 전구체, 특히 CD8+세포를 자극하는 것이 지향성인 조성물은 일반적으로 제I군의 조직화합성 분자의 측면에서 제공될 수 있는 T 세포 에피토프를 포함한다.
헤르페스 비루스에 대한 향후의 노출에 대하여 개체를 예방하는데에는 항체 응답 반응이면 충분할 것이다. 예방 조성물에는 B 세포 응답 반응을 유도하는 성분을 포함하는 것이 바람직하다. 헤르페스 비루스 감염 개시의 성공적인 근절은 세포독성 T 세포, T 헬퍼-유도인자 세포 또는 이의 혼합물의 사용으로 이루어질 수 있다. 개시 감염을 치료하기 위한 감염치료제에는 T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포를 유도할 수 있는 성분을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 타입 2 헬퍼(TH2) 세포에 비해 타입 1 헬퍼(TH1) 세포를 우선적으로 자극하는 조성물이 보다 바람직하다. 활성 백신에 적합한 조성물의 제조 및 시험은 하기에 개략한다.
다른 일련의 양태들은 수동 백신 및 입양면역 전달하기 위한 다른 물질에 관한 것이다. 이 조성물에는 일반적으로 비루스 중화 또는 근절에 즉시 관여할 준비가 된 당단백질 B에 대한 특이적 면역 성분을 포함한다. 이러한 조성물을 사용하는 치료 방법은 비루스 노출 초기의 병인 결과를 예방하는데 바람직하다. 이 방법은 또한 활성 백신에 대해 충분한 면역 응답 반응을 유발시킬 수 없는 면역타협성 개체중에 사용하기에 바람직하다. 이러한 개체들로는 선천성 면역결핍증, 후천성 면역결핍증이 있는 개체(예컨대 HIV 감염 개체 또는 신장 투석을 받는 개체) 및 예컨대 코르티코스테로이드로 면역 억제 치료를 받는 개체들을 포함한다.
입양면역 전달시키기에 적합한 물질로는 하기 기술되는 바와 같은 당단백질 B에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 또한, 면역 세포의 입양면역 전달도 포함한다. 예컨대, 당단백질 B에 대해 반응성인 T 세포는 선택적으로 시험관내에서 클로닝되거나 배양된 뒤 조직화합성 수용체로 전이된 공여 개체로부터 취할 수 있다. 전이된 세포는 수용체에서 자가유래이고, 시험관내에서 자극되는 것이 보다 바람직하다. 따라서, T 세포는 처치될 개체로부터 정제하고, 당단백질 B의 면역원성 성분 및 비루스-특이적 세포를 유인하기에 적합한 자극 인자들의 존재하에 배양한 다음 재투여한다.
본원에서 구현된 특정 조성물은 활성 백신 및 수동 백신의 성질을 모두 가질 수 있다. 예컨대, 입양면역 전달에 의해 제공된 당단백질 B 항체는 헤르페스 비루스에 대한 직접적인 방어를 부여할 수 있으며, 또한 항-유전형 네트워크를 통해서나, 또는 비루스 항원의 면역 발현을 증강시켜 개시 응답을 자극할 수 있다.
당단백질 B 폴리펩티드를 함유하는 백신
당단백질 B에 대한 면역 응답 반응을 자극하는 백신의 특정 성분에는 천연 당단백질 B 분자 및 숙주내에서 면역원성인 당단백질 B의 단편을 포함한다.
천연 당단백질 B 및 이것의 긴 단편은 전술한 방법으로 제조할 수 있으며, 특히 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 발현 벡터로부터 정제하여 제조할 수 있다. 다른 비루스 균주로부터 분리된 당단백질 B는 방어적 면역 응답 반응을 자극할 수 있다(미국 특허 제5,171,568호; Burke 등). 바람직한 단편은 본래의 비루스 엔벨로프 외측에 노출된 분자 영역, 즉 성숙 단백질의 N-말단으로부터 약 650 아미노산내에 위치한 영역을 포함한 것이다.
당단백질 B의 글리코실화는 면역원성에 필요한 것은 아니다(O'Donnell 등). 따라서, 그 분자의 글리코실화 형태 및 비글루코실화 형태든지 간에 동일하게 바람직하다. 글리코실화는 표준 기법에 따라 측정할 수 있으며; 예컨대 시판용 엔도글리코시다제 타입 F 또는 H로 처리하기 전과 처리한 후의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 단백질 이동성을 비교하여 측정할 수 있다.
당단백질 B의 특정 에피토프를 포함하는 5개 내지 50개 아미노산의 소단편도 또한 적합한 백신 성분이다. 이 단편도 전술한 방법으로 제조할 수 있으며; 가장 편리한 방법은 화학 합성법이다. 바람직한 단편은 비루스 엔벨로프의 외측에 발현되고 면역원성인 것이다. 보다 바람직한 것은 세포 표면 수용체에 대한 결합이나 표적 세포내로의 비루스 침투와 같은 당단백질 B의 생물학적 기능과 관련있는 단편이다.
각종 에피토프들의 면역원성은 당업계에 알려진 연산방법으로 예측할 수 있다. B 세포 수용체에 대한 항원성 영역은 예컨대 가변 극성 영역을 동정하여 측정할 수 있다(Hopp et al., 실시예 9 참조). T 세포 수용체에 대한 항원성 영역은 예컨대 조직화합성 분자의 외면 홈내에 양쪽성 헬릭스를 형성할 수 있는 영역을 규명하여 측정할 수 있다. 또한, 항원성 영역은 다른 비루스 종의 당단백질 B 분자로부터 유추하여 동정할 수도 있다. 예컨대, 문헌, Sanchez-Pescador 등 및 Mester 등에 의한 HSV1의 B 세포 에피토프; Liu 등에 의한 hCMV의 HLA-제한 헬퍼 T 세포 에피토프; 및 Hanke 등에 의한 HSV1의 세포독성 T 림프구 에피토프들에 대해 참조하기 바란다.
각종 에피토프들에 대한 면역독성은 각종 기법들로 실험적으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기법들은 가능성이 큰 항원성 영역을 포함하는 5 내지 20 아미노산 길이의 단백질 단편을 제조하는 단계 및 이것을 특이적 생물분석법으로 시험하는 단계를 포함한다. 단편은 CNBr로 제조하거나(그리고) 당단백질 B의 보다 큰 분절을 단백분해적으로 붕괴시켜 제조한 뒤, 예컨대 겔 전기영동하고 니트로셀룰로스상에 블롯팅하여 정제할 수 있다(Demotz 등). 또한, 단편은 표준 펩티드 합성으로 제조할 수 있다(Schumacher 등, Liu 등). 바람직한 한 방법에서, 8 잔기가 중복되는 12개 아미노산의 연속 펩티드는 나일론 막 지지체상에서의 F-Moc 화학을 이용하여 성숙 당단백질 B 분자의 전체 세포외 도메인을 따라 합성한다(실시예 11 참조).
제조된 단편에 대한 반응성은 천연 비루스 또는 당단백질 B 성분에 노출된 개체로부터 얻은 샘플에 대하여 측정할 수 있다. 먼저, 개체에 당단백질 B 성분을 조심스럽게 투여하여 개체를 실험적으로 노출시킬 수 있다. 또는, 개체를 천연 발생의 비루스로 감염시킨 뒤, 바람직하게는 당단백질 B 또는 DNA 폴리머라제에 대한 비루스 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 양성 증폭 반응시켜 확인할 수 있다. 그 개체로부터 혈액 샘플을 채취하여 혈청, T 세포 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 표준 기법으로 제조할 수 있다.
혈청은 효소-결합된 면역흡착 분석법으로 당단백질 B 특이적 항체의 존재에 대하여 시험할 수 있다. 예컨대, 나일론 막과 같은 고체 지지체에 부착된 펩티드를 혈청과 함께 항온처리한 후, 세척한 다음, 효소 결합된 항-면역글로불린과 항온처리하고 효소 기질을 사용하여 발색시킨다. 특정 당단백질 B 펩티드에 대한 항체의 존재는 무관련 펩티드를 함유하는 웰중에서 보다 시험 웰중에 존재하는 고농도의 반응 생성물로 나타난다(실시예 11).
증식 분석법에서 당단백질 B 특이적 헬퍼 T 세포의 존재에 대하여 림프구 제조물을 시험할 수 있다. 약 2 x 104헬퍼 T 세포를 10-4내지 10-6M 농도의 펩티드와 항원 발현 세포로서 방사능조사된 자가유래 또는 방사능조사된 105PBMC 존재하에 항온처리한다. 배양한지 최종 16시간정도에 [3H]티미딘을 첨가한다. 그 다음 세포를 수거하고 세척한다. 펩티드 부재하에 배양된 세포중의 방사능활성에 비해 약 10배 수준인 세척된 세포의 방사능활성은 그 펩티드에 특이적인 T 세포의 증식을 반영하는 것이다(Liu 등). 필요한 경우, CD3+4+8-표현형을 가진 세포를 클로닝하여 헬퍼 T 세포 응답반응을 더욱 특성규명할 수도 있다.
림프구 제조물은51Cr 방출 분석법으로 당단백질 B 특이적 세포독성 T 세포의 존재에 대하여 시험할 수 있다. 표적은 발현성 당단백질 B 유전자를 포함하는 헤르페스 비루스로 동종이계 세포를 감염시켜 제조한다. 또는, 당단백질 B 발현 벡터로 형질감염된 동종이계 세포를 사용할 수도 있다. 표적을51Cr과 37℃에서 약 90분동안 항온처리한 다음 세척한다. 그 다음 약 5 x 104표적 세포를 10-4내지 10-5M의 펩티드 및 0.1 내지 2 x 104시험 T 세포와 37℃에서 30분동안 항온처리한다. 자발적인 용균으로 인한 상청액내로 방출된 실질적으로 상기 수준의 방사능활성은 CTL 활성을 반영하는 것이다. 필요하다면, CD3+4-8+표현형을 가진 세포를 클로닝하여 CTL 응답 반응을 추가 특성규명할 수도 있다.
당단백질 B 펩티드는 선택적으로 동일한 비루스의 다른 펩티드와 함께 백신중에 혼합할 수 있다.적합한 펩티드에는 당단백질 C, D, H, E, I, J 및 G와 같은 헤르페스 비루스의 임의의 다른 성분들의 펩티드도 포함한다. 또한, 당단백질 B 펩티드는 선택적으로 다른 비루스 유래의 면역원성 펩티드와 혼합하여 1종 이상의 병원성 유기체에 대한 다가 백신을 제공할 수 있다. 펩티드는 혼합하여 이 펩티드들의 혼합물을 용액으로 제조하거나, 또는 각종 펩티드 성분들이 결합된 융합 단백질로 합성할 수도 있다.
적합한 에피토프를 포함하는 당단백질 B의 형태는 특히 100개 이하의 아미노산을 포함하는 경우에는 선택적으로 면역원성이 증가되도록 화학적으로 처리할 수도 있다. 이러한 처리로는 예컨대 글루타르알데히드와의 가교, 즉 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드와 같은 단백질 캐리어에 결합시킨 형태를 포함할 수 있다.
상기 펩티드 또는 펩티드 혼합물은 순수 형태로 사용될 수 있으나, 물, 식염수, 생리적 완충 식염수 또는 당 용액과 같은 생리적 및 약리적 허용성 부형제와 혼합하는 것이 일반적이다.
바람직한 양태에 있어서, 활성 백신에는 또한 면역원의 발현을 증가시키거나 면역원에 대한 면역 반응을 증강시키는 보조제를 포함한다. 적합한 보조제로는 명반, 수산화 알루미늄, 베타-2 마이크로글로불린(WO 91/16924: Rock 등), 뮤라밀 디펩티드, 뮤라밀 트리펩티드(미국 특허 제5,171,568호; Burke 등) 및 모노포스포릴 지질 A(미국 특허 제4,436,728호: Ribi 등; 및 WO 92/16231: Francotte 등)를 포함한다. 인터루킨 2와 같은 면역조절제도 또한 첨가할 수 있다. 상기 펩티드 및 다른 성분(첨가된 경우)들은 선택적으로 리포좀이나 미소구에 캡슐화할 수도 있다. 각종 보조제들의 실험적 시험 개요는 미국 특허 제5,171,568호(Burke et al.)를 참조하라. 각종 보조제가 효과적일 수도 있다. 보조제의 선택은 그 보조제의 존재하에 백신 안정성, 투여 경로 및 특히 인체용으로 사용하고자 하는 경우 보조제의 조절 허용성에 따라 적어도 부분적으로 이루어질 수 있다.
폴리펩티드 백신은 일반적으로 광범위한 유효 허용 범위를 가지고 있다. 일반적인 투여 경로는 근육내이지만, 정맥내, 복강내, 경구, 비측 및 흡입을 비롯한 다른 여러 경로로 투여하는 것이 효과적인 제조물로 개발할 수도 있다. 근육내 제공되는 백신 투여량당 당단백질 B 폴리펩티드의 총 양은 일반적으로 10㎍ 내지 5㎎; 일반적으로 약 50㎍ 내지 2㎎; 보다 일반적으로 약 100 내지 500㎍일 것이다. 백신은 먼저 개시 투여량으로서 투여한 다음, 다시 통상 적어도 4주 이후에 부스타 투여량으로 투여하는 것이 바람직하다. 추가의 부스타 투여량은 주기적으로 응답 반응을 증강시키거나 회복시킬 정도로 투여할 수 있다.
당단백질 B를 발현하는 비루스 입자를 함유하는 백신
또한, 활성 백신은 당단백질 B의 면역원성 에피토프를 발현하는 입자로서 제조할 수 있다.
이러한 한 백신으로는 재조합 헤르페스 비루스의 L-입자를 포함한다(미국 특허 제5,284,122호: Cunningham et al.). 재조합 비루스의 게놈은 캡시드 성분이 결손되어 있거나, 또는 천연 비루스를 형성하지 못하도록 차단되어 있지만, L-입자를 제조하는 성질은 보유한다. 이 게놈을 유전자조작하여 재조합 비루스의 조절 성분에 작동가능하게 결합된 본 발명의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드를 함유시킬 수 있다. 그 다음 이 비루스를 예컨대 배양 세포중에서 증식시키고, FICOLLTM과 같은 적합한 구배상에서 원심분리하여 입자를 정제한다. 이러한 제조물에는 감염성 비루스가 없으며, 다수의 여러 바람직한 에피토프들의 펩티드 성분을 발현시킬 수 있다.
이러한 종류의 다른 백신에는 이종 항원으로서 본 발명의 당단백질 B를 발현하는 생비루스를 포함한다. 이러한 비루스로는 HIV, SIV, FIV, 말의 감염성 빈혈증, 비스나 비루스 및 다른 종의 헤르페스 비루스를 포함한다. 이 비루스는 처치되는 종중에서 천연적으로 비면역원성이거나; 또는 유전자 변화로 약독화시켜 복제 또는 독성을 감소시켜야만 한다. 헤르페스 비루스는 복제 관련 유전자, 예컨대 DNA 폴리머라제 유전자의 돌연변이로 약독화시킬 수 있다. 또한, 헤르페스 비루스는 당단백질 H와 같은 필수 후기 단계 성분의 결실로 약독화시킬 수 있다(WO 92/05263: Inglis 등). 생백신은 특히 단백질 발현을 증강시키는 경우에는 숙주내에서 저농도로 복제할 정도일 수 있지만, 처치되는 검체에 대해 임의의 병리학적 증후를 유발시킬 정도는 아니어야 한다.
생백신을 제조하기에 바람직한 비루스 종은 아데노비루스이다. 인체를 치료하기 위한 경우에, 인간 아데노비루스 타입 4 및 7은 어떤 부작용도 없는 것으로 밝혀졌으며, 벡터로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 본 발명의 당단백질 B 폴리뉴클레오티드는 예컨대 비루스 게놈의 E1 또는 E3 영역내로 유전자조작할 수 있다. HSV1 또는 HSV2 유래의 당단백질 B를 발현하는 아데노비루스 벡터는 고역가의 비루스-중화 항체 생산을 자극하는 것으로 알려져 있다(McDermott 등). 이 응답 반응은 각각의 생 비루스가 치명적 항원 투여되는 것에 대하여 실험 동물을 방어한다.
또한, 재조합 생 백신의 비루스로서 바람직한 것은 재조합 폭스 비루스, 특히 종두 비루스이다. 보다 바람직한 것은 예컨대 비필수 독성 인자에 관한 오픈 리딩 프레임을 결실 또는 삽입시켜 그 비필수 독성 인자를 불활성화 변화시킨 종두 비루스 균주이다(미국 특허 제5,364,773호: Paoletti 등). 백신을 제조하기 위하여 본 발명의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드를 비루스 게놈내에 유전자 조작하고 종두 비루스 프로모터의 조절하에 형질발현시킨다. 이러한 종류의 재조합체는 투여량 당 약 107내지 108플라크 형성 단위로 백신 접종에 직접 사용할 수 있다. 단일 투여량으로도 항체 응답을 충분히 자극할 수 있다. HSV1의 당단백질 B를 함유하는 종두 비루스 재조합체는 치명적인 HSV1 감염에 대하여 마우스를 보호하는데 효과적이다(Cantin 등).
이러한 부류에 속하는 다른 백신은 자가-조립성 복제-결손 하이브리드 비루스이다. 예컨대, WO 92/05263(Inglis 등)를 참조하라. 이 입자는 예컨대 캡시드 및 엔벨로프 당단백질을 포함하지만, 천연의 비루스 게놈은 포함하지 않는다. 본 발명에서 구현된 비루스 엔벨로프의 당단백질중 하나는 당단백질 B이다.
바람직한 양태로서, 입자는 복제하는 종의 게놈의 충분한 분절을 이종 유래의 캡시드 및 엔벨로프의 암호 영역과 함께 가진 제1 종의 비루스 벡터에 의하여 생산한다(미국 특허 제5,420,026호: Payne 참조). 제1 종의 유전자 성분은 그 벡터로 진핵 세포를 감염시킨 결과 복제-결손 입자로 자가 조립하는 캡시드 및 엔벨로프 당단백질을 생산할 수 있는 것을 선택한다. 이러한 양태의 일 변형예로서, 캡시드 및 엔벨로프 당단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 제 1 비루스 종에서 유래된 2가지 다른 벡터에 제공한다. 캡시드 암호 영역은 HIV, SIV, FIV, 말의 감염성 빈혈증 비루스 또는 비스나 비루스와 같은 렌티비루스에서 유래할 수 있다. 엔벨로프 암호 영역은 본 발명의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 모든 엔벨로프 성분은 헤르페스 비루스, 특히 RFHV/KSHV 아과의 비루스에 의해 암호된다. 결손 비루스 입자는 감수성 진핵 세포 주, 예컨대 BSC-40을 상기 벡터(들)로 감염시키고 약 18 시간 후 상청액을 수거하여 얻는다. 비루스 입자는 필요한 경우 슈크로스 쿠션을 통해 원심분리하여 더 정제할 수 있다. 또한, 입자는 백신으로 투여하기 이전에 40℃에서 24시간동안 0.8% 포르말린으로 처리할 수 있다.
약독화 생비루스 또는 비루스 유사체를 함유하는 백신은 동결건조할 수 있다. 선택적으로, 조직 배양 배지, 소르비톨, 젤라틴, 중탄산 나트륨, 알부민, 젤라틴, 식염수 용액, 인산염 완충액 및 멸균수와 같은 희석제를 포함할 수 있다. 다른 활성 성분으로서, 선택적으로 홍역, 유행성 이하선염 및 풍진의 약독화 균주등을 첨가하여 다가 백신을 만들 수 있다. 현탁액은 예컨대 가스 주입 기법으로 동결건조시킬 수 있다. 이것은 10 내지 18 Pa의 무수 멸균 아르곤으로 약 -45℃로 예비냉각시킨 동결건조실에 백신 바이엘을 놓고, 온도를 시간당 약 5 내지 25℃씩 +30℃까지 올린 다음, 완전 진공하에 2차 동결건조시킨 후, 바이엘을 아르곤하에서 통상적인 방식으로 밀봉하여 실시한다(EP 0290197B1: Mcaleer 등). 헤르페스 생 비루스를 함유하는 백신의 경우에, 최종 동결건조된 제조물은 2 내지 8% 수분을 함유하는 것이 바람직할 것이다.
본원에 기술된 것 외에도 다수의 대안적인 활성 백신 조성물은 특이적 B 세포 및 T 세포 면역성을 유도하는데 효과적일 수 있다. 이러한 조성물들은 모두 본 발명의 취지하에 구성될 수 있고, 다른 활성 성분으로서 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함해야만 한다.
당단백질 B 항체를 함유하는 백신
RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B에 대하여 지향성인 항체는 처치군에 대해 일정 수준의 체액 면역성을 즉시 부여하기 위한 입양면역 전달로 투여할 수 있다. 수동적으로 투여된 항-당단백질 B는 타협성 T-세포 면역성을 가진 개체에서도 다른 헤르페스 비루스로의 치명적 항원투여에 대하여 실험적으로 방어한다(Eis-Hubinger 등).
사용된 항체 분자는 방어가 필요한 당단백질 B에 대하여 특이적이어야만 한다. 이 항체 분자는 다른 항원들, 특히 처치되는 검체의 내인성 항원들과 교차반응하지 않아야 한다. 항체는 치료 대상에 따라 전체 RFHV/KSHV 아과(제II군 항체) 또는 특정 비루스 종(제III군 항체)에 대해 특이성일 수 있다. 항체는 다가 항원에 대해 약 108M-1이상; 보다 바람직하게는 약 1010M-1이상; 이보다 바람직하게는 약 1012M-1이상; 이 보다 바람직하게는 약 1013M-1이상의 총 친화성을 가질 것이다. 천연의 항체 분자, 재조합체, 융합 단백질 또는 항체 단편을 사용할 수 있으나; 천연 항체 작동인자 기능을 발현할 수 있는 천연 항체 분자 또는 재조합체가 바람직하다. 관련 작동인자 기능으로는 비루스 응집; 항체-의존적 세포의 세포독성; 보체 활성화; 및 옵소닌화를 포함하나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
항체는 상기 단락에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 전신 예방용으로서, 항체는 단량체인 것이 바람직하고, IgG 군이 보다 바람직하다. 점막 예방용으로서, 항체는 중합체, 바람직하게는 IgA군일 수 있다. 항체는 모노클로널 또는 폴리클로널일 수 있으며; 일반적으로 모노클로널 항체의 칵테일이 바람직하다. 또한, 제조물은 본래의 항체원으로부터 다른 생물학적 성분이 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 바람직한 활성의 다른 항체 분자 및 캐리어 또는 안정화제는 정제후 첨가할 수도 있다.
일부 경우에, 항체는 처치되어야만 하는 종의 항체와 가능한한 유사한 것이 바람직하다. 이것은 투여된 항체가 수용체의 면역 응답 반응의 표적이 되는 것을 방지하기 때문이다. 이러한 형태의 항체는 특히 검체가 활성 면역계를 갖고 있거나, 또는 항체가 반복 투여량으로 투여되어야만 하는 경우에 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 인체 유래의 항-당단백질 B 항체, 또는 인체화된 항-당단백질 B 항체를 제공한다. 폴리클로널 인체 항체는 각각의 RFHV/KSHV 아과 헤르페스 비루스로 종래 감염되었던 인체 개체의 혈청으로부터 또는 활성 백신이 투여된 지원자의 혈청으로부터 채취하여 정제할 수 있다. 모노클로널 인체 항체는 이러한 개체의 림프구로부터 생성되고, 예컨대 말초 혈액으로부터 얻을 수 있다. 일반적으로, 인체 하이브리도마는 전술한 방법에 따라 생성할 수 있다. 일반적으로, 안정한 인체 하이브리도마의 생산에는 복합적인 조작 기법, 예컨대 인체 골수종 세포주의 융합 및 예컨대 EBV로의 형질전환 기법을 필요로 할 것이다.
바람직한 방법에 있어서, 인체 항체는 작용성 인체 면역글로불린 좌를 가진 키메라성 비영장류 동물로부터 생산한다(WO 91/10741: Jakobovits 등). 비영장류 동물 균주(일반적으로 마우스)는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 바람직하게는 1종류 이상의 내인성 면역글로불린 경쇄를 발현시킬 수 없다. 이 동물을 인체 중쇄, 바람직하게는 인체 경쇄를 발현하도록 유전자 조작한다. 그 다음 이 동물을 헤르페스 비루스의 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B로 면역화시킨다. 그 후, 이 동물의 혈청을 사용하여 폴리클로널 항체를 제조하고, 그 림프구를 사용하여 통상적인 방식으로 하이브리도마를 제조할 수 있다. 적당한 선택과 정제 후, 생성된 항체는 목적하는 특이성을 가진 인체 항체이다.
또다른 바람직한 방법에 있어서, 당단백질 B의 바람직한 특이성을 가진 모노클로널 항체는 먼저 마우스와 같은 다른 종에서 발생시키고, 그 다음 인체화한다. 항체를 인체화하기 위해서는, 특이적 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 항원 결합 영역을 얻은 뒤, 무관련 특이성의 인체 면역글로불린의 폴리뉴클레오티드 암호 인자와 재조합한다. 또는, 특이적 항체의 뉴클레오티드 서열을 얻어, 이것을 사용하여 인체 특성을 가진 관련 서열을, 예컨대 화학 합성법으로 디자인하여 제조할 수 있다. 특이적 항체의 중쇄 불변부 또는 경쇄 불변부, 바람직하게는 그 둘다를 바람직한 군의 인체 면역글로불린의 불변부들로 치환시킨다. 또한, 상보성 결정 영역(CDR)의 외측에 있는 경쇄 및 중쇄의 가변부 분절도 인체의 대응 분절로 치환시키는 것이 바람직하다(EP 0329400: Winter).
보다 바람직하게는, 가변부의 분절을 인체 불변부로 치환시키는데, 단 이 분절이 항원 결합이나 결합 부위의 구조를 유지하는데 관련이 없는 것이어야 한다. 주요 아미노산은 예컨대 Padlan에 의해 개시된 바와 같이 동정할 수 있다. 하나의 특정 기법으로서(WO 94/11509: Couto 등), 공지의 면역글로불린의 서열 및 결정학 자료를 사용하여 위치 콘센서스 서열을 만든다. 이 모델 서열과 당단백질 B 특이적 항체의 아미노산 서열을 비교하고, CDR과 접촉하고 있거나 대향 사슬과 접촉하고 있는 항원 결합에 연관있는 아미노산을 동정한다. 필요한 경우에는 다른 아미노산으로 대체시켜 인체 면역글로불린 서열의 콘센서스에 대해 부합시킨다. 그 다음 인체화된 서열을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시켜 이것을 사용하여 본래의 항체 클론과 동일한 당단백질 B 특이성을 가진 인체화된 항체를 생산한다.
이러한 방법들중 임의의 방법을 사용하여 얻은 특이적 항체는 일반적으로 살균한 뒤, 약학적 상용성 부형제와 혼합한다. 또한, 0.3 몰의 글리신과 같은 안정화제 및 1:10,000의 티메로살과 같은 보존제를 첨가할 수도 있다. 이 현탁액은 예컨대 탄산 나트륨과 같은 중성 pH(∼7.0)로 완충시킬 수 있다. 역가는 예컨대 콘(Cohn) 냉 에탄올 분별화 절차에 의하여 정상 혈장 대량 수집물로부터 얻은 정상 인체 IgG를 첨가하여 선택적으로 조정할 수 있다. 알부민 용액과 같은 기타 다른 희석제를 대체물로서 사용할 수도 있다. 농도는 1회 투여량이 0.005 내지 0.2 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.06㎎/㎏이 되도록 조정한다. 1회 투여량은 활성 당단백질 B 백신을 투여하거나 대응 비루스로의 급성 감염으로부터 회복된 개체에서 발견되는 것에 상당하는 농도이거나, 또는 비루스의 병인학적 투여량으로의 항원투여에 대하여 방어적인 것으로 실험을 통해 알려진 농도로서, ELISA 또는 기타 다른 적합한 기법으로 검출되는 바와 같은 항-당단백질 B의 순환량을 산출하는 것이 바람직하다.
투여는 일반적으로 정맥내 주사가 아닌 근육내 주사로 수행해야만 하며, 주사 바늘이 혈관에 들어가지 않도록 주의해야 한다. 또한, 인체 글로불린 투여 이후 전신 알레르기 반응의 이력을 가진 개체에 대해서는 특별한 주의를 요한다. 예방용의 경우, 항체 제조물은 선택적으로 상기 단락에 기술된 바와 같은 당단백질 B의 활성 백신과 함께 투여할 수 있다. 노출 후 투여하는 경우에는, 항체 제조물은 노출된지 1주일 내에 투여하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 24 시간이내에, 또는 노출 후 가능한 한 즉시 투여되는 것이 바람직하다. 연속 투여량은 선택적으로 약 3개월 간격으로 투여할 수 있다.
본원에 기술된 모든 투여 기구, 사용된 조성물 양 및 적당한 투여 경로와 투여 계획은 처치되는 특정 개체의 임상적 상태와 요구조건에 따라 달라질 것이다. 특정 섭생의 선택은 궁극적으로 처치의 또는 수의사의 판단에 따른다.
상기 기술 내용을 통해 특히 헤르페스 비루스, 그 중에서도 RFHV/KSHV 아과의 비루스가 가진 당단백질 B 암호 영역이 어떻게 동정될 수 있고 그 서열이 어떻게 얻어지는 지를 상세하게 설명하였다. 또한, RFHV 및 KSHV의 당단백질 B 암호 영역에 대한 폴리뉴클레오티드 서열도 제공하였다.
본원에 개시된 RFHV 및 KSHV에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 본 연구에 사용된 조직 샘플에서 얻은 헤르페스 비루스 유래의 폴리뉴클레오티드내에 함유된 서열의 정확한 분석인 것으로 사료된다. 이 서열들은 다중 클론에서 얻은 서열 자료의 콘센서스를 나타낸다. 하지만, PCR과 같은 증폭 방법으로 얻은 서열은 증폭 결과로서 서열에 약간의 오차를 포함할 수도 있다. 오차율은 1회 측정의 경우 약 0.44% 내지 0.75% 사이인 것으로 추정되며; n회의 여러 결정치들 갖는 콘센서스를 √(n-1)로 나누면 대략 동일한 비율이 얻어진다. 그럼에도 불구하고, 오차율은 2% 이상으로 높을 수 있다. 증폭 오차가 없는 서열은 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 만들고, 관련클론을 선택하기 위해서 표 7에 제공된 것과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하며, 선택된 클론내에 DNA를 서열 결정하므로서 수득할 수 있다. 관련 방법론은 당업계의 일반 당업자에게 공지되어 있으며, 하기 실시예에 제시된 설명을 참조하기 바란다.
헤르페스 비루스의 대립유전자 변형체 및 일탈 변이체가 발생한다는 것도 인지해야 한다. 본 발명의 범주내에서 자연적으로 발생하거나, 우연히 또는 의도적으로 유도된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 분리하거나 또는 유도할 수 있다.
하기의 실시예는 당업자에게 추가적인 지침을 제공하려는 것이며, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 목적은 헤르페스 비루스중 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B 분자를 암호하는 신규 유전자의 생성물과 반응성이거나 이 유전자로부터 유도된 분리된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체를 제공하는 것이다. 이러한 과의 2가지 구성원은 복막후 섬유종증 관련 헤르페스 비루스(RFHV) 및 카포시 육종 관련 헤르페스 비루스(KSHV)이다. 이들을 재료로 하고 관련 방법을 사용하여 인간을 포함한 영장류의 헤르페스 비루스 감염을 진단 및 치료할 수 있다. 이들을 암호하는 분리 또는 재조합된 당단백질 B 단편 또는 폴리뉴클레오티드는 활성 헤르페스 백신의 성분으로서 사용할 수 있는 반면, 당단백질 B에 특이적인 항체는 수동 백신의 성분으로서 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 RFHV/KSHV 아과의 헤르페스 비루스가 가진 당단백질 B를 암호하는 영역을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 이 폴리뉴클레오티드는 각각 RFHV 및 KSHV 유래의 당단백질 B를 암호하는 319 뉴클레오티드 단편인 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 36 내지 354와 65% 이상 동일한 319개의 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 SHMDA(서열 번호 41)와 74% 이상 동일한 35개 뉴클레오티드 서열; 올리고뉴클레오티드 CFSSB(서열 번호 43)와 73% 이상 동일한 30개의 뉴클레오티드 서열; 올리고뉴클레오티드 ENTFA(서열 번호 45)와 72% 이상 동일한 29개의 뉴클레오티드 서열; 및 올리고뉴클레오티드 DNIQB(서열 번호 46)와 80% 이상 동일한 35개의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군중에서 선택되는 서열을 함유하고 당단백질 B를 암호하는 영역을 가진 분리된 폴리뉴클레오티드도 제공한다.
본 발명의 제2 양태는 상기 양태의 폴리뉴클레오티드가 가진 당단백질 B 암호 영역의 연속 뉴클레오티드를 21개 이상, 바람직하게는 35개 이상, 보다 바람직하게는 50개 이상, 보다 더 바람직하게는 75개 이상, 가장 바람직하게는 100개 이상 가진 단편을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 이 폴리뉴클레오티드는 영장류를 감염시킬 수 있는 비루스 유래인 것이 바람직하다. 또한, RFHV 및 KSHV 유래의 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드 단편도 포함된다. 또다른 양태로서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 92에서는 뉴클레오티드 36 내지 354 사이에 포함되어 있거나, 서열 번호 96에서는 임의의 위치에 포함되어 있으나, 서열 번호 98에는 포함되어 있지 않은 당단백질 B 암호 서열과 동일한 약 21개 이상의 뉴클레오티드의 선형 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 제3 양태는 상기 양태들중 임의의 양태에 의해 암호된 분리된 폴리펩티드이다. 또한, 본 발명은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 97에 기재되어 있거나 서열 번호 94(KSHV)에서는 임의의 위치에 포함되어 있으나, 서열 번호 99에는 포함되어 있지 않은 당단백질 B 단백질 서열과 실질적으로 동일한 17개 이상의 아미노산의 선형 서열을 함유하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 이것은 융합 폴리펩티드, 면역원성 폴리펩티드 및 글리코실화 형태와 비글리코실화 형태로 나타나는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 바람직한 항원 펩티드는 서열 번호 67 내지 76에 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 전술한 폴리펩티드들중 임의의 폴리펩티드를 암호하는 분리된 비자연 발생의 폴리뉴클레오티드, 클로닝 벡터, 발현 벡터 및 이로부터 유도된 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 복제하거나 적합한 숙주 세포내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명에서 제공된 당단백질 B 폴리펩티드 또는 본 발명에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 암호 영역내에서 암호된 당단백질 B에 특이적인 모노클로널 또는 분리된 폴리클로널 항체이다. 이 항체들은 RFHV/KSHV 아과의 구성원들에 특이적이고 관련성이 보다 먼 당단백질 B 서열, 특히 서열 번호 30 내지 41의 서열과 교차반응하지 않는다. 다른 당단백질 B 항체는 제9항의 폴리뉴클레오티드에 특이적이나, 서열 번호 30 내지 41의 임의의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드에 대해서는 특이적이지 않은 모노클로널 또는 분리된 폴리클로널 항체이다.
본 발명의 제5 양태는 약학적 상용성 부형제중에 본 발명의 폴리펩티드를 함유하고, 또한 선택적으로 보조제를 함유하는 백신을 제공한다. 다른 본 발명의 양태는 생비루스 또는 비루스 발현 벡터 형태일 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 백신이다. 또한, 본 발명은 약학적 상용성 부형제내에 본 발명의 항체를 함유하는 백신을 제공한다. 본 발명의 다른 양태는 헤르페스 비루스 감염을 예방적 또는 감염 개시동안 전술한 양태들중의 어느 하나의 양태를 투여하여 치료하는 방법이다.
본 발명의 제6 양태는 감마 헤르페스 아과, 즉 RFHV/KSHV 아과, RFHV와 KSHV의 당단백질 B 암호 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드, 특히 서열 번호 24 내지 63에 기재된 올리고뉴클레오티드이다. 또한, 본 발명은 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 1 종류 이상의 전술한 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하여 상기 폴리뉴클레오티드의 증폭 복사체를 얻는 방법을 제공한다. 증폭될 폴리뉴클레오티드는 복막후 섬유종증이나 카포시 육종 또는 림프구 계통의 악성종양 등을 비롯하여 섬유아세포 증식과 콜라겐 침착을 특징으로 하는 질환에 걸린 개체로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 제7 양태는 샘플내의 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하는 방법이다. 그 한가지 방법은 샘플내의 DNA 또는 RNA와 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 프로브를, 이 프로브가 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와는 안정한 이본체를 형성하나 RFHV/KSHV 아과 이외의 헤르페스 비루스 서열을 가진 폴리뉴클레오티드, 특히 서열 번호 5 내지 13과는 안정한 이본체를 형성하지 하는 조건하에서 접촉시키는 단계, 및 이와 같이 형성된 임의의 이본체의 존재를 검측하는 단계를 포함한다. 상기 언급한 조건은 상기 폴리뉴클레오티드를 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열과 택일적으로 접촉시키거나 이 둘모두와 접촉시킨 경우에는 안정한 이본체를 형성하나, 서열 번호 5 내지 13중 임의의 폴리뉴클레오티드와 접촉시킨 경우에는 안정한 이본체를 형성하지 않는 일군의 반응 매개변수로서, 예컨대 항온처리 시간, 온도, 용질 농도, 세척 단계이다. 또 다른 방법은 증폭 반응에서 프라이머로서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 샘플중의 DNA 또는 RNA를 증폭시키는 단계, 및 증폭된 모든 복사체의 존재를 검측하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 자연 발생의 비루스 또는 감염된 조직의 게놈에도 존재할 수 있는, 전술한 방법에 의해 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 제8 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체를 적합한 포장중에 함유하는, 예컨대 헤르페스 비루스에 감염된 것으로 추정되는 개체에서 얻을 수 있는 것과 같은 생물학적 샘플중의 헤르페스 비루스 감염과 관련있는 성분을 검측하기 위한 진단 키트이다. 또한, 본 발명은 개체에서 얻은 생물학적 샘플에 대해 본 발명의 시약, 방법 또는 키트를 적용하여, 개체의 감염을 검측하는 방법도 제공한다.
본 발명의 제9 양태는 감마 헤르페스 비루스에 감염된 개체를 치료하는데 사용하기 위한 치료 화합물 및 조성물이다. 또한, 본 발명은 유전자 치료용으로서 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 벡터를 함유하는 치료제도 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화합물과 본 발명에 제공된 폴리펩티드를 접촉시키는 단계 및 이 폴리펩티드의 생화학적 기능이 변화되었는지를 측정하는 단계에 의해 동정된 약학적 화합물을 제공한다. 또한, 당단백질 B 분자의 구조적 및 생화학적 특징을 기본으로 한 적당한 약물 디자인으로부터 얻은 약학적 화합물도 제공한다.
실시예 1: 헤르페스 비루스 당단백질 B를 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머
공지된 헤르페스 비루스 당단백질 B 분자의 아미노산 서열을 PIR 단백질 데이터베이스로부터 수득하거나, 또는 진뱅크(GenBank) 데이터 베이스로부터 수득한 DNA 서열로부터 유도하였다. 컴퓨터-보조된 정렬 프로그램 및 수작업으로 서열을 정렬하였다.
그 결과를 도 3에 제시하였다. 특히 감마 헤르페스 비루스중에서 비교적 보존성이 큰 영역을 동정하기 위하여 sHV1, bHV4, mHV68, EBV 및 hHV6 서열을 사용하였다. 증폭 프라이머를 디자인하기 위하여 9개의 영역을 선택하였다. 이들 영역에 대한 DNA 서열을 올리고뉴클레오티드 프라이머를 구성하는데 사용하였다. 프라이머는 3' 말단에 8-14 염기쌍의 축퇴성 분절, 및 5' 말단에 18-30 염기의 콘센서스 분절을 갖도록 구성하였다. 이는 최적 감도 및 특이성을 갖는 프라이머를 제공하였다.
상기 축퇴성 분절을 헤르페스 비루스 당단백질 B 서열의 가장 잘 보존된 영역에 걸쳐 확장시키고, 최소한의 수의 대체 코돈으로 둘러싼다. 따라서, 프라이머는 축퇴성 위치에서 대체 뉴클레오티드 잔기를 사용하여 합성할 수 있고, 최소한의 조합물을 형성할 수 있었다. 유도된 각 프라이머의 경우 256개 이하의 대체형이 있다.
콘센서스 분절은 당단백질 B 서열의 해당 인접 영역으로부터 유도되었다. 일반적으로, 콘센서스 분절은 분석된 모든 당단백질 B 서열의 각 위치에서 종종 유발되는 뉴클레오티드를 선택하므로서 유도하였다. 그러나, 안정한 이본체를 형성하는 프라이머의 능력을 최대화하기 위해서, C 또는 G 뉴클레오티드에 치중하여 선택하였다.
결과는 도 4-12에 나타나 있으며, 표 4에 요약되어 있다. PCR에서, "센스" 배향을 가진 것으로서 표 4에 기재된 올리고뉴클레오티드가 프라이머로서 작용하여 암호 가닥에 안티센스인 가닥과 하이브리드하고, 당단백질 B 암호 서열과 동일 방향으로 중합을 개시시킬 수 있다. "안티센스" 배향을 가진 것으로서 표 4에 기술된 올리고뉴클레오티드는 암호 가닥과 하이브리드한 뒤, 당단백질 B 암호 서열의 방향과 반대 방향으로 중합을 개시시킬 수 있다.
디자인한 서열에 따른 합성 올리고뉴클레오티드는 Oligos Etc, Inc.에 주문하여 얻었다.
실시예 2: DNA 추출
생검 재료는 AIDS로 진단 받은 인간 검체의 카포시 육종 병변으로부터 수득하였다. 재료는 파라포름알데히드에 고정시키고 파라핀에 매립시켰으며, 이는 일반적인 조직학 검사를 위한 과정이다.
파라핀 샘플의 단편을 1.5㎖ 에펜도르프 원뿔형 원심 분리관중의 500㎕의 크실렌으로 추출하였다. 샘플은 실온에서 5분 동안 부드럽게 요동시키고, 관은 에펜도르프 벤치-탑(bench-top) 원심 분리기에서 5분 동안 14,000rpm으로 원심분리하였다. 파스쳐 피펫으로 크실렌을 제거한 후, 95% 에탄올 500㎕을 첨가하고, 샘플을 재현탁시킨 후 재원심분리하였다. 에탄올을 제거하고, 세척 단계를 반복하였다. 이어서, 샘플을 약 1 시간 동안 공기-건조시켰다. 500㎕의 프로테인아제-K 완충액 (0.5% TWEENTM20, 세정제; 50mM 트리스 완충액 pH 7.5, 50mM NaCl) 및 5㎕의 프로테인아제 K(20mg/㎖)를 첨가하고, 3시간 동안 55℃에서 샘플을 배양시켰다. 상기 프로테인아제 K는 10분 동안 95℃에서 배양하므로서 불활성화시켰다.
KS 조직 유래의 DNA 샘플을 모아 증폭 반응을 위한 폴리뉴클레오티드의 일정 공급원으로서 사용하였다. 이 수집물은 본출원인이 소유권을 갖고 있는 미국 특허 출원 60/001,148호에 기술된 바와 같은 KSHV DNA 폴리머라제 서열의 증폭으로 검출되는 바와 같은 KSHV 유래의 DNA를 포함하는 것으로 알려져 있다.
실시예 3: KSHV 당단백질 B의 증폭된 분절의 수득
하기의 계획에 의하여 실시예 1에서 수득한 올리고뉴클레오티드를 실시예 2에서 KSHV 조직으로부터 추출한 DNA 분절을 증폭시키는데 사용하였다.
2㎕의 DNA 주형 수집물, 1㎕의 올리고뉴클레오티드 FRFDA(50pmol/㎕), 1㎕의 올리고뉴클레오티드 TVNCB(50pmol/㎕), 10㎕의 10× 완충액, 각 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs) 2.5mM을 함유하는 1㎕, 65㎕의 증류수, 및 65㎕의 광유를 사용하여 제 1 PCR 반응을 수행하였다. 퍼킨-엘머(모델 480) PCR 기계에서 혼합물을 80℃로 가열하였다. 이어서, 0.5㎕의 Taq 폴리머라제(BRL, 5U/㎕) 및 19.5㎕의 물을 첨가하였다. 하기 순서로 35 사이클의 증폭을 수행하였다: 94℃에서 1분, 어닐링 온도에서 1분, 및 72℃에서 1분. 어닐링 온도는 제 1 사이클에서 60℃, 그다음 50℃가 될 때까지 각 사이클 당 2℃씩 감소시켰다. 그 다음 사이클에서의 어닐링 온도는 50℃로 설정했다.
제 2 PCR 반응은 하기와 같이 수행하였다: 전단계의 반응 혼합물 1㎕에 올리고뉴클레오티드 NIVPA(50pmol/㎕) 1㎕, 올리고뉴클레오티드 TVNCB(50pmol/㎕) 1㎕, 10 × 완충액 10㎕, 1㎕의 dNTP, 66㎕의 물, 및 65㎕의 광유를 첨가하였다. 혼합물을 80℃로 가열하고, 19.5㎕물중의 Taq 폴리머라제 0.5㎕를 첨가하였다. 35사이클의 증폭을 전술한 바와 같이 수행하였다. PCR 생성물은 2% 아가로스 겔상에서 전기영동한 뒤 에티디움 브로마이드로 염색하여 분석하였다.
2차 증폭 절차는 14가지 시험 완충액을 사용하여 수행하였다. 5가지 완충액은 다른 헤르페스 서열을 통해 대략 유추 예상되는 크기의 PCR 생성물을 생성하였다. 이 완충액에는 WB4 완충액(10x WB4 완충액은 0.67M 트리스 완충액, pH8.8, 40mM MgCl2, 0.16M (NH4)2SO4, 0.1M β-머캅토에탄올, 1㎎/㎖ 소 혈청 알부민을 포함하며, 반응에는 1:10의 희석물을 사용한다)을 포함한다. 또한, WB2 완충액(WB4 완충액과 동일하나, 단 10x 농축물의 20 mM MgCl2를 포함함)도 시험하였다. 또한, 10 mM 트리스 pH 8.3, 3.5 mM MgCl2, 및 25 mM KCl; 또는 10 mM 트리스 pH 8.3, 3.5 mM MbCl2및 75 mM KCl; 또는 10 mM 트리스 pH 8.8, 3.5 mM MgCl2및 75 mM KCl(최종 반응 부피로 희석시켰을 때의 함유 농도)을 함유하는 완충액도 시험하였다. WB4 완충액이 가장 강한 밴드와 약간 희미한 추가 밴드를 나타냈다. 이것은 WB4 샘플중에서 형성된 표지된 폴리뉴클레오티드가 보다 다량으로 증폭한 것에 기인할 수도 있다.
WB2 완충액에 의한 증폭 생성물을 추가 연구를 위해 선택하였다. 방사능표지를 도입시키기 위하여 3차 증폭을 실시하였다. 최종적으로 사용된 올리고뉴클레오티드(TVNCB)는 감마32P-ATP로 말단 표지시키고, 1㎕를 종래 증폭 단계의 반응 혼합물 20㎕에, 2.5 mM dNTP 1㎕와 함께 첨가하였다. 이 혼합물을 80℃로 가열하고, Taq 폴리머라제 0.5㎕를 첨가하였다. 증폭은 94℃, 60℃ 및 72℃ 사이클을 5회 순환시켜 실시하였다. 반응은 Circumvent 서열결정 겔 키트에 함유된 장입 완충액 8.8㎕를 사용하여 중지시켰다.
방사능표지된 반응 생성물의 ∼4㎕ 일정량은 6% 폴리아크릴아미드 서열결정 겔상에서 51℃하에 1.5 시간동안 전기영동하였다. 이 겔을 1.5 시간동안 건조하고 12시간동안 노출시켜 자동방사능촬영하였다. 2개의 밴드를 확인하였다. 보다 큰 밴드가 다른 감마 헤르페스 비루스 서열로부터 유추해 볼때 그 단편인 것으로 예상되는 크기를 갖고 있었다.
이 밴드를 표시하여 절단해내고, TE 완충액(10 mM 트리스 및 1 mM EDTA, pH 8.0) 40㎕중에서 항온처리하여 DNA를 용출시켰다. 추출된 DNA를 가지고, 용출물 1㎕, 10x WB2 완충액 10㎕, 1㎕ 2.5 mM dNTP, 1㎕ 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머 제 2 군(NIVPA 및 TVNCB) 및 65㎕ 물을 사용하여 추가 증폭 반응을 수행하였다. 혼합물을 80℃로 가열한 뒤, 19.5 ㎕ 물중의 Taq 폴리머라제 0.5㎕를 첨가하였다. 증폭은 전술한 온도 단계 절차를 사용하여 35회 수행하였다.
실시예 4: KSHV 당단백질 B의 386 염기 단편의 서열
KSHV의 당단백질 B 유전자로부터 증폭된 폴리뉴클레오티드 단편은 다음과 같은 절차에 따라 정제 및 클로닝하였다.
증폭 생성물 40㎕를 2% 아가로스겔에서 전기영동시켜 정제하고, 에티디움 브로마이드 0.125㎍/㎖를 사용하여 염색하였다. 약 400 염기쌍의 단일 밴드를 절단해 내고, QIAGENTM겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
정제 PCR 생성물은 pGEMTM-t 클로닝 벡터에 결찰시켰다. 이 벡터를 사용하여 컴피턴트 박테리아(이.콜리 JM-109)를 형질전환시켰다. 증폭 DNA를 함유하는 박테리아 클론을 취하여 배양하였다. 박테리아는 용균하고 DNA를 페놀-클로로포름을 사용하여 추출한 다음 에탄올로 침전시켰다. 정확한 크기의 삽입체를 포함하는 콜로니를 사용하여 서열분석용 DNA를 얻었다. 클론 삽입체는 SEQUENASETM7-데아자 dGTP 키트에 함유된 벡터 특이적 올리고뉴클레오티드(순방향 및 역방향 프라이머)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 양 말단으로부터 서열결정하였다. 새로운 단편의 콘센서스 서열은 KSHV 당단백질 B 증폭 생성물의 5가지 클론으로부터 얻은 서열 자료를 혼합하여 얻었다.
프라이머 하이브리드 영역 사이의 단편의 길이는 319 염기쌍이었다. 그 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 3과 도 1에 도시하였다. 이로부터 암호된 폴리펩티드는 서열 번호 4로서 나타내었다.
도 13은 이 당단백질 B 유전자 단편과 이에 상응하는 다른 감마 헤르페스 비루스의 서열을 비교한 것이다. 단일 점(.)은 KSHV 서열 잔기와 동일한 다른 감마 헤르페스 비루스의 잔기를 나타낸다. 대시(-)는 암호된 단백질을 적절히 정렬시키기 위해 갭을 첨가한 위치를 나타낸다. KSHV 서열과 기재된 다른 임의의 서열간에 동일한 연속 뉴클레오티드의 가장 긴 스트레치는 14이다. 짧은 보존 서열은 단편을 통해 분산되어 있다. 전체적으로, 폴리뉴클레오티드 단편은 KSHV 및 이것과 가장 가까운 헤르페스 비루스 서열, sHV1 및 bHV4간에 63% 동일하였다.
이 서열 데이터를 사용하여 길이가 20 내지 40 염기쌍의 타입 3 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다. 프라이머들은 당단백질 B를 암호하는 다른 서열분석된 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하는 것이 아니라 KSHV 당단백질 B 폴리뉴클레오티드와 우선적으로 하이브리드하도록 디자인하였다. 이러한 종류의 프라이머는 상기 표 7에 기술한 바와 같다.
도 14는 동일한 당단백질 B 유전자 단편에 암호되는 추정상의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 아미노산 수준에서, KSHV와 종래 공지된 감마 헤르페스 비루스, bHV4 간에는 2개의 짧은 분절이 공유하고 있다. 그 하나(서열 번호 64)는 길이가 13개의 아미노산으로, 단편의 N 말단 부근에 위치한다. 다른 하나(서열 번호 65)는 길이가 15개의 아미노산으로, 단편의 C 말단 부근에 위치한다. KSHV와 다른 감마 헤르페스 비루스간에 공유된 모든 다른 분절들은 9개 이하의 아미노산이다.
실시예 5: RFHV 당단백질 B의 386 염기 단편의 서열
조직 표본은 워싱톤 대학의 지역 영장류 연구 센터(University of Washington Regional Primate Research Center)에서 입수한 머카크 내매스트리나 원숭이의 종양으로부터 얻었다. 이 표본을 포름알데히드로 고정시키고 파라핀에 침지시켰다. 이 표본으로부터 실시예 2의 절차에 따라 DNA를 추출하였다.
DNA 제조물중의 RFHV 폴리뉴클레오티드의 존재는 DNA 폴리머라제 유전자에 하이브리드하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 반응을 수행하여 측정하였다. 이 절차의 세부 사항은 본 출원인이 소유권을 갖고 있는 미국 특허 출원 60/001,148호에 기술되어 있다. 이러한 방식으로 측정된 RFHV 폴리뉴클레오티드를 함유하는 DNA 추출물을 모아서 본 연구에 사용하였다.
RFHV 폴리뉴클레오티드를 함유하는 DNA 제조물은 당단백질 B 콘센서스-축퇴 올리고뉴클레오티드 FRFDA 및 TVNCB를 사용하는 PCR 증폭 반응 및 그 다음 올리고뉴클레오티드 NIVPA 및 TVNCB를 사용하는 2차 증폭 반응에 주형으로서 사용하였다. 반응 조건은 실시예 3과 실질적으로 동일하게 사용하였고, 단 WB4 완충액만이 초기 공급원중의 DNA 양과 사용된 조건을 사용하여 실질적으로 확인가능한 밴드를 생성하였다. 증폭된 DNA의 표지화는 전술한 바와 같이32P 말단 표지된 NIVPA로 실시하였고; 생성물은 6% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하고 자동방사능사진 촬영으로 확인하였다. 약 386 염기쌍과 약 10 mol wt 이상의 콘카터머(concatemer)에 상응하는 일련의 밴드를 관찰하였다. 동시 전개시킨 KSHV 단편과 동일한 이동성을 가진 386 염기쌍 밴드를 겔로부터 절단해내어 추출하였다.
이 추출물중의 DNA가 특이적 증폭 반응으로부터 얻어졌는지를 측정하기 위하여, NIVPASQ 단독, TVNCBSQ 단독 또는 2개의 프라이머를 함께 사용하여 PCR을 수행하였다. 완충액 조건은 초기 증폭 반응에 사용된 것과 동일하였다. 이 혼합물을 80℃까지 가열한 뒤, Taq 폴리머라제를 첨가하고, 증폭은 온도 감소 절차를 사용하여 35회 순환시켰다. 이론상으로, 특이적 증폭 반응은 1 종류의 프라이머가 사용되는 경우 선형으로 생성물을 축적하며, 역배향의 2종류 프라이머를 사용하는 경우에는 지수적으로 축적한다. 따라서, 특이성은 2종류의 프라이머를 사용하는 반응에서 보다 다량의 생성물의 생성으로 나타나지만, 3종류의 혼합물 모두에서 동일한 생성물의 생성은 비특이적 증폭이 일어남을 암시하고 있다. 이러한 시험 반응에서 얻은 증폭 생성물은 에티디움 브로마이드로 염색하는 아가로스 겔상에서 분석하였다. RF 추출물은 NIVPASQ 반응 생성물을 전혀 나타내지 않고, 적당한 이동성을 나타내는 TVNCBSQ 반응물의 중간 농도의 염색 밴드와 2종류 프라이머를 함께 사용했을때의 생성물에 대한 강한 염색 밴드를 나타냈다. 이와 병행하여 분석된 KSHV 단편의 경우에는, NIVPASQ 반응물에 대한 희미한 밴드, 2종류 프라이머를 함께 사용한 경우에는 강한 염색 밴드를 나타냈고, TVNCBSQ 반응물에 대해서는 어떤 밴드도 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 RF 추출물내에 존재하는 386 염기쌍 밴드가 특이적 증폭 생성물이라고 결론지었다.
따라서, 2종류의 프라이머를 사용하여 증폭시킨 RF 추출물 40㎕를 2% 아가로스 겔상에서 정제용으로 전개시키고, ∼386 염기쌍 밴드를 절단해내었다. QIAGENTM키트를 사용하여 아가로스를 제거하고, 생성물은 이.콜리내에 클로닝한 뒤, 실시예 4에서와 같이 서열분석하였다. 동일한 증폭 RFHV 생성물로부터 얻은 3개의 다른 클론으로부터 콘센서스 서열을 분석하였다.
RFHV 당단백질 B 단편의 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)은 도 1에 KSHV의 대응 서열과 함께 정렬시켰다. 또한, 이로부터 암호된 RFHV 아미노산 서열(서열 번호 2)도 나타내었다. 프라이머 하이브리드화 영역(뉴클레오티드 36-354) 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열은 76% 동일하고; 아미노산 서열은 91% 동일하였다. 내부 시스테인 잔기와 추정상의 N-결합된 글리코실화 부위는 상기 두 비루스간에 보전적이었다.
상기 서열 자료를 사용하여 길이가 20 내지 40 염기쌍인 타입 3 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다. 이 프라이머들은 서열분석된 다른 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하는 것이 아니라 RFHV 당단백질 B 폴리뉴클레오티드와 우선적으로 하이브리드하도록 디자인하였다. 이러한 형태의 프라이머는 표 7에 이미 기재한 바 있다.
도 15는 당단백질 B 유전자 단편의 뉴클레오티드 36 내지 354에 의해 암호된 추정상의 아미노산 서열을 비교한 것이다. KSHV 서열과 관련하여, RFHV와 종래 공지의 감마 헤르페스 비루스, bHV4간에 2개의 짧은 분절이 공유하였다. RFHV와 다른 감마 헤르페스 비루스간에 공유된 모든 다른 분절들은 길이가 9개 이하의 아미노산이었다.
도 16은 입수용이한 자료가 있는 헤르페스 비루스들중에 존재하는 동일한 당단백질 B 단편에 대한 서열 자료를 정렬시킨 것이다. 도 17은 도 16에 도시된 부분 당단백질 B 아미노산 서열을 따라 동일성의 정도를 기초로 하여 작성한 헤르페스 비루스간의 계통발생학적 관련성을 도시한 것이다. 제시된 비루스들중에서 RFHV와 KSHV가 아미노산 상동성면에서 bHV4, eHV2 및 sHV1과 가장 근연성이 컸다.
실시예 6: RFHV/KSHV 아과의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브
RFHV 및 KSHV에서 얻어진 폴리뉴클레오티드 단편을 기초로 하여, 7가지 타입 2 올리고뉴클레오티드를 디자인하여 RFHV/KSHV 아과의 구성원들에 대한 PCR 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서 사용하였다.
4가지 콘센서스-축퇴성 타입 2 올리고뉴클레오티드, SHMDA, CFSSB, ENTFA 및 DNIQB는 이 서열들이 유래된 서열을 따라 도 17에 도시하였다. 실시예 1의 올리고뉴클레오티드 같이, 이 서열들은 5' 말단에 콘센서스 분절을, 3' 말단에 축퇴 분절을 가지고 있다. 하지만, 이 올리고뉴클레오티드는 RFHV 및 KSHV 서열에만 기초하고 있고, 따라서, RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B와만 우선적으로 안정한 이본체를 형성할 것이다. 예시적인 타입 2 올리고뉴클레오티드의 목록은 표 6에 제시한 바 있다.
여러 타입 2 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향을 갖고 있다. 역배향을 가진 프라이머를 PCR 증폭에 함께 사용할 수 있다. 또는, 모든 타입 2 올리고뉴클레오티드를 역 배향의 타입 1 올리고뉴클레오티드와 함께 사용할 수 있다.
실시예 7: 업스트림 및 다운스트림 당단백질 B 서열
또다른 서열 자료를 얻기 위하여 증폭 반응을 더 수행하였다. KSHV DNA의 공급원으로서, 실시예 2에 따라 제조된 동결 조직 블록이나 파라핀 침지된 조직 형태의 카포시 육종 조직, 또는 체강 림프종과 같은 KSHV 병인에 의한 암에서 발생된 세포주를 사용하였다. 또한, 배양물중에서 전파되는 KSHV도 적합하다(Weiss 등).
암호 가닥의 5' 방향으로 서열 자료를 더 얻기 위한 일반적인 전략은 5' 프라이머로서 상기 단편으로부터 업스트림에 하이브리드하는 콘센서스-축퇴(타입 1) 올리고뉴클레오티드를, 3' 프라이머로서 가장 근연성이 큰 비루스-특이적(타입 3) 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하여 증폭 반응을 수행하는 것이다. 따라서, 증폭 사이클중 1차 사이클은 예컨대 프라이머의 제1세트로서 FRFDA 및 TNKYB를 사용하여 실시하였다. 이 사이클 다음에는, 선택적으로 프라이머의 제2 세트로서 예컨대 FRFDA 및 GLTEB를 사용하여 수행되는 2차 증폭 사이클을 실시할 수 있다.
사용된 반응 조건은 실시예 3 및 4에 기술된 바와 유사하다. 이 반응은 WB4 완충액중에서 실시예 3에 기술된 온도 감소 절차를 사용하여 실시한다. 2차 증폭 사이클 후, 생성물을 감마32P-ATP로 말단 표지시킨 최후 사용된 비루스 특이적 올리고뉴클레오티드(이 경우에는 GLTEB)를 사용하여 표지시켰다. 표지된 생성물을 6% 폴리아크릴아미드 전기영동하고, 다른 헤르페스 비루스로 유추 예상되는 바와 같은 적당한 크기에 상응하는 밴드를 절단하였다. 이것을 재증폭 후, 생성물을 전술한 바와 같이 정제, 클로닝 및 서열분석하였다. 새로운 단편에 대한 콘센서스 서열은 대략 3가지 측정치들의 결과를 복합하여 얻었다.
암호 가닥의 3' 방향으로 서열 자료를 더 얻기 위하여, 5' 프라이머로서 가장 근연성이 큰 비루스-특이적(타입 3) 올리고뉴클레오티드와 함께 3' 프라이머로서 상기 단편으로 부터 다운스트림에 하이브리드하는 콘센서스-축퇴(타입 1) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭을 수행하였다. 한 예로서, 증폭 사이클중 1차 사이클은 NVFDB 및 TVFLA를 사용하여 실시한 다음, 선택적으로 NVFDB 및 SQPVA를 사용하여 2차 사이클을 수행하였다. 증폭 및 서열분석은 전술한 바와 같이 수행하였다. 신규 서열을 사용하여 센스 배향의 타입 3 올리고뉴클레오티드를 더 디자인하였고, 이것을 다른 다운스트림-하이브리드 타입 1 올리고뉴클레오티드(예컨대 FREYB 및 NVFDB)를 사용하여 서열 자료를 더 얻었다. 또는, 3' 방향으로의 서열 자료는 역방향의 타입 1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 더 얻었고; 예컨대 FRFDA, NIVPA, TVNCA, NIDFB, NVFDB 및 FREYB로 구성된 군중에서 선택되는 2개의 프라이머를 사용하고, 또다른 프라이머를 네스트형 증폭을 위해 선택할 수 있다.
최후의 다운스트림 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 3' 의 서열 자료를 얻기 위하여, CYSRA와 같은 타입 1 프라이머, 또는 TVFLA와 같은 타입 3 프라이머를 DNA 폴리머라제 유전자의 5' 말단쪽으로 하이브리드하는 프라이머와 함게 사용할 수 있다. RFHV 및 KSHV와 관련있는 헤르페스 비루스의 DNA 폴리머라제 유전자에 하이브리드하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 본출원인이 소유권을 갖고 있는 미국 특허 출원 60/001,148호에 기술되어 있다. DNA 폴리머라제 암호 영역은 당단백질 B 암호 영역에 대해 3'에 위치해 있다. 이러한 프라이머 조합을 사용하여 수행한 PCR은 당단백질 B 암호 영역의 3' 말단, 존재할 수도 있는 임의의 중재 서열 및 DNA 폴리머라제 암호 영역의 5' 말단을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 것으로 추정된다.
이 전략은 다음과 같이 수행하였다:
당단백질 B의 KSHV 암호 서열을 함유하는 DNA는 RiGr이라고 표시한 동결 카포시 육종 샘플 및 BC-1이라고 표시한 체강 림프종 유래의 세포주로부터 제조하였다.
완전한 5' 서열을 얻기 위하여, 당단백질 B의 업스트림인 것으로 추정되는 암호 서열에 대하여 타입 1 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하였다: 즉, 캡시드 성숙 유전자(CAPMAT). 또한, 다른 비루스에서 유래하는 CAPMAT의 공지 서열을 사용하여 비교적 보전성인 영역을 동정하고, 당단백질 B의 센스 배향으로 CAPMAT와 하이브리드하는 FENSA라고 표시한 콘센서스-축퇴 프라이머를 디자인하였다. 타입 1 올리고뉴클레오티드 프로브는 당단백질 B의 다운스트림인 것으로 추정되는 암호 서열에 대하여 디자인하였다: 즉, DNA 폴리머라제 유전자. 이러한 올리고뉴클레오티드를 표 9에 기재하였다.
헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드를 검출, 증폭 또는 특성규명하기 위해 사용한 추가의 타입 1 올리고뉴클레오티드
표적: 헤르페스 비루스, 특히 감마 헤르페스 비루스 유래의 캡시드/성숙 유전자
명칭 서열(5' 에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
FENSAC GCCTTTGAGAATTCYAARTAYATHAAR 27 48 센스 77
FENSAG GGGTTTGAGAATTCYAARTAYATHAAR 27 48 센스 78
표적: 헤르페스 비루스, 특히 감마 헤르페스 비루스 유래의 DNA 폴리머라제 유전자
명칭 서열(5' 에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
CVNVB TAAAAGTACAGCTCCTGCCCGAANACRTTNACRCA 35 64 안티센스 79
증폭은 전체 당단백질 B 암호 영역에 걸친 센스 및 안티센스 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. 얻어진 단편을 표 10에 기재하였다.
형성된 KSHV 당단백질 B 단편
단편 길이 위치
1 NIVPA → TVNCB 0.39 kb 본래 단편
2 FENSA → VNVNB 0.9 kb CAPMAT를 따라 단편 1의 5'
3 TVNCA → FREYB 2.3 kb 단편 1'의 3'
4 FAYDA → FREYB 0.65 kb 단편 1의 3'
5 SQPVA → HVLQB 2.5 kb DNA 폴리머라제를 따라 단편 1의 3'
6 FREYA → SCGFB 1.1 kb DNA 폴리머라제를 따라 단편 2의 3'
증폭 및 서열분석에 사용된 프로토콜은 다음과 같다: PCR 증폭은 프라이머 쌍(예, FREYA 및 SCGFB)과 함께 DNA 주형을 사용하여 실시하였다. 94℃에서 45초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 45초의 사이클을 35회 실시하고; 그 다음 최종 신장 단계로서 72℃에서 10분간 실시하였다. 예상 길이를 가진 PCR 생성물을 퀴아겐에서 입수한 QIAQUICKTMPCR 정제 키트를 사용하여 아가로스 겔 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 2차 증폭 사이클로 재증폭시켰다. 2차 사이클은 대안적으로 네스트형 또는 비네스트형 방식으로 실시하였다. 일 실시예로서, 2차 증폭은 FREYA 및 SCGFB 또는 FREYA 및 HVLQB를 사용하여 수행하였다. 35 사이클의 증폭은 94℃에서 45초, 65℃에서 45초 및 72℃에서 45초간 수행하였고, 그 다음 최종 신장 단계를 72℃에서 60분간 실시하였다.
PCR 생성물을 Novagen PT7 BLUETM벡터에 결찰시키고, 노바블루 컴피턴트 이.콜리를 형질전환시켰다. 결찰과 형질전환은 노바겐 프로토콜에 따라 수행하였다. M13 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 콜로니를 선별하였다. Quiaquick 플라스미드 분리 키트를 사용하여, 5㎖ LB 브로스에서 37℃하에 하룻밤동안 성장시킨 PCR 양성 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였다. M13 순방향 및 역방향 서열분석 프라이머를 사용한 플라스미드의 수작업 서열분석은 USB Sequenase 키트 프로토콜(USB)에 따라 실시하였다. 자동 서열분석은 ABI법으로 수행하였다.
생성된 KSHV 서열로서 추가의 KSHV-특이적 타입 3 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 타입 3 올리고뉴클레오티드는 각종 쌍의 조합물로, 또는 타입 1 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하여 KSHV DNA의 구역을 PCR 증폭, 클로닝 및 서열분석하였다. 사용된 타입 3 올리고뉴클레오티드는 표 11에 기재하였다:
당단백질 B를 암호하는 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드를 검출, 증폭 또는 특성규명하기 위해 사용한 추가의 타입 3 올리고뉴클레오티드
표적: KSHV 유래의 당단백질 B
명칭 서열(5' 에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
GAYTADTYSBAIYGBVTECACEHYBDLGGBDLGGARAPPA TGTGGAAACGGGAGCGTACACTCAGACAAGAGTACGTGTCGGTACAGGTCGACCGTAGATGGCCACCATTTCCGTGACCGAGTGTGATGAAGTAGTGTTCGCAGGGATGCCACCCAGGTCCGCCACGTGGCGGACCTGGGTGGCATCCGTAGATCGCAGGGCACCTCC 2121212121212121 11111111 센스안티센스안티센스센스안티센스안티센스센스센스 8081828384858687
표적: KSHV 유래의 DNA 폴리머라제 유전자
명칭 서열(5' 에서 3') 길이 형태 수 배향 서열 번호
GEVFBHVLQBSCGFB GTCTCTCCCGCGAATACTTCTGAGGGCCTGCTGGAGGACGTGCGGTGGAGAAGCCGCAGGATG 212121 111 안티센스안티센스안티센스 888990
도 18은 KSHV DNA와 하이브리드하는 올리고뉴클레오티드들의 위치를 나타내는 지도이다. 사용된 약어는 다음과 같다: d 또는 h = 헤르페스비루스 서열과 하이브리드하는 콘센서스-축퇴 프로브(타입 1), sq = 유용한 부가 서열결정 테일, g = 감마 헤르페스비루스와 하이브리드하는 프로브(타입 1), f = 헤르페스비루스의 KSHV/RFHV 과와 하이브리드하는 프로브(타입 2), ks = KSHV에 특이적인 프로브(타입 3).
도 19는 특성규명된 단편들 각각의 서열 자료를 수집하여 얻은 콘센서스 서열을 기재한 것이다. 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 91)을 도시하고 있다. DNA 폴리머라제 암호 서열 이전의 영역을 포함하는 뉴클레오티드 1 내지 3056(서열 번호 92)은 본 발명의 일 양태이다. 이 콘센서스 서열은 카포시 육종 샘플 RiGr과 림프종 세포주 BC-1에서 얻은 자료의 콘센서스를 나타내는 것인데, 각 샘플과 각 유전자 분절에 대하여 다수의 클론들을 서열분석하였다. 각 위치마다 약 3 내지 9회의 결정치간에 수행되었다.
또한, 도 19에는 3개의 오픈 리딩 프레임(서열 번호 93 내지 95)의 아미노산 해독을 도시하고 있다. 암호된 CAPMAT 단백질 단편(서열 번호 93)은 여러 상에서 당단백질 B 암호 서열(서열 번호 94)의 5' 말단에 중첩한다. 또다른 업스트림에서 CAPMAT 암호 서열은 엡스타인 바아 비루스의 RNA 폴리머라제 2에 대한 결합 부위와의 상동성면에서 볼때 당단백질 B 전사에 대한 조절 인자를 포함하는 것으로 추정된다. 이 도면에서 상기 추정상의 프로모터 영역에 밑줄을 그어 표시하였다. 당단백질 B 암호 서열의 3' 말단에는, 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 비해독 서열이 있다. 또한, 다운스트림에는 DNA 폴리머라제 단편의 암호 서열을 포함한다(서열 번호 95).
당단백질 B 암호 서열을 GenBank중의 다른 서열과 비교하는 경우, 다른 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B 서열과만 상동성이 발견되었다. 20개 이하의 뉴클레오티드로 된 간헐적인 서열은 여러 헤르페스 비루스들에 공유되었다. 서열 ATGTTCAGGGAGTACAACTACTACAC(서열 번호 98)은 eHV2와 공유되었다. 이 서열 이외에, KSHV 암호 영역의 21개 이상의 뉴클레오티드로 된 분절은 다른 종래의 공지 서열과 비교해볼때 그 고유성이 분명하였다.
당단백질 B 암호 서열내에서, 카포시 육종 샘플을 사용하여 얻은 서열 자료와 체강 림프종 세포주를 사용하여 얻은 서열 자료간에 폴리뉴클레오티드 수준에서 4가지 대립유전자 변이체가 발견되었다. 이들은 도면에 화살표로 표시하고 있다. 이 변이체들중 하나를 제외한 모든 변이체는 침묵 변이체이다. 4번째 변이체는 유전자 생성물중에서 프롤린 대 로이신의 차이를 나타낸다.
KSHV 당단백질 B 유전자에 의해 암호된 단백질 생성물은 다음과 같은 특징을 갖고 있다: N 말단의 한 도메인이 다른 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B의 시그널-펩티드 도메인("선도")에 상응한다. 다른 헤르페스 비루스들에서 공지된 서열과 함께 완전한 KSHV 당단백질 B 아미노산 서열을 도 3에 도시하였으며, 상동성 영역을 나타내었다. 헤르페스 비루스 당단백질 B 서열간에 고도로 보존성인 잔기들은 별표(*)로 표시하였다. 다른 헤르페스 비루스 당단백질 B 서열중에서 보존적인 시스테인 잔기들도 KSHV 서열중에 존재하였고, 또한 부가 내부 이황화 결합을 형성하여 입체 구조를 안정화시키는 2개의 시스테인을 더 포함하고 있다("·"로 표시함). 또한, KSHV 당단백질 B 서열은 다른 헤르페스 비루스의 당단백질 B의 대응 서열에 상응하는 추정상의 막-내재 도메인을 갖고 있다.
RFHV의 완전한 당단백질 B 서열도 유사한 방법으로 수득하였다. RFHV DNA의 공급원은 워싱톤 대학 지역 영장류 연구 센터에서 입수한 감염 원숭이로부터 유사하게 제조한 조직을 사용하였다. DNA는 실시예 5에 기술된 바와 같이 추출하였다.
암호 가닥의 5' 방향으로 서열 자료를 더 얻기 위하여, 5' 프라이머로서 상기 단편으로부터 업스트림에 하이브리드하는 콘센서스-축퇴(타입 1) 올리고뉴클레오티드를, 3' 프라이머로서 가장 근연성이 큰 비루스-특이적(타입 3) 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하여 증폭 반응을 수행하였다. 따라서, 증폭 사이클중 1차 사이클은 예컨대 프라이머의 제1세트로서 FRFDA 및 AAITB를 사용하여 실시하였다. 이 사이클 다음에는, 상기와 동일한 프라이머를 사용하거나, 또는 네스트형 프라이머 세트, FRFDA 및 GMTEB를 사용하여 수행되는 2차 증폭 사이클을 실시할 수 있다. 사용된 증폭 조건은 KSHV에 기술된 바와 유사하다.
암호 가닥의 3' 방향으로 서열 자료를 더 얻기 위하여, 5' 프라이머로서 가장 근연성이 큰 비루스-특이적(타입 3) 올리고뉴클레오티드와 함께 3' 프라이머로서 상기 단편으로부터 다운스트림에 하이브리드하는 콘센서스-축퇴(타입 1) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭을 수행하였다. 한 예로서, 증폭 사이클중 1차 사이클은 NVFDB 및 VEGLA를 사용하여 실시한 다음, NVFDB 및 PVLYA를 사용하여 2차 사이클을 수행하였다. 증폭 및 서열분석은 전술한 바와 같이 수행하였다. 신규 서열을 사용하여 센스 배향의 타입 3 올리고뉴클레오티드를 더 디자인하였고, 이것을 다른 다운스트림-하이브리드 타입 1 올리고뉴클레오티드(예컨대 FREYB 및 NVFDB)와 함께 사용하여 서열 자료를 더 얻었다.
폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열 자료는 RFHV 및 KSHV의 당단백질 B를 서로 비교하고, 다른 헤르페스 비루스의 당단백질 B와 비교하는데 사용하였다. 이 RFHV 및 KSHV 서열을 사용하여 실시예 6에서와 같이 또다른 아과-특이적인 타입 2 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다.
실시예 8: DNA 라이브러리 유래의 당단백질 B 서열
완전한 당단백질 B 서열은 감염 조직의 DNA 라이브러리를 생성시켜 얻거나 확인할 수 있다. 본 연구의 DNA 공급원은 실시예 7에서와 동일한 것을 사용하였다.
DNA 용해물은 프로테이나제 K로 절단하고, 페놀-클로로포름으로 DNA를 추출하였다. 충분한 투석 후, 제조물을 Sau3AI 제한 엔도뉴클레아제로 부분 절단하였다. 이 절단물을 슈크로스 구배상에서 원심분리하고, 약 10 내지 23 킬로베이스의 단편을 수거하였다. 람다 DASH-2TM벡터 파지(Stratagene)를 BamHI으로 절단 제조하였다. 그 다음 크기 선별된 단편을 상기 벡터와 혼합하고, DNA 리가제를 사용하여 결찰시켰다.
결찰된 벡터는 제조자의 지시에 따라 Stratagene 유래의 포장 추출물로 제조하였다. 이 벡터를 사용하여 XL1-BLUETMMRA 박테리아를 감염시켰다. 약 200,000의 파지 감염 박테리아를 평판당 약 20,000의 밀도로 한천상에 도말하였다. 배양 후, 평판을 니트로셀룰로스 상에 증층하고, 니트로셀룰로스를 단편으로 절단하였다. 파지를 단편으로부터 용출시키고 그 DNA를 적당한 비루스-특이적 프라이머를 사용하여 증폭 반응시켰다. 반응 생성물을 아가로스 겔상에 전개시키고 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 파지를 추정 크기의 증폭 DNA를 제공하는 평판 영역으로부터 회수하였다. 회수한 파지를 사용하여 신규 XL1 박테리아를 감염시키고 새 배양물에 재평판 배양시켰다. 이 과정을 한계 희석으로 단일 클론이 얻어질 때까지 반복하였다.
이 절차로 선별된 각 클론을 그 다음 제한 뉴클레아제를 사용해 지도화하여 병입된 단편의 크기를 확인하였다. 전체 당단백질 B 서열을 병입시키기에 충분히 큰 삽입체를 벡터-특이적 프라이머를 사용하여 양 말단에서 서열분석하였다. 그 서열을 전체 EBV 게놈의 공지 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 그 단편이 본래의 당단백질 B 서열에 걸쳐있는지를 측정하였다. 적합한 클론으로부터 DNA를 얻어, 절단하고 표준 기법에 따라 샷건 클로닝으로 서열분석하였다.
실시예 9: 당단백질 B의 항원성 영역
당단백질 B 내의 NIVPA 및 TVNCB의 하이브리드화 부위 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드 단편은 도 14에 도시한 바와 같은 추정상의 아미노산 서열을 가지고 있다. 이 서열을 기초로 하여, RFHV 또는 KSHV에 고유한 펩티드, 또는 종 사이에 공유된 펩티드를 동정할 수 있다.
도 14는 길이가 6개 또는 7개의 아미노산으로 된 펩티드 예를 도시한 것이다. 이 펩티드들중의 일부는 RFHV 또는 KSHV(제III군)에 독특하거나, 또는 해당 감마 헤르페스 비루스 펩티드들과 비교하여 RFHV/KSHV 아과(제II군)에 독특한 1개 이상의 잔기를 포함한다.
당단백질 B의 106-아미노산 영역내에 포함된 영역들이 항체에 의해 인식될 수 있는지를 확인하기 위하여, 컴퓨터 분석을 수행하여 Hopp 및 Woods 항원성 플롯을 도시하였다. Hopp 및 Woods 측정치는 부분적으로 연속 아미노산 잔기의 상대적인 친수성 및 소수성에 기초한 것이다(Hopp 등). 결과는 도 20, 21 및 22에 나타냈다. 기호는 다음을 의미한다: ~ = 항원성; ＾= 소수성; # = 잠재성 N-결합 글리코실화 부위. 도 20은 RFHV 유래의 106개 아미노산 당단백질 B 단편의 분석 결과이고, 도 21은 KSHV 단편의 분석 결과이며; 도 22는 완전한 KSHV 서열을 분석한 결과이다.
RFHV 및 KSHV는 항체 표적 부위일 것이라고 예상되는 몇개 영역을 포함한다. 특히 KSHV 서열은 이 단편의 N-말단 부근과, 잠재성 N-결합된 글리코실화 부위 부근에 있는 항원성 영역을 도시하고 있다. 완전한 길이의 KSHV 서열은 시그널 펩티드(잔기 ~25) 및 경막 도메인(잔기 ~750)에 해당하는 소수성 최소 잔기를 나타낸다. 다수의 추정상의 항원성 영역들은 그 측정치가 >1.0 또는 >1.5인 것으로 관찰되었다. 특히, 대략 잔기 440 내지 460으로 나타나는 영역은 측정치가 ~2.5 이하인 영역이었다.
실시예 10: 비루스 특이적 당단백질 B 증폭 분석법
타입 3 올리고뉴클레오티드는 네스트형 비루스-특이적 증폭 반응에 사용하여 감염 잠재성 검체 유래의 조직 샘플의 패널중에 RFHV 또는 KSHV가 존재함을 검측하였다.
KSHV의 경우에 있어서, 비루스가 있을 것으로 추정되는 조직, 특히 카포시 육종 병변부 및 체강 B-세포 림프종이 있는 인간 검체 유래의 생검 샘플로부터 DNA를 추출하였다. KS 병변부 유래의 조직, 동일 개체중의 명백한 비감염 조직 유래의 조직, KS 병변부가 명백히 없는 HIV 양성 개체 유래의 조직 및 HIV 음성 개체 유래의 조직을 비롯하여 다양한 여러 조직 샘플을 사용하였다. 각 군중에서 5가지 샘플을 얻었다. DNA는 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 GLTEA, YELPA, VNVNB 및 ENTFB는 Oligos Etc., Inc.로부터 주문하여 입수하였다. DNA는 제1단계에서 프라이머 GLTEA와 ENTFB를 사용하고, 제2단계에서 YELPA 및 VNVNB를 사용하여 2단계로 증폭시켰다. 증폭 조건은 실시예 3과 유사하게 하였다. 반응 생성물은 2% 아가로스 겔 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색한 뒤 자외선하에 조사하였다. 양성 결과는 에티디움 브로마이드 염색시 검출되는 바와 같은 반응 생성물중의 풍부한 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타낸다. 이것은 샘플중에 KSHV 유래의 DNA, 특히 YELPA에서 부터 VNVNB까지의 당단백질 B 암호 단편이 존재한다는 것을 반영하는 것이다. 양성 분석 결과가 KS에 대한 감수성과 관련이 있는지를 측정하기 위하여 환자 이력과 샘플의 조직병리학 결과를 부합시켰다.
RFHV의 경우에는, 워싱톤 대학의 지역 영장류 연구 센터에 있는 영장류 집단에서 사는 마카카 내매스트리나 및 마카카 팩시쿨라리스 원숭이에서 채취한 동결 조직 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 섬유종증의 명백한 증후를 나타내는 조직 부위; 동 원숭이중에서 명백하게 감염되지 않은 부위 및 증후를 전혀 나타내지 않는 원숭이중의 대응 부위로부터 각각 10개의 샘플을 채취하였다. 먼저 GMTEA 및 VEGLB를 사용하고, 그 다음 KYEIA 및 TDRDB를 사용하여 네스트형 PCR 증폭을 실시하였다. 증폭 생성물을 전술한 바와 같이 전기영동하고 염색하여 샘플중에 RFHV 폴리뉴클레오티드의 존재 여부를 측정하였다.
실시예 11: 당단백질 B의 면역원성 영역
KSHV의 자연 감염 과정에서 항체가 발생하는지의 여부를 확인하기 위해서, 카포시 육종 병변부를 가진 10 내지 20명의 AIDS 검체, 10 내지 20명의 HIV-양성 증후군-음성 검체 및 10 내지 20명의 HIV-음성 대조군으로부터 혈청 샘플을 얻었다. 초기 연구에서 각 개체중의 혈청은 항체 분석용으로서 수집하였다.
펩티드 12 잔기 길이는 성숙 KSHV 당단백질 B 분자의 추정상의 전체 세포외 도메인에 따라 합성하였다. 전체 서열을 커버하고 8개 잔기는 중첩되는 연속 펩티드를 제조하였다. 이 펩티드를 Genosys에서 입수한 SPOTSTM키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 표준 F-Moc 화학 합성법으로 나일론 막 지지체상에 제조하였다. 제조된 막을 혈청과 중층시키고, 세척한 뒤, 베타-갈락토시다제 결합된 항-인체 IgG와 중층시켰다. 이 시험은 기질 X-gal을 첨가하여 발색시켰다. 양성의 염색 결과는 해당 펩티드에 대한 IgG 항체가 혈청중에 존재하여 반응성을 나타낸 것을 의미한다.
이와 유사하게, RFHV 의 자연 감염 과정에서 형성된 항체를 동정하기 위하여, 혈청 샘플을, 섬유종증의 명백한 증상을 일정 비율이 나타내는 10마리의 마카카 내매스트리나와 10마리의 마카카 팩시쿨라리스로부터 수집하였다. RFHV 개시 감염의 존재 유무는 실시예 10에서와 같이 RFHV-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭 분석을 수행하여 확인하였다. 혈장 및 혈액 세포는 원심분리로 분리하였다. 이 혈청을 사용하여 KSHV에서와 유사한 방법으로 항체를 시험하였고, 단 RFHV 당단백질 B 서열에 기초하여 12-mer를 합성하였다.
또한, 선택된 RFHV 및 KSHV 펩티드를 동물 모델중에서 시험하여 명반과 DETOXTM과 같은 바람직한 보조제와 함께 투여했을 때의 면역원성을 측정하였다. 적합한 펩티드에는 자연적인 비루스 감염 과정동안 항체를 유인하므로써 전술한 실험에서 확인된 것을 포함한다. 다른 시험물질로는 당단백질 B의 생물학적 기능에 관여할 것으로 생각되는 펩티드와 비루스 중화 항체를 유도하는 것으로 알려진 기타 다른 헤르페스 비루스의 펩티드에 상응하는 펩티드를 포함한다. 이 펩티드들을 캐리어로서 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 상에 결합시킨 뒤, 표준 프로토콜에 따라 보조제와 혼합하고, 1 내지 2 ㎖ 접종물중의 100㎍ 상당량의 펩티드를 토끼에 근육내 주입하였다. 이 토끼에 대해 4주 후에 2차 투여량을 투여하여 항원자극시키고, 다시 2주후 시험 방혈시켰다.
ELISA를 위하여 면역원 또는 무관련 펩티드-KLH 대조군을 코팅시켜 미량역가 웰을 제조하였다. 이 웰을 시험 혈액 유래의 혈장 연속 희석물로 중층시킨 뒤, 세척하고, 베타-갈락토스 항-인체 IgG 및 X-gal를 사용하여 발색시켰다. 대조용 웰이 아닌 시험 웰중의 양성 염색은 펩티드가 사용된 조건하에서 면역원성이라는 것을 나타낸다.
실시예 12: RFHV/KSHV 아과의 다른 구성원들에서 유래된 당단백질 B의 동정 및 특성규명
종래 규명되지 않은 감마 헤르페스 비루스를 포함할 것으로 추정되는 조직 샘플, 특히 섬유증식 질환, 림프구 악성종양과 면역결핍 및 면역억제 관련 질환, 예컨대 급성 호흡 질환 증후군(ARDS)으로 추정되는 조직 샘플을 동결 보존하고, 실시예 2에서와 같이 DNA를 추출하였다. 1차 사이클에 타입 1 올리고뉴클레오티드 FRFDA 및 TVNCB를 사용하고, 그 다음 2차 사이클에 네스트형 타입 1 또는 타입 2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭 반응을 2회 실시하였다.
선택적으로, 증폭 생성물을 적합한 프로브로 탐침하여 RFHV/KSHV과 당단백질 B 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하였다. 증폭된 폴리뉴클레오티드를 아가로스 전기영동하고 나일론 막상에 블롯팅하였다. 이 블롯을32P로 표지된 당단백질 B를 암호하는 KSHV 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3의 잔기 36 내지 354)로부터 얻은 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드시켰다. 이 하이브리드 반응은 RFHV/KSHV 아과 이외의 공급원에서 얻은 당단백질 B 암호 폴리뉴클레오티드와 프로브 간에 형성되는 것이 아니라, 헤르페스 비루스 유래의 당단백질 B 와 프로브 사이에 안정한 이본체가 형성되도록 하는 조건하에서 실시한다. 하이브리드화 조건은 프로브의 하이브리드화 분절과 안정한 이본체를 형성하는 표적간에 약 70%의 동일성을 필요로 하는 것이다. 이러한 조건은 프로브의 길이와 서열 및 표적의 대응 서열에 따라 상기 제시된 바와 같은 수학식에 따라 계산한다. 반응 조건은 a) 프로브가 포름아미드 부재하에 실온에서 6 x SSC(0.15M NaCl, 15mM 구연산 나트륨 완충액)중의 표적과 하이브리드하도록 하며; b) 새로 형성된 이본체를 단기간동안(5 내지 10분) 2xSSC로 실온에서 세척하는 것으로 추정된다.
이러한 조건하에서 표지된 프로브에 하이브리드하는 증폭 폴리뉴클레오티드는 선택하여 다른 특성에 대하여 분석한다. 또는, KSHV로부터 추정되는 것과 대략 동일한 크기의 PCR 증폭 생성물은 관연 서열을 가지고 있는 것으로 생각된다. 또한, 샘플을 사용하여 DNA 폴리머라제와 같은 헤르페스 비루스 게놈의 다른 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 얻었다면 샘플이 관련 서열을 가지고 있다고 추정할 수 있다. 크기 차이 또는 다른 기원으로 인하여 RFHV 또는 KSHV 와는 전혀 다른 단편을 함유하는 샘플은 실시예 4에서와 같이 단편을 따라 서열분석하였다. 새로운 서열을 가진 샘플을 사용하여 실시예 7 또는 실시예 8에 기술된 방법과 유사한 방법으로 전체 당단백질 B 유전자 서열을 결정하였다.
RFHV/KSHV 헤르페스 비루스 아과의 제3군 유래의 당단백질 B 암호 서열은 다음과 같이 얻었다.
복강후 섬유종증에 걸린 마카카 뮬라타 원숭이로부터 채취한 2가지 동결 조직 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 추출은 실시예 1에 따라 수행하였다. 추출된 DNA는 캐리어로서 40㎍ 글리코겐을 함유한 에탄올로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척한 뒤, 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0중에 재현탁시켰다. 추출 DNA를 사용하여, KSHV, RFHV 또는 종래 특성규명된 다른 모든 DNA 폴리머라제의 서열과 동일하지 않은 헤르페스 비루스 DNA 폴리머라제 유전자의 151 염기쌍 단편을 얻었다. 이것은 샘플이 다른 헤르페스 비루스 유래의 게놈 DNA를 함유하고 있다는 의심을 갖게 하며, 따라서 새로운 당단백질 B 유전자를 동정하고 특성규명하는데 사용될 것이다.
당단백질 B 암호 서열의 386 염기쌍 단편은 절반-네스트형 PCR를 사용하여 샘플로부터 증폭시켰다. 사용된 방법은 실시예 4 및 5에서 사용된 방법과 유사한데, 1차 증폭 사이클에 FRFDA 및 TVNCB를 사용한 다음, 2차 증폭 사이클에 NIVPA 및 TVNCB를 사용하였다. 최종 PCR 생성물은 전술한 바와 같이 서열결정하였다.
도 23은 해당 아미노산 해독(서열 번호 97)과 함께 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 96)을 도시한 것이다. 밑줄친 부위는 두 프라이머 하이브리드화 부위 사이에 존재하는 319 염기쌍 서열을 나타낸다. 이 서열은 KSHV 및 RFHV의 서열과는 다르다. 이 당단백질 B는 헤르페스 비루스의 RFHV/KSHV 아과의 신규 구성원으로서 RFHV2로 나타내었다.
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WO 92/05263 Inglis 등 (약독화된 헤르페스)
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WO 94/11509 Couto 등 (인체화 ab)
EP 0239400 Winter (인체화 ab)
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서열 목록
서열 번호 명칭 종류 형태 공급원
1 RFHV 당단백질 B PCR 분절 dsDNA 도 1
2 RFHV 당단백질 B PCR 분절 단백질 도 1
3 KSHV 당단백질 B PCR 분절 dsDNA 도 1
4 KSHV 당단백질 B PCR 분절 단백질 도 1
5 sHV1 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크HSVSPOLGBP
6 bHV4 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크BHT4GLYB
7 eHV2 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크EHVU20824
8 mHV68 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크MVU08990
9 hEBV 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크EBV
10 hCMV 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크HEHCMVGB
11 hHV6 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크HH6GBXA
12 hVZV 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크HEVZVXX
13 HSV1 당단백질 B 서열 dsDNA 진뱅크HS1GLYB
14 sHV1 당단백질 B 서열 단백질 해독
15 bHV4 당단백질 B 서열 단백질 해독
16 eHV2 당단백질 B 서열 단백질 해독
17 mHV68 당단백질 B 서열 단백질 해독
18 hEBV 당단백질 B 서열 단백질 해독
19 hCMV 당단백질 B 서열 단백질 해독
20 hHV6 당단백질 B 서열 단백질 해독
21 hVZV 당단백질 B 서열 단백질 해독
서열번호 명칭 종류 형태 공급원
22 HSV1 당단백질 B 서열 단백질 해독
23 sHVSA8 당단백질 B 서열 단백질 해독
24-40 타입1 올리고뉴클레오티드(감마 헤르페스 당단백질 B) ssDNA(IUPAC) 표 4
41-47 타입 2 올리고뉴클레오티드(RFHV/KSHV 아과 당단백질 B) ssDNA(IUPAC) 표 6
48-55 타입 3 올리고뉴클레오티드(RFHV 특이적 당단백질 B) ssDNA 표 7
56-63 타입 3 올리고뉴클레오티드(KSHV 특이적 당단백질 B) ssDNA 표 7
64-66 제I군 항원 펩티드(감마 헤르페스 당단백질 B) 단백질 표 8
67-72 제II군 항원 펩티드(RFHV/KSHV 아과 당단백질 B) 단백질 표 8
73-74 제III군 항원 펩티드(RFHV 특이적 당단백질 B) 단백질 표 8
75-76 제III군 항원 펩티드(KSHV 특이적 당단백질 B) 단백질 표 8
77-78 타입 1 올리고뉴클레오티드(감마 헤르페스 캡시드 성숙) ssDNA(IUPAC) 표 9
79 타입 1 올리고뉴클레오티드(감마 헤르페스 DNA 폴리머라제) ssDNA(IUPAC) 표 9
80-87 타입 3 올리고뉴클레오티드(KSHV 특이적 당단백질 B) 표 11
88-90 타입 3 올리고뉴클레오티드KSHV 특이적 DNA 폴리머라제 표 11
91 KSHV 캡시드 성숙 단편, 당단백질 B 및 DNA 폴리머라제 단편에 대한 암호 영역을 함유하는 DNA 서열 dsDNA 도 18
92 KSHV 캡시드 성숙 단편 및 당단백질 B(잔기 1 내지 3056)의 암호 영역을 함유하는 DNA 서열 dsDNA 실시예 7
서열번호 명칭 종류 형태 공급원
93 KSHV 캡시드 성숙 서열 단백질 도 18
94 KSHV 당단백질 B 서열 단백질 도 18
95 KSHV DNA 폴리머라제 서열 단백질 도 18
96 RFHV2 당단백질 B PCR 분절 dsDNA 도 22
97 RFHV2 당단백질 B PCR 분절 단백질 도 22
98 공유 서열 dsDNA 실시예 7
99-100 당단백질 B의 제I군 항원 펩티드 단백질 표 8
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인 : 티모시 엠. 로즈; 마닉스 보쉬; 커트 스트랜드
(ii)발명의 명칭 : 헤르페스 비루스에 속하는 RFHV/KSHV 아과의 당단백질 B
(iii) 서열의 수 : 40
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인 : 모리슨 및 포에스터
(B) 스트리트 : 페이지 밀 로드 755
(C) 도시 : 팔로 알토
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국가 : 미국
(F) ZIP : 94304-1018
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 쉬프, 제이. 마이클
(B) 등록번호 : 40,253
(C) 참조번호 : 29938-20002.00
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화 : (415) 813-5600
(B) 팩스 : (415) 494-0792
(C) 텔렉스 : 706141

Claims (60)

  1. 헤르페스 비루스의 당단백질 B를 암호하는 영역을 가지며, 서열 번호 1 또는서열 번호 3의 서열중 뉴클레오티드 36 내지 354와 65% 이상 동일한 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드중 당단백질 B 암호 영역의 50개 이상의 연속 뉴클레오티드 단편을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 헤르페스 비루스의 당단백질 B를 암호하는 영역을 가지며, 올리고뉴클레오티드 SHMDA(서열 번호 41)와 74% 이상 동일한 35개 뉴클레오티드 서열; 올리고뉴클레오티드 CFSSB(서열 번호 43)와 73% 이상 동일한 30개 뉴클레오티드 서열; 올리고뉴클레오티드 ENTFA(서열 번호 45)와 72% 이상 동일한 29개 뉴클레오티드 서열; 및 올리고뉴클레오티드 DNIQB(서열 번호 46)와 80% 이상 동일한 35개 뉴클레오티드 서열로 구성된 군중에서 선택된 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드중 당단백질 B 암호 영역의 50개 이상의 연속 뉴클레오티드의 단편을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 헤르페스 비루스가 영장류를 감염시킬 수 있는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 헤르페스 비루스가 RFHV1, RFHV2 또는 KSHV인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 서열 번호 1, 3 또는 92에 포함된 뉴클레오티드 36 내지 354 사이에 위치하거나, 서열 번호 96의 임의의 위치에 포함되지만; 서열 번호 98에는 포함되지 않는 선형 서열과 동일한 21개 이상의 뉴클레오티드 선형 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 서열 번호 1, 3 또는 96의 뉴클레오티드 36 내지 354, 또는 서열 번호 92의 200개 이상의 연속 뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 선형 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제2항의 폴리뉴클레오티드에 암호된 분리된 폴리펩티드.
  10. 서열 번호 2, 4 또는 97에 포함된 아미노산 13 내지 118 사이에 위치하거나, 서열 번호 94의 임의의 위치에 포함되지만; 서열 번호 99에는 포함되지 않는 서열과 실질적으로 동일한 17개 이상의 아미노산 선형 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 서열 번호 2, 4, 94 또는 97에 도시된 서열을 가진 폴리펩티드로 실질적으로 이루어진 분리된 폴리펩티드.
  12. 제10항의 폴리펩티드에 포함된 서열과 17개 이상 동일한 아미노산 선형 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  13. 제10항에 있어서, 포유류 세포와 헤르페스 비루스의 결합 또는 융합과 연관있는 분리된 폴리펩티드.
  14. 제10항에 있어서, 글리코실화된 분리된 폴리펩티드.
  15. 제10항에 있어서, 글리코실화되지 않은 분리된 폴리펩티드.
  16. 제10항에 있어서, 면역원성인 분리된 폴리펩티드.
  17. 제10항에 있어서, 서열 번호 67 내지 76으로 구성된 군중에서 선택되는 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  18. 제10항의 폴리펩티드를 암호하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제10항의 폴리펩티드를 암호하는 비자연발생의 폴리뉴클레오티드.
  20. 한 폴리펩티드를 암호하는 제2의 폴리뉴클레오티드에 직접 결합된 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합 폴리펩티드 암호 폴리뉴클레오티드.
  21. 제10항 기재의 폴리펩티드에 포함된 서열과 동일한 17개 이상의 아미노산 선형 서열을 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 클로닝 벡터.
  22. 제10항 기재의 폴리펩티드에 포함된 서열과 동일한 17개 이상의 아미노산 선형 서열을 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열과, 이것에 작동가능하게 결합된 조절 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  23. 제7항의 폴리뉴클레오티드에 포함된 선형 서열과 동일한 21개 이상의 뉴클레오티드 선형 서열을 포함하는 재조합 클로닝 벡터.
  24. 제18항 또는 제19항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제21항, 제22항 또는 제23항의 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포.
  25. 제1항 기재의 폴리뉴클레오티드의 암호 영역에서 암호된 당단백질 B 폴리펩티드에 특이적인 모노클로널 또는 분리된 폴리클로널 항체.
  26. 제11항 기재의 폴리펩티드에는 특이적이지만, 서열 번호 30 내지 41중 어느 한 서열 기재의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드에는 특이적이지 않은 모노클로널 또는 분리된 폴리클로널 항체.
  27. 제26항에 있어서, 모노클로널 항체인 항체.
  28. 제26항에 있어서, 분리된 폴리클로널 항체인 항체.
  29. 제9항 또는 제10항 기재의 폴리펩티드를 약학적 상용성 부형제내에 함유하는 백신.
  30. 제29항에 있어서, 보조제를 더 포함하는 백신.
  31. 제29항의 백신을 투여하는 것을 포함하여, 헤르페스 비루스 감염을 치료하는 방법.
  32. 제2항 또는 제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 약학적 상용성 부형제내에 함유하는 백신.
  33. 제32항에 있어서, 생비루스 또는 비루스 발현 벡터인 백신.
  34. 제32항의 백신을 투여하는 것을 포함하여, 헤르페스 비루스 감염을 치료하는 방법.
  35. 제25항 또는 제26항 기재의 항체를 약학적 상용성 부형제중에 포함하는 백신.
  36. 제35항 기재의 백신을 투여하는 것을 포함하여 헤르페스 비루스 감염을 치료하는 방법.
  37. 서열 번호 24 내지 63, 서열 번호 77, 78 및 서열 번호 80 내지 90으로 구성된 군중에서 선택되는 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
  38. a) 제37항의 올리고뉴클레오티드와 당단백질 B를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 폴리뉴클레오티드와 이본체를 형성한 올리고뉴클레오티드를 신장시키는 단계를 포함하여, 상기 폴리뉴클레오티드의 증폭 복사체를 얻는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 증폭 반응이 폴리머라제 사슬 반응(PCR)인 방법.
  40. 제39항에 있어서, PCR이 어닐링과 신장 단계의 반복 사이클을 포함하며, 어닐링이 500℃ 이상의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 증폭될 폴리뉴클레오티드를 먼저 섬유아세포 증식 및 콜라겐 침착을 특징으로 하는 질환에 걸린 개체에서 채취한 생물학적 샘플로부터 얻는 방법.
  42. a) 서열 번호 1, 3, 92 또는 94 기재의 서열을 가진 1종류 이상의 폴리뉴클레오티드와는 안정한 이본체를 형성하나, 서열 번호 5 내지 13 기재 서열중 어느 하나의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와는 이본체를 형성하지 않는 조건하에서 제2항 또는 제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브와 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 접촉시키는 단계; 및
    b) 선택적으로 단계 a)에서 형성된 안정한 이본체의 존재를 검측하는 단계를 포함하여, 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하는 방법.
  43. a) 서열 번호 1 및 34 기재의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와는 안정한 이본체를 형성하나, 서열 번호 5 내지 13 기재 서열중 어느 하나의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와는 이본체를 형성하지 않는 조건하에서 제2항 또는 제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브와 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 접촉시키는 단계; 및
    b) 선택적으로 단계 a)에서 형성된 안정한 이본체의 존재를 검측하는 단계를 포함하여, 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하는 방법.
  44. a) 서열 번호 1, 3, 92 또는 94 기재의 서열을 가진 1종류 이상의 폴리뉴클레오티드와는 안정한 이본체를 형성하나, 서열 번호 5 또는 9 내지 13 기재 서열중 어느 하나의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와는 이본체를 형성하지 않는 조건하에서 제2항 또는 제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브와 영장류 기원의 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 접촉시키는 단계; 및
    b) 선택적으로 단계 a)에서 형성된 안정한 이본체의 존재를 검측하는 단계를 포함하여, 영장류 기원의 샘플중에 존재하는 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 샘플의 DNA 또는 RNA를 프로브와 접촉시키기 이전에 그 DNA 또는 RNA에 대하여 증폭 반응을 실시하는 단계를 더 포함하는 방법.
  46. a) 프라이머로서 제37항의 올리고뉴클레오티드를 반응액중에 사용하여 샘플중에 존재하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및
    b) 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 증폭 복사체의 존재를 검측하는 단계를 포함하여, 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하는 방법.
  47. 서열 번호 1, 3, 92 및 94로 구성된 군중에서 선택된 서열 및 이의 각각의 상보 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 1, 3, 92 또는 94 기재의 서열을 가진 1종류 이상의 폴리뉴클레오티드와는 안정한 이본체를 형성할 수 있으나, 서열 번호 5 내지 13 기재의 서열중 어느 하나의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와는 이본체를 형성할 수 없는 조건하에서, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드와 안정한 이본체를 형성할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  48. 제47항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 자연 발생의 비루스 게놈내에 포함되어 있는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  49. 제47항 기재의 폴리뉴클레오티드에서 암호된 25개 이상의 아미노산 선형 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  50. 제42항, 제44항 또는 제46항 기재의 방법으로 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하여, 한 개체로부터 얻은 생물학적 샘플중의 비루스 DNA 또는 RNA를 검측하는 것을 포함하는, 한 개체중의 헤르페스 비루스 감염을 검측하는 방법.
  51. 제2항 또는 제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시약을 적합한 포장중에 보유하는, 생물학적 샘플중에 존재하는 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드 검측용 진단 키트.
  52. 제37항 기재의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 시약을 적합한 포장중에 보유하는, 생물학적 샘플중에 존재하는 헤르페스 비루스 폴리뉴클레오티드 검측용 진단 키트.
  53. a) 제25항 또는 제26항 기재의 폴리펩티드와 한 개체에서 얻은 샘플 유래의 항체를, 안정한 항원-항체 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계; 및
    b) 선택적으로, 단계 a)에서 형성된 안정한 복합체를 검측하는 단계를 포함하여, 한 개체의 헤르페스 비루스 감염을 검측하는 방법.
  54. 제25항 또는 제26항 기재의 폴리펩티드를 함유하는 시약을 적합한 포장중에 보유하는, 생물학적 샘플중에 존재하는 항-헤르페스비루스 항체 검측용 진단 키트.
  55. a) 제9항 또는 제10항 기재의 항체와 한 개체에서 얻은 샘플 유래의 폴리펩티드를, 안정한 항원-항체 복합체를 형성시킬 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계; 및
    b) 선택적으로, 단계 a)에서 형성된 안정한 복합체를 검측하는 단계를 포함하여, 한 개체의 헤르페스 비루스 감염을 검측하는 방법.
  56. 제9항 또는 제10항 기재의 항체를 포함하는 시약을 적당한 포장내에 보유하는, 생물학적 샘플중에 존재하는 헤르페스 비루스 폴리펩티드 검측용 진단 키트.
  57. a) 제9항 또는 제10항 기재의 폴리펩티드를 약학적 시험제제와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 폴리펩티드의 생화학적 기능이 상기 약학적 시험제제에 의해 변화되는지를 측정하는 단계를 포함하여, 상기 약학적 시험제제가 감마 헤르페스 비루스 감염 치료에 유용한지를 측정하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 단계 b)에서 측정된 폴리펩티드의 생화학적 기능이 포유류 세포 표면에 상기 폴리펩티드를 결합시키는 것인 방법.
  59. 제2항 또는 제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포내에서 발현시키는 것을 포함하여, 당단백질 B 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  60. 제21항 또는 제23항 기재의 재조합 클로닝 벡터를 복제하는 것을 포함하여, 헤르페스 비루스 당단백질 B 암호 영역을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법.
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