BG62977B1 - Вирусен материал и нуклеотидни фрагменти, свързани с диагностика, профилактика и лечение на мултиплената склероза - Google Patents
Вирусен материал и нуклеотидни фрагменти, свързани с диагностика, профилактика и лечение на мултиплената склероза Download PDFInfo
- Publication number
- BG62977B1 BG62977B1 BG101355A BG10135597A BG62977B1 BG 62977 B1 BG62977 B1 BG 62977B1 BG 101355 A BG101355 A BG 101355A BG 10135597 A BG10135597 A BG 10135597A BG 62977 B1 BG62977 B1 BG 62977B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- sequences
- nucleotide
- msrv
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 199
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 197
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims description 121
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 90
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 146
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 117
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 109
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 67
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 65
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 65
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 64
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 53
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 43
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 39
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 29
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 claims description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 24
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 24
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 22
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 claims description 21
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 14
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 13
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 10
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 9
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 9
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 8
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 4
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 3
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 122
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 113
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 85
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 76
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 44
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 40
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 39
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 19
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 17
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 16
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 16
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 14
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 14
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 101100224485 Arabidopsis thaliana POL2B gene Proteins 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100170950 Methanocella arvoryzae (strain DSM 22066 / NBRC 105507 / MRE50) polC gene Proteins 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 10
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 9
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 9
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 9
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- -1 aryl phosphonate Chemical compound 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-dichloro-5-propan-2-yloxyphenyl)acetamide Chemical compound CC(C)OC1=CC(NC(C)=O)=C(Cl)C=C1Cl QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001484259 Lacuna Species 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical class C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 5-methyl-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXKNLCPUNZPFGY-LEWSCRJBSA-N Ala-Tyr-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N ZXKNLCPUNZPFGY-LEWSCRJBSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710191958 Amino-acid acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100023167 Argininosuccinate lyase Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 101100224481 Dictyostelium discoideum pole gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- PGXZHYYGOPKYKM-IHRRRGAJSA-N His-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O PGXZHYYGOPKYKM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101000912957 Homo sapiens Protein DEK Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000813323 Maize streak Reunion virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 description 1
- 208000008457 Neurologic Manifestations Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150110488 POL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- OEXWWDYOBBQCKD-UHFFFAOYSA-N SSSSSS Chemical compound SSSSSS OEXWWDYOBBQCKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100365193 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sec73 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl ether Chemical compound CC(C)(C)OC(C)(C)C AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000055418 human Dek Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 244000000066 protist pathogen Species 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- GEUFMGZEFYJAEJ-UHFFFAOYSA-N tris(2-methylpropyl)silicon Chemical compound CC(C)C[Si](CC(C)C)CC(C)C GEUFMGZEFYJAEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000007419 viral reactivation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, чийто геном съдържа нуклеотидна последователност, избрана от последователностите SEQ ID Х 46, 51, 52, 53 и 56 и техните комплементарни и еквивалентни последователности. По-специално нуклеотидните последователности проявяват за всяка поредица от 100 непрекъснати мономера поне 50%, по-специално поне 70%, хомоложност спосочените последователности, съответно SEQ ID Х 46, 51, 52, 53 и 56, и техните комплементарни последователности.
Description
Мултиплената склероза (MS) е демиелинизиращо заболяване на централната нервна система (CNS), причината за което остава все още неизвестна.
Много изследвания са в подкрепа на хипотезата за вирусната етиология на заболяването, но за никой от известните тестувани вируси не е доказано, че е причинител: прегледа на вирусите в MS е осъществяван в продължение на няколко години от Nan±y (1) и R. т. Johnson (2).
Напоследък, у пациенти,страдащи от MS,са изолирани ретровируси, различни от известните човешки ретровируси (3, 4 и 5). Авторите също така са били в състояние да покажат, че пациенти, страдащи от MSynpogyuupam антитела, способни да разпознаят протеини, свързани с инфектирани с тези ретровируси лептоменингиални клетки , и че експресията на последните може силно да бъде стимулирана от ранните гени на някои херпесни вируси (6).
Всички тези резултати сочат за ролята на поне един непознат ретровирус в MS или на вирус с обратно транскрибтазна активност, която може да бъде установена по метода, публикуван от Н. Perron (3) и квалифициран като “LM7- подобна RT“ активност. Съдържанието на публикацията, означена с (3)?е включено в настоящето описание в приложената литературна справка.
Напоследък, изследванията на заявителя предоставят възможност за получаване на две постоянни клетъчни линии, инфектирани с природни изолати, произхождащи от два различни пациента, страдащи от MS, с помощта на метода, описан в документа WO- А- 93/ 20188, съдържанието на който е включено в литературната справка към настоящето описание. Тези две линии, получени от човешки хороидални плексусни клетки, означени като LM7PC и PLI- 2, са депозирани в ЕСАСС на
22. юли 1992 и 8. януари 1993, съответно, под номера 92072201 и 93010817, в съответствие с изискванията на Будапещенския договор. Нещо повече, вирусните изолати, притежаващи LM7- подобна RT активност, също са депозирани в ЕСАСС под общото означение “щамове“. “Щамът“, или изолатът;произхождащ от линия PLI- 2 , означен като POL- 2, е депозиран в ЕСАСС на 22. юли 1992 под номер V92072202. “Щамът“ или изолатът, произхождащ от линия LM7PC, означен като MS7PG, е депозиран в ЕСАСС на 8. януари 1993 под номер V93010816.
На базата на културите и изолатите, посочени по- горе, охарактеризирани с биологични и морфологични показатели, следващ етап се явява опита за охарактеризиране на материала от нуклеинови киселини, свързан с Вирусните частици, продуцирани в тези култури.
Частите от генома, които вече са охарактеризирани, се използват за създаване на тестове за молекулно откриване на вирусния геном, както и за имуносерологични тестове с помощта на аминожисе2 линии последователности, кодирани от нуклеотидните последователности на вирусния геном с оглед установяване на имунния отговор, насочен срещу епитопи, асоциирани с инфекцията и/ или вирусната експресия.
Тези средства вече дават възможност за потвърждаване на една асоциация между MS и експресията на последователностите, идентифицирани в пациентите, цитирани по- горе. Независимо от това, вирусната система, открита от заявителя е сродна на комплекс ретровирусна система. По действие, за намиране на последователностите, капсулирани в екстрацелуларните вирусни частици, продуцирани от различните клетъчни култури от пациенти, страдащи от MS, показват ясно, че е налице ко- капсулиране на ретровирусни геноми, които са сродни, но различни от “дивият - тип“ ретровирусен геном, който продуцира инфекциозните вирусни частици. Този феномен е наблюдаван между репликативни ретровируси и ендогенни ретровируси, принадлежащи на същото семейство, или дори хетероложни ретровируси. Идеята за ендогенни ретровируси е много важна в контекста на нашето откритие, доколкото, в случай на MSRV- 1?е наблюдавано, че ендогенни ретровирусни последователности, хомоложни на MSRV- 1 генома съществуват в нормална човешка ДНК. Съществуването на ендогенни ретровирусни елементи (ERV), сходни на MSRV-1 в целия или част от техния геном обяснява факта, че експресията на MSRV-1 ретровирус в човешки клетки е способна да взаимодейства с близко родствени ендогенни последователности. Тези взаимодействия следва да бъдат установени в случаите на патогенни и/ или инфекциозни ендогенни ретровируси (например някои екотропични щамове на човешкия левкемиен вирус), и в случаите на екзогенни ретровируси, чиято нуклеотидна последователност може да бъде установена частично или изцяло, под формата на ERV-u, в генома на гостоприемник животно (напр. екзогенен вирус на тумор на млечната жлеза у мишки, трансмитиран чрез млякото). Тези взаимодействия се състоят главно в (i) транс- активация или коактивация на
ERVs чрез репликашивния решровирус (ii) и “нелегитимно“ капсулиране на РНКи, или на ERV-u, сродни на ERVS, или ERVs- или дори на клетъчна РНК - просто притежаващи конкурентни капсулиращи последователности, в ретровирусните частици, продуцирани от експресията на ретровирусния щам, които понякога са трансмисиВни, а понякога сами по себе си са патогенни, и (iii) повече или по- малко съществени рекомбинации между кокапсулирани геноми, в частност фазите на обратна транскрибция, които водят до формиране на хибридни геноми, които са понякога трансмисивни , а понякога сами по себе си патогенни.
Така, (i) в пречистените вирусни частици са установени различни последователности, сродни на MSRV-1; (ii) молекулни анализи на различните участъци от MSRV- 1 ретровирусният геном следва да бъдат провеждани чрез систематично анализиране на кокапсулираните, взаимодействащи си и/ или рекомбинирани последователности, които са получени чрез инфекция и/ или експресия на MSRV- 1; нещо повече, някои клонове може да притежават дефектни участъци в последователността, продуцирани от ретровирусна репликация и грешки в матрицата и/ или грешки в транскрибцията на обратната транскрибтаза; (iii) семействата от последователности, сродни на същия ретровирусен геномен участък^предлагат средствата за общо диагностично откриване, което може да бъде оптимизирано чрез идентифициране на невариабилни участъци сред експресираните клонове, и чрез идентификацията на четящи рамки, отговорни за продуцирането на антигенни и/ или патогенни полипептиди, които могат да бъдат продуцирани само на части, или дори само поотделно, от експресираните клонове, и при тези условия, системният анализ на експресираните клонове в участъка на даден ген дава възможност за честота на вариациите и/ или на рекомбинации на MSRV1 генома в този участък да бъде оценен и да бъдат дефинирани оптималните последователности за приложенията при диагностициране; (iv) патологията, причинена от ретровируси като MSRV- 1?може да бъде пряк резултат от тяхната експресия и протеините или продуцираните пептиди, продуцирани като директен резултат от това, но също ефекта на активация, капсулирането или рекомбинацията на сродни или хетероложни геноми и протеините или пептидите, продуцирани като резултат на това; така, тези геноми,свързани с експресията на и/ или инфекцията с MSRV- 1,са неотделима част от потенциалната патогенност на този вирус, и доколкото определя средства за диагностично откриване и специални терапевтични цели. Аналогично на това, всеки агент, асоцииран с или кофактор на тези взаимодействия, отговорни за евентуалната патогенност, като MSRV- 2, или гликотоксичният фактор, които са описани в публикувано патентно описание N FR- 2 716 198, може да участва в развитието на всеобща или много ефективна стратегия за диагноза, прогноза, терапевтично наблюдение и/ или интегрирана терапия на MS в частност, но също и на всяко друго заболяване, сВързано със същите агенти.
В същия контекст енаправено успоредно откритие в друго автоимунно заболяване, ревматоиден артрит (RA), което е описано във Френско патентно описание, заявено под номер No. 95/ 02960. Това откритие показва, че посредством прилагане на методологични подходи, сходни на тези, които се използват в работата на заявитела no MS, е възможно идентифицирането на ретровируси, експресирани в RA, които споделят последователностите, описани за MSRV-1 в MS, и същевременно съществуването на асоциирана MSRV- 2 последователност, също описана в MS. По отношение на MSRV-1, последователносттаузткрита найобщо в MS и RA;ce отнася go pol и gag гени. По съществуващото знание понастоящем, възможно е асоциирането nagagnpol последователности, описани със MSRV-1 щамовете, експресирани в тези две заболявания.
Настоящата патентна заявка се отнася до различни резултати, които са допълнителни към вече защитените със следните Френски патентни заявки:
- No. 92/ 04322 om 03. 04. 1992, публикувана nog No. 2 689 519;
- No. 92/13447 om 03. 11. 1992, публикувана nog No. 2 689 521;
- No. 92/ 13443 om 03. 11. 1992, публикувана nog No. 2 689 520;
- No. 94/ 01529 om 04. 02. 1994, публикувана nog No. 2 715 936;
- No. 94/ 01531 om 04. 02. 1994, публикувана nog No 2 715 939;
- No. 94/ 01530 om 04. 02. 1994, публикувана nog No. 2 715 936;
- No. 94/ 01532 om 04. 02. 1994, публикувана nog No. 2 715 937;
- No. 94/14322 om 24. 11. 1994, публикувана nog No. 2 727 428;
- u No. 94/15810 om 23.12.1994, публикувана nog No. 2 728 585.
Настоящето изобретение се отнася, на първо място, до вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, който може да бъде разпознат или охарактеризиран по различни начини:
- неговият геном включва нуклеотидна последователност, избрана от групата, включваща последователността SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: %*, SEQ ID NO: 59, SRQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, техните комплементарни последователности и техните еквивалентни последователности, по- специално нуклеотидни последователности, показващи, за всяка поредица от 100 непрекъснати мономера, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложни с посочените SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, съответно, и техните комплементарни последователности; участъка на техния геномгвключващ env и pol гени и част от gag гена, с изключение на субучастъкащритежаващ последователност^идентична или еквиВалентна на SEQ ID NO: 1, кодиращ който и да е полипептид, и показващ, която и да е съседна последователност от поне 30 аминокиселини, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложност с пептидна последователност, кодира на om която u да е нуклеотидна последователност, избрана от групата, включваща SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89 и техните комплементарни послидователности;
- генътpol включва нуклеотидна последователност^частично или тотално идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 57, която не включва SEQ ID NO: 1.
- 2em>mgag включва нуклеотидна последователност;частично или тотално идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 88.
Както е показано по- горе, съгласно настоящето изобретение, вирусният материал;както е определен по- горе7се асоциира с MS. И както е определено в литературните справки заро1 или gag ген за MSRV-1, и по- специално последователностите SEQ ID 51,56, 57,59, 60, 61, 88 и 89, този вирусен материал се асоциира с RA.
Настоящето изобретение също се отнася до различни нуклеотидни фрагменти, всеки от които включва нуклеотидна последователност^избрана от групата, състояща се от групата:
(a) всички геномни последователности, част от тях или пълни, генът pol от вируса MSRV-1, с изключение на пълната последователност от нуклеотидния фрагмент, определен от SEQ ID NO: 1;
(b) всички геномни последователности, части от тях или пълни, от env гена на MSRV-1;
(c) всички частични геномни последователности omgag гена на MSRV-1;
(d) всички геномни последователности, припокриващи гена pol и гена env от MSRV-1 вируса, и припокриваща гена pol и гена gag;
(e) всички последователности, части от тях или пълни, от клона^избран от групата7включваща клоновете Fbd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO: 51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc2 (SEQ ID NO: 53) u GM3 (SEQ ID NO: 56), Fbdl3 (SEQ ID NO: 58), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+ E+ A (SEQ ID NO: 89), koumo не включваш която u ga е нуклеотидна последователност, идентична или лежаща в рамките на определената от SEQ ID NO: 1 последователност;
(f) последователности, комплементарни на посочените геномни последователности;
(g) последователности, еквивалентни на посочените последователности (а) до (е), в частност нуклеотидни последователности, показващи която и да е последователност от 100 съседни мономера, с поне 50 % и за предпочитане поне 70 % хомоложност с дадените последователности от (a) go (d) при условие, че тази нуклеотиден фрагмент не включва или се състои от последователността ERV- 9, както е описано в LA MANTIA et al. (18).
Терминът геномна последователност, частична или пълна, включва всички последователности, асоциирани от кокапсулиране или коекспресия, или рекомбинирани последователности.
За предпочитане, такъв фрагмент включва:
- както нуклеотидна последователност,идентична на частична или пълна геномна последователност от pol гена от вируса MSRV1, с изключение на пълната последователност на нуклеотидния фрагмент, определен от SEQ ID NO: 1, така и идентична на която и да е последователност, еквивалентна на посочената частична или пълна геномна последователност, в частност такава, която да е хомоложна на последната;
- или нуклеотидна последователност, идентична на частична или пълна геномна последователност от гена env от MSRV-1 вируса, или идентична на която и да е последователност, комплементарна на посочената нуклеотидна последователност, или идентична на която и да е последователност^еквивалентна на посочената нуклеотидна последователност, в частност такава, която да е хомоложна на последната.
По- специално, изобретението се отнася до нуклеотиден фрагмент, включващ кодираща нуклеотидна последователност, която е частично или напълно идентична на нуклеотидната последователност, избрана от групата, състояща се от:
- нуклеотидната последователност, определена от SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 или SEQ ID NO: 89;
- последователности, комплементарни на SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 или SEQ ID NO: 89;
- последователности, еквивалентни, и в частност частично хомоложни на SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 iuu SEQ ID NO: 90;
- последователност,кодираща цялата или част от пептидната последователност, еквивалентна и частично хомоложна на SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 90, която може да бъде разпозната от серум на пациенти, инфектирани с MSRV- 1 вирус, или в който вируса MSRV- 1 е реактивиран.
Изобретението се отнася също до която и да е нуклеиново киселинна сонда за откриване на патогенен и/ или инфекциозен агент с MS, който е способен да се хибридизира специфично с който и да е фрагмент като определените по- горе, принадлежащ или лежащ в рамките на генома на дадения патогенен агент. Изобретението се отнася също, в допълнение, към която и да е нуклеиново киселинна сонда за установяване на патогенен и/ или инфекциозен агент, асоцииран с RA, който е способен да се хибридизира ефективно с който и да е фрагмент, както е определен по- горе по отношение на pol и gag гени, и по- специално по отношение на последователностите SEQ ID NO: 40, 51, 56, 59, 60, 61, 62, 89 и SEQ ID NO: 39, 63 и 90.
Изобретението се отнася също до праймер за амплификацията чрез полимеризация на РНК или ДНК от вирусен материал, включващ нуклеотидна последователност, идентична или еквивалентна на по не една част от нуклеотидната последователност на който и да е фрагмент като този, дефиниран по- горе, в частност нуклеотидна последователност, проявяваща за всяка последователност от 10 съседни мономера, поне 70 % хомоложност с поне същата част от посочения фрагмент. За предпочитане, нуклеотидната последователност от такъв праймер е идентична на която и да е от последователностите, избрани от групата, състояща се от SEQ ID NO: 47 go SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55 u SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 86.
Най- общо, изобретението включва която и да е РНК или ДНК, и в частност вектор на репликация, който съдържа геномен фрагмент от вирусния материал такъв, какъвто е дефиниран по- горе, или нуклеотиден фрагмент, такъв?какъвто е дефиниран по- горе.
Изобретението също се отнася до различните пептиди, кодирани от която и да е отворена четяща рамка, принадлежаща на нуклеотиден фрагмент, такъв7какъвто е дефиниран по- горе, в частност всеки полипептид, например който и да е олигопептид, формиращ или включващ антигенна детерминантна, разпознаваема от серум на пациенти, инфектирани с MSRV- 1 и/ или в който вируса MSRV-1 е реактивиран. За предпочитане, този полипептид е антигенен и е кодиран от отворената четяща рамка, принадлежаща, в посока 5’- 3’, на нуклеотид 181 и кодираща 330 от SEQ ID NO: 1.
В частност, изобретението се отнася до антигенен полипептид, разпознаваем от серума на пациенти, инфектирани с MSRV1 вируса, и/ или в който MSRV-1 вируса е реактивиран, чиято пептидна последователност е частично или напълно идентична или е еквивалентна на последователността, дефинирана от SEQ ID NO & 63 и SEQ ID NO: 87; такава последователност е идентична, например, на която и да е последователност, избрана от групата, включваща последователностите SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 63 u SEQ ID NO: 87.
Настоящето изобретение се отнася също до моно- или по ликлонални антитела^насочени срещу вируса MSRV-1, които са получени чрез имунологична реакция на човешко или животинско тяло срещу имуногенен агент, състоящ се от антигенен полипептид като този, определен по- горе.
По- нататък изобретението се отнася до:
- реагенти за установяване на вируса MSRV-, или за показване на последния, включващи, като реактивна субстанция, пептид, в частност антигенен пептид като дефинирания по- горе, или един антилиганд, в частност антитяло срещу посочения пептид;
- всички диагностични, профилактични или терапевтични състави, включващи един или повече пептиди, в частност антигенни пептиди, като дефинираните по- горе, или един или повече антихлиганди, в частност антитела срещу пептидите, дискутирани по- горе; такъв състав е, например, ваксинален състав.
- Изобретението се отнася също до който и да е диагностичен, профилактичен или терапевтичен състав, по- специално инхибиращ експресията на поне един патогенен и/ или инфекциозен агент, асоцииран с MS, който включва нуклеотиден фрагмент като дефинирания по- горе или полинуклеотид, в частност олигонуклеотид, чиято последователност е идентична на тази на посочения фрагмент, с изключение на този от фрагментите, който притежава нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 1. С други думи, изобретението се отнася до който и да е диагностичен, профилактичен или терапевтичен състав, по- специално за инхибиране експресията на поне един патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с RA, включващ нуклеотиден фрагмент като този, дефиниран по- горе по отношение на pol и gag гените, и специално по отношение на последователностите SEQ ID NO: 40, 51, 56, 59, 60, 61, 62 и 89.
Съгласно изобретението тези същите фрагменти или полинуклеотиди, по- специално олигонуклеотиди, могат да участват във всички подходящи състави за установяване, съгласно който и да е подхо дящ процес или метод, на патологичен и/ или инфекциозен агент, асоцииран с MS и RA, съответно, в биологична проба. В такъв процес, в който се предполага, че РНК и/ или ДНК принадлежи или произхожда от посочения патологичен и/ или инфекциозен агент, и/ или техните комплементарни РНК и/ или ДНК, е/ са доведени до контакт с такъв състав.
Настоящето изобретение също се отнася до който и да е метод за откриване присъствието или подлагането на въздействието на такъв патологичен и/ или инфекциозен агент, в биологична проба, чрез довеждане на тази проба в контакт с пептид, в частност антигенен пептид като този, дефиниран по- горе, или на един анти^иганд, по- специално антитяло срещу този пептид, като този, дефиниран по- горе.
Практически, едно примерно съоръжение за откриване на MSRV-1 вирус включва реагент като този, дефиниран по- горе, снабден с твърда повърхност, която е имунологично конкурентна с реагента, и средство за довеждане на биологичната проба, например кръв или цереброспинална течност, които изглеждаме съдържат анти- MSRV-1 антитела, в контакт с този реагент при условия, позволяващи имунологична реакция, също окомплектовани със средства за откриване на имунния комплекс, формиран с този реагент.
Накрая, изобретението се отнася също до откриването на анти- MSRV-1 антитела в биологична проба, например кръвна проба или проба от цереброспинална течност, съгласно което тази проба се довежда до контакт с реагент като посочения по- горе, състоящ се от антитяло, при условия, позволяващи тяхното възможно имунологично действие, и в присъствието на имунния комплекс, формиран с реагента.
Преди подробното описание на изобретението, следва да бъдат дефинирани някои термини:
- под щам или изолат се разбира която и да е инфекциозна и/ или патогенна фракция, съдържаща, например, вируси и/ или бактерии и/ или паразити, генериращи патогенна и/ или антигенна сила, произхожда щи om култура или жив гостоприемник; като пример, вирусен щам съгласно горната дефиниция, може да съдържа коинфективен агент, например патогенни протисти.
- терминът “MSRV“, използван в настоящето описание;сочи който и да е патогенен и/ или инфекциозен агент, асоцииран с MS, поспециално вирусни видове, атенуираните щамове на които или части, съдържащи (кокапсулирани геноми, или алтернативните геноми, рекомбинирани с част от MSRV-1 генома, получени от тези видове. Известни са вируси, и по- специално вируси;съдържащи РНК, притежаващи вариабилност, резултат от относително висока стойност на спонтанна мутация (7).
- под човешки вирус се разбира вирус, способен да инфектира човек, или такъв,произхождащ от хора,
- с оглед на всички природни или индуцирани варианции и/ или рекомбинации, които могат да бъдат изброени при прилагането на настоящето изобретение, обектът на последното, дефинирано по- горе и В претенциите, е експресиран;включвайки еквивалентите или производните на различните биологични материали, определени по- горе, по- специално на хомоложните нуклеотидни или пептидни последователности,
- варианта на вируса или на патогенени/ или инфекциозен агент съгласно изобретението включва поне един антиген, разпознаван от поне едно антитяло, насочено срещу поне един съответстващ антиген на дадения вирус и/ или дадения патогенен и/ или инфекциозен агент, и/ или геном, която и да е част от който се открива с поне една хибридизационна сонда и/ или поне един нуклеотиден праймер за амплификация, специфичен за дадения вирус и/ или патогенен и/ или инфекциозен агент, като например, за MSRV-1 вируса, праймерите и сондите^притежаващи нуклеотидна последователност, избрана от SEQ ID No. 20 go SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 16 go SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 31 go SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ
ID No. 50, SEQ ID No. 45 u техните комплементарни последователности при специални хибридизационни условия, добре известни на специалистите в областта.
Съгласно изобретението нуклеотиден фрагмент или олигонуклеотид или полинуклеотид е аранжимент от мономери, или биополимер, охарактеризирани от информационната последователност на природни нуклеинови киселини, които са способни на хибридизация с който и да е друг нуклеотиден фрагмент при предварително определени условия, е възможна да бъде така конструиран, че да съдържа мономери с различни химични структури и да бъде получен от молекула с природна нуклеинова киселина и/ или чрез генетична рекомбинация и/ или чрез химичен синтез; нуклеотиден фрагмент може да бъде идентичен на геномен фрагмент от MSRV- 1 вируса, дискутиран в настоящето изобретение, по- специално ген на този вирус, напр. pol или env в случая на този вирус,
- така мономер може да бъде природен нуклеотид на нуклеинова киселина, чиито съставни елементи са захар, фосфатна група и азотна база; в РНК захарта е рибоза, в ДНК захарта е 2- дезоксирибоза; в зависимост от това дали нуклеиновата киселина е ДНК или РНК, азотната база е избрана от аденин, гуанин, урацил, цитозин и тимин; или нуклеотида може да бъде модифициран в поне един от трите съставни елемента; като пример, модификацията може да стане в базите, генерирайки модифицирани бази като инозин, 5- метилдезоксицитидин, дезоксиуридин, 5- (диметиламино)дезоксиуридин, 2, 6- диаминопурин, 5бромодезоксиуридин и която и да е друга модифицирана база, промотираща хибридизация; в захарта модификацията може да се състои в изместване на поне една дезоксирибоза от полиамид (8), и във фосфатната група модификацията може да се състои в нейното изместване от естери, избрани, по- специално, от дифосфат, алкил- и арилфосфонат и фосфоротиоатни естери,
- под “информационни последователности“ се разбира всяка подредена последователност от мономери, чиято химична природа и ред в дадена посока или с други думи информация е от същото качество както на природните киселини,
- под хибридизация се разбира процес, по време на който, при подходящи работни условия, два нуклеотидни фрагмента,притежаващи двойка с достатъчна комплементарност, формират комплексна структура, в частност дуплет или триплет, за предпочитане с хеликоидна форма,
- сондата включВа нуклеотиден фрагмент, синтезиран химично или получен чрез разграждане или ензимно разцепване на дълъг нуклеотиден фрагмент, съдържащ поне шест мономера, за предпочитане от 10 до 100 мономера и за предпочитане 10 до 30 мономера, със специфичност на хибридизацията при определени условия; за предпочитане, сонда, съдържаща по- малко от 10 мономера,не се използва самостоятелно, но се използва в присъствие на други сонди със същия малък размер или подобен; при такива специални условия може да е полезно приложението на сонди с размер,по- голям от 100 мономера; сонда може да се използва, в частност, за диагностични цели, като такива молекули са, например, сонди за улавяне и/ или откриване;
- сондите за улавяне могат да бъдат имобилизирани върху твърда повърхност с което и да е подходящо средство, директно или индиректно, например чрез ковалентно свързване или пасивна адсорбция;
- сондата за откриване може да бъде белязана посредством избран маркер, по- специално с радиоактивни изотопи, ензими, в частност, пероксидаза и алкална фосфатаза и тези, способни да хибридизират хромогенен, флуорогенен или луминисцентен субстрат, хромофорни химични съединения, хромогенни, флуорогенни или луминисцентни съединения, аналози на нуклеотидни бази и биотин;
- използваните за диагностични цели сонди по изобретението могат да бъдат използвани във всички познати хибридизационни техники, и частност техниките, наречени “ DOT- BLOT“ (9), “SOUTHERN BLOT“ (10) , “NORTHERN BLOT“, която е техника, идентична на “SOUTHERN BLOT“, но която използва РНК като мишена, и SANDWICH техниката (11) ; в настоящето изобретение се използва с предпочитание SANDWICH техниката , включваща специфична сонда за улавяне и/ или специфична сонда за откриване, при условие;че се разбира, че сондата за улавяне или тази за откриване следва да притежават поне частично различна нуклеотидна последователност;
- всяка сонда съгласно настоящето изобретение може да се хибридизира in vivo или in vitro с РНК и/ или с ДНК за блокиране феномена на репликация, в частност транслация и/ или транскрибция,и/ или за разграждане на посочената ДНК и/ или РНК;
- праймер е сонда, съдържаща поне шест мономера, и предимно от 10 до 30 мономера, притежаващи специфичност на хибридизацията при определени условия за иницииране на ензимна полимеризация, например амплификационна техника като PCR ( полимеразна верижна реакция), в даден елонгационен процес като съгласуване, в метод на обратна транскрибция и др. подобни;
- две нуклеотидни или пептидни последователности са наречени еквиваленти или са получени по отношение на друг един, или по отношение на референтна последователност, ако функционално съответстващи биополимери могат да играят по същество същата роля, без да са идентични, по отношение приложимостта, или техниката, в която те участват; две последователности са, по- специално, еквивалентни, ако са получени като резултат от природна вариабилност, по- специално спонтанна мутация на видовете^от които са били идентифицирани, или индуцирана вариабилност, каквито са две хомоложни последователности, чиято хомоложност е идентифицирана по- горе;
- под “вариабилност“ се разбира която и да е спонтанна или индуцирана модификация на последователност, в частност чрез замест ване и/ или инсерция?и/ или делеция на нуклеотиди и/ или на нуклеотидни фрагменти, и/ или екстензия?и/ или съкращаване на последователността при единия или и в двата края; една неприродна вариабилност може да е резултат от генно инженерни техники, например избора на праймера за синтезата, дегенерация или други, подбрани за амплификация на нуклеинова киселина; тази вариабилност може да се проявява в модификации на всяка изходна последователност, и може да бъде експресирана в степен на хомоложност, съответстваща на сравняваната последователност;
- хомоложността характеризира степента на идентичност на два сравнявани нуклеотидни или пептидни фаргмента; измерва се с процента на идентичност, която е определена, по- специално, чрез директно сравняване на нуклеотидни или пептидни последователности, относително сравняваните нуклеотидни или пептидни последователности;
- този процент на идентичност е специфично определен за нуклеотидните фрагменти, в частност клонове, с които се работи в настоящето изобретение, които са хомоложни на идентифицираните фрагменти за MSRV-1 вируса, чрез SEQ ID NO 1. go No 9, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 56 u SEQ ID NO: 57, а така също и за сондите и праймерите, хомоложни на сондите и праймерите, идентифицирани с SEQ ID NO: 20 go SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 16 go SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 go SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ IDNO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 56 u SEQ ID NO: 57; например, най- малкият процент на идентичност, наблюдаван между различните основни консенсусни поледователности от нуклеинови киселини, получени от фрагменти на MSRV1 вирусна РНК, произхождаща от линии LM7PC и PLI-1 съгласно последния подробен протокол, е 67% в участъка, показан на фигура 1,
- всеки нуклеотиден фрагмент се нарича еквивалентен или получен от съотВетен фрагмент, ако той притежава нуклеотидна последователност, еквивалентна на последователността на съответ ния фрагмент; в съотВетствие с горната дефиниция еквивалентни на съответните нуклеотидни фрагменти са следните:
а) всеки фрагмент, способен на хибридизация поне частично с комплемента на еталонния фрагмент,
в) всеки фрагмент, чието изравняване със съответстващия фрагмент води до получаване на по- голям брой съседни идентични бази в сравнение с който и да е друг фрагмент, произхождащ от друга таксономична група,
c) всеки фрагмент, резултат от, или който може да се получи от природната вариабилност на видовете, от които е получен,
d) всеки фрагмент, който може да се получи с генно инженерни техники, приложени на еталонния фрагмент,
e) всеки фрагмент, съдържащ поне осем съседни нуклеотида, кодиращи пептид, хомоложен или идентичен на пептида, кодиран от еталонния фрагмент,
f) всеки фрагмент, който е различен от еталонния фрагмент по инсерция, делеция или субституция на поне един мономер, или удължаване или съкращаване при един или и при двата му края; например, всеки фрагмент, съответстващ на еталонния фрагмент, фланкиран при един или и при двата му края посредством нуклеотидна последователност, която не кодира полипептид,
- под полипептид се разбира, по- специално, всеки пептид с поне две аминокиселини, в частност олигопептид или протеин, екстрахиран, разделен или по същество изолиран или синтезиран чрез човешка интервенция, в частност такива, получени с химичен синтез или чрез експресия в рекомбинантен организъм,
- под полипептид ^частично кодиран от нуклеотиден фрагмент,се разбира полипептид, притежаващ поне три аминокиселини, кодирани от поне девет съседни мономера, лежащи в рамките на дадения нуклеотиден фрагмент,
- една аминокиселина се нарича аналог на друга аминожиселина,когато техните съответстващи физикохимични свойства, като полярност, хидрофобност и/ или основност;и/ или киселинност^/ или неутралност са по същество еднакви; така, левцинът е аналог на изолевцина.
- всеки полипептид се нарича еквивалент или получен от еталонен полипептид, ако сравняваните полипептиди притежават по същество еднакви свойства, и в частност същите антигенни, имунологични, ензимологични и/ или молекулни свойства на разпознаване; по- специално еквивалентни на еталонния полипептид са:
a) всеки полипептид, притежаващ последователност, в която поне една аминокиселина е заместена от аналогична аминокиселина,
b) всеки полипептид, притежаващ еквивалентна пептидна последователност, получена с природни или индуцирани вариации на дадения еталонен полипептид и/ или на нуклеотидния фрагмент, кодиращ дадения полипептид,
c) мимотоп на дадения еталонен полипептид,
d) всеки полипептид в чиято последователност една или повече аминокиселини от L серията са заместени от една аминокиселина от D серията, и
e) всеки полипептид в чиято последователност е въведена модификация на страничните вериги на аминокиселините, като например, ацетилиране на аминните функции, карбоксилация на тиоловите функции, естерификация на карбоксиловите функции,
f) всеки полипептид, в чиято последователност са модифицирани една или повече от пептидните връзки, като например, карба, ретро, инверсо, ретро-инверсо, редуцирани и метиленокси връзки,
g) всеки полипептид, поне един антиген от които се разпознава с антитяло, насочено срещу еталонния полипетид,
- процента на идентичност, охарактеризиращ хомологията на два сравнявани пептидни фрагмента^ поне 50% и за предпочитане поне 70%.
С оглед на факта, че вирус,притежаващ обратно транскрибтазна ензимна активност,може да бъде генетично охарактеризиран еднакво добре в РНК и в ДНК форма, както вирусната ДНК, така и РНК биха могли да бъдат използвани за охарактеризиране на последователността,отнасяща се до вирус, притежаващ такава обратно транскрибтазна активност, наречена MSRV- 1 съгласно настоящето патентно описание.
Изразяването на реда, използван в настоящето описание и в претенциите, като “първа нуклеотидна последователност“ не са възприети да изразят някакъв определен ред, а за да определят изобретението по- ясно.
Откриването на вещество или агент означава едновременно идентифициране и количествено определяне, или разделяне и изолиране, на даденото вещество или дадения агент.
По- добро разбиране на изобретението би могло да се постигне при прочитане на подробното описаниежоето следва, изготвено с използване на приложените фигури, в които:
- фигура 1 показва основната консенсусна последователност на нуклеинови киселини от MSRV- 1В клонове, амплифицирани с PCR техниката в участъка “ро1“, определен от Shih (12), от вирусна ДНК, произхождаща от линии LM7PC и PLI- 2, и идентифицирани от еталонните SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 u SEQ ID NO: 6, и общото съгласуване c праймерите за амплификация, носещи еталонната SEQ ID NO: 7;
- фигура 2 дава определението на функционална четяща рамка за всеки MSRRV- 1В/ “PCR ро1“ тип семейство, като семействата А до D са дефинирани, съответно от нуклеотидните последователности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 u SEQ ID NO: 6, описани на фиг. 1;
- фигура 3 дава пример за съгласуване на MSRV- 2В последователностите, идентифицирани от SEQ ID NO: 11;
- фигура 4 е предстаВяне на обратно транскрибтазната (RT) активност в dpm (дезинтеграция за минута) в захарозни фракции, взети от градиента на пречистване на вириони, получени от В лимфоцитите в култура от пациент, страдащ от MS;
- фигура 5 дава при същите експериментални условия както на фигура 4 изпитване на обратно транскрибтазната активност в културата от В лимфоцитна линия, получена от контрола, свободна на MS;
- фигура 6 показва нуклеотидната последователност на клона PSJ17 (SEQ ID NO: 9);
- фигура 7показва нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 8 на клона,означен МООЗ- РОО4;
-фигура 8 показва нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 2 на клона Fll-1; частта, локализирана между двете стрелки в участъка на праймера съответства на вариабилността в зависимост от праймера, който е използван за клонирането на Fll- 1; в същата тази фигура е показана транслацията в аминокиселини;
- фигура 9 показава нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 1, и възможната функционална четяща рамка на SEQ ID NO: 1 посредством аминокиселини; на тази последователност е подчертана консенсусната последовталеност на pol гена;
- фигури 10 и 11 дават резултатите от PCR, под формата на снимки в ултравиолетова светлина на импрегниран с етидиум бромид агарозен гел, на продукти на амлификацията,получени от праймерите, идентифицирани с SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 u SEQ ID NO: 19;
- фигура 12 представя в матрична форма на хомологията между SEQ ID NO: 1 на MSRV-1 и един ендогенен ретровирус, означен HSERV9],ma3u хомология от поне 65% е показана с непрекъсната линия, липсата на линия означава хомология от по- малко от 65%;
- фигура 13 показва нуклеотиднаша последователност на SEQ ID NO: 46 на клона Fbd3;
- фигура 14 показва секвенционната хомоложност между клона Fbd3 и HSERV- 9 ретовируса;
- фигура 15 показва нуклеотиднаша последователност SEQ ID NO; 51 на клона t pol·,
- фигури 16 и 17 показват, съответно, нуклеотидните последователности SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53 на клоновете JLBcl и JLBc2, съответно;
- фигура 18 показва секвенционната хомология между клона JLBcl и клона Fbd3;
Фигура 19 секвенционната хомология между клоновете JLBc2 и клона Fbd3;
- фигура 20 показва секвенционната хомология между клоновете JLBcl и JLBc2;
- фигури 21 и 22 показват секвенционната хомоложност между HSERV- 9 ретровируса и клоновете JLBcl и JLBc2, съответно;
- фигура 23 показва секвенционната хомоложност между HSERV- 9 ретровируса и клона GM3;
- фигура 25 показва локализацията на различните изучени клонове, съответно на генома на известния ретровирус ERV9;
- фигура 26 показва позицията на клоновете Fll- 1, МООЗРОО4, MSRV- IB и PSJ17 в участъка, означаван от тук нататък MSRV1 pol*;
- фигура 27, сбор от три фигури 27а, 27 b и 27с, показва четяща рамка, покриваща пълния генpol·,
- фигура 28 показва, съгласно SEQ ID NO: 40, кодираща ептидния фрагмент POL2B, притежаващ аминокиселинната последователност, идентифицирана от SEQ ID NO: 39;
- фигура 29 показва стойностите OD (ELISA тестове) при
492 nm, получени за 29 серума на пациенти с MS и 32 серума на здрави контроли, тестувани с анти- IgG антитяло;
- Фигура 30 показва стойностите OD (ELISA тестове) при 492 пт получени за 36 серума от пациенти с MS и 42 серума от здрави контроли, тестувани с анти- IgM антитяло;
- фигури 13 до 33 показват резултатите, получени (относителна интензивност на петната) за 43 припокриващи се октапептиди, покриващи аминоАиселинната последователност 61- 110, съгласно техниката на Spotscan, съответно с MS серум след извеждане на базата, съответстваща на максималния открит сигнал, открит при поне един октапептид с контролния серум (интензитет =1), като се има предвид, че тези серуми се разреждат 1 50. Ивицата при далечния десен край представя графичен стандарт, несвързан със серологичния тест;
- фигура 34 показва SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 на два полипептида, съдържащи имунодоминант [lacuna], докато SEQ ID NO: 43 и 44 представя имунореактивни полипептиди, специфични за NS;
- фигура 35 показва нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 59 на клона LB19 и три потенциални четящи рамки на SEQ ID NO: 59 определени с аминокиселини;
- фигура 36 показва нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 88 (GAG*) и потенциална четяща рамка на SEQ ID NO: 88 посредством аминокиселини;
- фигура 37 показва секвенционната хомоложност между клона Fbdl3 и HSERV- 9 ретровируса; съгласно това представяне непрекъснатата линия означава процента хомоложност по- голяма или еднаква на 70%, а липсата на линия означава по- малък процент на хомоложност;
- фигура 38 показва нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 61 на клона FP6 и три потенциални четящи рамки на SEQ ID NO 61 чрез аминокиселини;
- фигура 39 показва нуклеотидната последователност SEQ
ID NO: 89 на клона G+E+A u mpu потенциални четящи рамки на SEQ ID
NO: 89 посредством аминокиселини;
- фигура 40 показва четяща рамка, установена в участъка Е и кодираща MSRV- 1 ретровирусна протеаза, идентифицирана с SEQ ID NO: 90;
- фигура 41 показва отговора на всеки серум от пациенти, страдащи от MS, означени със символа (-), тестуван с анти- IgG антитяло, изразен като чиста оптична плътност 492 пт;
- фигура 42 показва отговора на всеки серум от пациенти, страдащи от MS, означени със символите (+) и (QS), и на здрави пациенти (-), тестувани с анти- IgM антитяло, изразен като чиста оптична плътност 492 пт.
ПРИМЕР 1: Получаване на клонове, означени MSRV- 1В и MSRV- 2В, определящи съответно ретровируса MSRV-1 и коинфективния агент MSRV2, чрез “NESTED“ PCR амплификация на съхранения pol участък от ретровируси на вирионни препарати, произхождащи от линии LM7PC и PLI- 2.
Използва се PCR техниката, публикувана от Shih (12). Тази техника позволява да бъдат отстранени всички следи от контаминантна ДНК чрез третиране на всички компоненти от реакционната среда с ДНК- аза. Това става възможно с използването на различни, но припокриващи се праймери в две серии PCR амплификационни цикъла, за повишаване измененията на амплифицираща се сДНК, синтезирана от количество РНК, което е малко при началото и твърде редуцирано в пробата от лъжливото действие на ДНК- азата върху РНК. При действие, ДНК- азата се използва при условия на активност в излишък, което позволява всички следи от контаминантна ДНК да бъдат отстранени преди инактивация на този ензим, оставащ в пробата чрез загряване до 85 С за 10 минути. Този вариант на PCR техниката, описан от Shih (12);се използва на сДНК, синтезирана от нуклеиновите киселини от фракции от инфекциозни частици, пречистени върху захарозен инградиент съгласно техниката, описана от Н. Perron (13) от “POL- 2“ изолата (ECACC No. V92072202) , продуциран от линия PLI- 2 (ECACC No. 92072201) от една страна, и от MS7PG изолат (ECACC No. V93010816), продуциран от линия LM7PC (ECACC No. 93010817) от друга страна. Тези култури са получени съгласно методите, които формират обекта на патентните описания, публикуВани под Nos. WO 93/ 20188 и WO 93/ 20189.
След клониране на продуктите, амплифицирани по тази техника с ТА Cloning KitT и анализ на последователността с помощта на Applied Biosystems model 373А Automatic Sequencer, последователностите се подлагат на анализ с помощта на GeneworksT софтуер от последната достъпна версия на GenebankT база данни.
Клонираните и съгласувани последователности от тези проби съответстват в частност на два типа последователности: първият тип последователност, която може да бъде открита в повечето от клоновете (55% от клоновете, произхождащи от POL- 2 изолатите от PLI- 2 културата, и 67% от клоновете, произхождащи от изолатите MS7PG на културата LM7PC), която съответства на семейство от “роГ‘ последователности, твърде сходни на, но различни от, ендогенния човешки ретровирус, означен ERV- 9 или HSERV- 9, и втори тип последователност, която съответства на последователности твърде много хомоложни на последователност, близка до друг инфекциозен и/ или патогенен агент, обозначен MSRV- 2.
Първият тип последователност, представяща множеството от клоновете, се състои от последователности, чиято вариабилност позволява да бъдат определени четири подсемейства от последователности. Тези подсемейства са достатъчно сходни на един друг, за който7за да бъде считан за квази- вид, произхождащ от същия ретровирус, който е добре известен за HIV-1 ретровирусите (14), или да бъде резултат от интерференция с няколко ендогенни провируси, ко-^регулирани в продуциращите клетки. Тези повече или по- малко дефекни ендогенни елементи са чувствителни на същите регулаторни сигнали, вероятно генерирани от репликативен ретровирус, доколкото те принадлежат на същото семейство от ендогенни ретровируси (15). Това ново семейство от ендогенни ретровируси, или обратно, тези нови ретровирусни видове,от които в културата е получено поколение от квазиИЗидове, и които съдържат консенсус от последователностите, описани по-горе, е означено MSRV- 1В.
фигура 1 представя общите консенсусни последователности от оследователностите на различните MSRV- 1В клонове, съгласувани в този експеримент, като тези последователности са идентифицирани, съответно , от SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 u SEQ ID NO:
6. Тези последователности показват хомоложност по отношение на нуклеиновите киселини, граничещи от 70% до 88% с HSERV9 последователността, означена като Х57147 и М37638 в Genebank базата данни. Определени са четири “консенсусни“ последователности от нуклеинови киселини, представителни за различни квазиЯЗидове от вероятно екзогенния ретровирус MSRV- IB, или от различни подсемейства от ендогенен ретровирус MSRV- IB. Тези представителни консенсусни последователности са представени на фигура 2 с техните аминокиселини. Фунукционална четяща рамка съществува за всяко под семейство от тези MSRV- IB последователности, и може да се види, че функционалната отворена четяща рамка съответства във всяко отношение на аминожиселинните последователности, появяващи се на втората линия под последователността от аминокиселини. Съгласуването на MSRV- IB последователността, идентифицирана от SEQ ID NO: 7 и получена с тази PCR техника в участъка “ро1“, е представена на фигура 1.
Вторият тип последователности, представящи множеството от съгласуваните клонове, е представен от последователността
MSRV- 2В^представена на фигура 3 и идентифицирана от SEQ ID N0:11. Разликите, наблюдавани в последователностите, съответстващи на PCR праймерите се обясняват с използването на дегенеративни праймери в смес, използвана при различни технични условия.
Последователността MSRV- 2В (SEQ ID N0:11) е различна в достатъчна степен от ретровирусните последоваталености, вече описани в базата данни, така че да се предположи ?че въпросният участък принадлежи на нов инфекциозен агент, означен MSRV- 2. Този инфекциозен агент, по принцип, би бил на базата на анализа на първите получени последователности, сроден на ретровирус, но с оглед на използваната техника за получаване, това би могло да е ДНК вирус, чийто геном кодира ензим, който инцидентно придобива обратно транскрибтазна активност, както в случая, например, с вируса на хепатит В, HBV (12). Нещо повече, случайната природа на използваните дегенеративни праймери за тази PCR амплификационна техника може много добре да бъде разрешена като резултат от непредвидени секвенционни хомологии или съхранени места в гена за сподния ензим, амплификацията на нуклеинова киселина, произхождаща от прокариотичен или еукариотичен патогенен и/ или коинфекциозен агент (протист).
ПРИМЕР 2: Получаване на клонове, означени като MSRV1В и MSRV- 2В, определящи семейство NSRV-1 и MSRV- 2 чрез “NESTED“ PCR амплификация на съхранени pol участъци на ретровируси в препарати на лимфоцити от нов случай на MS.
Използва се същата PCR техника, модифицирана съгласно техниката на Shih (12) за амплификация и съгласуване на РНК материала от нуклинови киселини, присъстващ в пречистена фракция от вириони в пика на “LM7- подоба“ обратно транскрибтазна активност върху захарозен градиент съгласно техниката, описана отН. Perron (13) и съгласно протоколите, посочени в Пример 1, от спонтанна линия на лимфоблас тоидни клетки, получени чрез самоунищожаване в култура на В лимфоцити от MS пациент, който е серопозитиван за Вируса на Epstein- Barr (EBV), след поставяне на кръвни лимфоидни клетки в култура в подходяща среда, съдържаща подходяща концентрация на циклоспорин А. На фигура 4 е представена обратно транскрибтазната активност в захарозни фракции, взети от градиент на пречистване на вириони, продуцирани с тази линия. Аналогично на това, супернатанти от култура на В линия, получена при същите условия от контрола, свободна на на MS, се третират при същите условия, и пробата от обратно транскрибтазна активност във фракциите на захарозния градиент доказват негативния край, което е представено на фигура 5. Фракция 3 на градиента, съответстващ на MS линия В и същата фракция без обратно транскрибтазна активност на контролата без MS се анализират по същата RT- PCR техника, както по- горе, получена от Shih (12), последвано от същите етапи на клониране и съгласуване,както е описано в Пример 1.
Специално е подчертано, че последователностите от типа на MSRV-1 и MSRV- 2 са намерени само в материал, асоцииран с пик от “LM7- подобна“ обратно транскрибтазна активност, произхождаща от MS В лимфобластоидна линия. Тези последователности не са установени в материал от контролата (non- MS) В лимфобластоидна линия в 26 рекомбинантни клона, взети случайно. Само контаминантни последователности тип Мо- MuLV, произхождащи от търговска обратна транскрибтаза, използвана за етапа на сДНК синтезата, и последователности без каквато и да е аналогия с ретровируса са установени в контролата, като резултат от “консенсусна“ амплификация на хомоложни полимеразни последователности, които се продуцират с тази PCR техника. Нещо повече, липсата на концентрирана мишена, която да конкурира за реакцията на амплификация в контролната проба, позволява амплификацията на разредени контаминанти. Разликата в резултатите се манифестира особено ярко (chi- квадратно, р< 0. 001).
ПРИМЕР 3: Получаване на клон PSJ17, определящ ретровирус MSRV-1, чрез реакция на ендогенна обратна транскрибтаза с препарат на вирион, произхождащ от линия PLI- 2.
Този подход е насочен срещу получаване на обратно^нпранскрибтазни ДНК последователности от предполагаеми ретровирусни РНК в изолат, с помощта на обратнонпранскрибтазната активност, представена в същия изолат. Тази обратнсипранскрибтазна активност може теоретично да функционира само в присъствието на ретровирусна РНК, свързана към праймерна tPHK или хибридизирана с къси вериги на ДНК, вече транскрибирани с обратна транскрибтаза в ретровирусните частици (16). Така, получаването на специфични ретровирусни последователности в материал, контаминиран с клетъчни нуклеинови киселините оптимизира съгласно тези автори посредством специфична ензимна амплификация на части от вирусни РНК с вирусна обратнотзранскрибтазна активност. Към този край, авторите определят специални физикохимични условия, при които тази ензимна активност на обратна транскрибция върху РНК,съдържаща се във вириони?би била ефективна in vitro.Тези условия съответстват на техническите описания на протоколите, представени по- долу (ендогенна RT реакция, пречистване, клониране и съгласуване).
Молекулярният подход се състои в използването на препарат от концентриран, но непречистен вирион, получен от културални супернатанти на линия PLI- 2, изготвени съгласно следния метод: супернатантите от културите се събират два пъти седмично, прецентрофугират се на 10 000 грт за 30 минути за отстраняване на клетъчните дебриси и след това се охлаждат на - 80° С или се използват такива, каквито са за следващите етапи. Пресните или размразени супернатанти се центрофугират върху възглавница от 30% глицерол- PBS при 100 000 g (или 30 000 грт в ротор тип 45 Т LKB- HITACHI) за 2 часа при 4° С.
След отстраняване на надутаечната течност, отделената утайка се смесва отново с малък обем PBS и представлява фракцията концентриран, но непречистен вирион. Тази вирусна проба концентрирана, но непречистена се използва за извършване на реакция^наречена ендогенна обратна транскрипция, както е описано тук по-нататък.
Обем от 200 μΐ от вириона.пречистен съгласно протокола,описан тук по-горе и съдържащ активност на обратна транскриптаза около 1-5 милиона dpm, се размразява при 37°С до поява на течна фаза, след което се поставя върху лед. Прибавя се буфер,концентриран 5 пъти със следните съставки: Трис-HCl pH 8,2, 500 mM; NaCl 75 тМ; MgCl, 25 тМ; DTT 75 тМ и NP 40 0,10%; 100ц1 буфер 5Х + 25μ1 разтвор на dATP 100 тМ + 25 μΐ разтвор на dTTP 100 тМ + 25 μΐ разтвор на dGTP 100 тМ + 25 μΐ разтвор на dCTP 100 тМ + 100 μΐ стерилна дестилирана вода + 200 μΐ от суспензията от вириона (активност Τ.Ι. 5 милиона DPM) в DPS се смесват и инокулират при 42°С в продължение на 3 часа. След тази инкубация, реакционната смес се прибавя директно към буферирана смес фенол/хлороформ/изоамилов алкохол (Sigma ref. Р 3803); водната фаза се събира и към органичната фаза се прибавя един обем стерилна дестилирана вода, за да се екстрахира останалият ядрен материал. Събраните водни фази се обединяват отново и съдържащите се нуклеинови киселини се утаяват чрез прибавяне на натриев ацетат ЗМ, pH 5,2 по 1/10 от обема + 2 обема етанол + 1 μΐ гликоген (Boehringer-Manheim ref. 901 393) и пробата се поставя при -20°С в продължение на 4 часа. Получената утайка след концентриране след това се промива с 70%-ен етанол и се суспендира в 60 ml дестилирана вода. След това продуктите на тази реакция се пречистват, клонират и секвенционират съгласно протокола7описан тук по-нататък; получават се ДНК с отворени краища с несдвоени аденини в краищата: най-напред се извършва реакция на запълване: 25 μΐ разтвор на ДНК7 предварително пречистена^се смесва с 2 μΐ разтвор 2,5 шМ, съдържащ в еквимолекулни количества dATP + dGTP 4- dTTP + dCTP/1 ml om T4 ДНК полимераза (Boehringer- Mannheim ref. 1004 786) / 5 ml om Юх “инкубационен буфер за рестрикционен ензим“ (BoehringerMannheim ref 1417 975N /1 ml 1% разтвор на албумин в говежди серум /16 ml стерилна дестилирана вода. Тази смес се инкубира в продължение на 20 мин при 11° С. 50 ml от ТЕ буфер и 1 ml гликоген (Boehringer- Mannheim ref. 901 393) се добавят преди екстракцията на нуклеинови киселини с фенол/ хлороформ/изоамилов алкохол (Sigma ref. Р 3803) и преципитацията с натриев ацетат?както е описано по- горе. Преципитираната след центрофугиране Днк се ресуспендира в 10 ml 10 тМ Tris буфер с 20 ml 5х Taq буфер, 20 ml от 5 тМ dATP, 1 ml (5U) Taq ДНК полимераза (Amplitaqg) и 54 ml стерилна дестилирана вода. Тази смес се инкубира в продължение на 2 часа при 75 ° С с маслен филм върху повърхността на разтвора. Суспендираната ДНК във водния разтвор се изважда изпод масления филм след инкубация, както е описано по- горели се ресуспендира в 2 ml стерилна дестилирана вода. Получената ДНК се инсертира в плазмид с помощта на ТА CloningO кит. 2 ml от разтвора на ДНК се смесва с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml 10- кратно концентриран лигационен буфер “Юх LIGATION BUFFER“, 2 ml “pCRQ вектор“ ( 25 ng/ ml) и 1 ml “ТА ДНК o
лигаза“. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ при 12 С. След това се провеждат етапите съгласно инструкциите на ТА CloningT кит (British Biotechnology). Към края на процедурата белите колонии от рекомбинантна бактерия (white) се отделят с оглед култивиране, което да позволи екстракция на плазмидите, включени съгласно така наречената “miniprep“ процедура (17). Плазмидният продукт от всяка рекомбинантна колония се изрязва с подходящ рестрикционен ензим и се анализира върху агарозен гел. Плазмидите, притежаващи инсерт, установен с UV светлина след оцветяване на гела с етидиум бромид се подбират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на Sp6 промотор, намиращ се в плазмида за клониране от ТА cloning китаТ. Реакцията преди съгласуването след това се провежда съгласно метода, препоръчан за приложение с кита за съгласуВане “ Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit“ (Applied Biosystems, ref. 401384), a автоматично съгласуване се провежда с апарат на Applied Biosystems “Automatic Sequencer, model 373 А” съгласно инструкциите на производителя.
Анализите за разбор на компютризираните бази данни за последователностите, клонирани от ДНК фрагментите, намиращи се в реакционната смес позволяват да бъде изявен типа на ретровирусната последователност. Съответният клон PSJ17 е напълно съгласуван и получената съответно последователност, представена на фигура 6 и идентифицирана от SEQ ID N0: 9, е анализирана с помощта на “Geneworrks“ софтуер на актуализирани бази данни на “GenebankT“. Една вече описана идентична последователност не би могла да бъде намерена чрез анализ на базите данни. Би могла дфъде установена само частична холожност с някои известни ретровирусни елементи. Най- приложимата относителна хомоложност се отнася до един ендогенен ретровирус, означен ERV9, или HSERV- 9, съгласно литературен източник (18).
ПРИМЕР 4: PCR амплифкация на последователностите на аминокиселини, намиращи се между 5’ участъка, определен от клона “ pol MRSV- lByU 3’ участъка, определен от клона PSJ17.
Определени са пет олигонуклеотида, М001- А, М002- А, М003BCD, Р004 и Р005, с оглед амплификация на РНК^произхождаща от пречистени POL- 2 вириони. Проведени са и контролни реакции за проверка присъствието на контаминанти (реакция с вода). Амплификацията се състои от един RT- PCR етап съгласно протокола, описан в Пример 2, последвана от “гнездова“ PCR съгласно PCR протокола, описан в документа ЕР- А- 0 569 272. В първия PCR цикъл се използват праймерите Р001 и Р004. Във втория PCR цикъл се използват праймерите М002- А илиМООЗBCD и праймера Р004. Праймерите са разположени по следния начин:
М002- A
M003- BCD
MOO1 _____ P004 P005 __________________________________ РНК
POL-2 pol MSRV- IB PSJ17
Тяхната структура е :
праймер M001: GGTCITICCICAIGG (SEQ ID NO: 20) праймер M002 - A: TTAGGGATAGCCCTCATCTCT (SEQ ID NO: 21) праймер M003- BCD: TCAGGGATAGCCCCCATCTAT (SEQ ID NO: 22) праймер P004: AACCCTTTGCCACTACATCAATTT (SEQ ID NO: 23) праймер P005: GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT (SEQ ID NO: 24)
Полученият “гнездови“ амплификационен продукт , означен М003- Р004, е представен на фигура 7 и съответства на последователността SEQ ID N0: 8.
ПРИМЕР 5: Амплификация и клониране на част от MSRV-1 ретровирусния геном с помощта на вече идентифицирана последователност и вирусна проба, пречистена при пика от обратнсипранскрибтазна активност.
Ицзползва се PCR техника, получена от тази, публикувана от Frohman (19). Получената техника прави възможно амплифициране с помощта на специфичен праймер при 3’ края на генома и анализиране на удължената последователност срещу 5 ’ участъка на генома. Този технически вариант е описан в документацията на Clontech Laboratories Inc. ”, (Palo- Alto California, USA), снабдена c техния продукт “5’- AmpliFINDER RACE Kit“, който се използва за фракция от вириона, пречистена,както е описана по- горе.
Специфичните 3’ праймери, използвани в протокола за кита за синтез на сДНК и PCR амплификацията^са, съответно, комплементарни на следните MSRV-1 последователности:
сДНК : TCATCCATGTACCGAAGG (SEQ ID NO: 25) амплификация: ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT (SEQ ID NO: 26)
Продуктите, произхождащи от PCR?ce пречистват след пречистване върху агарозен гел съгласно обичайните за целта методи (17) и след това се ресуспендират в 10 ml дестилирана вода. Доколкото едно от свойствата на Taq полимеразата се състои в добавяне в 3’ края на всяка от двете ДНК вериги, получената ДНК се инсертира директно в плазмид с помощта на ТА CloningO (British Biotechnology). 2 ml от разтвор на ДНК се смесва с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml 10- кратно концентриран буфер за свързване “ 10’ LIGATION BUFFER“, 2 ml “pCRO VECTOR“ (25 ng/ ml) и 1 ml “ТА ДНК ЛИГАЗА“. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ при 12 С. Следващите етапи се провеждат съгласно инструкциите на ТА Cloning Т кит (British Biotechnology). Към края на процедурата белите колонии от рекомбинантна бактерия (white) се отделят с оглед култивиране и екстрахиране на включените плазмиди съгласно така наречената процедура “miniprep“ (17). Плазмидните препарати, получени от всяка рекомбинантна колония^се изрязват с подходящ рестрикционен ензим и се анализират върху агарозен гел. Плазмидите, притежаващи инсерт, установен с UV светлина след оцветяване на гела с етидиум бромид, се подбират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на Sp6 промотора, намиращ се в клониращия плазмид от ТА Cloning KitT. След това се провежда реакцията преди съгласуването съгласно метода, препоръчаващ използването на кит за съгласуване “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit“ (Applied Biosystems, ref. 401384) и провеждане на автоматично съгласува34 не с апарат на Applied Biosystems “Automatic Sequencer model 373 A “ съгласно инструкциите на производителя.
Тази техника е приложена най- напред спрямо две фракции на вирион, пречистени^както е описано по- долу върху захарозен изолат от “POL- 2“ продуциран от линия PLI- 2 от една страна, и от MS7PG изолат, продуциран от линия LM7PC от друга. Културалните супернатанти се събират два пъти седмично, прецентрофугират се при 10 000 грт в продължение на 30 минути за отстраняване на клетъчните дебриси и след о
това се замразяват на - 80 С или се използвати директно за следващите етапи. Пресните или размразени супернатанти се центрофугират на възглавница от 30% глицерол- PBS при 100 000 g (или 30 000 грт в ротор тип 45Т LKB- HITACHI) в продължение на 2 часа при 4° С. След отстраняване на супернатантата утайката се отстранява в малък обем от PBS и съставлява фракцията на концентрирани^но непречистени вириони. Концентрираният вирус след това се прилага на захарозен градиент в стерилен РВЗбуфер (15 до 50% тегло/ тегло) и се подлага на ултраценто рофугиране при 35 000 грт (100 000 g) за 12 часа при +4 С в ротор на клатачка. Събират се 10 фракции и от всяка фракция се отделят 20 ml след хомогенизиране за изпитване на обратнскпранскрибтазната активност съгласно техниката, описана от Н. Perron (3). фракциите, съдържащи пика на “LM7- подобна“ RT активност^след това се разреждат в стерилен PBS буфер и се подлагат на ултрацентрофугиране за един час при 35 000 грт (100 000 g) за утаяване на вирусните частици. Утайката от пречистен вирион, получена по този начищслед това се поставя в малък обем буфер, подходящ за екстрахиране на РНК. Синтезата на сДНК, посочена по- горене провежда върху тази РНК, екстрахирана от пречистен екстрацелуларен вирион. PCR амплификацията съгласно посочените по- горе техники позволява получаването на клона F1-11, чиято последователност, идентифицирана от SEQ ID NO: 2^е представена на фигура 8.
Този клон дава възможност да бъде дефиниран с помощта на различни по- рано съгласувани клонове, относително дълъг участък (1. 2 kb),представителен за “ро1“ гена на MSRV-1 ретровируса, както е показан на фигура 9. Тази последователност, означена SEQ ID NO: 1, е реконституирана от различни клонове, припокриващи се един друг в краищата си и съответстващи на артефактите,свързани с праймерите и с техниките за амплификация или клониране, които по изкуствен начин прекъсват четящата рамка. Тази последователност се идентифицира подолу под означението “MSRV-1 pol* участък“. Нейната степен на хомоложност с HSERV- 9 последователността е показана на фигура 12.
На фигура 9 е представена потенциалната четяща рамка посредством нейната аминокиселинна последователност.
ПРИМЕР 6: Установяване на специфични MSRV-1 и MSRV2 последователности в различни проби плазма, взета от пациенти?страдащи от MS,или от контроли.
За откриване на MSRV-1 и MSRV- 2 геноми в плазма, получена след взимане на кръвни проби от пациенти,страдащи от MS,и от неMS контролите използва PCR върху EDTA.
Екстрахирането на РНК от плазма се осъществява съгласно техниката, описана от Р. Chomzynski (20), след добавяне на един обем буфер, съдържащ гуанидин тиоцианат към 1 ml плазма, съхранявана в замQ разено състояние при - 80 С след събирането й.
За MSRV- 2, PCR се провежда при същите условия и със следните праймери:
- 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 14
5’ GTAGTTCGATGTAGAAAGCG У;
- 3’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 15 5’ GCATCCGGCAACTGCACG 3’.
Обаче, сходни резултати са получени също и със следващите праймери в две успешни амплификации от “гнездова“ PCR върху проби нуклеинови киселини, които не са обработвани с ДНК- аза.
Праймерите, използвани за този първи етап от 40 цикъла с хибридизационна температура от 48 С^са следните:
- 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 27
5’ GCCGATATCACCCGCCATGG 3’, съответстващ на 5’ MSRV- 2 PCR праймер, за първата PCR върху проба от пациенти,
- 3’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 28
5’ GCATCCGGCAACTGCACG 3’ , съответстващ на 3’ MSRV- 2 PCR праймер, за първата PCR върху проба от паценти.
След този етап се взимат 10 ml от амплификационния продукт и се използва за провеждане на втора, така наречена “гнездова“ PCR амплификация с праймери, локализирани в участъка, който е бил вече амплифициран. Този втори етап включва над 35 цикъла с температура на хибридизация 50° С. Обемът на реакцията е 100 ml.
Праймерите, използвани в този втори етапна:
- 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 29
5’ CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3’, съответстващ на 5‘ MSRV- 2 PCR праймер, за гнездова PCR върху проби от пациенти,
- 3’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 30
5’ TCTCCACTCCGAATATTCCG 3’, съответстващ на 3’ MSRV- 2 PCR праймер, за гнездова PCR върху проби от пациенти.
За MSRV-1 амплификацията се провежда на два етапа. Нещо повече, пробата нуклеинови киселини се третира предварително с ДНКаза и се провежда контролна PCR без RT (AMV обратна транскрибтаза) в двата амплификационни етапа^така че да се RT- PCR амплификацията произхожда изключително от MSRV- 1 РНК. В случай на позитивна контрола без RT, изходната аликвотна проба РНК отново се третира с ДНКаза и се амплифицира отново.
Протокола за третиране с ДНК- аза без РНК- азна активност е следният: екстрахираната РНК се уравновесява в присъствие на “РНК- азен инхибитор“ (Boehringer- Mannheim) Във вода, обработена с DEPC при крайна концентрация 1 ml в 10 ml, 1 ml “свободна от РНК- аза ДНК- аза“ (Boehringer Mannheim) и 1. 2 ml буфер с pH 5, съдържащ 0. 1 М/1 натриев ацетат7и се добавят 5 тМ/1 MgSO4; сместа се инкубира за 15 мин. при 20р С и се довежда до 95° С за 1. 5 мин в “термоциклер“.
Първият MSRV-1RT- PCR етап се провежда съгласно вариант на метода за амплификация на РНК,както фписан в Патентно описание No. ЕР- А-0 569 272. По- специално, етапагна синтез на сДНК се провежда при 42 С за един час; PCR амплификацията включва над 40 о цикъла, при температура 53 С. Обемът на реакцията е 100 ml.
Използваните В този първи етап праймери са: 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 16 5’AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3’;
3’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 17 5’ TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3’.
След този етап се взимат 10 ml от амплификационния продукт и се използват за провеждане на втора, така наречена “гнездова“ PCR амплификация с праймери, локализирани в участъка, който е вече амплифициран.Този втори етап включва повече от 35 цикъла, при температура 53° С. Обемът на реакцията е 100 ml.
Използваните за този втори етап праймери са следните:
- 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 18
5’ TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3’;
- 3’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 19
5’ AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3’.
Фигури 10 и 11 представят резултатите от PCR под формата на снимки в ултраволетова светлина върху импрегнирани с етидиум бромид агарозни гелове, в които се осъществява електрофореза на PCR амплификационните продукт, приложена поотделно в различни кладенчета.
Горната фотография (фигура 10) показва резултатите от специфична MSRV- 2 амплификация.
Кладенче номер 8 съдържа смес от ДНК маркери, а кладенчета 1 до 7 представят в съответния ред амплификационните продукти от общите РНК от плазми, произхождащи от 4 здрави контроли, свободни HaMS (кладенче 1 до 4)?и от 3 пациента, страдащи от MS в различни стадии на заболяването (кладенчета 5 до 7).
В тези серии материалът от нуклеинови киселини на MSRV2 се установява в плазмата на един случай с MS от 3 тестувани и в нито една от 4- те контролни плазми. Други резултати, получени върху поекстензивни серии?потвърждават това.
Долната снимка (фигура 11) показва резултата от специфична амплификация чрез MSRV-1 “гнездова“ RT- PCR:
кладенче No. 1 съдържа PCR продукта, получен само с вода, без добавяне на AMV обратна транскрибтаза; кладенче No. 2 съдържа PCR продукта, получен само с вода, с добавяне на AMV обратна транскрибтаза; кладенче номер 3 съдържа смес от ДНК маркери; кладенчета 4 до 13 съдържат, в съответния ред, амплифицираните продукти от общата РНК- аза, екстрахирана от фракции на захарозен градиент (събрани в низходящ ред), при който градиент утайката от вирион, произхождащ от супернатантата на култура, инфектирана с MSRV-1 и MSRV- 2, се центрофугират съгласно протокола, описан отЯ. Perron (13); към кладенче 14 не се добавя нищо; към кладенчета 15 до 17 се прилагат амплификационните продукти на РНК, екстрахирана от плазма, произхождаща от 3 различни пациента, страдащи от MS в различни стадии на заболяването.
MSRV- 1 ретровируснят геном действително е установен във фракция на захарозен градиент, съдържаща пика на обратнотранскрибтазна активност, измерена съгласно техниката, описана отН. Perron (3), с много силен интензтет (фракция 5 от градиента, разположен в кла39 денче No. 8). В първата фракция протича слаба амплификация (кладенче No. 4), вероятно съответстваща на РНК, освободена от лизирани частици, които флокулират на повърхността на градента; аналогично, агрегирани дебриси седиментират в първата фракция (на дъното на епруветката), носейки със себе си няколко копия на MSRV-1 генома, който дава възможност за амплификация с нисък интензитет.
От 3 MS плазми, тестувани в тази серия, MSRV- 1 РНК се появяват в един случай, продуцирайки много интензивна амплификация (кладенче No. 17).
В тези серии, MSRV- 1 ретровирусен РНК геном, вероятно съответстващ на частици от екстрацелуларен вирус, намиращ се плазмата в изключително малък брой, се установява чрез “гнездова“ RT- PCR в един случай на MS извън трите тестувани. Други резултати, получени в по- екстензивни серии^потвърждават това.
Нещо повече, спецификата на последователностите, амплифицирани с тези PCR техники,могат да бъдат потвърдени и преценени с “ELOSA“ техника, както е описано от Е. Mallet (21) и в документа FR- А2 663 040.
За MSRV-1, продуктите на “гнездова“ PCR, опрани по- горе, могат да бъдат тестувани в две “ELOSA“ системи, които позволяват да бъдат открити поотделно консенсусната А и консенсусните A+C+D от MSRV-1, което съответства на подсемействата, описани в Пример 1 и фигури 1 и 2. По въздействие, последователностите,сходни на консенсуса B+C+D,ca установени в РНК пробите, произхождащи от MSRV- 1 вириони, пречистени от култури или амплифицирани в екстрацелуларни биологични течности на MS пациенти, където последователностите са сходни на консенсуса А, са по същество установени в нормалнфювешка клетъчна РНК.
Системата ELOSA/ MSRV-1 за улавянето и специфичната хибридизация на PCR продуктите от подсемейство А използва олигонук40 леопшд cpVIA с една аминна връзка при 5’ края и биотинилиран олигонуклеотид dpVIA като тяхна последователност, съответно:
- cpVIA идентифициран чрез SEQ ID NO: 31
5’ GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3’, съответстващ на ELOSA олигонуклеотид за продуктите на MSRV-1 гнездова PCR, осъществена с праймерите, идентифицирани чрез SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, незадължително последванаот амплификация с праймерите, идентифицирани чрез SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 на проби от пациенти;
- dpVIA идентифицирани чрез SEQ ID NO: 32;
5’ CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3’, съответстващ на ELOSA олигонуклеотид за подсемейство А от продуктите на MSRV-1 “ гнездова“ PCR, осъществена с праймери, идентифицирани чрез SEQ ID NO: 16 и SEQID NO: 17, незадължително последвано от амплифициране с праймерите, идентифицирани чрез SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 на проби от паценти.
Системата ELOSA MSRV-1 за улавяне и специфчна хибридизация на PCR продуктите на подсемейството В+ С+ D използва същия биотинилиран олигонуклеотид dpVIA за откриване и олигонуклеотида cpVIB с една аминна връзка при 5’ края, със своята последователност:
- dpVIB идентифициран от SEQ ID NO: 33
5’ CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3’, съответстваща на ELOSA олигонуклеотида за улавяне за подсемейството В+ С+ D от продуктте на MSRV- 1 “гнездова“ PCR, осъществена с праймерите, идентифицирани чрез SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, незадължително последвано от амплификация с праймерите, идентфицирани 4pe3SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 на проби от пациенти.
Тази ELOSA система за откриване позволява потвърждаването на факта, че нито един от PCR продуктите, така амплифицирани от третирани с ДНК- аза плазми от страдащи от MS пациенти,съдър41 жат последователност от подсемейството А, и че всички са позитивни с консенсус от подсемействата В, С и D.
Аналогична ELOSA техника се използва за MSRV- 2 на изолати от инфектирани клетъчни култури с помощта на следните PCR амплификационни праймери:
- 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 34
5’AGTGYTRCCMCARGGCGCTGAA 3’, съответстваща на 5’ MSRV- 2 PCR праймер, за PCR на проби от култури,
- 3’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID NO: 35
5’ GMGGCCAGCAGSAKGTCATCCA 3’, съответстващ на 3’ MSRV- 2 PCR праймер, за PCR на проби от култури, и олигонуклеотиди за улавяне с една аминна връзка при 5’ края cpV2 и биотинилиран олигонуклеотид за откриване dpV2 стехните съответни последователности:
- cpV2ugeHim^unupaH чрез SEQ ID NO: 36
5’ GGATGCCGCCTATAGCCTCTAC 3’, съответстващ на ELOSA олигонуклеотид за улавяне за продуктте на MSRV- 2 PCR, осъществена с праймерите SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, или незадължително с дегенеративните праймери, определени от Shih (12).
- dpV2 идентифициран npe3SEQ ID NO: 37
5’ AAGCCTATCGCGTGCAGTTGCC 3’, съответстващ на ELOSA олигонуклеотид за откриване на продуктите на MSRV- 2 PCR, осъществена с праймерите, представени чрез SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, или незадължително с дегенеративните праймери, определени от Shih (12).
Тази PCR амплификационна система с двойка праймери, различни от описаните по- рано за амплификация на проби от пациенти, дава възможност за потвърждаване инфекцията с MSRV- 2 в in vitro култури и на проби от нуклеинови киселини, използвани за молекулярно биологични изследвания.
Kamo се взема предвид всичко това, първите резултати от PCR откриване на генома от патогенни и/ или инфекциозни агенти показват, че е възможно свободни “вируси“ да циркулират в кръвния поток на пациенти в акутна, вирулентна фаза, извън нервната система. Те конкурират в почти невариабилното присъствие на “празнини“ в кръвномозъчната бариера на пациенти в активна фаза на MS.
ПРИМЕР 7: Получаване на последователности от “env“ гена на MSRV-1 ретровирусния геном
Както вече е описано в Пример 5, използва се PCR техника, получена от техниката, публикувана от Frohman (19). Тази техника дава възможност с помощта на специфични праймери да се осъществи амплификация при 3’ края от генома за удължаване на последователността към 5 ’ участъка с оглед анализиране. Този технически вариант е описан в документацията на “Clontech Laboratories Inc.“ , (Palo Alto California, USA), снабдена c нейния продукт “5’ - AmpliFINDERO RACE Kit“, който се използва за фракцията от вириона, както е описано по- горе.
С оглед провеждането на амплификация в 3’ участъка от MSRV-1 ретровирусния геном, обхващащ участъка от “env“ гена, е осъществено изследване за определяне консенсусна последователност в LTR участъците от същия тип както онези от дефективния ендогенен ретровирус HSERV- 9 (18,24);с които MSRV-1 ретровируса показва частична хомоложност.
Същият специфичен 3’ праймер е използван в протокола за кит за синтезата на сДНК и PCR амплификацията; неговата последователност е следната:
GTGCTGATTGGTGTATTTACAATCC (SEQ ID NO: 45)
Синтезата на комплементарната ДНК (сДНК) и многопо43 сочната PCR амплификация с посочения по- горе праймер се осъществява в един етап съгласно метода, описан в Patent ЕР- А- 0 569 272.
Продуктите, произхождащи от PCR;ce екстрахират след пречистване върху агарозен гел съгласно обичайни методи (17) и след това се ресуспендират в 10 ml дестилирана вода. Доколкото едно от свойствата на Taq полимеразата се състои в добавяне на един аденин в 3’ края на всяка от двете ДНК вериги, получената ДНК се инсертира директно в плазмид с помощта на ТА CloningO кит (British Biotechnology) . 2 ml от ДНК разтвор се смесват с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml 10- кратно концентриран буфер за свързване “ 10х LIGATION BUFFER“, 2 ml “pCRO VECTOR“ (25 ng/ ml) и 1 ml “TA DNA LIGASE“. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ при 12° С. Провеждат се следните етапи съгласно инструкциите за ТА CloningT кита (British Biotechnology). Към края на процедурата белите колонии от рекомбинантната бактерия (white) се взимат с оглед култивиране и екстрахиране на включените плазмиди съгласно така наречената “miniprep“ процедура (17). Полученият плазмиден продукт от всяка рекомбинантна колония се изрязва с подходящ рестрикционен ензим и се анализира върху агарозен гел. Плазмидите, притежаващи един инсерт, установен в UV светлина след оцветяване на гела с етидиум бромид се селекционират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на Sp6 промотора, присъстващ клониращия плазмид а от ТА Cloning KitT. Реакцията преди съгласуването след това се провежда съгласно метода, препоръчан за приложението на кит за съгласуване “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems, ref. 401384),\i автоматичното съгласуване се провежда с апарат на Applied Biosystems“автоматичен секвенатор, модел 373 A [laguna] съгласно инструкциите на производителя.
Този технически подход се прилага към проба от вирион, концентриран,както е описано по- долу от смес от културални супернатанти, продуцирани от В лимфобластоидни линии, както е описано в Пример 2, създадена от лимфоцити на пациенти, страдащи от MS и притежаващи обратнситранскрибтазна активност, която може да бъде установена съгласно техниката, описана от Perron et al. (3): културалните супернатанти се събират два пъти седмично, прецентрофугират се на 10 000 грт в продължение на 30 минути до отстраняване на клетъчните дебри0 си и след това се замразяват на - 80 С или се използват такива каквито са за следните етапи. Пресните или размразени супернатанти се центз рофугират на възглавница от глицерол- PBS на 100 000 g за 2 часа при 4. :С. След отстраняване на супернатантата утайката съставлява пробата от концентрирана, но непречистени вириони. Така получената утайка след това се отделя в малък обем подходящ буфер за екстрахиране на РНК. Посочената по- горе реакция за синтез на сДНК се провежда върху тази РНК, екстрахирана от концентрирания екстрацелуларен вирион.
RT- PCR амплификацията съгласно посочената по- горе техника позволява получаването на клона Fbd3, чиято последователност, идентифицирана чрез SEQ ID NO: 46, е представена на фигура 13.
На фигура 14 секвенционната хомоложност между клона Fbd3 и HSERV- 9 ретровируса е показана на диаграмата чрез непрекъсната линия за която и да е частична хомоложност, по- голяма или равна на 65%. Може да се види, че е налице хомоложност във фланкиращите участъци на клона (с pol гена при 5’ края и с “env” гена на HSERV-. Нещо повече, очевидно е ,че клона FBd3 съдържа по- дълъг “env” участък в сравнение с този, който е описан за дефективния ендогенен HSERV- 9; очевидно е също, че вътрешният дивергентен участък представлява “инсерт“ между участъците с частична хомоложност с HSERV- 9 дефектиВните гени.
ПРИМЕР 8: Амплификация, клониране и съгласуване на участъка от MSRV- 1 ретровирусния геном, локализиран между клоновете PSJ17 и Fbd3
Определени са четири олигонуклеотида, Fl, В4, F6 и В1 за амплифициране на РНК, произхождаща от концентрирани Вириони от щамове POL2 и MS7PG. Контролните реакции се осъществяват така, че да се провери присъствието на контаминанти (реакция с вода). Амплификацията се състои от първи етап RT- PCR съгласно протокола, описан в заявка за патент ЕР- А- 0 569 272, последван от втори етап на PCR , осъществен на 10 ml от продукта от първия етап, с праймери, вътрешни на амплифицирания първи участък (“гнездова“ PCR). В първия RT- PCR цикъл се използват праймерите Fl и В4. Във втория PCR цикъл се използват праймерите F6 и В1. Праймерите са позиционирани както следва:
Fl F6 Bl В4 ____________________________________________РНК MSRV-1
PSJ17 Fbd3
------------> <-----------------/_ 5’ pol MSRV- 1 3’pol MSRV-1 /
5’env
Тяхната структура е:
праймер Fl: TGATGTGAACGGCATACTCACTG (SEQ ID NO: 47) праймер B4: CCCAGAGGTTAGGAACTCCCTTTC (SEQ ID NO: 48) праймер F6: GCTAAAGGAGACTTGTGGTTGTCAG (SEQ ID NO: 49) праймер Bl: CAACATGGGCATTTCGGATTAG (SEQ ID NO: 50)
Полученият продукт на “гнездовата“ амплификация, означен“! pol“ е представен на фигура 15, и съответства на последователността SEQ ID NO: 51.
ПРИМЕР 9: Получаване на нови последователности, експресирани като РНК в клетки в култура, продуцираща MSRV-1, и съдържаща един “env участък на MSRV-1 ретровирусния геном.
Изготвя се библиотека от сДНК съгласно процедурата, описана от производителя на модула за синтез на сДНК, модула за бързо адапторно свързване на сДНК, модула за бързо сДНК клониране и ламбда gtlO “in vitro packaging“ китове (Amersham, ref RPN1256Y/Z, RPN1712, RPN11713, RPN1717, N334Z) от информационна РНК, екстрахирана от клетки от В лимфобластоидна линия като тази, описана в Пример 2, създадена от лимфоцитите на пациенти, страдащи от MS и притежаващи обратноипранскрибтазна активност, която може да бъде установена съгласно техниката, описана от Perron et al. (3).
Определени са олигонуклеотидите за амплифициране на сДНК, клонирана в библиотеката от нуклеинови киселини между 3’ участъка на клона PSJ17 (pol) и 5 ’ (LTR) участъка на клона Fbd3. Контролните реакции се провеждат така,че да се установи присъствието на контаминанти (реакция с вода). Провеждат се PCR реакции върху нуклеинови киселини, клонирани в библиотеката с различни двойки от праймерите, което позволява амплифицирането на серия [lacuna] клонове, свързващи pol последователностите към MSRV- 1 тип env или към LTR последователностите.
За последователностите, получени в клетъчната сДНК библиотеката представителни два клона:
- клонът JLBcl?4uamo последователност SEQ ID NO: 52 е представена на фигура 16;
- клонът JLBc2, чиято последователност SEQ ID NO: 53 е представена на фигура 17.
Последователностите на клоновете JLBcl и JLBc2 са хомоложни на тези от клона Fbd3, както е видно от фигури 18 и 19. Хомологията между клона JLBcl и клона JLBc2 е показана на фигура 20.
Хомоложността между клоновете JLBcl u JLBc2 от една страна и HSERV- 9 последователността от друга е представена, съответно на фигури 21 и 22.
Следва да се отбележи, че участъкът на хомоложност между JLB1, JLB2 и Fbd3 включва, с малки вариации в последователността и размера на инсерта, допълнителна липса на последователност (“инсертирана“) в HSERV- 9 env последователността, както е описано в Пример 8.
Следва да се отбележи, че клонираният “pol“ участък е много хомоложен на HSERV- 9, не притежава четяща рамка (носеща в паметта си секвенционни грешки, индуцирани от използваните техники, включително дори автоматичен секвенатор) и се отдалечава от MSRV1 последователностите, получени от вириони. С оглед на факта, че тези последователности са клонирани от РНК на клетки, експресиращи MSRV1 частици, вероятно е те да произлизат от ендогенни ретровирусни елементи, сродни с ERV9 семейството; това като че ли се дължи на факта, чеpol и env гените са налице в същата РНК, която явно не е MSRV1 геномна РНК. Някои от тези ERV9 елементи притежават функционална LTR, която може да бъде активирана с репликативни вируси, кодиращи хомолжи или хетероложни трансактиватори. При тези условия взаимовръзката между MSRV-1 и HSERV- 9 прави вероятна трансактивацията на дефективните (или други) ендогенни ERV9 елементи чрез хомоложни, или дори идентични, MSRV-1 трансактивиращи протеини.
Такъв феномен може да индуцира вирусна интерференция между експресията на MSRV-1 и сродните ендогенни елементи. Такава интерференция обикновено води до така наречената “дефективно- интерферираща“ експресия, някои от характеристиките на която могат да бъдат намерени в изследваните инфектирани с MSRV-1- култури. Нещо повече, такъв феномен не води до липса на експресия на полипептиди в поколението или дори на ендогенни ретровирусни протеини, които не са необходимо понасяни от имунната система. Такава схема на разсеяна експресия на ендогенни елементи^родствени на MSRV-I^h предизвикана от последния е податлива на мултиплициране на разсеяните антигени и съдейства за предизвикване на автоимунни процеси, каквито се наблюдават при SEP.
Обаче, съществено е да се отбележи, че клони JLBcl и
JLBc2 се различават от секвенцията ERV9 или HSERV9 вече описани, по това, че притежават по-дълга област env,cb държаща допълнителна област,изцяло отклоняваща се от ERV9. Впрочем, тяхното сродство с ендогенната фамилия ERV9 може да се определи, но те съставляват очевидно оригинални елементи, неописвани досега. Действително, изследването на банките данни за нуклеинови секвенции на разположение във версия № 15 (1995) на logical Entrez (NCBI, NIH, Bethesda, USA) не позволи идентифициране на хомоложна секвенция^известна в областта env на тези клони.
ПРИМЕР 10. Получаване на секвенции^разположени в областта 5' pol и 3' gag на ретровирусния геном MSRV-1
Тъй като това вече е описано в пример 5, използвана е техника PCR, получена от техниката7публикувана от Frohman (19). Производната техника позволява с помощта на специфична примамка в 3' на генома да се амплифицира, удължава секвенцията към областта 5' на генома за анализиране. Тази вариантна техника е описана в документацията на фирмата Clothech Laboratories Inc., (Palo-Alto California, и8А);снабдена c нейния продукт 5AmpliFINDER™ RACE Kit”, която се използва върху фракция от пречистения вирион,както е описано по-горе.
С цел да се осъществи амплификация на областта 5' на ретровирусния геном,като се тръгне от последователността ро1л вече секвенционирана (клон F-11-1) и простираща се към гена gag, са определени специфичните примамки MSRV-1.
Специфичните 3’ праймери, използвани в протокола за кита за синтез на сДНК и PCR амплификация, са съответно комплементарни на следните MSRV-1 последователности:
сДНК: (SEQ ID NO: 54)
CCTGAGTTCTTGCACTAACCC амплификация: (SEQ ID NO: 55)
GTCCGTTGGGTTTCCTTACTCCT
Получените продукти от PCR се екстрахират след пречистване върху агарозен гел по обичайните методи (17) и след това се ресуспендират в 10 ml дестилирана вода. Доколкото едно от свойствата на Taq полимеразата се състои в добавяне на аденин при 3’ края на всяка от двете ДНК вериги, получената ДНК се инсертира директно в плазмид с помощта на ТА CloningO кит (British Biotechnology). 2 ml ДНК разтвор се смесват с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml 10- кратно концентриран буфер за свързване “10х LIGATION BUFFER“, 2 ml pPCRQ VECTOR (25 ng/ ml) и 1 ml “TA DNA LIGASE“. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ при 12° С. Следващите етапи се провеждат съгласно инструкциите за ТА Cloning Т кит (British Biotechnology). В края на процедурата белите колонии от рекомбинантни бактерии (white) се отстраняват с оглед култивиране и екстрахиране на плазмидите, включени съгласно така наречената “miniprep“ процедура (17). Плазмидният продукт от всяка рекомбинантна колония се изрязва с подходящ рестрикционен ензим и се анализира върху агарозен гел. Плазмидите, притежаващи инсерт, установен под UV светлина след оцветяване на гела с етидиум бромид, се подбират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на Sp6 промотора, намиращ се в клониращия плазмид на ТА Cloning KitT. Реакцията преди съгласуването след това се провежда съгласно метода, препоръчан за използването на кита за съгласуване “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems, ref. 401384), а автоматичното съгласуване се провежда с апарат на Applied Biosystems “automatic sequencer model 373 A [lacuna] съгласно инструкциите на производителя.
Техническият подход се прилага на проба от вирион, канцентрирана^както е описано по- долу от смес от културални супернатанти, продуцирани от В лимфобластоидни линии като тези, описани в Пример
2, създадени от лимфоцити на пациенти, страдащи от MS и притежава щи обратнситранскрибтазна активност, която може да бъде открита съгласно техниките, описани от Perron et al. (3): културалните суперна танти се събират два пъти в седмицата, прецентрофугират се на 10 000 грт в продължение на 30 минути за отстраняване на клетъчните дебриси и след това се замразяват на - 80° С или се използват такива^каквито са за следващите етапи. Пресните или размазени супернатанти се центрофугират на възглавница от 30% глицерол- PBS при 100 000 g за 2 часа при 4° С. След отстраняване на супернатантата седиментиралата утайка съставлява пробата от концентрирани, но непречистени вириони. ака получената утайка след това се отделя в малък обем подходящ буфер за екстраиране на ДНК. Реакцията за синтез на сДНК, посочена по- горе, се провежда върху РНК, екстрахирана от концентриран екстрацелуларен вирион.
RT- PCR амплификация съгласно посочената по- горе техника позволява получаването на клона GM3, чиято последователност, идентифицирана със SEQ ID NO: 56, е представена на фигура 23.
На фигура 24 хомоложността в последователностите между клона GMP3 и HSERV- 9 ретровируса е показан на графиката чрез непрекъсната линия, за всяка отделна хомология, по- голяма или равна на 65%.
Най- общо, Фигура 25 показава локализацията на различните клонове7изследвани по- горе, сродни на ERV9 генома. На фигура 25, докол komo MSRV- 1 env участъка e no- дълъг от референтншйУГУ9 env ген, допълнителниягучастък е показан над точката на инсерция “V“, като се има предвид, че инсертираният материал показва вариабилността в секвенциите и размера между показаните клонове (JLBcl2, JLBc2, Fbd3). И Фигура 26 показва позицията на различни клонове, изследвани в участъка MSRV-1 pol*.
Посредством описания: по- горе GM3 клон може да бъде определена вероятна четяща рамка, покриваща изцяло гена pol, съгласно SEQ ID NO: 57, показан на фигури 27а до 27с.
ПРИМЕР 11: Откриване на анти- MSRV- 1 специфични антитела в човешки серум.
Идентифицирането на последователността на pol гена от MSRV-1 ретровируса и на една отворена четяща рамка от този ген позволява определянето на аминоЛиселинната последователност SEQ ID NO: 39 от участъка на този ген, показан на SEQ ID NO: 40 (виж фигура 28).
Различни синтетични пептиди, съответстващи на фрагменти от протеиновата последователност на MSRV- 1 обратнатранскрибтаза, кодирана от pol гена, се тестват за тяхната антигенна специфичност спрямо серум на пациенти, стадащи от MS,и от здрави контроли.
Пептидите са синтезирани по химичен път с твордо- фазова синтеза съгласно техниката на Merrifields (Barany G, and Memfields R. В, In the Peptides, 2, 1- 284, Gross E. and MeienhoferJ, Eds., Academic Press, New York). Детайлите, необходими за npakmukama,ca описани по- долу.
а) Пептиден синтез:
Пептидите се синтезират върху фенилацетамидометил (РАМ)/ полистирен/ дивинилбензенова смола (Applied Biosystems, Inc. Foster City, СА), c помощта на автоматичен синтезатор “Applied Biosystems
430А“. Аминокиселините се куплират nog формата на хидроксибензотриазолови (НОВТ) естери. Използваните аминокиселини се получават от Novabiochem (Lauflerlfingen, Switzerland) или Bachem (Bubendorf, Switzerland).
Химичният синтез се осъществява с помощта на протокола за двойно куплиране с N- метилпиролидон (NMP) като разтворител. Пептидите се изрязват от смолата, а така също и протективните групи на страничните вериги , с помощта на хидрофлуорна киселина (HF) в подходяща апаратура (тип I апарат за разграждане, Peptide Institute, Osaka, Japan).
За 1 g от пептидиловата смола се използват 10 ml HF, 1 ml анизол и 1 ml диметилеулфид 5DMS. След това HF се изпарява под вакуум. След интензивно промиване с етер пептидът се елуира от смолата с 10% оцетна киселина и след това се лиофилизира.
Пептидите се пречистват с препаративна високоефективна течна хроматография върху колона тип VYDAC С18 (250 х 21 тт) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA). Елуирането се провежда с ацетонитрилен градиент при скорост на потока от 22 ml/ min. Събраните фракции се наблюдават чрез елуиране при изокритични условия на аналитична колона VYDAC Т С18 (250 х 4. 6 тт) при скорост на потока от lml/ min. фракциите, притежаващи същото време на съхранение, се отливат и лиофилизират. Преобладаващата фракция след това се анализира с аналитична високо ефективна течна хроматография със системата, описана по-горе. Пептидите, които се приемта за приемливо чисти, се прояВяват в отделен пик, представляващ не по- малко от 95% от хроматограмата.
Пречистените пептиди след това се анализират с обекта на техния аминожиселинен състав, с помощта на Applied Biosystems 420Н автоматичен анализатор на аминокиселини. Измерването на (общата) химичната молекулна маса на пептидите се получава с помощта на LSIMS масова спектрометрия в позитивен йонен обмен на VG. ZAB. ZSEQ двойно фокусиращ инструмент, свързан към DEC- VAX 2000 система (VG analytical Ltd, Manchester, England).
Реактивността на различните пептиди се тестува спрямо серум на пациенти, страдащи от MS^u спрямо серум на здрави контроли. Това позволява да бъде подбран пептид с означение POL2B, чиято последователност е показана на фигура 28 чрез SEQ ID NO: 39, по- долу, кодиран отpol гена на MSRV-1 (нуклеотиди 181 до 330).
Ь) Антигенни свойства:
Антигенните свойства на пептида POL2B се демонстрират съгласно протокола за ELISA, описан по- долу.
Лиофилизираният POL2B пептид се разтваря в стерилна дестилирана вода в концентрация 1 mg/ ml. Този разтвор са разпределя на еднакВи части и се съхранява при +4° С за използване повече от две седмици, или се замразява при - 20° С за употреба в рамките на два месеца. Една от тези аликвотни части се разрежда в PBS (фосфатно буфериран разтвор) за получаване на крайна концентрация на пептида от 1 микрограм / ml. 100 микролитра от това разреждане се поставят във всяко кладенче на микротитърните панички (“high- binding“ plastic, COSTAR ref: 3590). Паничките се покриват с адхезив тип “plate- sealer“ и се съхраняват в продължение на една нощ при +4° С за фазатаца адсорбция на пептида към пластмасата. Адхезивът се отстранява и паничките се промиват три пъти с обем от 300 микролитра от разтвора A (lx PBS, 0. 05% Tween 20Т), след което се инвертира върху абсорбентна тъкан. Така изсушените панички се запълват с 200 микролитра за кладенче от разтвор В (разтвор А + 10% кози серум), след което се покриват с адхезив и се инкубират в продължение на 45 минути до 1 час при 37 С. Паничките след това се промиват трикратно с разтвор А^както е описано по- горе.
Пробите от тест серума се разреждат най- напред до 1/50 в разтвор В и 100 микролитра от всеки разреден тест серум се поставя в кладенчетата на всяка микротитърна паничка. В едно от кладенчетата на всяка паничка се поставя негативна контрола, под формата на 100 микролитра от буфер В. Паничките, покрити с адхезив,след това се инкубират за 1 до 3 часа при 37° С. След това паничките се промиват трикратно с разтвора Агкакто е описано по- горе. Успоредно на това, маркирано с пероксидаза козе антитяло, насочено срещу човешки IgG (Sigma Immunochemicals ref. A6029) или IgM (Cappel ref 55228) се разрежда в разтвор В (разреждане 16 5000 за анти- IgG и 16 1000 за анти- IgM). След това по 100 микролитра от подходящото разреждане на белязаното антитяло се поставят във всяко кладенче от микротитърните панички, и паничките, покрити с адхезив се инкубират за 1 до 2 часа при 37° С. Понататъшното промиване на паничките след това се провежда;както е описано по- горе. Успоредно на това, пероксидазният субстрат се изготвя съобразно насоките на “Sigma fast OPD kit“ (Sigma Immunochemicals, ref. P9187). Във всяко кладенче се поставят по 100 микролитра от субстратния разтвор и паничките се поставят на защитено от светлината място за 20 - 30 минути на стайна температура.
Когато цветната реакция се стабилизира, паничките незабавно се поставят в устройство за разчитане на ELISA спектрофотометричните измервания, и оптичната плътност (OD) от всяко кладенче е червено при дължина на вълната 492 пт. Обратно, 30 микролитра от IN HCL сред това се поставят в спектрофотометър за 24 часа.
Серологичните проби се повтарят двукратно или трикратно и оптичната плътност (OD), съответстваща на тестуваният серум^се изчислява?като се има предвид стойностите на OD, получени за същата проба при същото разреждане.
Мрежата от OD от всеки серум съответства на значението на OD от серума минус значението на OD от негативната контрола (разтвор В: PBS, 0. 05% Tween 20Т, 10% кози серум).
с) Откриване на анти- MSRV-1 IgG антитела чрез ELISA
Описаните по- горе техники се използват с POLB2 пептида за изпитване присъствието на анти- MSRV-1 специфични IgG антитела в серума на 29 пациента, за които определената или вероятна диагноза MS е установена съгласно критериите на Poser (23), и на 32 здрави контроли (кръвни донори).
Фигура 29 показва резултатите от всеки серум, изпитан с анти- IgG антитяло. Всяка вертикална ивица представя получената оптична плътност (OD при 492 пт) на изпитвания серум. Ординатата дава резултантната OD на въра на вертикалните ивици. Първите 29 вертикални ивици, разположени отляво на вертикалната прекъсната линия, представят серума на 29 тестувани случая на MS, а 32- те вертикални ивици, разположени отдясно на вертикалната прекъсната линия,представят серума на 32 здрави контроли (кръвни донори).
Значението на резултантните OD стойности за тестуваният MS серум е 0. 62. Диаграмата дава възможност да бъдат открити 5 контроли, чиято стойност на OD достига над груповите стойности на контролната популация. Тези стойности могат да представят присъствието на специфични IgG в серопозитивни пациенти, които не проявяват никакви симптоми. Следователно с оглед определяне статичтическата отправна точка на позитивността на теста са оценени два метода.
Значението на резултантните OD стойности на контролите, включително контролите с високи стойности на OD, е 0. 36. Без петте контроли, 4i$no резултантни OD стойности са по- големи от или еднакви на 0. 5, значението на “негативните“ контроли е 0. 33. Стандартното отклонение на негативните контроли е 0. 10. Теоретичната изходна стойност на позитивността може да бъде изчислена съгласно формулата:
изходна стойност (значение на резултантната OD стойност на серонегативните контроли) + (2 или 3 х стандартно отклонение на резултантните OD стойности на серонегативните контроли).
В първия случай, предполага се,че се касае до безсимптомни серопозитиви, и изходната стойност е равна на 0. 33 + (2 х 0. 10) = 0. 53. Негативните резултати представят неспецифичната “база“ на присъствието на антитела, насочени специфично срещу един епитоп от пептида.
Във втория случай, ако системата от контроли,състояща се от донори на кръв в очевидно добро здраве,е взето като референтна база, без да се изключвагсерумите, които са серопозитивни при този облик, стандартното отклонение на “не- MS контроли“ е 0. 116. Изходната стойност тогава става 0. 36 + (2 х 0. 116) = 0. 59.
Съгласно този анализ теста е специфичен за MS. В този аспект видно е, че теста е специфичен за MS, доколкото, както е показано на Таблица 1, няма контрола, чиято резултантна OD да е над тази изходна стойност, фактически, този резултат рефлектира на факта,че антитяло титрите на пациенти, страдащи от MS,са за по-голямата част по-високи от здравите контроли, които са били в контакт с MSRV1.
ТАБЛИЦА N о^1
MS КОНТРОЛА
0. 681 0. 3515
1. 0425 0. 56
0. 5675 0. 3565
0. 63 0. 449
| 0. 588 | 0. 2825 |
| 0. 645 | 0. 55 |
| 0. 6635 | 0. 52 |
| 0. 576 | 0. 2535 |
| 0. 7765 | 0. 56 |
| 0. 5745 | 0.51 |
| 0.513 | 0. 426 |
| 0. 4325 | 0. 451 |
| 0. 7255 | 0. 227 |
| 0. 859 | 0. 3905 |
| 0.6435 | 0. 265 |
| 0. 5795 | 0. 4295 |
| 0. 8655 | 0. 291 |
| 0. 671 | 0. 347 |
| 0. 596 | 0. 4495 |
Средна стойност
0. 662
0. 602
0. 525
0. 53
0.565
0.517
0. 607
0. 3705
0. 397
0. 4395
0. 62
0. 3725
0. 181
0. 2725
0. 426
0. 1915
0. 222
0. 395
0. 34
0. 307
0. 219
0. 491
0. 2265
0. 2605
0. 33
Стандартно отклонение
0. 10
Изходна стойност
0. 14
0. 53
В съответствие с първия метод на изчисление и както е показано на фигура 29 и в съответстващата Таблица 1, 26 от 29- me MS серума дават положителен резултат (резултантна OD по- голяма или еднаква на 0. 50), което показва присъствието на IgG- и, специфично насочени срещу пептида POL2B, следователно спрямо част от ензима обратна транскрибтаза на MSRV- 1 ретровируса, кодиран от неговия pol ген, и съответно спрямо MSRV- 1 ретровируса. Така, приблизително 90% от тестуваните MS пациенти реагират спрямо един епитоп, носен от POL2B пептида и притежава циркулиращи IgG- ни, насочени спрямо последния.
Пет от 32- ма донори на кръв в очевидно добро здраве показват положителен резултат. Така, очевидно е?че приблизително 15% от популацията, която не показва симптоми^може да са били в контакт с епитоп, носен от POL2B пептида при условия, които водят до активна имунизация, която се проявява в съхраняване на специфични серумни IgGи. Тези условия са конкурентни с имунизация спрямо MSRV- 1 ретровирусната обратна транскрибтаза по време на инфектиране с (и/или реактивация с) MSRV-1 ретровируса. Отсъствието на очевидна неврологична патология, напомняща MS в тези серопозитивни контроли?сочи, че те са здрави носители и са елиминирали инфекциозният вирус след имунизацията им, или че те определят една рискова популация от хронични носители. В действителност, епидемиологичните данни?показващи, че патогенен агентррисъстващ в околната среда с широко разпростране ние на MS може да е причината за това заболяване, навеждат на мисълта^ че фракция от популацията, свободна от МЗ^задължително е била в контакт с такъв патогенен агент. Показано е, че MSRV- 1 ретровирусът съставлява целия или част от “патогенния агент“ на източника на MS, и това следователно е обичайно за контроли,взети от здрава популацията да притежава IgG тип антитела спрямо компоненти от MSRV- 1 ретровируса. Така, разликата в серопревентивността между MS и контролна популация е особено значима: “chi- квадрат“ тест, р< 0. 001. Тези резултати следователно сочат за една етиопатогенна роля на MSRV-1 в MS.
d) Откриване на анти- MSRV- 1 IgM антитела чрез ELISA:
Техниката ELISA с пептида POL2B се използва за изпитване присъствието на анти- MSRV-1 IgM специфични антитела в серума на 36 пациенти, за които е установена вероятната или точна диагноза на MS съгласно критериите на Poser (23), или 42 здрави контроли (кръвни донори).
фигура 30 показва резултатите за всеки серум, тестван с анти- IgM антитяло. Всяка вертикална ивица представя резултантната оптична плътност (OD при 492 пт) на тестувания. Ординатната ос дава резултантната OD на горния край на вертикалната ивица. Първите 36 вертикални ивици, разположени отляво на вертикалната линия, пресичаща абсцисната ос^представят серума на 36 тестувани случая на MS, а вертикалните ивици, разположени отдясно на вертикалната прекъсната линия^представят серума на 42 здрави контроли (кръвни донори). Хоризонталната линия, начертана в средата на диаграмата^представя теоретичната отправна точка, определяща границата на позитивните резултати ( в които върха ивицата е разположена отгоре) и негативните резултати (в които върха на ивицата е разположена отдолу).
Значението на резултантните OD стойности за случаите на тестуваните MS възлиза на 0. 19.
Значението на резултантните OD стойности за контролите е 0.
09.
Стандартното отклонение на негативните контроли е 0. 05.
С оглед на малката разлика между значението на стандартното отклонение от контролите, изходната стойност на теоретичната позитивност може да бъде изчислена съобразно формулата:
изходна стойност = (значението на резултантните OD стойности на серонегативните контроли) + ( Зх стандартното отклонение на резултантните OD стойности на серонегативните контроли).
Следователно изходната стойност възлиза на 0. 09 + (3 х 0. 05) = 0. 26; или практически, 0. 25.
Негативните резултати представят неспецифичната “основа“ за присъствието на антитела, насочени специфично спрямо даден епитоп от пептида.
Съгласно този анализ и както е показано на фигура 30 и на съответстващата Таблица 2, IgM тест е специфичен за MS, докато нито една контрола не притежава резултантни стойности на OD над изходната стойност. Седем от 36 MS серума продуцират позитивен IgM резултат. Сега изследване на клиничните данни показва, че тези позитивни серуми са взети по време на първата атака на MS или акутна атака в нелекувани пациенти. Известно е, че IgM- и, насочени спрямо патогенни агенти,се продуцират по време на първични инфекции или по време на повторно активиране, следващо латентна фаза на дадения патогенен агент.
Разликата в серопревалентността между MS и контролни популации е особено значима: “chi- квадрат“ тест, р< 0= 001.
Тези резултати сочат за етиопатогенната роля на MSRV- 1 в MS.
Отриването на IgM и IgG антитела спрямо POL2B пептида дава възможност да бъде оценен курса на една MSRV-1 инфекция и/ или вирус62 наша реактивация на MSRV-1.
| MS | КОНТРОЛА |
| 0. 064 | 0. 243 |
| 0. 087 | 0. 11 |
| 0. 044 | 0. 098 |
| 0. 115 | 0. 028 |
| 0. 089 | 0. 094 |
| 0. 025 | 0. 038 |
| 0. 097 | 0. 176 |
| 0. 108 | 0. 146 |
| 1. 018 | 0. 049 |
| 0. 234 | 0. 161 |
| 1. 274 | 0. 113 |
| 0. 225 | 0. 079 |
| 0.314 | 0. 093 |
| 0. 522 | 0. 127 |
| 0. 306 | 0. 02 |
| 0. 143 | 0. 052 |
| 0. 357 | 0. 062 |
| 0. 142 | 0. 074 |
| 0. 157 | 0. 043 |
| 0. 168 | 0. 046 |
| 1. 051 | 0. 041 |
| 0. 104 | 0. 13 |
| 0. 187 | 0. 153 |
| 0. 044 | 0. 107 |
| 0. 053 | 0. 178 |
| 0. 153 | 0. 114 |
| 0. 07 | 0. 078 |
| 0.033 | 0.118 |
| 0.104 | 0. 177 |
| 0.187 | 0. 026 |
| 0. 044 | 0. 024 |
| 0. 053 | 0. 046 |
| 0. 153 | 0. 116 |
| 0. 07 | 0. 04 |
| 0. 033 | 0. 028 |
| 0. 973 | 0. 073 0. 008 0. 074 0. 141 0. 219 0. 047 0. 017 |
Средна стойност
0. 19
0. 09 стандартно отклонение 0. 23
0. 05 изходна стойност 0. 26
е) ИзследВане за имунодоминантни епитопи В пептида POL2B
За редуциране на неспецифичната основа (ниво) и за оптимизиране откриването на отговорите на анти- MSRV-1 антитела, синтезата на октапептиди, покриващи цялата последователност, определена от POL2B, се провежда съгласно протокола,описан по- долу.
Химичната синтеза на припокриващи се октапептиди, покриващи аминокиселинната последователност 61-110, показана на SEQ ID NO: 39, се осъществява върху активирана целулозна мембрана съгласно техниката на BERG et al. (1989, J. Ann. Chem. Soc., 111, 8024- 8026), която се продава om Cambridge Research Biochemicals nog търговското наименование Spotscan. Тази техника позволява едновременното синтезиране на голям брой пептиди и техния анализ.
Синтезата се осъществява с естерифицирани аминожиселини, в които а- аминосрупата е защитена с FMOC група (Nova Biochem) и групите от страничните вериги с протективни групи като тритил, t- бутилов естер или t- бутилов етер. Естерифицираните аминокиселини се солюбилизират в N- метилпиролидон (NMP) при концентрация от 300 пМ, и 0. 9 ml се накапват към местата на депозити на бромофенол блу. След инкубация в продължение на 15 минути, по- нататъшното добавяне на аминожиселини се осъществява чрез още една инкубация в продължение на 15 минути. Ако куплирането между две аминокиселини е осъществено коректно, се наблюдава модификация в оцветяването (изменение от синьо в жълто- зелено). След три промивания в DMF се провежда етап на ацетилизация с оцетен анхидрид. След това, защитата на крайните аминогрупи на пептидите в процеса на синтеза се премахва с 20% пиридин в DMF. Петната от депозити се обезцветяват с 1% разтвор на бромофенол блу в DMF, промиват се трикратно с метанол и се изсушават. Този комплект от операции определя един цикъл на добавяне на една аминокиселина, и този цикъл се повтаря до пълно завършване на синтезата. Когато всички аминокиселини са добавени, ΝΗ2- крайната група на последната аминокиселина се депротектира с 20% пиперидин в DMF и се ацетилира с оцетен анхидрид. Групите, протектиращи страничната верига се отстраняват със смес от дихлорометан / трифлуорооцетна киселина/ триизобутилсилан (5 ml/ 5 ml/ 250 ml). Имунореактивността на пептидите след това се тестува с ELISA.
След синтезата на различните октапептиди в двойно количество върху две различни мембрани, последните се изплакват с метанол и се промиват в TBS (0. IM Tris pH 7. 2), след което се инкубират в продължение на една нощ на стайна температура в наситен буфер. След няколко промивания в TBS- Т (0. 1 М Tris pH 7. 2 - 0. 05% Tween 20), едната мембрана се инкубира със съответния серум пациент , страдащ от MS при разреждане 1/ 50, а другата - с 1/ 50 разреден серум на здрави контроли. Мембраните се инкубират за 4 часа на стайна температура. След промиване с TBS- Т, се добавя маркиран с Ь- галактозидаза античовешки имуноглобулинов конюгат (продаван от Cambridge Research Biochemicals) с разреждане 1/ 200, и сместа се инкубира за два часа на стайна температура. След промиване на мембраните с 0.05% TBS- Т и PBS, имунореактивността в различните места се визуализира чрез добавяне на 5- бромо- 4хлоро- 3- индолил b- D- галактопиранозид в калий. Интензивността на оцветяване се изпитва със съответни стойности от 0 до 5?както е показано на приложените фигури 31 до 33.
По този начин става възможно определянето на два имунодоминант ни участъка npu Всеки от краищата на пептида POL2B, съответстващи на аминожиселинните последователности 65- 75 (SEQ ID NO: 41) и 92109 (SEQ ID NO: 42), съгласно фигура 34, и разположена съответно между октапептидите Phe- Cys- lie- Pro- Vai- Arg- Pro- Asp (FCIPVRPD) u Arg- Pro- Asp- Ser- Gin- Phe- Leu- Phe (RPDSQFLF), u Thr- Vai- Leu- ProGin- Gly- Phe- Arg (TVLPQGFR) u Leu- Phe- Gly- Gin- Ala- Leu- Ala- Gin (LFGQALAQ), и участък^който e no- малко реактивен, но очевидно поспецифичен, доколкото не продуцира каквато и да е основа (ниво) с контролния серум, представена от октапептидите Leu- Phe- Ala- Phe- GluAsp- Pro- Leu (LFAFEDPL) (SEQ ID no: 43) u Phe- Ala- Phe- Glu- Asp- ProLeu- Asn- (FAFEDPLN) (SEQ ID NO: 44).
Тези участъци дават възможност за определяне на нови пептиди, които са повече имунореактивни съобразно обиковените техники.
Ето защо е възможно, като резултат на направените открития и методите, създадени от изобретателите, да се осъществява диагностициране на MSRV-1 инфекция и/ или реактивация и да се прецени лечението на MS на базата на тяхното въздействие за “негативиране“ откриването на тези агенти в биологичните течности на пациентите. Нещо повече, ранното установяване у индивидите, които все още не проявяват неврологични знаци на MS^gaBa възможност за установяване лечение, което би било толкова по- ефективно по отношение последващия клиничен курс за факта, че би предшествал етапа на увреждане, който съответства на неврологичните нарушения. Понастоящем, диагнозата на MS не може да бъде поставена^реди да се проявят симптоми на неврологичните увреждания, и следователно не се постановява лечение преди развиване на клинична картина, предполагаща увреждания на централната нервна система, които са вече значими. Диагностиката на MSRV- 1 и/ или MSRV- 2 инфекции и/ или реактивация в човек е следователно от решаваща важност и настоящето изобретение предоставя средства за осъществяването й.
Emo защо е Възможно, освен провеждането на диагностика на MSRV1 инфекция и/ или реактивация, да бъде преценена терапията на MS на базата на въздействието върху “негативиране“ откриването на тези агенти в биологичните течности на пациентите.
ПРИМЕР 12: Получаване на клон LB19, съдържащ част от гена GAG на ретровируса MSRV- 1
Използвана е техниката PCR, получена от публикуваната от Gonzales- Quintial R. et al. (19) u Plaza et al. (25). От общото количество РНК, екстрахирана от фракция на вирион, пречистена,както е описано по- горе, се синтезира сДНК с помощта на специфичен праймер (SEQ ID NO: 64) в 3’ края на генома за амплифициране, с помощта на ΕΧΡΑΝϋφ обратна транскрибтаза (Boehringer Mannheim).
сДНК:
AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT (SEQ ID NO: 65) (безсмислена)
След пречистване се добавя поли (G) опашка при 5’ края на сДНК с помощта на “Terminal transferases kit“, произведен от компаниятавое/гга^ег Mannheim, съгласно протокола на производителя.
Провежда се укрепваща PCR с помощта на следните 5’ и 3’ праймери: AGATCTGCAG AATTCGATAT САСССССССС СССССС (SEQ ID No. 91) (смислова), и AAATGTCTGC GGGCACCAATC TCCATGTT (SEQ ID No: 64) (безсмислена)
След това се провежда полу^гнездова укрепваща PCR със следните 5’ и 3’ праймери:
AGATCTGCAG AATTCGATAT СА (SEQ ID No: 92) (смислова), и AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT (SEQ ID No: 64) (безсмислена).
Продуктите, получени om PCR^ce пречистват върху агарозен гел по обичайни методи (17), и след това се ресуспендират в 10 микролитра дестилирана вода. Доколкото едно от свойствата на Taq полимеразата се състоят в добавяне на аденин в 3’ края на всяка от двете OKU вериги, получената ДНК се инсертира директно в плазмид с помощта на ТА CloningO кит (British Biotechnology). Двата микролитра от ДНК разтвор се смесват с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml от 10- кратно концентриран буфер за свързване “10х LIGATION BUFFER“, 2 ml “ PCR(p VECTOR“ (25 ng/ ml) и 1 ml “T4 ДНК лигаза “. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ на 12° С. Следващите етапи се провеждат съгласно инструкциите на ТА CloningT kit (British Biotechnology). Към края на процедурата елите колонии от рекоминанта бактерия (white) се отделят за култивиране и екстрахиране на плазмидите, включени съгласно така наречената процедура “минипреп“ (17). Плазмидният препарат от всяка рекомбинантна колония се изрязва с подходящ рестрикцинен ензим и се анализира върху агарозин гел. Плазмидите, притежаващи инсерт, отк на гела с етидиум брорит с ултравиолетова светлина сле>
мид се подбират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на Sp6 промотор, намиращ се в клониращия плазмид на ТА Cloning kitT. Реакцията преди съгласуването след това се осъществява съгласно метода, препоръчан за употреба на кита “Prism ready reaction kit dye deoxytermiator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems, ref. 401384) u автоматичното съгласуване се провежда с “Automatic Sequencer, model 373 А“ съгласно инструкците на производителя.
PCR амплификация съгласно посочената по- горе техника се използва на сДНК, синтезирана от нуклеинови киселини от фракции на
астици, пречистени на агарозен градиент, съгласно техниката, описана от Н. Perron (13), от културални супернатанти на В лимфоцити на пациенти, страдащи от MS, имоблизирани с вируса на Epstein- Barr (EBV) щам В95 и експресиращ ретровирусни частици, асоциирани с обратнснпранскрибтазна активност^както е описано от Perron et al. (3) u Във Френско патентно описание MS 10, 11 и 12. Клонът LB 19, чиято последователност, идентифицирана от SEQ ID N0:59, е представена на фигура 35.
Клонът дава възможност да бъде определен, с предварително съгласувания клон GM3 и клона G+ Е+ А (виж Пример 15), участък от 690 двойки бази, представителни за значителна част от гена gag на MSRV-1 ретровируса, както е представено на фигура 36. Таз последователност, означена SEQ ID No: 88,е реконструирана от различни клонове, припокриващи се в техните краища. 1ази последователност е означена с името MSRV-1 “gag*“ участък. На фигура 36 е представена потенциална четяща рамка с транслацията в аминокиселини под последователността от нуклеинови киселини.
ПРИМЕР 13: Получаване на клон FBdl3, съдържащ участък от гена pol, свързан с MSRV- 1 ретровируса и очевидно непълен env участък, съдържащ потенциална четяща рамка (ORF) за гликопротеин.
Екстракция на вирусна РНК: РНК се екстрахира съгласно метода, описан накратко по- долу.
Културална супернатанта от В лимфоцити на пациенти, страдащи от MS (650 ml) се центрофугира за 30 минути при 10 000 g. Получената утайка от вируса се ресуспендира в 300 микролитра PBS/10 тМ MgC12. Материалът се третира с ДНК- аза (100 mg/ ml) / РНК- аза (50 mg/ ml) смес за 30 минути при 37° С и след това с протеиназа К (50 mg/ ml) за 30 минути при 46° С.
Нуклеиновите киселини се екстрахират с един обем фенол/ 0. 1% SDS (v/v) смес, нагрята до 60° С, и след това се ре^екстрахира с един обем фенол/ хлороформ (1: 1; v/ v).
Преципитацията на материала се осъществяВа с 2. 5 v етанол В присъствието на 0. 1 v натриев ацетат с рН= 5. 2. Получената след центрофугирането утайка се ресуспендира В 50 микролитра стерилна DEPC вода.
Пробата се третира отново с 50 mg/ ml “ свободна на РНК- аза“ ДНК- аза за 30 минути на стайна температура, екстрахира се с един обем фенол/ хлороформ и се преципитира в присъствието на натриев ацетат и етанол.
Получената РНК се определя количествено с OD, разчетено при 260 пт. Присъствието на MSRV-1 и липсата на ДНК контаминанти се наблюдава чрез PCR и MSRV-1- специфична RTPCR, асоциирана със специфична ELOSA за MSRV-1 генома.
Синтез на сДНК:
За синтезата на сДНК се използват 5 mg РНК, обработена с поли(ОТ) олигонуклеотид съгласно инструкциите на кита “модул за синтез на сДНК“ (refRPN 1256, Amershani) с няколко модификации: Обратната транскрибция се осъществява при 45° С вместо препоръчаните 42° С.
Продуктът на синтезата се пречиства чрез двойна екстракция и двойно пречистване съгласно инструкциите на производителя.
Присъствието на MSRV-1 се потвърждава с MSRV-1 PCR, свързана със специфична за MSRV-1 генома ELOSA.
“PCR на дълго разстояние (LD- PCR)
500 ng сДНК се използват за етапа на LD- PCR (Expand Long Template system; Boehringer (ref. 1681 842)).
Използвани са няколко двойки олигонуклеотиди. Между тях са двойките, дефинирани от следните праймери:
5’ праймер: GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G (SEQ ID No: 66) 3’ праймер: GTGCTGATTG GTGTATTTAC ААТСС (SEQ ID No: 67).
Условията на амплификация са следните:
94° С 10 секунди
56Р С 30 секунди цикъла, след това 20 цикъла с еднфовишение от 20 секунди във ο
С 5 минути;
всеки цикъл от удълженото време. В края на тази първа амплификация 2 микролитра от амплификационния продукт се подлагат на втора амплификация при същите условия както по- рано.
LD- PCR реакциите се провеждат в апарат на Perkin, модел 9600 PCR в тънкостенни микроепруветки (Boehringer).
Амплификационните продукти се наблюдават с електрофореза на 1/5-та част от амплификационния обем (10 микролитра) в 1% агарозен гел. За двойката праймери, описана по- горе, е получена ивица от прибли зително 1. 7 КЬ.
Клониране на амплифииирания фрагмент:
PCR продукта се пречиства чрез прекарването му през препаративен агарозен гел и след това през колона на Costar (Spin; D. Dutcher) съгласно инструкциите на снабдителя.
микролитра от пречистения разтвор се сливат с 50 ng от вектора PCRII съгласно инструкциите на снабдителя (ТА Cloning Kit; British Biotechnology ).
Полученият рекомбинантен вектор се изолира с трансформация на компетентна DH5aF’ бактерия. Бактерията е подбрана с помощта на устойчивостта им на ампицилин и загуба на метаболизма за Xgal (= white колонии). Молекулярната структура на рекомбинантния вектор е потвърдена с миниполучаване на плазмид и хидролиза с ензима EcoRl.
Селекциониран е позитивен клон за всички тези критерии, означен FBdl3. Получаването на рекомбинантния плазмид в по- голям мащаб се осъществява с помощта на кита Midiprep Quiagen (ref 12243) съгласно инструкциите на производителя.
Съгласуването на клона FBdl3 се осъществява със средствата на Perkin Prism Ready Amplitaq FS dye terminator kit (ref. 402119) съгласно инструкциите на производителя. Реакциите на съгласуване се въвеждат в сек73 венатор Perkin mun 377 или 373A аВтоматик. Методиката за съгласуване се състои в преминаване на гена, осъществено върху двете вериги на клона FBdl3.
Съгласуването на клона FBdl3 е идентифицирано със SEQ ID No: 58.
На фигура 37, секвенционната хомоложност между клона FBdl3 и HSERV- 9 ретровируса е показано на основната графика с непрекъсната линия за всяка частична хомология, по- голяма или равна на 70%. Видно е, че има хомоложност във фланкиращите участъци на клона (с гена/ю/ при 5’ края и с env гена и след това LTR при 3’ края), но че вътрешния участък е изцяло дивергентен и не показва каквато и да е хомоложност, дори слаба, с env гена на HSERV- 9. Нещо повече, очевидно е?че клона FBdl3 съдържа по- дълъг “env“ участък от този, който е описан за дефективния ендогенен HSERV- 9; така може да се види, че вътрешният дивергентен участък определя един “инсерт“ между участъците с частична хомоложност с HSERV- 9 дефективните гени.
Това допълнително съгласуване определя потенциален orf, означен ORF В13, който е представен чрез неговата аминожиселинна последователност SEQ ID No: 87.
Молекулярната структура на клона FBdl3 е анализирана с помощта на GeneWork софтуер и Genebank и SwissProt бази данни. Установени са 5 места на гликозилация.
Протеинът не проявява значима хомоложност с вече известни последователности.
Вероятно този клон произхожда от рекомбинация с ендогенен ретровирусен елемент (ERV), присъединен към репликацията на MSRV-1.
Такъв феномен няма поколение от експресията на полипептиди или дори на ендогенни ретровирусни протеини?които не са задължително толерирани от имунната система. Подобна схема на аберантна експресия на ендогенни елементи? отнасяща се go MSRV- 1 и/ или индуцирана от последния, е способна да мултиплицира аберантните антигени, и следователно проявява тенденция да определя индукцията на автоимунни процеси,каквито са наблюдавани в MS. Тя определено се състои от нови елементи, които никога досега не са били описвани. В действителност, справката с базата данни от последователности на нуклеинови киселини, достъпни във версия No 19 (1996) от “Entrez “ софтуер (NCBI, NIH, Bethesda, USA),He предоставя възможност за идентифициране с позната хомоложна последователност, съдържаща пълния env участък от този клон.
ПРИМЕР 14: Получаване на клон FP6,съдържащ част от генаpol, с участък, кодиращ ензима обратна транскрибтаза, хомоложен на клона pol* MSRV- 1, и 3’ pol участък, различен от еквивалентната последователност, описана в клоноветеpol*, tpol, FBd3, JLBcl и JLBc2.
3’ RACE се провежда върху обща РНК, екстрахирана от плазма на пациенти, страдащи от MS. Плазма от здрави хора, третирана при същите условия се използва като негативна контрола. Синтезата на сДНК се провежда със следният модифициран олиго (dT) праймер:
5’GACTGCCTGT AGATCGATTT ТТТТТТТТТТ ТТТТ 3’(SEQIDNo: 68) и обратна транскрибтаза на Boehringer “Expand RT“ съгласно условията, препоръчани от компанията.
PCR се провежда със ензима Klentaq (Clontech) при следните условия: 94°U за 5 мин, след това 93° С за 1 минута, 58°С за 1 мин, 68°С 3 мин за 40 цикъла и 68°С за 8 минути, при краен обем на реакцията от 50 ml.
Използваните за PCR праймери са :
- 5’ праймер, идентифициран чрез SEQ ID No: 69 5’GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT 3’;
- 3’ праймер, идентифициран от SEQ ID No: 68 (= на същото както за сДНК)
Втора, така наречена “полу^гнездова“ PCR се осъществява с праймер, локализиран в рамките на вече амплифициран участък. Тази втора PCR реакция се провежда при същите експериментални условия като тези при първата PCR с помощта на 10 ml от амплификационния продукт, получен от първата PCR.
Използваните за тази полу**гнездова PCR праймери са:
- 5’ праймер, идентифициран от SEQ ID No: 70
5’CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT 3’
- 3’ праймер, идентифициран om SEQ ID No: 68 (същия както за сДНК).
Праймерите SEQ ID No: 69 и SEQ ID No: 70 са специфични за участъка pol*; позиция No. 403 go No. 422 и No. 641 go No. 670, респективно.
По този начин се получава амплификационен продукт, получен от екстрацелуларна РНК, екстрахирана от плазмата на пациент, страдащ от MS. Съответният фрагмент не се наблюдава в плазмата на здравата контрола. Този амплификационен продукт се клонира по следния начин.
Амплифицираната ДНК се инсертира в плазмид с помощта на кит ТА Cloningg. 2 ml от разтвора на ДНК се смесват с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml 10- кратно концентриран лигационен буфер “Юх LIGATION BUFFER “, 2 ml “pCRg VECTOR “ (25 ng/ ml) u 1 ml “ТА ДНК ЛИГАЗА. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ при 12w С. Следващите етапи се провеждат съгласно инструкциите на производителя на ТА Cloning kitT (British Biotechnology). В края на процедурата белите колонии от рекомбинантни бактерия (white) се отделят за култивиране, което да позволи екстрахиране на включените плазмиди съгласно така наречената “минипреп“ процедура (17). Плазмидният продукт от всяка рекомбинантна колония се изрязва с подходящ рестрикционен ензим и се анализира върху агарозен гел. Плазмидите, притежаващи един инсерт, установен nog UV светлина след оцветяване на гела с етидиум бромид, се подбират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на промотора Sp6, намиращ се в клониращия плазмид от ТА клониращият китТ. Реакцията преди съгласуването след това се провежда съгласно методиката, препоръчана за употребата на кита за съгласуване “Prism ready reaktion kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit “ (Applied Biosystems, ref. 401384), и автоматичното съгласуване се провежда с апарата на Applied Biosystems “Automatic Sequencer, model 373 A “ съгласно инструкциите на производителя.
Полученият клон, обозначен FP6, позволява да бъде определен участък от 467 Ьр, който е 89% хомоложен на участъкаро/* от MSRV-1 ретровируса и на участък от 1167 Ьр, който е 64% хомоложен на участъка от ERV- 9 (No. 1634 до 2856) .
Клонът FP6 е представен на Фигура 38 посредством неговата нуклеотидна последователност, идентифицирана от SEQ ID No: 61. Трите потенциални четящи рамки от този клон са представени с техните аминожиселинни последователности в нуклеотидните последователности.
ПРИМЕР 15: Получаване на участък, обозначен G+E+A, съдържащ ORF за ретровирусна протеаза, чрез PCR амплификация на последователността от нуклеинови киселини, съдържаща се между участъка 5)определен от клона “GM3 “ и 3’ участъка, определен от клонаpol*, от РНК, екстрахирана от плаз мидите на пациенти, страдащи от MS.
Олигонуклеотидите, специфични за последователностите на MSRV1, вече идентифицирани от Заявителя?са определени с оглед амплификация на ретровирусната РНК, произхождаща от вирионите, намиращи се в плазмата на пациенти, страдащи от MS. Контролите реакции се осъществяват така, че да се наблюдава наличието на контаминанти (реакция с вода). Амплификацията се състои от етап на RT- PCR, последвано от “гнездова “ PCR. Двойки от праймери се определят за амплифициране на mpu припокриващи се участъка (означени G, Е и А) в участъците, определени от последователностите на клоновете GM3 иpol*, описани погоре.
Полу^гнездова RT- PCR за амплификация на участъка G:
- в първия RT- PCR цикъл са използвани следните праймери: праймер 1: SEQ ID No: 71 (смислов ) праймер 2: SEQ ID No: 72 (безсмислой )
- във втория PCR цикъл са използвани следните праймери: праймер 1: SEQ ID No: 73 (смислов ) праймер 4: SEQ ID No: 74 (безсмислов )
Гнездова RT- PCR за амплификация на участъка Е:
- в първия RT- PCR цикъл са използвани следните праймери:
- праймер 5: SEQ ID No: 75 (смислов ) праймер 6: SEQ ID No: 76 (безсмислов )
- във втория PCR цикъл са използвани следните праймери: праймер 7: SEQ ID No: 77 (смислов ) праймер 8: SEQ ID No: 78 (безсмислов )
Полу-^нездова RT- PCR за амплификация на участъка А:
- в първия RT- PCR цикъл са използвани следните праймери: праймер 9: SEQ ID No: 79 (смислов ) праймер 10: SEQ ID No: 80 (безсмислов )
- във втория PCR цикъл са използвани следните праймери: праймер 9: SEQ ID No: 81 (смислов ) праймер 11: SEQ ID No: 82 (безсмислов )
Праймерите и участъците G, Е и А, които те определят, са разположени^акто следва:
сДНК
G 4 2
| 5 1 | Е | 8 6 |
| 3 А 11 10 | ||
| --а | -------а<— | |
| GM3 | POL* |
Последователността на участъка, определен от различните клонове G, Е и А,е определена след клониране и съгласуване на “гнездовите“ продукти на амплификация.
Клоновете G, Е и А се композират заедно чрез PCR с праймерите 1 при 5’ края на фрагмента G и 11 при 3’ края на фрагмент А, праймери; които са описани по- горе. Един фрагмент с размер, приблизително 1580 bp G+ Е+ А,се амплифицира и инсертира в плазмид с помощта на кита ТА Cloning (запазена марка). Определя се последователността на амплификационния продукт, съответстваща на G+E+А,и се осъществява анализ на припокриВанията G+A и Е+А. Последователността е показана на фигура 39 и съответства на последователността SEQ ID No: 89.
В участъка Е е установена четяща рамка, кодираща една MSRV-1 ретровирусна протеаза. Аминокиселини ат а последователност на протеазата, идентифицирана с SEQ ID No: 90^ е представена на фигура 40.
ПРИМЕР 16: Получаване на клон LTRGAG12, свързан към ендогенен ретровирусен елемент (ERV) в близост с MSRV- 1, в ДНК на една MS лимфобластоидна линия, продуцираща вириони и експресираща ретровируса MSRV- 1.
Провежда се гнездова PCR на ДНК, екстрахирана от лимфобластоидна линия (В лимфоцити, обезсмъртени с ERV вирусен щам В95, както е описано по- горе и както е добре известно на специалистите в областта), която експресира MSRV- 1 ретровируса и произхождаща от лимфоцшпи на периферната кръв на пациенти с MS.
В първия PCR етап са използвани следните праймери:
праймер 4327: CTCGATTTCT TGCTGGGCCT ТА (SEQ ID No: 83) праймер 3512: GTTGATTCCC TCCTCAAGCA (SEQ ID No: 84)
Този етап включва 35 амплификационни цикъла при следните условия: 1 минута при 94G С, 1 минута при 54° С и 4 минути при 72° С.
Във втория PCR етап са използвани следните праймери: праймер 4294: СТСТАССААТ CAGCATGTGG (SEQ ID No: 85) праймер 3591: TGTTCCTCTT GGTCCCTAT (SEQ ID No: 86)
Този eman включва 35 амплификационни цикъла при следните условия: 1 минута при 94° С, 1 минута при 54° С и 4 минути при 72° С.
Продуктите, произхождащи от PCR?ce пречистват върху агарозен гел по обичайните методи (17) и след това се ресуспендират в 10 ml дестилирана вода. Доколкото едно от свойствата на Taq полимеразата се състои в добавяне на един аденин в 3’ края на всяка от двете ДНК вериги, получената ДНК е инсертирана директно в плазмид с помощта на ТА Cloningg кит (British Biotechnology). Два микролитра от ДНК разтвора се смесват с 5 ml стерилна дестилирана вода, 1 ml 10- кратно концентриран лигационен буфер “ 10х LIGATION BUFFER “, 2 ml от “pCRg VECTOR “ (25 NG/ ML) и 1 ml “ТА ДНК LIGASE “. Тази смес се инкубира в продължение на една нощ при 12° С. Следващите етапи се провеждат съгласно инструкциите на ТА CloningT кит (British Biotechnology). В края на процедурата белите колонии от рекомбинантните бактерии (white) се отделят за култивиране, което да позволи екстракция на плазмидите, включени съгласно така наречената “минипреп“ процедура (17). Полученият продукт от всяка рекомбинантна колония се изрязва с подходящ рестрикционен ензим и се анализира върху агарозен гел. Празмидите, притежаващи инсерт, установен с UV светлина след оцветяване на гела с етидиум бромид се подбират за съгласуване на инсерта, след хибридизация с праймер, комплементарен на Sp6 промотора, намиращ се в клонира80 щия плазмид на ТА Cloning KitT. Реакцията преди съгласуването след тоВа се провежда съгласно методиката, препоръчана за използване на кита за съгласуване “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit“ (Applied Biosystems, ref. 401384), и автоматичното съгласуване се провежда с апарат на Applied Biosystems “Automatic Sequencer, model 373 А“ съгласно инструкциите на производителя.
Така може да бъде получен кюн, обозначен LTRGAG12 и е представен с неговата вътрешна последователност, идентифицирана чрез SEQ ID No: 60.
Този клон е вероятно представителен за ендогенни елементи,близки до ERV- 9, намиращи се в човешка ДЕК, в частност в ДНК на пациенти, страдащи от MS, и способни да препятстват експресията на MSRV- 1 ретровируса, следователно са способни да играят роля в патогенезата, свързана с MSRV-1 ретровируса и да служат като маркер за специфично изразяване при въпросната патология.
ПРИМЕР 17 : Откриване на анти- MSRV-1 специфични антитела в човешки серум.
Идентифицирането на последователността наpol гена от MSRV1 ретровируса и на една отворена четяща рамка от този ген позволява определянето на аминожиселинната последователност SEQ ID No: 63 от участък на този ген, посочен на SEQ ID No: 62.
Тествани са различни синтетични пептиди, съответстващи на фрагменти от протеиновата последователност на MSRV- 1 обратна транскрибтаза, кодирана от гена pol за тяхната антигенна специфичност по отношение на серум от пациенти, страдащи от MS и здрави контроли.
Пептидите се синтезират химично чрез твърдо- фазова синтеза съгласно техниката uuMemfield (22). Практическите подробности са описани по- долу:
а) Пептиден синтез:
Пептидите са синтезирани на фенилацетамидометил (РАМ)/ полистирен/дивинилбензенова смола (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA), c помощта на автоматичен синтезатор “Applied Biosystems 430А“. Аминокиселините куплират под формата на хидроксибензотриазолови (НОВТ) естери. Използваните аминокиселини са получени от Novabiochem (Lauflerlfingen, Switzerland) или Bachem (Bubendorf, Switzerland).
Химичният синтез е осъществен с помощта на протокола за двойно куплиране с N-метилпиролидон (NMP) като разтворител. Пептидите се изрязват от смолата, а едновременно с това и страничните защитни групи с помощта на хидрофлуорна киселина (HF) в подходяща апаратура (апарат тип I за разграждане, Peptide Institute, Osaka, Japan).
За 1 g от пептидиловата смола се използват 10 ml HS, 1 ml анизол и 1 ml диметил сулфид 5DMS. Сместа се разбърква в продължение на 54 минути при - 2° С. След това HF се изпарява под вакуум. След интензивно промиване с етер, пептида се елуира от смолата с 10% оцетна киселина и след това се лиофилизира.
Пептидите се пречистват с препаративна течна хроматография с висока разделителна способност на колона тип VYDAC С18 (250 х 21 тт) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA). Елуацията се провежда с ацетонитрилов градиент при ниска скорост от 22 ml/ min. Събраните фракции се наблюдават чрез елуиране при изократни условия на VYDACT С18 аналитична колона (250 х 4.6 тт) при ниска скорост от 1 ml/ min. фракциите, притежаващи същото време на съхранение^се събират и се лиофилизират. Преобладаващата фракция след това се анализира с аналитична течна хроматография с висока разделителна способност със системата, описана по- горе. Пептида, който се считаме е с приемлива чистота^е проявява в отделен пик, представляващ не по- малко от 95% от хроматограмата.
Пречистените пептиди след това се анализират с обекта на наблюдаване- техния аминажиселинен състав, с помощта на автоматичнцЯ анализатор на аминокиселини Applied Biosystems 420Н. Измерването на (средната) молекулна маса на пептидите е осъществено с помощта на LSIMS масова спектрофотометрия в позитивния йонен начин на VG. ZAB. ZSEQ двойно фокусиращ инструмент, свързан към DEC- VAX 2000 система (VG analytical Ltd, Manchester, England).
Реактивността на различните пептиди се изпитва спрямо серум на пациенти, страдащи от MS,и спрямо серум на здрави контроли. Това позволява подбора на пептид, означен S24Q, чиято последователност се идентифицира със SEQ ID No: 63, кодиран от нуклеотидна последователност на гена pol от MSRV-1 (SEQ ID No: 62).
b) Антигенни свойства:
Антигенните свойства на пептида S24Q се демонстрират съгласно протокола на ELISA, описан по- долу.
Лиофилизираният пептид S24Q се разтваря в 10% оцетна киселина при концентрация 1 mg/ ml. Този щок от разтвора се съхранява на +4^ С за употреба в продължение на повече от две седмици, или се замразява при - 20° С за употреба в рамките на 2 месеца. Една част се разрежда в PBS (фосфатно буферен разтвор),така че да се получи крайна пептидна концентрация от 5 микрограма/ ml. 100 микролитра от този разтвор се поставят във всяка ямка на микротитърна паничка Nunc Maxisorb (търговско наименование). Последните се покриват с адхезив “plate- sealer“ и о се пазят за 2 часа при +37 С за фазата на абсорбиране на пептида от пластмасата. Адхезивът се отстранява и паничките се промиват трикратно с обем от 300 микролитра от разтвор А (1 х PBS, 0. 05% Tween 20Т), след това се инвертира над абсорбентната тъкан. Така изсушените панички се запълват с по 250 микролитра за всяка ямка от разтвора В (разтвор А + 10% кози серум), след това се покриват с адхезив и се инкуо бират за 1 час при 37 С. След това паничките се промиват трикратно с разтвора А,както е описано по- горе.
Пробите с тест серума се разреждат предварително до 1/ 100 в разтвора В, и 100 микролитра от всяко разреждане се поставят в ямките на всяка микротитърна паничка. Негативната контрола се поставя в една ямка от всяка паничка, под формата на 100 микролитра от буфер В. Паничките, покрити с адхезив,след това се инкубират за 1 час и 30 мин 0 при 37 С. Паничките след това се промиват трикратно с разтвор А, както е описано по- горе. За IgG отговора, маркирано с пероксидаза козе антитяло, насочено срещу човешки IgG ( произведен от Jackson Immuno Research Inc.) се разрежда в разтвора В (разреждане 1/10 000). 100 микролитра от подходящо разреждане на белязаното натитяло след това се поставят във всяка ямка от микротитърната паничка, и покритите с адхезив панички се инкубират за 1 час при 37° С. По- нататъшно промиване на паничките след това се провежда,както е описано по- горе. Успоредно с това, пероксидазният субстрат се изготвя съгласно инструкциите за китовете BioMerieux. 100 микролитра от субстратният разтвор се поставят във всяка ямка и паничките се поставят на защитено от светлината място за 20 - 30 минути на стайна температура.
Когато цветната реакция се стабилизира, 50 микролитра от Цвят 2 (търговско наименование BioMerieux) се поставят във всяка ямка за прекъсване на реакцията. Паничките се поставят незабавно в устройство за разчитане спектрофотометрите на ELISA и оптичната плътност на всяка паничка (OD) се прочита при дължина на вълната 492 пт.
Серологичните проби се въвеждат двукратно или трикратно и оптичната плътност (OD), съответстваща на изпитвания серум,се изчислява,като се има предвид стойностите на OD, получени за всяка проба при едно и също разреждане.
Стойността на OD от всяко разреждане съответства на значението на OD от серума минус стойността на OD на отрицателната контрола (разтвор В: PBS, 0. 05% Tween 20Т, 10% кози серум ).
с) Определяне на анти- MSRV-1 IgG антитела (S24Q) чрез ELISA:
Описаната по- горе техника се използва с пептида S24Q за изпитва84 не наличието на анти- MSRV-1 специфични IgG антитела в серума на 15 пациентара които окончателната диагноза е поставена съгласно критериите на Poser (23), и 15 здрави контроли (донори на кръв).
фигура 41 показва резултатите за всеки серум, изпитан с антиIgG антитяло. Всяка вертикална ивица представя оптичната плътност (OD при 492 пт) от изпитвания а серум. Ординатата дава OD на върха на вертикалните ивици. Първите 15 вертикални ивици, разположени отляво на вертикалната прекъсната ивица^представят серума на 15 здрави контроли (кръвни донори), а 15- те вертикални ивици, разположени отдясно на вертикалната прекъсната линия^представят серума от изпитаните 15 случая. Диаграмата дава възможност да бъдат изявени 2 контроли, чието OD достига над групираните стойности на кЬтролната популация. Тези стойности могат да представят наличието на специфични IgG в серопозитивни пациенти без проява на симптоми. Следователно, оценени са два метода за определяне статистическото начало на позитивността на теста.
Значението на чистите OD стойности за контролите, включително контролите с високи чисти OD стойности, е 0. 129 и стандартното отклонение е 0. 06. Без двете контроли, чиито OD стойности са по- големи от 0. 2, значението на “негативните“ контроли е 0.107 и стандартното отклонение е 0. 03. Теоретичното начало на позитивността може да бъде изчислена съгласно формулата:
изходна стойност (значение на чистите OD стойности на негативните контроли) + (2 или 3 х стандартното отклонение на чистите OD стойности на негативните контроли).
В първия случай счита се^че се касае до безсимптомна серопозитивност, и изходната стойност е равна на 0. 11 + (3 х 0. 03) = 0. 20. Негативните резултати представят неспецифичното “ниво“ на на85 личието на антитела, насочени специфично срещу определен епитоп от пептида.
Във втория случай, ако база е взета системата от контроли, състоящи се от кръвни донори в очевидно добро здраве, без да се изключи серума, който е серопозитивен, стандартното отклонение на “не- MS контроли“ е 0.116. Изходната стойнот тогава става 0.13 + (3 х 0. 06) = 0.31.
Съгласно този последен анализ теста е специфичен за MS. В този аспект видно е,че теста е специфичен за MS, следователно, както е показано на Таблица 1, няма контрола с чиста OD стойност над тази изходна стойност, фактически, този резултат влияе върху факта, че титрите на антителата у пациенти, страдащи от MS?ca, за по- голямата част, по- високи от тези на здравите контроли, които са били в контакт с MSRV-1.
В съответствие с първия метод на изчисление и както е показано на фигура 41 и на Таблица 3, 6 от 15 MS серума дават позитивен резултат (OD по- голям или равен на 0.2), което показва наличие на IgG специфично насочени срещу пептида S24Q, следователно срещу част от обратноипранскрибтазния ензим на MSRV- 1 ретровируса, кодиран от неговия pol ген и съответно срещу ретровируса MSRV-1.
Така приблизително 40% от тестуваните MS пациенти реагират срещу един епитоп, носен от S24Q пептида и притежават циркулиращи IgG, насочени срещу последния.
Два кръвни донора, различни от описаните по- горе 15, в очевидно добро здраве показват позитивен резултат. Така, очевидно е,че приблизително 13% от популацията без проява на симптоми може да са били в контакт с епитоп, носен от S24Q пептида при условия, които са довели до активна имунизация, която се манифестира със съхраняване на специфични серумни IgG. Тези условия са конкурентни с имунизация срещу MSRV1 ретровирусна обратна транскрибтаза по време на инфекция с (и/ или реактивация на ) MSRV- 1 ретровируса. Липсата на проявена неврологична патология, напомняща MS в тези серопозитивни контроли може да са показател, че те са здрави носители и са елиминирали инфекциозния вирус след имунизирането им, или че те определят една рискова популация от хронични носители, фактически, епидемиологичните данни, показващите в средата с преобладаващи случаи на MS се намира патогенен агент, който може да причини това заболяване, предполагат, че фракция от популацията, свободна на MS, задължително е била в контакт с такъв патогенен агент. Показано е, че MSRV- 1 ретровирусът определя целия или част от този “патогенен агент“ от източника на MS, и следователно е нормално за контролите, взети от здрави популации, да притежават IgG тип антитела срещу компоненти на MSRV-1 ретровируса.
Напоследък, установяването на анти- S24Q антитела само в един, различен от двата MS тестувани тук случая, може да повлияе на факта, че този пептид не представлява амино- доминантен MSRV- 1 епитоп, който вътре^-индивидуални щамови вариации може да индуцират срещу дивергентен пептид в същия участък, или че курса на заболяването и последвалото лечение може да модулира свръх антитяло отговора срещу S24Q пептида.
ТАБЛИЦА No. 3
КОНТРОЛИ
MS
0. 101
0. 136
0. 058
0. 391
0. 126
0. 37
0. 131
0. 119
0. 105
0. 267
0. 294
0. 141
0. 116
0. 102
0. 088
0. 18
0. 105
0. 411
0. 172
0. 164
0. 137
0. 049
0. 223
0. 644
0. 08
0. 268
0. 073
0. 065
0. 132
0. 074 средно 0. 129 стандартно отклонение 0. 06 изходна стойност
0.31
d) Установяване на анти- MSRV-1 IgM антитела чрез ELISA:
Техниката ELISA с пептида S24Q е използвана за изпитване наличието на анти- MSRV- 1 IgG специфични антитела в серума както погоре.
Фигура 42 показва резултатите от всеки тестуван серум с антиIgM антитяло. Всяка вертикална ивица представя чистата оптична плътност (OD при 492 пт) от изпитвания серум. Ординатната ос дава чистата OD стойност при върха на вертикалните ивици. Първите 15 ивици, разположени отляво на вертикалната линия,срязваща абсцисата,представят серума на 15 здрави контроли (кръвни донори), и вертикалните ивици, разположени отдясно на вертикалната прекъсната линия,представят серума на 15 от тестуваните MS случая.
Значението на OD стойностите за тестуваните MS случаи е 1. 6.
Значението на чистите OD стойности за контролите е 0. 7. Стандартното отклонение на негативните контроли е 0. 6.
Изходната стойност на теоретичната позитивност може да бъде изчислена съгласно формулата:
изходна стойност = (значението на OD стойностите от негативните контроли) + (3 х стандартното отклонение на OD стойностите на негативните контроли).
Изходната стойност е следователно равна на 0. 7 + (3 х 0. 6) = 2. 5;
Негативните резултати представят неспецифичното “ниво“ на присъствието на антитела, насочени специфично срещу един епитоп на пептида.
Съгласно този анализ и както е показано на фигура 42 и на съответната Таблица 4, IgM теста е специфичен за MS, доколкото няма кон90 трола с чиста OD стойност над изходната. 6 от 15 MS серума продуцират позитивен IgM резултат.
Разликата В серопревалентността между MS и контролните популации е изключително Важна: “chi- квадратен“ тест, р < 0. 002.
Тези резултати сочат за етиопатогенна роля на MSRV-1 в MS.
Така, установяването на IgM и IgG антитела срещу S24Q пептида дава възможност за оценяването му, самостоятелно или в комбинация с други MSRV-1 пептиди, курса на една MSRV-1 инфекция и/ или вирусната реактивация на MSRV-1.
ТАБЛИЦАТА
КОНТРОЛИ
MS
1. 449
0. 974
0. 371
6. 117
0. 448
2. 883
0. 456
1. 945
0. 885
1. 787
2. 235
0. 273
0.301
1. 766
0. 138
0. 668
0. 16
2. 603
1. 073
0. 802
1. 366
0.245
0. 283
0. 147
0. 262
2.442
0. 585
0. 287
0. 356
0.589
1.
Средно
Стандартно отклонение
Изходна стойност
0.7
0.6
2.5
Възможно е като резултат от направените нови открития и новите методи, развити от изобретателите, да бъдат създадени нови диагностични тестове за MSRV- 1 инфекция и/ или реактивация и за оценка лечението на MS и/ или RA на базата на тяхната ефективност в “негативиране“ установяването на тези агенти в биологичните тестове на пациентите. Нещо повече, ранното установяване у индивиди,които все още не проявяват неврологични симптоми на RA,6u направило възможно постановяване на лечение, което би било най- ефективно с оглед последващия клиничен курс, който би предшествал етапа на увреждане, съответстващ на клиничните нарушения. Понастоящем не може да бъде поставена диагноза на MS или RA преди проявата на симтоматологията на увреждане, и следователно не може да бъде назначено лечение преди опасността от клинична картина предполагаща увреждания, които са вече значителни. Диагнозата на MSRV-1 и/ или реактивиране у човек е следо вателно om особена важност и настоящето изобретение предлага средства за решаването на проблема.
Поради това е възможно, освен диагностицирането на MSRV-1 инфекция и/ или реактивация, да бъде направена оценка на леченето на MS на базата на неговата ефикасност за “негативиране“ установяването на тези агенти в биологичните течности на пациентите.
ЕЦИОНЕН ЛИСТИНГ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:
(i) ЗАЯВИТЕЛ:
(A) ИМЕ: BIOMERIEUX (B) УЛИЦА НЯМА (C) ГРАД: MARCY L'ETOILE (D) ДЪРЖАВА ФРАНЦИЯ (E) ПОЩЕНСКИ КОД; 69280 (ii) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО (ш) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ 92 (Ίν) КОМПЮТЪРНО ЧИТ АЕМА ФОРМА (A) СРЕДЕН ТИП: флопи диск (B) КОМПЮТЪР: IBM PC compatible (C) ОПЕРАТИВНА СИСТЕМА* PC- DOS / MS- DOS (D) SOFTWARE Patenln Release 11.0, Version ί 1.30 (EPO) (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 1:
(i) СЕКВЕН1ДИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА* 1158 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едвоверижка (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарня (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 1:
CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAG7 AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG 60
CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT АССТЛАСССТ 120
TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA аСЛаЖОТООТ TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180
GATOCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTOTTTGC CTTTGAAGAT 240
CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAGGGATAGC 300
ССССАТСТЛТ TTGGCCAGGC ATTAGCCCAA OACTTGAGTC AATTCTCATA CCTGOACACT 360
CTTOTCCTTC AGTACATGGA TGATTTACTT TTAGTCGCCC GTTCAGAAAC CTTGTGCCAT 420
CAAGCCACCC AAGAACTCTT ААСТТГССТС ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA f 480
AAGGCTCGGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTNAGGGC ТЛЛЛАТТАТС CAAAGGCACC 540
AGGGCCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGCTT ATCCTCATCC СЛАААСССТА 600
AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TGGCATAACA GGTTTCTGCC GAAAACAGAT TCCCAGGTAC 660
ASCCCAATAG CCAGACCATT АТАТЛСАСТЛ ATTANGGAAA CTCAGAAAGC СААТЛССТАТ 720
TTAGTAAGAT
GCCCCAGTGT
GGAATAGCTC
CTGAGTAAGG GCAGTAGCAG TGGACATCTC AACCATTTAC
TGTGCAACTC
GGACACCTAC TCAQCTTGCC TAGGAGTCCT AAATTGATGT TCTNAGTATC ATGATGTGAA TTAMJTATCA TTAAACCC
AGAAGTGGCT AACAGGGCAA TACGCAGGTC AGTGGCAAAG TGAAGCAGTT CGGCATACTC GGCTCTATTA
TTCCAGGCCC GATTTTTCTT TCAGGGATGA GGTTGGCCTC
AAAATAATAC ACTGCTAAAG
CTTGAAGAGC
TAAAGAAOGC TATATGCCAC GCTTGCAACC ATNGTTTATG AGGGAAGAGA GAGACTTGTG CAGTGCTGHG
ССТАЛСССАА AGAAAAAACA CGTGGTATAC QGTAATQGNG TCTTNCTGTG GTTGTCAGAC ACTGCGCACT
780
840
900
980 1020 1080 1140
1158 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO 2:
d)
ЙОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 297 gboftku бази (B) ТИП: нукдеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: еддоберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: ливеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК
(]ф ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 2:
CCCTTTGCCA СТАСАТСААТ TTTAGGAGTA AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG CO
CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120
TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180
GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240
CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAAGGGA 297 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 3:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 85 двойки бази (B) ТИ11: муклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (χί) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 3:
gtttagggat anccctcatc tctttggtca ggtactggcc caagatctag gccacttctc so
AGGTCCAGSH ACTCTGTYCC TTCAG »e (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 4:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 86 gBouku бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (η) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 4:
GTTCAGGGAT AGCCCCCATC TATTTGGCCA GGCACTAGCT CAATACTTGA GCCAGTTCTC 60
ATACCTGGAC AYTCTYGTCC TTCGGT 86 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 5:
(D СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 85 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iif) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NQ 5
GTTCAURGA TAGCCCCCATC TATTTGGCCW RGYATTAGCC CAAGACTTGA GYCAATTCTC 60
ATACCTGGA CACTCTTGTCC TTYRG 85 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 6:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 85 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (Р) ТОПОЛОГИЯ: ливеарна (И) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Щ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 6
GTTCAGGGAT AGCTCCCATC TATTTGGCCT GGCATTAACC CGAGACTTAA GCCA.GTTCTY CO
ATACGTGGAC ACTCTTGTCC TTTGG 85 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO. 7:
(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 111 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеярня (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Щ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 7:
GTGTTGCCAC AGGGGTTTAR RGATANCYCY CATCTMTTTG GYCWRGYAYT RRCYCRAKAY CO YTRRGYCAVT TCTYAKRYSY RGSNAYTCTB KYCCTTYRGT ACATGGATGA C 111 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: &
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 645 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарня (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 8:
TCAQGGATAG
CCCCCATCTA
TTTOGCCAGG
GATTAOGCCA
ASAL’llUAST
UMuwai
ACCTGGACAC
TCTTGTCCTT
CAGTACATGG
ATGATTTACT
TTTAGTCGCC
CGTTCAGAAA
120
CCTTGTGCCA
TCAAGCCACC
CAAGAACTCT
TAACTTTCCT
CACTACCTGT
GGCTACAAGG
180
TTTCCAAACC
AAAGGCTCGG
CTCTGCTCAC
AGGAGATTAG
ATACTNAGGG
CTAAAATTAT
240
CCAAAGGCAC
CAGGGCCCTC
AGTGAGGAAC
GTATCCAJGCC
TATACTGGCT
TATCCTCATC
300
CCAAAACCCT
AAAGCAACTA
AGAGGGTTCC
TTGGCATAAC
AjGGTTTCTGC
CGAAAACAGA
SCO
TTCCCAGGTA
CASCCCAATA
GCCAGACCAT
TATATACACT
AATTAKGGAA
ACTCAGAAAG
420
CCAATACCTA
TTTAGTAAGA
TGGACACCTA
CAOAAGTGGC
TTTCCAGGCC
CTAAAGAAGG
480
CCCTAACCCA
AGCCCCAGTG
TTCAGCTTGC
CAACAGGGCA
AGATTTTTCT
TTATATGCCA
S40
CAGAAAAAAC
AGGAATAGCT
CTAGGAGTCC
TTACGCAGGT
CTCAGGGATG
AGCTTGCAAC
CCGTGGTATA
CCTGAGTAAG
GAAATTGATG
TAGTGGCAAA
GGGTT ,coo
645 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO ft
0)
ЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 741 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO ft
| CAAGCCACCC | AAGAACTCTT | AAATTTCCTC | ACTACCTGTG | GCTACAAGGT | TTCCAAACCA | co |
| AAGGCTCAGC | TCTGCTCACA | GGAGATTAGA | TACTTAGGGT | TAAAATTATC | CAAAGGCACC | 120 |
| AGGGGCCTCA | GTGAGGAACG | TATCCAGCCT | ATACTGGGTT | ATCCTCATCC | CAAAACCCTA | 180 |
| AAGCAACTAA | GAGGGTTCCT | TAGCATGATC | AGGTTTCTGC | CGAAAACAAG | ATTCCCAGGT | 240 |
| ACAACCAAAA | TAGCCAGACC | ATTATATACA | CTAATTAAGG | AAACTCAGAA | AGCCAATACC | 300 |
| TATTTAGTAA | GATGGACACC | TAAACAGAAG | GCTTTCCAGG | CCCTAAAGAA | GGCCCTAACC | 360 |
| CAAGCCCCAG | TGTTCAGCTT | GCCAACAGGG | CAAGATTTTT | CTTTATATGG | CACAGAAAAA | 420 |
| ACAGGAATCG | CTCTAGGAGT | CCTTACACAG | GTCCGAGGGA | TGAGCTTGCA | ACCCGTGGCA | 480 |
| TACCTGAATA | AGGAAATTGA | TGTAGTGGCA | AAGGGTTGGC | CTCATNGTTT | ATGGGTAATG | 540 |
| GNGGCAGTAG | CAGTCTNAGT | ATCTGAAGCA | GTTAAAATAA | TACAGGGAAG | AGATCTTNCT | coo |
| GTGTGGACAT | CTCATGATGT | GAACGGCATA | CTCACTGCTA | AAGGAGACTT | GTGGTTGTCA | CCO |
| GACAACCATT | TACTTAANTA | TCAGGCTCTA | TTACTTGAAG | AGCCAGTGCT | GNGACTGCGC | 720 |
| ACTTGTGCAA | CTCTTAAACC | C | 741 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 10:
Ci) СЕКВЕПЦИОППИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 93 двойки бази (B) ТИП* нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 11:
(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА* 96 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едвоверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Til) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: ll· (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 12:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА* 748 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП* сДНК (Щ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 12
TGCAAGCTTC ACCGCTTGCT GGATGTAGGC TTCGATGTAG AAAGCGCCCG GAAACACGCG CGCCTCGTTG CCATTGGCCA GCGCCACGCC CAGCAGACCG GCGGCCAGCG GCGCATTCTC GATTTCCGCA CGACCGCGAT QCTQGTTGGA GTTCAGGTAA CCCTGCTTGT CCCGCACCAA GTCGTGATTG GTGATCCACA CGTCAGCCCC TTCCTTGTAG ANGCGCACCA GCCCGAAG C CATGCCATCT TTGGCGGCAG CCTTGACGGC GGAATATTCG GAGTGGAGAC GGAGGTGGAC ACGGGTGACA CCTTCCGCAA AGCATTCCGG ACGGCTGCGC GGGCAGTTAT AATTTCGGCT AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CCGGATGC
| CTCAGTACCG | GNGTGCCCCG CGCGCTGTAG | £0 |
| GGACCAATGC | GTCGCCAGCT TGCGCGCCAG | 120 |
| GATATCACCC | GCCATGGCGC CGGAGAGCGC | 180 |
| AACGCCGGGC | TCGTCGAACC ATTCGGGGGC | 240 |
| GAQCCAGGCC | CTGQCCAGCA ACTGGCACAG | 300 |
| CAGCAGCAGG | CGGGTCGGCT TGTCGCGCTC | 360 |
| GACGATGGGC | TTCACGCCCT TQCCACGCGC | 420 |
| ATTGGCGAGA | TCGGTCAGCG CCAAGGCGCC | 480 |
| ATCGTCGAGA | CGGACATTGC CATCGACGAC | 540 |
| GAAGCGCGGC | GAATTCATCC GCGTATTGTA | 600 |
| ACGTGCCCGA | TTGACCCGGA GCAACCCCGC | 660 |
| TACGAATCAA | CGGGTTACCC CAGGGCGCTG | 720 |
| 748 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 13:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
100 (A) ДЪЛЖИНА 18 двойки баш (B) ТИП: нуклвопшд (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарма (Н) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (и) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА* SEQ ID NO: 13:
GCATCCGGCA ACTGCACG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 14:
fl) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 20 двойки баш (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 14:
GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 15:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 18 двойки баш (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: лияеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Щ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 15:
101
GCATCCGGCA ACTGCACG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 16:
(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеариа (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 16:
AGGAGTAAG GAAACCCAACG GAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 17:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 19 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Hi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ A SEQ ID NO: 17:
TAAGAGTTGC ACAAGTGCG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 18:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 21 двойки бази (B) ТИП нуклеотид
102 (C) ВЕРИЖНОСТ: ещюверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеариа (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Ш) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQIDNO. 1&
TCAGGGATAG СССССАТСГА Т (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQIDNO: 1ft (i) СЕКВЕПЦИОНПИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 24 двойки бази (B) ТИП: вуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижяа (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 19:
AACCCTTTGC САСГАСАТСА ATTT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 20:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 15 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: ливеарпа (il) МОЛЕКУЛЕН ТИП* сДНК (in) ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 5,7, Ю, 13 (C) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: G представлява ивозим (i)
103 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 20:
GGTCGTGCCG CAGGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 21:
(I) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 21 двойки бази (B) ТИП: нуклеоспид (C) ВЕРИЖНОСГ: едаоберижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 21:
TTAGGGATA GCCCTCATCTC T (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 22:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА* 21 двойки бази (B) ТИП: яуклеошид (C) ВЕРИЖНОСГ: едяоберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеараа (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ffi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 22:
TCAGGGATAG ССОССАТСГА Т (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0.23:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
104 (A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 23:
AACCCTTTGC СЛСГЛСЛТСЛ АТТТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQIDNO: 24:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 24:
GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 25:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 18 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 25:
105
TCATCCATGT ACCGAAGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 26:
fl) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА' 20 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ш) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 26:
ATGGGGTTCC CAAGTTCCCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 27:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 20 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Щ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 27:
GCCGATATCA CCCGCCATGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 28:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА* 18 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид
106 (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 28:
GCATCCGGCA ACTGCACG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 29:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 20 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 29:
CGCGATGCTG GTTGGAGAGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 30:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 20 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 30:
ТСТССАСГСС GAATATTCCG
107 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 31:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА: 26 двойки бази (B) ТИП нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ* линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (т) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 31:
GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 32:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП сДНК (iii) ХАРАТЕРИСТИКИ:
(B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ б, 12,19 (C) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ G представя ииозин (ί) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 32:
CATCTGTTTG GGCAGGCAGT AGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 33:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
108 (A) ДЪЛЖИНА* 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 33:
CYYGAGCCAG ТТСГСАТАСС TGGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 34:
(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ* (A) ДЪЛЖИНА 22 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 34:
AGTGYTRCCM CARGGCGCTG AA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 35:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 22 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (й) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 35:
109
GMGGCCAGCA GSAKGTCATC CA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 36:
fl) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА* 22 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: ливеаряа (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ш) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 36:
GGATGCCGCC TATAGCCTCT AC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 37:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА* 22 двойки бази (B) ТИП: ауклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ш) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 37:
AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 38:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА 40 двойки бази (B) ТИП: нуклеопшд
110 (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ίϋ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 3&
TAAAGATCTA GAATTCGGCT ATAGGCGGCA TCCGGCAAGT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3ft (i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Й1) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 3ft виж Фигура 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 40:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (^'ОПИСАНИЕ'НАТОСЛЕДОВАТЕЛНОСГТА* SEQ ID NO ‘ 40f Виж фигура 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQIDNO: 4t
111 (?)
ВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(А) ДЪЛЖИНА: двойки бази (B) ТИП нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ϋί) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 41:
Виж фигура 34 (2)ИНФОРМАЦИЯ ЗАSEQIDNO 42:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеарна (й) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 42:
Виж фигура 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 43.;
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (Ш) ОПИСАНИЕ НЕПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 43.
Виж фигура 34
112 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 44:
ЩИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(А) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 44:
Виж фигура 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 45:
(I) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП· сДНК (ш) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 45:
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 46:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 46:
Виж Фигура 13
113 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Π) NQ 47:
ЛИК
ВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 23 двойки баш (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едиоверижма (D) ТОПОЛОГИЯ: литеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА* SEQ ID NO. 47:
TGATGTGAAC GGCATACTCA CTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 48:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 24 двойки бази (B) ТИП: иукдеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеариа (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 48:
CCCAGAGGTT AGGAACTCCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO. 49:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 25 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна
114 (И) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (хО ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 4ft
GCTAAAGGAG ACTTGTGGTT GT CAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 50:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 22 двойки баш (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 50:
CAACATGGGC ATTTCGGATT AG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 51:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки баш (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 51:
Виж фигура 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 52:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(А) ДЪЛЖИНА двойки баш
115 (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК
(]ф ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO 52:
Виж фигура 16 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 53:
(i)C
ЩИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (и) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO. 53:
Виж фигура 17 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 54:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 21 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 54:
CCTGAGTTCr TGCACTAACC C
116 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ED NO: 55:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 55:
GTCCGTTGGG ТТТССГТАСТ CCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 56:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (и) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 56:
фиж фигура 23 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO: 57:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК
117 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 57:
Виж фигура 27 (27a go 27c ) (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 58:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 1722 двойки бази (B) ТИП: иуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 58:
| TGGAGAATAG | CAGCATAAGT | TGGCTGGCAG | AAGTAGGGAA | AGACAGCAAG | AAGTAAAGAA | 60 | |
| AAAAARGAGA | AAGTCAGAGA | AAGAAAAAAA | GAGAGGAAGA | AACAAAGAAG | AACTTGAAGA | 120 | i |
| GAGAAAGAAG | TAGTAAAGAA | AAAACAGTAT | ACCCTATTCC | TTTAAAAGCC | AGGGTAAATT | 160 | |
| TCTGTCTACC | TAGCCAAGGC | ЛТАТТСТТСТ | TATGTGGAAC | ATCAACCTAT | ATCTGCCTCC | 240 | |
| CCACTAACTG | GACAGGCACC | TGAACCTTAG | TCTTTCTAAG | TCCCAACATT | AACATTGCCCi | ||
| CAGGAAATCA | GACCCTATTG | GTACCTGTCA | AAGCTAAAGT | CCCGTCAGTG | CAGAGCCATA | 360 | |
| CAACTAATAT | CCCTATTTAT | AGGGTTAGGA | ATGGCTACTG | CTACAGGAAC | TGGAATAGCC | 420 | £ |
| GGTTTATCTA | CTTCATTATC | CTACTACCAT | ACACTCTCAA | AGAATTTCTC | AGACAGTTTG | 480 | |
| CAAGAAATAA | TGAAATCTAT | TCTTACTTTA | CAATCCCAAT | TAGACTCTTT | GGCAGCAATG | 540 | |
| ACTCTCCAAA | ACCGCCGAGG | CCCACACCTC | CTCACTGCTG | AGAAAGGAGG | ACTCTGCACC | 600 | |
| TTCTTAGGGG | AAGAGTGTTG | TTTTTACACT | AACCAGTCAG | GGATAGTACG | AGATGCCACC | 660 | |
| TGGCATTTAC | AGGAAAGGGC | TTCTGATATC | AGACAATGCC | TTTCAAACTC | TTATACCAAC | 720 | |
| CTCTGGAGTT | GGGCAACATG | GCTTCTTCCA | TTTCTAGGTC | CCATGGCAGC | CATCTTGCTG | 780 | |
| TTACTCACCT | TTGGGCCCTG | TATTTTTAAG | CTTCTTGTCA | AATTTGTTTC | CTCTAGGATC | 840 | |
| GAAGCCATCA | AGCTACAGAT | GGTCTTACAA | ATGGAACCCC | AAATGAGTTC | AACTAACAAC | 900 | |
| TTCTACCAAG | GACCCCTGGA | ACGATCCACT | GGCACTTCCA | CTAGCCTAGA | GATTCCCCTC | 960 | |
| TGGAAGACAC | TACAACTGCA | GGGCCCCTTC | TTTGCCCCTA | TCCAGCAGGA | AGTAGCTAGA | 1020 | : ·. .. j |
| GCGGTCATCG | GCCAAATTCC | CAACAGCAGT | TGGGGTGTCC | TGTTTAGAGG | GGGGATTGAA | 1080 | . Ж |
| GAGGTGACAG | CCTGCTGGCA | GCCTCACAGC | CCTCGTTGGY | TCTCAGTGCC | TCCTCAGCCT | 1140 | |
| TGGTGCCCAC | TCTGGCCGTG | CTTGAGGAGC | CCTTCAGCCT | GCCACTGCAC | TGTGGGAGCC | 1200 | |
| TCTTTCTGGG | CTGGACAAGG | CCGGAGCCAG | CTCCCTCAGC | TTGCAGGGAG | GTATGGAGGG | 1260 | |
| AGAGATGCAG | GCGGGAACCA | GGGCTGCGCA | TGGCGCTTGC | GGGCCAGCAT | GAGTTCCAGG | 1320 | |
| TGGGCGTGGG | CTCGGCGGGC | CCCACACTCG | GGCAGTGAGG | GGCTTAJ3CAC | CTGGGCCAGA | 1380 | |
| CAGATGCTGT | GCTCAACTTC | TTCGCTGGGC | CTTAGCTGCC | TTCCCCGTGG | GGCAGGGCTY | 1440 | |
| CGGGAACMTG | CAGCCTGCCC | ATGCTTGAGC | CCCCCACCCC | GCCGTGGGTT | CYTGCACAGC f | 1500 | |
| CCAAGCTTCC | CGGACAAGCA | CCACCCCTTA | TCCACGGTGC | CCAGTCCCAT | CAACCACCCA | 1S60 | |
| AGGGTTGAGG | AGTGCGGGCA | CACAGCGCGG | GATTGGCAGG | CAGTTCCACT | TGCGGCCTTG | 1620 | |
| GTGCGGGATC | CACTGCGTGA | AGCCAGCTGG | GCTCCTGAGT | CTGGTGGGGA | CTTGGAGAAT | 1680 | |
| CTTTATGTCT | AGCTAAGGGA | TTGTAAATAC | ACCAATCAGC | AC | 1722 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO: 59:
118 (ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 495 gBonkii баян (B) ТИП: нуклсотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижиа (D) ТОПОЛОГИЯ: лииеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 59:
СТТССССААС TAATAAGGAC СССССТТТСА ACCCAAACAG TCCAAAAGGA CATAGACAAA 60
GGAGTAAACA ATGAACCAAA GAGTGCCAAT ATTCCCTGGT TATGCACCCT CCAAGCGGTG 120
GGAGAAGAAT TCGGCCCAGC CAGAGTGCAT GTACCTTTTT CTCTCTCACA CTTGAAGCAA 180
ATTAAAATAG ACNTAGGTHA ATTNTCAGAT AGCCCTGATG GYTATATTGA TGTTTTACAA 240
GGATTAGGAC AATCCTTTGA TCTGACATGG AGAGATATAA TATTACTGCT AAATCAGACG 300
CTAACCTCAA ATGAGAGAAG TGCTGCCATA ACTGGAGCCC GAGAGTTTGG CAATCTCTGG 360
TATCTCAGTC AGGTCAATGA TAGGATGACA ACGGAGGAAA GAGAACGATT CCCCACAGGG 420
CAGCAGGCAG TTCCCAGTGT AGCTCCTCAT TGGGACACAG AATCAGAACA TGGAGATTGG 480
TGCCGCAGAC ATTTA
455 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 60:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 2503 двойки бази (B) ТИП: нуклеошид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линсарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 60:
CCAAGAACCC ACCAATTCCG GAHCACATTT TGGCGACCAC GAAGGGACTT TCGCATATCG 60
CCAA0CGGTG AGACAATA0C COAGCGGTGA GACCTTTCCC AATCGCCAAG CAGTGAGTAC 120
CATCAOACCC CTTTCACTTG CTATTCTGTC CTATCTTTCT TTAGAATTCG GGGGCTAAAT 180
ACCGGGCATC TGTCAGCCAT TTAAAAGTGA CTAGCGGGCC GCCGGACTAA AGACACGGGT 240
119
GTCAAGCTTT CTGGGAAAGG GCTCTCTAAC GGTTTGCCTA GAACCAGCTT CCGCTTTTCC GTGAAGGAAA GCCATGCATC TCCGGGGTCT GAGTGGAACT CTCAAAAGCA TGTCGCCCAA TGACCCTTGC CCTCTGGGTC CTAATGCCTG TGAAGCTAGA ACCGCTTCTA AAAATTGCTA CTATAAAGAA TGAWTTCTAG TATTAAACTC GGCTCACCAA TCAGAAAGAC ACAGTTTTTG GGAATTTTAG GATCCCTCCT CAGACTAACA ATATGGGGAG CCTCAGAAAT TGTATCCCTC ACTCTTCCAA CCCTGAAGAT CCCCTCCCTC GTGGCATAAC ATCTTTATAG GATGGGGTAA ACTCTAACAG GTTTTTGAGA ATGCGTCAGT GGTCCTCCTT GTGGTCTAGG AGGACAGGCA TAAGGACCAC TAAATCCGAC CTTCCTCGGT TTTCTGCTGC TGCGTCGGTG AGCGCAACTA AGGTTCTTGG GCAGGGGTTG TTTCTGCTGC CAGGGTCCCA GGACCATTGC AGGTCCTTGG GTGGGCGGTT TTGTCTTTCA TATGGGAAAC TGCATCCTAA GCCATTGGGA CCAATTTGAC TTTTCCTGCA CTACGGCTTG GCCCCAATAT GAGGGAAGCA CAAATTACAA TAYTATCCTA AAATGGAGTG AATACCTTAT GTCCAAGCTT GCAAAGCTTG CAATTTACAT CCCACAGGAG TCCCTATAGC TTCCCTTCCT ATTGATGATA AAATAAGCAA AGAAATCTCC AAAGGTCCAC TCAAGYTGTA GGGGGAGGGG AATTTGGCCC GATTTAAAGC AGATCAAGGC AGACCTGGGG GATGTCCTAC AGGGTCTAGG GCAAACCTTT TTAGATCAAA CCCTGGCCTT TAATGAAAAG GGAGATACCT GGTATCCTAG TCAAGTAAAT TTCCTTACTG GTCAGCAACC CATCCCCAGT CATGGGGACT GGAGTCGTAA ACATCTGTTG GGGAAAAAGC CCATGAATTA TTCAATGATA CCTTCTGCCT TCCTCGAGCG GCTACAAGAG GAATCACTCG AGGGTCAATT GATTCTAAAA ATCAGGAGAA AGCTCCAAAA GCAAGCCCTG ACCTGGCAAC CTTGGTGTTC TATAATAGGG
| ААСССССААС | TCTTTGGAGT | TGGGACCGTT | 300 |
| TGTACTTCTG | GGCTGAGCCG | TGGGTTGACA | J60 |
| CGNCAACATG | TTGGTTGACC | CTGCGGCCAT | 420 |
| GCGACACTCG | ССТАТСТАТС | СТАТСТАТСС | 480 |
| CCAGACAAAC | TTCCTCTCGC | СТСТСТТСТС | 540 |
| CCTGGTCTCT | GGTGCTTTTC | CTARTTTCTC | 600 |
| CAGGACTCTG | ТТАССТТСТТ | TAGGCACCCG | 660 |
| CCCAAGGCCC | CATCGTAGTG | GGGACTACCT | 720 |
| GGCCTAACAA | AAGTTATTCC | TGAAGCTAGG | 780 |
| СТАТТСАТАТ | AAGTGAGAAC | AAAAGGTGTC | 840 |
| CCTCAGGGTA | TGGCCCTCCA | ТТТСАТТТТТ | 900 |
| AGTCCCAATA | CTAACAGGAG | AATGCTTAGG | 960 |
| AAGpGCCACT | AAATCTGATT | TTTCTCAGTC | 1020 |
| AGGTTGTGCA | GGTTTTCGAG | AATGCGTCAG | 1080 |
| CCTCCATGTG | GTCTGGGAGG | AAAACTAGTG | 1140 |
| TTCAAGTCAG | CAGGGTCCAG | GGACCGTTGC | 1200 |
| TGCATTGGTG | AATGCAACTA | TTCTGATCAG | 1260 |
| GCAGGGAGAG | АААСААААСА | ААССААААСТ | 1320 |
| ACTCAGGCAT | CAACAGGTTC | ACCCTTGAAA | 1380 |
| ССАСАААССС | TGAAAAAGAG | GAGGCTCATT | 1440 |
| TCTCTTTXTG | ATGGGGAAAA | ATGGCCACCT | 1500 |
| CAGCYTGATC | TTTTCTGTAA | GAGGGAAGGC | 1560 |
| ТСТТТТСАТТ | GAGGGAGAAT | АСАСААСТАТ | 1620 |
| GACCCTTCAG | СТТАСССССА | TATCCTAGCC | 1680 |
| СТССТССТСТ | ААТСТССССТ | GCCCAGAAGG | 1740 |
| АААААССССС | GGGCTATCGG | TTATGTCCCT | 1800 |
| AACCCGGGTG | CATGTCCCTT | СТСССТСТСТ | 1860 |
| AAGTTTTCAG | ATGATCCTGA- | TAGGTACATA | 1920 |
| GACCTCACTT | GGAGAGACGT | CATGCTACTG | 1980 |
| AATGCGGCTT | TAGCTGCAGC | CTGAGAGTTT | 2040 |
| GAAAGAATGA | CAGCCGAAGA | AAGGGACAAC | 2100 |
| ATGGATCCCC | ACTGGGACTT | TGACTCAGAT | 2160 |
| ATCTGTGTTC | TGGAAGGACT | AAGGAGAATT | 2220 |
| ТССАССАТАА | CCCAGGGAAA | GGAAGAAAAT | 2280 |
| GCCTTAAGAA | ААТАТАСТСС | CCTGTCACCC | 2340 |
| GATAAGTTTA | ТТАСССААТС | AGCCACAGAT | 2400 |
| AGCCTGAACA | AAATCTAGAG | АСАТТАТТАА | 2460 |
| ACCAAGAGGA | АСА | 2503 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO: 61:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 1167 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна
120 (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 61:
| AAGGAAACTC | AGAAAGCCAA | ТАСССАТТТА | GTAAGATGGA | CACCAGAAGC | AGAAGCAGCT | 60 |
| TTCCAGGCCC | TAAAGAAATC | ССТААСССАА | GCCCCAGTGT | TAAGCTTGCC | AACGGGGCAA | 120 |
| GACTTTTCTT | TATATGTCAC | AGAAAAACAG | GAATAGCTCT | AGGAGTCCTT | ACACAGGTCC | 180 |
| AAGGGACAAG | CTTGCAACCT | GTGGCATACC | TGAGTAAGGA | AACTGATGTA | NTGGCAAAGG | 240 |
| GTTGGCCTCA | TTGTTTACAG | GTAGGGCAGC | AGTAGCAGTC | TTAGTTTCTG | AAACAGTTAA | 300 |
| AATAATACAG | GGAAGAGATC | TTACTGTGTG | GACATCTCAT | GATGTGAACG | GCATACTCAC | 360 |
| TGCTAAAGAG | GACTTGTGGC | TGTCAGACAA | ССАТТТАСТТ | AAATAGCAGG | ТТСТАТТАСТ | 420 |
| TGAAGTGCCA | GTGCTGCGAC | TGCACATTTG | TGCAACTCTT | AACCCAGCCA | САТТТСТТСС | 480 |
| AGACAATGAA | GAAAAGATAG | AACATAACTG | TCAACAAGTA | ATTGCTCAAA | CCTATGCTGC | S40 |
| TCGAGGGGAC | CTTCTAGAGG | TTCCCTTGAC | TGATCCCGAC | CTCAACTTGT | ATACTGATGG | 600 |
| AAGTTCCTTG | GCAGAAAAAG | GACTTTGAAA | AGCGGGGTAT | GCAGTGATCA | GTGATAATGG | 660 |
| AATACTTGAA | AGTAATCGCC | TCACTCCAGG | AACTAGTGCT | CACCTGGCAG | AACTAATAGC | 720 |
| CCTCACTTGG | GCACTAGAAT | TAGGAGAAGG | AAAAAGGGTA | ААТАТАТАТТ | CAGACTCTAA | 780 |
| GTATGCTTAC | CTAGTCCTCC | ATGCCCATGC | AGCAATATGG | AGAGAGAGGG | ААТТССТААС | 840 |
| TTCTGAGGGA | АСАССТАТСА | ACCATCAGGG | AAGCCATTAG | GAGATTATTA | TTGGCTGTAC | 900 |
| AGAAACCTAA | AGAGGTGGCA | GTCTTACACT | GCCAGGGTCA | TCAGGAAGAA | GAGGAAAGGG | 960 |
| AAATAGAAGG | CAATCGCCAA | GCGGATATTG | AAGCAAAAAA | AGCCGCAAGG | CAGGACTCTC | 1020 |
| CATTAGAAAT | GCTTATAGAA | GGACCCCTAG | TATGGGGTAA | TCCCCTCTGG | GAAACCAAGC | 1080 |
| CCCAGTACTC | AGCAGGAAAA | ATAGAATAGG | АААССТСАСА | AGGACATACT | ТТССТССССТ | 1140 |
| CCAGATGGCT | AGCCACTGAG | GAAGGAA | 1167 |
121 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 62:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 78 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SFQ TD NO: 62:
TCCAAAGGCA CCAGGGCCCT CAGTGAGGAA CGTATCCAGC CTATACTGGC TTATCCTCAT 60 CCCAAAACCC TAAAGCAA 76 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO: 63:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 26 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 63:
Ser Lys Gly ТЪг Arg Ala Leu Ser Glu Glu Arg De Gin Pro De Leu
10 15
Ala Tyr Pro His Pro Lys Tbr Г-eu Lys Gin
25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 64:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 28 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна
122 (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 64:
AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ TD NO: 65:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 30 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ί) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEO ID NO: 65:
AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 66:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 21 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 66:
GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G
123 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO: 67:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 34 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQIDNO: 67:
GTGCTGATTG GTGTATTTAC ААТСС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO: 68:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 34 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO; 68:
GACTCGCTGC AGATCGATTT ΤΤΤΤΤΊΊΤΤΤ ΤΊΤΤ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 69:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 30 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 69:
124
GCCATCAAGC CACCCAAGAA СГСГГААСТТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗЛ SEQ ID NO: 70:
(ii) CEKBEHT (ИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 30 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (1) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 70:
CCAATAGCCA СтАССАТТАТА ТАСАСГААТТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO: 71:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 71:
GCCATAACTG CAACCCAAGA GTT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ TO NO: 72:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 23 дВойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ': едноверижна
125
GCCATCAAGC CACCCAAGAA СТСТТААСГТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 70:
(ii) CF.KREHHTTOHHH ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 30 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 70:
CCAATAGCCA СтАССАТТАТА ТАСАСГААТТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 71:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 71:
GCCATAACTG CAACCCAAGA GTT (2) ИНфОРМАТЩЯ ЗА SEQ TD NO: 72:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна
126 (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 72:
GGACGAGGTG GTGGCTTATT TCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 73:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 25 дВойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (1) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 73:
AACTTGCGTG CTAGAAGGAC TAAGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 74:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (») ОПИСАНИЕ НЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 74:
ААСГПТССС ITTTCCAGAT ССТС
127 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ED NO: 75:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 22 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (1) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 75:
GCATACCAGG CAAGTGGACA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 76:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 25 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 76:
CTGTCCGTTG GGTTTCCTTA CTCCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 77:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(Л) ДЪЛЖИНА 24 дВойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна
128 (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEO ID NO: 77:
GAGGCTCTGG AAAAGGGAAA AGTT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 78:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 25 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 78:
CTGTCCGTTG GGTTTCCTTA CTCCT (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ TD NO: 79:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 25 дВойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEO ID NO: 79:
AGGAGTAAGG AAACCCAACG GACAG (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 80:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
129 (A) ДЪЛЖИНА 25 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (я) ОПИСАНИЕ ПА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQIDNO: 80:
TGTATATAAT GGTCTGGCTA TTGGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 81:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 25 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 81:
AGGAGTAAGG AAACCCAACG GACAG (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 82:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 26 дВойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижпа (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ TD NO: 82:
TTCGGCAGAA ACCTGTTATG CCAAGG
130 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO. 83:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 22 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: сдновсрижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ ПА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 83:
СГСОАТГГСТ TGCTGGGCCT ТА (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO: 84:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 20 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: сдновсрижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ ПА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 84:
GTTGATTCCC TCCTCAAGCA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO: 85:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 20 дВойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: сдновсрижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна
131 (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEO ID NO: 85:
СТСТАССААТ CAGCATGTGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ TD NO: 86:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 19 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEO ID NO; 86:
TGTTCCTCTT GGTCCCTAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 87:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 433 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 87:
MATATGTGIA GLSTSLSYYH TLQNRRGPHL LTAEKGGLCT RQCLSNSYTN LWSWATWLLP EAIKLQMVLQ MEPQMSSTNN FAPIQQEVAR AVIGQIPHSS WCPLWPCLRS PSACHCTVGA WRLRASMSSR KAWARRAPHS REXAACPCbS PPPRRGFLHS
DWQAVPLAAL VRDPLREASW APESGGDLEN LYV
TLSKNFSDSL QEIMKSIbTL· FLGEECCFYT NQSGIVRDAT FIX3PMAAILL LLTFGPCIFK FYQGPLERST GTSTSLEIPL WGVLFRGGIE EVTACWQPHS SFWAGQGRSQ LPQLAGRYGG GSEGLSTWAR QMLCSTSSLG PSFPDKHHPL STVPSPINHP
| QSQLDSLAAM | 50 |
| WHLQERASDI | 100 |
| LLVKFVSSRI | 150 |
| WKTLQLQGPF | 200 |
| PRWXSVPPQP | 250 |
| RDAGGNQGCA | 300 |
| LSCLPROAGL· | 350 |
| RVEECGHTAR | 400 |
433
132 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 88:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 693 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 88:
СТТССССААС TAATAAGGAC CCCCCTTTCA ACCCAAACAG TCCAAAAGGA CATAGACAAA 60
GGAGTAAACA ATGAACCAAA GAGTGCCAAT ATTCCCTGGT TATGCACCCT CCAAGCGGTG 120
GGAGAAGAAT TCGGCCCAGC CAGAGTGCAT GTACCTTTTT CTCTCTCACA CTTGAAGCAA 180
ATTAAAATAG ACNTAGGTNA ATTNTCAGAT AGCCCTGATG GYTATATTGA TGTTTTACAA 240
GGATTAGGAC AATCCTTTGA TCTGACATGG AGAGATATAA TATTACTGCT AAATCAGACG 300
CTAACCTCAA ATGAGAGAAG TGCTGCCATA ACTGGAGCCC GAGAGTTTGG CAATCTCTGG 360
TATCTCAGTC AGGTCAATGA TAGGATGACA ACGGAGGAAA GAGAACGATT CCCCACAGGG 42 0
CAGCAGGCAG TTCCCAGTGT AGCTCCTCAT TGGGACACAG AATCAGAACA TGGAGATTGG 480
TGCCGCAGAC ATTTACTAAC TTGCGTGCTA GAAGGACTAA GGAAAACTAG GAAGACTATG 540
AATTATTCAA TGATGTCCAC TATAACACAG GGGAAAGGAA GAAAATCCTA CTGCCTTTCT 600
GGAGAGACTA AGGGAGGCAT TGAGGAAGCA TACCAGGCAA GTGGACATTG GAGGCTCTGG 660
AAAAGGGAAA AGTTGGGCAA ATTGAATGCC TAA 693 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 89:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 1577 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ TD NO: 89:
133
| AACTTGCGTG | CTAGAAGGAC | TAAGGAAAAC | TAGGAAGACT | ATGAATTATT | CAATGATGTC | CO |
| CACTATAACA | CAGGGGAAAG | GAAGAAAATC | CTACTGCCTT | TCTGGAGAGA | CTAAGGGAGG | 120 |
| CATTGAGGAA | GCATACCAGG | CAAGTGGACA | TTGGAGGCTC | TGGAAAAGGG | AAAAGTTGGG | 180 |
| CAAATTGAAT | GCCTAATAGG | GCTTGCTTCC | AGTGCAGTCT | ACAAGGACGC | TTTAGAAAAG | 240 |
| ATTGTCCAAG | TAGAAATAAG | CCGCCCCTCG | TCCATGCCCC | TTATGTCAAG | GGAATCACTG | 300 |
| GAAGGCCTAC | TGCCCCAGGG | GACGAAGGTC | CTCTGAGTCA | GAAGCCACTA | ACCTGATGAT | 360 |
| CCAGCAGCAG | GACTGAGGGT | GCCCGGGGCA | AGTGCCAGCC | CATGCCATCA | CCCTCAGAGC | 420 |
| CCCGGGTATG | TTTGACCATT | GAGAGCCAGG | AAGTTAACTG | TCTCCTGGAC | ACTGGCGCAG | 480 |
| CCTTCTCAGT | CTTACTTTCC | TGTCCCAGAC | AATTGTCCTC | uAGATCTGTC | ACTATCCGAG | 540 |
| GGGTCCTAAG | ACAGCCAGTC | ACTACATACT | TCTCTCAGCC | ACTAAGTTGT | GACTGGGGAA | 600 |
| CTTTACTCTT | TTCACATGCT | TTTCTAATTA | TGCCTGAAAG | CCCCACTCCC | TTGTTAGGGA | 660 |
| GAGACATTTT | AGCAAAAGCA | GGGGCCATTA | TACACCTGAA | CATAGGAAAA | GGAATACCCA | 720 |
| TTTGCTGTCC | CCTGCTTGAG | GAAGGAATTA | ATCCTGAAGT | CTGGGCAATA | GAAGGACAAT | 780 |
| ATGGACAAGC | AAAGAATGCC | CGTCCTGTTC | AAGTTAAACT | AAAGGATTCT | GCCTCCTTTC | 840 |
| CCTACCAAAG | GAAGTACCCT | CTTAGACCCG | AGGCCCTACA | AGGACTCAAA | AGATTGTTAA | 900 |
| GGACCTAAAA | GCCCAAGGCC | TAGTAAAACC | ATGCAGTAGC | CCCTGCAATA | CTCCAATTTT | 960 |
| AGGAGTAAGG | AAACCCAACG | GACAGTGGAG | GTTAGTGCAA | GATCTCAGGA | TTATTAATGA | ,1020 |
| GGCTGTTTTT | CCTCTATACC | CAGCTGTATC | TAGCCCTTAT | ACTCTGCTTT | CCCTAATACC | 1080 |
| AGAGGAAGCA | GAGTAGTTTA | CAGTCCTGGA | CCTTAAGGAT | GCCTCTTTCT | GCATCCCTGT | 1140 |
| ACATCCTGAT | TCTCAATTCT | TGTTTGTCTT | TGAAGATCCT | TTGAACCCAA | TGTCTCAATT | 1200 |
| CACCTGGACT | GTTTTACCCC | AGGGGTTCCG | GGATAGCCCC | CATCTATTTG | GCCAGGCATT | 1260 |
| AGCCCAAGAC | TTGAGCCAAT | TCTCATACCT | GGACATCTTG | TCCTTCGGTA | TGGGATGATT | 1320 |
| TAATTTTAGC | CACCCGTTCA | GAAACCTTGT | GCCATCAAGC | CACCCAAGCG | TTCTTAAATT | 1380 |
| TCCTCACTCC | GTGTGGCTAC | AAGGTTTCCA | AACCAAAGGC | TCAGCTCTGC | TCACAGCAGG | 1440 |
| TTAAATACTT | AGGGTTAAAA | TTATCCAAAG | GCACCAGGGC | CCTCTGTGAG | GAATGTATCC | 1500 |
| AACCTGTACT | GGCTTATCTT | CATCCCAAAA | CCCTAAAGCA | ACTAAGAAGG | TCCTTGGCAT | 1560 |
| AACAGGTTTC | TGCCGAA | 1577 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 90:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 182 амино киселинни остатъка (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОПИСАНИЕ ПА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 90:
SSSRTEGARG QLSSRSVTIR RDILAKAGAI QVKLKDSASF
KCQPMPSPSE GVLRQPVTTY IHLHIGKGIP PYQRKYPLRP
PRVCLTIESQ FSQPLSCDWG ICCPLLEEGI EALQGLKRL·!,
EVNCLbDTGA TLLFSHAFLI KPEVWAIEGQ RT
AFSVLLSCPR
MPESPTPLLG
YGQAKNARPV
100
150
182
134 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 91:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 36 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (i) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 91:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CACCCCCCCC CCCCCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO: 92:
(ii) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА 22 двойки бази (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (Ϊ) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO; 92:
AGATCTGCAG AATTCGATAT СА
Claims (45)
- ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, в който геномът Включва нуклеотидна последователност,избрана от групата, включваща последователностите SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, техните комплементарни последователности и техните еквивалентни последователности, по- специално нуклеотидни последователности, проявяващи, за всяка поредица от 100 мономера, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложност с посочените последователности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, съответно, и техните комплементарни последователности.
- 2. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, в който участъкът от генома,включващ гените env и pol, с изключение на субучастъка?притежаващ последователност?идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 1, кодира който и да е полипептид, проявяващ за всяка непрекъсната поредица от поне 30 аминокиселини поне 50% и за предпочитане 70% хомоложност с пептидна последователност, кодирана от която и да е от групите, включаща SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89 и техните комплементарни последователности.
- 3. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, в който генът pol включва нуклеотидна последователност;частично или напълно идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 57, с изключение на SEQ ID NO: 1.
- 4. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, в който генът gag включва нуклеотидна последователност частично или напъл136 но идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 88.
- 5. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с мултиплената склероза, чийто геном включва нуклеотидна последователност, избрана от групата, обхващаща последователностите SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, техните комплементарни последователности и техните еквивалентни последователности, по- специално нуклеотидните последователности;проявяващи, за всяка поредица от 100 мономера, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложност с посочените последователности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NQ: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, съответно, и техните комплементарни последователности.
- 6. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с мултиплената склероза,в който участъкът от генома/Зключ ващ гените env и pol, с изключение на субучастъка, притежаващ последователност;идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 1, кодира който и да е полипептид, проявяващ за всяка поредица от поне 30 аминокиселини, поне 50% и за предпочитане 70% хомоложност с пептидна последователност, избрана от групата, включваща SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID N0: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89 и техните комплементарни последователности.
- 7. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с мултиплената склероза, в който генът pol включва нуклеотидна последователност, частично или напълно идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 57, с изключение на SEQ ID NO: 1.
- 8. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързван с мултиплената склероза, в който генът gag включва нуклотидна последователност, частично или напълно идентична или еквивалентна137 на SEQ ID NO: 88.
- 9. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с ревматоидния артрит, в който геномът включва нуклеотидна последователност, избрана от групата, включваща последователностите SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, техните комплементарни последователноти, в частност нуклеотидни последователности, проявяващи за всяка поредица от 100 последователни нуклеотида, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложност с посочените последователности SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89 съответно, и техните комплементарни последователности.
- 10. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с ревматоидния артрит, в който участъкагот генома,включващ генаpol, с изключение на субучастъкарритежаващ последователност.идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 1, кодира всеки полипептид, проявяващ за всяка непрекъсната поредица от поне 30 аминокиселини, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложност с пептидна последователност, кодирана от всяка нуклеотидна последователност, избрана от групата, включваща SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89 и техните комплементарни последователности.
- 11. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с ревматоидния артрит, в който генът pol съдържа нуклеотидна последователност, частично или напълно идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 57, с изключение на SEQ ID NO: 1.
- 12. Вирусен материал в изолирано или пречистено състояние, свързан с ревматоидния артрит, в който gag генът съдържа нуклеотидна последователносШуЧастично или напълно идентична или еквивалентна на SEQ ID NO: 88.138
- 13. Нуклеотиден фрагмент, съдържащ нуклеотидна последователност, избрана от групата,включваща:а) всички геномни последователности, част или цяло от гена pol наMSRV-1 вируса, с изключение на цялата последователност на нуклеотидния фрагмент, определен от SEQ ID NO: 1;b) всички геномни последователности, част или цяло от гена env на MSRV-1;c) всички частични геномни последователности на gag гена от MSRV1;d) всички геномни последователности, припокриващи генаpol и гена env от вируса MSRV-1, и припокриващи гена pol и гена gag',e) всички последователности, част или цяло от клона, избран от групата, включваща клоновете FBd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO: 51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc (SEQ ID NO: 53), GM3 (SEQ ID NO: 56), FBdl3 (SEQ ID NO: 58), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), c изключение на всяка нуклеотидна последователност, идентична или лежаща вътре в последователността, определена от SEQ ID NO: 1;f) последователности, комплементарни на посочените геномни последователности;g) последователности, еквивалентни на посочените последователности от (а) до (е), в частност нуклеотидни последователности, проявяващи за всяка поредица от 100 последователни мономера, поне 50% и за предпочитане 70% хомоложност с посочените последователности от (а) до (е), като посоченият нуклеотиден фрагмент нито съдържа, нито се състои от последователността ERV- 9.Ж Нуклеотиден фрагмент, съдържащ нуклеотидна последователност, избрана от групата, включваща:а) всички геномни последователности, част или цяло от генаpol на MSRV-1 вируса, с изключение на цялата последователност на нуклеотид139 ния фрагмент, определен от SEQ ID NO: 1;b) всички частични геномни последователности от гена gag на MSRVI;c) всички геномни последователности , припокриващи генаpol гена и на гена env от MSRV-1 вируса, и припокриващи гена pol и гена gag;d) всички последователности, част или цяло от клона, избран от групата, включваща клоновете t pol (SEQ ID NO: 51), GM3 (SEQ ID NO: 56), LBW (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), c изключение на всяка нуклеотидна последователност, идентична на или лежаща в последователността, определена от SEQ ID NO: 1;e) последователности, комплементарни на посочените геномни последователности;f) последователности, еквивалентни на посочените последователности от (а) до (е), в частност нуклеотидни последователности, проявяващи за всяка поредица от 100 непрекъснати мономера, поне 50% и за предпочитане поне 70% хомоложност с посочените последователности (а) до (е), като посоченият нуклеотиден фрагмент нито съдържа, нито се състои от последователността ERV- 9.
- 15. фрагмент съгласно претенция 14, съдържащ нуклеотидна последователност, идентична на част или цялата геномна последователност на гена pol от MSRV-1 вируса, с изключение на общата последователност от нуклеотидния фрагмент, определен от SEQ ID NO: 1, или идентичен на всяка последователност, еквивалентна на посочената частична или цяла геномна последователност, в частност такава, която е хомоложна на последната.
- 16. Нуклеотиден фрагмент съгласно претенция 15, съдържаща нуклеотидна последователност, която е частично или напълно идентична на нуклеотидната последователност, избрана от групата, включваща:140- нуклеотидната последователност, избрана от последователностите SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 u SEQ ID NO: 89;- последователности, комплементарни на SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 или SEQ ID NO: 89;- последователности,еквивалентни, и в частност хомоложни на SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 89;- последователности, кодиращи част или цялата пептидна последователност, определена от SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 90;- последователности,кодиращи част или цялата пептидна еквивалентна последователност, и в частносгхомоложна на SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 90;които могат да бъдат разпознати от серума на пациенти, инфектирани с вируса MSRV-1, или в които вируса MSRV1 е реактивиран.
- 17. фрагмент съгласно претенция 13, включващ нуклеотидна последователност, идентична на част или цялата геномна последователност на гена env от вируса MSRV- 1, или идентична на всяка последователност, комплементарна на посочената нуклеотидна последователност, или идентична на всяка последователност, еквивалентна на посочената нуклеотидна последователност, в частност такава, която е хомоложна на последната.
- 18. Фрагмент съгласно претенция 13, включващ нуклеотидна последователност,идентична на част или цялата последователност на клона, избран от групата, съдържаща клоновете FBd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO: 51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc (SEQ ID NO: 53), GM3 (SEQ ID NO: 56), FBdl3 (SEQ ID NO: 58), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), c изключение на всяка последователност, идентична на или лежаща в последователността, определена от SEQ ID NO: 1.
- 19. фрагмент съгласно претенция 14, съдържащ нуклеотидна141 последователност, идентична на част или цялата последователност от клона, избран от групата, включваща клоновете FBd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO: 51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc (SEQ ID NO: 53), GM3 (SEQ ID NO: 56), FBdl3 (SEQ ID NO: 58), LBW (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), c изключение на нуклеотидната последовтаелност, идентична на или лежаща в последователността, определена от SEQ ID NO: 1.
- 20. Сонда нуклеинова киселина за установяване на патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с мултиплената склероза, характеризиращ се с това, че е способен на специфична хибридизация с всеки фрагмент съгласно която и да е от претенции от 13 до 19, принадлежащи или лежащи в генома на посочения патогенен агент.
- 21. Сонда нуклеинова киселина за установяване на патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с ревматоидния артрит, характеризиращ се с това, че е способен на специфична хибридизация с всеки фрагмент съгласно която и да е от претенции 14,15,16 и 19, принадлежащи или лежащи в генома на посочения патогенен агент.
- 22. Праймер за амплификация чрез полимеризиране на РНК или НДК от вирусен материал, характеризиращ се с това, че съдържа нуклеотидна последователност, идентична или еквивалентна на поне една част от нуклеотидната последователност на фрагмент съгласно която и да е от претенции от 13 до 19, в частност нуклеотидна последователност, проявяваща, за всяка поредица от 10 непрекъснати мономера, поне 70% хомоложност поне с посочената част от дадения фрагмент.
- 23. Праймер съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че неговата нуклеотидна последователност е идентична на всяка от последователностите, избрана от групата, включваща SEQ ID NO: 47 go SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55 u SEQ ID NO: 64 go SEQ ID NO: 86.142
- 24. РНК или ДНК, по- специално вектор на репликация, съдържащ геномен фрагмент от вирусния материал съгласно която и да е от претенции 1 до 12, или фрагмент съгласно която и да е от претенции от 13 до 19.
- 25. Пептид, кодиран от всяка отворена четяща рамка, принадлежаща на нуклеотиден фрагмент съгласно която и да е от претенции от 13 до 19, по- специално полипептид, например един олигопептид, формиращ или включващ антигенна детерминанта, разпознаваема от серума на пациенти, инфектирани с вируса MSRV- 1,и/ или в които вируса MSRV1 е бил реактивиран.
- 26. Антигенен полипептид съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че отворената четяща рамка, която го кодира, започва, в посока 5’ - 3’, при нуклеотид 181 и завършва при нуклеотид 330 от SEQ ID NO: 1.
- 27. Полипептид, в частност антигенен олигопептид, разпознаваем от серума на пациенти, инфектирани с вируса MSRV-1, и/ или в които вируса MSRV- 1 е реактивиран, характеризиращ се с това, че неговата пептидна последователност е частично или напълно идентична;или е еквивалентна на последователността, определена от SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 87.
- 28. Антигенен олигопептид съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че неговата пептидна последователност е идентична на последователността, избрана от групата, включваща последователностите SEQ ID NO: 41 go SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 63 u SEQ ID NO: 87.
- 29. Пептид, кодиран от всяка отворена четяща рамка, принадлежаща на нуклеотиден фрагмент съгласно която и да е от претенции 14, 15, 16 и 19, и по- специално полипептид. например олигопептид, формиращ или включващ антигенна детерминанта, разпознаваема от серума на пациенти, инфектрани с вируса MSRV-1, и/ или в които вируса MSRV-1143 е реактивиран.
- 30. Антигенен полипептид съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че кодиращата го отворена четяща рамка започва, в посока 5’3’, при нуклеотид 181 и завършва при нуклеотид 330 на SEQ ID NO: 1.
- 31. Полипептид, по- специално антигенен олигопептид, разпознаваем от серума на пациенти, инфектирани с вируса MSRV-1, и/ или в които вируса MSRV-1 е реактивиран, характеризиращ се с това, че неговата пептидна последователност е частично или напълно идентичнащли е еквивалентна на последователността, определена от SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 63.
- 32. Антигенен олигопептид съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че неговата пептидна последователност е идентична на последователност, избрана от групата, състояща се от последователностите SEQ ID NO: 41 go SEQ ID NO: 44 u SEQ ID NO: 63.
- 33. Моно- или поликлонално антитяло, насочено срещу вируса MSRV1, характеризиращо се с това ,че е получено чрез имунологична реакция на човешко или животинско тяло спрямо имуногенен агент, състоящ се от антигенен полипептид съгласно която и да е от претенции 25 до 28.
- 34. Моно- или поликлонално антитяло, насочено срещу вируса MSRV-1, характеризиращо се с това, че е получено чрез имунологична реакция на човешко или животинско тяло спрямо имуногенен агент, състоящ се от антигенен полипептид съгласно която и да е от претенции от 29 до 32.
- 35. Реагент за установяване на вируса MSRV-1 или на показване на този вирус, характеризиращ се с това, че съдържа като реактивно вещество пептид, по- специално антигенен пептид, съгласно която и да е от претенции от 25 до 32, или анти^лиганд, по- специално антитяло спрямо посочения пептид.
- 36. Диагностичен, профилактичен или терапевтичен състав, съдържащ пептид, по- специално антигенен пептид, съгласно която и да е от144 претенции 25 go 28, или анти^лиганд, по- специално антитяло спрямо посочения пептид, съгласно претенция 33.
- 37. Диагностичен, профилактичен или терапевтичен състав, съдържащ пептид, по- специално антигенен пептид, съгласно която и да е от претенции 29 до 32, или анти-^лиганд, по- специално антитяло срещу посочения пептид, съгласно претенция 34.
- 38. Активен имунотерапевтичен състав, по- специално ваксинален състав, съгласно претенция 36 или 37.
- 39. Активен имунотерапевтичен състав, по- специално за инхибиране експресията на поне един и/ или инфекциозен агент, свързан с мултиплената склероза, съдържащ нуклеотиден фрагмент съгласно която и да е от претенции от 13 до 19 или полинуклеотид, по- специално олигонуклеотид, чиято последователност е частично идентична на тази на посочения фрагмент, с изключение на фрагмента, притежаващ нуклеотидната последователност SEQ ID NO: 1.
- 40. Диагностичен, профилактичен или терапевтичен състав, по- специално за инхибиране експресията на поне един патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с ревматоидния артрит, съдържащ нуклеотиден фрагмент съгласно която и да е от претенции 14,15, 16 и 19, или полинуклеотид, по- специално олигонуклеотид, чиято последователност е частично идентична на тази на посочения фрагмент, с изключение на този от фрагментите с нуклеотидна последователност SEQ ID NO: 1.
- 41. Метод за установяване на патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с муртиплената склероза, в биологична проба, характеризиращ се с това, че РНК и/ или ДНК , за които се предполагаме принадлежат или произхождат от дадения патогенен и/ или инфекциозен агент, или техни комплементарни РНК и/ или ДНК, е/са доведени в контакт със състав, съдържащ нуклеотиден фрагмент съгласно която и да е от претенции 13 до 19 или полинуклеотид, по- специално олигонуклеотид,145 чиято последователност е частично идентична на тази на дадения фрагмент, с изключение на този от фрагментите с нуклеотидна последователност SEQ ID NO: 1.
- 42. Метод за установяване на патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с ревматоидния артрит, в биологична проба, характеризиращ се с това, че РНК и/ или ДНК, за които се предполагаме принадлежат или произхождат от дадения патогенен и/ или инфекциозен агент, или техни комплементарни РНК и/ или ДНК, е/ са доведени до контакт със състав, съдържащ нуклеотиден фрагмент съгласно която и да е от претенции 14, 15, 16 и 19 или полинуклеотид, по- специално олигонуклеотид, чиято последоватленост е частично идентична на дадения фрагмент, с изключение на този от фрагментите с нуклеотидна последователност SEQ ID NO: 1.
- 43. Метод за установяване присъствието или излагане на патогенен и/ или инфекциозен агент, свързан с мултиплената склероза в биологична проба, характеризиращ се с това, че дадената проба се довежда до контакт с пептид, по- специално антигенен пептид, съгласно която и да е от претенции 25 до 28, или антихлиганд, по- специално антитяло срещу дадения пептид, съгласно претенция 33.
- 44. . Метод за установяване присъствието или показването на патоге нен и/ или инфекциозен агент;свързан с ревматоиден артрит, в биологична проба, характеризиращ се с това, че дадената проба се довежда до контакт с пептид, съгласно която и да е от претенции 29 до 32, или ангшклиганд, по- специално антитяло съгласно претенция 34.
- 45. Средство за установяване на вируса MSRV-1, съдържащо реагент съгласно претенция 35, снабдено с твърд носител, който е имунологич но конкурентен с дадения реагент, характеризиращ се с това, че съдържа средство за довеждане на биологична проба, като кръвна проба или цереброспинална течност, които по всяка вероятносгфъдържат антиMSRV- 1 антитела, до контакт с посочения реагент при условия, поз146Воляващи протичането на имунологична реакция, и средство за откриване на имунния комплекс, формиран с посочения реагент.
- 46. Метод за установяване на анти- MSRV-1 антитела в биологична проба, като кръвна проба или цереброспинална течност, характеризиращ се с това, че дадената проба и реагентът съгласно претенция 35, състоящ се от антитяло, се довеждат до контакт при условия, позволяващи протичането на имунологична реакция, след което формираният имунен комплекс с посочения реагент се регистрира.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9509643A FR2737500B1 (fr) | 1995-08-03 | 1995-08-03 | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| PCT/FR1996/001244 WO1997006260A1 (fr) | 1995-08-03 | 1996-08-02 | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG101355A BG101355A (bg) | 1997-12-30 |
| BG62977B1 true BG62977B1 (bg) | 2000-12-29 |
Family
ID=9481811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG101355A BG62977B1 (bg) | 1995-08-03 | 1997-03-25 | Вирусен материал и нуклеотидни фрагменти, свързани с диагностика, профилактика и лечение на мултиплената склероза |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6001987A (bg) |
| EP (2) | EP1916304B1 (bg) |
| JP (2) | JP4444372B2 (bg) |
| AT (2) | ATE541933T1 (bg) |
| AU (1) | AU730080B2 (bg) |
| BG (1) | BG62977B1 (bg) |
| BR (1) | BR9606566A (bg) |
| CA (1) | CA2201282C (bg) |
| CZ (1) | CZ135797A3 (bg) |
| DE (1) | DE69637264T2 (bg) |
| ES (2) | ES2293645T3 (bg) |
| FR (1) | FR2737500B1 (bg) |
| HU (1) | HUP9900425A3 (bg) |
| IS (1) | IS4455A (bg) |
| NO (1) | NO971493L (bg) |
| NZ (1) | NZ316080A (bg) |
| PL (1) | PL319512A1 (bg) |
| SK (1) | SK56797A3 (bg) |
| WO (1) | WO1997006260A1 (bg) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2737500B1 (fr) * | 1995-08-03 | 1997-08-29 | Bio Merieux | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| US7241876B2 (en) | 1996-01-11 | 2007-07-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer |
| EP0938320B2 (en) * | 1996-03-26 | 2014-06-18 | Michael S. Kopreski | Method enabling use of extracellular rna extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| US7785842B2 (en) * | 1996-03-26 | 2010-08-31 | Oncomedx, Inc. | Comparative analysis of extracellular RNA species |
| US6759217B2 (en) * | 1996-03-26 | 2004-07-06 | Oncomedx, Inc. | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| US8043835B1 (en) | 1996-03-26 | 2011-10-25 | Oncomedx, Inc. | Methods for detecting and monitoring cancer using extracellular RNA |
| JP4044142B2 (ja) * | 1996-10-04 | 2008-02-06 | ビー． アーノビッツ，ハワード | 核酸の診断検出 |
| ES2331496T3 (es) * | 1996-11-26 | 2010-01-05 | Bio Merieux | Material viral y fragmentos de nucleotidos asociados a la esclerosis multiple, para fines diagnosticos, profilacticos y terapeuticos. |
| US20070009934A1 (en) * | 1997-03-14 | 2007-01-11 | Kopreski Michael S | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| US8440396B2 (en) * | 1997-03-14 | 2013-05-14 | Oncomedx, Inc. | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| FR2762600B1 (fr) * | 1997-04-29 | 1999-11-05 | Bio Merieux | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations |
| FR2762601B3 (fr) * | 1997-04-29 | 1999-06-04 | Bio Merieux | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations |
| FR2765588A1 (fr) * | 1997-07-07 | 1999-01-08 | Bio Merieux | Materiel nucleique retroviral et fragments nucleotidiques notamment associes a la sclerose en plaques et/ou la polyarthrite rhumatoide, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| EP1000158B1 (fr) * | 1997-07-07 | 2006-11-22 | Bio Merieux | Sequences retroviraux endogenes, associees a des maladies auto-immunes et/ou a des perturbations de la grossesse |
| US20040176314A1 (en) * | 1997-07-07 | 2004-09-09 | Bio Merieux | Endogenetic retroviral sequences, associated with autoimmune diseases or with pregnancy disorders |
| WO1999053103A1 (en) * | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Ms Research A/S | Diagnosis of multiple sclerosis and other demyelinating diseases |
| FR2780069B1 (fr) * | 1998-06-23 | 2002-06-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Famille de sequences nucleiques et de sequences proteiques deduites presentant des motifs retroviraux endogenes humains et leurs applications |
| US20080261292A1 (en) * | 1998-09-22 | 2008-10-23 | Oncomedx, Inc. | Method Enabling the Use of Extracellular Ribonucleic Acid (RNA) Extracted from Plasma or Serum to Detect, Monitor or Evaluate Cancer or Premalignant Conditions |
| US8163524B2 (en) * | 1998-09-22 | 2012-04-24 | Oncomedx, Inc. | Comparative analysis of extracellular RNA species |
| US20060204989A1 (en) * | 1998-09-22 | 2006-09-14 | Kopreski Michael S | Comparative analysis of extracellular RNA species |
| FR2788784A1 (fr) * | 1999-01-21 | 2000-07-28 | Bio Merieux | Fragment nucleique endogene associe a une maladie auto-immune, procede de marquage et reactif |
| EP1029917A1 (en) | 1999-02-15 | 2000-08-23 | Bio Merieux | The LTR region of MSRV-1 and the proteins it encodes, and probes and methods for detecting MSRV-1 retrovirus |
| AU6785700A (en) * | 1999-08-20 | 2001-03-19 | Biogen, Inc. | Novel polynucleotides expressed in activated t-lymphocytes and proteins encoded thereby |
| DE10012875B4 (de) * | 2000-03-16 | 2004-04-01 | Infineon Technologies Ag | Mobilfunkempfänger |
| EP1265989A2 (en) * | 2000-03-21 | 2002-12-18 | MS Research A/S | An infective endogenous retrovirus in association with demyelinating diseases e.g. multiple sclerosis |
| DE60239470D1 (de) * | 2001-07-25 | 2011-04-28 | Oncomedx Inc | Verfahren zur bewertung pathologischer krankheitszustände unter verwendung extrazellulärer rna |
| US20030104454A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-06-05 | Kopreski Michael S. | Method for detection of DNA methyltransferase RNA in plasma and serum |
| US20100159464A1 (en) * | 2001-11-05 | 2010-06-24 | Oncomedx, Inc. | Method for Detection of DNA Methyltransferase RNA in Plasma and Serum |
| US20090136942A1 (en) * | 2007-09-18 | 2009-05-28 | Oncomedx, Inc. | Analysis of Extracellular RNA |
| US8680065B2 (en) * | 2008-09-11 | 2014-03-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Oligonucleotides of human endogenous retrovirus 9 (ERV-9) long terminal repeat (LTR) and methods of use |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5871996A (en) * | 1994-02-04 | 1999-02-16 | Bio Merieux | Retrovirus agents MSRV1 and MSRV2 associated with multiple sclerosis |
| US4346074A (en) * | 1978-08-24 | 1982-08-24 | National Research Development Corp. | Pasteurellosis vaccines |
| US4311686A (en) * | 1979-04-30 | 1982-01-19 | The Immunology Development Corporation | Methodology for the immunodiagnosis of multiple sclerosis and/or malignant diseases from blood sample analysis |
| US4396600A (en) * | 1980-12-18 | 1983-08-02 | Gus Gallucci | Adult schistosome worm-derived antigenic substance and method of obtaining same |
| US4388298A (en) * | 1982-07-14 | 1983-06-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Propagation of hemorrhagic enteritis virus in a turkey cell line and vaccine produced |
| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
| US4520113A (en) * | 1984-04-23 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
| US4647773A (en) * | 1984-04-23 | 1987-03-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of continuous production of retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS |
| NZ218050A (en) * | 1985-11-13 | 1989-05-29 | Wistar Inst | Test for the presence of htlv-1v |
| US4900553A (en) * | 1987-09-11 | 1990-02-13 | Case Western Reserve University | Method of reducing glial scar formation and promoting axon and blood vessel growth and/or regeneration through the use of activated immature astrocytes |
| EP0326395A2 (en) * | 1988-01-29 | 1989-08-02 | City Of Hope | Method of detecting and identifying certain viral sequences |
| FR2651581B1 (fr) * | 1989-09-06 | 1994-05-13 | Centre Nal Recherc Scientifique | Moyens pour le diagnostic de neuropathies demyelinisantes, en particulier de la sclerose en plaques. |
| US5219837A (en) * | 1990-06-21 | 1993-06-15 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of stimulating myelination of cells |
| US5158976A (en) * | 1990-10-29 | 1992-10-27 | The Children's Medical Center Corporation | Controlling glutamine/glutamate related neuronal injury |
| KR100242671B1 (ko) * | 1991-03-07 | 2000-03-02 | 고돈 에릭 | 유전학적으로 처리한 백신 균주 |
| DK173091D0 (da) * | 1991-10-11 | 1991-10-11 | Schleroseforeningen The Danish | Biologisk materiale |
| FR2689520B1 (fr) * | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede et milieu de culture pour l'obtention de cellules infectees par un virus associe a la sclerose en plaques. |
| FR2689521B1 (fr) * | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede d'obtention et maintien d'une culture cellulaire viable, infectee par un virus associe a la sclerose en plaques, et produits biologiques derives de ladite culture. |
| EP0642585B1 (en) * | 1992-05-18 | 2005-12-28 | Genentech, Inc. | Activation of oligomerizing receptors by using fused receptor ligands |
| GB9310657D0 (en) * | 1993-05-24 | 1993-07-07 | Univ London | Retrovirus |
| US5580766A (en) * | 1994-01-14 | 1996-12-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells |
| US5691147A (en) * | 1994-06-02 | 1997-11-25 | Mitotix, Inc. | CDK4 binding assay |
| US5710037A (en) * | 1994-06-10 | 1998-01-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Retroviral vector particles |
| FR2731356B1 (fr) * | 1995-03-09 | 1997-04-30 | Bio Merieux | Virus msrv-1 et agent pathogene et/ou infectant msrv-2 associes a la polyarthrite rhumatoide |
| FR2737500B1 (fr) * | 1995-08-03 | 1997-08-29 | Bio Merieux | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
-
1995
- 1995-08-03 FR FR9509643A patent/FR2737500B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-08-02 AT AT07018564T patent/ATE541933T1/de active
- 1996-08-02 BR BR9606566A patent/BR9606566A/pt unknown
- 1996-08-02 US US08/691,563 patent/US6001987A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 ES ES96420265T patent/ES2293645T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 JP JP50817997A patent/JP4444372B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 PL PL96319512A patent/PL319512A1/xx unknown
- 1996-08-02 CA CA2201282A patent/CA2201282C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 AT AT96420265T patent/ATE374252T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-02 CZ CZ971357A patent/CZ135797A3/cs unknown
- 1996-08-02 HU HU9900425A patent/HUP9900425A3/hu unknown
- 1996-08-02 EP EP07018564A patent/EP1916304B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 EP EP96420265A patent/EP0789077B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 ES ES07018564T patent/ES2379011T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 AU AU68232/96A patent/AU730080B2/en not_active Ceased
- 1996-08-02 DE DE69637264T patent/DE69637264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 WO PCT/FR1996/001244 patent/WO1997006260A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-08-02 SK SK567-97A patent/SK56797A3/sk unknown
-
1997
- 1997-03-25 BG BG101355A patent/BG62977B1/bg unknown
- 1997-03-26 IS IS4455A patent/IS4455A/is unknown
- 1997-03-27 NZ NZ316080A patent/NZ316080A/en unknown
- 1997-04-02 NO NO971493A patent/NO971493L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-08-16 US US09/374,766 patent/US6579526B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-05-07 US US10/430,442 patent/US20030186391A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-08-08 US US11/463,109 patent/US7932350B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-11-20 JP JP2009265658A patent/JP5143814B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG62977B1 (bg) | Вирусен материал и нуклеотидни фрагменти, свързани с диагностика, профилактика и лечение на мултиплената склероза | |
| US7674888B2 (en) | Viral material and nucleotide fragments associated with multiple sclerosis, for diagnostic, prophylactic and therapeutic purposes | |
| Haseltine et al. | Structure of 3′ terminal region of type II human T lymphotropic virus: evidence for new coding region | |
| JP3428012B2 (ja) | Ｈｉｖ―１、ｈｉｖ―２及びｓｉｖタイプのレトロウイルスのゲノムからのヌクレオチド配列、並びに、特に、これらのレトロウイルスのゲノムの増幅のため及びこれらのウイルスによる感染の「生体外」診断のためのこれらの配列の応用 | |
| AU625174B2 (en) | Hiv-2 virus variants | |
| JP3611856B2 (ja) | 多発性硬化症に関与するｍｓｒｖ１ウイルスおよびｍｓｒｖ２病因性及び／又は感染性の作因、核酸成分およびその応用 | |
| JP2569185B2 (ja) | 抗ｈｉｖ応答を喚起する合成抗原 | |
| CA2169603C (en) | Retrovirus from the hiv group and its use | |
| US6548635B1 (en) | Retrovirus from the HIV type O and its use (MVP-2901/94) | |
| JP2002515725A (ja) | カポジ肉腫および腹膜後繊維腫症に関連するガンマヘルペスウイルスのｄｎａポリメラーゼ | |
| JP4272264B2 (ja) | 診断予防及び治療的使用のための、特に多発性硬化症及び／又は慢性関節リウマチに関連した、レトロウイルス核材料及びヌクレオチドフラグメント |