ES2331496T3 - Material viral y fragmentos de nucleotidos asociados a la esclerosis multiple, para fines diagnosticos, profilacticos y terapeuticos. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN MATERIAL NUCLEICO, EN ESTADO AISLADO O PURIFICADO, QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA ESCOGIDA EN EL GRUPO CONSTITUIDO POR LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, POR SUS SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS Y POR SUS SECUENCIAS EQUIVALENTES, EN PARTICULAR LAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE PRESENTAN, PARA CUALQUIER SUCESION DE 100 MONOMEROS CONTIGUOS, AL MENOS EL 50% Y PREFERENTEMENTE, COMO MINIMO, EL 60% DE HOMOLOGIA CON DICHAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, Y CON SUS SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS, EXCLUYENDO LA SECUENCIA HSERV - 9.
Description
Material viral y fragmentos de nucleótidos
asociados a la esclerosis múltiple, para fines diagnósticos,
profilácticos y terapéuticos.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad
desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) cuya causa
todavía se desconoce.
La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad
neurológica más común entre adultos jóvenes, con una prevalencia en
Europa y Norteamérica de 20 a 200 por cada 100.000 personas. Se
caracteriza clínicamente por un curso recidivante/remitente o
progresivo crónico que frecuentemente conduce a una discapacidad
severa. Los conocimientos actuales sugieren que la EM se encuentra
asociada a la autoinmunidad, que el contexto genético presenta una
influencia importante y que podrían encontrarse implicados uno o
más agentes "infecciosos". En efecto, se han propuesto muchos
virus como posibles candidatos pero, hasta ahora, no se ha
demostrado que ninguno de ellos desempeñe un papel etiológico.
Muchos estudios apoyan la hipótesis de una
etiología vírica de la enfermedad, pero ninguno de los virus
conocidos y sometidos a ensayo ha demostrado ser el agente causal
buscado: una revisión de los virus buscados durante varios años en
la EM ha sido compilada por E. Norrby (1) y R. T. Johnson (2).
Al descubrimiento de los retrovirus patogénicos
en el hombre (HTLV y VIH) ha seguido un gran interés en su
capacidad de alterar el sistema inmunológico y de provocar
inflamación y/o degeneración del sistema nervioso central. En el
caso de HTLV-1, su asociación con una enfermedad
desmielinizante inflamatoria crónica en el ser humano (48) condujo
a investigaciones extensas en busca de un retrovirus similar a HTLV1
en los pacientes de EM. Sin embargo, a pesar de las
reivindicaciones iniciales, la presencia de HTLV-1 o
de retrovirus similares a HTLV no ha sido confirmada.
Recientemente se ha aislado un retrovirus
diferente de los retrovirus humanos conocidos a partir de pacientes
que sufren EM (3, 4 y 5).
En 1989, los autores describieron la producción
de viriones extracelulares asociados a actividad de transcriptasa
inversa (RT) mediante un cultivo de células leptomeníngeas (LM7)
obtenidas del líquido cerebroespinal (CSF) de un paciente con EM
(3). Siguieron resultados similares en cultivos de monocitos
procedentes de una serie de pacientes con EM (5). No se encontraron
partículas víricas ni actividad vírica de RT en los individuos de
control. Además, los autores pudieron transferir el virus LM7 a
células leptomeníngeas no infectadas in vitro (26). La
caracterización molecular del retrovirus "LM7" era una
condición previa para la evaluación posterior de su posible papel
en la EM. Se plantearon dificultades considerables debido a la
ausencia de cultivos retrovíricos productivos en continuo y a los
bajos niveles de expresión en los pocos cultivos transitorios
conseguidos. La estrategia descrita en la presente memoria se centró
en el ARN procedente de viriones extracelulares, con el fin de
evitar la detección no específica de ARN celular y de elementos
endógenos de ADN humano contaminante. Se identificó una secuencia
retrovírica específica asociada a viriones producidos en cultivos
celulares procedentes de varios pacientes con EM. La secuencia
completa de este nuevo genoma retrovírico se está obteniendo en la
actualidad utilizando PCR-RT en ARN procedente de
viriones extracelulares. El retrovirus denominado anteriormente
"virus LM7" corresponde a un oncovirus y se denomina MSRV
(retrovirus asociado a esclerosis múltiple).
Los autores también pudieron demostrar que dicho
retrovirus podía transmitirse in vitro, que los pacientes
que sufrían EM producían anticuerpos capaces de reconocer proteínas
asociadas a la infección de células leptomeníngeas por dicho
retrovirus, y que la expresión de este último podía resultar
fuertemente estimulada por los genes
inmediatos-tempranos de algunos virus herpes
(6).
La totalidad de dichos resultados apunta a la
implicación en la EM de por lo menos un retrovirus desconocido o de
un virus que presenta actividad de transcriptasa inversa y que
resulta detectable según el método publicado por H. Perron (3),
calificada de actividad "de RT similar a LM7". El contenido de
la publicación identificada por (3) se incorpora a la presente
memoria como referencia.
Recientemente, los estudios de los presentes
solicitantes han permitido obtener dos líneas celulares continuas
infectadas por aislados naturales originados en dos pacientes
diferentes que sufrían EM, mediante un método de cultivo según se
describe en el documento
WO-A-93/20188, cuyo contenido se
incorpora a la presente memoria como referencia. Dichas dos líneas,
derivadas de células del plexo coroideo humano, denominadas LM7PC y
PLI-2, se depositaron en la ECACC el 22 de julio de
1992 y el 8 de enero de 1993, respectivamente, con los números
92072201 y 93010817, según las disposiciones del Tratado de
Budapest. Además, los aislados víricos que presentan actividad de
RT similar a LM7 también fueron depositados en la ECACC bajo la
denominación general de "cepas". La "cepa" o aislado que
alberga la línea PLI-2, denominada
POL-2, se depositó en la ECACC el 22 de julio de
1992 con el nº V92072202. La "cepa" o aislado albergado por la
línea LM7PC, denominada MS7PG, se depositó en la ECACC el 8 de
enero de 1993 con el nº V9301816.
Partiendo de los cultivos y aislados indicados
anteriormente, caracterizados por criterios biológicos y
morfológicos, la etapa siguiente consistió en intentar caracterizar
el material de ácidos nucleicos asociado con las partículas víricas
producidas en dichos cultivos.
Las porciones del genoma que ya han sido
caracterizadas se han utilizado para desarrollar ensayos para la
detección molecular de genoma vírico y ensayos inmunoserológicos,
utilizando las secuencias de aminoácidos codificadas por las
secuencias de nucleótidos del genoma vírico, con el fin de detectar
la respuesta inmunológica dirigida contra epítopos asociados a la
infección y/o a la expresión vírica.
Dichas herramientas ya han permitido confirmar
una asociación entre la EM y la expresión de las secuencias
identificadas en las patentes mencionadas a continuación. Sin
embargo, el sistema vírico descubierto por el presente solicitante
está relacionado con un complejo sistema retrovírico. En efecto, la
secuencias que se encuentran encapsidadas en las partículas víricas
extracelulares producidas por los diferentes cultivos de células
procedentes de pacientes que sufren EM, demuestran claramente que se
produce la coencapsidación de genomas retrovíricos que están
relacionados pero son diferentes del genoma retrovírico "de tipo
salvaje" que produce las partículas víricas infecciosas. Este
fenómeno ha sido observado entre retrovirus replicativos y
retrovirus endógenos que pertenecen a la misma familia, o incluso
retrovirus heterólogos. La idea de retrovirus endógenos resulta muy
importante en el contexto del descubrimiento de los presentes
inventores debido a que, en el caso de MSRV-1, se
ha observado que las secuencias retrovíricas endógenas que
comprenden secuencias homólogas al genoma de MSRV-1
existen en ADN humano normal. La existencia de elementos
retrovíricos endógenos (ERV) relacionados con
MSRV-1 en la totalidad o en parte de su genoma
explica el hecho de que la expresión del retrovirus
MSRV-1 en células humanas es capaz de interaccionar
con secuencias endógenas estrechamente relacionadas. Estas
interacciones pueden encontrarse en el caso de retrovirus endógenos
patogénicos y/o infecciosos (por ejemplo algunas cepas ecotrópicas
del virus de la leucemia murina) y en el caso de retrovirus exógenos
cuya secuencia de nucleótidos puede encontrarse parcial o
totalmente, en la forma de ERV, en el genoma del animal huésped
(por ejemplo el virus de tumor mamario exógeno del ratón transmitido
por medio de la leche). Estas interacciones consisten
principalmente de: (i) una transactivación o coactivación de ERV por
parte del retrovirus replicativo, (ii) y la encapsidación
"ilegítima" de ARNs relacionados con ERV o de ERV, (o incluso
de ARNs celulares) que simplemente presentan secuencias de
encapsidación compatibles, en las partículas retrovíricas
producidas mediante la expresión de la cepa replicativa, que en
ocasiones son transmisibles y en ocasiones presentan su propia
patogenicidad, y (iii) recombinaciones más o menos sustanciales
entre los genomas coencapsidados, en particular en las etapas de
transcripción inversa, que conducen a la formación de genomas
híbridos, que en ocasiones son transmisibles y en ocasiones
presentan su propia patogenicidad.
De esta manera, (i) se han encontrado diferentes
secuencias relacionadas con MSRV-1 en las partículas
víricas purificadas, (ii) el análisis molecular de las diferentes
regiones del genoma retrovírico de MSRV-1 debe
llevarse a cabo mediante el análisis sistemático de secuencias
coencapsidadas, interfirientes y/o recombinadas que se generan con
la infección y/o la expresión de MSRV-1; además,
algunos clones pueden presentar porciones de secuencias defectivas
producidas mediante la replicación retrovírica y errores de molde
y/o errores de transcripción de la transcriptasa inversa, (iii) las
familias de secuencias relacionadas con la misma región genómica
retrovírica proporcionan los medios para una detección diagnóstica
general que puede optimizarse mediante la identificación de
regiones invariables entre los clones expresados, y mediante la
identificación de marcos de lectura responsables de la producción
de polipéptidos antigénicos y/o patogénicos que pueden ser
producidos únicamente por una porción o incluso por únicamente uno
de los clones expresados y, bajo estas condiciones, el análisis
sistemático de los clones expresados en la región de un gen dado
permite evaluar la frecuencia de variación y/o de recombinación del
genoma de MSRV-1 en dicha región y permite definir
las secuencias óptimas para las aplicaciones, en particular las
aplicaciones diagnósticas, (iv) la patología causada por un
retrovirus tal como MSRV-1 puede ser un efecto
directo de su expresión y de la expresión de las proteínas o
péptidos producidos como resultado de la expresión del retrovirus,
aunque también puede ser un efecto de la activación, de la
encapsidación o de la recombinación de genomas relacionados o
heterólogos y de proteínas o péptidos producidos como resultado de
dichos procesos; de esta manera, dichos genomas asociados a la
expresión y/o infección por MSRV-1 son una parte
integral de la potencial patogenicidad de este virus, y por lo tanto
constituyen tanto un medio de detección diagnóstica como dianas
terapéuticas especiales. De manera similar, cualquier agente
asociado, o cofactor de estas interacciones responsable de la
patogénesis en cuestión, tal como MSRV-2 o el
factor gliotóxico, que se describen en la solicitud de patente
publicada FR nº 2.716.198, podría participar en el desarrollo de
una estrategia general y muy eficaz para el diagnóstico,
prognóstico, seguimiento terapéutico y/o terapia integrada de la EM
en particular, aunque también de cualquier otra enfermedad asociada
a dichos agentes.
En este contexto, se ha realizado un
descubrimiento paralelo en otra enfermedad autoinmunológica, la
artritis reumatoide (AR), que ha sido descrito en la solicitud de
patente francesa presentada bajo el nº 95/02960, o en el
correspondiente documento
EP-A-731.168. Este descubrimiento
demuestra que, mediante la aplicación de enfoques metodológicos
similares a los que se utilizaron en los estudios del presente
solicitante sobre la EM, resultó posible identificar un retrovirus
expresado en la AR que comparte las secuencias descritas para
MSRV-1 en la EM, y también la coexistencia de una
secuencia asociada de MSRV-2 también descrita en la
EM. Con respecto a MSRV-1, las secuencias detectadas
en común en la EM y en la AR se refieren a los genes pol y
gag. En el estado actual de la técnica, resulta posible
asociar las secuencias de gag y pol descritas con las
cepas de MSRV-1 expresadas en dichas dos
enfermedades.
La presente solicitud de patente se refiere a
diversos resultados que son adicionales a los ya protegidos por las
solicitudes de patente francesa:
- -
- nº 92/04322 de fecha 03.04.1992. publicada con el nº 2.689.519;
- -
- nº 92/13447 de fecha 03.11.1992. publicada con el nº 2.689.521;
- -
- nº 92/13443 de fecha 03.11.1992. publicada con el nº 2.689.520;
- -
- nº 94/01529 de fecha 04.02.1994. publicada con el nº 2.715.936;
- -
- nº 94/01531 de fecha 04.02.1994. publicada con el nº 2.715.939;
- -
- nº 94/01530 de fecha 04.02.1994. publicada con el nº 2.715.936;
- -
- nº 94/01532 de fecha 04.02.1994. publicada con el nº 2.715.937;
- -
- nº 94/14322 de fecha 24.11.1994. publicada con el nº 2.727.428; y
- -
- nº 94/15810 de fecha 23.12.1994, publicada con el nº 2.728.585 o por la solicitud correspondiente, WO-A-95/21256, que da a conocer el aislamiento de secuencias de MSRV-1 de la región pol del retrovirus MSRV-1 asociado a la EM, a partir de la preparación de viriones originados de la línea PLI-2 anteriormente indicada o de muestras procedentes de pacientes que presentan EM.
\vskip1.000000\baselineskip
El documento
WO-A-94/28138 da a conocer la
asociación de la EM con un retrovirus denominado
HMSV-1, obteniendo secuencias retrovíricas de
material procedente de pacientes de EM mediante amplificación con
cebadores basados en una región altamente conservada de genes
pol retrovíricos.
El contexto de la presente invención se basa en
un material vírico, en estado aislado o purificado, que puede
reconocerse o caracterizarse de diferentes maneras de acuerdo con
las enseñanzas del documento
WO-A-97/06260,
- -
- el genoma del mismo comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que incluye las secuencias SEC ID nº 46, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, SEC ID nº 61, SEC ID nº 89, las secuencias complementarias de las mismas y sus secuencias equivalentes, en secuencias de nucleótidos particulares que muestran, para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos, una homología de por lo menos 50%, y preferentemente de por lo menos 70%, con dichas secuencias SEC ID nº 46, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, SEC ID nº 61, SEC ID nº 89, respectivamente, y las secuencias complementarias de las mismas,
- -
- la región de su genoma comprende los genes env y pol y una porción del gen gag, excluyendo la subregión que presenta una secuencia idéntica o equivalente a la secuencia SEC ID nº 1, codifica cualquier polipéptido que presenta, para cualquier sucesión contigua de por lo menos 30 aminoácidos, una homología de por lo menos 50%, y preferentemente de por lo menos 70%, con una secuencia peptídica codificada por cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que incluye las secuencias SEC ID nº 46, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, SEC ID nº 61, SEC ID nº 89 y las secuencias complementarias de las mismas,
- -
- el gen pol comprende una secuencia de nucleótidos parcial o totalmente idéntica o equivalente a la secuencia SEC ID nº 57,
- -
- el gen gag comprende una secuencia de nucleótidos parcial o totalmente idéntica o equivalente a la secuencia SEC ID nº 88.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, la invención se refiere a un fragmento
de nucleótidos que presenta por lo menos una de las definiciones
siguientes:
- -
- un fragmento de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 93, SEC ID nº 94, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 95, el fragmento 19-342 de la secuencia SEC ID nº 93, cualquier secuencia de nucleótidos codificante del fragmento 7-114 de la secuencia SEC ID nº 96, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 97, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 98, y las secuencias complementarias de las mismas, y no comprendiendo ni consistiendo dicho fragmento de nucleótidos de la secuencia HSERV-9,
- -
- un fragmento de nucleótidos seleccionado de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 93, SEC ID nº 94, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 95, el fragmento 19-342 de la secuencia SEC ID nº 93, cualquier secuencia de nucleótidos codificante del fragmento 7-114 de la secuencia SEC ID nº 96, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 97, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 98, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, la invención se refiere a cualquier
sonda de ácidos nucleicos para la detección de virus asociados a la
EM y/o a la artritis reumatoide (AR), que es capaz de hibridarse
específicamente con cualquier fragmento, tal como se ha definido
anteriormente, perteneciente o interior al genoma de dicho agente
patogénico. Se refiere, además, a cualquier sonda de ácidos
nucleicos para la detección de un agente patogénico y/o infeccioso
asociado a la AR, que es capaz de hibridarse específicamente con
cualquier fragmento tal como se ha definido anteriormente.
Asimismo, la invención se refiere a un cebador
para la amplificación mediante polimerización de un ARN o de un ADN
de un material vírico, asociado a la EM y/o a la AR, siendo capaz
dicho cebador de hibridarse específicamente con cualesquiera
fragmentos de nucleótidos comprendidos dentro de la invención.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de dicho cebador es
idéntica a cualquiera de las secuencias seleccionadas de entre el
grupo que incluye.
De manera general, la invención también
comprende cualquier ARN o ADN, y en particular cualquier vector de
replicación, que comprenda un fragmento genómico del material vírico
tal como se ha definido anteriormente, o un fragmento de
nucleótidos tal como se ha definido anteriormente.
Asimismo, la invención se refiere a los
diferentes péptidos codificados por cualquier marco de lectura
abierto perteneciente a un fragmento de nucleótidos tal como se ha
definido anteriormente, en particular cualquier polipéptido, por
ejemplo cualquier oligopéptido que forme o comprenda un determinante
antigénico reconocido por sueros de pacientes infectados por el
virus MSRV-1 y/o en los que el virus
MSRV-1 se ha reactivado. Preferentemente, dicho
polipéptido es antigénico, y se encuentra codificado por el marco de
lectura abierto que se inicia, en la dirección 5' a 3', en el
nucleótido 181 y que finaliza en el nucleótido 330 de la secuencia
SEC ID nº 1.
Más particularmente, la invención comprende los
polipéptidos siguientes:
- -
- un polipéptido codificado por cualquier marco de lectura abierto perteneciente a un fragmento de nucleótidos tal como se ha definido anteriormente,
- -
- preferentemente, un polipéptido seleccionado de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 95, SEC ID nº 96, el fragmento 7-114 de la secuencia SEC ID nº 96 y las secuencias SEC ID nº 97 y SEC ID nº 98.
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, la invención se refiere a un
polipéptido antigénico reconocido por los sueros de pacientes
infectados por el virus MSRV-1 y/o en los que el
virus MSRV-1 se ha reactivo, seleccionando dicho
polipéptido antigénico de un polipéptido tal como se ha definido
anteriormente.
Preferentemente, un polipéptido de la invención
se selecciona de entre las secuencias SEC ID nº 173, SEC ID nº 174,
SEC ID nº 175, SEC ID nº 180, SEC ID nº 181 y SEC ID nº 182.
La presente invención también propone
anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra el virus
MSRV-1, que se obtienen mediante la reacción
inmunológica corporal o de células de un ser humano o animal contra
un agente inmunogénico constituido por un polipéptido antigénico
tal como se ha definido anteriormente.
A continuación, la invención se refiere a:
- -
- reactivos para la detección del virus MSRV, o de una exposición al mismo, que comprende por lo menos una sustancia reactiva seleccionada de entre el grupo constituido por una sonda de la presente invención, un polipéptido, en particular un péptido antigénico, tal como se ha definido anteriormente, o un anticuerpo contra dicho polipéptido,
- -
- todas las composiciones diagnósticas, profilácticas o terapéuticas que comprenden uno o más péptidos, en particular péptidos antigénicos, tales como las definidas anteriormente, o uno o más anticuerpos contra los péptidos, expuestos anteriormente; este tipo de composición preferentemente es, a título de ejemplo, una composición de vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, la invención se refiere a cualquier
composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, en particular
para la inhibición de la expresión de por lo menos un virus asociado
a la EM o a la AR, y/o las actividades enzimáticas de las proteínas
de dicho virus, que comprende un fragmento de nucleótidos tal como
se ha definido anteriormente. De manera similar, se refiere a
cualquier composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, en
particular para la inhibición de la expresión de por lo menos un
agente patogénico y/o infeccioso asociado a la AR, que comprende un
fragmento de nucleótidos tal como se ha definido anteriormente.
Dichos mismos fragmentos o polinucleótidos, en
particular oligonucleótidos, pueden participar en todas las
composiciones adecuadas para detectar, según cualquier procedimiento
o método adecuado, un agente patológico y/o infeccioso asociado a
la EM y a la AR, respectivamente, en una muestra biológica. En dicho
procedimiento, un ARN y/o ADN que se cree pertenece o se origina en
dicho agente patológico y/o infeccioso, y/o el ARN y/o ADN
complementario, se pone en contacto con dicho fragmento de
nucleótidos.
Asimismo, la presente invención se refiere a
cualquier procedimiento para detectar la presencia o exposición de
dicho agente patológico y/o infeccioso, en una muestra biológica,
poniendo en contacto dicha muestra con un péptido, en particular un
péptido antigénico tal como se ha definido anteriormente, o un
anticuerpo contra dicho péptido tal como se ha definido
anteriormente.
En la práctica, y a título de ejemplo, un
dispositivo para la detección del virus MSRV-1
comprende un reactivo tal como se ha definido anteriormente,
soportado en un soporte sólido que es inmunológicamente compatible
con el reactivo, y un medio para poner en contacto la muestra
biológica, por ejemplo una muestra de sangre o de líquido
cerebroespinal, que probablemente contendrá anticuerpos
anti-MSRV-1, con dicho reactivo bajo
condiciones que permitan una posible reacción inmunológica,
acompañando a los elementos mencionados anteriormente, medios para
detectar el complejo inmunológico formado con dicho reactivo.
Finalmente, la descripción también se refiere a
la detección de anticuerpos
anti-MSRV-1 en una muestra
biológica, por ejemplo una muestra de sangre o de líquido
cerebroespinal, según la cual dicha muestra se pone en contacto con
un reactivo tal como se ha definido anteriormente, consistente de un
anticuerpo, bajo condiciones que permitan su posible reacción
inmunológica, y seguidamente se detecta la presencia del complejo
inmunológico formado de esta manera con el reactivo.
Antes de describir la invención en detalle, se
definen a continuación diferentes términos utilizados en la
descripción y en las reivindicaciones:
- -
- cepa o aislado se interpreta como referencia a cualquier fracción biológica infecciosa y/o patogénica que contiene, por ejemplo, virus y/o bacterias y/o parásitos, que genera poder patogénico y/o antigénico, albergado en un cultivo o en un huésped vivo, a título de ejemplo, una cepa vírica según la definición anterior puede contener un agente coinfeccioso, por ejemplo un protista patogénico,
- -
- el término "MSRV" utilizado en la presente descripción se refiere a cualquier agente patogénico y/o infeccioso asociado a la EM, en particular una especie vírica, conteniendo las cepas atenuadas de dicha especie vírica o las partículas defectivas-interfirientes o las partículas que contienen genomas coencapsidados, o alternativamente los genomas recombinados con una porción del genoma de MSRV-1, derivado de dicha especie. Los virus, y especialmente los virus que contienen ARN, es conocido que presentan una variabilidad que resulta, en particular, de tasas relativamente elevadas de mutación espontánea (7), considerada posteriormente para definir el concepto de equivalencia,
- -
- se entiende que virus humano se refiere a un virus capaz de infectar seres humanos, o que es albergado por ellos,
- -
- en vista de todas las variaciones naturales o inducidas y/o la recombinación que puede encontrarse al implementar la presente invención, los sujetos de la misma, definidos anteriormente y en las reivindicaciones, se han expresado incluyendo los equivalentes o derivados de los diferentes materiales biológicos definidos posteriormente, en particular de las secuencias homólogas de nucleótidos o de péptidos,
- -
- la variante de un virus o de un agente patogénico y/o infeccioso según la invención comprende por lo menos un antígeno reconocido por lo menos por un anticuerpo dirigido contra por lo menos un antígeno correspondiente de dicho virus y/o de dicho agente patogénico y/o infeccioso, y/o un genoma, cualquier parte del cual se detecta mediante por lo menos una sonda de hibridación y/o por lo menos un cebador de amplificación de nucleótidos específico para dicho virus y/o agente patogénico y/o infeccioso tal como, por ejemplo, para el virus MSRV-1, presentando los cebadores y las sondas una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 20 a SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 16 a SEC ID nº 19, SEC ID nº 31 a SEC ID nº 33, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 48, SEC ID nº 49, SEC ID nº 50, SEC ID nº 45 y las secuencias complementarias de las mismas, bajo condiciones de hibridación particulares bien conocidas por el experto en la materia.
- -
- según la invención, un fragmento de nucleótidos o un oligonucleótido o polinucleótido es una estructura de monómeros, o un biopolímero, caracterizado por la secuencia informacional de los ácidos nucleicos naturales, que es capaz de hibridarse con cualquier otro fragmento de nucleótidos bajo condiciones predeterminadas, resultando posible para la estructura que contenga monómeros de diferentes estructuras químicas y la obtención a partir de una molécula de ácidos nucleicos naturales y/o mediante recombinación genética y/o mediante síntesis química; un fragmento de nucleótidos puede ser idéntico a un fragmento genómico del virus MSRV-1 comentado en la presente invención, en particular un gen de dicho virus, por ejemplo pol o env en el caso de dicho virus,
- -
- de esta manera, un monómero puede ser un nucleótido natural de ácidos nucleicos cuyos elementos constituyentes son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada; en el ARN el azúcar es la ribosa, en el ADN el azúcar es la 2-desoxirribosa, dependiendo de si el ácido nucleico es ADN o ARN, la base nitrogenada se selecciona de entre adenina, guanina, uracilo, citosina y timina, o el nucleótido puede modificarse en por lo menos uno de los tres elementos constituyentes; a título de ejemplo, la modificación puede encontrarse en las bases, generando bases modificadas, tales como inosina, 5-metildesoxicitidina, desoxiuridina, 5-(dimetilamino)desoxiuridina, 2,6-diaminopurina, 5-bromodesoxiuridina y cualquier otra base modificada que estimule la hibridación; en el azúcar, la modificación puede consistir en la sustitución de por lo menos una desoxirribosa por una poliamida (8), y en el grupo fosfato, la modificación puede consistir en la sustitución del mismo por ésteres seleccionados, en particular, de entre difosfato, alquilfosfonato y arilfosfonato y ésteres fosforotioato,
- -
- la expresión "secuencia informacional" se interpreta como referencia a cualquier sucesión ordenada de monómeros cuya naturaleza química y orden en una dirección de referencia constituye un elemento de información funcional de la misma calidad que la de los ácidos nucleicos naturales,
- -
- el término "hibridación" se interpreta que se refiere al procedimiento durante el que, bajo condiciones de trabajo adecuadas, dos fragmentos de nucleótidos que presentan secuencias suficientemente complementarias se aparean formando una estructura compleja, en particular doble o triple, preferentemente en la forma de una hélice,
- -
- una sonda que comprende un fragmento de nucleótidos sintetizado químicamente u obtenido mediante digestión o corte enzimático de un fragmento de nucleótidos mayor, que comprende por lo menos seis monómeros, ventajosamente entre 10 y 1.000 monómeros, preferentemente entre 10 y 30 monómeros y más preferentemente entre 18 y 30, y que presenta una especificidad de hibridación bajo condiciones particulares; preferentemente una sonda que presenta menos de 10 monómeros, aunque preferentemente menos de 15 monómeros no se utiliza sola, sino que se utiliza en presencia de otras sondas de tamaño igualmente corto, bajo determinadas condiciones especiales, puede resultar útil utilizar sondas de tamaño superior a 100 monómeros; puede utilizarse una sonda, en particular, para fines diagnósticos, siendo dichas moléculas, por ejemplo, sondas de captura y/o de detección,
- -
- la sonda de captura puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido mediante cualquier medios apropiados es decir directa o indirectamente, por ejemplo mediante enlace covalente o adsorción pasiva,
- -
- la sonda de detección puede marcarse mediante un marcaje seleccionado, en particular, de entre isótopos radioactivos, enzimas seleccionados, en particular de peroxidasa y fosfatasa alcalina y aquellos capaces de hidrolizar un sustrato cromogénico, fluorogénico o luminiscente, compuestos químicos cromofóricos, cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes, análogos de base nitrogenada y biotina,
- -
- las sondas utilizadas con fines diagnósticos de la invención pueden utilizarse en todas las técnicas de hibridación conocidas, y en particular en las técnicas denominadas "TRANSFERENCIA POR PUNTOS" (9), "TRANSFERENCIA SOUTHERN" (10), "TRANSFERENCIA NORTHERN", que es una técnica idéntica a la "TRANSFERENCIA SOUTHERN" pero que utiliza ARN como diana, y la técnica SÁNDWICH (11); ventajosamente, la técnica SÁNDWICH se utiliza en la presente invención, que comprende una sonda de captura específica y/o una sonda de detección específica, interpretando que la sonda de captura y la sonda de detección presentan secuencias de nucleótidos por lo menos parcialmente diferentes,
- -
- cualquier sonda según la presente invención puede hibridarse in vivo o in vitro con ARN y/o con ADN con el fin de bloquear los fenómenos de la replicación, en particular la traducción y/o la transcripción y/o degradar dicho ADN y/o ARN,
- -
- un cebador es una sonda que comprende por lo menos seis monómeros, y ventajosamente entre 10 y 30 monómeros, y preferentemente entre 18 y 25 monómeros, presentando una especificidad de hibridación bajo condiciones particulares para el inicio de una polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación, tal como PCR (reacción en cadena de la polimerasa), en un procedimiento de elongación, tal como la secuenciación, en un método de transcripción inversa o similar,
- -
- dos secuencias de nucleótidos o de péptidos se denominan equivalentes o derivadas una respecto a la otra, o con respecto a una secuencia de referencia, si funcionalmente los biopolímeros correspondientes pueden llevar a cabo sustancialmente el mismo papel, sin ser idénticos, con respecto a la aplicación o utilización en cuestión, o en la técnica en la que participan; dos secuencias son, en particular, equivalentes, si se obtienen como resultado de la variabilidad natural, en particular la mutación espontánea de la especie a partir de la que se han identificado, o de variabilidad inducida, como dos secuencias homólogas, definiéndose el término "homología" posteriormente,
- -
- el término "variabilidad" se interpreta como referencia a cualquier modificación espontánea o inducida de una secuencia, en particular mediante sustitución y/o inserción y/o deleción de nucleótidos y/o de fragmentos de nucleótidos, y/o la extensión y/o acortamiento de la secuencia en uno o en ambos extremos; puede resultar una variabilidad no natural de las técnicas de manipulación genética utilizadas, por ejemplo la selección de cebadores de síntesis, degenerados o de otro tipo, para la amplificación de un ácido nucleico; esta variabilidad puede manifestarse en la modificación de cualquier secuencia de partida, considerada como de referencia, y capaz de expresarse en virtud de un grado de homología respecto a dicha secuencia de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En vista de que un virus que presente actividad
enzimática de transcriptasa inversa puede caracterizarse
enzimáticamente igualmente bien en forma de ARN y de ADN, se hará
referencia tanto al ADN vírico como al ARN vírico para caracterizar
las secuencias referentes a un virus que presente dicha actividad de
transcriptasa inversa, denominado MSRV-1 según la
presente descripción.
Las expresiones de orden utilizadas en la
presente descripción y en las reivindicaciones, tales como
"primera secuencia de nucleótidos" no se adoptan para expresar
un orden particular, sino con el fin de definir la invención con
mayor claridad.
La detección de una sustancia o agente se
entiende posteriormente que se refiere tanto a una identificación
como a una cuantificación, o a la separación o aislamiento, de dicha
sustancia o de dicho agente.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente, haciendo
referencia a las figuras adjuntas, en las que:
- la figura 1 muestra las secuencias generales
de consenso de ácidos nucleicos de los clones de
MSRV-1B amplificadas mediante la técnica de PCR en
la región "pol" definida por Shih (12), procedente de
ADN vírico originado de las líneas LM7PC y PLI-2, e
identificadas con las referencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID
nº 5 y SEC ID nº 6, y la secuencia de consenso en común con los
cebadores de amplificación, con la referencia SEC ID nº 7,
- la figura 2 proporciona la definición de un
marco de lectura funcional para cada familia de tipo
MSRV-1B/"pol de PCR", encontrándose definidas
dichas familias A a D, respectivamente, por las secuencias de
nucleótido SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6
indicadas en la figura 1,
- la figura 3 proporciona un ejemplo de
secuencia de consenso de las secuencias de MSRV-2B,
identificadas con SEC ID nº 11,
- la figura 4 es una representación de la
actividad de transcriptasa inversa (RT) en dpm (desintegraciones
por minuto) en las fracciones en sacarosa obtenidas de un gradiente
de purificación de los viriones producido por los linfocitos B en
cultivo procedentes de un paciente que sufre EM,
- la figura 5 proporciona, en las mismas
condiciones experimentales que en la figura 4, el ensayo de la
actividad de transcripción inversa en el cultivo de una línea de
linfocitos B obtenida a partir de un control libre de EM,
- la figura 6 representa la secuencia de
nucleótidos del clon PSJ17 (SEC ID nº 9),
- la figura 7 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 8 del clon denominado
M003-P004,
- la figura 8 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 2 del clon F11-1; la porción
situada entre las dos flechas en la región del cebador corresponde
a la variabilidad impuesta por la selección de cebador que se
utilizó para la clonación de F11-1; en la misma
figura se muestra la traducción en aminoácidos,
- la figura 9 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 1, y un posible marco de lectura funcional de
SEC ID nº 1 en términos de aminoácidos; en esta secuencia, se
subrayan las secuencias de consenso del gen pol,
- las figuras 10 y 11 proporcionan los
resultados de una PCR, en forma de una fotografía bajo luz
ultravioleta de un gel de agarosa impregnado con bromuro de etidio,
de los productos de amplificación obtenidos a partir de los
cebadores identificados como SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº
18 y SEC ID nº 19,
- la figura 12 proporciona una representación en
forma matricial de la homología entre SEC ID nº 1 de
MSRV-1 y la de un retrovirus endógeno denominado
HSERV9; esta homología, de por lo menos 65%, queda demostrada por
una línea continua, implicando la ausencia de una línea, una
homología inferior a 65%,
- la figura 13 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 46 del clon FBd3,
- la figura 14 representa la homología de
secuencias entre el clon FBd3 y el retrovirus
HSERV-9,
- la figura 15 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 51 del clon t pol,
- las figuras 16 y 17 representan,
respectivamente, las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 52 y SEC ID
nº 53 de los clones JLBc1 y JLBc2, respectivamente,
- la figura 18 representa la homología de
secuencias entre el clon JLBc1 y el clon FBd3, y
- la figura 19 representa la homología de
secuencias entre el clon JLBc2 y el clon FBd3,
- la figura 20 representa la homología de
secuencias entre los clones JLBc1 y JLBc2,
- las figuras 21 y 22 representan la homología
de secuencias entre el retrovirus HSERV-9 y los
clones JLBc1 y JLBc2, respectivamente,
- la figura 23 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 56 del clon GM3,
- la figura 24 representa la homología de
secuencias entre el retrovirus HSERV-9 y el clon
GM3,
- la figura 25 representa la localización de los
diferentes clones estudiados, respecto al genoma del retrovirus
conocido ERV9,
- la figura 26 representa la posición de los
clones F11-1, M003-P004,
MSRV-1B y PSJ17 en la región denominado en adelante
MSRV-1 pol*,
- la figura 27, dividida en tres figuras
sucesivas 27a-27c, representa un posible marco de
lectura que comprende la totalidad del gen pol,
- la figura 28 representa, según la secuencia
SEC ID nº 40, la secuencia de nucleótidos codificante del fragmento
péptido POL2B, que presenta la secuencia de aminoácidos identificada
por SEC ID nº 39,
- la figura 29 representa los valores de DO
(ensayos ELISA) a 492 nm obtenidos para 29 sueros de pacientes de
EM y de 32 sueros de controles sanos sometidos a ensayo con un
anticuerpo anti-IgG,
- la figura 30 representa los valores de DO
(ensayos ELISA) a 492 nm obtenidos de 36 sueros de pacientes de EM
y de 42 sueros de controles sanos sometidos a ensayo con un
anticuerpo anti-IgM,
- las figuras 31 a 33 representan los resultados
obtenidos (intensidad relativa de los puntos) para 43 octapéptidos
solapantes que cubren la secuencia de aminoácidos
61-110, según la técnica Spotscan, respectivamente
con un grupo de sueros de EM, con un grupo de sueros de control y
con el grupo de sueros de EM tras la deducción de un fondo
correspondiente a la máxima señal detectada en por lo menos un
octapéptido con el suero de control (intensidad=1), considerando
que estos sueros se diluyeron a 1/50. La columna en el extremo
derecho representa un estándar de escala gráfica no relacionado con
el ensayo serológico,
- la figura 34 representa las secuencias SEC ID
nº 41 y SEC ID nº 42 de dos polipéptidos que comprenden regiones
inmunodominantes, mientras que las secuencias SEC ID nº 43 y 44
representan polipéptidos inmunorreactivos específicos de la EM,
- la figura 35 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 59 del clon LB19 y tres marcos de lectura
potenciales de la secuencia SEC ID nº 59 en términos de
aminoácidos,
- la figura 36 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 88 (GAG*) y un marco de lectura potencial de
la secuencia SEC ID nº 88 en términos de aminoácidos,
- la figura 37 representa la homología de
secuencias entre el clon FBd13 y el retrovirus
HSERV-9; según esta representación, la línea
continua se refiere a un porcentaje de homología superior o igual a
70%, y la ausencia de una línea se refiere a un porcentaje de
homología más pequeño,
- la figura 38 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 61 del clon FP6 y tres marcos de lectura
potenciales de la secuencia SEC ID nº 61 en términos de
aminoácidos,
- la figura 39 representa la secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 89 del clon G+E+A y tres marcos de lectura
potenciales de la secuencia SEC ID nº 89 en términos de
aminoácidos,
- la figura 40 representa un marco de lectura
presente en la región E y codificante de una proteasa retrovírica
de MSRV-1 identificada como SEC ID nº 90,
- la figura 41 representa la respuesta de cada
suero de pacientes que sufren EM, indicada por el símbolo (+) y de
pacientes sanos, simbolizada por (-), sometidos a ensayo con un
anticuerpo anti-IgG, expresada como densidad óptica
neta a 492 nm,
- la figura 42 representa la respuesta de cada
suero de pacientes que sufren EM, indicada por los símbolos (+) y
(QS) y de pacientes sanos (-), sometidos a ensayo con un anticuerpo
anti-IgM, expresada como densidad óptica neta a 492
nm,
- la figura 43 representa el perfil de actividad
de RT en gradientes de densidad de sacarosa de pellets procedentes
de sobrenadantes de líneas de células B, la línea de control de
células B (\blacksquare) se obtuvo de un pariente de un paciente
con mitocondriopatía. La línea de células B de EM (\boxempty) se
obtuvo de un paciente con EM definida,
\newpage
- la figura 44 representa la alineación de
nucleótidos y de aminoácidos de las regiones pol conservadas de
virus detectados en el estudio (ver el Ejemplo 18) mediante la PCR
"Pan-retrovirus". El término "deleciones"
se representan mediante barras y las abreviaturas de una sola letra
se utilizan para referirse a aaminoácidos y a nucleótidos
(i=inosina). Las regiones más altamente conservadas VLPQG y YXDD se
representan como bloques separados en negrita en el extremo de cada
secuencia. Los aminoácidos que se encuentran presentes en la
totalidad o en la totalidad excepto una de las secuencias se
encuentran subrayadas. Los cebadores de PCR (modificados de (12))
PAN-UO y PAN-UI se encuentran
orientados 5' a 3' (sentido), mientras que el cebador
PAN-DI se encuentra orientado 3' a 5'
(antisentido). Se representan las degeneraciones en la parte
superior (PAN-UO y PAN-DI) o
inferior (PAN-UI) de las secuencias del cebador de
PCR. "I" se refiere a la extensión 5' de nueve bases,
cttggatcc, "-I" se refiere a la extensión 5' de nueve bases,
ctcaagctt. Las sondas de captura y de detección DpV1 y CpV1b
utilizadas en el ensayo ELISA se representan en la parte inferior de
una secuencia representativa cpol de MSRV. En tres
posiciones en la parte inferior de la secuencia traducida de
cpol de MSRV se representan en cursiva aminoácidos
alternativos (que representan variaciones de ácidos nucleicos "no
silenciosos") -únicamente se observaron sustituciones K e Y en
clones derivados de PLI-1, mientras que R y W se
encontraban codificados por una proporción significativa de los
clones con independencia del origen. Obsérvese que DpV1 se
encuentra marcado con peroxidasa y que CpV1b puede biotinilarse en
el extremo 5' en el caso de que
se utilicen placas recubiertas de estreptavidina. El nombre de cada secuencia se indica a la izquierda de la figura.
se utilicen placas recubiertas de estreptavidina. El nombre de cada secuencia se indica a la izquierda de la figura.
HTLV1: virus de la leucemia humana de tipo 1;
VIH1: virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1; MoMLV: virus
de la leucemia murina de Moloney; MPMV: virus
Mason-Pzifer del mono. ERV9: retrovirus endógeno 9.
MSRV-cpol: región pol conservada de
retrovirus asociado a esclerosis múltiple.
- La figura 45 representa un árbol filogenético
que se basa en la región de aminoácidos conservada codificada por
el gen pol de MSRV y de retrovirus endógenos y exógenos
representativos y de virus ADN con transcriptasa inversa. Fue
generado por el programa filogenético U.P.G.M.A. del software
Geneworks®.
HSRV: espumaretrovirus humano. EIAV: virus de la
anemia infecciosa equina. BLV: virus de la leucemia bovina. VIH1,
VIH2: virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y de tipo 2.
HTLV1 y HTLV2: virus de la leucemia humana de tipo 1 y de tipo 2.
F-MuLV: virus de la leucemia murina de Friend.
MoMLV: virus de la leucemia murina de Moloney. BAEV: virus endógeno
del babuino. GaLV/virus de la leucemia del gibón. HUMER41: secuencia
retrovírica endógena humana, clon 41. IAP: partícula intracisternal
de tipo A. MPMV: virus del mono Mason-Pzifer.
HERVK10: retrovirus endógeno humano K10. MMTV: virus del tumor
mamario del ratón. HSERV9 (secuencia de la base de datos ERV9):
secuencia humana del retrovirus endógeno 9. MSRV: retrovirus
asociado a la esclerosis múltiple. SIV: virus de la
inmunodeficiencia del simio; RTLV-H: secuencia
vírica H similar a transcriptasa inversa; SFV: virus espumoso del
simio; VISNA: retrovirus Visna; SIV1: virus de la inmunodeficiencia
del simio de tipo 1; SRV-2: retrovirus del simio de
tipo 2; SMRV-H: retrovirus H del mono ardilla.
- La figura 46 representa la secuencia de MSRV
en las regiones de proteasa y de transcriptasa inversa del gen
pol.
La traducción de aminoácidos se encuentra
alineada bajo la secuencia de nucleótidos correspondiente. La región
correspondiente a la ORF de proteasa clonada en un vector
recombinante y expresada en E. coli se representa dentro de
una caja. Las regiones correspondientes a los fragmentos A y B
amplificados en representas de plasma procedentes de pacientes de
EM se indican entre paréntesis. Las regiones de transcriptasa
inversa (RT) y de ARNasa H (RNH) se representan en cajas de líneas
punteadas. Los aminoácidos altamente conservados y/o los sitios
activos de actividades enzimáticas tanto de PRT como de RT
(incluyendo RNH) se encuentran subrayados.
- La figura 47A ilustra la detección específica
de la secuencia de ARN de pol de MSRV mediante
RT-PCR de la fracción de densidad de sacarosa
asociada a la actividad de RT y en el plasma de pacientes con EM; la
figura 47B representa el perfil de actividad de RT en un gradiente
de densidad de sacarosa obtenido con viriones extracelulares
peletizados a partir de un cultivo de plexo coroideo de pacientes
con EM. La fotografía en la parte inferior muestra un gel de
agarosa cargado de productos de PCR amplificados desde los productos
de RT-PCR de ronda 1 (ST1.1) con el conjunto de
cebadores ST1.2. De izquierda a derecha: control de agua 1 de la
etapa de RT-PCR con el conjunto ST1.1; control de
agua 2 amplificado a partir del control de agua 1 con los cebadores
anidados ST1.2; marcadores de peso molecular; fracciones nº 1 a 10
correspondiente al perfil de actividad de RT mostrado
anteriormente; muestras de plasma C1 y C2 procedentes de donantes de
sangre sanos; muestras de plasma MS1 y MS2 de dos pacientes de
EM.
- La figura 48 representa un ejemplo de una
variante y/o secuencia recombinada en la región del gen pol
definido mediante homología con las regiones solapantes indicadas en
la figura 25, tales como GM3, MSRV-1 pol*, t pol y
FBd3.
- La figura 49 representa las alineaciones de
nucleótidos (figura 49A) y de aminoácidos (figura 49B) de la región
pol entre los clones 1, 5 y 8 del mismo paciente (Experimento
46-7).
- La figura 50 representa las alineaciones de
nucleótidos (figura 50A) y de aminoácidos (figura 50B) de la región
pol entre los clones 41, 43 y 42 del mismo paciente
(Experimento 68-1).
- La figura 51 representa las alineaciones de
nucleótidos (figura 51A) y de aminoácidos (figura 51B) de la región
pol entre la secuencia de consenso (SEC ID nº 176) de los
clones 1, 5 y 8 del mismo paciente (Experimento
46-7) y la secuencia SEC ID nº 1 y entre sus
secuencies peptídicas correspondientes.
- La figura 52 representa las alineaciones de
nucleótidos (figura 52A) y de aminoácidos (figura 52B) de la región
pol entre la secuencia de consenso (SEC ID nº 169) de los clones 41,
43 y 42 del mismo paciente (Experimento 68-1) y la
secuencia SEC ID nº 1, y entre sus secuencias peptídicas
correspondientes.
- La figura 53 representa las alienaciones de
nucleótidos (figura 53A) y de aminoácidos (figura 53B) de la región
pol entre la secuencia de consenso (SEC ID nº 176) de los clones 1,
5 y 8 del mismo paciente (Experimento 46-7) y la
secuencia de consenso (SEC ID nº 169) de los clones 41, 43 y 42 del
mismo paciente (Experimento 68-1).
La Tabla 5 (al final de la descripción) muestra
las secuencias obtenidas mediante RT-PCR con
cebadores pol degenerados en fracciones de gradiente de
densidad de sacarosa que contienen el máximo de actividad de RT o
su control negativo (ver el Ejemplo 18); y
La Tabla 6 (al final de la descripción) muestra
los datos clínicos y los resultados de la detección de cpoI de MSRV
mediante PCR "Pan-retro" con ensayo ELISA
específico, en CSF de pacientes de EM y de control (ver el Ejemplo
18).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó una técnica de PCR derivada de la
técnica publicada por Shih (12). Esta técnica permite eliminar toda
las trazas de ADN contaminante mediante el tratamiento de todos los
componentes del medio de reacción con ADNasa. Simultáneamente,
utilizando cebadores diferentes aunque solapantes en dos series
sucesivas de ciclos de amplificación de PCR, resulta posible
incrementar la probabilidad de amplificación de un ADNc sintetizado
a partir de una cantidad de ARN inicialmente reducida y que se
reduce adicionalmente en la muestra por la acción espuria de la
ADNasa sobre el ARN. En efecto, la ADNasa se utiliza bajo
condiciones de actividad en exceso que permiten eliminar todas las
trazas de ADN contaminante antes de la inactivación de los restos de
dicho enzima en la muestra mediante calentamiento a 85ºC durante 10
minutos. Esta variante de la técnica PCR descrita por Shih (12) se
utilizó con un ADNc sintetizado a partir de ácidos nucleicos de
fracciones de partículas infecciosas purificadas en un gradiente de
sacarosa según la técnica descrita por H. Perron (13) a partir del
aislado "POL-2" (ECACC nº V92072202) producido
por la línea PLI-2 (ECACC nº 92072201) por una
parte, y del aislado MS7PG (ECACC nº V93010816) producido por la
línea LM7PC (ECACC nº 93010817), por otra parte. Estos cultivos se
obtuvieron siguiendo los métodos que formaban el sujeto de las
solicitudes de patente publicadas bajo los números WO 93/20188 y WO
93/20189.
Tras clonar los productos amplificados mediante
dicha técnica con el kit TA Cloning Kit® y el análisis de la
secuencia utilizando un secuenciador automático modelo 373A de
Applied Biosystems, las secuencias se analizaron utilizando el
software Geneworks® en la última versión disponible del banco de
datos Genebank®.
Las secuencias clonadas y secuenciadas a partir
de dichas muestras corresponden, en particular, a dos tipos de
secuencia: un primer tipo de secuencia, encontrado en la mayoría de
los clones (55% de los clones originados a partir de los aislados
POL-2 del cultivo PLI-2, y 67% de
los clones originados de los aislados MS7PG de los cultivos LM7PC),
que corresponden a una familia de secuencias "pol"
estrechamente similares, aunque diferentes, del retrovirus endógeno
humano denominado ERV-1 o HSERV-9, y
un segundo tipo de secuencia que corresponde a secuencias muy
fuertemente homólogas respecto a una secuencia atribuida a otro
agente infeccioso y/o patogénico denominado
MSRV-2.
El primer tipo de secuencia, que representa la
mayoría de los clones, consiste de secuencias cuya variabilidad
permite definir cuatro subfamilias de secuencias. Estas subfamilias
son suficientemente similares entre sí para que resulte posible
considerarlas quasi-especies originadas del mismo
retrovirus, tal como es bien conocido para el retrovirus
VIH-1 (14), o el resultado de la interferencia con
varios provirus endógenos corregulados en las células productoras.
Estos elementos endógenos más o menos defectivos son sensibles a las
mismas señales reguladoras posiblemente generados por un provirus
replicativo, debido a que pertenecen a la misma familia de
retrovirus endógenos (15). Esta nueva familia de retrovirus
endógenos, o alternativamente esta nueva especie retrovírica a
partir de la que se ha obtenido en cultivo la generación de
quasi-especie, y que contiene un consenso de las
secuencias indicadas posteriormente, se denomina
MSRV-1B.
La figura 1 presenta las secuencias generales de
consenso de los diferentes clones de MSRV-1B
secuenciados en el presente experimento, identificando estas
secuencias, respectivamente, con SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID
nº 5 y SEC ID nº 6. Estas secuencias muestran una homología con
respecto a los ácidos nucleicos comprendida entre 70% y 88% con la
secuencia de HSERV9 denominada X57147 y M37638 en la base de datos
GeneBank®. Se han definido cuatro secuencias de ácidos nucleicos de
"consenso" representativas de diferentes
quasi-especies de un retrovirus posiblemente
exógeno MSRV-1B, o de diferentes subfamilias de un
retrovirus endógeno MSRV-1B. Estas secuencias de
consenso representativas se presentan en la figura 2, con la
traducción en aminoácidos. Existe un marco de lectura funcional
para cada subfamilia de estas secuencias de MSRV-1B,
y puede observarse que el marco de lectura abierto funcional
corresponde en cada caso a la secuencia de aminoácidos que aparece
en la segunda línea bajo la secuencia de ácidos nucleicos. El
consenso general de la secuencia de MSRV-1B,
identificada como SEC ID nº 7 y obtenida mediante esta técnica de
PCR en la región "pol", se presenta en la figura 1.
El segundo tipo de secuencia que representa la
mayoría de los clones secuenciados se encuentra representado por la
secuencia de MSRV-2B presentada en la figura 3 e
identificada como SEC ID nº 11. Las diferencias observadas en las
secuencias correspondientes a los cebadores de PCR se explican
mediante la utilización de cebadores degenerados en forma de mezcla
utilizados bajo diferentes condiciones técnicas.
La secuencia de MSRV-2B (SEC ID
nº 11) es suficientemente divergente respecto a las secuencias
retrovíricas ya indicadas en los bancos de datos para que se
sugiera que la región de secuencia en cuestión pertenezca a un
nuevo agente infeccioso, denominado MSRV-2. Este
agente infeccioso podría, basándose en el análisis de las primeras
secuencias obtenidas, estar relacionado con un retrovirus aunque, en
vista de la técnica utilizada para obtener esta secuencia, también
podría ser un virus ADN cuyo genoma codifica un enzima que
incidentalmente presenta actividad de transcriptasa inversa, tal
como ocurre, por ejemplo con el virus de la hepatitis B, HBV (12).
Además, la naturaleza aleatoria de los cebadores degenerados
utilizados para esta técnica de amplificación por PCR podría haber
permitido perfectamente, como resultado de homologías de secuencia
no previstas o de sitios conservados en el gen de un enzima
relacionado, la amplificación de un ácido nucleico originado de un
agente patogénico y/o coinfeccioso procariótico o eucariótico
(protista).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la misma técnica de PCR, modificada
según la técnica de Shih (12), para amplificar y secuenciar el
material de ácido nucleico ARN presente en una fracción purificada
de viriones en el máximo de actividad de transcriptasa inversa
"de tipo LM7" en un gradiente de sacarosa según la técnica
descrita por H. Perron (13), y siguiendo los protocolos indicados
en el Ejemplo 1, a partir de una línea linfoblastoide espontánea
obtenida mediante autoinmortalización de un cultivo de linfocitos B
procedentes de un paciente con EM que era seropositivo para el
virus de Epstein-Barr (EBV), tras preparar un
cultivo de células sanguíneas linfoides en un medio de cultivo
adecuado que contenía una concentración adecuada de ciclosporina A.
En la figura 4 se proporciona una representación de la actividad de
transcriptasa inversa en las fracciones de sacarosa obtenidas de un
gradiente de purificación de los viriones producidos por dicha
línea. De manera similar, los sobrenadantes de cultivo de una línea
B obtenida bajo las mismas condiciones procedentes de un control sin
EM se trataron bajo las mismas condiciones, y el ensayo de
actividad de transcriptasa inversa en las fracciones de gradiente
de sacarosa demostraron ser negativas en todo momento (nivel de
fondo), y se presentan en la figura 5. La fracción 3 del gradiente
correspondiente a la línea B de EM y la misma fracción sin actividad
de transcriptasa inversa del gradiente de control no EM se
analizaron mediante la misma técnica de RT-PCR que
la anteriormente utilizada, derivada de Shih (12), seguido de las
mismas etapas de clonación y secuenciación indicadas en el Ejemplo
1.
Resulta particularmente importante indicar que
las secuencias de tipo MSRV-1 y de tipo
MSRV-2 se encuentran únicamente en el material
asociado a un máximo de actividad de transcriptasa inversa "de
tipo LM7" originada en la línea linfoblastoide B de EM. Estas
secuencias no se encontraron en el material procedente de la línea
linfoblastoide B de control (no EM) en 26 clones recombinantes
extraídos aleatoriamente. Únicamente pudieron encontrarse en dicho
control las secuencias contaminantes de tipo
Mo-MuLV, originadas a partir de la transcriptasa
inversa comercial utilizada para la etapa de síntesis de ADNc, y las
secuencias sin ninguna analogía retrovírica particular, como
resultado de la amplificación "de consenso" de las secuencias
de polimerasa homólogas producidas mediante esta técnica de PCR.
Además, la ausencia de una diana concentrada que compita con la
reacción de amplificación en la muestra de control permite la
amplificación de contaminantes diluidos. La diferencia de
resultados es, manifiestamente, significativamente elevada
(ji-cuadrado, p<0,001).
\vskip1.000000\baselineskip
Este enfoque se refiere a la obtención de
secuencias de secuencias de ADN transcritas inversamente a partir
del ARN supuestamente retrovírico en el aislado utilizando la
actividad de transcriptasa inversa presente en el mismo aislado.
Esta actividad de transcriptasa inversa puede funcionar en teoría
únicamente en presencia de un ARN retrovírico unido a un ARNt de
cebador o hibridarse con cadenas de ADN cortas ya transcritas
inversamente en las partículas retrovíricas (16). De esta manera,
la obtención de secuencias retrovíricas específicas en un material
contaminado con ácidos nucleicos celulares se optimizó, según estos
autores, mediante amplificación enzimática específica de las
porciones de los ARNs víricos con actividad vírica de transcriptasa
inversa. Con este fin, los autores determinaron las condiciones
físicoquímicas particulares bajo las que esta actividad enzimática
de transcripción inversa en ARNs contenidos en los viriones podría
resultar efectiva in vitro. Estas condiciones corresponden a
la descripción técnica de los protocolos presentada a continuación
(reacción endógena de RT, purificación, clonación y
secuenciación).
El enfoque molecular consistía en utilizar una
preparación de viriones concentrada aunque no purificada obtenida
de los sobrenadantes de cultivo de la línea PLI-2,
preparada según el método siguiente: los sobrenadantes de cultivo
se recogieron dos veces por semana, se precentrifugaron a 10.000 rpm
durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares y después
se congelaron a -80ºC o se utilizaron sin modificación para las
etapas siguientes. Los sobrenadantes frescos o descongelados se
centrifugaron en un cojín de glicerol-PBS al 30% a
100.000 g (ó 30.000 rpm en un rotor LKB-HITACHI de
tipo 45 T) durante 2 horas a 4ºC. Tras eliminar el sobrenadante, se
introdujo el pellet sedimentado en un volumen reducido de PBS,
constituyendo la fracción de viriones concentrada aunque no
purificada. Esta muestra vírica concentrada aunque no purificada se
utilizó para llevar a cabo una denominada reacción de transcripción
inversa endógena, tal como se indica posteriormente.
Un volumen de 200 ml de viriones purificado
según el protocolo descrito anteriormente y que contenía una
actividad de transcriptasa inversa de aproximadamente 1 a 5
millones de dpm se descongeló a 37ºC hasta la aparición de una fase
líquida, y después se dejó sobre hielo. Se preparó un tampón
concentrado 5 veces con los componentes siguientes:
Tris-HCl 500 mM, pH 8,2; NaCl 75 mM; MgCl_{2} 25
mM; DTT 75 mM y NP 40 al 0,10%; 100 ml de tampón 5X + 25 ml de
una solución 100 mM de dATP + 25 ml de una solución 100 mM de dTTP +
25 ml de una solución 100 mM de dGTP + 25 ml de una
solución 100 mM de dCTP + 100 ml de agua destilada estéril + 200 ml
de la suspensión de viriones (actividad de RT de 5 millones de DPM)
en PBS se mezclaron y se incubaron a 42ºC durante 3 horas. Tras
esta incubación, la mezcla de reacción se añadió directamente a una
mezcla tamponada de fenol/cloroformo/isoamilo (Sigma ref. P 3803);
se recogió la fase acuosa y se añadió un volumen de agua destilada
estéril a la fase orgánica para extraer nuevamente el material
residual de ácidos nucleicos. Las fases acuosas recogidas se
agruparon y los ácidos nucleicos contenidos se precipitaron mediante
la adición de acetato sódico 3 M, pH 5,2 a 1/10 volúmenes + 2
volúmenes de etanol + 1 ml de glucógeno
(Boehringer-Mannheim, ref. 901 393) y manteniendo
la muestra a -20ºC durante 4 horas durante la noche a +4ºC. El
precipitado obtenido tras la centrifugación a continuación se lavó
con etanol al 70% y se resuspendió en 60 ml de agua destilada. A
continuación, los productos de esta reacción se purificaron, se
clonaron y se secuenciaron según el protocolo que se describe a
continuación: se generaron ADN de extremos romos con adeninas
desapareadas en los extremos: en primer lugar se llevó a cabo una
reacción de "rellenado": se mezclaron 25 ml de la solución de
ADN previamente purificada con 2 ml de una solución 2,5 mM que
contenía, en cantidades equimolares, dATP + dGTP + dTTP + dCTP/1 ml
de ADN polimerasa de T4 (Boehringer-Mannheim, ref.
1004 786)/5 ml de 10X "tampón de incubación para enzima de
restricción" (Boehringer-Mannheim, ref. 1417
975)/1 ml de una solución de albúmina sérica bovina al 1%/16 ml de
agua destilada estéril. Esta mezcla se incubó durante 20 minutos a
11ºC. Se añadieron 50 ml de tampón TE y 1 ml de glucógeno
(Boehringer-Mannheim, ref. 901 393) a la misma antes
de la extracción de los ácidos nucleicos con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (Sigma, ref. P 3803) y de la
precipitación con acetato sódico tal como se ha indicado
anteriormente. El ADN precipitado tras la centrifugación se
resuspendió en 10 ml de tampón Tris 10 mM, pH 7,5. A continuación,
se mezclaron 5 ml de esta suspensión con 20 ml de tampón Taq 5X, 20
ml de dATP 5 mM, 1 ml (5 U) de ADN polimerasa Taq (Amplitaq^{TM})
y 54 ml de agua destilada estéril. Esta mezcla se incubó durante 2
horas a 75ºC con una película de aceite sobre la superficie de la
solución. El ADN suspendido en la solución acuosa aspirado bajo la
película de aceite tras la incubación se precipitó tal como se ha
indicado anteriormente y se resuspendió en 2 ml de agua destilada
estéril. El ADN obtenido se insertó en un plásmido utilizando el
kit TA Cloning^{TM}. Los 2 ml de solución de ADN se mezclaron con
5 ml de agua destilada estéril, 1 ml de un tampón de ligación
concentrado 10 veces "TAMPÓN DE LIGACIÓN 10X", 2 ml de
"VECTOR pCR^{TM}" (25 ng/ml) y 1 ml de "ADN LIGASA DE
T4". Esta mezcla se incubó durante la noche a 12ºC. Las etapas
siguientes se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del kit TA
Cloning^{TM} (British Biotechnology). Al final del procedimiento,
se recolectaron individualmente las colonias blancas de bacterias
recombinantes (blancas) con el fin de cultivarlas y permitir la
extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento
denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada
colonia recombinante se cortó con un enzima de restricción adecuado
y se analizó en un gel de agarosa. Los plásmidos que presentaban una
inserción detectada bajo luz UV tras la tinción del gel con bromuro
de etidio se seleccionaron para la secuenciación de la inserción,
tras la hibridación con un cebador complementario al promotor Sp6
presente en el plásmido de clonación del kit TA Cloning^{TM}. A
continuación, se llevó a cabo la reacción anterior a la
secuenciación siguiendo el método recomendado de utilización del
kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator
cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) y se
llevó a cabo la secuenciación automática con un secuenciador
automático modelo 373A de Applied Biosystems siguiendo las
instrucciones del fabricante.
El análisis discriminante de los bancos de datos
computerizados de las secuencias clonadas a partir de los
fragmentos de ADN presentes en la mezcla de reacción permitió
revelar una secuencia de tipo retrovírico. El clon PSJ17
correspondiente se secuenció por completo y la secuencia obtenida,
presente en la figura 6 e identificada como SEC ID nº 9, se analizó
utilizando el software "Geneworks®" en los bancos de datos
actualizados "Genebank^{TM}". En el análisis de los bancos
de datos no pudo encontrarse una secuencia idéntica descrita con
anterioridad. Únicamente pudo encontrarse una homología parcial con
algunos elementos retrovíricos conocidos. La homología relativa más
útil se refería a un retrovirus endógeno denominado
ERV-9, o HSERV-9, según las
referencias (18).
\vskip1.000000\baselineskip
Se definieron cinco oligonucleótidos, M001,
M002-A, M003-BCD, P004 y P005 con el
fin de amplificar el ARN originado a partir de los viriones
POL-2 purificados. Se llevaron a cabo reacciones de
control con el fin de comprobar la presencia de contaminantes
(reacción con agua). La amplificación consistía de una etapa de
RT-PCR según el protocolo descrito en el Ejemplo 2,
seguido de una PCR "anidada" según el protocolo de PCR
descrito en el documento
EP-A-0.569.272. En el primer ciclo
de RT-PCR, se utilizaron los cebadores M001 y P004
o P005. En el segundo ciclo de PCR, se utilizaron los cebadores
M002-A o M003-BCD y el cebador P004.
Los cebadores se encontraban situados de la manera siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Su composición es:
El producto de amplificación "anidada"
obtenido, y denominado M003-P004, se presenta en la
figura 7, y corresponde a la secuencia SEC ID nº 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó una técnica de PCR derivada de la
técnica publicada por Frohman (19). La técnica derivada permite,
utilizando un cebador específico en el extremo 3' del genoma que
debe amplificarse, elongar la secuencia hacia la región 5' del
genoma que debe analizarse. Esta variante técnica se describe en la
documentación de la compañía "Clontech Laboratories Inc."
(Palo-Ato, California, USA) suministrada con su
producto "5'-AmpliFINDER^{TM}
RACE Kit", que se utilizó en una fracción de viriones purificada
tal como se ha descrito anteriormente.
Los cebadores 3' específicos utilizados en el
protocolo del kit para la síntesis de ADNc y la amplificación por
PCR son, respectivamente, complementarios a las secuencias de
MSRV-1 siguientes:
Los productos originados de la PCR se obtuvieron
tras la purificación en gel de agarosa según métodos convencionales
(17) y después se resuspendieron en 10 ml de agua destilada. Debido
a que una de las propiedades de la polimerasa Taq consiste en
añadir una adenina en el extremo 3' de cada una de las dos cadenas
de ADN, el ADN obtenido se insertó directamente en un plásmido
utilizando el kit TA Cloning^{TM} (British Biotechnology). Los 2
ml de solución de ADN se mezclaron con 5 ml de agua destilada
estéril, 1 ml de un tampón de ligación concentrado 10 veces
"TAMPÓN DE LIGACIÓN 10X", 2 ml de "pCR^{TM} VECTOR" (25
ng/ml) y 1 ml de "ADN LIGASA DE T4". Esta mezcla se incubó
durante la noche a 12ºC. Las etapas siguientes se llevaron a cabo
siguiendo las instrucciones del kit TA Cloning^{TM} (British
Biotechnology). Al final del procedimiento, las colonias blancas de
bacterias recombinantes (blancas) se recolectaron individualmente
con el fin de cultivarse y para permitir la extracción de los
plásmidos incorporados siguiendo el procedimiento denominado
"miniprep" (17). La preparación de plásmidos de cada colonia
recombinante se cortó con un enzima de restricción adecuado y se
analizó en gel de agarosa. Los plásmidos que presentaban una
inserción detectada bajo luz UV tras la tinción del gel con bromuro
de etidio se seleccionaron para la secuenciación de la inserción,
tras la hibridación con un cebador complementario al promotor Sp6
presente en el plásmido de clonación del kit TA Cloning^{TM}. A
continuación, se llevó a cabo la reacción anterior a la
secuenciación siguiendo el método recomendado para la utilización
del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye
deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref.
401384) y la secuenciación automática se llevó a cabo con un
secuenciador automático modelo 373A de Applied Biosystems siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Dicha técnica se aplicó en primer lugar a dos
fracciones de viriones purificadas tal como se describe
posteriormente, en sacarosa procedentes del aislado
"POL-2" producido por la línea
PLI-2 por una parte, y procedente del aislado MS7PG
producido por la línea LM7PC por otra parte. Los sobrenadantes de
cultivo se recogieron dos veces por semana, se precentrifugaron a
10.000 rpm durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares y
después se congelaron a -80ºC o se utilizaron sin modificación para
las etapas siguientes. Los sobrenadantes frescos o descongelados se
centrifugaron en un cojín de glicerol al 30%-PBS a 100.000 g (O
30.000 rpm en un rotor LKB-HITACH de tipo 45T)
durante 2 horas a 4ºC. Tras eliminar el sobrenadante, se introdujo
el pellet sedimentado en un volumen reducido de PBS, constituyendo
la fracción de viriones concentrada aunque no purificada. El virus
concentrado seguidamente se aplicó a un gradiente de sacarosa en
tampón PBS estéril (15% a 50% p/p) y se ultracentrifugó a 35.000
rpm (100.000 g) durante 12 horas a +4ºC en un rotor basculante. Se
recogieron 10 fracciones, y se extrajeron 20 ml de cada fracción
tras la homogeneización para someter a ensayo la actividad de
transcriptasa inversa siguiendo la técnica descrita por H. Perron
(3). Las fracciones que contenía la actividad máxima de RT "de
tipo LM7" seguidamente se diluyeron en tampón PBS estéril y se
ultracentrifugaron durante una hora a 35.000 rpm (100.000 g) para
sedimentar las partículas víricas. El pellet de viriones purificados
obtenido de esta manera seguidamente se introdujo en un volumen
reducido de un tampón que resultase apropiado para la extracción
del ARN. La reacción de síntesis de ADNc indicada anteriormente se
llevó a cabo en este ARN extraído de viriones extracelulares
purificados. La amplificación por PCR siguiendo la técnica indicada
anteriormente permitió obtener el clon F1-11, cuya
secuencia, identificada como SEC ID nº 2, se presenta en la figura
8.
Dicho clon permite definir, conjuntamente con
los clones secuenciados anteriormente, una región de longitud
considerable (1,2 kb) representativa del gen "pol" del
retrovirus MSRV-1, tal como se presenta en la figura
9. Esta secuencia, denominada SEC ID nº 1, se reconstituyó a partir
de diferentes clones que se solapaban entre sí en sus extremos,
corrigiendo los artefactos asociados a los cebadores y a las
técnicas de amplificación o de clonación que interrumpirían
artificialmente el marco de lectura del total. Esta secuencia se
identifica posteriormente bajo la denominación "región
pol* de MSRV-1". El grado de homología de
la misma con la secuencia de HSERV-9 se muestra en
la figura 9.
En la figura 9, el marco de lectura potencial
con su traducción en aminoácidos se presenta en la parte inferior
de la secuencia de ácidos nucleicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó una técnica de PCR para detectar los
genomas de MSRV-1 y de MSRV-2 en
plasmas obtenidos tras extraer muestras de sangre de pacientes que
sufrían EM y de controles sin EM, en EDTA.
La extracción de los ARNs del plasma se llevó a
cabo según la técnica de P. Chomzynski (20) tras la adición de un
volumen de tampón que contenía tiocianato de guanidina a 1 ml de
plásmido almacenado tras ser recolectado bajo congelación a
-80ºC.
Para MSRV-2, la PCR se llevó a
cabo bajo las mismas condiciones y con los cebadores siguientes:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº:14
- 5' GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº:15
- 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, también se obtuvieron resultados
similares con los cebadores de PCR siguientes, en dos
amplificaciones sucesivas mediante PCR "anidada" en muestras
de ácidos nucleicos no tratados con ADNasa.
Los cebadores utilizados para esta primera etapa
de 40 ciclos con una temperatura de hibridación de 48ºC fueron los
siguientes:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº 27
- 5' GCCGATATCACCCGCCATGG 3', correspondiente a un cebador de PCR 5' de MSRV-2, para una primera PCR de muestras procedentes de pacientes,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº 28,
- 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3', correspondiente a un cebador 3' de PCR de MSRV-2, para una primera PCR de muestras procedentes de pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras esta etapa, se obtuvieron 10 ml del
producto de amplificación y se utilizaron para llevar a cabo una
segunda amplificación por PCR denominada "anidada" con
cebadores situados dentro de la región ya amplificada. Esta segunda
etapa tuvo lugar durante 35 ciclos, a una temperatura de hibridación
del cebador ("hibridación") de 50ºC. El volumen de reacción
era 100 ml.
Los cebadores utilizados para esta segunda etapa
fueron los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº 29, 5' CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3', correspondiente a un cebador de PCR 5' de MSRV-2, para una PCR anidada de muestras procedentes de pacientes,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº 30, 5' TCTCCACTCCGAATATTCCG 3', correspondiente a un cebador 3' de PCR de MSRV-2, para una PCR anidada de muestras procedentes de pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Para MSRV-1, la amplificación se
llevó a cabo en dos etapas. Además, la muestra de ácidos nucleicos
se trató previamente con ADNasa, y se llevó a cabo una PCR de
control sin RT (transcriptasa inversa de AMV) en las dos etapas de
amplificación, de manera que se verificase que la amplificación de
RT-PCR procedía exclusivamente del ARN de
MSRV-1. En el caso de un control positivo sin RT, la
muestra alícuota inicial de ARN se trataba nuevamente con ADNasa y
se amplificaba nuevamente.
El protocolo de tratamiento con ADNasa sin
actividad de ARNasa fue el siguiente: el ARN extraído se dividió en
alícuotas en presencia de "inhibidor de ARNasa"
(Boehringer-Mannheim) en agua tratada con DEPC a una
concentración final de 1 mg en 10 ml; a estos 10 ml, se añadió 1 ml
de "ADNasa libre de ARNasa"
(Boehringer-Mannheim) y 1,2 ml de tampón de pH 5
que contenía acetato sódico 0,1 m/l y MgSO_{4} 5
mM/l; la mezcla se incubó durante 15 minutos a 20ºC y se calentó a
95ºC durante 1,5 minutos en un
"termociclador".
La primera etapa de RT-PCR de
MSRV-1 se llevó a cabo según una variante del método
de amplificación de ARN descrito en la solicitud de patente nº
EP-A-0.569.272. En particular, la
etapa de síntesis de ADNc se llevó a cabo a 42ºC durante una hora;
la amplificación de PCR tiene lugar durante 40 ciclos, con una
temperatura de hibridación del cebador ("hibridación") de
53ºC. El volumen de reacción era 100 ml.
Los cebadores utilizados para esta primera etapa
fueron los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº:16
- 5' AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº:17
- 5' TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras esta etapa, se extrajeron 10 ml del
producto de amplificación y se utilizaron para llevar a cabo una
segunda amplificación por PCR denominada "anidada" con
cebadores situados dentro de la región ya amplificada. Esta segunda
etapa tuvo lugar durante 35 ciclos, a una temperatura de hibridación
de cebador ("hibridación") de 53ºC. El volumen de reacción era
100 ml.
\newpage
Los cebadores utilizados para esta segunda etapa
fueron los siguientes:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº:18
- 5' TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3';
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº:19
- 5' AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 10 y 11 presentan los resultados de
PCR en forma de fotografías bajo luz ultravioleta de geles de
agarosa impregnados con bromuro de etidio, en los que se llevó a
cabo una electroforesis de los productos de amplificación por PCR
aplicados separadamente en los diferentes pocillos.
La fotografía superior (figura 10) muestra el
resultado de la amplificación específica de
MSRV-2.
El pocillo número 8 contenía una mezcla de
marcadores de peso molecular de ADN, y los pocillos 1 a 7
representan, en orden, los productos amplificados a partir de los
ARNs totales procedentes de plasmas originados en 4 controles sanos
sin EM (pocillos 1 a 4) y procedentes de 3 pacientes que sufrían EM
en diferentes estadios de la enfermedad (pocillos 5 a 7).
En esta serie, el material de ácidos nucleicos
de MSRV-2 se detectó en el plasma en un caso de EM
de entre los 3 casos sometidos a ensayo, y en ninguno de los 4
plasmas de control. Otros resultados obtenidos de series más
extensas confirmaron estos resultados.
La fotografía en la parte inferior (figura 11)
muestra el resultado de la amplificación específica mediante
RT-PCR "anidada" de MSRV-1:
el pocillo nº 1 contenía el producto de PCR
producido con agua únicamente, sin adición de transcriptasa inversa
de AMV; el pocillo nº 2 contenía el producto de PCR producido con
agua únicamente, con adición de transcriptasa inversa de AMV; el
pocillo número 3 contenía una mezcla de marcadores de peso molecular
de ADN; los pocillos 4 a 13 contenían, en orden, los productos
amplificados a partir de los ARNs totales extraídos de fracciones
de gradiente de sacarosa (recogidos en dirección hacia abajo), en
cuyo gradiente un pellet de viriones originado a partir de un
sobrenadante de un cultivo infectado por MSRV-1 y
MSRV-2 se centrifugó hasta el equilibrio siguiendo
el protocolo descrito por H. Perron (13); en el pocillo 14 no se
aplicó nada; en los pocillos 15 a 17 se aplicaron los productos
amplificados de ARN extraídos de plasmas originados en 3 pacientes
diferentes que sufrían EM en diferentes estadios de la
enfermedad.
El genoma retrovírico de MSRV-1
en efecto se encontraba en la fracción de gradiente de sacarosa que
contenía el máximo de actividad de transcriptasa inversa, medida
según la técnica descrita por H. Perron (3), con una intensidad muy
fuerte (fracción 5 del gradiente, situada en el pocillo nº 8). Se
había producido una ligera amplificación en la primera fracción
(pocillo nº 4), probablemente correspondiente a ARN liberado por las
partículas lisadas que flotaban en la superficie del gradiente; de
manera similar, sedimentaron residuos agregados en la última
fracción (fondo del tubo),
que incluían unas cuantas copias del genoma de MSRV-1 que habían dado lugar a una amplificación de baja intensidad.
que incluían unas cuantas copias del genoma de MSRV-1 que habían dado lugar a una amplificación de baja intensidad.
De los 3 plasmas de EM sometidos a ensayo en
dicha serie, se identificó ARN de MSRV-1 en un caso,
produciendo una amplificación muy intensa (pocillo nº 17).
En dicha serie, el ARN genómico retrovírico de
MSRV-1, probablemente correspondiente a partículas
víricas extracelulares presentes en el plasma en número
extremadamente reducido, se detectó mediante RT-PCR
"anidada" en un caso de EM de entre 3 casos sometidos a
ensayo. Otros resultados obtenidos en series más extensas
confirmaron estos resultados.
Además, la especificidad de la secuencia
amplificada mediante estas técnicas de PCR puede verificarse y
evaluarse mediante la técnica "ELISA", tal como se describe en
F. Mallet (21) y en el documento
FR-A-2.663.040.
Para MSRV-1, los productos de la
PCR anidada indicada anteriormente pueden someterse a ensayo en dos
sistemas ELISA que permiten detectar separadamente una secuencia de
consenso A y una secuencia de consenso B+C+D de
MSRV-1, correspondientes a las subfamilias indicadas
en el Ejemplo 1 y en las figuras 1 y 2. En efecto, las secuencias
estrechamente similares a la secuencia de consenso B+C+D pueden
encontrarse esencialmente en las muestras de ARN originadas en
viriones MSRV-1 purificados a partir de cultivos o
amplificados a partir de líquidos biológicos extracelulares de
pacientes de EM, mientras que las secuencias estrechamente similares
a la secuencia de consenso A esencialmente se encuentran en ADN
celular humano normal.
El sistema ELISA/MSRV-1 para la
captura e hibridación específica de los productos de PCR de la
subfamilia A utiliza un oligonucleótido de captura cpVIA con un
enlace amina en el extremo 5' y un oligonucleótido de detección
biotinilado dpV1A, que presentan las secuencias siguientes,
respectivamente:
- -
- cpV1a, identificado como SEC ID nº 31,
- 5' GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3', correspondiente al oligonucleótido de captura de ELISA para los productos de la PCR anidada de MSRV-1 realizados con los cebadores identificados como SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, opcionalmente seguido de la amplificación con los cebadores identificados como SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19 en muestras procedentes de pacientes,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- dpV1A, identificado como SEC ID nº 3,
- 5' CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3', correspondiente al oligonucleótido de captura de ELISA para la subfamilia A de los productos de PCR "anidada" de MSRV-1 realizados con los cebadores identificados como SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, opcionalmente seguido de la amplificación con los cebadores identificados como SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19 en muestras procedentes de pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema ELISA/MSRV-1 para la
captura e hibridación específica de los productos de PCR de la
subfamilia B+C+D utiliza el mismo oligonucleótido biotinilado de
detección, dpV1A, y un oligonucleótido de captura, cpV1B, con un
enlace amina en el extremo 5', que presentan como secuencias:
- -
- dpV1B, identificado como SEC ID nº 33,
- 5' CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3', correspondiente al oligonucleótido de captura ELISA para la subfamilia B+C+D de los productos de la PCR "anidada" de MSRV-1 realizada con los cebadores identificados como SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17, opcionalmente seguido de la amplificación con los cebadores identificados como SEC ID nº 18 y SEC ID nº 19 en muestras de pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
- Este sistema de detección ELISA permitió verificar que ninguno de los productos de PCR amplificados de esta manera a partir de plasmas tratados con ADNasa de pacientes de EM contenía una secuencia de la subfamilia A, y que la totalidad eran positivos con la secuencia de consenso de las subfamilias B, C y D.
- Para MSRV-2, se evaluó una técnica ELISA similar en aislados originados en cultivos celulares infectados, utilizando los cebadores de amplificación por PCR siguientes:
- -
- cebador 5' identificado como SEC ID nº 34
- 5' AGTGYTRCCMCARGGCGCTGAA 3', correspondiente a un cebador 5' de PCR de MSRV-2, para la PCR de muestras procedente de cultivos,
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº 35
- 5' GMGGCCAGCAGSAKGTCATCCA 3', correspondiente a un cebador 3' de PCR de MSRV-2, para la PCR de muestras procedentes de cultivos,
- y los oligonucleótidos de captura con un enlace amina en el cpV2 del extremo 5' y el oligonucleótido biotinilado de detección dpV2, que presentan las secuencias respectivas siguientes:
- -
- cpV2 identificado como SEC ID nº 36
- 5' GGATGCCGCCTATAGCCTCTAC 3', correspondiente a un oligonucleótido de captura de ELISA para los productos de PCR de MSRV-2 realizada con los cebadores SEC ID nº 34 y SEC ID nº 35, u opcionalmente con los cebadores degenerados definidos por Shih (12).
- -
- dpV2, identificado como SEC ID nº 37
- 5' AAGCCTATCGCGTGCAGTTGCC 3', correspondiente a un oligonucleótido de detección de ELISA para los productos de la PCR de MSRV-2 realizada con los cebadores SEC ID nº 34 y SEC ID nº 35, u opcionalmente con los cebadores degenerados definidos por Shih (12).
\vskip1.000000\baselineskip
Dichos sistema de amplificación por PCR con un
par de cebadores diferente de aquellos que se han indicado
anteriormente para la amplificación de muestras procedentes de
pacientes ha permitido confirmar la infección por
MSRV-2 de cultivos in vitro y de muestras de
ácidos nucleicos utilizados para los estudios de biología
molecular.
Considerando lo expuesto anteriormente, los
primeros resultados de la detección por PCR del genoma de agentes
patogénicos y/o infecciosos demuestra que resulta posible que puedan
circular "virus" libres en el flujo sanguíneo de pacientes en
una fase virulenta, aguda, fuera del sistema nervioso. Lo expuesto
anteriormente es compatible con la presencia prácticamente
invariable de "huecos" en la barrera hematocefálica de
pacientes en una etapa activa de la EM.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como ya se ha indicado en el Ejemplo 5, se
utilizó una técnica de PCR derivada de la técnica publicada de
Frohman (19). La técnica derivada permite, utilizando un cebador
específico en el extremo 3' del genoma que debe amplificarse,
elongar la secuencia hacia la región 5' del genoma que debe
analizarse. Esta variante técnica se describe en la documentación
de "Clontech Laboratories Inc." (Palo-Alto,
California, USA), suministrado con su producto
"5'-AmpliFINDER^{TM} RACE kit", que se
utilizó en una fracción de viriones purificada tal como se ha
indicado anteriormente.
Con el fin de llevar a cabo una amplificación de
la región 3' del genoma retrovírico de MSRV-1 que
comprende la región del gen "env", se llevó a cabo un
estudio para determinar una secuencia de consenso en las regiones
LTR del mismo tipo que las del retrovirus endógeno defectivo
HSERV-9 (18, 24), con el que el retrovirus
MSRV-1 muestra homologías parciales.
Se utilizó el mismo cebador 3' específico en el
protocolo del kit para la síntesis del ADNc y para la amplificación
por PCR; la secuencia del mismo es la siguiente:
| GTGCTGATTGGTGTATTTACAATCC | (SEC ID nº 45). |
La síntesis del ADN complementario (ADNc) y la
amplificación unidireccional por PCR con el cebador anteriormente
indicado se llevaron a cabo en una etapa según el método descrito en
la patente EP-A-0.569.272.
Los productos originados en la PCR se extrayeron
tras la purificación del gel de agarosa siguiendo métodos
convencionales (17), y después se resuspendieron en 10 ml de agua
destilada. Debido a que una de las propiedades de la polimerasa Taq
consiste en añadir una adenina en el extremo 3' de cada una de las
dos cadenas de ADN, el ADN obtenido se insertó directamente en un
plásmido utilizando el kit TA Cloning^{TM} kit (British
Biotechnology). Se mezclaron 2 ml de solución de ADN con 5 ml de
agua destilada estéril, 1 ml de un tampón de ligación concentrado
10 veces "TAMPÓN DE LIGACIÓN 10X", 2 ml de vector "VECTOR
pCR^{TM}" (25 ng/ml) y 1 ml de "ADN LIGASA DE T4". Esta
mezcla se incubó durante la noche a 12ºC. Se llevaron a cabo las
etapas siguientes siguiendo las instrucciones del kit TA Cloning®
(British Biotechnology). Al final del procedimiento, se recolectaron
individualmente las colonias blancas de bacterias recombinantes
(blancas) con el fin de cultivarlas y permitir la extracción de los
plásmidos incorporados siguiendo el procedimiento denominado
"miniprep" (17). La preparación de plásmidos de cada colonia
recombinante se cortó con un enzima de restricción adecuado y se
analizó en gel de agarosa. Los plásmidos que presentaban una
inserción detectada bajo luz UV tras la tinción del gel con bromuro
de etilo se seleccionaron para la secuenciación de la inserción,
tras la hibridación con un cebador complementario al promotor Sp6
presente en el plásmido de clonación del kit TA Cloning^{TM}. A
continuación, se llevó a cabo la reacción antes de la secuenciación
siguiendo el método recomendado para la utilización del kit de
secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle
sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) y se llevó a
cabo la secuenciación automática con un "secuenciador automático
modelo 373 A", de Applied Biosystems, siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Dicho enfoque técnico se aplicó a una muestra de
viriones concentrada tal como se indica posteriormente a partir de
una mezcla de sobrenadantes de cultivo producidos por líneas
linfoblastoide B, tal como se describe en el Ejemplo 2, establecida
a partir de linfocitos de pacientes que sufren EM y que presenta
actividad de transcriptasa inversa que resulta detectable según la
técnica descrita por Perron et al. (3): los sobrenadantes de
cultivo se recogieron dos veces semanalmente, se precentrifugaron a
10.000 rpm durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares
y después se congelaron a -80ºC o se utilizaron sin modificación
para las etapas siguientes. Los sobrenadantes frescos o
descongelados se centrifugaron en un cojín de glicerol al 30%-PBS a
100.000 g durante 2 horas a 4ºC. Tras eliminar el sobrenadante, el
pellet sedimentado constituye la muestra de viriones concentrados
aunque no purificados. El pellet obtenido de esta manera se
introdujo en un volumen reducido de un tampón apropiado para la
extracción del ARN. La reacción de síntesis de ADNc indicada
anteriormente se llevó a cabo en dicho ARN extraído a partir de
viriones extracelulares concentrados.
La amplificación por RT-PCR
según la técnica indicada anteriormente permitió obtener el clon
FBd3, cuya secuencia, identificada como SEC ID nº 46, se presenta
en la figura 13.
En la figura 14, se muestra la homología de
secuencias entre el clon FBd3 y el retrovirus
HSERV-9 en el gráfico matricial mediante una línea
continua para cualquier homología parcial superior o igual a 65%.
Puede observarse que existen homologías en las regiones
flanqueantes del clon (con el gen pol en el extremo 5' y con
el gen env y después la LTR en el extremo 3'), pero que la
región interna es totalmente divergente y no muestra ninguna
homología, ni siquiera débil, con el gen "env" de HSERV9.
Además, resulta evidente que el clon FBd3 contiene una región
"env" más larga que la que se describe para
HSERV-9 endógeno defecto; de esta manera, puede
observarse que la región divergente interna constituye una
"inserción" entre las regiones de homología parcial con los
genes defectivos de HSERV-9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se definieron cuatro oligonucleótidos, F1, B4,
F6 y B1, para amplificar ARN procedente de viriones concentrados de
las cepas POL2 y MS7PG. Se llevaron a cabo reacciones de control
para comprobar si se encontraban presentes contaminantes (reacción
con agua). La amplificación consistía de una primera etapa de
RT-PCR según el protocolo descrito en la solicitud
de patente EP-A-0 569 272, seguido
de una segunda etapa de PCR realizada en 10 ml de producto de la
primera etapa con cebadores internos a la región amplificada primera
(PCR "anidada"). En el primer ciclo de RT-PCR,
se utilizaron los cebadores F1 y B4. En el segundo ciclo de PCR, se
utilizaron los cebadores F6 y B1. Los cebadores se encuentran
localizados de la manera siguiente:
Su composición es:
El producto de la amplificación "anidada"
obtenido y denominado "t pol" se presenta en la figura 15, y
corresponde a la secuencia SEC ID nº 51.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo una biblioteca de ADNc siguiendo el
procedimiento descrito por el fabricante de los kits módulo de
síntesis de ADNc, módulo de ligación rápida de adaptador de ADNc,
módulo de clonación rápida de ADNc y módulo de empaquetamiento
in vitro de lambda gt10 (Amersham, refs. RPN1256Y/Z, RPN1712,
RPN1713, RPN1717, N334Z) a partir del ARN mensajero extraído de
células de una línea linfoblastoide B tal como la indicada en el
Ejemplo 2, establecida a partir de linfocitos procedentes de un
paciente que sufría EM y que presentaba actividad de transcriptasa
inversa que era detectable según la técnica descrita por Perron
et al. (3).
Se definieron oligonucleótidos para la
amplificación del ADNc clonado en la biblioteca de ácidos nucleicos
entre la región 3' del clon PSJ17 (pol) y la región (LTR) 5'
del clon FBd3. Se llevaron a cabo reacciones de control para
comprobar la presencia de contaminantes (reacción con agua). Las
reacciones de PCR realizadas con los ácidos nucleicos clonados en
la biblioteca con diferentes pares de cebadores permitió la
amplificación de una serie de clones que unen secuencias de
pol con las secuencias o LTR de tipo
MSRV-1.
Dos clones son representativos de las secuencias
obtenidas en la biblioteca de ADNc celular:
- -
- clon JLBcl, cuya secuencia, SEC ID nº 52, se presenta en la figura 16,
- -
- clon JLBc2, cuya secuencia, SEC ID nº 53, se presenta en la figura 17.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de los clones JLBc1 y JLBc2 eran
homólogas a la del clon FBd3, según resulta evidente de las figuras
18 y 19. La homología entre el clon JLBc1 y el clon JLBc2 se muestra
en la figura 20.
Las homologías entre los clones JLBc1 y JLBc2,
por una parte, y la secuencia de HSERV9, por otra parte, se
presentan, en las figuras 21 y 22, respectivamente.
Se apreciará que la región de homología entre
JLB1, JLB2 y FBd3 comprende, con unas cuantas variaciones de
secuencia y de tamaño de la "inserción", la secuencia adicional
ausente ("insertada") en la secuencia de env de
HSERV-9, tal como se indica en el Ejemplo 8.
También se apreciará que la región
"pol" clonada es muy homóloga respecto a
HSERV-9, no presenta un marco de lectura
(considerando los errores de secuencia inducidos por las técnicas
utilizadas, incluyendo incluso el secuenciador automático) y
diverge de las secuencias de MSRV-1 obtenidas a
partir de los viriones. En vista del hecho de que dichas secuencias
se clonaron a partir del ARN de células que expresaban partículas de
MSRV-1, resulta probable que se originen a partir
de elementos retrovíricos endógenos relacionados con la familia
ERV9; lo anterior resulta más probable en vista del hecho de que los
genes pol y env se encuentran presentes en el mismo
ARN, que claramente no es el ARN genómico de MSRV-1.
Algunos de dichos elementos de ERV9 presentan LTR funcionales que
pueden ser activados por virus replicativos codificantes de
transactivadores homólogos y heterólogos. Bajo estas condiciones,
la relación entre MSRV-1 y HSERV-9
convierte en probable la transactivación de los elementos de ERV9
endógenos defectivos (o no) por parte de proteínas transactivadoras
de MSRV-1 homólogas e incluso idénticas.
Este tipo de fenómeno puede inducir una
interferencia vírica entre la expresión de MSRV-1 y
los elementos endógenos relacionados. Dicha interferencia
generalmente conduce a una expresión denominada
"defectiva-interfiriente", algunas
características de la cual se encontraron en los cultivos infectados
por MSRV-1 estudiados. Además, dicho fenómeno no
carece de la generación de expresión de polipéptido, o incluso de
proteínas retrovíricas endógenas que no resultan necesariamente
toleradas por el sistema inmunológico. Dicho esquema de expresión
aberrante de elementos endógenos relacionados con
MSRV-1 e inducidos por éste podría multiplicar el
número de antígenos aberrantes y, por lo tanto, contribuir a la
inducción de procesos autoinmunológicos, tales como los observados
en la EM.
Sin embargo, resulta esencial indicar que los
clones JLBc1 y JLBc2 difieren de la secuencia de ERV9 o de HSERV9
ya indicadas, en que presentan una región env más larga que
comprende una región adicional totalmente divergente de ERV9. Por
lo tanto, La relación de los mismos con la familia endógena de ERV9,
por lo tanto, puede definirse, aunque constituyen claramente
elementos nuevos no descritos hasta ahora. En efecto, la
interrogación de los bancos de datos de secuencias de ácidos
nucleicos disponibles en la versión nº 15 (1995) del software
"Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) no permitieron identificar
una secuencia homóloga conocida en la región env de dichos
clones.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como ya se ha indicado en el Ejemplo 5, se
utilizó una técnica de PCR publicada por Frohman (19). La técnica
derivada permite, utilizando un cebador específico en el extremo 3'
del genoma que debe amplificarse, elongar la secuencia hacia la
región 5' del genoma que debe analizarse. Esta variante técnica se
describe en la documentación de la compañía Clontech Laboratories
Inc. (Palo-Alto, California, USA) suministrada con
su producto "5'-AmpliFINDER^{TM} RACE kit",
que se utilizó en una fracción de viriones purificada tal como se ha
indicado anteriormente.
Con el fin de llevar a cabo una amplificación de
la región 5' del genoma retrovírico de MSRV-1
partiendo de la secuencia pol ya secuenciada (clon
F11-1) y extendiéndose hacia el gen gag, se
definieron cebadores específicos de MSRV-1.
Los cebadores 3' específicos utilizados en el
protocolo del kit para la síntesis del ADNc y la amplificación por
PCR son, respectivamente, complementarios a las secuencias de
MSRV-1 siguientes:
Los productos originados de la PCR se extrajeron
tras la purificación en gel de agarosa según métodos convencionales
(17) y después se resuspendieron en 10 ml de agua destilada. Debido
a que una de las propiedades de la polimerasa Taq consiste en
añadir una adenina en el extremo 3' de cada una de las dos cadenas
de ADN, se insertó directamente el ADN obtenido en un plásmido
utilizando el kit TA Cloning^{TM} (British Biotechnology). Se
mezclaron los 2 ml de solución de ADN con 5 ml de agua destilada
estéril, 1 ml de un tampón de ligación concentrado 10 veces
"TAMPÓN DE LIGACIÓN 10X", 2 ml de "VECTOR pCR^{TM}" (25
ng/ml) y 1 ml de "ADN LIGASA DE T4". Esta mezcla se incubó
durante la noche a 12ºC. Las etapas siguientes se llevaron a cabo
siguiendo las instrucciones del kit TA Cloning® (British
Biotechnology). Al final del procedimiento, se recolectaron
individualmente las colonias blancas de bacterias recombinantes
(blancas) con el fin de cultivarse y para permitir la extracción de
los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado
"miniprep" (17). La preparación de plásmidos de cada colonia
recombinante se cortó con un enzima de restricción adecuado y se
analizó en gel de agarosa. Los plásmidos que presentaban una
inserción, detectada bajo luz UV tras la tinción del gel con bromuro
de etidio, se seleccionaron para la secuenciación de la inserción
tras la hibridación con un cebador complementario al promotor Sp6
presente en el plásmido de clonación del kit TA Cloning^{TM}. La
reacción antes de la secuenciación seguidamente se llevó a cabo
según el método recomendado para la utilización del kit de
secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle
sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) y la
secuenciación automática se llevó a cabo en un aparato secuenciador
automático modelo 373A de Applied Biosystems siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Este enfoque técnico se aplicó a una muestra de
viriones concentrada tal como se ha indicado anteriormente a partir
de una mezcla de sobrenadantes de cultivo producidos por líneas
linfoblastoides B, tales como las indicadas en el Ejemplo 2,
establecidas a partir de linfocitos de pacientes que sufren EM y que
presentan actividad de transcriptasa inversa que resulta detectable
según la técnica descrita por Perron et al. (3): los
sobrenadantes de cultivo se recogieron dos veces semanalmente, se
precentrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos para eliminar los
residuos celulares y después se congelaron a -80ºC o se utilizaron
sin modificación para las etapas siguientes. Los sobrenadantes
frescos o descongelados se centrifugaron en un cojín de glicerol al
30%-PBS a 100.000 g durante 2 horas a 4ºC. Tras la eliminación del
sobrenadante, el pellet sedimentado constituye la muestra de
viriones concentrados aunque no purificados. El pellet obtenido de
esta manera seguidamente se introduce en un volumen reducido de un
tampón apropiado para la extracción de ARN. La reacción de síntesis
de ADNc indicada anteriormente se llevó a cabo en este ARN extraído
de los viriones extracelulares concentrados.
La amplificación por RT-PCR
según la técnica indicada anteriormente permitió obtener el clon
GM3, cuya secuencia, identificada como SEC ID nº 56, se presenta en
la figura 23.
En la figura 24, se muestra la homología de
secuencias entre el clon GMP3 y el retrovirus
HSERV-9 en el gráfico matricial mediante una línea
continua, para cualquier homología parcial superior o igual a
65%.
En resumen, la figura 25 muestra la localización
de los diferentes clones estudiados anteriormente, respecto al
genoma de ERV9 conocido. En la figura 25, debido a que la región
env de MSRV-1 es más larga que el gen
env de ERV9 de referencia, la región adicional se muestra en
la parte superior del punto de inserción con una "V",
considerando que el material insertado muestra la variabilidad de
secuencias y de tamaños entre clones que se muestra (JLBc1, JLBc2,
FBd3). La figura 26 muestra la posición de los diferentes clones
estudiados en la región pol* de MSRV-1.
Por medio del clon GM3 indicado anteriormente,
pudo definirse un posible marco de lectura que cubría el gen
pol completo, con la referencia SEC ID nº 57, mostrado en las
sucesivas figuras 27a a 27c.
\vskip1.000000\baselineskip
La identificación de la secuencia del gen pol
del retrovirus MSRV-1 y del marco de lectura abierta
de dicho gen permitió determinar la secuencia de aminoácidos SEC ID
nº 39 de una región de dicho gen, con la referencia SEC ID nº 40
(ver la figura 28).
Se sometieron a ensayo diferentes péptidos
sintéticos correspondientes a fragmentos de la secuencia proteica
de la transcriptasa inversa de MSRV-1 codificada por
el gen pol, para su especificidad antigénica con respecto a
los sueros de pacientes que sufren EM y de controles sanos.
Los péptidos se sintetizaron químicamente
mediante síntesis en fase sólida según la técnica de Merrifield
(Barany G. y Merrifields R.B., In the Peptides
2:1-284, Gross E. y Meienhofer J., editores,
Academic Press, New York, 1980). Los detalles prácticos son los
descritos posteriormente.
Los péptidos se sintetizaron en una resina de
fenilacetamidometilo (PAM)/poliestireno/divinilbenceno (Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA) utilizando un sintetizador
automático "Applied Biosystems 430A". Los aminoácidos se
acoplaron en forma de ésteres de hidroxibenzotriazol (HOBT). Los
aminoácidos utilizados se obtuvieron de Novabiochem
(Läuflerlfingen, Suiza) o Bachem (Bubendorf, Suiza).
La síntesis química se llevó a cabo utilizando
un protocolo de doble acoplamiento con
N-metilpirrolidona (NMP) como solvente. Los
péptidos se cortaron de la resina, así como los grupos protectores
de cadena lateral, utilizando simultáneamente ácido hidrofluórico
(HF) en un aparato adecuado (aparato de corte de tipo I, Peptide
Institute, Osaka, Japón).
Para 1 g de resina peptidilo se utilizaron 10 ml
de HF, 1 ml de anisol y 1 ml de sulfuro de dimetilo 5DMS. La mezcla
se agitó durante 45 minutos a -2ºC. A continuación, se eliminó el HF
mediante evaporación bajo vacío. Tras lavados intensivos con éter,
el péptido se eluyó de la resina con ácido acético al 10% y después
se liofilizó.
Los péptidos se purificaron mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa en una columna
VYDAC de tipo C18 (250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia,
CA, USA). Se llevó a cabo la elución con un gradiente de
acetonitrilo a un caudal de 22 ml/minuto. Se realizó el seguimiento
de las fracciones recogidas mediante una elución bajo condiciones
isocráticas en una columna analítica VYDAC® C18 (250
x 4,6 mm) a un caudal de 1 ml/minuto. Las fracciones que
presentaban el mismo tiempo de retención se agruparon y se
liofilizaron. A continuación, se analizó la fracción mayoritaria
mediante cromatografía líquida de alto rendimiento analítica
utilizando el sistema indicado anteriormente. El péptido que se
considera de pureza aceptable se manifiesta en un único pico que
representa no menos de 95% del cromatograma.
A continuación, se analizaron los péptidos
purificados con el objetivo de realizar el seguimiento de la
composición de aminoácidos de los mismos utilizando un analizador
automático de aminoácidos 420H de Applied Biosystems. La medición
de la masa molecular química (media) de los péptidos se obtuvo
utilizando espectrometría de masas LSIMS en el modo de iones
positivos en un instrumento de doble enfoque VG.ZAB.ZSEQ conectado a
un sistema de captura DEC-VAX 2000 (VG Analytical
Ltd., Manchester, Inglaterra).
Se sometió a ensayo la reactividad de los
diferentes péptidos contra sueros de pacientes que sufrían EM y
contra sueros de controles sanos. Lo anterior permitió seleccionar
un péptido denominado POL2B, cuya secuencia se muestra en la figura
28 con el identificador SEC ID nº 39, posteriormente, codificado por
el gen pol de MSRV-1 (nucleótidos 181 a 330).
Se demostraron las propiedades antigénicas del
péptido POL2B según el protocolo ELISA descrito posteriormente.
El péptido POL2B liofilizado se disolvió en agua
destilada estéril a una concentración de 1 mg/ml. Esta solución
madre se dividió en alícuotas y se mantuvo a +4ºC para la
utilización antes de catorce días, o se congeló a -20ºC para la
utilización antes de 2 meses. Se diluyó una alícuota en PBS
(solución salina tamponada con fosfato) de manera que se obtuvo una
concentración final de péptidos de 1 microgramo/ml. Se introdujeron
100 microlitros de dicha dilución en cada pocillo de placas de
microtitulación (plástico de unión elevada, COSTAR ref. 3590). Las
platas se cubrieron con un adhesivo de tipo "sellador de placa"
y se mantuvieron durante la noche a +4ºC durante la etapa de
adsorción del péptido al plástico. Se retiró el adhesivo y las
placas se lavaron tres veces con un volumen de 300 microlitros de
una solución A (PBS 1X, Tween 20® al 0,05%), después se invirtieron
sobre un tejido absorbente. Las placas enjuagadas de esta manera se
llenaron con 200 microlitros por pocillo de una solución B
(solución A + suero de cabra al 10%), después se cubrieron con un
adhesivo y se incubaron durante 45 minutos a 1 hora a 37ºC. A
continuación, las placas se lavaron tres veces con la solución A
tal como se ha indicado anteriormente.
Las muestras de suero de ensayo se diluyeron
previamente hasta 1/50 en la solución B, y se introdujeron 100
microlitros de cada suero de ensayo diluido en los pocillos de cada
placa de microtitulación. Se introdujo un control negativo en un
pocillo de cada placa, en forma de 100 microlitros de tampón B. Las
placas se cubrieron con un adhesivo y después se incubaron durante
1 a 3 horas a 37ºC. A continuación, las placas se lavaron tres
veces con la solución A, tal como se ha indicado anteriormente. En
paralelo, se diluyó un anticuerpo de cabra marcado con peroxidasa
dirigido contra IgG humana (Sigma Immunochemicals ref. A6029) o
contra IgM (Cappel ref. 55228) en la solución B (dilución 1/5.000
para el anticuerpo anti-IgG y 1/1.000 para el
anticuerpo anti-IgM). A continuación, se
introdujeron 100 microlitros de la dilución apropiada del anticuerpo
marcado en cada pocillo de las placas de microtitulación y las
placas cubiertas con un adhesivo se incubaron durante 1 a 2 horas a
37ºC. Se llevó a continuación a cabo un lavado adicional de las
placas, tal como se ha indicado anteriormente. En paralelo, se
preparó el sustrato peroxidasa según las indicaciones del kit
"Sigma fast OPD" (Sigma Immunochemicals ref. P9187). Se
introdujeron 100 microlitros de solución de sustrato en cada pocillo
y las placas se protegieron de la luz durante 20 a 30 minutos a
temperatura ambiente.
Tras estabilizarse la reacción de color, las
placas se introdujeron inmediatamente en un lector
espectrofotométrico de placas ELISA, y se leyó la densidad óptica
(DO) de cada pocillo a una longitud de onda de 492 nm.
Alternativamente, se introdujeron 30 microlitros de HCl 1 N en cada
pocillo para detener la reacción, y las placas se leyeron en el
espectrofotómetro dentro de las 24 horas.
Las muestras serológicas se introdujeron por
duplicado o por triplicado, y se calculó la densidad óptica (DO)
correspondiente al suero sometido a ensayo como el promedio de los
valores de DO obtenidos para la misma muestra a la misma
dilución.
La DO neta de cada suero corresponde a la DO
media del suero menos la DO media del control negativo (solución B:
PBS, Tween 20® al 0,05%, suero de cabra al 10%).
Se utilizó la técnica descrita anteriormente con
el péptido POLB2 para someter a ensayo la presencia de anticuerpos
IgG anti-MSRV-1 específicos en el
suero de 29 pacientes para los que se había establecido un
diagnóstico definitivo o probable de EM según los criterios de
Poser (23) y de 32 controles sanos (donantes de sangre).
La figura 29 muestra los resultados de cada
suero sometido a ensayo con un anticuerpo anti-IgG.
Cada columna representa la densidad óptica neta (DO a 492 nm) de un
suero sometido a ensayo. El eje de ordenadas proporciona la DO neta
en la parte superior de las columnas. Las primeras 29 columnas
situadas a la izquierda de la línea vertical discontinua
representan los sueros de 29 casos de EM sometidos a ensayo, y las
32 columnas situadas a la derecha de la línea vertical discontinua
representan los sueros de 32 controles sanos (donantes de
sangre).
La media de los valores de DO neta para los
sueros de pacientes de EM sometidos a ensayo era de 0,62. El
diagrama permite revelar 5 controles cuya DO neta es superior a los
valores agrupados de la población de control. Estos valores podrían
representar la presencia de IgG específicas en paciente
seropositivos sin síntomas. Por lo tanto, se evaluaron dos métodos
con el fin de determinar el umbral estadístico de positividad del
ensayo.
La media de los valores netos de DO para los
controles, incluyendo los controles con valores de DO neta elevados,
era de 0,36. Sin los 5 controles cuyos valores de DO neta eran
superiores o iguales a 0,5, la media de los controles
"negativos" era de 0,33. La desviación estándar de los
controles negativos era de 0,10. Puede calcularse un umbral teórico
de positividad según la fórmula:
valor umbral
(media de los valores de DO neta de los controles seronegativos) +
(2 ó 3 desviaciones estándar de los valores de DO neta de los
controles
seronegativos).
En el primer caso, se consideran seropositivos
sin síntomas, y el valor umbral es igual a 0,33 + (2 x 0,10) = 0,53.
Los resultados negativos representan un "fondo" no específico
de la presencia de anticuerpos dirigidos específicamente contra un
epítopo del péptido.
En el segundo caso, si el conjunto de controles
constituido por donantes de sangre en aparentemente buena salud se
considera una base de referencia, sin excluir los sueros que son,
aparentemente, seropositivos, la desviación estándar de los
"controles no EM" era de 0,116. En este caso el valor umbral es
0,36 + (2 x 0,116) = 0,59.
Según este análisis, el ensayo es específico
para la EM. A este respecto, se observa que el ensayo es específico
para la EM, debido a que, tal como se muestra en la Tabla 1, ningún
control presenta una DO neta superior a este umbral. De hecho, este
resultado refleja el hecho de que los títulos de anticuerpos en
pacientes que sufren EM son, mayoritariamente, superiores a los de
controles sanos que han estado en contacto con
MSRV-1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
De acuerdo con el primer método de cálculo, y
tal como se muestra en la figura 29 y en la Tabla 1 correspondiente,
26 de los 29 sueros de EM proporcionaron un resultado positivo (DO
neta superior o igual a 0,50), indicando la presencia de IgG
dirigidas específicamente contra el polipéptido POL2B, por lo tanto
contra una porción del enzima transcriptasa inversa del retrovirus
MSRV-1 codificada por el gen pol del mismo, y
en consecuencia contra el retrovirus MSRV-1. De
esta manera, aproximadamente 90% de los pacientes de EM sometidos a
ensayo reaccionaron contra un epítopo transportado por el péptido
POL2B y que presenta IgG circulantes dirigidas contra el mismo.
Cinco de entre 32 donantes de sangre que
aparentemente presentaban buena salud mostraron un resultado
positivo. De esta manera, resulta evidente que aproximadamente 15%
de la población sin síntomas podría haber estado en contacto con un
epítopo transportado por el péptido POL2B bajo condiciones que
condujeron a una inmunización activa que se manifiesta en la
persistencia de IgG séricas específicas. Estas condiciones son
compatibles con una inmunización contra la transcriptasa inversa
del retrovirus MSRV-1 durante una infección (y/o
reactivación) del retrovirus MSRV-1. La ausencia de
patología neurológica evidente reminiscente de EM en estos controles
seropositivos podría indicar que son portadores sanos y que han
eliminado un virus infeccioso tras inmunizarse, o que constituyen
una población de riesgo de portadores crónicos. En efecto, los datos
epidemiológicos que muestran que un agente patogénico presente en
el medio ambiente de regiones de elevada prevalencia de EM podría
ser la causa de esta enfermedad, implican que una fracción de la
población libre de EM ha estado necesariamente en contacto con
dicho agente patogénico. Se ha demostrado que el retrovirus
MSRV-1 constituye la totalidad o parte de dicho
"agente patogénico" en el origen de la EM, y por lo tanto es
normal para los controles obtenidos de una población sana presentar
anticuerpos de tipo IgG contra componentes del retrovirus
MSRV-1. De esta manera, la diferencia de
seroprevalencia entre las poblaciones que presentan EM y de control
es extremadamente significativa: ensayo
ji-cuadrado, p<0,001. Por lo tanto, estos
resultados apuntan a un papel etiopatogénico de
MSRV-1 en la EM.
La técnica ELISA con el péptido POL2B se utilizó
para someter a ensayo la presencia de anticuerpos
anti-MSRV-1 específicos de IgM en
el suero de 36 pacientes para los que se estableció un diagnóstico
definitivo o probable de EM según los criterios de Poser (23), y de
42 controles sanos (donantes de sangre).
La figura 30 muestra los resultados de cada
suero sometido a ensayo con un anticuerpo anti-IgM.
Cada columna representa la densidad óptica neta (DO a 492 nm) de un
suero sometido a ensayo. El eje de ordenadas proporciona la DO neta
en la parte superior de las columnas. Las primeras 36 columnas
situadas a la izquierda de la línea vertical que corta el eje de
abscisas representan los sueros de 36 casos de EM sometidos a
ensayo, y las columnas situadas a la derecha de la línea vertical
discontinua representan los sueros de 42 controles sanos (donantes
de sangre). La línea horizontal en el centro del diagrama representa
un umbral teórico que define el límite de los resultados positivos
(en la que el límite superior de la columna se encuentra encima del
mismo) y los resultados negativos (en los que el límite superior de
la columna se encuentra debajo del mismo).
La media de los valores de DO neta para los
casos de EM sometidos a ensayos fue de 0,19.
La media de los valores de DO neta para los
controles fue de 0,09.
La desviación estándar de los controles
negativos era de 0,05.
En vista de la diferencia reducida entre la
media y la desviación estándar de los controles, puede calcularse
el umbral de positividad teórica según la fórmula:
Valor
umbral=(media de los valores de DO neta de los controles
seronegativos)+(3 x desviación estándar de los valores de DO neta
de los controles
seronegativos).
Por lo tanto, el valor umbral es igual a 0,09 +
(3 x 0,05)=0,26 o, en la práctica, 0,25.
Los resultados negativos representan un
"fondo" no específico de la presencia de anticuerpos dirigidos
específicamente contra un epítopo del péptido.
Según el presente análisis, y tal como se
muestra en la figura 30 y en la Tabla 2 correspondiente, el ensayo
de IgM es específico de la EM, debido a que ningún control presenta
una DO neta superior al umbral. 7 de los 36 sueros de pacientes con
EM produjeron un resultado de IgM positivo; sin embargo, un estudio
de los datos clínicos revela que estos sueros positivos se
obtuvieron durante un primer ataque de EM o un ataque agudo en
pacientes no tratados. Es conocido que las IgMs dirigidas contra
agentes patogénicos se producen durante infecciones primarios o
durante reactivaciones tras una etapa de latencia de dicho agente
patogénico.
La diferencia de seroprevalencia entre las
poblaciones de EM y de control es extremadamente significativa:
ensayo ji-cuadrado, p<0,001.
Estos resultados apuntan a un papel
etiopatogénico de MSRV-1 en la EM.
La detección de los anticuerpos IgM e IgG contra
el péptido POL2B permite evaluar el curso de una infección por
MSRV-1 y/o de la reactivación vírica de
MSRV-1.
Con el fin de reducir el fondo no específico y
optimizar la detección de las respuestas de los anticuerpos
anti-MSRV-1, se llevó a cabo la
síntesis de octapéptidos, avanzando en etapas sucesivas de un
aminoácido, cubriendo la totalidad de la secuencia determinada por
POL2B, siguiendo el protocolo descrito posteriormente.
Se llevó a cabo la síntesis química de
octapéptidos solapantes que cubrían la secuencia de aminoácidos
61-110 mostrada en el identificador SEC ID nº 39,
en una membrana de celulosa activada siguiendo la técnica de Berg
et al. (J. Ann. Chem. Soc. 111:8024-8026,
1989) comercializada por Cambridge Research Biochemicals bajo la
marca comercial Spotscan. Esta técnica permite sintetizar
simultáneamente un gran número de péptidos y el análisis de los
mismos.
La síntesis se llevó a cabo con aminoácidos
esterificados en los que el grupo a-amino se
encontraba protegido por un grupo FMOC (Nova Biochem.) y los grupos
de cadenas laterales se encontraban protegidos con grupos
protectores, tales como tritilo, éster t-butílico o
éter t-butílico. Los aminoácidos esterificados se
solubilizaron en N-metilpirrolidona (NMP) a una
concentración de 300 nM y se aplicaron 0,9 ml a puntos de azul de
bromofenol depositado. Tras incubar durante 15 minutos, se llevó a
cabo una aplicación adicional de aminoácidos, siguiendo otra
incubación de 15 minutos. En el caso de que el acoplamiento entre
dos aminoácidos se haya producido correctamente, se observa una
modificación de coloración (cambio de azul a
amarillo-verde). Tras tres lavados en DMF, se llevó
a cabo una etapa de acetilación con anhídrido acético. A
continuación, se desprotegieron con piridina al 20% en DMF los
grupos amino terminales de los péptidos en el procedimiento de
síntesis. Los puntos de depósito se tiñeron nuevamente con una
solución al 1% de azul de bromofenol en DMF, se lavaron tres veces
con metanol y se secaron. Este conjunto de operación constituye un
ciclo de adición de un aminoácido, y este ciclo se repitió hasta
completar la síntesis. Tras la adición de la totalidad de los
aminoácidos, se desprotegió el grupo
NH_{2}-terminal del último aminoácido utilizando
piperidina al 20% en DMF, y se acetiló con anhídrido acético. Los
grupos que protegían las cadenas laterales se eliminaron con una
mezcla de diclorometano/ácido trifluoroacético/triisobutilsilano (5
ml/5 ml/250 ml). A continuación, se sometió a ensayo la
inmunorreactividad de los péptidos mediante ELISA.
Tras la síntesis de los diferentes octapéptidos
por duplicado en dos membranas diferentes, éstas se enjuagaron con
metanol y se lavaron en TBS (Tris 0,1 M, pH 7,2), después se
incubaron durante la noche a temperatura ambiente en un tampón de
saturación. Tras varios lavados en TBS-T (Tris 0,1
M, pH 7,2-Tween 20 al 0,05%), una membrana se
incubó con una dilución 1/50 de un suero de referencia originado de
un paciente que sufría EM, y la otra membrana, con una dilución
1/50 de un grupo de sueros procedentes de controles sanos. Las
membranas se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente. Tras
varios lavados con TBS-T, se añadió un conjugado de
anti-inmunoglobulina humana marcado con
\beta-galactosidasa (comercializado por Cambridge
Research Biochemicals) a una dilución de 1/200, y la mezcla se
incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Tras varios lavados
de las membranas con TBS-T al 0,05% y PBS, se
visualizó la inmunorreactividad en los diferentes puntos mediante
la adición de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
en potasio. La intensidad de coloración de los puntos se estimó
cualitativamente con un valor relativo entre 0 y 5 tal como se
muestra en las figuras adjuntas 31 a 33.
De esta manera, resulta posible determinar dos
regiones inmunodominantes en cada extremo del péptido POL2B,
correspondientes, respectivamente, a las secuencias de aminoácidos
65-75 (SEC ID nº 41) y 92-109 (SEC
ID nº 42) según la figura 34, y situadas, respectivamente, entre
los octapéptidos
Phe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp
(FCIPVRPD) y
Arg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe
(RPDSQFLF) y entre
Thr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg
(TVLPQGFR) y
Leu-Phe-Gly-Gln-Ala-Leu-Ala-Gln
(LFGQALAQ), y una región que es menos reactiva, aunque aparentemente
más específica, debido a que no produce ninguna señal de fondo con
el suero de control, representada por los octapéptidos
Leu-Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu
(LFAFEDPL) (SEC ID nº 43) y
Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn
(FAFEDPLN) (SEC ID nº 44).
Dichas regiones permite definir nuevos péptidos
que son más específicos y más inmunorreactivos según las técnicas
habituales.
De esta manera, resulta posible, como resultado
de los descubrimientos realizados y los métodos desarrollados por
los inventores, llevar a cabo un diagnóstico de la infección y/o
reactivación de MSRV-1 y evaluar una terapia de la
EM basado en su eficacia en "negativizar" la detección de
dichos agentes en los líquidos biológicos del paciente. Además, la
detección precoz en individuos que todavía no manifiestan indicios
neurológicos de la EM podría permitir la institución de un
tratamiento que resultaría más eficaz con respecto al curso clínico
posterior debido a que precedería a la etapa de lesiones, que
corresponde a la aparición de los trastornos neurológicos. Ahora,
en la actualidad, no puede establecerse un diagnóstico de la EM
antes de que se haya asentado una sintomatología de lesiones
neurológicas y, por lo tanto, no se instituye ningún tratamiento
antes de la aparición de un cuadro clínico sugestivo de lesiones
del sistema nervioso central que ya son significativas. Por lo
tanto, el diagnóstico de una infección y/o reactivación de
MSRV-1 y/o MSRV-2 en el ser humano
resulta de importancia decisiva, y la presente invención
proporciona los medios para llevarlo a cabo.
De esta manera, resulta posible, aparte de
realizar un diagnóstico de la infección y/o reactivación de
MSRV-1, evaluar una terapia de la EM basándose en
su eficacia en "negativizar" la detección de dichos agentes en
los líquidos corporales del paciente.
\newpage
Se utilizó una técnica de PCR derivada de la
técnica publicada por Gonzalez-Quintial R. et
al. (19) por Plaza et al. (25). A partir de los ARNs
totales extraídos de una fracción purificada de viriones tal como
se ha descrito anteriormente, se sintetizó ADNc utilizando un
cebador específico (SEC ID nº 64) en el extremo 3' del genoma que
debía amplificarse, utilizando transcriptasa inversa Expand^{TM}
(Boehringer-Mannheim).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la purificación, se añadió una cola
poli(G) en el extremo 5' del ADNc utilizando el "kit de
transferasas terminales" comercializado por la compañía
Boehringer-Mannheim, siguiendo el protocolo del
fabricante.
Se llevó a cabo una PCR de anclaje utilizando
los cebadores 5' y 3' siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se llevó a cabo una PCR de
anclaje semianidada con los cebadores 5' y 3' siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos originados en la PCR se
purificaron tras la purificación en gel de agarosa según métodos
convencionales (17) y después se resuspendieron en 10 microlitros
de agua destilada. Debido a que una de las propiedades de la
polimerasa Taq consiste en añadir una adenina en el extremo 3' de
cada una de las dos cadenas de ADN, se insertó el ADN obtenido
directamente en un plásmido utilizando el kit TA Cloning^{TM}
(British Biotechnology). Los 2 \mul de solución de ADN se
mezclaron con 5 \mul de agua destilada estéril, 1 \mul de tampón
de ligación concentrado 10 veces "TAMPÓN DE LIGACIÓN 10X", 2
\mul de "vector pCR^{TM}" (25 ng/ml) y 1 \mul de "ADN
LIGASA DE T4". Esta mezcla se incubó durante la noche a 12ºC. Las
etapas siguientes se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones
del kit TA Cloning^{TM} (British Biotechnology). Al final del
procedimiento, se recolectaron individualmente las colonias blancas
de bacterias recombinantes (blancas) con el fin de cultivarlas y de
permitir la extracción de los plásmidos incorporados siguiendo el
procedimiento denominado "miniprep" (17). La preparación de
plásmido de cada colonia recombinante se cortó con un enzima de
restricción adecuado y se analizó en gel de agarosa. Los plásmidos
que presentaban una inserción detectada bajo luz UV tras teñir el
gel con bromuro de etidio se seleccionaron para la secuenciación de
la inserción, tras la hibridación con un cebador complementario al
promotor Sp6 presente en el plásmido de clonación del kit Cloning
TA^{TM}. A continuación, se llevó a cabo la reacción anterior a
la secuenciación siguiendo el método recomendado para la
utilización del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye
deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref.
401384) y se llevó a cabo secuenciación automática con un
secuenciador automático modelo 373A de Applied Biosystems siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Se utilizó la amplificación por PCR según la
técnica indicada anteriormente de un ADNc sintetizado a partir de
los ácidos nucleicos de fracciones de partículas infecciosas
purificadas en un gradiente de sacarosa, según la técnica descrita
por H. Perron (13), a partir de sobrenadantes de cultivo de
linfocitos B de un paciente que sufría EM, inmortalizadas con virus
de Epstein-Barr (EBV) cepa B95 y que expresaban
partículas asociadas a actividad de transcriptasa inversa tal como
se describe en Perron et al. (3) y en las solicitudes de
patente francesa MS 10, 11 y 12. El clon LB19, la secuencia del
cual, identificada como SEC ID nº 59, se presenta en la figura
35.
El clon permite definir, con el clon GM3
anteriormente secuenciado y el clon G+E+A (ver el Ejemplo 15), una
región de 690 pares de bases representativa de una porción
significativa del gen gag del retrovirus
MSRV-1, tal como se presente en la figura 36. Esta
secuencia, denominada SEC ID nº 86, se reconstituyó a partir de
diferentes clones solapantes en los extremos de los mismos. Esta
secuencia se identifica con el nombre región "gag" de
MSRV-1. En la figura 36, se presenta un marco de
lectura potencial con la traducción en aminoácidos, debajo de la
secuencia de ácidos nucleicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Extracción de ARNs víricos: los ARNs se
extrajeron siguiendo el método descrito brevemente a
continuación.
Se centrifugó un grupo de sobrenadantes de
cultivo de linfocitos B de pacientes que sufrían EM (650 ml),
durante 30 minutos a 10.000 g. El pellet vírico obtenido se
resuspendió en 300 microlitros de PBS/MgCl_{2} 10 mM. El material
se trató con una mezcla de ADNasa (100 mg/ml)/ARNasa (50 mg/ml)
durante 30 minutos a 37ºC y después con proteinasa K (50 mg/ml)
durante 30 minutos a 46ºC.
Los ácidos nucleicos se extrajeron con un
volumen de una mezcla de fenol/SDS al 0,1% (v/v) calentada a 60ºC,
y después se extrajeron nuevamente con un volumen de
fenol/cloroformo (1:1, v/v).
La precipitación del material se llevó a cabo
con 2,5 volúmenes de etanol en presencia de 0,1 volúmenes de
acetato sódico, pH 5,2. El pellet obtenido tras la centrifugación se
resuspendió en 50 microlitros de agua DEPC estéril.
La muestra se trató nuevamente con 50 mg/ml de
ADNasa "libre de ARNasa" durante 30 minutos a temperatura
ambiente, se extrajo con un volumen de fenol/cloroformo y se
precipitó en presencia de acetato sódico y etanol.
El ARN obtenido se cuantificó a partir de una
lectura de DO a 260 nm. Se realizó el seguimiento de la presencia
de MSRV-1 y de la ausencia de ADN contaminante
mediante una PCR y de una RT-PCR específica de
MSRV-1 asociadas a una ELISA específica para el
genoma de MSRV-1.
Se utilizaron 5 mg de ARN para sintetizar un
ADNc cebado con un oligonucleótido poli(DT) siguiendo las
instrucciones del kit módulo de síntesis de ADNc (ref. RPN 1256,
Amersham) con unas cuantas modificaciones. La transcripción inversa
se llevó a cabo a 45ºC en lugar de a la temperatura recomendada de
42ºC.
Se producto de síntesis se purificó mediante una
doble extracción y una doble purificación siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Se verificó la presencia de
MSRV-1 mediante una PCR de MSRV-1
asociada a una ELISA específica para el genoma de
MSRV-1.
Se utilizaron 500 ng de ADNc para la etapa de
LD-PCR (Expand Long Template System; Boehringer
(ref. 1681 842)).
Se utilizaron varias parejas de
oligonucleótidos. De entre ellos, la pareja definida por los
cebadores siguientes:
Las condiciones de amplificación fueron las
siguientes:
10 segundos a 94ºC
30 segundos a 56ºC
5 minutos a 68ºC;
10 ciclos, después 20 ciclos con un incremento
de 20 segundos en cada ciclo del tiempo de elongación. Al final de
la primera amplificación, se sometieron 2 microlitros del producto
de amplificación a una segunda amplificación bajo las mismas
condiciones que anteriormente.
Las reacciones de LD-PCR se
llevaron a cabo en un aparato de PCR modelo 9600 de Perkin en
microtubos de pared delgada (Boehringer).
Se realizó el seguimiento de los productos de
amplificación mediante electroforesis de 1/5 del volumen de
amplificación (10 microlitros) en gel de agarosa al 1%. Para la
pareja de cebadores indicada anteriormente, se obtuvo una banda de
aproximadamente 1,7 Kb.
El producto de PCR se amplificó mediante pase a
través de un gel de agarosa preparativo y después a través de una
columna Costar (Spin; D. Dutcher) siguiendo las instrucciones del
proveedor.
Se agruparon 2 microlitros de la solución
purificada con 50 ng de vector PCRII según las instrucciones del
proveedor (kit TA Cloning, British Technology).
El vector recombinante obtenido se aisló
mediante transformación de bacterias DH5\alphaF' competentes. Las
bacterias se seleccionaron utilizando la resistencia de las mismas a
la ampicilina y la pérdida de metabolismo para Xgal (=colonias
blancas). Se confirmó la estructura molecular del vector
recombinante mediante minipreparación de plásmidos y la hidrólisis
con el enzima EcoRI.
Se seleccionó FBd13, un clon positivo para la
totalidad de dichos criterios. Se llevó a cabo una preparación a
gran escala del plásmido recombinante utilizando el kit Miniprep
Qiagen (ref. 12243) siguiendo las instrucciones del proveedor.
La secuenciación del clon FBd13 se llevó a cabo
con el kit Prism Ready Amplitaq FS dye terminator de Perkin (ref.
402119) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones
de secuenciación se introdujeron en un secuenciador automático de
tipo 377 ó 373A de Perkin. La estrategia de secuenciación consistía
en desplazamiento génico ("gene walking") realizado en ambas
cadenas del clon FBd13.
La secuencia del clon FBd13 se identifica con
SEC ID nº 58.
En la figura 37, en el gráfico matricial la
homología de secuencias entre el clon FBd13 y el retrovirus
HSERV-9 se muestra con una línea continua en
regiones de homología parcial superior o igual a 70%. Puede
observarse que existen homologías en las regiones flanqueantes del
clon (en el extremo 5' con el gen pol y en el extremo 3' con
el gen env y posteriormente la LTR), aunque la región interna
es totalmente divergente y no muestra ninguna homología, ni
siquiera débil, con el gen env de HSERV-9.
Además, resulta evidente que el clon FBd13 contiene una región
"env" más larga que la descrita para el retrovirus
HSERV-9 endógeno defectivo. De esta manera, puede
observarse que la región divergente interna constituye una
"inserción" entre las regiones de homología parcial respecto a
los genes defectivos de HSERV-9.
Dicha secuencia adicional determina una ORF
potencial, denominada ORF B13, que se encuentra representada por la
secuencia de aminoácidos de la misma, SEC ID nº 87.
Se analizó la estructura molecular del clon
FBd13 utilizando el software GeneWork y los bancos de datos GeneBank
y SwissProt.
Se encontraron 5 sitios de glucosilación.
La proteína no presentaba homologías
significativas con las secuencias ya conocidas.
Probablemente dicho clon se origina a partir de
una recombinación de un elemento retrovírico endógeno (ERV) ligada
a la replicación de MSRV-1.
Dicho fenómeno no se presenta en ausencia de la
generación de expresión de polipéptido, ni de proteínas retrovíricas
endógenas que no resultan necesariamente toleradas por el sistema
inmunológico. Este esquema de expresión aberrante de elementos
endógenos relacionada con MSRV-1 y/o inducida por
éste último, es susceptible de multiplicar los antígenos aberrantes
y, por lo tanto, tiende a contribuir a la inducción de procesos
autoinmunológicos, tales como los observados en la EM. Lo anterior
claramente constituye un elemento nuevo no descrito anteriormente.
En efecto, la interrogación de los bancos de datos de secuencias de
ácidos nucleicos disponibles en la versión nº 19 (1996) del
software "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) no permitió
identificar una secuencia homóloga conocida que comprendiese la
totalidad de la región env de dicho clon.
Se llevó a cabo una RACE 3' de ARN total
extraído de plasma de pacientes que sufrían EM. Se utilizó como
control negativo un plasma de control sano tratado bajo las mismas
condiciones. Se llevó a cabo la síntesis del ADNc con el cebador
oligo(dT) modificado siguiente:
y transcriptasa inversa "Expand
RT" de Boehringer bajo las condiciones recomendadas por la
compañía. Se llevó a cabo una PCR con el enzima Klentaq (Clontech)
bajo las condiciones siguientes: de 94ºC durante 5 minutos, 93ºC
durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 3 minutos 40
ciclos y 68ºC durante 8 minutos, y con un volumen final de reacción
de 50
\mul.
Cebadores utilizados para la PCR:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº:69
- 5' GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado como SEC ID nº:68 (=el mismo que para el ADNc)
Se llevó a cabo una segunda PCR denominada
"semi-anidada" con un cebador 5' situado dentro
de la región ya amplificada. Esta segunda PCR se llevó a cabo bajo
las mismas condiciones experimentales a las utilizadas en la
primera PCR, utilizando 10 \mul del producto de amplificación
originado en la primera PCR.
Para la PCR semi-anidada se
utilizaron los cebadores siguientes:
- -
- cebador 5', identificado como SEC ID nº:70
- 5' CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- - cebador 3', identificado como SEC ID nº:68 (=el mismo que para el ADNc)
Los cebadores SEC ID nº 69 y SEC ID nº 70 son
específicos de la región pol*: posiciones nº 403 a nº 422 y nº 641
a nº 670, respectivamente.
De esta manera, se obtuvo un producto de
amplificación a partir del ARN extracelular extraído del plasma de
un paciente que sufría EM. No se observó el fragmento
correspondiente en el plasma del control sano. Este producto de
amplificación se clonó de la manera siguiente.
Se insertó el ADN amplificado en un plásmido
utilizando el kit TA Cloning^{TM}. Se mezclaron 2 \mul de la
solución de ADN con 5 \mul de agua destilada estéril, 1 \mul de
un tampón de ligación concentrado 10 veces "TAMPÓN DE LIGACIÓN
10X", 2 \mul de "VECTOR pCR^{TM}" (25 ng/ml) y 1 \mul
de "ADN LIGASA DE T4". Esta mezcla se incubó durante la noche
a 12ºC. Se llevaron a cabo las etapas siguientes siguiendo las
instrucciones del kit TA Cloning^{TM} (British Biotechnology). Al
final del procedimiento, se recolectaron individualmente las
columnas blancas de las bacterias recombinantes (blancas) con el fin
de cultivarlas, permitiendo la extracción de los plásmidos
incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (17).
La preparación de plásmidos procedente de cada colonia recombinante
se cortó con un enzima de restricción adecuado y se analizó en gel
de agarosa. Los plásmidos que presentaban una inserción, detectada
bajo luz UV tras la tinción del gel con bromuro de etidio, se
seleccionaron para la secuenciación de la inserción, tras la
hibridación con un cebador complementario al promotor Sp6 presente
en el plásmido de clonación del kit TA Cloning^{TM}. A
continuación, se llevó a cabo la reacción anterior a la
secuenciación, siguiendo el método recomendado para la utilización
del kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye
deoxyterminator cycle sequencing" (Applied Biosystems, ref.
401384) y la secuenciación automática se llevó a cabo con un aparato
de secuenciación automática modelo 373A de Applied Biosystems
siguiendo las instrucciones del fabricante.
El clon obtenido, denominado FP6, permitió
definir una región de 467 pb que presenta una homología de 89% con
la región pol* del retrovirus MSRV-1 y una región de
1.167 pb que presenta una homología de 64% con la región pol
de ERV-9 (nº 1634 a nº 2856).
El clon FP6 se encuentra representado en la
figura 38 por la secuencia de nucleótidos del mismo identificada
por SEC ID nº 61. Los tres marcos de lectura potenciales de este
clon se indican mediante la secuencia de aminoácidos de los mismos,
bajo la secuencia de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se definieron oligonucleótidos específicos para
las secuencias de MSRV-1 ya identificadas por el
Solicitante, con el fin de amplificar el ARN retrovírico originado
en viriones presentes en el plasma de pacientes que sufren EM. Se
llevaron a cabo reacciones de control para realizar el seguimiento
de la presencia de contaminantes (reacción con agua). La
amplificación consistía de una etapa de RT-PCR
seguida de una PCR "anidada". Las parejas de cebadores se
definieron para amplificar tres regiones solapantes (denominadas G,
E y A) en las regiones definidas por las secuencias de los clones
GM3 y pol* indicadas anteriormente.
RT-PCR
semi-anidada para la amplificación de la región
G:
- -
- en el primer ciclo de RT-PCR, se utilizaron los cebadores siguientes:
- cebador 1: SEC ID nº:71 (sentido)
- cebador 2: SEC ID nº:72 (antisentido)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- en el segundo ciclo de PCR, se utilizaron los cebadores siguientes:
- cebador 1: SEC ID nº:73 (sentido)
- cebador 4: SEC ID nº:74 (antisentido)
- RT-PCR anidada para la amplificación de la región E:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- en el primer ciclo de RT-PCR, se utilizaron los cebadores siguientes:
- cebador 5: SEC ID nº:75 (sentido)
- cebador 6: SEC ID nº:76 (antisentido)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- en el segundo ciclo de PCR, se utilizaron los cebadores siguientes:
- cebador 7: SEC ID nº:77 (sentido)
- cebador 8: SEC ID nº:78 (antisentido)
- RT-PCR semi-anidada para la amplificación de la región A:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- en el primer ciclo de RT-PCR, se utilizaron los cebadores siguientes:
- cebador 9: SEC ID nº:79 (sentido)
- cebador 10: SEC ID nº:80 (antisentido)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- en el segundo ciclo de PCR, se utilizaron los cebadores siguientes:
- cebador 9: SEC ID nº:81 (sentido)
- cebador 11: SEC ID nº:82 (antisentido)
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores y las regiones G, E y A definidas
por los mismos presentan las posiciones siguientes:
Se determinó la secuencia de la región definida
por los diferentes clones G, E y A tras la clonación y secuenciación
de los productos de amplificación "anidados".
Los clones G, E y A se ensamblaron entre sí
mediante PCR utilizando el cebador nº 1 en el extremo 5' del
fragmento G y nº 11 en el extremo 3' del fragmento A. Los cebadores
han sido descritos anteriormente. Se amplificó un fragmento G+E+A
de aproximadamente 1.580 pb y se insertó en un plásmido utilizando
el kit TA Cloning (marca comercial). Se determinó la secuencia del
producto de amplificación correspondiente a G+E+A y se llevó a cabo
el análisis de los solapamientos de G+E y E+A. Se muestra la
secuencia en la fig. 39, y corresponde a la secuencia SEC ID nº
89.
Se encontró en la región E un marco de lectura
codificante de una proteasa retrovírica de MSRV-1.
La secuencia de aminoácidos de la proteasa, identificada por SEC ID
nº 90, se presenta en la figura 40.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una PCR anidada del ADN extraído
de una línea linfoblastoide (linfocitos B inmortalizados con el
virus EBV cepa B95, tal como se ha descrito anteriormente y como es
bien conocido por el experto en la materia) que expresa el
retrovirus MSRV-1 y que se ha originado en
linfocitos de sangre periférica de un paciente que sufre EM.
En la primera etapa de la PCR se utilizaron los
cebadores siguientes:
Dicha etapa comprende 35 ciclos de amplificación
con las condiciones siguientes: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 54ºC y
4 minutos a 72ºC.
En la segunda etapa de PCR se utilizaron los
cebadores siguientes:
Dicha etapa comprende 35 ciclos de amplificación
con las condiciones siguientes: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 54ºC y
4 minutos a 72ºC.
Los productos originados de la PCR se
purificaron tras la purificación en gel de agarosa siguiendo métodos
convencionales (17) y después se resuspendieron en 10 ml de agua
destilada. Debido a que una de las propiedades de la polimerasa Taq
consiste en añadir una adenina en el extremo 3' de cada una de las
cadenas de ADN, el ADN obtenido se insertó directamente en un
plásmido utilizando el kit TA Cloning^{TM} (British
Biotechnology). Se mezclaron los 2 \mul de solución de ADN con 5
\mul de agua destilada estéril, 1 \mul de un tampón de ligación
concentrado 10 veces "TAMPÓN DE LIGACIÓN 10X", 2 \mul de
"VECTOR pCR^{TM}" (25 ng/ml) y 1 \mul de "ADN LIGASA DE
T4". Esta mezcla se incubó durante la noche a 12ºC. Se llevaron a
cabo las etapas siguientes siguiendo las instrucciones del kit TA
Cloning^{TM} (British Biotechnology). Al final del procedimiento,
se recolectaron individualmente las colonias blancas de bacterias
recombinantes (blancas) con el fin de cultivarlas y permitir la
extracción de los plásmidos incorporados, siguiendo el procedimiento
denominado "miniprep" (17). La preparación de plásmido de cada
colonia recombinante se cortó con un enzima de restricción adecuado
y se analizó en gel de agarosa. Los plásmidos que presentaban una
inserción detectada bajo luz UV tras la tinción del gel con bromuro
de etidio se seleccionaron para la secuenciación de la inserción,
tras la hibridación con un cebador complementario al promotor Sp6
presentes en el plásmido de clonación del kit TA Cloning^{TM}. A
continuación, se llevó a cabo la reacción anterior a la
secuenciación según el método recomendado para la utilización del
kit de secuenciación "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator
cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) y se
llevó a cabo la secuenciación automática con un secuenciador
automático modelo 373A de Applied Biosystems siguiendo las
instrucciones del fabricante.
De esta manera, pudo obtenerse un clon
denominado LTRGAG12, y se encuentra representado por la secuencia
interna del mismo, identificada por SEC ID nº 60.
Dicho clon probablemente es representativo de
elementos endógenos próximos a ERV-9, presente en el
ADN humano, en particular en el ADN de pacientes que sufren EM, y
capaz de interferir con la expresión del retrovirus
MSRV-1, por lo tanto capaz de presentar un papel en
la patogénesis asociada al retrovirus MSRV-1 y capaz
de servir como marcador para la expresión específica en la
patología en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
La identificación de la secuencia del gen
pol del retrovirus MSRV-1 y de un marco de
lectura abierto de dicho gen permitió determinar la secuencia de
aminoácidos SEC ID nº 63 de una región de dicho gen, con la
referencia SEC ID nº 62.
Diferentes péptidos sintéticos correspondientes
a fragmentos de la secuencia proteica de la transcriptasa inversa
de MSRV-1 codificada por el gen pol se
sometieron a ensayo para su especificidad antigénica con respecto a
sueros de pacientes que sufren EM y de controles sanos.
Los péptidos se sintetizaron químicamente
mediante síntesis en fase sólida según la técnica Merrifield (22).
Se indican los detalles prácticos posteriormente.
Los péptidos se sintetizaron en una resina de
fenilacetamidometil(PAM)/poliestireno/divinilbenceno (Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA) utilizando un sintetizador
automático 430A de Applied Biosystems. Los aminoácidos se acoplan
en la forma de ésteres hidroxibenzotriazol (HOBT). Los aminoácidos
utilizados se obtienen de Novabiochem (Läuflerlfingen, Suiza) o de
Bachem (Bubendorf, Suiza).
La síntesis química se llevó a cabo utilizando
un protocolo de doble acoplamiento con
N-metilpirrolidona (NMP) como solvente. Los
péptidos se cortaron de la resina, así como los grupos protectores
de cadena lateral, simultáneamente, utilizando ácido hidrofluórico
(HF) en un aparato adecuado (aparto de corte de tipo 1, Peptide
Institute, Osaka, Japón).
Para 1 g de resina peptidilo, se utilizaron 10
ml de HF, 1 ml de anisol y 1 ml de sulfuro de dimetilo 5DMS. La
mezcla se agitó durante 45 minutos a -2ºC. A continuación, se
evaporó el HF bajo vacío. Tras lavados intensivos con éter, el
péptido se eluyó de la resina con ácido acético al 10% y después se
liofilizó.
Los péptidos se purificaron mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa en una columna
VYDAC de tipo C18 (250x21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA,
USA). La elución se llevó a cabo con un gradiente de acetonitrilo a
un caudal de 22 ml/minuto. Se realizó el seguimiento de las
fracciones recogidas mediante una elución bajo condiciones
isocráticas en una columna analítica VYDAC^{TM} C18 (250x4,6
mm) a un caudal de 1 ml/minuto. Las fracciones que presentaban el
mismo tiempo de retención se agruparon y se liofilizaron.
Seguidamente se analizó la fracción preponderante mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento analítica con el sistema
indicado anteriormente. El péptido considerado de pureza aceptable
se manifiesta como un único pico que representa no menos de 95% del
cromatograma.
A continuación, se analizaron los péptidos
purificados con el objetivo de realizar el seguimiento de la
composición de aminoácidos de los mismos, utilizando un analizador
automático de aminoácidos 420H de Applied Biosystems. La medición
de la masa molecular química (media) de los péptidos se realizó
mediante espectrometría de masas LSIMS en el modo de iones
positivos en un instrumento de doble enfoque VG.ZAB.ZSEQ conectado a
un sistema de captura DEC-VAX 2000 (VG Analytical
Ltd., Manchester, Inglaterra).
La reactividad de los diferentes péptidos se
sometió a ensayo contra sueros de pacientes que sufrían EM y contra
sueros de controles sanos. Lo anterior permitió seleccionar un
péptido denominado S24Q cuya secuencia se identifica como SEC ID nº
63, codificado por una secuencia de nucleótidos del gen pol
de MSRV-1 (SEC ID nº 62).
Se demostraron las propiedades antigénicas del
péptido S24Q siguiendo el protocolo de ELISA descrito
posteriormente.
Se disolvió el péptido S24Q liofilizado en ácido
acético al 10% a una concentración de 1 mg/ml. Esta solución madre
se dividió en alícuotas y se mantuvo a +4ºC para la utilización
antes de catorce días o se congeló a -20ºC para la utilización
antes de 2 meses. Se diluyó una alícuota en solución PBS (solución
salina tamponada con fosfato) de manera que se obtuviese una
concentración final de péptidos de 5 microgramos/ml. Se introdujeron
100 microlitros de esta dilución en cada pocillo de placas de
microtitulación Nunc Maxisorb (marca comercial). Las placas se
cubrieron con un adhesivo de tipo "sellante de placas" y se
mantuvieron durante 2 horas a +37ºC durante la etapa de adsorción
del péptido al plástico. Se retiró el adhesivo y las placas se
lavaron tres veces con un volumen de 300 microlitros de una
solución A (PBS 1X, Tween 20® al 0,05%), después se invirtieron
sobre un tejido absorbente. Las placas drenadas de esta manera se
llenaron con 250 microlitros por pocillo de una solución B
(solución A + suero de cabra al 10%), después se cubrieron con un
adhesivo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. A continuación, las
placas se lavaron tres veces con la solución A, tal como se ha
indicado anteriormente.
\newpage
Las muestras de suero de ensayo se diluyeron
previamente 1/100 en la solución B y se introdujeron 100 microlitros
de cada suero de ensayo diluido en los pocillos de cada placa de
microtitulación. Se introdujo un control negativo en un pocillo de
cada placa, en la forma de 100 microlitros de tampón B. Las placas
se cubrieron con un adhesivo y después se incubaron durante 1 hora
30 minutos a 37ºC. Las placas seguidamente se lavaron tres veces
con la solución A, tal como se ha indicado anteriormente. Para la
respuesta de IgG, se diluyó un anticuerpo de cabra marcado con
peroxidasa dirigido contra la IgG humana (comercializada por Jackson
Immuno Research Inc.) en la solución B (dilución/10.000). A
continuación, se introdujeron 100 microlitros de la dilución
apropiada del anticuerpo marcado en cada pocillo de las placas de
microtitulación, y las placas cubiertas con un adhesivo se
incubaron durante 1 hora a 37ºC. Seguidamente se llevó a cabo un
lavado adicional de las placas, tal como se ha indicado
anteriormente. En paralelo, se preparó el sustrato de la peroxidasa
siguiendo las instrucciones de los kits bioMérieux. Se introdujeron
100 microlitros de solución de sustrato en cada pocillo y las
placas se mantuvieron protegidas de la luz durante 20 a 30 minutos a
temperatura ambiente.
Tras la estabilización de la reacción de color,
se introdujeron 50 microlitros de Color 2 (marca comercial de
bioMérieux) en cada pocillo con el fin de detener la reacción. Las
placas se introdujeron inmediatamente en un lector
espectrofotométrico de placas ELISA y se leyó la densidad óptica
(DO) de cada pocillo a una longitud de onda de 492
nm.
Las muestras serológicas se introdujeron por
duplicado o por triplicado, y la densidad óptica (DO)
correspondiente al suero analizado se calculó como el promedio de
los valores de DO obtenidos para la misma muestra a la misma
dilución.
La DO neta de cada suero corresponde a la DO
media del suero menos la DO media del control negativo (solución B:
PBS, Tween 20x al 0,05%, suero de cabra al 10%).
Se utilizó la técnica descrita anteriormente con
el péptido S24Q para someter a ensayo la presencia de anticuerpos
IgG anti-MSRV-1 específicos en el
suero de 15 pacientes para los que se había establecido un
diagnóstico definitivo de EM según los criterios de Poser (23) y de
15 controles sanos (donantes de sangre).
La figura 41 muestra los resultados de cada
suero analizado con un anticuerpo anti-IgG. Cada
columna representa la densidad óptica neta (DO a 492 nm) de un
suero analizado. El eje de ordenadas proporciona la DO neta en la
parte superior de las columnas. Las primeras 15 columnas a la
izquierda de la línea discontinua vertical representan los sueros
de 15 controles sanos (donantes de sangre) y las 15 columnas a la
derecha de la línea discontinua vertical representan los sueros de
15 casos de EM sometidos a ensayo. El diagrama permite revelar 2
controles cuya DO es superior a los valores agrupados de la
población de control. Estos valores podrían representar la
presencia de IgG específicas en pacientes seropositivos sin
síntomas. Por lo tanto, se evaluaron dos métodos con el fin de
determinar el umbral estadístico de positividad del ensayo.
La media de los valores de DO neta para los
controles, incluyendo los controles con valores de DO neta elevada,
era de 0,129 y la desviación estándar, de 0,06. Sin los 2 controles
cuyos valores de DO eran superiores a 0,2, la media de los
controles "negativos" era de 0,107 y la desviación estándar, de
0,03. Puede calcularse un umbral teórico de positividad según la
fórmula siguiente:
Valor del
umbral (media de los valores de DO neta de los controles negativos)
+ (2 ó 3 desviaciones estándares de los valores de DO neta de los
controles
negativos).
En el primer caso, se considera que son
seropositivos sin síntomas, y el valor del umbral es igual a 0,11 +
(3 x 0,03)=0,20. Los resultados negativos representan una "señal
de fondo" no específica de la presencia de anticuerpos dirigidos
específicamente contra un epítopo del péptido.
En el segundo caso, si el conjunto de controles
que consiste de donantes de sangre con buena salud aparente se
considera que es una base de referencia, sin excluir los sueros que
aparentemente son seropositivos, la desviación estándar de los
"controles no EM" es de 0,116. El valor del umbral en este caso
es 0,13 + (3 x 0,06) = 0,31.
Según este último análisis, el ensayo es
específico para la EM. A este respecto se observa que el ensayo es
específico de la EM debido a que, tal como se muestra en la Tabla 1,
ningún control presenta una DO neta superior a dicho umbral. De
hecho, este resultado refleja el hecho de que los títulos de
anticuerpos en pacientes que sufren EM son mayoritariamente más
altos que en los controles sanos que han estado en contacto con
MSRV-1.
De acuerdo con el primer método de cálculo, y
tal como se muestra en la figura 41 y en la Tabla 3, seis de los 15
sueros de EM proporcionaron un resultado positivo (DO superior o
igual a 0,2), indicando la presencia de IgG dirigidas
específicamente contra el péptido S24Q, por lo tanto contra una
porción del enzima transcriptasa inversa del retrovirus
MSRV-1 codificada por el gen pol del mismo, y
en consecuencia contra el retrovirus MSRV-1.
\newpage
De esta manera, aproximadamente 40% de los
pacientes de EM sometidos a ensayo reaccionaron contra un epítopo
presente en el péptido S24Q y presentaban IgG circulantes dirigidas
contra el mismo.
Dos de 15 donantes de sangre en buena salud
aparente mostraron un resultado positivo. De esta manera, resulta
evidente que aproximadamente 13% de la población sin síntomas podría
haber estado en contacto con un epítopo transportado por el péptido
S24Q bajo condiciones que han conducido a una inmunización activa
que se manifiesta en la persistencia de IgG séricas específicas.
Estas condiciones son compatibles con una inmunización contra la
transcriptasa inversa del retrovirus MSRV-1 durante
una infección (y/o reactivación) con el retrovirus
MSRV-1. La ausencia de patología neurológica
evidente reminiscente de EM en estos controles seropositivos podría
indicar que son portadores sanos y que han eliminado el virus
infeccioso tras autoinmunizarse, o que constituyen una población de
riesgo de portadores crónicos. En efecto, los datos epidemiológicos
que muestran que un agente patogénico presente en el medio ambiente
de regiones de alta prevalencia de EM podría ser la causa de esta
enfermedad, implican que una fracción de la población sin EM ha
estado necesariamente en contacto con dicho agente patogénico. Se
ha demostrado que el retrovirus MSRV-1 constituye la
totalidad o parte de dicho "agente patogénico" subyacente a la
EM, y por lo tanto es normal que los controles obtenidos de una
población sana presenten anticuerpos de tipo IgG contra componentes
del retrovirus MSRV-1.
Finalmente, la detección de anticuerpos
anti-S24Q en únicamente uno de dos casos de EM
sometidos a ensayo en la presente invención podría reflejar el
hecho de que dicho péptido no representa un epítopo inmunodominante
de MSRV-1, que las variaciones de cepa
inter-individuales podrían inducir una inmunización
contra un motivo peptídico divergente en la misma región, o que el
curso de la enfermedad y los tratamientos seguidos podrían modular
con el tiempo la respuesta de anticuerpos contra el péptido
S24Q.
Se utilizó la técnica ELISA con el péptido S24Q
para someter a ensayo la presencia de anticuerpos IgM
anti-MSRV-1 específicos en los
mismos sueros que anteriormente.
La figura 42 muestra los resultados de cada
suero sometido a ensayo con un anticuerpo anti-IgM.
Cada columna representa la densidad óptica neta (DO a 492 nm) de un
suero analizado. El eje de ordenadas proporciona la DO neta en la
parte superior de las columnas. Las primeras 15 columnas a la
izquierda de la línea vertical que corta el eje de abscisas
representan los sueros de 15 controles sanos (donantes de sangre), y
las columnas situadas a la derecha de la línea discontinua vertical
representan los sueros de 15 casos de EM sometidos a ensayo.
El promedio de los valores de DO para los casos
de EM sometidos a ensayo era de 1,6.
El promedio de los valores de DO neta para los
controles era de 0,7.
La desviación estándar de los controles
negativos era de 0,6.
El umbral teórico de positividad puede
calcularse según la fórmula siguiente:
Valor del
umbral = (media de los valores de DO de los controles negativos) +
(3 x desviación estándar de los valores de DO de los controles
negativos)
Por lo tanto, el valor del umbral es igual a 0,7
+ (3 x 0,6) = 2,5.
Los resultados negativos representan una
"señal de fondo" no específica de la presencia de anticuerpos
dirigidos específicamente contra un epítopo del péptido.
Según dicho análisis, y tal como se muestra en
la figura 42 y en la Tabla 4 correspondiente, el ensayo de IgM es
específico de EM, debido a que ningún control presenta una DO neta
superior al umbral. 6 de los 15 sueros de EM produjeron un
resultado de IgM positivo.
La diferencia de seroprevalencia entre las
poblaciones de EM y de control era extremadamente significativa:
ensayo ji-cuadrado, p<0,002.
Estos resultados apuntan a un papel
etiopatogénico del retrovirus MSRV-1 en la EM.
De esta manera, la detección de los anticuerpos
IgM y IgG contra el péptido S24Q permite evaluar, por sí sola o en
combinación con otros péptidos de MSRV-1, el curso
de una infección por MSRV-1 y/o de la reactivación
vírica de MSRV-1.
Resulta posible, como resultado de los nuevos
descubrimientos realizados y de los nuevos métodos desarrollados
por los inventores, la implementación mejorada de ensayos
diagnósticos de la infección y/o reactivación de
MSRV-1 y evaluar una terapia en la EM o en la AR
basada en su eficacia en "negativizar" la detección de dichos
agentes en los líquidos biológicos del paciente. Además, la
detección precoz en individuos que todavía no manifiestan indicios
neurológicos de EM o indicios reumatológicos de AR podría permitir
la institución de un tratamiento que resultaría más eficaz con
respecto al curso clínico posterior debido al hecho de que
precedería al estudio de lesiones, que corresponde a la aparición
del trastorno clínico. Ahora, en la actualidad, no puede
establecerse un diagnóstico de EM o de AR antes de que se produzca
una sintomatología de lesiones y, por lo tanto, no se instituye
ningún tratamiento antes de que aparezca un cuadro clínico sugestivo
de lesiones que ya son significativas. Por lo tanto, el diagnóstico
de una infección y/o reactivación de MSRV-1 y/o
MSRV-2 en el ser humano resulta de importancia
decisiva, y la presente invención proporciona los medios para
llevarlo a cabo.
De esta manera, resulta posible llevar a cabo un
diagnóstico de infección y/o reactivación de MSRV-1,
para evaluar una terapia de la EM basada en la eficacia de
"negativización" de la detección de estos agentes en los
líquidos biológicos del paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células del plexo coroideo de
pacientes de EM y de controles, de la biblioteca de células
cerebrales, Laboratoire R. Escourolles, H\hat{o}pital de la
Salp\hat{e}triére, París, Francia. Se obtuvieron células
leptomeníngeas no tumorales de controles, tal como se ha descrito
anteriormente (26). La sangre periférica de pacientes de EM y de
control utilizados para obtener líneas de células B y plasma se
obtuvo del Neurological Departament, CHU de Grenoble, y de INSERM U
134, H\hat{o}pital de la Salp\hat{e}triére, Francia. Los
detalles clínicos y el origen de los 10 pacientes de EM y de los 10
pacientes con otras enfermedades neurológicas, que proporcionaron
las muestras de CSF, se proporcionan en la Tabla 6.
Todos los tipos celulares se cultivaron tal como
se ha descrito anteriormente (3, 5, 26).
Todos los cultivos se cribaron regularmente para
contaminación por micoplasmas utilizando un kit ELISA de detección
de micoplasmas (Boehringer). Ningún extracto celular ni sobrenadante
utilizado contenía micoplasmas detectables.
La purificación de viriones extracelulares y los
gradientes de densidad de sacarosa se llevaron a cabo tal como se
ha descrito anteriormente (3, 5, 26). De cada gradiente de sacarosa
se recogieron fracciones de 0,5 a 1 ml de la parte superior de los
tubos, con una pipeta Pipetman de 1.000 \mul y una punta estéril
diferente para cada fracción. Se utilizaron 60 \mul para el
ensayo de actividad de RT y el resto se mezcló con 1 volumen de
tampón que contenía tiocianato de guanidinio 4 M,
N-lauroil-sarcosina al 0,5%, EDTA 25
mM, \beta-mercaptoetanol al 0,2%
ajustado a pH 5,5 con ácido acético. Estas mezclas se congelaron a
-80ºC para la extracción posterior del ARN o se procesaron
directamente según Chomzynski (20), con una etapa de precipitación
durante la noche a -20ºC, en presencia de glucógeno libre de ARNasa
(Boehringer). El ARN se disolvió en 20 a 50 \mul de agua tratada
con DEPC en presencia de 1 a 2 \mul de inhibidor recombinante de
ARNasa (PROMEGA) y DTT 0,1 mM. Se utilizaron alícuotas de 10 \mul
para cada RT-PCR.
Se sometió a ensayo la actividad de RT con
Mg^{++} 20 mM y moldes poli-Cm o poliC, en pellets
o fracciones de viriones de gradientes de sacarosa, tal como se ha
descrito anteriormente (3, 5, 26).
Se requirió una actividad de RT total de entre
10^{6} y 10^{7} dpm en la fracción que contenía el pico de
viriones purificados. La técnica de RT-PCR
"Pan-retro" (27) se llevó a cabo en ARN de
viriones extraído mediante el método de Chomczynski (20) y se
disolvió en 20 \mul de agua libre de ARNasa. Una solución de 5
\mul de ARN se incubó durante 30 min. a 37ºC con 0,3 unidades (3
unidades para la serie de CSF) de ADNasa-1 libre de
ARNasa (Boehringer) en 20 \mul de solución de reacción que
contenía 7,5 mM de hexámeros aleatorios, Hepes-HCl
5 mM, pH 6,9, KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM, DTT 10 mM,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 0,5 mM de cada dNTP y 20
unidades de inhibidor recombinante de ARNasa (Promega). A
continuación, la ADNasa se inactivó por calor a 80ºC durante 10
minutos. Se añadieron 20 unidades de RT de MoMLV (Pharmacia) y 20
unidades adicionales de inhibidor de ARNasa en cada tubo en un
recinto Genesphere^{TM} (Safetech, Irlanda) y se sintetizó ADNc
durante 90 minutos a 37ºC. Tras la transcripción inversa, el ADNc
se sometió a ebullición durante 5 minutos, enfriándolo después
rápidamente en hielo. La mezcla para PCR de ronda 1 (volumen final:
25 \mul por reacción; Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl
60 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, 200 ng de cada uno de los cebadores
PAN-UO y PAN-DI (ver la figura 44),
0,2 mM de cada dNTP) se trató con 0,3 unidades de
ADNasa-1 y después se inactivó por calor tal como
anteriormente. Se añadieron 2,5 \mul de ADNc en el recinto
Genesphere^{TM} y los tubos se calentaron a 80ºC antes de añadir
0,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin Elmer) individualmente en
cada tubo ("inicio en caliente"). Los parámetros de la PCR de
ronda 1 fueron: 35 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 34ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 1 minuto, con una extensión final de 7
minutos a 72ºC. Se transfirieron 0,5 \mul del producto de PCR de
ronda 1 a la mezcla para PCR tratada con ADNasa de ronda 2
(composición igual que la de la ronda 1, aunque contenía los
cebadores PAN-UI y PAN-DI)
utilizando el procedimiento de "inicio en caliente". Los
parámetros de la PCR de ronda 2 eran iguales que los de la ronda 1,
aunque utilizando 30 ciclos únicamente e hibridando a 45ºC durante
1 minuto.
Se clonaron los productos de PCR utilizando el
kit TA-Cloning® (British Biotechnology) siguiendo
las recomendaciones del fabricante.
\newpage
Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación
utilizando el kit "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator
cycle sequencing kit" (Applied Biosystems). Se llevó a cabo el
análisis automático de secuencias en un secuenciador automático
(Applied Biosystems, 373A).
Se llevó a cabo la primera ronda de PCR
directamente a partir de la mezcla de reacción de ADNc según la
técnica de RT-PCR en una etapa descrita por Mallet
et al. (28). Este procedimiento de RT-PCR en
una única etapa redujo la probabilidad de contaminación aérea al
abrir los tubos y transferir los reactivos de PCR tras una síntesis
independiente de ADNc. Se extrajo el ARN tal como anteriormente, a
partir de 2 ml de plasma (congelado instantáneamente en nitrógeno
líquido y almacenado a -80ºC) o a partir de una fracción en sacarosa
de 500 \mul con una actividad total de RT superior a
10^{6} dpm, y se resuspendió en 50 \mul de agua libre de
ARNasa. Para cada reacción de RT-PCR, se incubaron x
\mul de solución de ARN en un termociclador
Perkin-Elmer 480, 15 minutos a 20ºC con 1 U de
ADNasa-1 libre de ARNasa y 1,2 \mul de tampón de
ADNasa 10X (Tris 50 mM, MgCl_{2} 10 mM y DTT 1 mM) que contenía 1
U/\mul de inhibidor de ARNasa (PROMEGA) y se calentaron a 70ºC
durante 10 minutos para la inactivación de la ADNasa. La solución se
mantuvo sobre hielo y se mezcló (bajo condiciones que evitasen la
contaminación por polvo áereo/ADN) con 88 \mul de mezcla para PCR
que contenía: tampón Taq 1X, 25 nM/tubo de dNTP, 40 pM/tubo de cada
cebador de primera ronda (cebador corriente arriba ST1.1: 5'
AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3' (SEC ID nº 99); cebador corriente abajo
ST1.1: 5' TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3' (SEC ID nº 100), 2,5
U/tubo de Taq (Appligene) y 10 U/tubo de AMV-RT
(Boehringer). Cada tubo se incubó adicionalmente en un
termociclador Perkin-Elmer 480 durante 10 minutos a
65ºC, seguido de 2 horas a 42ºC para la síntesis de ADNc y 5
minutos a 95ºC para la inactivación de AMV-RT y la
desnaturalización del ADN. Los parámetros de primera ronda eran: 40
ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 53ºC durante 2,5 minutos, 72ºC
durante 1 minuto, con una extensión final de 10 minutos a 72ºC. Se
transfirieron 10 \mul de la mezcla para PCR de primera ronda a la
mezcla para PCR de segunda ronda previamente tratada a 20ºC durante
15 minutos con ADNasa-1 libre de ARNasa (0,02
U/\mul) seguido de la inactivación de la ADNasa a 70ºC durante 10
minutos. Esta mezcla contenía tampón Taq 1X, 25
nM/tubo de dNTP, 40 pM/tubo de cada cebador de segunda ronda
[cebador corriente arriba ST1.2: 5' TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3' (SEC ID
nº 101); cebador corriente abajo ST1.2: 5' AACCCTTTGCCACTACATCAATTT
3' (SEC ID nº 102) y 2,5 U/tubo de Taq (Appligene). Los parámetros
de segunda ronda eran: 30 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 53ºC
durante 1,5 minutos, 72ºC durante 1 minuto, con una extensión final
de 8 minutos a 72ºC. Se depositaron 20 ml de dicho producto de
RT-PCR anidada en un gel de agarosa al 0,7% que
contenía bromuro de etidio y se expuso a luz UV para la
visualización de los productos amplificados.
El protocolo fue esencialmente el descrito con
anterioridad (21), aunque con las modificaciones siguientes: las
placas de microtitulación Nunc Maxisorb se recubrieron con 100 ng
por pocillo de sonda de captura CpV1b (ver la figura 44), mediante
adsorción pasiva (21) o alternativamente mediante la utilización de
capas recubiertas con estreptavidina y CpV1b biotinilada. Se
utilizó sonda detectora DpVI marcada con peroxidasa (ver la figura
44) y el valor de corte del ensayo se definió como la media de 4
controles negativos más 0,2 unidades de DO_{492}.
Se extrajo el ARN total de plasma humano de EM
mediante un método de guanidinio tal como se ha descrito con
anterioridad (29). El ARN total extraído de 100 \mul de plasma se
trató con ADNasa I libre de ARNasa (0,1 U/\mul;
Boehringer-Mannheim, Francia) y se transcribió
inversamente bajo las condiciones recomendadas por el fabricante
utilizando transcriptasa inversa Superscript
(Gibco-BRL, Francia). Los ADNc resultantes se
amplificaron mediante PCR semi-anidada en 35 ciclos
(94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto
30 segundos) y 72ºC durante 8 minutos para una extensión final. Se
amplificaron tres fragmentos diferentes en la región de RT
utilizando los cebadores específicos siguientes:
- -
- en la región de proteasa (PRT), para la primera y segunda rondas de PCR, respectivamente, cebador sentido [5' TCC AGC AGC AGG ACT GAG GGT 3' (SEC ID nº 103)] y cebadores antisentido [5' CTG TCC GTT GGG TTT CCT TAC TCC T 3' (SEC ID nº 104)/5' GAC AGC AAA TGG GTA TTC CTT TCC 3' (SEC ID nº 105)],
- -
- en el fragmento A de la región de RT (ver la fig. 46) para la primera y segunda rondas de PCR, respectivamente, cebador sentido [5' AGG AGT AAG GAA ACC CAA CGG ACA G 3' (SEC ID nº 106)] y cebadores antisentido [5' TGT ATA TAA TGG TCT GGC TAT TGG G 3' (SEC ID nº 107)/5' TTC GGC AGA AAC CTG TTA TGC CAA GG 3' (SEC ID nº 108)],
- -
- en el fragmento B de la región de RT (ver la fig. 46), para la 1ª y 2ª rondas de PCR, respectivamente, cebadores sentido [5' GGC TCT GCT CAC AGG AGA TTA GAT AC 3' (SEC ID nº 109)/5' AAA GGC ACC AGG GCC CTC AGT GAG GA 3' (SEC ID nº 110)] y cebador antisentido 3'[5' GGT TTA AGA GTT GCA CAA GTG CGC AGT C 3' (SEC ID nº 101)].
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos amplificados se analizaron en
geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio, se clonaron en
vector TA Cloning (Invitrogen) y se secuenciaron.
Las células de plexo coroideo (4) (obtenidas
post mórtem) y los linfocitos B periféricos inmortalizados con EBV
(30, 31) procedentes de pacientes de EM dieron lugar a cultivos que
expresaban partículas víricas de 100 a 120 nm asociadas a actividad
de RT similar a la del aislado de LM7 original (3). Algunos tipos
celulares similares procedentes de donantes sin EM no produjeron ni
dicha actividad de RT ni viriones. La totalidad de los cultivos
"infectados" fue poco y/o transitoriamente productivo y/o
presentaba una vida limitada. Por lo tanto, con el fin de analizar
el ARN genómico presente en la muy limitada cantidad de viriones
extracelulares, se utilizó un enfoque de RT-PCR
para amplificar, con cebadores degenerados, una región conservada
del gen pol presente en todos los retrovirus conocidos (12); las
técnicas basadas en este enfoque se denominan RT-PCR
"Pan-retro". El tratamiento extensivo con
ADNasa de las muestras y los reactivos resultó esencial, debido a
que el ADN humano contiene muchos elementos retrovíricos endógenos
amplificables mediante esta técnica.
Los experimentos de RT-PCR
"Pan-retro" se llevaron a cabo en viriones
purificados en un gradiente de densidad de sacarosa, procedentes de
sobrenadantes de diferentes tipos de cultivo celular y de sus
controles no infectados: (i) células de plexo coroideo muestreadas
post mórtem de cerebro de paciente con EM (PLI-I),
(ii) células de plexo coroideo de autopsia cerebral no EM,
infectadas mediante cocultivo con células LM7 irradiadas (LM7P), e
(iii) células de plexo coroideo no infectadas idénticas. Las líneas
de células B "tempranas" obtenidas mediante transformación
in vitro espontánea de dos individuos seropositivos para EBV,
(iv) un paciente con EM y (v) un control no EM. La figura 43
ilustra la actividad de RT en las fracciones de gradiente de
sacarosa obtenidas a partir de los cultivos de linfocitos B. La
técnica descrita por Shih et al. (12) se modificó en un
protocolo de RT-PCR semianidada (27) utilizando
cebadores degenerados (fig. 2) y tratamiento extensivo con ADNasa.
Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en Londres (Dpt. of
Virology, U.C.L.M.S.) en alícuotas codificadas de las fracciones
del gradiente de densidades. Se llevó a cabo la secuenciación y
clonación ciegas y sistemáticas de los productos de PCR en un
laboratorio independiente (bioMérieux, Lyon). Tras la secuenciación
completa de 20 a 30 clones por fracción de gradiente de sacarosa,
se abrieron los códigos y los resultados se analizaron en paralelo
con los datos de actividad de RT.
La Tabla 5 presenta la distribución de
secuencias obtenidas de fracciones de gradiente de sacarosa que
contenían los picos de actividad de RT vírica en cultivos derivados
de EM y también las secuencias amplificadas a partir de las
fracciones negativas para actividad de RT correspondientes de
cultivos no infectados. La secuencia predominante detectada en
bandas del tamaño esperado (\sim140 pb) amplificadas en todas las
fracciones positivas para actividad de RT (pero no en las
fracciones negativas para actividad de RT) eran diferentes de los
retrovirus conocidos y se denominaron MSRV-cpol.
Las secuencias de MSRV-cpol mostraron homología
parcial (70% a 75%) con ERV9, una secuencia retrovírica endógeno
anteriormente descrita (18). También se encontraban presentes
algunas secuencias de ERV9 (>90% de homología con ERV9), aunque
claramente representaban una minoridad de los clones. Además de las
secuencias pol típicas, se encontraron en todas las muestras
numerosos artefactos de la PCR (multímeros de cebador, concatámeros
o amplificaciones con un cebador único) relacionadas con la
utilización de cebadores degenerados y la hibridación a baja
temperatura (Tabla 5).
La figura 44 muestra una alineación de una
secuencia de consenso de MSRV-cpol con la región
VLPQG/YMDD correspondiente de diversos retrovirus. La figura 45
muestra un árbol filogenético basado en las secuencia de aminoácidos
evolutivamente conservadas de retrovirus tanto exógenos como
endógenos en esta región. En este árbol puede observarse que el gen
pol de MSRV se encuentra filogenéticamente relacionada con el
grupo de tipo C de Oncovirinae.
Se llevó a cabo un estudio a pequeña escala para
determinar la prevalencia de las secuencias
MSRV-cpol en el CSF de pacientes con EM. La
identificación de MSRV-cpol en los productos de PCR
mediante clonación y secuenciación resulta laboriosa y prolongada.
Por lo tanto, los presentes inventores diseñaron un ensayo
oligosorbente ligado a enzima (ELISA) que utiliza una sonda de
captura (CpVIB) y una sonda detectora marcada con peroxidasa (DpVI)
para la rápida identificación de secuencias de
MSRV-cpol en productos de PCR
"Pan-retrovirus" (figura 44). La especificidad
de este ensayo basado en la hibridación sándwich para
HMSRV-cpol se sometió a ensayo con secuencias de
pol distantemente relacionadas (VIH y MoMLV) y estrechamente
relacionadas (ERV9). No se observó reactividad cruzada
significativa con dichas dianas, a pesar de la capacidad de la ELISA
de detectar incluso tan solo 0,01 ng de ADN de
MSRV-cpol.
Se encontraban disponibles muestras de líquido
cerebroespinal (CSF) de 10 pacientes con EM y de 10 pacientes con
otros trastornos neurológicos. Se extrajo el ARN total de pellets de
CSF, se transcribieron inversamente y se amplificaron tal como
anteriormente. El análisis ELISA (Tabla 6) de los productos de PCR
reveló secuencias de MSRV-cpol en 5 de los 10 pacientes de
EM, pero en ninguna de las 10 muestras de pacientes con otras
enfermedades neurológicas (P<0,05). La presencia de
MSRV-cpol aparentemente no se encontraba correlacionada con
edad, sexo o tipo de EM, aunque únicamente se observó en pacientes
no tratados (5/6). No se encontró que ningún paciente sometido a
terapia inmunosupresora fuese positivo (0/4). No se observó
correlación entre la detección de MSRV-cpol y el
recuento de células del CSF.
Se consiguió una identificación independiente de
la secuencia genómica de MSRV mediante un enfoque no PCR utilizando
ARN extraído de concentrado de viriones derivado de 2,5 litros de
subcultivos infectados por LM7 de células de plexo coroideo. Se
obtuvo un número limitado de clones mediante clonación directa del
ADNc, uno de los cuales (PSJ17) mostraba homología parcial con
pol de ERV9. Los cebadores específicos, basados en la región
MSRV-cpol y en el clon PSJ17, amplificaron un
fragmento de 740 pb que unía las dos secuencias independientes en
ARN extraído de viriones purificados. Se localizó PSJ17 en el
extremo 3' de MSRV-cpol. Se consiguió la extensión
adicional de la secuencia en el lado 5' de MSRV-cpol y en el
lado 3' de PSJ17 utilizando enfoques de RT-PCR en
ARN procedente de viriones purificados similares a LM7 producidos en
cultivos de plexo coroideo EM (4).
En la figura 46, la secuencia de nucleótidos
correspondiente a clones solapantes obtenidos mediante extensión de
la secuencia en el gen pol se representa con la traducción en
aminoácidos correspondiente a los marcos de lectura abiertos (ORF)
putativos de la proteasa y de la transcriptasa inversa. Los motivos
de sitio activo de la proteasa (PRT) y de la transcriptasa inversa
(RT) se encuentran subrayados. En la región
C-terminal de la secuencia de RT, los residuos
aminoácidos, dispersados regularmente, presentes en dominios de
ARNasa H retrovírica también se encuentran subrayados.
Los cebadores de PCR (conjunto de cebadores
ST1.1; posiciones 603-625/1732-1714,
en la fig. 4) basados en clones solapantes en el gen pol,
amplificaron un segmento de 1,15 kb de la región RT de varios
aislados diferentes obtenidos de diferentes pacientes con EM. Los
cebadores anidados (ST1.2; posiciones
869-889/1513-1490, en la fig. 46)
generaron un fragmento de 700 pb (figura 47) que se visualizó más
fácilmente mediante tinción con bromuro de etidio que el producto
de primera ronda generado por ST1.1. La especificidad de los
productos de PCR se confirmó mediante hibridación estricta con una
sonda MSRV-cpol marcada con peroxidasa (fig. 44) utilizando
la técnica ELISA (21).
Se utilizaron los conjuntos de cebadores ST1.1 y
2 para detectar el ARN extracelular de MSRV en plasma humano,
aunque no resultan óptimos para la presente aplicación. La figura 47
ilustra los resultados de la amplificación por PCR de ADNc derivado
de 2 pacientes de EM y de 2 muestras de plasma de control sometidas
a ensayo en paralelo con ADNc procedente de fracciones de gradiente
de densidades de sacarosa de un aislado de plexo coroideo de un
paciente con EM. La secuenciación Taq de las bandas de 700 pb
confirmó la presencia de secuencia de MSRV. También resultaba
visible una banda muy débil de 700 pb en la fracción 10, que
corresponde al fondo del tubo, donde habitualmente sedimentan
partículas agregadas. La RT-PCR de control para los
transcritos de aldolasa celular en ARN derivado de plasma resultó
negativa, indicando que los resultados no se debían a ARN celular
liberado por lisis celular durante la separación del plasma. Debe
indicarse que esta técnica de PCR no se había diseñado para
estudios epidemiológicos, debido a que su sensibilidad se encuentra
limitada por la longitud de ADNc requerida (1,15 kb).
Los cebadores no degenerados que amplifican tres
fragmentos del gen pol (la región de proteasa completa, las
regiones A y B de la transcriptasa inversa; ver la fig. 46) también
se utilizaron para confirmar la presencia de secuencias de MSRV en
ARN tratado con ADNasa procedente de plasma de pacientes con EM.
Estos fragmentos se amplificaron a partir de plasma de 4 pacientes
adicionales con EM que presentaban enfermedad activa. El análisis
de las secuencias confirmó que las regiones de PRT y de RT eran
homólogas (>95% y >90%, respectivamente) a secuencias de MSRV
obtenidas anteriormente en cultivo de viriones. No se detectó dicha
secuencia en plasma procedente de controles sanos (n=4), sometidos
a ensayo en paralelo con el plasma de pacientes con EM.
A partir de los resultados del presente estudio,
puede concluirse que el virus denominado anteriormente "LM7"
(3, 5, 26) presenta un genoma de ARN que contiene las secuencias pol
de MSRV indicadas en la presente memoria.
El motivo conservado de RT tanto de MSRV como de
ERV9 es dos aminoácidos más corto que el de otros retrovirus,
aparte de los virus espumosos humanos, que sin embargo presentan una
RT funcional. La ORF potencial que comprende la región completa
PRT-RT es consistente con la actividad de RT
asociada a viriones detectada en gradiente de densidades de
sacarosa con sobrenadantes de cultivos infectados. Además, debido a
que los presentes inventores recientemente han podido expresar una
proteína recombinante a partir de la secuencia de proteasa de MSRV
clonada de plasma de pacientes con EM, pueden confirmar la
existencia de la ORF potencial de PRT. En la actualidad se llevan a
cabo clonaciones y expresiones similares de otras secuencias que
contienen ORF potenciales para proteínas de MSRV, con el fin de
confirmar la capacidad de las mismas de codificar enzimas y
proteínas estructurales de viriones de MSRV.
El árbol filogenético en la figura 45, basado en
la secuencia de aminoácidos más conservada en retrovirus
(VLPQG
...YXDD), demuestra que el gen pol de MSRV está relacionado con los oncovirus de tipo C. Aparte de ERV9, el elemento retrovírico conocido más similar es RTLV-H, una secuencia endógena humana que es conocido que presenta un subtipo con un gen pol funcional (32). En la región pol, esta afiliación filogenética con los oncovirus de tipo C aparentemente contradice las suposiciones anteriores de los presentes inventores basadas en la morfología general de las partículas observadas mediante microscopía electrónica (ME), que eran compatibles con un oncovirus de tipo B o D (3, 5, 26). Sin embargo, los datos preliminares de las secuencias env detectadas en viriones MSRV, sugerirían una proximidad filogenéticamente mayor con el tipo D. Esta diferencia en las filogenias de los genes pol y env han sido descritas en MPMV y sugieren un origen recombinatorio de los retrovirus de tipo D (33). La conversión morfológica del tipo C al tipo D también es una posibilidad, debido a que se ha informado de que una única sustitución de aminoácido en la proteína gag puede convertir la morfología retrovírica en la de un tipo diferente (34).
...YXDD), demuestra que el gen pol de MSRV está relacionado con los oncovirus de tipo C. Aparte de ERV9, el elemento retrovírico conocido más similar es RTLV-H, una secuencia endógena humana que es conocido que presenta un subtipo con un gen pol funcional (32). En la región pol, esta afiliación filogenética con los oncovirus de tipo C aparentemente contradice las suposiciones anteriores de los presentes inventores basadas en la morfología general de las partículas observadas mediante microscopía electrónica (ME), que eran compatibles con un oncovirus de tipo B o D (3, 5, 26). Sin embargo, los datos preliminares de las secuencias env detectadas en viriones MSRV, sugerirían una proximidad filogenéticamente mayor con el tipo D. Esta diferencia en las filogenias de los genes pol y env han sido descritas en MPMV y sugieren un origen recombinatorio de los retrovirus de tipo D (33). La conversión morfológica del tipo C al tipo D también es una posibilidad, debido a que se ha informado de que una única sustitución de aminoácido en la proteína gag puede convertir la morfología retrovírica en la de un tipo diferente (34).
El análisis de transferencia southern con una
sonda de MSRV-pol bajo condiciones restrictivas demostró la
hibridación con una familia endógena multicopia (datos no
presentados), indicando la existencia de elementos endógenos más
estrechamente relacionados con MSRV que con ERV9 mismo. En
consecuencia, los presentes inventores no pudieron buscar un
provirus específico de virión en células productoras de MSRV. De
acuerdo con los resultados de la transferencia southern, los
estudios de PCR de ADN genómico mostraron la amplificación de
múltiples bandas de secuencias endógenas relacionadas con MSRV.
Debido a que pol es el gen retrovírico más conservado, la
secuencia descrita en la presente memoria es la región menos
adecuada para discriminar entre secuencias exógenas y endógenas. Se
espera que la información de secuencia de otras partes del genoma
pueda permitir dicha discriminación, y se espera que en una porción
minúscula, tal como ha demostrado recientemente el retrovirus
Jaagsiekte (JSRV) de la oveja (35). Con este tipo de datos de
secuencia, resultaría posible identificar el provirus específico de
MSRV en el genoma de cultivos celulares productores de viriones.
El MSRV podría representar un elemento exógeno
productor de viriones de una familia endógena similar a ERV9, al
igual que existen cepas exógenas en las bien estudiadas familias
retrovíricas del ratón, virus del tumor mamario del ratón (MMTV) y
virus de la leucemia murina (MuLV), así como en la familia
retrovírica JSRV de la oveja (36). Alternativamente, también
resulta concebible que los viriones extracelulares de MSRV puedan
ser producidos por un provirus endógeno de replicación competente.
Sea MSRV exógeno o endógeno, existen similitudes conceptuales con
la categoría de retrovirus representada por MuLV, MMTV y JSRV. Al
contrario que los elementos endógenos defectivos, esta categoría de
agentes es conocido que produce viriones infecciosos y patogénicos
que causan enfermedad neurológica (37), tumores sólidos/leucemias
(36, 38) y que expresan "superantígenos endógenos" (39, 40).
Además, en las infecciones por MuLV, el fondo genético retrovírico
endógeno de la cepa de ratón puede determinar la susceptibilidad o
resistencia a la enfermedad (39, 41). En efecto, dichas
interacciones entre un retrovirus infeccioso y su contrapartida
endógena podrían resultar relevantes en la patogénesis de la EM,
debido a que los genotipos retrovíricos endógenos no son idénticos
en todos los individuos. Por lo tanto, un control genético debido a
genotipos retrovíricos endógenos relacionados podría contribuir a la
susceptibilidad hereditaria conocida a la EM (43), en el caso de
que MSRV en efecto desempeñe un papel activo en esta enfermedad.
En otro sitio, los datos de la Tabla 5 sugieren
que los elementos de ERV9 podrían coexpresarse, posiblemente
mediante transactivación en células infectadas, y dar lugar a ARN
heterólogo empaquetado en viriones de MSRV. Dicho empaquetamiento
heterólogo es conocido que se produce en otros sistemas retrovíricos
(42).
Entre los numerosos informes de virus
putativamente implicados en la etiopatogénesis de la EM, una
proporción significativa se centra en dos familias víricas:
Paramixoviridae y Herpesviridae. Con respecto a los
paramixoviridae, la observación crucial es un título de anticuerpos
frecuentemente incrementado frente al virus del sarampión en
pacientes de EM esencialmente dirigido, en el CSF, contra la
proteína de fusión del sarampión (44). La existencia de similitudes
de aminoácidos entre los dominios conservados de las proteínas de
fusión de paramixoviridae y la proteína transmembranal de los
retrovirus (45) podría explicar esta observación en el caso de que
se haya producido reactividad cruzada antigénica entre estas dos
proteínas.
Con respecto a la familia Herpesviridae,
se ha propuesto la implicación del virus de
Epstein-Barr (EBV), virus del herpes simplex de
tipo 1 (HSV-1) y, más recientemente, el virus 6 del
herpes humano (HHV-6) (31, 46, 47). De los estudios
anteriores de los presentes inventores y de aquellos de otros
grupos, aparentemente el herpesvirus podría desempeñar un papel
importante en la expresión de MSRV: los presentes inventores han
demostrado que las proteínas ICPO e ICP4
inmediatas-tempranas de HSV-1 pueden
transactivar MSRV/LM7 in vitro (6), y Haahr et al.
han propuesto un papel epidemiológico importante para el EBV como
cofactor en la EM, desencadenando la reactivación retrovírica (31).
La descripción reciente de Challoner et al. (47), que
muestra la expresión significativa de proteínas de HHV6 en las
placas de la EM, también podría sugerir un papel similar para HHV6
en el cerebro.
\newpage
Tras la filtración a través de 0,4 \mum para
eliminar los residuos celulares, y la digestión con ARNasa para
eliminar el ARN no encapsidado residual, se procesó suero para
extraer el ARN vírico por medio de la adsorción a una matriz de
sílice. El ARN vírico se sometió a digestión con ADNasa, después se
llevó a cabo una reacción combinada de transcripción
inversa-PCR (RT-PCR) utilizando los
cebadores PTpol-A (sentido: 5'xxxx3', SEC ID nº
183) y PTpol-F (antisentido: 5'xxxx3', SEC ID n1
184). Una segunda ronda de amplificación con los cebadores anidados
PTpol-B (sentido: 5'xxxx3', SEC ID nº 185) y
PTpol-E (antisentido: 5'xxxx3', SEC ID nº 186)
generó un producto de PCR de 435 pb que se identificó mediante
electroforesis en gel. Se confirmó la especificidad de cada
producto mediante secuenciación dideoxi. Se llevaron a cabo
reacciones de control sin transcriptasa inversa para garantizar que
los productos se derivaban de ARN vírico. Además, para excluir la
posibilidad de que el ARN vírico extraído se encontrase contaminado
con ácidos nucleicos derivados de la célula huésped, se sometieron
a ensayo alícuotas mediante PCR anidada para la presencia de ADN y
ARN de piruvato deshidrogenasa (PDH). Las muestras que generaron
una señal en los ensayos de PDH o de PCR "no RT" se excluyeron
del análisis.
Se amplificaron sueros de pacientes con EM
clínicamente activa y de pacientes de control mediante
RT-PCR y se secuenciaron. Se detectó el ARN de MSRV
asociado a viriones en el suero de 10 de 19 (53%) pacientes con EM,
aunque en sólo 3 de 44 controles sin EM (p=0,0001). El grupo de
control estaba constituido por 8 pacientes (todos negativos para
ARN de MSRV) con trastornos reumatológicos y 36 adultos sanos. Los
títulos de ARN de MSRV en ambos pacientes con EM y en los controles
eran aparentemente bajos debido a que la dilución incluso moderada
de los sueros (<10 veces) provocó la pérdida de señal.
En los pacientes con EM, la detección de ARN de
MSRV no se encontraba asociada a edad, sexo, duración de la
enfermedad o tipo de EM; sin embargo, se observó una correlación
negativa significativa con el tratamiento. Se obtuvieron 26
muestras de suero de 19 pacientes; el 100% de los sueros de
pacientes no tratados contenía ARN de MSRV detectable, mientras que
únicamente era detectable en 4 de 19 muestras (21%) obtenidas
durante el tratamiento con corticoesteroides y/o aztioprina
(P=0,001).
El motivo para la aparente pérdida de ARN de
MSRV asociado a viriones durante el tratamiento inmunosupresor no
se conoce, aunque el resultado concuerda con la observación anterior
de detección de MSRV en líquido cerebroespinal.
\vskip1.000000\baselineskip
^{a}El grupo de control consistía de 8
pacientes con trastornos no EM varios y 36 adultos sanos
- \quad
- ^{b}La detección de ARN de MSRV en el plasma de unos cuantos controles bajo condiciones que seleccionan el ARN empaquetado en viriones es consistente con el conocimiento existente de que un virus asociado a la EM debe encontrarse presente en una pequeña proporción de la población aparentemente sana. En efecto, dichos individuos pueden ser portadores sanos o encontrarse en la etapa preclínica (o subclínica) de la enfermedad, que puede durar años.
\vskip1.000000\baselineskip
(Todas las centrifugaciones se realizaron a
temperatura ambiente).
Se filtraron hasta 500 microlitros de suero
utilizando filtros de centrífuga de 0,45 micrómetros (Nanosep MF,
de Flowgen nº de catálogo U3-0126, ref. ODM45). El
suero se centrifugó durante 5 minutos a 130.000 g (o durante 10
minutos adicionales en caso necesario).
Se incubaron 150 microlitros de suero filtrado
con 10 unidades de ARNasa-Uno (Promega, nº de
catálogo M4261) durante 30 minutos a 37ºC.
A continuación, se extrajeron los 150
microlitros utilizando el kit de extracción SNAP de ARN
(Invitrogen), de la manera siguiente:
- -
- se añadieron 10 microgramos de ARN poliA a los 450 microlitros de tampón de unión para que actuase como portador; lo expuesto anteriormente se añadió a continuación al suero y se mezcló mediante inversión 6 veces; a continuación se añadieron 300 microlitros de propán-2-ol y se mezcló mediante inversión 10 veces; se transfirieron 500 microlitros a la columna SNAP y se centrifugaron a 1.300 g durante 1 minuto y se descartó el eluido; el resto seguidamente se añadió a la columna SNAP y se centrifugó a 1.300 g durante 1 minuto y se descartó el eluido; después, la columna se lavó con 600 microlitros de Superwash y se descartó el eluido; a continuación, la columna se lavó con 600 microlitros de solución de lavado de ARN 1X y se descartó el eluido; este lavado se repitió con una centrifugación de 1.300 g durante 2 minutos y se descartó el eluido; a continuación, los ácidos nucleicos unidos se eluyeron mediante incubación con 135 microlitros de agua libre de ARNasa durante 5 minutos y se centrifugaron a 1.300 g durante 1 minuto.
- -
- se añadieron 15 microlitros de tampón de ADNasa 10X y 3 microlitros (30 unidades) de ADNasa I libre de ARNasa (Boehringer-Mannheim, nº de cat. 776 785) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC; se añadieron 450 microlitros de tampón de unión y se mezclaron mediante inversión 6 veces; a continuación se añadieron 300 microlitros de propán-2-ol y se mezclaron mediante inversión 10 veces; se transfirieron 500 microlitros a la columna SNAP y se centrifugaron a 1.300 g durante 1 minuto y se descartó el eluido; el resto se añadió seguidamente a la columna SNAP y se centrifugó a 1.300 g durante 1 minuto y se descartó el eluido; a continuación la columna se lavó con 600 microlitros de solución de lavado de ARN 1X y se descartó el eluido; este lavado se repitió con una centrifugación de 1.300 g durante 2 minutos y se descartó el eluido; seguidamente, los ácidos nucleicos unidos se eluyeron mediante incubación con 105 microlitros de agua libre de ARNasa durante 5 minutos y se centrifugaron a 1.300 g durante 1 minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo RT-PCR
utilizando el sistema de RT-PCR de un tubo Titan
(Boehringer-Mannheim, nº de cat. 1 855 476). Se
utilizaron 25 microlitros de ARN en la reacción combinada
RT-PCR. El volumen total de reacción era 50
microlitros. El inhibidor de ARNasa utilizado era rRNAsin de Promega
(10 unidades). Se utilizaron 170 ng de los cebadores SEQ ID nº 183
y SEC ID nº 184, respectivamente. Se preparó una única mezcla madre
y la muestra de ARN se añadió al final. Lo anterior se llevó a cabo
a temperatura ambiente, no en hielo.
La etapa de RT estaba constituida por dos
incubaciones secuenciales de 30 minutos: a 50ºC y después a 60ºC.
Inmediatamente después se realizó una PCR con las etapas
siguientes:
- \text{*}
- Desnaturalización inicial del molde a 94ºC durante 2 minutos,
- \text{*}
- 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 45 segundos,
- \text{*}
- 1 ciclo de 68ºC durante 7 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda ronda de PCR se llevó a cabo
utilizando el sistema de PCR Expand de moldes largos
(Boehringer-Mannheim, nº de cat. 1 681 842). Se
añadieron 0,5 microlitros de la mezcla de RT-PCR a
25 microlitros de la mezcla de PCR de ronda 2. Se utilizó el tampón
nº 3 y 50 ng de los cebadores B y E. La PCR presentaba las etapas
siguientes:
- \text{*}
- 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 45 segundos,
- \text{*}
- 1 ciclo de 68ºC durante 7 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se corrieron los productos de
PCR en un gel de agarosa al 2%.
Los controles de no RT se llevaron a cabo
utilizando el sistema de PCR "Expand" para ambas rondas. La
primera ronda eran 40 ciclos y la segunda ronda, 20 ciclos.
Como control positivo, se utilizó una serie de
dilución de ADN tanto en la RT-PCR como en la PCR
"no RT". Para que un resultado fuese válido, las PCR de
RT-PCR y de "no RT" debían haber detectado una
cantidad de ADN equivalente a entre 1 y 0,1 células.
\newpage
El análisis de los productos de PCR de un
fragmento de aproximadamente 435 pb en la región pol se
muestra en la Tabla 8.
Los datos de la Tabla 9, determinados a partir
de las alineaciones de las figuras 49 a 53, muestran una
variabilidad:
- -
- entre los clones obtenidos de la muestra de plasma del mismo paciente en el mismo experimento de amplificación por PCR; lo anterior significa que el paciente presenta una población de viriones que comprende diferentes variantes de MSRV en un momento dado,
- -
- entre las poblaciones variantes secuenciadas de diferentes pacientes; lo anterior significa que las variantes difieren de un paciente a otro.
A partir de las figuras 53A y 53B puede
determinarse la variabilidad entre las secuencias de pacientes
sometidas a ensayo:
- -
- entre SEC ID nº 169 y SEC ID nº 176: 16,5%^{a} y 14,8%^{b}
- -
- entre las secuencias de péptidos obtenidas de SEC ID nº 169 y SEC ID nº 176: 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mencionan cuatro microorganismos en la
memoria: página 3, líneas 15 a 26, y se identifican posteriormente.
La totalidad ha sido depositada en la ECACC*, según las
disposiciones del Tratado de Budapest.
- -
- LM7PC, depositada el 22 de julio de 1992 con el nº 92072201,
- -
- PLI-2, depositada el 8 de enero de 1993 con el nº 93010817,
- -
- POL-2, depositada el 22 de julio de 1992 con el nº V92072202, y
- -
- MS7PG, depositada el 8 de enero de 1993 con el nº V93010816.
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{*}ECACC: colección europea de cultivos celulares animales,
- Vaccine Research and Production Laboratory
- Public Health Laboratory Service
- Centre of Applied Microbiology and Research
- Porton Down
- Salisbury, Wiltshire SP4 OJG
- Reino Unido.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: BIO MERIEUX
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MATERIAL VIRAL Y FRAGMENTOS DE NUCLEÓTIDOS ASOCIADOS A LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE, PARA FINES DIAGNÓSTICOS, PROFILÁCTIVOS Y TERAPÉUTICOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 160
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: CABINET GERMAIN & MAUREAU
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 12 rue Boileau
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LYON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FRANCE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CP: 69006
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dominique GUERRE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: MD/B05B2679
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFOnº: 4 72 69 84 30
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 4 72 69 84 31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 297 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 645 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 741 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 748 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 5, 7, 10, 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: G representa inosina (i)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 6, 12, 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: G representa inosina (i)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 39
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 150 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 41
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 42
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 43
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 44
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 45
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 46
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1859 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 47
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 48
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 49
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 400 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2389 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2448 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1196 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2391 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1722 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 495 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2503 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1167 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 63
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 433 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 693 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1577 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 182 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2304 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2364 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 768 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 114 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 99
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 100
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 100:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 101
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 102
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 103
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 103:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 104
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 104:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 105
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 105:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 106
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 106:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 107
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 108
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 108:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 109
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 109:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 110
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 110:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 111
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 111:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 310 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 112:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 103 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 113:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 114:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 115:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1481 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 493 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1329 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 162 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 758 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 124:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 126:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 127:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 128:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1511 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 130:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 131:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 352 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 131:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 132:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 132:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 133:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 133:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 135:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 398 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 135:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 137:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 378 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 138:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 138:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 139:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 139:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 140:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 140:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 141:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 764 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 141:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 142:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 800 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 142:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 169:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 169: consenso (41/68-1 + 42/68-1 + c143 68-1)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 170:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 438 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 170:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 171:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 438 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 171:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 172:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 438 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 172:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 173:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 146 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 173:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 174:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 146 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 174:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 175:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 146 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 175:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 176:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 176: consenso (1/46-7+8/46-7+c15/46/7)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 177:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 429 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 177:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 178:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 429 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 178:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 179:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 429 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 179:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 180:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 180:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 181:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 181:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 182:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC: ID nº: 182:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 183:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 183:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 184:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 184:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 185:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 185:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 186:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 186:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Fragmento de nucleótidos, que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido
por SEC ID nº 93, SEC ID nº 94, cualquier secuencia de nucleótidos
codificante de SEC ID nº 95, el fragmento 19-342 de
SEC ID nº 93, cualquier secuencia de nucleótidos codificante del
fragmento 7-114 de SEC ID nº 96, cualquier
secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 97, cualquier
secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 98, y sus
secuencias complementarias, y no comprendiendo ni estando
constituido dicho fragmento de nucleótidos por la secuencia
HSERV-9.
2. Fragmento de nucleótidos según la
reivindicación 1, seleccionado de entre el grupo constituido por SEC
ID nº 93, SEC ID nº 94, cualquier secuencia de nucleótidos
codificante de SEC ID nº 95, el fragmento 19-342 de
SEC ID nº 93, cualquier secuencia de nucleótidos codificante del
fragmento 7-114 de SEC ID nº 96, cualquier
secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 97, cualquier
secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 98, y sus
secuencias complementarias.
3. Sonda de ácidos nucleicos para la detección
de un virus asociado a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide,
caracterizada porque puede hibridarse específicamente con
cualquier fragmento según la reivindicación 1 ó 2.
4. Cebador para la amplificación mediante
polimerización de un ARN o de un ADN de un material vírico asociado
a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, caracterizado
porque puede hibridarse específicamente con cualquier fragmento
según la reivindicación 1 ó 2.
5. Cebador según la reivindicación 4, que
comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido
por SEC ID nº 99 a SEC ID nº 111.
6. Polipéptido codificado por cualquier marco de
lectura abierto perteneciente a un fragmento de nucleótidos según
la reivindicación 1 ó 2.
7. Polipéptido según la reivindicación 6,
caracterizado porque se selecciona de entre el grupo
constituido por SEC ID nº 95, SEC ID nº 96, el fragmento 7 a 114 de
SEC ID nº 96, SEC ID nº 97 y SEC ID nº 98.
8. Polipéptido antigénico reconocido a partir de
los sueros de pacientes infectados con el virus
MSRV-1, y/o en los que el virus
MSRV-1 ha sido reactivo, caracterizado porque
se selecciona de entre cualquier polipéptido según la
reivindicación 6 ó 7.
9. Polipéptido según la reivindicación 7, cuya
secuencia peptídica se selecciona de entre el grupo constituido por
SEC ID nº 173, 174, 175, 180, 181 y 182.
10. Anticuerpo mono- o policlonal dirigido
contra el virus MSRV-1, caracterizado porque
se obtiene mediante la reacción inmunológica de un cuerpo o células
humanos o animales a un agente inmunogénico constituido por un
polipéptido antigénico según la reivindicación 8.
11. Reactivo para la detección del virus
MSRV-1, o de una exposición a dicho virus,
caracterizado porque comprende por lo menos una sustancia
reactiva seleccionada de entre el grupo constituido por una sonda o
cebador según la reivindicación 3 ó 4; un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9; o un anticuerpo según la
reivindicación 10.
12. Composición diagnóstica, profiláctica o
terapéutica para la inhibición de la expresión de un virus asociado
a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, y/o la actividad
enzimática de las proteínas de dicho virus, comprendiendo dicha
composición un fragmento de nucleótidos según la reivindicación 1 ó
2.
13. Composición diagnóstica, profiláctica o
terapéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, o un anticuerpo según la reivindicación
10.
14. Procedimiento para la detección in
vitro de un virus asociado a esclerosis múltiple o a artritis
reumatoide, en una muestra biológica, caracterizado porque
un ARN y/o un ADN que se presume pertenece o se origina a partir de
dicho virus, o sus ARN y/o ADN complementarios, se ponen en contacto
con un fragmento de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2.
15. Procedimiento para la detección in
vitro de la presencia o exposición a un virus asociado a
esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, en una muestra
biológica, en el que dicha muestra se pone en contacto con un
polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o un
anticuerpo según la reivindicación 10.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US75642996A | 1996-11-26 | 1996-11-26 | |
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|---|---|
| ES2331496T3 true ES2331496T3 (es) | 2010-01-05 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97911411T Expired - Lifetime ES2331496T3 (es) | 1996-11-26 | 1997-11-26 | Material viral y fragmentos de nucleotidos asociados a la esclerosis multiple, para fines diagnosticos, profilacticos y terapeuticos. |
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