ES2379011T3 - Polipéptidos antigénicos asociados a la esclerosis en placas y utilizaciones - Google Patents
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Abstract
Polipéptido antigénico reconocido por sueros de pacientes infectados por un retrovirus cuyo genoma comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre SEC ID nº 1 y SEC ID nº 89, y/o en los cuales se ha reactivado dicho retrovirus, cuya secuencia peptídica consiste en una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 39, SEC ID nº 41 a SEC ID nº 44 y SEC ID nº 63.
Description
Polipéptidos antigénicos asociados a la esclerosis en placas y utilizaciones.
La esclerosis en placas (SEP) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) cuya causa completa permanece todavÃa desconocida.
Numerosos estudios han apoyado la hipótesis sobre una etiologÃa vÃrica de la enfermedad, pero ninguno de los virus conocidos estudiados se ha revelado como el agente causal buscado: se ha realizado un informe de los virus buscados desde hace años en la SEP por E. Norrby (1) y R. T Jonson (2).
Recientemente, un retrovirus, diferente de los retrovirus humanos conocidos, ha sido aislado en pacientes afectados por la SEP (3, 4 y 5). Los autores han podido asà demostrar que este retrovirus podÃa transmitirse in vitro, que pacientes afectados por la SEP producÃan anticuerpos susceptibles de reconocer proteÃnas asociadas a la infección de las células leptomenÃngeas por este retrovirus, y que la expresión de éste podÃa estar considerablemente estimulada por los genes inmediatos-precoces de ciertos herpesvirus (6).
Todos estos resultados apuntan hacia la implicación de al menos un retrovirus desconocido en la SEP o de un virus que tiene una actividad transcriptasa inversa detectable según el método publicado por H. Perron (3) y calificada de actividad "RT de tipo LM7".
Recientemente, los estudios del solicitante han permitido la obtención de dos lÃneas continuas de células infectadas por aislados naturales que proceden de pacientes diferentes afectados por la SEP, mediante un procedimiento de cultivo tal como se describe en el documento WO-A-93 20188. Estas dos lÃneas derivadas de células de plexos coroideos humanos, denominadas LM7PC y PLI-2 han sido depositadas respectivamente en la E.C.A.C.C el 22 de julio de 1992 y el 8 de enero de 1993, con los números 92 072201 y 93 010817, según las disposiciones del Tratado de Budapest. Por otra parte, los aislados vÃricos que poseen una actividad RT de tipo LM7 han sido también depositados en la E.C.A.C.C. con la denominación global de "cepas". La "cepa" o aislado alojado por la lÃnea PLI-2, denominada POL-2, ha sido depositada en la E.C.A.C.C el 22 de julio de 1992 con el nº V92072202. La "cepa" o aislado alojado por la lÃnea LM7PC, denominada MS7PG, ha sido depositada en la E.C.A.C.C. el 8 de enero de 1993 con el nº V93010816.
A partir de los cultivos y de los aislados citados anteriormente, caracterizados por criterios biológicos y morfológicos, se ha involucrado en la caracterización del material nucleico asociado a las partÃculas virales producidas en estos cultivos.
Las porciones de genoma ya caracterizadas han sido utilizadas para elaborar ensayos de detección molecular del genoma vÃrico, y ensayos inmunoserológicos, utilizando las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos del genoma vÃrico, para detectar la respuesta inmunitaria dirigida contra epÃtopos asociados a la infección y/o a la expresión vÃrica.
Estas herramientas han permitido confirmar ya una asociación entre la SEP y la expresión de las secuencias identificadas en las patentes citadas a continuación. Sin embargo, el sistema vÃrico descubierto por el solicitante, es similar a un sistema retrovÃrico complejo. En efecto, las secuencias encontradas encapsidadas en las partÃculas vÃricas extracelulares producidas por los diferentes cultivos de células de pacientes afectados por la SEP, muestran claramente que existe una co-encapsidación de genomas retrovÃricos similares, pero diferentes del genoma retrovÃrico "salvaje" que produce las partÃculas vÃricas infecciosos. Este fenómeno se ha observado entre retrovirus replicativos y retrovirus endógenos que pertenecen a la misma familia, incluso heterólogos. La noción de retrovirus endógeno es muy importante en el contexto del descubrimiento del solicitante porque, en el caso de MSRV-1, se ha observado que existen en el ADN humano normal unas secuencias retrovÃricas endógenas que contienen secuencias homólogas al genoma MSRV-1. La existencia de elementos retrovÃricos endógenos (ERV) similares a MSRV-1 en parte o en la totalidad de su genoma, explica el hecho de que la expresión del retrovirus MSRV-1 en las células humanas pueda interactuar con secuencias endógenas cercanas. Estas interacciones se vuelven a encontrar en el caso de retrovirus endógenos patógenos y/o infecciosos (por ejemplo algunas cepas ecotrópicas del virus de la leucemia murina), en el caso de retrovirus exógenos cuya secuencia nucleotÃdica puede encontrarse parcialmente o en su totalidad, en la forma de ERV, en el genoma del animal hospedante (por ejemplo virus exógeno del tumor mamario del ratón transmitido por la leche). Estas interacciones consisten principalmente en (i) una transactivación o co-activación de ERV por el retrovirus replicativo, (ii) una encapsidación "ilegÃtima" de ARN similares de ERV, o ERVS (incluso de ARN celulares) que posean simplemente secuencias de encapsidación compatibles, en las partÃculas retrovÃricas producidas por la expresión de la cepa replicativa, a veces transmisibles y a veces con una patogenicidad propia, y (iii) recombinaciones más o menos importantes entre los genomas co-encapsidados, en particular en las fases de transcripción inversa, que llevan a la formación de genomas hÃbridos, a veces transmisibles y a veces con una patogenicidad propia.
De esta manera, (i) se han encontrado diferentes secuencias relacionadas con MSRV-1 en las partÃculas vÃricas purificadas; (ii) el análisis molecular de diferentes regiones del genoma retrovÃrico MSRV-1 se debe realizar analizando sistemáticamente las secuencias co-encapsidadas, interferentes y/o recombinadas generadas por la infección y/o la expresión de MSRV-1, además, ciertos clones pueden tener partes de secuencias defectivas producidas por la replicación retrovÃrica y los errores de matriz y/o de transcripción de la transcriptasa inversa; (iii) las familias de secuencias relacionadas con una misma región geonómica retrovÃrica son los soportes de una detección diagnóstica global que se puede optimizar mediante la identificación de regiones invariables entre los clones expresados y mediante la identificación de tramas de lecturas responsables de la producción de polipéptidos antigénicos y/o patógenos que se pueden producir únicamente mediante una parte, incluso por uno solo, de los clones expresados y, en estas condiciones, el análisis sistemático de los clones expresados en una región de un genoma dado permite evaluar la frecuencia de variación y/o de recombinación del genoma MSRV-1 en esta región y definir las secuencias óptimas para las aplicaciones, en particular diagnósticas; (iv) la patologÃa provocada por un retrovirus como el MSRV-1 puede ser un efecto directo de su expresión y de las proteÃnas o de los péptidos producidos por este hecho, pero también un efecto de la activación, de la encapsidación, de la recombinación de los genomas relacionados o heterólogos, y de las proteÃnas o de los péptidos producidos por estos hechos; de esta manera estos genomas asociados a la expresión y/o la infección por MSRV-1 son una parte integrante de la patogenicidad potencial de este virus y, por lo tanto, constituyen soportes de detección diagnóstica y dianas terapéuticas concretas. De la misma manera, cualquier agente que esté asociado a un cofactor o sea un cofactor de estas interacciones responsables de la patogenia en cuestión, tal como MSRV-2 o el factor gliotóxico descritos en la solicitud de patente publicada con el nº FR-2 716 198, puede participar en la elaboración de una estrategia global y muy eficaz de diagnóstico, de pronóstico, de seguimiento terapéutico y/o de terapéutica integrada de la SEP en particular, pero también de cualquier otra enfermedad asociada a los mismos agentes.
En este contexto, se ha descubierto paralelamente en otra enfermedad autoinmune, la poliartritis reumatoide (PR), que se describió en la solicitud de patente francesa depositada con el nº 95 02960. Este descubrimiento demuestra que, aplicando enfoques metodológicos similares a los que fueron utilizados en los estudios del solicitante sobre la SEP, se ha podido identificar un retrovirus expresado en la PR que comparte las secuencias descritas para MSRV-1 en la SEP, y también la coexistencia de una secuencia asociada a MSRV-2 también descrita en la SEP. En lo que se refiere a MSRV-1, las secuencias detectadas de manera común a la SEP y la PR, se refieren a los genes pol y gag. En el estado actual de los conocimientos, se pueden asociar las secuencias gag y pol descritas a las cepas MSRV-1 expresadas en estas dos enfermedades.
La presente solicitud de patente tiene por objeto diferentes resultados, que se suman a los que ya están protegidos por las solicitudes de patente francesas:
- -
- nº 92 04322 del 03.04.1992, publicada con el nº 2 689 519; -nº 92 13447 del 03.11.1992, publicada con el nº 2 689 521; -nº 92 13443 del 03.11.1992, publicada con el nº 2 689 520; -nº 94 01529 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 936; -nº 94 01531 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 939; -nº 94 01530 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 936; -nº 94 01532 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 937; -nº 94 14322 del 24.11.1994, publicada con el nº 2 727 428; y -nº 94 15810 del 23.12.1994, publicada con el nº 2 728 585;
La presente invención es una solicitud divisionaria de la solicitud EP 96420265.9 (EP 789 077) en la que el solicitante ha determinado un material vÃrico, en estado aislado o purificado, que puede ser aprehendido o estar caracterizado de diferentes maneras:
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- su genoma comprende una secuencia nucleotÃdica seleccionada de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 46, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, SEC ID nº 61, SEC ID nº 89, presentando sus secuencias complementarias, y sus secuencias equivalentes, en particular las secuencias nucleotÃdicas, para cualquier serie de 100 monómeros contiguos, por lo menos 50% y preferentemente por lo menos 70% de homologÃa con respectivamente dichas secuencias SEC ID nº 46, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, SEC ID nº 61, SEC ID nº 89, y sus secuencias complementarias;
- -
- la región de su genoma que comprende los genes env, pol y una parte de gen gag, excepto la sub-región que tiene una secuencia idéntica o equivalente a la SEC ID nº 1, codifica para cualquier polipéptido que presenta, para cualquier serie contigua de por lo menos 30 aminoácidos, por lo menos 50%, y preferentemente por lo menos 70% de homologÃa con una secuencia peptÃdica codificada por cualquier secuencia nucleotÃdica seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 46, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, SEC ID nº 61, SEC ID nº 89, y sus secuencias complementarias;
- -
- el gen pol comprende una secuencia nucleotÃdica idéntica o equivalente, parcial o totalmente, a la SEC ID nº 57, excepto la SEC ID nº 1;
- -
- el gen gag comprende una secuencia nucleotÃdica idéntica o equivalente, parcial o totalmente, a la SEC ID nº 88.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el material vÃrico tal como se ha definido anteriormente está asociado a la SEP. Y tal como se ha definido haciendo referencia al gen pol o gag de MSRV-1, y más particularmente a las secuencias SEC ID nº 51, 56, 57, 59, 60, 61, 88 y 89, este material está asociado a la PR.
El solicitante ha definido asimismo diferentes fragmentos nucleotÃdicos, que comprenden cada uno, una secuencia nucleotÃdica seleccionada de entre el grupo constituido por:
- (a)
- todas las secuencias genómicas, parciales y totales, del gen pol del virus MSRV-1, excepto la secuencia total del fragmento nucleotÃdico definido por SEC ID nº 1;
- (b)
- todas las secuencias genómicas, parciales y totales, del gen env de MSRV-1;
- (c)
- todas las secuencias genómicas parciales del gen gag de MSRV-1;
- (d)
- todas las secuencias genómias que solapan el gen pol y el gen env del virus MSRV-1, y que solapan el gen pol y el gen gag;
- (e)
- todas las secuencias, parciales y totales, de un clon seleccionado de entre el grupo constituido por los clones FBd3 (SEC ID nº 46), t pol (SEC ID nº 51), JLBc1 (SEC ID nº 52), JLBc2 (SEC ID nº 53), GM3 (SEC ID nº 56),
FBd13 (SEC ID nº 58), LB19 (SEC ID nº 59), LTRGAG12 (SEC ID nº 60), FP6 (SEC ID nº 61), G+E+A (SEC ID
nº 89), excepto cualquier secuencia nucleotÃdica idéntica a, o comprendida en, la secuencia definida por SEC ID
nº 1;
- (f)
- las secuencias complementarias a dichas secuencias genómicas;
- (g)
- las secuencias equivalentes a dichas secuencias (a) a (e), en particular las secuencias nucleotÃdicas que presentan, para cada serie de 100 monómeros contiguos, por lo menos 50% y preferentemente por lo menos 70% de homologÃa con dichas secuencias (a) a (d),
con la condición de que este fragmento nucleotÃdico no comprenda o no consista en la secuencia ERV-9 tal como se describe en LA MANTIA et al (18).
Mediante secuencias genómicas, parciales o totales, se incluyen todas las secuencias asociadas mediante coencapsidación o mediante coexpresión, o recombinadas.
Preferentemente, dicho fragmento comprende:
- -
- o una secuencia nucleotÃdica idéntica a una secuencia genómica parcial o total del gen pol del virus MSRV-1, excepto a la secuencia total del fragmento nucleotÃdico definido por SEC ID nº 1, o idéntica a cualquier secuencia equivalente a dicha secuencia genómica parcial o total, en particular homóloga a esta última;
- -
- o una secuencia nucleotÃdica idéntica a una secuencia genómica parcial o total del gen env del virus MSRV-1, o idéntica a cualquier secuencia complementaria de dicha secuencia nucleotÃdica, o idéntica a cualquier secuencia equivalente a dicha secuencia nucleotÃdica, en particular homóloga a esta última.
Según el documento H. Perron et al., Research in Virology, vol. 143 N°5 (1992) p337-350, los autores han analizado
el perfil antigénico del retrovirus LM7 aislado de células leptomenÃngeas de un paciente afectado de SEP. Mediante
técnicas de transferencia Western y de inmunoprecipitación, han puesto en evidencia la existencia de antÃgenos
vÃricos que han caracterizado por su peso molecular.
Se describen diferentes péptidos codificados por cualquier marco abierto de lectura cuya secuencia nucleotÃdica
pertenece al gen pol del virus MSRV-1 tal como el definido anteriormente, y en particular cualquier polipéptido
antigénico reconocido por sueros de pacientes infectados por el virus MSRV-1, y/o en los cuales se ha reactivado el
virus MSRV-1.
A tÃtulo de ejemplo, dicho polipéptido está codificado por cualquier marco abierto de lectura cuya secuencia nucleotÃdica pertenece a la SEC ID nº 1, SEC ID nº 89 o a su secuencia complementaria. AsÃ, está codificado ventajosamente por el marco abierto de lectura que empieza en el sentido 5’-3’, en el nucleótido 181, y que termina en el nucleótido 330 de la SEC ID nº 1 o el marco abierto de lectura que empieza en el sentido 5'-3', en el nucleótido 529, y que termina en el nucleótido 606 de la SEC ID nº 1 o también el marco abierto de lectura que empieza en el sentido 5'-3', en el nucleótido 1118, y que termina en el nucleótido 1267 de SEC ID nº 89, o también el marco abierto de lectura que empieza en el sentido 5'-3', en el nucleótido 1464, y que termina en el nucleótido 1541 de SEC ID nº
89.
La presente invención tiene por objeto un polipéptido antigénico, reconocido por los sueros de pacientes infectados por el virus MSRV-1, y/o en los que se ha reactivado el virus MSRV-1, cuya secuencia peptÃdica consiste en una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 39, SEC ID nº 41 a SEC ID nº 44, SEC ID nº 63.
Un polipéptido preferido asimismo posee una secuencia peptÃdica que consiste en una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 39 y SEC ID nº 63.
La invención se refiere asimismo a una secuencia nucleotÃdica que codifica para un polipéptido tal como el definido anteriormente, seleccionada de entre SEC ID nº 40, SEC ID nº 62, sus fragmentos y sus secuencias
complementarias de éstos.
La presente invención propone asimismo anticuerpos mono-o policlonales, dirigidos contra el virus MSRV-1, obtenidos mediante reacción inmunológica de un organismo humano o animal, con un agente inmunógeno constituido por un polipéptido antigénico tal como el definido anteriormente.
La invención se refiere asimismo:
- -
- a los agentes reactivos de detección del virus MSRV-1, o de una exposición a este último, que comprenden a
tÃtulo de sustancia reactiva, un polipéptido, en particular antigénico, tal como se ha definido anteriormente, o un
anticuerpo de dicho polipéptido;
- -
- a cualquier composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, que comprende uno o varios polipéptidos, tales como se han definido anteriormente, o uno o varios anticuerpos de los polipéptidos considerados anteriormente; preferentemente, dicha composición es, a tÃtulo de ejemplo, una composición inmunoterapéutica activa, en particular una composición vacunal.
La invención se refiere asimismo a cualquier composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, en particular para inhibir la expresión de al menos un agente patógeno y/o infeccioso asociado a la SEP, que comprende una secuencia nucleotÃdica tal como la definida anteriormente. De la misma manera, se refiere a cualquier composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, en particular para inhibir la expresión de al menos un agente patógeno y/o infeccioso asociado a la PR, que comprende un fragmento nucleotÃdico tal como se ha definido anteriormente con respecto a los genes pol, y en particular con respecto a las secuencias SEC ID nº 40, 62 y 89.
Estos mismos fragmentos, o polinucleótidos, en particular oligonucleótidos, pueden entrar en cualquier composición apropiada, para detectar, según cualquier procedimiento o método conveniente, un agente patológico y/o infeccioso, asociado respectivamente a la SEP y a la PR, en una muestra biológica. En dicho procedimiento, se pone en contacto un ARN y/o un ADN que pertenecen o proceden supuestamente de dicho agente patológico y/o infeccioso, y/o su ARN y/o ADN complementario, con dicha composición.
La presente invención se refiere asimismo a cualquier procedimiento para detectar la presencia de dicho agente o la exposición a dicho agente patológico y/o infeccioso, en una muestra biológica, poniendo en contacto esta muestra con un polipéptido, tal como se ha definido anteriormente, o anticuerpo de este polipéptido, tal como se ha definido anteriormente.
En la práctica, y por ejemplo, un dispositivo de detección del virus MSRV-1 comprende un agente reactivo tal como se ha definido anteriormente, soportado por un soporte sólido, inmunológicamente compatible con el agente reactivo, y un medio de puesta en contacto de la muestra biológica, por ejemplo una muestra de sangre o de lÃquido cefalorraquÃdeo, susceptible de contener anticuerpos anti-MSRV-1, con este agente reactivo, en condiciones que permiten una eventual reacción inmunológica, con medios de detección del complejo inmune formado con este agente reactivo.
La invención se refiere asimismo a la detección de anticuerpos anti-MSRV-1, en una muestra biológica, por ejemplo una muestra de sangre o de lÃquido cefalorraquÃdeo, según la cual se pone en contacto esta muestra con un agente reactivo tal como se ha definido anteriormente, que consiste en un anticuerpo, en condiciones que permiten su eventual reacción inmunológica y, después, se detecta la presencia del complejo inmune asà formado con el agente reactivo.
Antes de describir con mayor detalle la invención, se definirán a continuación diferentes términos utilizados en la descripción y en las reivindicaciones.
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- por cepa o aislado, se entiende cualquier fracción biológica infecciosa y/o patógena, que contiene por ejemplo virus y/o bacterias y/o parásitos, que genera un poder patógeno y/o antigénico, acogida por un cultivo o un hospedante vivo; a tÃtulo de ejemplo, una cepa vÃrica según la definición anterior puede contener un agente coinfeccioso, por ejemplo un protista patógeno,
- -
- el término "MSRV" utilizado en la presente descripción se refiere a cualquier agente patógeno y/o infeccioso, asociado a la SEP, en particular una especie vÃrica, las cepas atenuadas de dicha especie vÃrica, o las partÃculas defectivas interferentes o que contienen genomas coencapsidados o también genomas recombinados con una parte del genoma MSRV-1, derivadas de esta especie. Se sabe que los virus y particularmente los virus que contienen ARN tienen una variabilidad consecutiva en particular a Ãndices relativamente elevados de mutación espontánea (7), la cual se tendrá en cuenta más adelante para definir la noción de equivalencia,
- -
- mediante la expresión "virus humano", se entiende un virus susceptible de infectar o de ser acogido por el ser humano,
- -
- teniendo en cuenta todas las variaciones y/o las recombinaciones naturales o inducidas, que se pueden encontrar en la práctica de la presente invención, los objetos de esta última, definidos anteriormente y en las reivindicaciones, se han expresado comprendiendo los equivalentes o derivados de los diferentes materiales biológicos definidos a continuación, en particular de las secuencias homólogas nucleotÃdicas o peptÃdicas,
- -
- la variante de un virus o de un agente patógeno y/o infeccioso, según la invención, comprende al menos un antÃgeno reconocido por al menos un anticuerpo dirigido contra al menos un antÃgeno correspondiente de dicho virus y/o de dicho agente patógeno y/o infeccioso, y/o un genoma del que se detecta cualquier parte mediante al menos una sonda de hibridación, y/o al menos un cebador de amplificación nucleotÃdico especÃfico de dicho virus y/o agente patógeno y/o infeccioso, como por ejemplo para el virus denominado MSRV-1, las que tienen una secuencia nucleotÃdica seleccionada de entre SEC ID nº 20 a SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 16 a SEC ID nº 19, SEC ID nº 31 a SEC ID nº 33, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 48, SEC ID nº 49, SEC ID nº 50, SEC ID nº 45 y sus secuencias complementarias, en condiciones de hibridación determinadas bien conocidas por el experto en la materia,
- -
- según la invención, un fragmento nucleotÃdico o un oligonucleótido o un polinucleótido es una cadena de monómeros, o un biopolÃmero, caracterizado por la secuencia informacional de los ácidos nucleicos naturales, susceptible de hibridarse a cualquier otro fragmento nucleotÃdico en condiciones predeterminadas, pudiendo la cadena contener monómeros de estructuras quÃmicas diferentes y ser obtenida a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o mediante recombinación genética y/o mediante sÃntesis quÃmica; un fragmento nucleotÃdico puede ser idéntico a un fragmento genómico del virus MSRV-1 considerado por la presente invención, en particular un gen de este último, por ejemplo pol o env en el caso de dicho virus;
- -
- asimismo un monómero puede ser un nucléotido natural de ácido nucleico, cuyos elementos constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada; en el ARN el azúcar es la ribosa, en el ADN el azúcar es la desoxi-2-ribosa; según se trate del ADN o del ARN, la base nitrogenada se selecciona de entre la adenina, la guanina, el uracilo, la citosina, la timina; o el nucleótido se puede modificar por lo menos en uno de los tres elementos constitutivos; a tÃtulo de ejemplo, la modificación puede intervenir al nivel de las bases, generando bases modificadas tales como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5desoxiuridina, la diamino-2,6-purina, la bromo-5-desoxiuridina y cualquier otra base modificada que favorece la hibridación; al nivel del azúcar, la modificación puede consistir en la sustitución de al menos una desoxirribosa por una poliamida (8), y al nivel del grupo fosfato, la modificación puede consistir en su sustitución por ésteres, especÃficamente seleccionados de entre los ésteres de difosfato, de alquilo y arilfosfonato y de fosforotioato,
- -
- mediante la expresión "secuencia informacional", se entiende cualquier serie ordenada de monómeros, cuya naturaleza quÃmica y cuyo orden en un sentido de referencia, constituyen o no una información funcional de la misma calidad que la de los ácidos nucleicos naturales,
- -
- por hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en condiciones operativas apropiadas, dos fragmentos nucleotÃdicos, que tienen secuencias suficientemente complementarias, se emparentan para formar una estructura compleja, en particular doble o triple, preferentemente en forma de hélice,
- -
- una sonda contiene un fragmento nucleotÃdico sintetizado por vÃa quÃmica u obtenido por digestión o corte enzimático de un fragmento nucleotÃdico más largo, que comprende al menos seis monómeros, ventajosamente entre 10 y 100 monómeros, preferentemente entre 10 y 30 monómeros, y que posee una especificidad de hibridación en condiciones determinadas; preferentemente, una sonda que posee menos de 10 monómeros no se utiliza sola, pero sà en presencia de otras sondas de tamaño tan corto o no; en ciertas condiciones particulares, puede resultar útil utilizar sondas de tamaño superior a 100 monómeros; en particular, se puede
usar una sonda con fines de diagnóstico, y se tratará por ejemplo de sondas de captura y/o de detección,
- -
- la sonda de captura se puede inmovilizar sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o absorción pasiva,
- -
- la sonda de detección se puede marcar mediante un marcador seleccionado en particular de entre los isótopos radioactivos, enzimas seleccionadas en particular de entre la peroxidasa y la fosfatasa alcalina, y los susceptibles de hidrolizar un sustrato cromógeno, fluorÃgeno o luminiscente, compuestos quÃmicos cromóforos, compuestos cromógenos, fluorÃgenos o luminiscentes, análogos de bases nucleotÃdicas, y la biotina,
- -
- en el marco de la presente invención, las sondas utilizadas con fines de diagnóstico se pueden implementar en cualquier técnica de hibridación conocida, y en particular las técnicas denominadas "TRANSFERENCIA DE DOT" (9), "TRANSFERENCIA SOUTHERN" (10), "TRANSFERENCIA NORTHERN" que es una técnica idénticaa la técnica de "TRANSFERENCIA SOUTHERN" pero que usa ARN como diana, la técnica "S�?NDWICH" (11); ventajosamente, en el marco de la presente invención se usa la técnica de "S�?NDWICH", que comprende una sonda de captura especÃfica y/o una sonda de detección especÃfica, entendiéndose que la sonda de captura y la sonda de detección deben presentar una secuencia nucleotÃdica al menos parcialmente diferente,
- -
- en el marco de la presente invención, cualquier sonda puede hibridarse in vivo o in vitro sobre el ARN y/o el ADN, para bloquear los fenómenos de replicación, en particular de traducción y/o de transcripción, y/o para degradar dicho ADN y/o ARN,
- -
- un cebador es una sonda que comprende al menos seis monómeros, y ventajosamente de 10 a 30 monómeros, que poseen una especificidad de hibridación en condiciones determinadas, para la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación tal como PCR (Polymerase Chain Reaction), en un procedimiento de elongación, tal como la secuenciación, en un método de transcripción inversa
o análogo,
- -
- dos secuencias nucleotÃdicas o peptÃdicas se denominan equivalentes o derivadas una con relación a la otra, o con relación a una secuencia de referencia, si de manera funcional los biopolÃmeros correspondientes pueden desempeñar sustancialmente la misma función, sin ser idénticas, en relación con la aplicación o la utilización considerada, o en la técnica en la que intervienen; son en particular equivalentes dos secuencias obtenidas por el hecho de la variabilidad natural, en particular mutación espontánea de la especie a partir de la cual se identifican, o inducida, asà como dos secuencias homólogas, definiéndose la homologÃa a continuación,
- -
- por "variabilidad", se entiende cualquier modificación, espontánea o inducida de una secuencia, en particular por sustitución, y/o inserción, y/o supresión de nucleótidos y/o de fragmentos nucleotÃdicos, y/o extensión y/o acortamiento de la secuencia en por lo menos uno de los extremos; una variabilidad no natural puede resultar de las técnicas de ingenierÃa genética utilizadas, por ejemplo de la elección de los cebadores de sÃntesis degenerados o no, considerados para amplificar un ácido nucleico; esta variabilidad se puede traducir por modificaciones de cualquier secuencia de partida, considerada como referencia, y pudiendo ser expresadas por un grado de homologÃa en relación con dicha secuencia de referencia,
- -
- la homologÃa caracteriza el grado de identidad de dos fragmentos nucleotÃdicos o peptÃdicos comparados; se mide por el porcentaje de identidad que es especÃficamente determinado por comparación directa de secuencias nucleotÃdicas o peptÃdicas, en relación con secuencias nucleotÃdicas o peptÃdicas de referencia,
- -
- este porcentaje de identidad se ha determinado especÃficamente para los fragmentos nucleotÃdicos, en particular clones mencionados anteriormente, homólogos a los fragmentos identificados para el virus MSRV-1 por las SEC ID nº 1 a n° 9, SEC ID nº 46, SEC ID nº 51 a SEC ID nº 53, SEC ID nº 40, SEC ID nº 56 y SEC ID nº 57, asà como para las sondas y cebadores homólogos a las sondas y cebadores identificados por las SEC ID nº 20 a SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 16 a SEC ID nº 19, SEC ID nº 31 a SEC ID nº 33, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 48, SEC ID nº 49, SEC ID nº 50, SEC ID nº 55, SEC ID nº 40, SEC ID nº 56 y SEC ID nº 57; a tÃtulo de ejemplo, el porcentaje más bajo de identidad observado entre los diferentes consensos generales de ácidos nucleicos obtenidos a partir de fragmentos de ARN vÃrico de MSRV-1, procedente de las lÃneas LM7PC y PLI-2 según un protocolo detallado más adelante, es de 67% en la región descrita en la figura 1,
- -
- cualquier fragmento nucleotÃdico se denomina equivalente o derivado de un fragmento de referencia, si presenta una secuencia nucleotÃdica equivalente a la secuencia del fragmento de referencia; según la definición anterior, son en particular equivalentes a un fragmento de nucleótidos de referencia:
- (a)
- cualquier fragmento susceptible de hibridarse al menos parcialmente con el complemento del fragmento de referencia,
- (b)
- cualquier fragmento cuya alineación con el fragmento de referencia conduce a poner en evidencia bases contiguas idénticas, en número más importante que con cualquier otro fragmento que procede de otro grupo
taxonómico,
- (c)
- cualquier fragmento que resulta o que puede resultar de la variabilidad natural de la especie, a partir de la cual se obtiene,
- (d)
- cualquier fragmento que puede resultar de técnicas de ingenierÃa genética aplicadas al fragmento de referencia,
- (e)
- cualquier fragmento, que contiene al menos ocho nucléotidos contiguos, que codifica para un péptido homólogo o idéntico al péptido codificado por el fragmento de referencia,
- (f)
- cualquier fragmento diferente del fragmento de referencia, por inserción, supresión, sustitución de al menos un monómero, extensión, o acortamiento de al menos uno de sus extremos; por ejemplo, cualquier fragmento que corresponde al fragmento de referencia, flanqueado en al menos uno de sus extremos por una secuencia nucleotÃdica que no codifica para un polipéptido,
- -
- mediante el término "polipéptido", se entiende en particular cualquier péptido de al menos dos aminoácidos, en particular oligopéptido, proteÃna, extracto, separado, o sustancialmente aislado o sintetizado, por la intervención del ser humano, en particular los que se obtienen mediante sÃntesis quÃmica, o mediante expresión en un organismo recombinante,
- -
- mediante la expresión "polipéptido codificado de manera parcial por un fragmento nucleotÃdico", se entiende un polipéptido que presenta al menos tres aminoácidos codificados por al menos nueve monómeros contiguos comprendidos en dicho fragmento nucleotÃdico,
- -
- un aminoácido se denomina análogo a otro aminoácido, cuando sus caracterÃsticas fisicoquÃmicas respectivas, tales como la polaridad, la hidrofobicidad, y/o la alcalinidad, y/o acidez, y/o neutralidad, son sustancialmente las mismas; de esta manera, una leucina es análoga a una isoleucina.
- -
- cualquier polipéptido se denomina equivalente o derivado de un polipéptido de referencia, si los polipéptidos comparados tienen sustancialmente las mismas propiedades, y en particular las mismas propiedades antigénicas, inmunológicas, enzimológicas y/o de reconocimiento molecular; es en particular equivalente a un polipéptido de referencia:
- (a)
- cualquier polipéptido que posee una secuencia de la que al menos un aminoácido ha sido sustituido por un aminoácido análogo,
- (b)
- cualquier polipéptido que tiene una secuencia peptÃdica equivalente, obtenida por variación natural o inducida de dicho polipéptido de referencia, y/o del fragmento nucleotÃdico que codifica para dicho polipéptido,
- (c)
- un mimotopo de dicho polipéptido de referencia,
- (d)
- cualquier polipéptido en cuya secuencia uno o varios aminoácidos de la serie L se sustituyen por un aminoácido de la serie D, y viceversa,
- (e)
- cualquier polipéptido en cuya secuencia se ha introducido una modificación de las cadenas laterales de los aminoácidos, tal como por ejemplo una acetilación de las funciones aminas, una carboxilación de las funciones tiol, una esterificación de las funciones carboxÃlicas,
- (f)
- cualquier polipéptido en cuya secuencia uno o varios enlaces peptÃdicos han sido modificados, como por ejemplo los enlaces carba, retro, inverso, retro-inverso, reducidos, y metilenoxi,
- (g)
- cualquier polipéptido del que al menos un antÃgeno es reconocido por un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de referencia,
- -
- el porcentaje de identidad que caracteriza la homologÃa de dos fragmentos peptÃdicos comparados es de al menos 50% y preferentemente de al menos 70%.
Dado que un virus que posee una actividad enzimática de transcriptasa inversa se puede caracterizar genéticamente tanto en forma de ARN como de ADN, se mencionará tanto el ADN como el ARN vÃrico para caracterizar las secuencias relativas a un virus que posee dicha actividad de transcriptasa inversa, denominado MSRV-1 según la presente descripción.
Las expresiones de orden usadas en la presente descripción y las reivindicaciones, tales como "primera secuencia nucleotÃdica" no se consideran para expresar un orden particular, sino para definir más claramente la invención.
Mediante la expresión "detección de una sustancia o de un agente", se entiende a continuación tanto una identificación como una cuantificación o una separación o aislamiento de dicha sustancia o de dicho agente.
La invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la lectura de la descripción detallada siguiente, que hace referencia a las figuras anexas, en las que:
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- la figura 1 representa unos consensos generales de ácidos nucleicos de los clones MSRV-1B amplificados mediante la técnica PCR en la región "pol" definida por Shih (12), a partir de ADN vÃrico que procede de las lÃneas LM7PC y PLI-2, e identificados con las referencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, y el consenso común con cebadores de amplificación que tienen la referencia SEC ID nº 7.
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- la figura 2 da la definición de una trama de lectura funcional para cada familia de tipo MSRV-1B/"PCR pol", siendo dichas familias A a D definidas respectivamente por las secuencias nucleotÃdicas SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, descritas en la figura 1.
- -
- la figura 3 da un ejemplo de consenso de las secuencias de MSRV-2B, identificado mediante la SEC ID nº 11,
- -
- la figura 4 es una representación de la actividad de transcriptasa inversa (RT) en dpm (desintegración por minuto), en las fracciones de sacarosa extraÃdas en un gradiente de purificación de los viriones producidos por los linfocitos B en cultivo de un paciente que padece SEP,
- -
- la figura 5 da, en las mismas condiciones experimentales que en la figura 4, la determinación de la actividad de
transcriptasa inversa en el cultivo de una lÃnea de linfocitos B obtenida a partir de un control libre de SEP,
- -
- la figura 6 representa la secuencia nucleotÃdica del clon PSJ17 (SEC ID nº 9),
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- la figura 7 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 8, del clon denominado M003-P004,
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- la figura 8 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 2 del clon F11-1; la parte observada entre las dos flechas en la región del cebador corresponde a una variabilidad impuesta por la elección del cebador que ha servido a la clonación de F11-1; en esta misma figura, se representa la traducción en aminoácidos,
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- la figura 9, que agrupa las figuras 9a y 9b, representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 1, y un tramo funcional de lectura posible de aminoácidos de SEC ID nº 1; en esta secuencia, las secuencias de consenso del gen pol están subrayadas,
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- las figuras 10 y 11 dan los resultados de una PCR, en forma de fotografÃa bajo luz ultravioleta de un gel de azarosa impregnado de bromuro de etidio, de los productos obtenidos a partir de los cebadores identificados mediante la SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19.
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- la figura 12 muestra una representación matricial de la homologÃa entre la SEC ID nº 1 de MSRV-1 y la de un retrovirus endógeno denominado HSERV9; esta homologÃa de al menos 65% se muestra mediante un trazo lleno, significando la ausencia de trazo una homologÃa inferior a 65%,
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- la figura 13 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 46 del clon FBd3,
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- la figura 14 representa la homologÃa de secuencia entre el clon FBd3 y el retrovirus HSERV-9;
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- la figura 15 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 51 del clon t pol,
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- las figuras 16 y 17 representan respectivamente las secuencias nucleotÃdicas SEC ID nº 52 y SEC ID nº 53, de
los clones JLBc1 y JLBc2 respectivamente;
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- la figura 18 representa la homologÃa de secuencia entre el clon JLBc1 y el clon FBd3,
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- la figura 19 representa la homologÃa de secuencia entre el clon JLBc2 y el clon FBd3,
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- la figura 20 representa la homologÃa entre los clones JLBc1 y JLBc2,
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- las figuras 21 y 22 representan la homologÃa de secuencia entre el retrovirus HSERV-9 y los clones JLBc1 y
JLBc2 respectivamente,
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- la figura 23 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 56 del clon GM3;
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- la figura 24 representa la homologÃa de secuencia entre el retrovirus HSERV-9 y el clon GM3,
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- la figura 25 representa la localización de los diferentes clones estudiados, con relación al genoma del retrovirus conocido ERV9,
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- la figura 26 representa la posición de los clones F11-1, M003-P004, MSRV-1B y PSJ17 en la región denominada a continuación MSRV-1 pol*,
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- la figura 27, explosionada en tres figuras sucesivas 27a, 27b, 27c, representa un cuadro de lectura posible, que cubre la totalidad del gen pol,
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- la figura 28 representa según la SEC ID nº 40, la secuencia nucleotÃdica que codifica para el fragmento peptÃdico POL2B, que tiene la secuencia de aminoácidos identificada mediante la SEC ID nº 39,
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- la figura 29 representa los valores de DO (ensayos ELISA) a 492 nm obtenidos para 29 sueros de pacientes SEP y 32 sueros de pacientes de control sanos ensayados con un anticuerpo anti-IgG,
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- la figura 30 representa los valores de DO (ensayos ELISA) a 492 nm obtenidos para 36 sueros de pacientes SEP y 42 sueros de pacientes de control sanos ensayados con un anticuerpo anti-IgM,
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- las figuras 31 a 33 representan los resultados obtenidos (intensidad relativa de los puntos) para 43 octapéptidos solapantes que cubren la secuencia de aminoácidos 61-110, según la técnica de Spotscan, respectivamente con un grupo de sueros de SEP, con un grupo de sueros de control y con el grupo de sueros SEP después de la deducción de un ruido de fundo que corresponde a la señal máxima detectada en al menos un octapéptido con el suero de control (intensidad = 1), entendiéndose que estos sueros han sido diluidos al 1/50. La barra en el extremo derecho representa un estándar de escala gráfica sin relación con el ensayo serológico,
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- la figura 34 representa las SEC ID nº 41 y SEC ID nº 42 de dos polipéptidos que comprenden inmunodominantes, mientras que las SEC ID nº 43 y 44 representan polipéptidos inmunorreactivos y especÃficos de SEP,
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- la figura 35 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 59 del clon LB19 y tres tramos de lectura potenciales de aminoácidos de SEC ID nº 59,
- -
- la figura 36 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 88 (GAG*) y una trama de lectura potencial de aminoácidos de SEC ID nº 88,
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- la figura 37 representa la homologÃa de secuencia entre el clon FBd13 y el retrovirus HSERV-9; según esta representación, el trazo lleno significa un porcentaje de homologÃa superior o igual a 70%, y la ausencia de trazo significa un porcentaje de homologÃa inferior,
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- la figura 38 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 61 del clon FP6 y tres tramas de lectura potenciales de aminoácidos de SEC ID nº 61,
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- la figura 39 representa la secuencia nucleotÃdica SEC ID nº 89 del clon G+E+A y tres tramas de lectura potenciales de aminoácidos de SEC ID nº 89,
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- la figura 40 representa una trama de lectura encontrada en la región E y que codifica para una proteasa retrovÃrica MSRV-1 identificada por la SEC ID nº 90;
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- la figura 41 representa la respuesta de cada suero de pacientes que padecen SEP indicada mediante el sÃmbolo (+) y de pacientes sanos simbolizada mediante (-), ensayada con un anticuerpo anti-IgG expresada en densidad óptica neta a 492 nm, y
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- la figura 42 representa la respuesta de cada suero de pacientes que padecen SEP indicado mediante los sÃmbolos (+) y (QS) y de pacientes sanos (-), ensayado con un anticuerpo anti-IgM expresada en densidad óptica neta a 492 nm.
EJEMPLO 1: OBTENCIÓN DE CLONES DENOMINADOS MSRV-1B Y MSRV-2B, QUE DEFINICEN RESPECTIVAMENTE UN RETROVIRUS MSRV-1 Y UN AGENTE COINFECCIOSO MSRV2, MEDIANTE AMPLIFICACIÓN PCR "ANIDADA" DE LAS REGIONES POL CONSERVADAS DE LOS RETROVIRUS, ENPREPARACIONES DE VIRIONES QUE PROCEDEN DE LAS L�?NEAS LM7PC Y PLI-2
Se ha usado una técnica de PCR derivada de la técnica publicada por Shih (12). Esta técnica permite, mediante tratamiento de todos los componentes del medio de reacción por la ADNasa, eliminar cualquier traza de ADN contaminante. Permite paralelamente, mediante el uso de cebadores diferentes pero solapantes en dos series sucesivas de ciclos de amplificaciones PCR, aumentar las posibilidades de amplificar un ADNc sintetizado a partir de una cantidad de ARN baja al principio, y también reducida en la muestra mediante la acción parásita de la ADNasa sobre el ARN. En efecto, la ADNasa se usa en condiciones de actividad en exceso que permiten eliminar cualquier traza de ADN contaminante, antes de la desactivación de esta enzima que se queda en la muestra mediante calentamiento hasta 85ºC durante 10 minutos. Esta variante de la técnica de PCR descrita por Shih (12), se ha usado sobre un ADNc sintetizado a partir de los ácidos nucleicos de fracciones de partÃculas infecciosos purificadas sobre gradiente de sacarosa, según la técnica descrita por H-Perron (13), a partir del aislado "POL-2" (ECACC n°V92072202) producido por la lÃnea PLI-2 (ECACC n°92072201) por una parte, y a partir del aislado MS7PG (ECACC n°V93010816) producido por la lÃnea LM7PC (ECACC n°93010817) por otra parte. Estos cultivos se han obtenido según los métodos que han sido objeto de las solicitudes de patentes publicadas con los nº WO 93/20188 y WO 93/20189.
Después de la clonación con TA Cloning kit® de los productos amplificados mediante esta técnica, y análisis de la secuencia con la ayuda de un secuenciador automático "Automatic Sequencer, modelo 373A" de Applied Biosystems, se analizaron la secuencias con la ayuda del programa Beneworks®, en la última versión disponible del banco de datos Genebank®.
Las secuencias clonadas y secuenciadas a partir de estas muestras corresponden en particular a dos tipos de secuencias: un primer tipo de secuencia, encontrado en la mayorÃa de los clones (55% de los clones que proceden de los aislados POL-2 de los cultivos PLI-2, y 67% de los clones que proceden de los aislados MS7PG de los cultivos LM7PC), que corresponde a una familia de secuencias "pol" cercanas pero diferentes del retrovirus endógeno humano denominado ERV-9 o HSERV-9, y un segundo tipo de secuencia que corresponde a secuencias muy homólogas a una secuencia atribuida a otro agente infeccioso y/o patógeno denominado MSRV-2.
El primer tipo de secuencias que representa la mayorÃa de los clones está constituido por secuencias cuya variabilidad permite definir cuatro subfamilias de secuencias. Estas subfamilias son suficientemente cercanas entre sà para que se las pueda considerar como casi-especies que proceden de un mismo retrovirus, tal como se conoce bien para el retrovirus VIH-1 (14), o como el resultado de la interferencia con varios provirus endógenos coregulados en las células productoras. Estos elementos endógenos más o menos defectivos son sensibles a las mismas señales de regulación generadas eventualmente por un provirus replicativo, debido a que pertenecen a la misma familia de retrovirus endógenos (15). Esta nueva familia de retrovirus endógenos o, alternativamente, esta nueva especie retrovÃrica de la que se obtuvo en cultivo la generación de casi-especies, y que contiene un consenso de las secuencias descritas anteriormente, se denomina MSRV-1B.
En la figura 1 se representan los consensos generales de las secuencias de los diferentes clones MSRV-1B secuenciados durante este experimento, siendo estas secuencias respectivamente identificadas mediante la SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6. Estas secuencias presentan una homologÃa de ácidos nucleicos comprendida entre 70% y 88% con la secuencia HSERV9 referenciada X57147 y M37638 en la base de datos Genebank®. Se han definido cuatro secuencias nucleicas "consenso" representativas de diferentes casi-especies de un retrovirus MSRV-1B eventualmente exógeno, o de diferentes subfamilias de un retrovirus endógeno MSRV-1b. Estos consensos representativos se representan en la figura 2, con la traducción de aminoácidos. Una trama de lectura funcional existe para cada subfamilia de estas secuencias MSRV-1B, y se puede observar que la trama de lectura abierta funcional corresponde cada vez a la secuencia de aminoácidos que vienen en segunda lÃnea bajo la secuencia de ácidos nucleico. El consenso general de la secuencia MSRV-1B, identificado mediante la SEC ID nº 7 y obtenido mediante esta técnica de PCR en la región "pol" se representa en la figura 1.
El segundo tipo de secuencia que representa la mayorÃa de los clones secuenciados se representa mediante la secuencia MSRV-2B representada en la figura 3 e identificada mediante la SEC ID nº 11. Las diferencias observadas en las secuencias que corresponden a los cebadores de PCR se explican mediante el uso de cebadores degenerados en mezcla usados en condiciones técnicas diferentes.
La secuencia MSRV-2B (SEC ID nº 11) es suficientemente divergente de las secuencias retrovÃricas ya descritas en los bancos de datos, para que se pueda anticipar que se trata de una región de secuencia que pertenece a un nuevo agente infeccioso, denominado MSRV-2. Este agente infeccioso se emparentarÃa a priori, según el análisis de las primeras secuencias obtenidas, a un retrovirus, pero, debido a la técnica usada para obtener esta secuencia, también se podrÃa tratar de un virus con ADN cuyo genoma codifica para una enzima que posee de forma accesoria una actividad de transcriptasa inversa como es el caso, por ejemplo, para el virus de la hepatitis B, HBV (12). Además, el carácter aleatorio de los cebadores degenerados usados para esta técnica de amplificación PCR puede haber permitido, debido a las homologÃas de secuencias imprevistas o de sitios conservados en el gen de una enzima emparentada, la amplificación de un ácido nucleico que procede de un agente patógeno y/o co-infeccioso procariota o eucariota (protista).
EJEMPLO 2: OBTENCIÓN DE CLONES DENOMINADOS MSRV-1B Y MSRV-2B, QUE DEFINEN UNA FAMILIAMSRV-1 Y MSRV-2, MEDIANTE AMPLIFICACIÓN PCR "ANIDADA" DE LAS REGIONES POL CONSERVADAS DE LOS RETROVIRUS, EN PREPARACIONES DE LINFOCITOS B DE UN NUEVO CASO DE SEP
Se ha usado la misma técnica de PCR modificada según la técnica de Shih (12) para amplificar y secuenciar el material nucleico ARN presente en una fracción de viriones purificada en el pico de actividad de transcriptasa inversa "de tipo LM7", en un gradiente de sacarosa según la técnica descrita por H. Perron (13), y según los protocolos mencionados en el ejemplo 1, a partir de una lÃnea linfoblastoide espontánea, obtenida mediante autoinmortalización en cultivo de linfocitos B de un paciente SEP seropositivo para el virus de Epstein-Barr (EBV), después del cultivo de las células linfoides sanguÃneas en un medio de cultivo apropiado que contiene una concentración apropiada de ciclosporina A. En la figura 4 se ilustra una representación de la actividad de transcriptasa inversa en las fracciones de sacarosa extraÃdas en un gradiente de purificación de los viriones producidos por esta lÃnea. De la misma manera, se han tratado los sobrenadantes de cultivo de una lÃnea B obtenida en las mismas condiciones a partir de un control libre de SEP en las mismas condiciones, y la determinación de la actividad de transcriptasa inversa en las fracciones del gradiente de sacarosa resultó negativo en todas partes (ruido de fondo) y se representa en la figura 5. Se han analizado la fracción 3 del gradiente que corresponde a la lÃnea B de SEP y la misma fracción sin actividad de transcriptasa inversa del gradiente de control no-SEP mediante la misma técnica de RT-PCR que anteriormente, derivada de Shih (12), seguida de las mismas etapas de clonación y de secuenciación tales como se describen en el ejemplo 1.
Se puede observar que las secuencias de tipo MSRV-1 y MSRV-2 se encuentran en el único material asociado con un pico de actividad de transcriptasa inversa "de tipo LM7" que procede de la lÃnea linfoblastoide B de SEP. Estas secuencias no se han encontrado con el material de la lÃnea linfoblastoide B de control (no-SEP) en 26 clones recombinantes tomados al azar. Sólo se han encontrado las secuencias contaminantes de tipo Mo-MuLV que proceden de la transcriptasa inversa comercial usada para la etapa de sÃntesis del ADNc y de las secuencias sin analogÃa retrovÃrica particular en este control, debido a la amplificación "consenso" de las secuencias de polimerasas homólogas que realiza esta técnica de PCR. Además, la ausencia de diana concentrada que compite para la reacción de amplificación en la muestra de control permite la amplificación de contaminantes diluidos. La diferencia de los resultados es de forma evidente altamente significativa (chi-2, p<0,001).
EJEMPLO 3: OBTENCIÓN DE UN CLON PSJ17, QUE DEFINE UN RETROVIRUS MSRV-1, MEDIANTE REACCIÓN DE TRANSCRIPTASA INVERSA ENDÓGENA EN UNA PREPARACIÓN DE VIRION QUE PROCEDEDE LA L�?NEA PLI-2
Este enfoque prevé obtener secuencias de ADN retro-transcrita a partir del ARN supuesto retrovÃrico en el aislado, usando la actividad de transcriptasa inversa presente en este mismo aislado. Esta actividad de transcriptasa inversa únicamente puede funcionar teóricamente en presencia de un ARN retrovÃrico, enlazado a un cebador ARNt o hibridado con hebras cortas de ADN ya retro-transcritas en las partÃculas retrovÃricas (16). AsÃ, se ha optimizado la obtención de secuencias retrovÃricas especÃficas en un material contaminado por ácidos nucleicos celulares, según estos autores gracias a la amplificación enzimática especÃfica de las porciones de ARN vÃricos mediante una actividad de transcriptasa inversa vÃrica. Para ello, los autores han determinado las condiciones fÃsico-quÃmicas particulares en las que esta actividad enzimática de transcripción inversa en ARN contenidos en viriones podÃa ser efectiva in vitro. Estas condiciones corresponden a la descripción técnica de los protocolos presentados a continuación (reacción de RT endógeno, purificación, clonación y secuenciación).
El enfoque molecular consistió en usar una preparación de virión concentrado, pero no purificado, obtenido a partir de los sobrenadantes de cultivo de la lÃnea PLI-2 preparados según el siguiente método: los sobrenadantes de cultivo se recogen dos veces por semana, se pre-centrifugan a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares, y después se congelan a -80ºC o se usan tal cual para las siguientes etapas. Los sobrenadante frescos o descongelados se centrifugan en un tampón de PBS-glicerol al 30% a 100.000 g (o 30.000 r.p.m. en un rotor LKB-HITACHI de tipo 45 T) durante 2 horas a 4ºC. Después de la eliminación del sobrenadante, el residuo sedimentado se recoge en un pequeño volumen de PBS y constituye la fracción de virión concentrado, pero no purificado. Esta muestra vÃrica concentrada pero no purificada se usó para efectuar una reacción denominada de transcripción inversa endógena, tal como se describe a continuación.
Se descongela un volumen de 200 μl de virión purificado según el protocolo descrito anteriormente y que contiene una actividad de transcriptasa inversa de aproximadamente 1-5 millones de dpm a 37ºC hasta aparición de una fase lÃquida, y después se dispone sobre hielo. Se ha preparado un tampón 5 veces concentrado con los siguientes componentes: se han mezclado 500 mM de Tris-HCl pH 8,2; 75 mM de NaCl; 25 mM de MgCl2; 75 mM de DTT y NP 40 al 0,10%; 100 μl de tampón 5X + 25 μl de una disolución de 100 mM de dATP + 25 μl de una disolución de 100 mM de dTTP + 25 μl de una disolución de 100 mM de dGTP + 25 μl de una disolución de 100 mM de dCTP + 100 μl de agua destilada estéril + 200 μl de la suspensión de viriones (actividad T.I. de 5 millones de DPM) en el PBS y se han incubado a 42ºC durante 3 horas. Después de esta incubación, la mezcla de reacción se añade directamente a una mezcla tamponada de fenol/cloroformo/alcohol isoamÃlico (Sigma ref. P 3803); se recoge la fase acuosa y se añade un volumen de agua destilada estéril a la fase orgánica para volver a extraer el material nucleico residual. Las fases acuosas recogidas se agrupan, y los ácidos nucleicos se precipitan mediante adición de acetato de sodio 3M, pH 5,2 al 1/10 de volumen + 2 volúmenes de etanol + 1 μl de glicógeno (Boehringer-Mannheim ref. 901393) y se ponen a -20ºC de la muestra durante 4 horas o una noche a +4ºC. Después, el precipitado obtenido después de la centrifugación se lava con etanol al 70% y se resuspende en 60 ml de agua destilada. Después, los productos de esta reacción se purificaron, se clonaron y se secuenciaron según el protocolo descrito a continuación: se han generado ADN con extremos libres con adeninas no emparentadas a los extremos: en primer lugar se ha efectuado una reacción de "llenado": se han mezclado 25 μl de la disolución de ADN previamente purificado con 2 μl de una
disolución de 2,5 mM que contiene, en cantidad equimolar, dATP + dGTP + dTTP + dCTP/1 μl de ADN polimerasa T4 (Boehringer-Mannheim ref. 1004 786)/5 μl de 10X "incubation buffer for restriction enzyme" (Boehringer-Mannheim ref. 1417 975)/1 μl de una disolución al 1% de sero-albumina bovina/16 μl de agua destilada estéril. Esta mezcla se incubó durante 20 minutos a 11ºC. Se añadieron 50 μl de tampón TE y 1 μl de glicógeno (Boehringer5 Mannheim ref. 901 393), antes de la extracción de los ácidos nucleicos con fenol/cloroformo/alcohol isoamÃlico (Sigma ref. P 3803), y de la precipitación con acetato de sodio como se ha descrito anteriormente. El ADN precipitado después de la centrifugación se resuspende en 10 μl de tampón 10 mM de Tris pH 7,5. Después, se mezclaron 5 μl de esta suspensión con 20 μl de tampón Taq 5X, 20 μl de 5 mM de dATP, 1 μl (5U) de Taq ADN polimerasa (AmplitaqTM) y 54 μl de agua destilada estéril. Esta mezcla se incuba durante 2 horas a 75ºC con una 10 pelÃcula de aceite en la superficie de la disolución. El ADN en suspensión en la disolución acuosa extraÃdo debajo de la pelÃcula de aceite después de la incubación se precipita como se ha descrito anteriormente, y se resuspende en 2 μl de agua destilada estéril. El ADN obtenido se insertó en un plásmido con la ayuda del kit TA CloningTM. Se mezclaron los 2 μl de disolución de ADN con 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 μl de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) y 1 μl de "TA DNA LIGASE". Esta 15 mezcla se incubó durante una noche a 12ºC. Las siguientes etapas se realizaron según las instrucciones del kit TA CloningTM (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se replantaron para ser cultivadas y la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado de "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se escindió mediante una enzima de restricción apropiada y se analizó sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado 20 bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio se seleccionaron para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning kit®. Después, se ha realizado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "Automatic Sequencer,
25 modelo 373 A", Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El análisis discriminante en los bancos de datos informáticos de las secuencias clonadas a partir de los fragmentos de ADN presentes en la mezcla de reacción permitió demostrar una secuencia de tipo retrovÃrica. El clon que corresponde a PSJ17 ha sido totalmente secuenciado, y se ha analizado la secuencia obtenida, representada en la
30 figura 6 e identificada mediante la SEC ID nº 9, con la ayuda del programa "Geneworks®" en los bancos de datos actualizados "Genebank®". El análisis de los bancos de datos no ha permitido encontrar ninguna secuencia idéntica ya descrita. Sólo se ha podido encontrar una homologÃa parcial con ciertos elementos retrovÃricos conocidos. La homologÃa relativa más interesante se refiere a un retrovirus endógeno denominado ERV-9 o HSERV-9, según las referencias (18).
EJEMPLO 4: AMPLIFICACIÓN PCR DE LA SECUENCIA NUCLEICA CONTENIDA ENTRE LA REGIÓN 5’ DEFINIDA POR EL CLON "POL MSRV-1B" Y LA REGIÓN 3’ DEFINIDA POR EL CLON PSJ17
Se han definido cinco oligonucleótidos, M001, M002, M002-A, M003-BCD, P004 y P005, para amplificar ARN que
40 procede de viriones purificados POL-2. Se han efectuado reacciones de control a fin de controlar la presencia de contaminantes (reacción sobre agua). La amplificación consiste en una etapa de RT-PCR según el protocolo descrito en el Ejemplo 2, seguida de una PCR "anidada" según el protocolo PCR descrito en el documento EP-A-0 569 272. En el primer ciclo de RT-PCR, se usan los cebadores M001 y P004 o P005. En el segundo ciclo de PCR, se usan los cebadores M002-A o M003-BCD, y el cebador P004. Los cebadores se posicionan como sigue:
45 corresponde a la secuencia SEC ID nº 8.
- 50
- Su composición es:
- 55
- cebador M001: GGTCITICCICAIGG (SEC ID nº 20) cebador M002-A: TTAGGGATAGCCCTCATCTCT (SEC ID nº 21) cebador M003-BCD: TCAGGGATAGCCCCCATCTAT (SEC ID nº 22) cebador P004: AACCCTTTGCCACTACATCAATTT (SEC ID nº 23) cebador P005: GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT (SEC ID nº 24)
- El producto de amplificación "anidada" obtenido y denominado M003-P004 se representa
- en la figura 7, y
EJEMPLO 5: AMPLIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE UNA PORCIÓN DEL GENOMA RETROV�?RICO MSRV-1 CON LA AYUDA DE UNA SECUENCIA YA IDENTIFICADA, EN UNA MUESTRA DE VIRUS PURIFICADA CON PICO DE ACTIVIDAD DE TRANSCRIPTASA INVERSA
Se ha usado una técnica de PCR derivada de la técnica publicada por Frohman (19). La técnica derivada permite, con la ayuda de un cebador especÃfico en dirección 3’ del genoma a amplificar, alargar la secuencia hacia la región 5’ del genoma a analizar. Esta técnica variante se describe en la bibliografÃa de la compañÃa Clontech Laboratories Inc., (Palo-Alto California, USA) suministrada con su producto "5’-AmpliFINDERTM RACE Kit", que se usó en una fracción de virión purificada como se ha descrito anteriormente.
Los cebadores 3’ especÃficos usados en el protocolo del kit para la sÃntesis del ADNc y la amplificación PCR son respectivamente complementarios a las secuencias MSRV-1 siguientes:
ADNc: TCATCCATGTACCGAAGG(SEC ID nº 25) amplificación: ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT(SEC ID nº 26)
Los productos que proceden de la PCR se purificaron sobre gel de agarosa según los métodos habituales (17), y después se resuspendieron en 10 ml de agua destilada. Consistiendo una de las propiedades de la polimerasa Taq en añadir una adenina en el extremo 3’ de cada una de las dos hebras de ADN, se insertó directamente el ADN obtenido en un plásmido con la ayuda del kit TA CloningTM (British Biotechnology). Los 2 μl de disolución de ADN se mezclaron con 5 μl de agua destilada estéril, 1 µl de tampón de ligación concentrado 10 veces "10X LIGATION BUFFER", 2 µl de "PCRTM VECTOR" (25 ng/ml) y 1 µl de "TA DNA LIGASE". Esta mezcla se incubó durante una noche a 12ºC. Las siguientes etapas se realizaron según las instrucción del kit TA Cloning® (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se replantaron para ser cultivadas y la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se escindió mediante una enzima de restricción apropiada, y se analizó sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, se seleccionaron para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning Kit®. Después, se ha realizado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "Automatic sequencer, modelo 373 A" Applied Biosystems según las instrucciones del fabricante.
En primer lugar, esta técnica se ha aplicado a dos fracciones de virión purificado como se describe a continuación, sobre sacarosa a partir del aislado "POL-2" producido por la lÃnea PLI-2 por una parte, y a partir del aislado MS7PG producido por la lÃnea LM7PC por otra parte. Los sobrenadantes de cultivos se recogen dos veces por semana, se precentrifugan a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares, y después se congelan hasta -80ºC o se usan tal cual para las siguientes etapas. Los sobrenadantes frescos o descongelados se centrifugan sobre un tampón de PBS-glicerol al 30% a 100.000 g (o 30.000 r.p.m. En un rotor LKB-HITACHI de tipo 4,5 T) durante 2 horas a 4ºC. Después de la eliminación del sobrenadante, el residuo sedimentado se recoge en un pequeño volumen de PBS y constituye la fracción de viriones concentrados, pero no purificados. Después, el virus concentrado se dispone en un gradiente de sacarosa en un tampón PBS estéril (15 a 50% en peso/peso) y se ultracentrifuga a 35.000 r.p.m. (100.000 g) durante 12 horas a +4ºC en un rotor con pocillos. Se recogen 10 fracciones y se extraen 20 μl en cada fracción después de la homogeneización para dosificar la actividad de transcriptasa inversa según la técnica descrita por H. Perron (3). Después, las fracciones que contienen el pico de actividad RT "de tipo LM7" se diluyen en un tampón PBS estéril y se ultracentrifugan durante una hora a 35.000
r.p.m. (100.000 g) para sedimentar las partÃculas vÃricas. El residuo de virión purificado asà obtenido se recoge entonces en un pequeño volumen de un tampón adecuado para la extracción de ARN. La reacción de sÃntesis de ADNc mencionada anteriormente se realiza sobre este ARN extraÃdo de virión extracelular purificado. La amplificación de PCR según la técnica citada anteriormente ha permitido obtener el clon F1-11 cuya secuencia identificada por la SEC ID nº 2 se representa en la figura 8.
Este clon permite definir, con los diferentes clones previamente secuenciados, una región de longitud importante (1,2 kb) representativa del gen "pol" del retrovirus MSRV-1, tal como se representa en la figura 9. Esta secuencia denominada SEC ID nº 1 está reconstituida a partir de diferentes clones que se recubren en sus extremos, corrigiendo los artefactos relacionados con los cebadores y con las técnicas de amplificación o de clonación, que interrumpirÃan artificialmente la trama de lectura del conjunto. Esta secuencia se identificará a continuación con la denominación "región MSRV-1 pol*". Su grado de homologÃa con la secuencia HSERV-9 se representa en la figura
12.
En la figura 9, la trama de lectura potencial con su traducción en aminoácidos se representa debajo de la secuencia de ácidos nucleicos.
EJEMPLO 6: DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPEC�?FICAS MSRV-1 Y MSRV-2 EN DIFERENTES MUESTRAS DE PLASMA QUE PROCEDEN DE PACIENTES QUE PADECEN SEP O DE PACIENTES DE CONTROL
Se ha usado una técnica de PCR para detectar los genomas MSERV-1 y MSERV-2 en plasmas obtenidos después de una extracción de sangre sobre EDTA de pacientes que padecen SEP y de pacientes de control no-SEP.
La extracción de los ARN de plasma se ha efectuado según la técnica descrita por P. Chomzynski (20), después de la adición de un volumen del tampón que contiene tiocianato de guanidinio con 1 ml de plasma guardado congelado a -80ºC después de la recogida.
Para MSRV-2, la PCR se ha efectuado en las mismas condiciones y con los cebadores siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 14 5’ GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3’;
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 15 5’ GCATCCGGCAACTGCACG 3’.
Sin embargo, también se han obtenido resultados similares con los cebadores de PCR siguientes en dos amplificaciones sucesivas mediante PCR "anidada" sobre muestras de ácidos nucleicos no-tratadas mediante ADNasa.
Los cebadores usados para esta primera etapa de 40 ciclos con una temperatura de hibridación de 48ºC son los siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 27 5’ GCCGATATCACCCGCCATGG 3’, que corresponde a un cebador PCR MSRV-2 5’, para una primera PCR sobre extracción de pacientes,
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 28 5’ GCATCCGGCAACTGCACG 3’, que corresponde a un cebador PCR MSRV-2 3’, para una primera PCR sobre extracción de pacientes.
Después de esta etapa, se extraen 10 μl del producto de amplificación y se usan para realizar una segunda amplificación de PCR denominada "anidada" con cebadores situados en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda etapa se desarrolla en 35 ciclos, con una temperatura de hibridación de los cebadores ("annealing") de 50ºC. El volumen de reacción es de 100 μl.
Los cebadores usados para esta segunda etapa son los siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 29 5’ CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3’, que corresponde a un cebador PCR MSRV-2 5’, para una PCR-anidada sobre extracción de pacientes,
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 30 5’ TCTCCACTCCGAATATTCCG 3’, que corresponde a un cebador PCR MSRV-2 3’, para una PCR-anidada sobre extracción de pacientes.
Para MSRV-1, la amplificación se ha efectuado en dos etapas. Además, la muestra de ácidos nucleicos se trata previamente mediante ADNasa y se efectúa un control de PCR sin RT (transcriptasa inversa AMV) en las dos etapas de amplificación, a fin de verificar que la amplificación de RT-PCR procede exclusivamente del ARN MSRV-1. En el caso de un control sin RT positivo, la muestra alÃcuota de ARN de partida se trata nuevamente mediante ADNasa, y se amplifica nuevamente.
El protocolo de tratamiento mediante ADNasa desprovista de actividad ARNasa es el siguiente: se alÃcuota un ARN extraÃdo en presencia de "RNAse inhibitor" (Boehringer-Mannheim) en agua tratada con DEPC a una concentración final de 1 μl en 10 μl; a estos 10 μl se añade 1 μl de "RNAse-free DNAse" (Boehringer-Mannheim) y 1,2 μl de tampón a pH 5 que contiene 0,1 M/l de acetato de sodio y 5 mM/l de MgSO4, la mezcla se incuba durante 15 minutos a 20ºC y se lleva a 95ºC durante 1,5 minutos en un "thermocycler".
La primera etapa de RT-PCR MSRV-1 se efectúa según una variante del procedimiento de amplificación de ARN tal como se describe en la solicitud de patente EP-A-0 569 272. En particular, la etapa de sÃntesis de ADNc se efectúa a 42ºC durante una hora; la amplificación de PCR se desarrolla sobre 40 ciclos, con una temperatura de hibridación de los cebadores ("annealing") de 53ºC. El volumen de reacción es de 100 μl.
Los cebadores usados para esta primera etapa son los siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 16 5’ AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3’;
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 17 5’ TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3’.
Después de esta etapa, se extraen 10 μl del producto de amplificación y se usan para realizar una segunda amplificación de PCR denominada "anidada" con cebadores situados en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda etapa se desarrolla sobre 35 ciclos, con una temperatura de hibridación de los cebadores ("annealing") de 53ºC. El volumen de reacción es de 100 μl.
Los cebadores usados para esta segunda etapa son los siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 18 5’ TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3’;
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 19 5’ AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3’.
En las figuras 10 y 11, se representan los resultados de PCR en forma de fotografÃa bajo luz ultravioleta de geles de agarosa impregnados de bromuro de etidio, en los que se ha efectuado una electroforesis de los productos de amplificación de PCR depositados separadamente en los diferentes pocillos.
La fotografÃa de arriba (figura 10) representa el resultado de la amplificación especÃfica MSRV-1.
El pocillo número 8 contiene una mezcla de marcadores de peso molecular ADN, y los pocillos 1 a 7 representan, en orden, los productos amplificados a partir de los ARN totales de plasmas que proceden de 4 controles sanos libres de SEP (pocillos 1 a 4) y de 3 pacientes que padecen SEP, en diferentes etapas de la enfermedad (pocillos 5 a 7).
En esta serie, se ha detectado material nucleico MSRV-2 en el plasma de un caso de SEP de los 3 ensayados y en ninguno de los 4 plasmas de control. Otros resultados obtenidos en series más extendidas confirman estos resultados.
La fotografÃa de abajo (figura 11) representa el resultado de la amplificación especÃfica mediante RT-PCR "anidada" MSRV-1:
el pocillo nº 1 contiene el producto de PCR efectuada con agua sola, sin adición de transcriptasa inversa AMV; el pocillo nº 2 contiene el producto de PCR efectuada con agua sola, sin adición de transcriptasa inversa AMV; el pocillo número 3 contiene una mezcla de marcadores de peso molecular ADN; los pocillos 4 a 13 contienen, en orden, los productos amplificados a partir de los ARN totales extraÃdos de fracciones de gradiente de sacarosa (recogido de arriba abajo) en el que un residuo de virión que procede de un sobrenadante de cultivo infectado por MSRV-1 y MSRV-2 se ha centrifugado en equilibrio según el protocolo descrito por H. Perron (13); en el pocillo 14 no se ha depositado nada; en los pocillos 15 a 17, se han depositado los productos amplificados de ARN extraÃdo de plasmas que proceden de 3 pacientes diferentes que padecen SEP, en diferentes etapas de la enfermedad.
El genoma retrovÃrico MSRV-1 se encuentra efectivamente en la fracción del gradiente de sacarosa que contiene el pico de actividad de transcriptasa inversa medida según la técnica descrita por H. Perron (3), con una intensidad muy alta (fracción 5 del gradiente, depositada en el pocillo nº 8). Una ligera amplificación ha tenido lugar en la primera fracción (pocillo nº 4) que corresponde posiblemente a un ARN liberado por partÃculas lisadas que flotaban en la superficie del gradiente; de la misma manera, unos restos agregados han sedimentado en la última fracción (fondo de tubo) arrastrando algunas copias del genoma MSRV-1 que han dado lugar a una amplificación de baja densidad.
En los 3 plasmas de SEP ensayados en esta serie, se ha encontrado el ARN MSRV-1 en un caso, produciendo una amplificación muy intensa (pocillo nº 17).
En esta serie, el genoma ARN retrovÃrico MSRV-1 que corresponde aparentemente a partÃculas de virus extracelular presentes en el plasma en número extremadamente bajo, se ha detectado mediante RT-PCR "anidada" en un caso de SEP de los 3 ensayados. Otros resultados obtenidos en series más extendidas confirman estos resultados.
Además, la especificidad de las secuencias amplificadas mediante estas técnicas de PCR se pueden verificar y evaluar mediante la técnica "ELOSA" tal como se describe por F. Mallet (21) y en el documento FR-A-2 663 040.
Para MSRV-1, los productos de la PCR anidada descrita anteriormente se pueden ensayar en dos sistemas ELOSA que permiten detectar separadamente un consenso A y un consenso B+C+D de MSRV-1, que corresponden a las subfamilias descritas en el ejemplo 1 y en las figuras 1 y 2. En efecto, las secuencias cercanas del consenso B+C+D se encuentran esencialmente en las muestras de ARN que proceden de viriones MSRV-1 purificados a partir de cultivos o amplificados en lÃquidos biológicos extra-celulares de pacientes SEP, mientras que las secuencias cercanas del consenso A se encuentran esencialmente en el ADN celular humano normal.
El sistema ELOSA/MSRV-1 para la captura y la hibridación especÃfica de los productos de PCR de la subfamilia A usa un oligonucleótido de captura cpV1A con un enlace amina en dirección 5’, y un oligonucleótido de detección biotinilado dpV1A que tienen respectivamente por secuencia:
- -
- cpV1A identificado mediante la SEC ID nº 31
5’ GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3’, que corresponde al oligonucleótido de captura ELOSA de los productos de PCR-anidada MSRV-1 efectuada con los cebadores identificados mediante las SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, seguida eventualmente de la amplificación con los cebadores identificados mediante las SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19 sobre extracción de pacientes;
- -
- dpV1A identificado mediante la SEC ID nº 32
5’ CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3’ que corresponde al oligonucleótido de captura ELOSA de la subfamilia A de los productos de PCR-"anidada" MSRV-1 efectuada con los cebadores identificados mediante las SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, seguida eventualmente de la amplificación con los cebadores identificados mediante las SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19 sobre extracción de paciente.
El sistema ELOSA/MSRV-1 para la captura y la hibridación especÃfica de los productos de PCR de la subfamilia B+C+D usa el mismo oligonucleótido de detección biotinilado dpV1A, y un oligonucleótido de captura cpV1B con un enlace amina en dirección 5’ que tienen por secuencia:
- -
- dpV1B identificado mediante la SEC ID nº 33
5’ CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3’, que corresponde al oligonucleótido de captura ELOSA de la subfamilia B + C + D de los productos de PCR-"anidada" MSRV-1 efectuada con los cebadores identificados mediante las SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, seguida eventualmente de la amplificación con los cebadores identificados mediante las SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19 sobre extracción de pacientes.
Este sistema de detección ELOSA ha permitido verificar que ninguno de los productos de PCR asà amplificados a partir de plasmas de pacientes SEP tratados mediante ADNasa contenÃa secuencias de la subfamilia A, y que todos eran positivos con el consenso de las subfamilias B, C y D.
Para MSRV-2, se ha evaluado una técnica ELOSA similar sobre aislados que proceden de cultivos celulares infectados usando los cebadores de amplificación de PCR siguientes:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 34 5’ AGTGYTRCCMCARGGCGCTGAA 3’, que corresponde a un cebador PCR MSRV-2 5’, para PCR sobre extracción de cultivos,
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 35 5’ GMGGCCAGCAGSAKGTCATCCA 3’, que corresponde a un cebador PCR MSRV-2 3’, para PCR sobre extracción de cultivos,
y los oligonucleótidos de captura con un enlace amina en dirección 5’ cpV2, y de detección biotinilado dpV2, que tienen por secuencias respectivas:
- -
- cpV2 identificado mediante la SEC ID nº 36
5 GGATGCCGCCTATAGCCTCTAC 3’, que corresponde a un oligonucleótido de captura ELOSA de los productos de la PCR MSRV-2 efectuada con los cebadores SEC ID nº 34 y SEC ID nº 35, o eventualmente con los cebadores degenerados definidos por Shih (12),
- -
- dpV2 identificado mediante la SEC ID nº 37
5’ AAGCCTATCGCGTGCAGTTGCC 3’, que corresponde a un oligonucleótido de detección ELOSA de los productos de la PCR MSRV-2 efectuada con los cebadores SEC ID nº 34 y SEC ID nº 35, o eventualmente con los cebadores degenerados definidos por Shih (12).
Este sistema de amplificación PCR con un par de cebadores diferente de los que se han descrito anteriormente para la amplificación sobre muestras de pacientes, ha permitido confirmar la infección mediante MSRV-2 de cultivos in vitro y de muestras de ácidos nucleicos usadas para los trabajos de biologÃa molecular.
Por último, los primeros resultados de detección PCR del genoma de agentes patógenos y/o infecciosos, muestran que aparentemente un "virus" libre puede circular en el flujo sanguÃneo de pacientes en fase de brote agudo, fuera del sistema nervioso. Esto es compatible con la existencia casi-sistemática de "brechas" en la barrera hematoencefálica de los pacientes en fase activa de SEP.
EJEMPLO 7: OBTENCIÓN DE SECUENCIAS DEL GEN "env" DEL GENOMA RETROV�?RICO MSRV-1
Tal como ya se ha descrito en el ejemplo 5, se ha usado una técnica de PCR derivada de la técnica publicada por Frohman (19). La técnica derivada permite, con la ayuda de un cebador especÃfico en dirección 3’ del genoma a amplificar, alargar la secuencia hacia la región 5’ del genoma a analizar. Esta técnica variante se describe en la bibliografÃa de la compañÃa "Clontech Laboratories Inc., /Palo-Alto California, USA) suministrada con su producto "5’-AmpliFINDERTM RACE kit", que se ha usado en una fracción de virión purificado como se ha descrito anteriormente.
A fin de realizar una amplificación de la región 3’ del genoma retrovÃrico MSRV-1 abarcando la región del gen "env", se ha realizado un estudio para determinar una secuencia consenso en las regiones LTR del mismo tipo que las del retrovirus endógeno defectivo HSERV-9 (18, 24) con el que el retrovirus MSRV-1 presenta homologÃas parciales.
Se ha usado el mismo cebador 3’ especÃfico en el protocolo del kit para la sÃntesis del ADNc y la amplificación PCR; su secuencia es la siguiente:
GTGCTGATTGGTGTATTTACAATCC (SEC ID nº 45)
Se han realizado en una etapa, la sÃntesis del ADN complementario (ADNc) y la amplificación PCR monodireccional con el cebador anterior según el procedimiento descrito en la patente EP-A-0 569 272.
Los productos que proceden de la PCR se han extraÃdo después de la purificación sobre gel de agarosa según los métodos convencionales (17), y después se han resuspendido en 10 ml de agua destilada. Consistiendo una de las propiedades de la polimerasa Taq en añadir una adenina en el extremo 3’ de cada una de las dos hebras de ADN, el ADN obtenido ha sido directamente insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA CloningTM (British Biotechnology). Los 2 μl de disolución de ADN se han mezclado con 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 μl de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) y 1 μl de "TA DNA LIGASE". Esta mezcla se incubó durante una noche a 12ºC. Las siguientes etapas se realizaron según las instrucciones del kit TA Cloning® (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se replantaron para ser cultivadas y la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se escindió mediante una enzima de restricción apropiada y se analizó sobre gel de agarosa. Los plásmidos que tienen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, se seleccionaron para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning kit®. Después, se ha efectuado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "automatic sequencer, modelo 373 A Applied Biosystems según las instrucciones del fabricante.
Este enfoque técnico se ha aplicado a una muestra de virión concentrada como se describe a continuación, a partir de una mezcla de sobrenadantes de cultivo producidos por lÃneas linfoblastoides B tales como se describen en el ejemplo 2, establecidas a partir de linfocitos de pacientes que padecen SEP y que presentan una actividad de transcriptasa inversa detectable según la técnica descrita por Perron et al. (3): los sobrenadantes de cultivos se recogen dos veces por semana, se precentrifugan a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos para eliminar los restos celulares, y después se congelan a -80ºC o se usan tal cual para las siguientes etapas. Los sobrenadantes frescos o descongelados se centrifugan sobre un tampón de PBS-glicerol al 30% a 100.000 g durante 2 horas a 4ºC. Después de la eliminación del sobrenadante, el residuo sedimentado constituye la muestra de viriones concentrados, pero no purificados. El residuo asà obtenido se recoge entonces en un pequeño volumen de un tampón adecuado para la extracción de ARN. La reacción de sÃntesis de ADNc mencionada más arriba se realiza sobre este ARN extraÃdo de virión extracelular concentrado.
La amplificación de RT-PCR según la técnica citada anteriormente ha permitido obtener el clon FBd3 cuya secuencia identificada mediante la SEC ID nº 46 se representa en la figura 13.
En la figura 14, la homologÃa de secuencia entre el clon FBd3 y el retrovirus HSERV-9 se representa en la tabla matricial mediante un trazo lleno, para cualquier homologÃa parcial superior o igual a 65%. Se puede observar que existen homologÃas en las regiones flanqueantes del clon (con el gen pol en dirección 5’ y con el gen env y después el LTR en dirección 3’), pero que la región interna es totalmente divergente y no presenta ninguna homologÃa, incluso baja, con el gen "env" de HSERV-9. Además, aparece que el clon FBd3 contiene una región "env" más larga que la que se ha descrito para el endógeno defectivo HSERV-9; asÃ, se puede observar que la región divergente interna constituye un "inserto" entre las regiones de homologÃa parcial con los genes defectivos HSERV-9.
5 Se han definido cuatro oligonucleótidos, F1, B4, F6 y B1, para amplificar un ARN que procede de viriones concentrados de las cepas POL2 y MS7PG. Se han efectuado reacciones de control de manera que se controla la presencia de contaminantes (reacción sobre agua). La amplificación consiste en una primera etapa de RT-PCR según el protocolo descrito en la solicitud de patente EP-A-0 569 272, seguida de una segunda etapa de PCR
10 efectuada sobre 10 μl de producto de la primera etapa con cebadores internos en la primera región amplificada (PCR "anidada"). En el primer ciclo de RT-PCR, se usan los cebadores F1 y B4. En el segundo ciclo de PCR, se usan los cebadores F6 y B1. Los cebadores están posicionados como sigue:
15 Su composición es:
cebador F1: TGATGTGAACGGCATACTCACTG (SEC ID nº 47)
cebador B4: CCCAGAGGTTAGGAACTCCCTTTC (SEC ID nº 48)
20 cebador F6: GCTAAAGGAGACTTGTGGTTGTCAG (SEC ID nº 49) cebador B1: CAACATGGGCATTTCGGATTAG (SEC ID nº 50)
El producto de amplificación "anidada" obtenido y denominado "t pol" se representa en la figura 15, y corresponde a la secuencia SEC ID nº 51.
25 EJEMPLO 9: OBTENCIÓN DE NUEVAS SECUENCIAS, EXPRESADAS EN ARN EN LAS CÉLULAS EN CULTIVO QUE PRODUCEN MSRV-1, Y QUE COMPRENDEN UNA REGIÓN "env" DEL GENOMA RETROV�?RICO MSRV-1
30 Se ha realizado un banco de ADNc según el procedimiento descrito por el fabricante de los kit "cDNA synthesis module, cDNA rapid adaptator ligation module, cDNA rapid cloning module, lambda gt10 in vitro packaging module" (Amersham, ref RPN1256Y/Z, RPN1712, RPN1713, RPN1717, N334Z) a partir del ARN mensajero extraÃdo de células de una lÃnea linfoblastoide B tal como se describe en el ejemplo 2, establecida a partir de los linfocitos de un paciente que padece SEP y que presentan una actividad de transcriptasa inversa detectable según la técnica
35 descrita por Perron et al. (3).
Se han identificado oligonucleótidos para amplificar un ADNc clonado en el banco nucleico entra la región 3’ del clon PSJ17 (pol) y la región 5’ (LTR) del clon FBd3. Se han efectuado reacciones de control de manera que se controla la presencia de contaminantes (reacción sobre agua). Las reacciones de PCR efectuadas sobre los ácidos nucleicos
40 clonados en el banco con diferentes pares de cebadores han permitido amplificar una serie de clones que unen unas secuencias pol a las secuencias env o LTR de tipo MSRV-1.
Dos clones son representativos de las secuencias obtenidas en el banco de ADNc celular:
45 -el clon JLBc1, cuya secuencia SEC ID nº 52 se representa en la figura 16; -el clon JLBc2, cuya secuencia SEC ID nº 53 se representa en la figura 17.
Las secuencias de los clones JLBc1 y JLBc2 son homólogas a la del clon FBd3, asà como aparece en las figuras 18 y 19. La homologÃa entre el clon JLBc1 y el clon JLBc2 se representa en la figura 20.
50 Las homologÃas entre los clones JLBc1 y JLBc2 por una parte, y la secuencia HSERV9 por otra parte, se representan respectivamente en las figuras 21 y 22.
Se observa que la región de homologÃa entre JLB1 y JLB2 y FBd3 comprende, con algunas variaciones de
55 secuencia y de tamaño del "inserto", la secuencia suplementaria ausente ("insertada") en la secuencia env HSERV9, tal como se describe en el ejemplo 8.
Se observa asimismo que la región "pol" clonada es muy homóloga a HSERV-9, que no posee ninguna trama de lectura (teniendo en cuenta los errores de secuencias inducidos por las técnicas usadas, incluyendo el secuenciador automático) y diverge de las secuencias MSERV-1 obtenidas a partir de viriones. Puesto que estas secuencias se clonaron a partir del ARN de células que expresan partÃculas MSRV-1, es probable que procedan de elementos retrovÃricos endógenos emparentados a la familia ERV9; esto, aun más cuando los genes pol y env están presentes en un mismo ARN que, evidentemente, no es el ARN genómico MSRV-1. Ciertos de estos elementos ERV9 poseen unos LTR funcionales activables mediante virus replicativos que codifican para unos transactivadores homólogos o heterólogos. En estas condiciones, el parentesco entre MSRV-1 y HSERV-9 hace posible la transactivación de los elementos ERV9 endógenos defectivos (o no) por proteÃnas transactivadores MSRV-1 homólogas, incluso idénticas.
Dicho fenómeno puede inducir una interferencia vÃrica entre la expresión de MSRV-1 y los elementos endógenos emparentados. Dicha interferencia conduce generalmente a una expresión denominada "defectiva-interferente", de la que ciertas caracterÃsticas se han encontrado en los cultivos estudiados infectados por MSRV-1. Además, dicho fenómeno genera la expresión de polipéptidos, incluso de proteÃnas retrovÃricas endógenas que no son obligatoriamente toleradas por el sistema inmunitario. Dicho esquema de expresión aberrante de elementos endógenos emparentados a MSRV-1 e inducido por éste es susceptible de multiplicar los antÃgenos aberrantes y, por lo tanto, contribuir a la inducción de procesos autoinmunes tales como se observan en la SEP.
Sin embargo, es esencial notar que los clones JLBc1 y JLBc2 difieren de la secuencia ERV9 o HSERV-9 ya descrita, porque poseen una región env más larga que comprende una región suplementaria totalmente divergente de ERV9. Por lo tanto, se puede definir su parentesco con la familia endógena ERV9, pero constituyen evidentemente elementos originales, nunca descritos hasta ahora. En efecto, la interrogación de los bancos de datos de secuencias nucleicas disponibles en la versión nº 15 (1995) del programa "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) no ha permitido identificar ninguna secuencia homóloga conocida en la región env de estos clones.
EJEMPLO 10: OBTENCIÓN DE LAS SECUENCIAS SITUADAS EN LA REGIÓN 5’ pol Y 3’ gag DEL GENOMARETROV�?RICO MSRV-1
Tal como ya se ha descrito en el ejemplo 5, se ha usado una técnica de PCR derivada de la técnica publicada por Frohman (19). La técnica derivada permite, con la ayuda de un cebador especÃfico en dirección 3’ del genoma a amplificar, alargar la secuencia hacia la región 5’ del genoma a analizar. Esta variante técnica se describe en la documentación de la compañÃa "Clontech Laboratories Inc., (Palo-Alto California, USA) suministrada con su producto "5’-AmpliFINDER™ RACE Kit", que se ha usado sobre una fracción de virión purificado como se ha descrito anteriormente.
A fin de realizar una amplificación de la región 5’ del genoma retrovÃrico MSRV-1 que empieza en la secuencia pol ya secuenciada (clon F11-1) y que se extiende hacia el gen gag, se han definido unos cebadores especÃficos MSRV
1.
Los cebadores 3’ especÃficos usados en el protocolo del kit para la sÃntesis del ADNc y la amplificación PCR son respectivamente complementarios a las secuencias MSRV-1 siguientes:
ADNc: (SEC ID nº 54) CCTGAGTTCTTGCACTAACCC amplificación: (SEC ID nº 55) GTCCGTTGGGTTTCCTTACTCCT
Los productos que proceden de la PCR se han extraÃdo después de la purificación sobre gel de agarosa según los métodos habituales (17), y después se han resuspendido en 10 ml de agua destilada. Consistiendo una de las propiedades de la polimerasas Taq en añadir una adenina en el extremo 3’ de cada una de las dos hebras de ADN, el ADN obtenido se ha insertado directamente en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning™ (British Biotechnology). Se han mezclado los 2 μl de disolución de ADN con 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 μl de "pCR™ VECTOR" (25 ng/ml) y 1 μl de "TA DNA LIGASE". Se ha incubado esta mezcla durante una noche a 12ºC. Se han realizado las siguientes etapas según las instrucciones del kit TA Cloning® (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se han recultivado para permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se ha escindido mediante una enzima de restricción apropiada y se ha analizado sobre gel de agarosa. Se han seleccionado los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel de bromuro de etidio, para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning Kit®. Después, se ha efectuado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "Automatic Sequencer, modelo 373 A Applied Biosystems según las instrucciones del fabricante.
Este enfoque técnico se ha aplicado a una muestra de virión concentrado como se describe a continuación, a partir de una mezcla de sobrenadantes de cultivo producidos mediante lÃneas linfoblastoides B tales como se describen en el ejemplo 2, establecidas a partir de los linfocitos de pacientes que padecen SEP y que presentan una actividad de transcriptasa inversa detectable según la técnica descrita por Perron et al. (3): los sobrenadantes de cultivos se recogen dos veces por semana, se precentrifugan a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos para eliminar los restos celulares, y después se congelan a -80ºC o se usan tal cual para las siguientes etapas. Los sobrenadantes frescos o descongelados se centrifugan sobre un tampón de PBS-glicerol 30% a 100.000 g durante 2 horas a 4ºC. Después de la eliminación del sobrenadante, el residuo sedimentado constituye la muestra de viriones concentrados, pero no purificados. El residuo asà obtenido se recoge entonces en un pequeño volumen de un tampón adecuado para la extracción de ARN. La reacción de sÃntesis de ADNc mencionada anteriormente se realiza sobre este ARN extraÃdo de virión extracelular concentrado.
La amplificación de RT-PCR según la técnica citada anteriormente, ha permitido obtener el clon GM3 cuya secuencia identificada mediante la SEC ID nº 56 se representa en la figura 23.
En la figura 24, la homologÃa de secuencia entre el clon GMP3 y el retrovirus HSERV-9 se representa en la tabla matricial mediante un trazo lleno, para cualquier homologÃa parcial superior o igual a 65%.
En sÃntesis, en la figura 25 se representa la localización de los diferentes clones anteriormente estudiados, con relación al genoma ERV9 conocido. En la figura 25, siendo la región env MSRV-1 más larga que el gen env de ERV9 de referencia, la región suplementaria se representa por encima del punto de inserción según una "V", entendiéndose que el material insertado presenta una variabilidad de secuencia y de tamaño entre los clones representados (JLBc1, JLBc2, FBd3). Y en la figura 26 se representa la posición de diferentes clones estudiados en la región MSRV-1 pol*.
Gracias al clon GM3 descrito anteriormente, se ha podido definir una posible trama de lectura, que cubre el conjunto del gen pol, referenciado según la SEC ID nº 57, representado en las figuras sucesivas 27a a 27c.
EJEMPLO 11: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPEC�?FICOS ANTI-MSRV-1 EN EL SUERO HUMANO
La identificación de la secuencia del gen pol del retrovirus MSRV-1 y de una trama de lectura abierta de este gen ha permitido determinar la secuencia SEC ID nº 39 de aminoácidos de una región de dicho gen, referenciada SEC ID nº 40 (véase la figura 28).
Se han ensayado diferentes péptidos sintéticos que corresponden a fragmentos de la secuencia proteica de la transcriptasa inversa MSRV-1 codificada por el gen pol, para su especificidad antigénica frente a sueros de pacientes que padecen SEP y de pacientes de control sanos.
Se han sintetizado los péptidos quÃmicamente mediante sÃntesis en fase sólida, según la técnica de Merrifield (Barany G. y Merrifield R.B, 1980, en The Peptides, 2, 1-284, Gross E y Meienhofer J, Eds Academic Press, Nueva York). Las modalidades prácticas son las descritas a continuación.
a) SÃntesis de los péptidos:
Se han sintetizado los péptidos sobre una resina de fenilacetamidometilo (PAM)/poliestireno/divinilbenceno (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) usando un sintetizador automático "Applied Biosystems 430A". Los aminoácidos se enlazan en forma de ésteres de hidroxibenzotriazol (HOBT). Los aminoácidos usados proceden de Novabiochem (Laüflerlfingen, Suiza) o de Bachem (Bubendorf, Suiza).
La sÃntesis quÃmica se ha efectuado usando un protocolo de doble enlace con la N-metilpirrolidona (NMP) como disolvente. Los péptidos se han escindido de la resina asà como las protecciones laterales, de manera simultánea, con la ayuda de ácido fluorhÃdrico (HF) en un aparato apropiado (aparato de escisión de tipo I, Peptide Institute, Osaka, Japón).
Para 1 g de peptidilresina, 10 ml de HF, se usan 1 ml de anisol y 1 ml de dimetilsulfuro 5DMS. La mezcla se agita durante 45 minutos a -2ºC. Entonces, se evapora el HF a vacÃo. Después de lavados intensivos con éter, el péptido se eluye de la resina mediante ácido acético al 10%, y después se liofiliza.
Los péptidos se purifican mediante cromatografÃa lÃquida ultrarrápida preparativa sobre una columna VYDAC de tipo C18(250 x 21 mm) (The Séparation Group, Hesperia, CA, USA). La elución se realiza mediante un gradiente de acetonitrilo con un caudal de 22 ml/min. Las fracciones recogidas se controlan mediante una elución en condición isocrática sobre una columna VYDAC® C18 analÃtica (250 x 4,6 mm) con un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que presentan el mismo tiempo de retención se reúnen y se liofilizan. Después, se analiza la fracción mayoritaria mediante cromatografÃa lÃquida ultrarrápida analÃtica, con el sistema descrito anteriormente. El péptido que se considera como de pureza aceptable se traduce por un pico único que representa 95% mÃnimo del cromatograma.
Después, se analizan los péptidos purificados con el objeto de controlar su composición de aminoácidos, con la ayuda de un analizador de aminoácidos automático Applied Biosystems 420H. La medición de la masa molecular quÃmica (media) de los péptidos se obtiene usando la espectrometrÃa de masas L.S.I.M.S en modo de ión positivo en un instrumento de doble focalización VG. ZAB.ZSEQ unido a un sistema de adquisición DEC-VAX 2000 (VG analytical Ltd, Manchester, Inglaterra).
La reactividad de los diferentes péptidos se ha ensayado contra sueros de pacientes que padecen SEP y contra sueros de pacientes de control sanos. Esto ha permitido seleccionar un péptido denominado POL2B cuya secuencia se representa en la figura 28 en el identificador SEC ID nº 39 siguiente, codificado por el gen pol de MSRV-1 (nucleótidos 181 a 330).
b) Propiedades antigénicas:
Las propiedades antigénicas del péptido POL2B se han demostrado según el protocolo de ELISA descrito a continuación.
El péptido POL2B liofilizado se ha disuelto en agua destilada estéril con una concentración de 1 mg/ml. Esta disolución madre se ha alicuotado y se ha guardado a +4ºC para el uso dentro de una quincena de dÃas, o se ha congelado a -20ºC, para un uso dentro de los dos meses. Se ha diluido una alÃcuota en una disolución de PBS (Phosphate Buffer Saline) a fin de obtener una concentración final de péptido de 1 microgramo/ml. Se disponen 100 microlitros de esta dilución en cada pocillo de placas de microtitulación (plástico "high-binding", COSTAR ref. 3590). Las placas se recubren con un adhesivo de tipo "plate-sealer" y se mantienen durante una noche a +4ºC, para la fase de adsorción del péptido sobre el plástico. El adhesivo se quita y las placas se lavan tres veces con un volumen de 300 microlitros de una disolución A (PBS 1x, 0,05% de Tween 20®), después se les da la vuelta sobre una tela absorbente. Las placas asà escurridas se llenan con 200 microlitros por pocillo de una disolución B (disolución A + 10% de suero de cabra), y después se recubren con un adhesivo y se incuban durante 45 minutos a 1 hora, a 37ºC. Después, las placas se lavan tres veces con la disolución A, como se ha descrito anteriormente.
Las muestras de suero a ensayar se diluyen previamente al 1/50 en la disolución B, y 100 microlitros de cada suero diluido a ensayar se depositan en los pocillos de cada placa de microtitulación. Se deposita un control negativo en un pocillo de cada placa, en forma de 100 microlitros de tampón B. Las placas recubiertas con un adhesivo se incuban entonces durante 1 a 3 horas, a 37ºC. Después, las placas se lavan tres veces con la disolución A, como se ha descrito anteriormente. Paralelamente, se diluye un anticuerpo de cabra marcado con peroxidasa y dirigido contra los IgG (Sigma Immunochemicals ref. A6029) o los IgM (Cappel ref. 55228) humanos en la disolución B (dilución 1/5000 para el anti-IgG y 1/1000 para el anti-IgM). Entonces, se depositan 100 microlitros de la dilución adecuada del anticuerpo marcado en cada pocillo de las placas de microtitulación, y las placas recubiertas con un adhesivo se incuban durante 1 a 2 horas, a 37ºC. Después, se efectúa nuevamente un lavado de las placas como se ha descrito anteriormente. Paralelamente, el sustrato de la peroxidasa se prepara según las indicaciones del kit "Sigma fast OPD kit" (Sigma Immunochemicals, ref. P9187). Se depositan 100 microlitros de disolución-sustrato en cada pocillo, y las placas se colocan al abrigo de la luz durante 20 a 30 minutos, a temperatura ambiente.
Una vez la reacción coloreada se ha estabilizado, las placas se colocan inmediatamente en un lector espectrofotómetro de placas ELISA, y la densidad óptica (D.O.) de cada pocillo se lee con una longitud de onda de 492 nm. Alternativamente, se depositan 30 microlitros de HCL 1N en cada pocillo para detener la reacción, y las placas se leen mediante el espectrofotómetro en las 24 horas.
Las muestras serológicas se disponen en doble o en triple, y se calcula la densidad óptica (D.O.) que corresponde al suero ensayado calculando la media de las D.O. obtenidas para una misma muestra, con la misma dilución.
La D.O. neta de cada suero corresponde a la D.O. media del suero de la que se resta la D.O. media del control negativo (disolución B: PBS, 0,05% de Tween 20®, 10% de suero de cabra).
c) Detección de anticuerpos IgG anti-MSRV-1 mediante ELISA
Se ha usado la técnica descrita anteriormente con al péptido POL2B para buscar la presencia de anticuerpos IgG especÃficos anti-MSRV-1 en el suero de 29 pacientes, para los cuales se ha hecho un diagnóstico cierto o probable de SEP según los criterios de Poser (23), y de 32 controles sanos (donantes de sangre).
En la figura 29, se representan los resultados de cada suero ensayado con un anticuerpo anti-IgG. Cada barra vertical representa la densidad óptica (D.O. a 492 nm) neta de un suero ensayado. El eje de ordenadas indica la
D.O. neta en el pico de las barras verticales. Las 29 primeras barras verticales situadas a la izquierda de la lÃnea punteada vertical, representan los sueros de 29 casos de SEP ensayados, y las 32 barras verticales situadas a la derecha de la lÃnea punteada vertical, representan los sueros de 32 controles sanos (donantes de sangre).
La media de las D.O. netas de los SEP ensayadas es de: 0,62. La gráfica permite visualizar 5 controles cuya D.O. neta emerge por encima de los valores agrupados de la población de control. Estos valores pueden representar la presencia de IgG especÃficos en pacientes seropositivos no-enfermos. Por lo tanto, se han evaluado dos métodos para determinar el umbral estadÃstico de positividad del ensayo.
La media de las D.O. netas de los controles, incluyendo los controles con D.O. netas elevadas, es de 0,36. Sin los 5 controles cuyas D.O. netas son superiores o iguales a 0,5, la media de los controles "negativos" es de 0,33. La desviación tÃpica de los controles negativos es de 0,10. Se puede calcular un umbral de positividad teórica según la fórmula:
5 valor umbral (media de las D.O. netas de los controles seronegativos) + (2 ó 3 desviaciones tÃpicas de las D.O. netas de los controles seronegativos)
En el primer caso, se considera que existen seropositivos no-enfermos, y el valor umbral es igual a: 0,33 + (2 x 0,10) = 0,53. Los resultados negativos representan un "ruido de fondo" no especÃfico de la presencia de anticuerpos 10 especÃficamente dirigidos contra un epÃtopo del péptido.
En el segundo caso, si el conjunto de los controles constituidos por donantes de sangre con una buena salud aparente se toma como base de referencia, sin excluir los sueros a priori seropositivos, la desviación tÃpica de los "controles no-SEP" es de 0,116. Entonces, el valor umbral es: 0,36 + (2 x 0,116) = 0,59.
15 Según este análisis, el ensayo es especÃfico de la SEP. En este aspecto, se constata que el ensayo es especÃfico de la SEP, puesto que tal como se muestra en la tabla 1, ningún control tiene una D.O. neta por encima de este umbral. Realmente, este resultado refleja el hecho de que las titulaciones de los anticuerpos en los pacientes que padecen SEP son mayoritariamente más elevadas que en los controles sanos que han estado en contacto con MSRV-1.
20 TABLA nº 1
- SEP
- CONTROLES
- 0,681
- 0,3515
- 1,0425
- 0,56
- 0,5675
- 0,3565
- 0,63
- 0,449
- 0,588
- 0,2825
- 0,645
- 0,55
- 0,6635
- 0,52
- 0,576
- 0,2535
- 0,7765
- 0,55
- 0,5745
- 0,51
- 0,513
- 0,426
- 0,4325
- 0,451
- 0,7255
- 0,227
- 0,859
- 0,3905
- 0,6435
- 0,265
- 0,5795
- 0,4295
- 0,8655
- 0,291
- 0,671
- 0,347
- 0,596
- 0,4495
- 0,652
- 0,3725
- 0,602
- 0,181
- 0,525
- 0,2725
- 0,53
- 0,426
- 0,565
- 0,1915
- 0,517
- 0,222
- 0,607
- 0,395
- 0,3705
- 0,34
- 0,397
- 0,307
- 0,4395
- 0,219
- 0,491 0,491
- 0,2265
- 0,2605
- MEDIA
- 0,62 0,33
- DESVIACIÓN T�?PICA
- 0,14 0,10
- VALOR UMBRAL
- 0,53
En función del primer modo de cálculo y como se representa en la figura 29 y en la tabla correspondiente 1, 26 de
25 los 29 sueros SEP dan un resultado positivo (D.O. neta superior o igual a 0,50) indicando la presencia de IgG especÃficamente dirigidos contra el péptido POL2B, por lo tanto contra una parte de la enzima de transcriptasa inversa del retrovirus MSRV-1 codificada por su gen pol y, por consiguiente, contra el retrovirus MSRV-1, AsÃ, aproximadamente 90% de los pacientes SEP ensayados han reaccionado contra un epÃtopo portado por el péptido POL2B y presentan IgG circulantes dirigidos contra este último.
Cinco donantes de sangre, aparentemente con una buena salud, de 32 presentan un resultado positivo. AsÃ, aparece que aproximadamente 15% de la población no-enferma puede haber estado en contacto con un epÃtopo portado por el péptido POL2B en condiciones que han llevado a una inmunización activa que se traduce por la persistencia de IgG séricos especÃficos. Estas condiciones son compatibles con una inmunización contra la transcriptasa inversa del retrovirus MSRV-1, durante una infección por el (y/o reactivación del) retrovirus MSRV-1. La ausencia de patologÃa neurológica aparente que evoca la SEP en estos controles seropositivos puede indicar que son portadores sanos, que han eliminado un virus infeccioso después de haberse inmunizado o que constituyen una población con riesgo de portadores crónicos. En efecto, los datos epidemiológicos que muestran que un agente patógeno presente en el entorno de las regiones con alta preponderancia de SEP puede ser la causa de esta enfermedad, implican que una fracción de la población libre de SEP ha estado necesariamente en contacto con dicho agente patógeno. Se ha demostrado que el retrovirus MSRV-1 constituye la totalidad o parte de este "agente patógeno" origen de la SEP, y es por lo tanto normal que unos controles tomados en una población sana presenten anticuerpos de tipo IgG contra componentes del retrovirus MSRV-1. AsÃ, la diferencia de seropreponderancia entre los SEP y la población de control es extremadamente significativa: ensayo "chi-2", p<0,001. Estos resultados están por lo tanto a favor de un papel etiopatogénico de MSRV-1 en la SEP.
d) Detección de anticuerpos IgM anti-MSRV-1 mediante ELISA
Se ha usado la técnica de ELISA con el péptido POL2B para buscar la presencia de anticuerpos especÃficos IgM anti-MSRV-1 en el suero de 36 pacientes, para los cuales se ha hecho un diagnóstico cierto o probable de SEP según los criterios de Poser (23), y de 42 controles sanos (donantes de sangre).
En la figura 30, se representan los resultados de cada suero ensayado con un anticuerpo anti-IgM. Cada barra vertical representa la densidad óptica (D.O. a 492 nm) neta de un suero ensayado. El eje de ordenadas indica la
D.O. neta en el pico de las barras verticales. Las 36 primeras barras verticales situadas a la izquierda de la lÃnea vertical que corta el eje de abscisas representan los sueros de 36 casos de SEP ensayados, y las barras verticales situadas a la derecha de la lÃnea discontinua vertical representan los sueros de 42 controles sanos (donantes de sangre). La lÃnea horizontal trazada en el medio de la gráfica representa un umbral teórico que delimita los resultados positivos (cuyo pico de la barra se sitúa por encima), y los resultados negativos (cuyo pico de la barra se sitúa por debajo).
La media de las D.O. netas de las SEP ensayadas es de: 0,19.
La media de las D.O. netas de los controles es de: 0,09.
La desviación tÃpica de los controles negativos es de: 0,05.
Debido a la pequeña diferencia entre la media y la desviación tÃpica de los controles, el umbral de positividad teórico se puede calcular según la fórmula:
valor umbral = (media de las D.O. netas de los controles seronegativos) + (3 x desviación tÃpica de las D.O. netas de los controles seronegativos)
El valor umbral es, por lo tanto, igual a 0,09 + (3 x 0,05) = 0,26; es decir, en la práctica, 0,25.
Los resultados negativos representan un "ruido de fondo" no especÃfico de la presencia de anticuerpos especÃficamente dirigidos contra un epÃtopo del péptido.
Según este análisis y como se muestra en la figura 30 y en la tabla 2 correspondiente, el ensayo IgM es especÃfico de la SEP, puesto que ningún control tiene una D.O. neta por encima del umbral. Siete de los 36 sueros SEP producen un resultado IgM positivo; ahora bien, el estudio de los datos clÃnicos revela que estos sueros positivos se han extraÃdo durante un primer brote de SEP o de un brote agudo en enfermos no tratados. Se sabe que los IgM dirigidos contra agentes patógenos se producen durante las primeras infecciones o durante las reactivaciones tras una fase de latencia de dicho agente patógeno.
La diferencia de seropreponderancia entre las SEP y la población de control es extremadamente significativa: ensayo "chi-2", p<0,001.
Estos resultados están a favor de un papel etiopatogénico de MSRV-1 en la SEP.
La detección de los anticuerpos IgM e IgG contra el péptido POL2B permite evaluar la evolución de una infección mediante MSRV-1 y/o de la reactivación vÃrica de MSRV-1.
TABLA nº 2
- SEP
- CONTROLES
- 0,064
- 0,243
- 0,087
- 0,11
- 0,044
- 0,098
- 0,115
- 0,028
- 0,089
- 0,094
- 0,025
- 0,038
- 0,097
- 0,176
- 0,108
- 0,146
- 0,018
- 0,049
- 0,234
- 0,161
- 0,274
- 0,113
- 0,225
- 0,079
- 0,314
- 0,093
- 0,522
- 0,127
- 0,306
- 0,02
- 0,143
- 0,052
- 0,375
- 0,062
- 0,142
- 0,074
- 0,157
- 0,043
- 0,168
- 0,046
- 1,051
- 0,041
- 0,104
- 0,13
- 0,187
- 0,153
- 0,044
- 0,107
- 0,053
- 0,178
- 0,153
- 0,114
- 0,07
- 0,078
- 0,033
- 0,118
- 0,104
- 0,177
- 0,187
- 0,026
- 0,044
- 0,024
- 0,053
- 0,046
- 0,153
- 0,116
- 0,07
- 0,04
- 0,033
- 0,028
- 0,973
- 0,073
- 0,008
- 0,074
- 0,141
- 0,219
- 0,047
- 0,017
- MEDIA
- 0,19 0,09
- DESVIACIÓN T�?PICA
- 0,23 0,05
- VALOR UMBRAL
- 0,26
e) Búsqueda de epÃtopos inmunodominantes en el péptido POL2B:
5 Con el fin de reducir el ruido de fondo no especÃfico y de optimizar la detección de las respuestas de los anticuerpos anti-MSRV-1, se ha realizado la sÃntesis de octapéptidos, sucesivamente desplazados de un aminoácido, que cubren el conjunto de la secuencia determinada mediante POL2B, según el protocolo descrito a continuación.
10 Se ha realizado la sÃntesis quÃmica de octapéptidos solapantes que cubren la secuencia de aminoácidos 61-110 representada en el identificador SEC ID nº 39 en una membrana de celulosa activada según la técnica de BERG et al. (1989. J. Ann. Chem. Soc., 111, 8024-8026) comercializada por Cambridge Research Biochemicals con la denominación comercial Spotscan. Esta técnica permite la sÃntesis simultánea de un gran número de péptidos y su análisis.
15 La sÃntesis se realiza con aminoácidos esterificados cuyo grupo α-amina está protegido por un grupo FMOC (Nova
Biochem), y los grupos laterales por grupos protectores tales como tritilo, éster de t-butilo o éter de t-butilo. Los aminoácidos se solubilizan en N-metil-pirrolidona (NMP) a la concentración de 300 nM, y se depositan 0,9 μl a nivel de los puntos de depósito de azul de bromofenol. Después de una incubación de 15 minutos, se realiza nuevamente un depósito de aminoácidos seguido de otra incubación de 15 minutos. Si se efectúa el enlace entre dos aminoácidos correctamente, se observa una modificación de la coloración (paso del azul al verde-amarillo). Después de tres lavados en DMF, se efectúa una etapa de acetilación mediante anhÃdrido acético. Se desprotegen a continuación los grupos aminados terminales de los péptidos en curso de sÃntesis mediante piperidina al 20% en DMF. Los puntos de depósito se recolorean mediante una disolución de azul de bromofenol al 1% en DMF, se lavan tres veces con metanol y se secan. El conjunto de estas operaciones constituye un ciclo de adición de un aminoácido, y este siclo se repite hasta el final de la sÃntesis. Cuando se han añadido todos los aminoácidos, se desprotege el grupo NH2-terminal del último aminoácido mediante piperidina al 20% en DMF, y se acetila mediante anhÃdrido acético. Los grupos protectores de la cadena lateral se retiran mediante una mezcla de diclorometano/ácido trifluoroacético/triisobutilsilano (5 ml/5 ml/250 μl). Después se ensaya la inmunorreactividad de los péptidos mediante ELISA.
Después de la doble sÃntesis de los diferentes octapéptidos sobre dos membranas diferentes, estas últimas se aclaran con metanol y se lavan en TBS (Tris 0,1M pH 7,2), y después se incuban durante una noche a temperatura ambiente en un tampón de saturación. Después de varios lavados en TBS-T (tris 0,1M pH 7,2 -0,05% de Tween 20), se incuba una membrana con una disolución al 1/50 de un suero de referencia que procede de un paciente que padece SEP, y la otra membrana con una dilución al 1/50 de un grupo de sueros de controles sanos. Las membranas se incuban durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de los lavados con TBS-T, se añade un conjugado anti-inmunoglobulinas humanas marcado con β-galactosidasa (comercializado por Cambridge Research Biomedicals) a una dilución al 1/200, y el conjunto se incuba durante dos horas a temperatura ambiente. Después de los lavados de las membranas con TBS-T 0,05% y PBS, se revela la inmunorreactividad a nivel de los diferentes puntos mediante adición de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactopiranosida en potasio. La intensidad de coloración de los puntos se estima cualitativamente con un valor relativo de 0 a 5, como se representa en las figuras 31 a 33 anexas.
AsÃ, se puede determinar dos regiones inmunodominantes en cada extremo del péptido POL2B que corresponden respectivamente a las secuencias de aminoácidos 65-75 (SEC ID nº 41) y 92-109 (SEC ID nº 42), según la figura 34, y comprendidas respectivamente entre los octapéptidos Phe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp (FCIPVRPD) y Arg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe (RPDSQFLF), y Thr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg (TVLPQGFR) y Leu-Phe-Gly-Gln-Ala-Leu-Ala-Gln (LFGQALAQ) y una región menos activa, pero aparentemente más especÃfica, debido a que no produce ningún ruido de fondo con el suero de control, representada mediante los octapéptidos Leu-Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu (LFAFEDPL) (SEC ID nº 43) y Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn (FAFEDPLN) (SEC ID nº 44).
Estas regiones permiten definir nuevos péptidos más especÃficos y más inmunorreactivos según las técnicas habituales.
AsÃ, es posible, gracias a los descubrimientos efectuados y a los métodos llevados a cabo por los inventores, realizar un diagnóstico de la infección y/o de la reactivación MSRV-1, y evaluar una terapia en la SEP en base a su eficacia para "hacer negativa" la detección de estos agentes en los fluidos biológicos de los pacientes. Además, la detección precoz en personas que no presentan todavÃa señales neurológicas de SEP, podrÃa permitir instaurar un tratamiento tanto más eficaz de la evolución clÃnica posterior por cuanto que precederÃa el estado lesional que corresponde a la aparición de los trastornos neurológicos. Ahora bien, hoy en dÃa, no se puede establecer un diagnóstico de SEP antes de la instalación de una sintomatologÃa neurológica lesional y, por lo tanto, no se ha instaurado ningún tratamiento antes de la emergencia de una clÃnica evocadora de lesiones del sistema nervioso central ya consecuentes. El diagnóstico de una infección y/o de una reactivación de MSRV-1 y/o MSRV-2 en el ser humano es por lo tanto determinante, y la presente invención suministra los medios para ello.
AsÃ, es posible, además de realizar un diagnóstico de la infección y/o de la reactivación de MSRV-1, evaluar una terapia en la SEP en base a su eficacia en "hacer negativa" la detección de estos agentes en los fluidos biológicos de los pacientes.
EJEMPLO 12: OBTENCIÓN DE UN CLON LB19 QUE CONTIENE UNA PARTE DEL GEN GAG DEL RETROVIRUS MSRV-1
Se ha usado una técnica de PCR derivada de la técnica publicada por Gonzalez-Quintial R. et al. (19) y PLAZA et al. (25). A partir de los ARN totales extraÃdos de una fracción de virión purificado como se ha descrito anteriormente, se ha sintetizado el ADNc con la ayuda de un cebador especÃfico (SEC ID nº 64) en dirección 3’ del genoma a amplificar, usando la EXPANDTM REVERSE TRANSCRIPTASE (BOEHRINGER MANNHEIM).
ADNc: AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT (SEC ID nº 65) (anti-sentido)
Después de la purificación, se ha añadido una cola poli G en el extremo 5’ del ADNc con la ayuda del kit "Terminal transferases kit" comercializado por la compañÃa Boehringer Mannheim, según el protocolo del fabricante.
Se ha realizado una PCR de anclaje con la ayuda de los cebadores 5’ y 3’ siguientes:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CACCCCCCCC CCCCCC (SEC ID nº 91) (sentido), AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT (SEC ID nº 64) (anti-sentido)
Después, se ha realizado una PCR de anclaje semi-anidada con los cebadores 5’ y 3’ siguientes:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CA (SEC ID nº 92) (sentido), y AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT (SEC ID nº 64) (anti-sentido)
Los productos que proceden de la PCR se han purificado después de la purificación sobre gel de agarosa según los métodos habituales (17), y después se han resuspendido en 10 microlitros de agua destilada. Consistiendo una de las propiedades de la polimerasa Taq en añadir una adenina en el extremo 3’ de cada una de las dos hebras de ADN, el ADN obtenido se ha insertado directamente en un plásmido con la ayuda del kit TA CloningTM (British Biotechnology). Se han mezclado los 2 μl de disolución de ADN con 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 μl de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) y 1 μl de "T4DNA LIGASE". Esta mezcla se ha incubado durante una noche a 12ºC. Las siguientes etapas se han realizado según las instrucciones del kit TA Cloning® (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se han replantado para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se ha escindido mediante una enzima de restricción apropiada, y se ha analizado sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, se han seleccionado para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning kit®. Después se ha efectuado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "Automatic sequencer, modelo 373 A" Applied Biosystems según las instrucciones del fabricante.
Se ha usado la amplificación PCR según la técnica citada anteriormente sobre un ADNc sintetizado a partir de los ácidos nucleicos de fracciones de partÃculas infecciosas purificadas en un gradiente de sacarosa, según la técnica descrita por H. Perron (13), a partir de sobrenadantes de cultivo de linfocitos B de un paciente que padece SEP, inmortalizado por la cepa B95 del virus de Epstein-Barr (EBV), y que expresa unas partÃculas retrovÃricas asociadas con una actividad de transcriptasa inversa tal como la descrita por Perron et al. (3) y en las solicitudes de patentes francesas SEP 10, 11 y 12. El clon LB19 cuya secuencia identificada mediante SEC ID nº 59 se representa en la figura 35.
Este clon permite definir, con el clon GM3 previamente secuenciado y el clon G+E+A (véase el Ejemplo 15), una región de 690 pares de bases representativa de una parte significativa del gen gag del retrovirus MSRV-1, tal como se representa en la figura 36. Esta secuencia denominada SEC ID nº 88 está reconstituida a partir de diferentes clones que se solapan en sus extremos. Esta secuencia se identifica con la denominación región MSRV-1 "gag*". En la figura 36, se representa una trama de lectura potencial con la traducción en aminoácidos por debajo de la secuencia de ácidos nucleicos.
EJEMPLO 13: OBTENCIÓN DE UN CLON FBd13 QUE CONTIENE UNA REGIÓN DE GENE pol EMPARENTADA AL RETROVIRUS MSRV-1, Y UNA REGIÓN ENV APARENTEMENTE INCOMPLETA QUE CONTIENE UNATRAMA DE LECTURA (ORF) POTENCIAL PARA UNA GLUCOPROTE�?NA
Extracción de los ARN vÃricos: Se han extraÃdo los ARN según el método brevemente descrito a continuación.
Se centrifuga un "grupo" de sobrenadante de cultivo de linfocitos B de pacientes que padecen SEP (650 ml) durante 30 minutos a 10.000 g. El residuo vÃrico obtenido se resuspende en 300 microlitros de PBS/10 mM de MgCl2. El material se trata mediante una mezcla ADNasa (100 mg/ml)/ARNsa (50 mg/ml) durante 30 minutos a 37ºC, y después mediante proteinasa K (50 mg/ml) durante 30 minutos a 46ºC.
Se extraen los ácidos nucleicos mediante un volumen de una mezcla de fenol/SDS al 0,1% (v/v) calentado a 60ºC, y después se extraen de nuevo mediante un volumen de fenol/cloroformo (1/1; v/v).
La precipitación del material se efectúa mediante 2,5 V de etanol en presencia de 0,1 V de acetato de sodio pH = 5,2. El residuo obtenido después de la centrifugación se resuspende en 50 microlitros de agua DEPC estéril.
La muestra se trata nuevamente mediante 50 mg/ml de ADNasa "ARNase free" durante 30 minutos a temperatura ambiente, se extrae mediante un volumen de fenol/cloroformo, y se precipita en presencia de acetato de sodio y de etanol.
El ARN obtenido se cuantifica mediante lectura de D.O. a 260 nm. La presencia de MSRV-1 y la ausencia de contaminante ADN se controlan mediante una PCR y una RTPCR MSRV-1 especÃfica asociada a una ELOSA especÃfica del genoma MSRV-1.
SÃntesis de ADNc:
Se usan 5 mg de ARN para sintetizar un ADNc cebado mediante un oligonucleótido polidT según las instrucciones del kit "cDNA Synthesis Module" (ref. RPN 1256, Amersham) con algunas modificaciones: la retrotranscripción se efectúa a 45ºC en lugar de los 42ºC recomendados.
El producto de sÃntesis se purifica mediante una doble extracción y una doble purificación siguiendo las instrucciones del fabricante.
La presencia de MSRV-1 se verifica mediante una PCR MSRV-1 asociada con una ELOSA especÃfica del genoma MSRV-1.
"Long distance PCR": (LD-PCR)
Se usan 500 ng de ADNc para la etapa de LD-PCR (Expand Long Template System; Boehringer (ref. 1681842)).
Se han usado varios pares de oligonucleótidos. Entre éstos, el par definido por los cebadores siguientes:
cebador 5’: GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G(SEC ID nº 66) cebador 3’: GTGCTGATTG GTGTATTTAC AATCC(SEC ID nº 67).
Las condiciones de amplificación son las siguientes:
94ºC durante 10 segundos 56ºC durante 30 segundos 68ºC durante 5 minutos;
Diez ciclos y después 20 ciclos con un incremento de 20 segundos a cada ciclo sobre el tiempo de elongación. Al final de esta primera amplificación, se someten 2 microlitros de producto de amplificación a una segunda amplificación en las mismas condiciones que las anteriores.
Las LD-PCR se llevan a un aparato PCR Perkin modelo 9600 en microtubos de pared fina (Boehringer).
Los productos de amplificación se controlan mediante electroforesis de 1/5 del volumen de amplificación (10 microlitros) en gel de agarosa al 1%. Para el par de cebadores descrito anteriormente, se obtiene una banda de aproximadamente 1,7 Kb.
Clonación del fragmento amplificado:
El producto de PCR se ha purificado mediante el paso sobre un gel de agarosa preparativo y después sobre una columna Costar (Spin; D. Dutcher) según las instrucciones del proveedor.
Se empalman 2 microlitros de la disolución purificada con 50 ng de vector PCRll según las instrucciones del proveedor (TA Cloning kit; British Biotechnology).
El vector recombinante obtenido se aÃsla mediante transformación de las bacterias DH5aF’ competentes. Las bacterias se seleccionan según su resistencia a la ampicilina y la pérdida del metabolismo para Xgal (= colonias blancas). La estructura molecular del vector recombinante se confirma mediante una minipreparación plasmÃdica, y se hidroliza mediante la enzima EcoR1.
Se ha seleccionado FBd13, un clon positivo para todos estos criterios. Se ha efectuado una preparación a gran escala del plásmido recombinante con la ayuda del kit Midiprep Quiagen (ref. 12243) según las instrucciones del proveedor.
La secuenciación del clon FBd3 se efectúa gracias al kit Prism Ready Amplitaq FS dye terminador Perkin (ref. 402119) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuencias se depositan en un secuenciador automático Perkin de tipo 377 ó 373A. La estrategia de secuenciación consiste en un "paseo sobre el gen" realizado sobre las dos hebras del clon FBd13.
La secuencia del clon FBd13 se identifica mediante la SEC ID nº 58.
En la figura 37, la homologÃa de secuencia entre el clon FBd13 y el retrovirus HSERV-9 se representa en la tabla matricial mediante un trazo lleno, para cualquier homologÃa parcial superior o igual a 70%. Se puede constatar que existen homologÃas en las regiones flanqueantes del clon (con el gen pol en dirección 5’ y con el gen env, y después LTR en dirección 3’), pero que la región interna es totalmente divergente y no presenta ninguna homologÃa, incluso baja, con el gen env de HSERV-9. Además, aparece que el clon FBd13 contiene una región "env" más larga que la que se describe para el endógeno defectivo HSERV-9; asÃ, se puede constatar que la región divergente interna constituye un "inserto" entre las regiones de homologÃa parcial con los genes defectivos HSERV-9.
Esta secuencia suplementaria determina una orf potencial, denominada ORF B13, representada mediante su secuencia de aminoácido SEC ID nº 87.
La estructura molecular del clon FBd13 se ha analizado con la ayuda del programa GeneWork y de los bancos de datos Genebank y SwissProt.
Se han encontrado 5 sitios de glucosilación.
La proteÃna no tiene ninguna homologÃa significativa con unas secuencias ya conocidas.
Es probable que es clon proceda de una recombinación con un elemento retrovÃrico endógeno (ERV), relacionado con la replicación de MSRV-1.
Dicho fenómeno genera la expresión de polipéptidos, incluso de proteÃnas retrovÃricas endógenas que no están necesariamente toleradas por el sistema inmunitario. Dicho esquema de expresión aberrante de elementos endógenos emparentados a MSRV-1 y/o inducida por éste es susceptible de multiplicar los antÃgenos aberrantes y, por lo tanto, contribuir a la inducción de procesos autoinmunes tales como se observan en la SEP. Evidentemente, constituye un elemento original nunca descrito hasta ahora. En efecto, la interrogación de los bancos de datos de secuencias nucleicas disponibles en la versión nº 19 (1996) del programa "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) no ha permitido identificar ninguna secuencia homóloga conocida que comprende el conjunto de la región env de este clon.
EJEMPLO 14: OBTENCIÓN DE UN CLON FP6 QUE CONTIENE UNA PARTE DEL GEN pol CON UNA REGIÓN QUE CODIFICA PARA LA ENZIMA DE TRANSCRIPTASA INVERSA HOMÓLOGA DEL CLON POL*MSRV-1, YUNA REGIÓN 3’pol DIVERGENTE DE LAS SECUENCIAS EQUIVALENTES DESCRITAS EN LOS CLONES POL*, tpol, FBd3, JLBc1 Y JLBc2
Se ha efectuado una 3’RACE sobre un ARN total extraÃdo de plasma de un paciente que padece SEP. Se ha usado como control negativo un plasma de control sano, tratado con las mismas condiciones. Se ha realizado la sÃntesis de ADNc con el cebador oligo dT modificado siguiente:
5’ GACTCGCTGC AGATCGATTT TTTTTTTTTT TTTT 3’ (SEC ID nº 68)
y la transcriptasa inversa "Expand RT" de Boehringer según las condiciones preconizadas por la compañÃa. Se ha efectuado una PCR con la enzima Klentaq (Clontech) con las siguiente condiciones: 94ºC durante 5 minutos y después 93ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto, 68ºC durante 3 minutos durante 40 ciclos y 68ºC durante 8 minutos y con un volumen de reacción final de 50 μl.
Cebadores usados para la PCR:
-cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 69
5’ GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT 3’;
-cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 68 (= la misma que para el ADNc)
Se ha realizado una segunda PCR denominada "semi-anidada" con un cebador 5’ situado en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda PCR se ha efectuado en las mismas condiciones experimentales que las usadas durante la primera PCR, usando 10 μl del producto de amplificación que procede de la primera PCR.
Cebadores usados para la PCR semi-anidada:
- -
- cebador 5’, identificado mediante la SEC ID nº 70 5’ CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT 3’;
- -
- cebador 3’, identificado mediante la SEC ID nº 68 (= la misma que para el ADNc)
Los cebadores SEC ID nº 69 y SEC ID nº 70 son especÃficos de la región pol*: posición nº 403 a nº 422 y nº 641 a nº 670 respectivamente.
AsÃ, se ha obtenido un producto de amplificación a partir del ARN extracelular extraÃdo del plasma de un paciente que padece SEP. El fragmento correspondiente no se ha observado para el plasma de un control sano. Este producto de amplificación se ha clonado de la siguiente manera.
El ADN amplificado se insertó en un plásmido con la ayuda del kit TA CloningTM. Se mezclaron los 2 μl de disolución de ADNcon 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 μl de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) y 1 μl de "TA DNA LIGASE". Esta mezcla se incubó durante una noche a 12ºC. Las siguientes etapas se realizaron según las instrucciones del kit TA CloningTM (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se replantaron para ser cultivadas y la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado de "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se escindió mediante una enzima de restricción apropiada y se analizó sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio se seleccionaron para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning kit®. Después, se ha realizado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "Automatic Sequencer, modelo 373 A" Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon obtenido, denominado FP6, permite definir una región de 467 pb homóloga en 89% a la región pol* del retrovirus MSRV-1, y una región de 1167 pg homóloga en 64% a la región pol de ERV-9 (nº 1634 a 2856).
El clon FP6 se representa en la figura 38 mediante su secuencia nucleotÃdica identificada mediante la SEC ID nº 61. Las tres tramas de lectura potenciales de este clon se representan mediante su secuencia de aminoácido debajo de la secuencia nucleotÃdica.
EJEMPLO 15: OBTENCIÓN DE UNA REGIÓN DENOMINADA G+E+A QUE CONTIENE UNA ORF PARA UNAPROTEASA RETROV�?RICA MEDIANTE AMPLIFICACIÓN PCR DE LA SECUENCIA NUCLEICA CONTENIDA ENTRE LA REGIÓN 5’ DEFINIDA POR EL CLON "GM3" Y LA REGIÓN 3’ DEFINIDA POR EL CLON POL*, APARTIR DEL ARN EXTRA�?DO DE UN GRUPO DE PLASMAS DE PACIENTES QUE PADECEN SEP
Se ha definido oligonucleótidos especÃficos de las secuencias MSRV-1 ya identificados por el solicitante para amplificar el ARN retrovÃrico de viriones presentes en el plasma de pacientes que padecen SEP. Se han efectuado reacciones de control a fin de controlar la presencia de contaminantes (reacción sobre agua). La amplificación consiste en una etapa de RT-PCR, seguida de una PCR "anidada". Se han definido pares de cebadores para amplificar tres regiones solapantes (denominadas G, E y A) en las regiones definidas por las secuencias de los clones GM3 y pol*, previamente descritos.
RT-PCR semi-anidada para la amplificación de la región G:
- -
- en el primer ciclo RT-PCR, se usan los siguientes cebadores:
cebador 1: SEC ID nº 71 (sentido)
cebador 2: SEC ID nº 72 (anti-sentido)
- -
- en el segundo ciclo PCR, se usan los siguientes cebadores:
cebador 1: SEC ID nº 73 (sentido)
cebador 4: SEC ID nº 74 (anti-sentido)
RT-PCR anidada para la amplificación de la región E:
- -
- en el primer ciclo RT-PCR, se usan los siguientes cebadores:
cebador 5: SEC ID nº 75 (sentido)
cebador 6: SEC ID nº 76 (anti-sentido)
- -
- en el segundo ciclo PCR, se usan los siguientes cebadores:
cebador 7: SEC ID nº 77 (sentido)
cebador 8: SEC ID nº 78 (anti-sentido)
RT-PCR semi-anidada para la amplificación de la región A:
- -
- en el primer ciclo RT-PCR, se usan los siguientes cebadores:
cebador 9: SEC ID nº 79 (sentido)
cebador 10: SEC ID nº 80 (anti-sentido)
- -
- en el segundo ciclo PCR, se usan los siguientes cebadores: cebador 9: SEC ID nº 81 (sentido) cebador 11: SEC ID nº 82 (anti-sentido) Los cebadores y las regiones G, E y A que definen se posicionan como en lo siguiente:
10 Se ha determinado la secuencia de la región definida por los diferentes clones G, E y A después de la clonación y de la secuenciación de los productos de amplificación "anidada".
Se han reunido los clones G, E y A mediante PCR con los cebadores 1 en dirección 5’ del fragmento G y 11 en
15 dirección 3’ del fragmento A, descritos anteriormente. Se ha amplificado un fragmento G+E+A de aproximadamente 1580 pb y se ha insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning (marca comercial). Se ha determinado la secuencia del producto de amplificación que corresponde a G+E+A y se ha realizado el análisis de los recubrimientos G+E y E+A. La secuencia se representa en la figura 39 y corresponde a la secuencia SEC ID nº 89.
20 Se ha encontrado una trama de lectura que codifica para una proteasa retrovÃrica MSRV-1 en la región E. La secuencia de aminoácido de la proteasa, identificada mediante SEC ID nº 90, se representa en la figura 40.
EJEMPLO 16: OBTENCIÓN DE UN CLON LTRGAG12, EMPARENTADO A UN ELEMENTO RETROV�?RICOENDÓGENO (ERV) CERCANO DE MSRV-1, EN EL ADN DE UNA L�?NEA LINFOBLASTOIDE DE SEP QUE 25 PRODUCE VIRIONES Y QUE EXPRESA EL RETROVIRUS MSRV-1
Se ha efectuado una PCR anidada sobre el ADN extraÃdo de una lÃnea linfoblastoide (linfocitos B inmortalizados por el virus EBV, cepa B95, como se ha descrito anteriormente y como es bien conocido por el experto en la materia) que expresa el retrovirus MSRV-1 y que procede de los linfocitos de la sangre periférica de un enfermo que padece
30 SEP.
En la primera etapa de PCR, se han usado los siguientes cebadores:
cebador 4327: CTCGATTTCT TGCTGGGCCT TA(SEC ID nº 83) 35 cebador 3512: GTTGATTCCC TCCTCAAGCA(SEC ID nº 84)
Esta etapa comprende 35 ciclos de amplificación con las siguientes condiciones: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 54ºC y 4 minutos a 72ºC.
40 En la segunda etapa de PCR, se han usado los siguientes cebadores:
cebador 4294: CTCTACCAAT CAGCATGTGG(SEC ID nº 85)
cebador 3591: TGTTCCTCTT GGTCCCTAT(SEC ID nº 86)
45 Esta etapa comprende 35 ciclos de amplificación con las siguientes condiciones: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 54ºC y 4 minutos a 72ºC.
Los productos que proceden de la PCR se han purificado después de la purificación sobre gel de agarosa según los métodos convencionales (17), y después se han resuspendido en 10 ml de agua destilada. Consistiendo una de las 50 propiedades de la polimerasa Taq en añadir una adenina en el extremo 3’ de cada una de las dos hebras de ADN, el ADN obtenido ha sido directamente insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA CloningTM (British Biotechnology). Los 2 μl de disolución de ADN se han mezclado con 5 μl de agua destilada estéril, 1 μl de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 μl de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) y 1 μl de "TA DNA LIGASE". Esta mezcla se incubó durante una noche a 12ºC. Las siguientes etapas se realizaron según las 55 instrucciones del kit TA Cloning® (British Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (blanco) se replantaron para ser cultivadas y la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante se escindió mediante una enzima de restricción apropiada y se analizó sobre gel de agarosa. Los plásmidos que tiene un inserto
detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, se seleccionaron para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del TA Cloning kit®. Después, se ha efectuado la reacción previa a la secuenciación según el método preconizado para el uso del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y se ha realizado la secuenciación automática con el aparato "Automatic Sequencer, modelo 373 A Applied Biosystems según las instrucciones del fabricante.
AsÃ, se ha podido obtener un clon denominado LTRGAG12 y se representa mediante su secuencia interna identificada mediante la SEC ID nº 60.
Este clon es probablemente representativo de elementos endógenos cercanos de ERV-9, presente en el ADN humano, en particular en el ADN de pacientes que padecen SEP, y que pueden interferir con la expresión del retrovirus MSRV-1, que por lo tanto, puede desempeñar un papel en la patogenia asociada al retrovirus MSRV-1 y que puede servir de marcador de una expresión especÃfica en la patologÃa implicada.
EJEMPLO 17: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPEC�?FICOS ANTI-MSRV-1 EN EL SUERO HUMANO
La identificación de la secuencia del gen pol del retrovirus MSRV-1 y de una trama de lectura abierta de este gen ha permitido determinar la secuencia SEC ID nº 63 de aminoácidos de una región de dicho gen, referenciada mediante la SEC ID nº 62.
Se han ensayado diferentes péptidos sintéticos que corresponden a unos fragmentos de la secuencia proteica de la transcriptasa inversa MSRV-1 codificada por el gen pol, para su especificidad antigénica frente a sueros de pacientes que padecen SEP y de pacientes de control sanos.
Se han sintetizado los péptidos quÃmicamente mediante sÃntesis en fase sólida, según la técnica de Merrifield (22). Las modalidades prácticas son las descritas a continuación.
a) SÃntesis de los péptidos:
Se han sintetizado los péptidos sobre una resina de fenilacetamidometilo (PAM)/poliestireno/divinilbenceno (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) usando un sintetizador automático "Applied Biosystems 430A". Los aminoácidos se enlazan en forma de ésteres de hidroxibenzotriazol (HOBT). Los aminoácidos usados proceden de Novabiochem (Laüflerlfingen, Suiza) o de Bachem (Bubendorf, Suiza).
La sÃntesis quÃmica se ha efectuado usando un protocolo de doble enlace con la N-metilpirrolidona (NMP) como disolvente. Los péptidos se han escindido de la resina asà como las protecciones laterales, de manera simultánea, con la ayuda de ácido fluorhÃdrico (HF) en un aparato apropiado (aparato de escisión de tipo I, Peptide Institute, Osaka, Japón).
Para 1 g de peptidilresina, se usan 10 ml de HF, 1 ml de anisol y 1 ml de dimetilsulfuro 5DMS. La mezcla se agita durante 45 minutos a -2ºC. Entonces, se evapora el HF al vacÃo. Después de lavados intensivos con éter, el péptido se eluye de la resina mediante ácido acético al 10%, y después se liofiliza.
Los péptidos se purifican mediante cromatografÃa lÃquida ultrarrápida preparativa sobre una columna VYDAC de tipo C18 (250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA). La elución se realiza mediante un gradiente de acetonitrilo con un caudal de 22 ml/min. Las fracciones recogidas se controlan mediante una elución en condición isocrática sobre una columna VYDAC® C18 analÃtica (250 x 4,6 mm) con un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que presentan el mismo tiempo de retención se reúnen y se liofilizan. Después, se analiza la fracción mayoritaria mediante cromatografÃa lÃquida ultrarrápida analÃtica, con el sistema descrito anteriormente. El péptido que se considera como de pureza aceptable se traduce mediante un pico único que representa 95% como mÃnimo del cromatograma.
Después, se analizan los péptidos purificados con el fin de controlar su composición de aminoácidos, con la ayuda de un analizador de aminoácidos automático. Applied Biosystems 420H. La medición de la masa molecular quÃmica (media) de los péptidos se obtiene usando la espectrometrÃa de masas L.S.I.M.S en modo de ión positivo en un instrumento de doble focalización VG. ZAB.ZSEQ conectado a un sistema de adquisición DEC-VAX 2000 (VG analytical Ltd, Manchester, Inglaterra).
La reactividad de los diferentes péptidos se ha ensayado contra sueros de pacientes que padecen SEP y contra sueros de pacientes de control sanos. Esto ha permitido seleccionar un péptido denominado S24Q cuya secuencia se identifica mediante la SEC ID nº 63, codificado por una secuencia nucleotÃdica del gen pol de MSRV-1 (SEC ID nº 62).
b) Propiedades antigénicas:
Las propiedades antigénicas del péptido S24Q se han demostrado según el protocolo ELISA descrito a continuación.
El péptido S24Q liofilizado se ha disuelto en ácido acético al 10% con una concentración de 1 mg/ml. Esta disolución madre se ha alicuotado y se ha guardado a +4ºC para el uso dentro de una quincena de dÃas, o se ha congelado a 20ºC, para un uso dentro de dos meses. Se ha diluido una alÃcuota en una disolución de PBS (Phosphate Buffer Saline) a fin de obtener una concentración final de péptido de 5 microgramos/ml. Se depositan 100 microlitros de esta dilución en cada pocillo de placas de microtitulación Nunc Maxisorb (nombre comercial). Las placas se recubren con un adhesivo de tipo "plate-sealer" y se mantienen durante 2 horas a +4ºC, para la fase de adsorción del péptido sobre el plástico. El adhesivo se quita y las placas se lavan tres veces con un volumen de 300 microlitros de una disolución A (PBS 1x, 0,05% de Tween 20®), después se les da la vuelta sobre una tela absorbente. Las placas asà escurridas se llenan con 250 microlitros por pocillo de una disolución B (disolución A + 10% de suero de cabra), y después se recubren con un adhesivo y se incuban durante 1 hora, a 37ºC. Después, las placas se lavan tres veces con la disolución A, como se ha descrito anteriormente.
Las muestras de suero a ensayar se diluyen previamente al 1/100 en la disolución B, y 100 microlitros de cada suero diluido a ensayar se depositan en los pocillos de cada placa de microtitulación. Se deposita un control negativo en un pocillo de cada placa, en forma de 100 microlitros de tampón B. Las placas recubiertas con un adhesivo se incuban entonces durante 1 hora 30 minutos, a 37ºC. Después, las placas se lavan tres veces con la disolución A, como se ha descrito anteriormente. Para la respuesta IgG, se diluye un anticuerpo de cabra marcado con peroxidasa y dirigido contra los IgG humanos (comercializado por Jackson Immuno Research Inc.) en la disolución B (dilución 1/10.000). Entonces, se depositan 100 microlitros de la dilución adecuada del anticuerpo marcado en cada pocillo de las placas de microtitulación, y las placas recubiertas con un adhesivo se incuban durante 1 hora, a 37ºC. Después, se efectúa nuevamente un lavado de las placas como se ha descrito anteriormente. Paralelamente, el sustrato de la peroxidasa se prepara según las indicaciones del kit bioMérieux. Se depositan 100 microlitros de disolución-sustrato en cada pocillo, y las placas se disponen al abrigo de la luz durante 20 a 30 minutos, a temperatura ambiente.
Una vez la reacción colorada se ha estabilizado, se depositan 50 microlitros de Color 2 (nombre comercial de bioMérieux) en cada pocillo para detener la reacción. Las placas se disponen inmediatamente en un lector espectrofotométrico de placas ELISA, y la densidad óptica (D.O.) de cada pocillo se lee con una longitud de onda de 492 nm.
Las muestras serológicas se depositan en doble o en triple, y se calcula la densidad óptica (D.O.) que corresponde al suero ensayado calculando la media de las D.O. obtenidas para una misma muestra, con la misma dilución.
La D.O. neta de cada suero corresponde a la D.O. media del suero de la que se resta la D.O. media del control negativo (disolución B: PBS, 0,05% de Tween 20®, 10% de suero de cabra).
c) Detección de anticuerpos IgG anti-MSRV-1 (S24Q) mediante ELISA:
Se ha usado la técnica descrita anteriormente con al péptido S24Q para buscar la presencia de anticuerpos IgG especÃficos anti-MSRV-1 en el suero de 15 pacientes, para los cuales se ha realizado un diagnóstico cierto de SEP según los criterios de Poser (23), y de 15 controles sanos (donantes de sangre).
En la figura 41, se representan los resultados de cada suero ensayado con un anticuerpo anti-IgG. Cada barra vertical representa la densidad óptica (D.O. a 492 nm) neta de un suero ensayado. El eje de ordenadas indica la
D.O. neta en el pico de las barras verticales. Las 15 primeras barras verticales situadas a la izquierda de la lÃnea discontinua vertical, representan los sueros de 15 controles sanos (donantes de sangre) y las 15 barras verticales situadas a la derecha de la lÃnea discontinua vertical, representan los sueros de 15 casos de SEP ensayados. La gráfica permite visualizar 2 controles cuya D.O. emerge por encima de los valores agrupados de la población de control. Estos valores pueden representar la presencia de IgG especÃficos en pacientes seropositivos no-enfermos. Por lo tanto, se han evaluado dos métodos para determinar el umbral estadÃstico de positividad del ensayo.
La media de las D.O. netas de los controles, incluyendo los controles con D.O. netas elevadas, es de 0,129 y la desviación tÃpica es de 0,06. Sin los 2 controles cuyas D.O. netas son superiores a 0,2, la media de los controles "negativos" es de 0,107 y la desviación tÃpica de 0,03. Se puede calcular un umbral de positividad teórica según la fórmula:
valor umbral (media de las D.O. netas de los controles negativos) + (2 ó 3 x desviación tÃpica de las D.O. netas de los controles negativos)
En el primer caso, se considera que existen seropositivos no-enfermos, y el valor umbral es igual a: 0,11 + (3 x 0,03) = 0,20. Los resultados negativos representan un "ruido de fondo" no especÃfico de la presencia de anticuerpos especÃficamente dirigidos contra un epÃtopo del péptido.
En el segundo caso, si el conjunto de los controles constituidos por donantes de sangre con una buena salud aparente se coge como base de referencia, sin excluir los sueros a priori seropositivos, la desviación tÃpica de los "controles no-SEP" es de 0,116. Entonces, el valor umbral es: 0,13 + (3 x 0,006) = 0,31.
5 Según este último análisis, el ensayo es especÃfico de la SEP. En este aspecto, se constata que el ensayo es especÃfico de la SEP, puesto que tal como se muestra en la tabla 1, ningún control tiene una D.O. neta por encima de este umbral. Realmente, este resultado refleja el hecho de que las titulaciones de los anticuerpos en los pacientes que padecen SEP son mayoritariamente más elevadas que en los controles sanos que han estado en contacto con MSRV-1.
10 En función del primer modo de cálculo y como se representa en la figura 41 y en la tabla 3, 6 de los 15 sueros SEP dan un resultado positivo (D.O. superior o igual a 0,2) indicando la presencia de IgG especÃficamente dirigidos contra el péptido S24Q, y por lo tanto contra una parte de la enzima de transcriptasa inversa del retrovirus MSRV-1 codificada por su gen pol y, por consiguiente, contra el retrovirus MSRV-1.
15 AsÃ, aproximadamente 40% de los pacientes SEP ensayados han reaccionado contra un epÃtopo portado por el péptido S24Q y presentan IgG circulantes dirigidos contra este último.
De 15 donantes de sangre, aparentemente con una buena salud, 2 presentan un resultado positivo. AsÃ, aparece
20 que aproximadamente 13% de la población no-enferma puede haber estado en contacto de un epÃtopo portado por el péptido S24Q en condiciones que han llevado a una inmunización activa que se traduce mediante la persistencia de IgG séricos especÃficos. Estas condiciones son compatibles con una inmunización contra la transcriptasa inversa del retrovirus MSRV-1, durante una infección por el (y/o reactivación del) retrovirus MSRV-1. La ausencia de patologÃa neurológica aparente que evoca la SEP en estos controles seropositivos puede indicar que son portadores
25 sanos, que han eliminado un virus infeccioso después de haberse inmunizado o que constituyen una población con riesgo de portadores crónicos. En efecto, los datos epidemiológicos que muestran que un agente patógeno presente en el entorno de las regiones con alta preponderancia de SEP, puede ser la causa de esta enfermedad, implican que una fracción de la población libre de SEP ha estado necesariamente en contacto con dicho agente patógeno. Se ha demostrado que el retrovirus MSRV-1 constituye la totalidad o parte de este "agente patógeno" origen de la SEP, y
30 es por lo tanto normal que unos controles cogidos en una población sana presenten anticuerpos de tipo IgG contra componentes del retrovirus MSRV-1.
AsÃ, la detección de anticuerpos anti-S24Q en sólo una SEP de dos ensayados en este caso, puede reflejar el hecho de que este péptido no presenta ningún epÃtopo inmunodominante MSRV-1, que unas variaciones interindividuales
35 de cepas pueden inducir una inmunización contra un motivo peptÃdico divergente en la misma región, o también que la evolución de la enfermedad y los tratamientos seguidos pueden modular en el tiempo la respuesta de anticuerpos contra el péptido S24Q.
TABLA nº 3 40
- CONTROLES
- SEP
- 0,101
- 0,136
- 0,058
- 0,391
- 0,126
- 0,37
- 0,131
- 0,119
- 0,105
- 0,267
- 0,294
- 0,141
- 0,116
- 0,102
- 0,088
- 0,18
- 0,105
- 0,411
- 0,172
- 0,164
- 0,137
- 0,049
- 0,223
- 0,644
- 0,08
- 0,268
- 0,073
- 0,065
- 0,132
- 0,074
- Media
- 0,129
- Desviación tÃpica
- 0,06
- Umbral
- 0,31
d) Detección de anticuerpos IgM anti-MSRV-1 mediante ELISA
Se ha usado la técnica de ELISA con el péptido S24Q para buscar la presencia de anticuerpos especÃficos IgM anti45 MSRV-1 en los mismos sueros que anteriormente.
En la figura 42, se representan los resultados de cada suero ensayado con un anticuerpo anti-IgM. Cada barra vertical representa la densidad óptica (D.O. a 492 nm) neta de un suero ensayado. El eje de ordenadas indica la
D.O. neta en el pico de las barras verticales. Las 15 primeras barras verticales situadas a la izquierda de la lÃnea vertical que corta el eje de abscisas representan los sueros de 15 controles sanos (donantes de sangre), y las barras
5 verticales situadas a la derecha de la lÃnea discontinua vertical representan los sueros de 15 casos de SEP ensayados.
La media de las D.O. netas de las SEP ensayadas es de: 1,6.
10 La media de las D.O. netas de los controles es de: 0,7.
La desviación tÃpica de los controles negativos es de: 0,6.
El umbral de positividad teórico se puede calcular según la fórmula: 15 valor umbral = (media de las D.O. de los controles negativos) + (3 x desviación tÃpica de las D.O. de los controles negativos)
El valor umbral es, por lo tanto, igual a 0,7 + (3 x 0,6) = 0,5;
20 Los resultados negativos representan un "ruido de fondo" no especÃfico de la presencia de anticuerpos especÃficamente dirigidos contra un epÃtopo del péptido.
Según este análisis y como se muestra en la figura 42 y en la tabla 4 correspondiente, el ensayo IgM es especÃfico 25 de la SEP, puesto que ningún control tiene una D.O. neta por encima del umbral. De los 15 sueros SEP 6 producen un resultado IgM positivo.
La diferencia de seroprevalencia entre los SEP y la población de control es extremadamente significativa: ensayo "chi-2", p<0,002. 30 Estos resultados están a favor de un papel etiopatogénico de MSRV-1 en la SEP.
AsÃ, la detección de los anticuerpos IgM e IgG contra el péptido S24Q permite evaluar, solo o en combinación con otros péptidos MSRV-1, la evolución de una infección mediante MSRV-1 y/o de la reactivación vÃrica de MSRV-1. 35 TABLA nº 4
- CONTROLES
- SEP
- 1,449
- 0,974
- 0,371
- 6,117
- 0,448
- 2,883
- 0,456
- 1,945
- 0,885
- 1,787
- 2,235
- 0,273
- 0,301
- 1,766
- 0,138
- 0,668
- 0,16
- 2,603
- 1,073
- 0,802
- 1,366
- 0,245
- 0,283
- 0,147
- 0,262
- 2,441
- 0,585
- 0,287
- 0,356
- 0,589
- Media
- 0,7
- Desviación tÃpica
- 0,6
- Umbral
- 2,5
AsÃ, es posible, gracias a los descubrimientos efectuados y a los nuevos métodos realizados por los inventores,
40 permitir la realización perfeccionada de los ensayos de diagnósticos de la infección y/o de la reactivación de MSRV1, y de evaluar una terapia en la SEP y/o en la PR en base a su eficacia para "hacer negativa" la detección de estos agentes en los fluidos biológicos de los pacientes. Además, la detección precoz en personas que no presentan todavÃa señales neurológicas de SEP, o señales reumatológicas de PR, podrÃa permitir instaurar un tratamiento tanto más eficaz de la evolución clÃnica posterior por cuanto que precederÃa el estado lesional que corresponde a la
45 aparición de los trastornos clÃnicos. Ahora bien, hoy en dÃa, no se puede establecer un diagnóstico de SEP o de PR antes de la instalación de una sintomatologÃa lesional y, por lo tanto, no se instaura ningún tratamiento antes de la emergencia de una clÃnica evocadora de lesiones ya consecuentes. El diagnóstico de una infección y/o de una reactivación de MSRV-1 y/o MSRV-2 en el ser humano es, por lo tanto, determinante, y la presente invención suministra los medios para ello.
AsÃ, es posible, además de realizar un diagnóstico de la infección y/o de la reactivación de MSRV-1, evaluar una terapia en la SEP en base a su eficacia en "hacer negativa" la detección de estos agentes en los fluidos biológicos de los pacientes.
- (1)
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- (2)
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- (3)
- Perron H. et al., Res. Virol. 1989, 140, 551-561.
- (4)
- Perron H. et al., "Current concepts in multiple sclerosis" Wiethölter et al., eds. Amsterdam, Elsevier, 1991, 111
116.
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- Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982.
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- Southern. E.M., J. Mol. Biol. 1975, 98, 503.
- (11)
- Dunn A.R. y Hassel J.A., Cell 1977, 12, 23.
- (12)
- Shih et al., J. Virol. 1989, 63, 64-75.
- (13)
- Perron H. et al., Res. Vir. 1992, 143, 337-350.
- (14)
- Meyerhans et al., Cell 1989, 58, 901-910.
- (15)
- Linial M.L. y Miller A.D., "Current topics in microbiology ADN immunobiology. Retroviruses, stratégies of replication" vol. 157, 125-152; Swanstrom R. y Vogt P.K., editores, Springer-Verlag, Heidelberg 1990.
- (16)
- Lori F. et al., J. Virol. 1992, 66, 5067-5074.
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- Sambrook J., Fritsch E.F., y Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
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229.
- (24)
- La Mantia et al., Nucleic Acid Research 1989, 17, 5913-22.
- (25)
- PLAZA, A; KONO, D.H; THEOFILOPOULOS, A.N. NEW HUMAN Vβ GENES ADN POLYMORPHIC VARIANTS.
- J.
- Imm; 147(12): 4360-4365, 1991.
- (1)
- INFORMACIONES GENERALES: 5
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: BIOMERIEUX
- (B)
- CALLE: NINGUNA 10 (C) CIUDAD: MARCY L’ETOILE
- (E)
- PA�?S: FRANCIA
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 69280
- (ii)
- T�?TULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptidos antigénicos asociados a la esclerosis en placas y utilizaciones. 15 (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 92
(iv) FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE SOPORTE: Disquete
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible 20 (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (OEB)
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 1:
25 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 1158 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple 30 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 2:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 40
- (A)
- LONGITUD: 297 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal 45
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 3:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 4:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 86 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 5:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 6:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
5 (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 7:
(i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 111 pares de bases 10 (B) TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 8: 20
(i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 645 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido 25 (C) NÚMERO DE HEBRAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: Lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8: 30
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 9:
35 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 741 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple 40 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 10:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 93 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 11:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 96 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 12:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 748 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 40:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 150 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 41:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 41:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 42:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 42:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 43:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 43:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 44:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 44:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 45:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 45: GTGCTGATTG GTGTATTTAC AATCC
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 46:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 1859 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 46:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 51:
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 13:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
- (B) (C) (D)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
- GCATCCGGCA ACTGCACG
- 18
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 14:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
- (B) (C) (D)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
- GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 15:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
- (B) (C) (D)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
- GCATCCGGCA ACTGCACG
- 18
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 16:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
- (B) (C) (D)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
- AGGAGTAAGG AAACCCAACG GAC
- 23
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 17:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 19 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
- TAAGAGTTGC ACAAGTGCG
- 19
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 18:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 21 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
- TCAGGGATAG CCCCCATCTA T
- 21
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 19:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 24 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
- AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT
- 24
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 20:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 15 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (ix)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc CARACTER�?STICAS:
- (B) (D)
- EMPLAZAMIENTOS: 5, 7, 10, 13 OTRAS INFORMACIONES: G representa la insosina (i)
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
- GGTCGTGCCG CAGGG
- 15
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 21:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 21 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
- TTAGGGATAG CCCTCATCTC T
- 21
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 22:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 21 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
- TCAGGGATAG CCCCCATCTA T
- 21
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 23:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 24 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
- AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT
- 24
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 24:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 23 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
- GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT
- 23
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 25:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 18 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
- TCATCCATGT ACCGAAGG
- 18
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 26:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 20 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
- ATGGGGTTCC CAAGTTCCCT
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 27:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 20 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
- GCCGATATCA CCCGCCATGG
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 28:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 18 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
- GCATCCGGCA ACTGCACG
- 18
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 29:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 20 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
- CGCGATGCTG GTTGGAGAGC
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 30:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C)
- LONGITUD: 20 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
- TCTCCACTCC GAATATTCCG
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 31:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 26 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
- GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS
- 26
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 32:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 23 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (ix)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc CARACTER�?STICAS:
- (B) (D)
- EMPLAZAMIENTO: 6, 12, 19 OTRAS INFORMACIONES: G representa la inosina (i)
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:
- CATCTGTTTG GGCAGGCAGT AGC
- 23
- 2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 33:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 24 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:
- CTTGAGCCAG TTCTCATACC TGGA
- 24
- 2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 34:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:
- AGTGYTRCCM CARGGCGCTG AA
- 22
- 2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 35:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:
- GMGGCCAGCA GSAKGTCATC CA
- 22
- 2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 36:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:
- GGATGCCGCC TATAGCCTCT AC
- 22
- 2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 37:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:
- AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CC
- 22
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 38:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 40 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38:
- TAAAGATCTA GAATTCGGCT ATAGGCGGCA TCCGGCAAGT
- 40
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 39:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B)
- LONGITUD: 50 aminoácidos TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 47:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
- (B) (C) (D)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 47:
- TGATGTGAAC GGCATACTCA CTG
- 23
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 48:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
- (B) (C) (D)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 48:
- CCCAGAGGTT AGGAACTCCC TTTC
- 24
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 49:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
- (B) (C)
- TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- 5
- (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 49: GCTAAAGGAG ACTTGTGGTT GTCAG 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 50:
- 10
- (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- 15
- (A) (B) (C) (D) LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 50:
- 20
- CAACATGGGC ATTTCGGATT AG 22
(i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
5 (A) LONGITUD: 400 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 51:
15 (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 52:
(i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 2389 pares de bases 20 (B) TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 52:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 53:
5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 2448 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 53:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 54:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 54: CCTGAGTTCT TGCACTAACC C
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 55:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 55:
GTCCGTTGGG TTTCCTTACT CCT23
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 56: 5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 1196 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 56:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 57:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 20
- (A)
- LONGITUD: 2391 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal 25
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 57:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 58:
5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 1722 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 58:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 59:
5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 495 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 59:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 60:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 20
- (A)
- LONGITUD: 2503 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal 25
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 60:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 61:
5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 1167 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 61:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 62:
5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 62:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 63:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 20
- (A)
- LONGITUD: 26 restos de aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 63:
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 64: 30
(i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 28 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido 35 (C) NÚMERO DE HEBRAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: Lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (2)
- INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 88: 5
(i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 693 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido 10 (C) NÚMERO DE HEBRAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: Lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 88: 15
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 64:
- AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT
- 28
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 65:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 30 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 65:
- AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT
- 30
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 66:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 21 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 66:
- GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G
- 21
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 67:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 67:
- GTGCTGATTG GTGTATTTAC AATCC
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 68:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 34 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 68:
- GACTCGCTGC AGATCGATTT TTTTTTTTT TTTTT
- 34
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 69:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B)
- LONGITUD: 30 pares de bases TIPO: Nucleótido
- (C) (D) (ii) (xi)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 69:
- GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT
- 30
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 70:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 30 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 70:
- CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT
- 30
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 71: (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D) (ii) (xi)
- LONGITUD: 23 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 71:
- GCCATAACTG CAACCCAAGA GTT
- 23
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 72:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 23 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 72:
- GGACGAGGTG GTGGCTTATT TCT
- 23
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 73: (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D) (ii) (xi)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 73:
- AACTTGCGTG CTAGAAGGAC TAAGG
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 74:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 24 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 74:
- AACTTTTCCC TTTTCCAGAT CCTC
- 24
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 75:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 75:
- GCATACCAGG CAAGTGGACA TT
- 22
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 76:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 76:
- CTGTCCGTTG GGTTTCCTTA CTCCT
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 77:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 24 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 77:
- GAGGCTCTGG AAAAGGGAAA AGTT
- 24
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 78:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 78:
- CTGTCCGTTG GGTTTCCTTA CTCCT
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 79:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 79:
- AGGAGTAAGG AAACCCAACG GACAG
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 80:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 80:
- TGTATATAAT GGTCTGGCTA TTGGG
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 81:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 25 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 81:
- AGGAGTAAGG AAACCCAACG GACAG
- 25
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 82:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 26 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 82:
- TTCGGCAGAA ACCTGTTATG CCAAGG
- 26
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 83:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 83:
- CTCGATTTCT TGCTGGGCCT TA
- 22
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 84:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 20 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 84:
- GTTGATTCCC TCCTCAAGCA
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 85:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 20 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 85:
- CTCTACCAAT CAGCATGTGG
- 20
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 86:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 19 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 86:
- TGTTCCTCTT GGTCCCTAT
- 19
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 87:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B)
- LONGITUD: 433 restos de aminoácidos TIPO: aminoácidos
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 87:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 89:
5 (i) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 1577 pares de bases
- (B)
- TIPO: Nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple 10 (D) CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 89:
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 90:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 20
- (A)
- LONGITUD: 182 restos de aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácidos
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 90:
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 91:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 36 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 91:
- AGATCTGCAG AATTCGATAT CACCCCCCCC CCCCCC
- 36
- (2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID nº: 92:
- (i)
- CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:
- (A) (B) (C) (D)
- LONGITUD: 22 pares de bases TIPO: Nucleótido NÚMERO DE HEBRAS: simple CONFIGURACIÓN: Lineal
- (ii) (xi)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 92:
- AGATCTGCAG AATTCGATAT CA
- 22
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Polipéptido antigénico reconocido por sueros de pacientes infectados por un retrovirus cuyo genoma comprendeuna secuencia nucleotÃdica seleccionada de entre SEC ID nº 1 y SEC ID nº 89, y/o en los cuales se ha reactivado dicho retrovirus, cuya secuencia peptÃdica consiste en una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 39, SEC IDnº 41 aSEC ID nº 44 y SEC ID nº 63.
-
- 2.
- Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque posee una secuencia peptÃdica que consiste en una
secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 39 y SEC ID nº 63. -
- 3.
- Secuencia nucleica que codifica para un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, seleccionada de entre SEC ID
nº 40, SEC ID nº 62, sus fragmentos y las secuencias complementarias de éstos. -
- 4.
- Anticuerpo mono-o policlonal dirigido contra un agente patológico y/o infeccioso asociado a la esclerosis en placas, caracterizado porque se obtiene mediante reacción inmunológica de un organismo humano o animal, con un agente inmunógeno constituido por un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2.
-
- 5.
- Agente reactivo de detección de un agente patológico y/o infeccioso asociado a la esclerosis en placas, o de una exposición a dicho agente, caracterizado porque comprende, a tÃtulo de sustancia reactiva, un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, o un anticuerpo según la reivindicación 4.
-
- 6.
- Composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2,
o un anticuerpo según la reivindicación 4. -
- 7.
- Composición inmunoterapéutica activa, en particular composición vacunal, según la reivindicación 6.
-
- 8.
- Procedimiento para detectar la presencia o la exposición a un agente patológico y/o infeccioso asociado a la esclerosis en placas, en una muestra biológica, caracterizado porque se pone en contacto dicha muestra con un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, o un anticuerpo según la reivindicación 4.
-
- 9.
- Dispositivo de detección de la presencia o de la exposición a un agente patológico y/o infeccioso asociado a la esclerosis en placas, en una muestra biológica, comprendiendo dicho dispositivo un agente reactivo según la reivindicación 5, que consiste en un polipéptido, soportado por un soporte sólido, inmunológicamente compatible con dicho agente reactivo, caracterizado porque comprende un medio de puesta en contacto de dicha muestra biológica con dicho agente reactivo, en condiciones que permiten una eventual reacción inmunológica, y unos medios de detección del complejo inmune formado con dicho agente reactivo.
-
- 10.
- Procedimiento de detección de anticuerpo dirigido contra un agente patológico y/o infeccioso asociado a la esclerosis en placas, en una muestra biológica, caracterizado porque se pone en contacto dicha muestra y un agente reactivo según la reivindicación 5, que consiste en un anticuerpo, en condiciones que permiten una eventual reacción inmunológica, y se detecta a continuación la presencia de un complejo inmune formado con dicho agente reactivo.
-
- 11.
- Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre o de lÃquido cefalorraquÃdeo.
-
- 12.
- Utilización de una región inmunodominante seleccionada de entre SEC ID nº 41 a SEC ID nº 44, para preparar unos péptidos antigénicos reconocidos por sueros de pacientes infectados por un retrovirus cuyo genoma comprende una secuencia nucleotÃdica seleccionada de entre SEC ID nº 1 y SEC ID nº 89, y/o en los cuales se ha reactivado dicho retrovirus.
FIG. 31FIG. 32.
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