ES2316151T3 - Retrovirus del grupo de vih y su uso. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN NUEVO INMUNOVIRUS CON LA DENOMINACION MVP2901/94, QUE SE HA DEPOSITADO EN LA COLECCION EUROPEA DE CULTIVOS CELULARES ANIMALES (CECCA) CON EL NUMERO V 95012601. TAMBIEN SE DESCRIBEN LOS ANTIGENOS CARACTERISTICOS OBTENIDOS, QUE SE PUEDEN UTILIZAR PARA DEMOSTRAR LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA RETROVIRUS, LOS CUALES ESTAN RELACIONADOS CON ENFERMEDADES DEL SISTEMA INMUNE, ASI COMO LAS SECUENCIAS PARCIALWA DEL ADN Y AMINOACIDOS DEL VIRUS.
Description
Retrovirus del grupo de VIH y su uso.
La presente invención se refiere a un nuevo
retrovirus del grupo de VIH que se designa actualmente más
precisamente como subtipo O de VIH. Se describe un procedimiento
para el cultivo del retrovirus. La invención se refiere además a la
obtención de este retrovirus así como al uso del virus con fines
medicinales, para diagnóstico y en la preparación de vacunas.
Los retrovirus que pertenecen al grupo
denominado VIH conducen en las personas infectadas por ellos a
síntomas de enfermedad que se resumen en el término colectivo
inmunodeficiencia o SIDA (síndrome de inmunodeficiencia
adquirida).
Los estudios epidemiológicos prueban que el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) representa el agente
etiológico de la inmensa mayoría de los casos de SIDA (síndrome de
inmunodeficiencia adquirida). Un retrovirus aislado y caracterizado
de un paciente en 1983 recibió la referencia VIH-1
(Barré-Sinoussi, F. et al., Science 220,
868-871 [1983]). Se describe una variante de
VIH-1 en el documento WO 86/02383.
Se identificó un segundo grupo de virus de
inmunodeficiencia humana en 1985 en África Occidental (Clavel, F.
et al., Science 233, 343-346 [1986]) y
se designó como virus de la inmunodeficiencia de tipo 2
(VIH-2) (documento
EP-A-0.239.425). Los retrovirus
VIH-2 se diferencian claramente de
VIH-1, pero presentan también una conexión con los
virus de inmunodeficiencia de simios (SIV-2). Como
el VIH-1, también el VIH-2 conduce a
una sintomatología de SIDA.
Por ANT70 (J. Vir., 1994, Vol. 68, Nº 3,
pág. 1586-1596) y MVP-5180/91 (J.
Vir., 1994, Vol. 68, Nº 3, pág. 1581-1585) se
han descrito recientemente virus de IH novedosos que no pueden
clasificarse en los subtipos de VIH-1
A-F. Debido a las claras diferencias estructurales
con las cepas de VIH-1 conocidas, se han combinado
ambos aislamientos temporalmente en el subtipo O (G. Myers, Base de
datos de Los Álamos), aunque se diferencian claramente entre sí en
la secuencia nucleotídica genómica.
Es una característica de los virus de
inmunodeficiencia humana que presentan una alta variabilidad, que
complica claramente la comparabilidad de los distintos aislamientos.
En la comparación de diversos aislamientos de VIH-1,
aparecen por ejemplo en algunas regiones del genoma altas
variabilidades, mientras que otras regiones del genoma se presentan
comparativamente conservadas (Benn, S. et al. Science
230, 949-951 [1985]). Ha podido observarse un muy
alto polimorfismo también para VIH-2 (Clavel, F.
et al., Nature 324, 691-695 [1986]).
La mayor estabilidad genética la poseen regiones de los genes gag y
pol, que codifican proteínas estructurales y enzimáticas esenciales.
En contraposición con esto, algunas regiones del genenv, así como
los genes (vif, vpr, tat, rev, nef), que codifican proteínas
reguladoras, presentan un alto grado de variabilidad.
Ha podido mostrarse también que los antisueros
contra VIH-1 reaccionan de forma cruzada también con
productos génicos de gag y pol de VIH-2, aunque sólo
presentaban bajas homologías de secuencia. Igualmente, la
hibridación entre ambos de estos virus era poco significativa, si se
empleaban condiciones no muy poco rigurosas (Clavel, F. et
al., Nature 324, 691-695 [1986]).
Debido a la amplia difusión de los retrovirus
del grupo VIH y al hecho de que entre el momento de la infección y
el momento en que son observables síntomas inequívocos de
alteraciones patológicas hay un intervalo de pocos a muchos años
(2-20), es de gran importancia epidemiológica
determinar la infección con retrovirus del grupo VIH lo antes
posible y sobre todo fiablemente. Esto desempeña un papel no sólo en
el diagnóstico de pacientes que presentan señales de
inmunodeficiencia, sino aún más en el análisis de donantes de
sangre. Se ha apuntado que, con el uso de retrovirus o componentes
de los mismos de tipos VIH-1 o
VIH-2, puede conducirse en sistemas de detección en
muchos sueros a detecciones nulas o sólo débiles de anticuerpos
aunque los pacientes de los que proceden los sueros presenten
señales de inmunodeficiencia. Con la ayuda del retrovirus según la
invención del grupo VIH, es posible en determinados casos dicha
detección.
Particularmente para el diagnóstico, la
diferenciación genotípica de los virus VIH representa un problema
considerable. En el caso de virus VIH-1, se deduce
que se modifica un nucleótido por genoma por ciclo de
replicación.
Debido a esta variabilidad genética, los virus
VIH pueden responder de forma extraordinariamente flexible a la
presión de selección in vivo y producir de forma
extremadamente rápida mutantes que son resistentes frente a
principios activos farmacológicos o que pueden atacar a individuos
que han configurado una cierta protección inmunitaria (Sharp et
al., "Origins and diversity of human immunodeficiency
viruses", AIDS 1994, Vol. 8, Supl. 1; S.
27-S 42).
Para impedir la propagación de infecciones,
particularmente en transfusiones de sangre, pero también en
donaciones de órganos, debe poder determinarse una infección por un
virus VIH con una seguridad lo más cercana posible a un 100%. Por
tanto, es necesario detectar diagnósticamente también aquellas
infecciones que están causadas por un virus que actualmente sólo
está difundido en determinadas regiones geográficas pero que, a
menos que se tomen medidas de precaución adecuadas, pueden
difundirse sin más también a Europa o los Estados Unidos de
América.
Se describen el aislamiento y la caracterización
de un nuevo virus de inmunodeficiencia humana, en adelante designado
como MVP-2901/94, que se aisló en 1994 en linfocitos
periféricos de una paciente de 24 años de Camerún que presentaba
señales de inmunodeficiencia. Geográficamente, este retrovirus
procede de una región de África que está localizada entre África
Occidental con infección de virus VIH-2 y
VIH-1 endémica y África Oriental con una difusión
casi exclusivamente de VIH-1. Es por tanto objeto de
la presente invención un nuevo retrovirus del subtipo O de VIH que
se designa como MVP-2901/94, así como secuencias de
ADN y secuencias aminoacídicas derivadas del mismo y kits de ensayo
que contienen éstas.
El MVP-2901/94 puede propagarse
en las líneas celulares MT2 y Jurkat. Se describen con detalle el
aislamiento y reproducción de virus en el libro "Viral
Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie
Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991".
Para una mejor comprensión de las diferencias
del virus MVP-2901/94 según la invención con los
retrovirus VIH-1 y VIH-2, debe
ilustrarse en primer lugar brevemente la configuración de los
retrovirus causantes de la inmunodeficiencia. En el interior del
virus se encuentra el ARN en un núcleo en forma de cono que está
constituido por unidades proteicas que portan la referencia p24 (p
de proteína). Este núcleo interno está recubierto por una cubierta
proteica que está configurada por la proteína p17 (núcleo externo) y
está recubierta por una cubierta glucoproteica que contiene, además
de lípidos que proceden de las células hospedadoras, la proteína
transmembrana gp41 y la proteína de cubierta 120 (gp120). Esta gp
realiza entonces un enlace con los receptores CD-4
de las células hospedadoras.
Hasta donde es conocido, el ARN de los virus VIH
presenta las siguientes regiones génicas, representadas
simplificadas: en ambos extremos las denominadas repeticiones
terminales largas (LTR) y las siguientes regiones génicas gag, pol,
env y nef. El gen gag codifica entre otras las proteínas de núcleo
p24 y p17, el gen pol codifica la transcriptasa inversa, la
proteasa, la ARNasa H y la integrasa, y el gen env codifica las
glucoproteínas gp41 y gp120 de la cubierta vírica. El gen nef
codifica una proteína con función reguladora. Se muestra en la
Figura 1 una disposición esquemática del genoma de retrovirus de
tipo VIH.
Es un procedimiento aplicable muy versátilmente
de la ingeniería genética la denominada PCR (reacción en cadena de
la polimerasa), en la que los componentes necesarios para la
práctica del procedimiento pueden adquirirse comercialmente. Con
este procedimiento, es posible amplificar secuencias de ADN si las
regiones de ADN de la secuencia a amplificar son conocidas. Deben
sintetizarse entonces fragmentos de ADN complementario cortos
(oligonucleótidos: cebadores) que se unan a una región corta de la
secuencia de ácido nucleico a amplificar. Para la práctica del
ensayo, se combinan ácidos nucleicos de VIH con los cebadores en una
mezcla de reacción que contiene adicionalmente una polimerasa y
trifosfatos de nucleótidos. La polimerización (síntesis de ADN) se
lleva a cabo durante un tiempo determinado y entonces se separan las
cadenas de ácido nucleico mediante calentamiento. Después de
enfriar, se inicia entonces de nuevo la polimerización. Por tanto,
si en los retrovirus según la invención se trata de un virus
VIH-1 o VIH-2, entonces deberían
poder amplificarse los ácidos nucleicos usando cebadores que estén
conservados dentro de las secuencias conocidas de los virus
VIH-1 y VIH-2. Dichos cebadores se
han especificado parcialmente (Lauré, F. et al.,
Lancet ii, (1988) 538-541 para pol 3 y pol 4
u Ou C.Y. et al., Science 239 (1988)
295-297 para sk 38/39, sk 68/69).
Sin embargo, estos cebadores no son capaces de
amplificar ADN del aislado de VIH MVP-5180/91 (J.
Vir., 1994, Vol. 68, nº 3, pág. 1581-1585). El
uso de este cebador no conducía igualmente a una amplificación de
ADN del aislado MVP-2901/94, lo que hablaba también
de una fuerte divergencia de este aislamiento de la secuencia
consenso de VIH-1. Por tanto, deberían construirse
nuevos cebadores distintos derivados de secuencias conocidas
conservadas lo más posible y utilizarse en todas las combinaciones
posibles con variación de las condiciones de reacción.
Sorprendentemente, resultó que la combinación de los cebadores 212 y
412 derivados de la secuencia del aislado
MVP-5180/94 en las condiciones de reacción indicadas
en el ejemplo 4 posibilitaba una amplificación del ADN de
MVP-2901/94 y por tanto permitía un primer acceso a
la secuencia del aislado.
(SEC ID Nº 1)
(SEC ID Nº 2)
Después de descifrar, como sucede aquí, una
región parcial de la secuencia de un virus de IH, puede clonarse y
secuenciarse el genoma completo del virus según procedimientos
estándar conocidos de la biología molecular.
1) Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo,
mediante la clonación de un ADNc del siguiente modo: el virus se
precipita de una cantidad de cultivo correspondientemente grande
(aproximadamente 1 l) y se recoge en solución de sal común tamponada
con fosfato. Se realiza entonces una sedimentación mediante un
colchón de sacarosa (al 20%). El sedimento celular puede suspenderse
en cloruro de guanidinio 6 M en ditiotreitol 20 mM y 0,5% de Nonidet
P 40. Se añade CsCl hasta una concentración 2 M y se aplica la
solución que contiene virus fragmentado sobre un colchón de cloruro
de cesio. Se sedimenta entonces el ARN vírico mediante
centrifugación, se disuelve, se extrae con fenol y se precipita con
etanol y cloruro de litio. Con la ayuda de un cebador
oligo(dT), se lleva a cabo la síntesis de la primera cadena
de ADNc del ARN vírico o partes del mismo. La síntesis puede
llevarse a cabo añadiendo transcriptasa inversa usando un kit
obtenible comercialmente. Para la síntesis de la segunda cadena, se
digiere la cadena de ARN del híbrido ARN/ADN con ARNasa H y se
sintetiza la segunda cadena utilizando ADN polimerasa I de E.
coli. Con la ayuda de ADN polimerasa T4, pueden producirse
entonces extremos romos y unirse estos con engarces adecuados para
sitios de corte de restricción. Después de la digestión de
restricción con las endonucleasas de restricción adecuadas, se aísla
el fragmento de ADNc de un gel de agarosa y se liga con un vector
cortado anteriormente de modo adecuado. El vector con el inserto de
ADNc puede usarse entonces para la transformación de células E.
coli competentes. Las colonias obtenidas se transfieren entonces
a membranas, se lisan y se desnaturalizan y finalmente se localizan
mediante hibridación los ácidos nucleicos marcados con digoxigenina
o biotina. Después de la preparación por ingeniería genética del
correspondiente ADNc, es posible un aislamiento de los fragmentos
de ADN deseados que proceden del retrovirus. Mediante el ensamblaje
de estos fragmentos en vectores de expresión adecuados, puede
expresarse entonces la proteína o fragmento de proteína deseado y
utilizarse para los ensayos de diagnóstico.
2) Como alternativa a los procedimientos
indicados, puede clonarse el ácido nucleico del virus de
inmunodeficiencia con la ayuda de tecnología de PCR. Para ello,
deben identificarse respectivamente cebadores de la región de
secuencia aún desconocida que sean capaces de posibilitar una
amplificación del ADN del aislamiento en combinación con cebadores
derivados de la parte conocida de la secuencia.
3) Otra posibilidad, a partir del tramo de
secuencia conocido del virus a clonar, es la clonación del ADN
genómico provírico del virus. Para ello, se purifica en primer lugar
ADN genómico de una línea celular infectada según procedimientos
estándar. El ADN provírico integrado en el genoma hospedador puede
clonarse entonces después de la creación y cribado de una genoteca.
Para ello, se fragmenta parcialmente el ADN genómico, se aísla la
fracción de los fragmentos de una longitud de 10-25
kb y se clona en un sistema vector que pueda incorporar fragmentos
de esta longitud, como cósmidos o fagos lambda. Se transforma la
mezcla de fragmentos genómicos mediante el sistema vector
seleccionado en una cepa de E. coli. Mediante hibridación con
un fragmento parcial de ADN presente clonado del virus buscado, que
está marcado radiactivamente o de otro modo, pueden identificarse y
aislarse vectores que contienen el genoma vírico (cribado en placa o
colonia). Por tanto, se pone entonces a disposición el genoma vírico
para un análisis de secuencia y una expresión de sus proteínas.
Entre los distintos aislados víricos, puede
expresarse la similitud mediante el grado de homología de las
secuencias de ácido nucleico o proteína. Una homología de un 50%
significa, por ejemplo, que coinciden 50 de 100 posiciones
nucleotídicas o aminoacídicas en las secuencias. La homología de
proteínas se determina mediante análisis de secuencia. Las
secuencias de ADN homólogas pueden establecerse también mediante la
técnica de hibridación
Es por tanto objeto de la presente invención un
virus de inmunodeficiencia del grupo de VIH que se ha depositado en
la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) con el número
V 95012601 con la referencia MVP-2901/94. El día de
depósito es el 26 de enero de 1995.
Para la caracterización inmunológica del virus,
son decisivos aquellos epítopes que causan una producción reforzada
de anticuerpos en personas infectadas y que son adecuados por tanto
para clasificar los virus en distintas subclases y subtipos. Se
trata por tanto a este respecto particularmente no de aquellos
epítopes que se proporcionan también en virus de los grupos
VIH-1 y/o VIH-2, sino de aquellos
epítopos que aparecen sólo en el virus depositado según la invención
y en aquellas variantes que pertenecen al estrecho grupo del virus
MVP-2901/94. Las propiedades morfológicas e
inmunológicas del virus se reflejan también en la región relevante
de diagnóstico de la proteína de cubierta.
El virus de inmunodeficiencia según la invención
presenta una secuencia de ARN que es complementaria de la secuencia
de ADN de la Tabla 1 y una homología con la secuencia de la Tabla 1
de al menos un 85%.
Es también objeto de la presente invención un
ADNc que es complementario del ARN del virus de inmunodeficiencia
MVP-2901/94 depositado en la European Collection of
Animal Cell Cultures (ECACC) con el nº V 95012601 o de un virus
según la invención según la reivindicación 1.
Este ADNc se presenta en una forma de
realización preferida en forma de ADN recombinante.
La invención comprende también antígenos que se
preparan usando el ADNc según la invención o el ADN recombinante o
usando la estructura aminoácida que puede derivarse de su ADNc. A
este respecto, el antígeno es una proteína o péptido.
Los antígenos según la invención presentan una
secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de
aminoácidos representada en la Tabla 1.
En una forma de realización especialmente
preferida, el antígeno según la invención muestra una secuencia de
aminoácidos NQQLLNLWGCKGKLICYTSVKWN.
La presente invención comprende también
antígenos que se preparan a partir de un virus de inmunodeficiencia
según la reivindicación 1 y se presentan, por ejemplo, en forma de
preparaciones víricas purificadas. Se prefiere preparar el antígeno
según la invención recombinantemente, pero también es posible
preparar sintéticamente el antígeno, por ejemplo, mediante síntesis
en fase sólida.
La invención comprende también kits de ensayo
para la detección de anticuerpos contra virus causantes de la
inmunodeficiencia que presentan al menos un antígeno según la
invención.
En los kits de ensayo, puede tratarse de
transferencia Western, ensayos ELISA o ensayos de detección de
anticuerpo por fluorescencia. Para el diagnóstico de virus y
particularmente de virus VIH, se ha apuntado en los últimos tiempos
que son muy sensibles y eficaces aquellos procedimientos en los que
se lleva a cabo una propagación (amplificación) de los ácidos
nucleicos víricos o de una región especial de los mismos.
Pertenece a los procedimientos de detección
conocidos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como
alternativa a ella, puede usarse también la reacción en cadena de la
polimerasa competitiva en la detección de infecciones por VIH (por
ejemplo, AIDS (1993), 7, Supl. 2; S. 65 - S. 71).
Otro procedimiento de detección que ha ganado
importancia en los últimos tiempos precisamente en el diagnóstico de
VIH es el procedimiento NASBA (amplificación basada en la secuencia
de ácido nucleico). Este procedimiento se describe, por ejemplo, en
AIDS 1993, 7 (Supl. 2): S.107-S.110. En este
procedimiento, se amplifica el ARN monocatenario o también el ADN
bicatenario con la ayuda de ARN polimerasa T7 y a continuación se
detecta.
Un procedimiento adicional para la detección de
virus VIH es la detección con amplificación de señal con la ayuda de
ADN ramificado. Este se describe, por ejemplo, en AIDS 1993,
7 (Supl. 2): S.11-S.14. En este procedimiento,
hibrida el ácido nucleico vírico en muestras que están unidas a una
fase sólida. Además, hibrida con la muestra una molécula detectora
(estructuras de ADN ramificado) y se detecta entonces
enzimáticamente.
En el procedimiento anterior, es común utilizar
determinadas regiones de ácido nucleico en el procedimiento de
detección que sean específicas del virus a detectar. En este
procedimiento de detección, se seleccionan determinados fragmentos
de ácido nucleico cortos, en los que se trata particularmente de
fragmentos de ADN, y se utilizan en el procedimiento de
detección.
Pueden usarse el virus de inmunodeficiencia
según la invención, el ADNc según la invención, así como los
antígenos para la detección de retrovirus que causan
inmunodeficiencia.
Pueden usarse particularmente los antígenos
según la invención para la preparación de vacunas.
Son también objeto de la invención ácidos
ribonucleicos que codifican un virus según la invención.
En el marco de la presente invención, se ha
secuenciado una parte de la proteína de cubierta que es de especial
relevancia para el diagnóstico. Se trata a este respecto de una
región de cubierta que comprende la zona del denominado bucle V3; la
región secuenciada en el marco de la presente invención se extiende
hasta la denominada región gp41.
En el marco de la presente invención, se ha
secuenciado en primer lugar una parte de la proteína de cubierta y
comprobado que esta secuencia presenta sólo una homología
relativamente baja con las secuencias correspondientes de virus de
tipo VIH. Referido particularmente a la región gp41, se ha
edtablecido una homología de como máximo un 79,1% a nivel
nucleotídico mediante una comparación con secuencias de VIH, que se
ha llevado a cabo con la ayuda de bancos de datos.
El virus según la invención se diferencia por su
secuencia de virus anteriormente conocidos. Son por tanto objeto de
la presente invención aquellos virus así como las correspondientes
secuencias de ADN o aminoácidos que corresponden en gran medida a la
secuencia del virus según la invención, en los que el grado de
desviación se comprueba mediante el grado de homología. Una
homología de, por ejemplo, más de un 85%, significa por tanto que se
comprenden aquellas secuencias que presentan al menos 85 a 100
nucleótidos o aminoácidos de los mismos nucleótidos o aminoácidos,
mientras que el resto puede ser distinto. En la comprobación de la
homología, se enfrentan ambas secuencias de modo que ajusten entre
sí lo más posible todos los nucleótidos o aminoácidos
correspondientes.
Mediante la secuencia aislada, pueden
construirse y sintetizarse epítopos inmunodominantes (péptidos). Ya
que la secuencia de ácido nucleico del virus es conocida, el experto
puede derivar de ella la secuencia de aminoácidos. Se da una región
parcial de la secuencia de aminoácidos en la Tabla 1. Se dan a
conocer por tanto también antígenos, es decir, proteínas, oligo- o
polipéptidos, que pueden prepararse con la ayuda de la información
dada a conocer en la Tabla 1. Estos antígenos, proteínas,
polipéptidos y oligopéptidos presentan secuencias aminoacídicas que
se dan en la Tabla 1. Los antígenos o péptidos pueden presentarse
secuencias parciales relativamente cortas de una secuencia de
aminoácidos que se reproducen en la Tabla 1. Esta secuencia de
aminoácidos es al menos de 10 aminoácidos, preferiblemente de al
menos 20 y con especial preferencia de al menos 25 aminoácidos de
longitud. Pueden prepararse estos péptidos no sólo con la ayuda de
tecnología recombinante, sino también mediante procedimientos
sintéticos. Es un modo de preparación adecuado la síntesis en fase
sólida de tipo Merrifield. Puede encontrarse una descripción
adicional de esta técnica y otros procedimientos conocidos en el
estado de la técnica en la bibliografía, por ejemplo, M. Bodansky,
et al., "Peptide Synthesis", John Weeley & Sons, 2ª
edición 1976.
En los ensayos de diagnóstico, se combina una
muestra de suero de la persona a examinar con las cadenas proteicas
de una o varias proteínas o glucoproteínas (que pueden expresarse en
líneas celulares eucarióticas), o partes de las mismas, que proceden
de MVP-2901/94. Los procedimientos de ensayo
preferidos incluyen procedimientos de ensayo de inmunofluorescencia
o inmunoenzimáticos (por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia).
En los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), puede
unirse, por ejemplo, antígeno que procede de
MVP-2901/94, o una variante del mismo, a las paredes
de placas de microvaloración. La dosificación usada a este respecto
depende esencialmente del sistema de ensayo y del tratamiento de las
placas de microvaloración. Se añaden entonces suero o diluciones de
suero que proceden de la persona a examinar a las depresiones de la
placa de microvaloración. Después de un tiempo de incubación
determinado, se lava la placa y se detectan los inmunocomplejos
específicos mediante anticuerpos que se unen específicamente a
inmunoglobulina humana y que se han unido previamente a una enzima,
por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.
o con un antígeno marcado enzimáticamente. Estas enzimas pueden
transformar un sustrato incoloro en un producto fuertemente
coloreado, y por la potencia de la coloración puede leerse entonces
la presencia de anticuerpos específicos anti-VIH. Es
una posibilidad adicional de uso del virus según la invención en
sistemas de ensayo el uso en transferencias Western.
Aunque la preparación de vacunas contra
enfermedades inmunodeficientes se ha probado excepcionalmente
difícil, pueden usarse sin embargo también este virus o partes del
mismo, es decir epítopos inmunodominantes e inductores de la
inmunidad celular, o antígenos preparados por ingeniería genética,
para el desarrollo y preparación de vacunas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló el virus de inmunodeficiencia según la
invención MVP-2901/94 a partir de sangre de una
paciente con señales de inmunodeficiencia. Para ello, se estimularon
con fitohemaglutinina células mononucleares periféricas (linfocitos
de sangre periférica, PBL) y linfocitos periféricos de la sangre
(PBL) de un donante no infectado con VIH y se mantuvieron en
cultivo. Se usó para ello el medio habitual RPMI 1640 con suero
fetal de ternero al 10%. Se describen las condiciones de cultivo en
Landay A. et al., J. Inf. Dis., 161 (1990) pág.
706-710. No se observó formación de células
gigantes. Se determinó la producción de virus de IH mediante la
determinación del antígeno p24 con la ayuda del ensayo
comercialmente adquirible de Abbott. Un ensayo adicional para la
determinación del crecimiento del virus era el ensayo que usaba
transcriptasa inversa unida a partículas (Eberle J., Seibl R., J.
Virol. Methods 40, 1992, pág. 347-356). Se
determinó por tanto el crecimiento del virus mediante las
actividades enzimáticas en el sobrenadante de cultivo una a dos
veces por semana, para vigilar la producción de virus. Se añadieron
una vez por semana nuevos linfocitos de donante.
Después de haber podido comprobar la propagación
de virus de IH, se infectaron linfocitos periféricos recientes de
sangre (PBL) de donantes sanos no infectados por VIH con el
sobrenadante del primer cultivo. Se repitió esta etapa y se
infectaron entonces células MT2 o Jurkat con el sobrenadante. De
este modo, era posible una producción permanente de virus de
inmunodeficiencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN genómico de linfocitos sanguíneos
infectados por MVP-2901/94 según procedimientos
estándar ("Current Protocols in Molecular Biology", Wiley
Interscience, 1994).
Para la caracterización de regiones de genoma
del aislamiento MVP-2901/94, se llevaron a cabo
experimentos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con pares
de cebadores de la región de proteína de cubierta gp41. Se llevó a
cabo la PCR (Saiki et al., Science 239:
487-491, 1988) con las siguientes
modificaciones:
Para la amplificación de regiones de ADN
específicas de VIH, se pipetearon 5 \mul (200 \mug/ml) de ADN
genómico de linfocitos sanguíneos infectados por
MVP-2901/94 en una preparación de reacción de 100
\mul (dNTP 0,25 mM,
1 \muM de cada cebador, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,001% de gelatina, 2,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin Elmer)) y se amplificaron según el siguiente programa de temperaturas: 1. desnaturalización inicial: 3 min a 95ºC, 2. amplificación: 90 s a 94ºC, 60 s a 56ºC, 90 s a 72ºC (30 ciclos).
1 \muM de cada cebador, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,001% de gelatina, 2,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin Elmer)) y se amplificaron según el siguiente programa de temperaturas: 1. desnaturalización inicial: 3 min a 95ºC, 2. amplificación: 90 s a 94ºC, 60 s a 56ºC, 90 s a 72ºC (30 ciclos).
Los cebadores usados para la PCR y la
secuenciación de nucleótidos se sintetizaron en el sintetizador
oligonucleotídico 8750 de la compañía Biosearch, presentando los
cebadores las siguientes secuencias:
(SEC ID Nº 3-9)
Después de que no fuera posible la amplificación
del aislado con los cebadores descritos en la bibliografía (Lauré,
F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541
para pol 3 y pol 4 u Ou C.Y. et al., Science 239
(1988) 295-297 para sk 38/39, sk 68/69), se
construyeron nuevos cebadores derivados de secuencias conocidas lo
más conservadas posible y se utilizaron en todas las combinaciones
concebibles con variación de las condiciones de reacción.
Sorprendentemente, resultó que la combinación de los cebadores 212 y
412 derivados de la secuencia del aislado
MVP-5180/94 en las condiciones de reacción
anteriormente indicadas posibilitaban una amplificación del ADN de
MVP-2901/94 y por tanto permitían un primer acceso a
la secuencia del aislamiento.
Mediante la secuenciación del primer
amplificado, pudieron diseñarse los cebadores 425 y 431 específicos
de MVP-2901/94. Para expandir adicionalmente la
región ahora conocida, se diseñaron nuevos cebadores según los
criterios citados anteriormente y se utilizaron en combinación con
el cebador 425 o 431. Se consiguió entonces una expansión en la
dirección 3' con el cebador 214 derivado de
MVP-5180/91 en combinación con 425, y una expansión
en la dirección 5' con la combinación 431/438 y 431/447, derivando
los cebadores 438 y 447 de regiones conservadas en la mayoría de
subtipos de VIH-1.
Se separó el ADN amplificado sobre gel de
agarosa "Nusieve" al 3% (compañía Biozyme), se cortó el
fragmento amplificado y se mezcló con el mismo volumen de tampón (1
x TBE (Trisborato 0,09 M, EDTA 0,002 M, pH 8,0)). Después de la
incubación de la mezcla de ADN-agarosa durante 10
minutos a 70ºC y posterior extracción con fenol, se precipitó el ADN
de la fase acuosa mediante la adición de 1/10 vol de NaAc 3 M, pH
5,5 y 2 vol de etanol a -20ºC durante 15 minutos, y a continuación
se sedimentó en una centrífuga Eppendorf (13.000 rpm, 10 min, 4ºC).
Se secó el ADN sedimentado, se recogió en agua y después de la
determinación fotométrica de la concentración de ADN a 260 nm en
espectrofotómetro (compañía Beckman), se secuenció según el
procedimiento de Sanger (F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci.,
74: 5463, 1977). En lugar de secuenciación con ADN polimerasa
Klenow, se llevó a cabo la reacción de secuenciación con un kit de
la compañía Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle
Sequencing", Nº art.: 401150). Como cebador, se utilizaron en
reacciones de secuenciación separadas respectivamente uno de los
cebadores usados para la PCR (respectivamente 1 \muM). El análisis
de la reacción de secuenciación se realizó en el dispositivo
secuenciador de ADN 373A (Applied Biosystems) según las
especificaciones del fabricante del dispositivo.
Se representan en la Tabla 1 la secuencia
nucleotídica de la región de ADN amplificada y la secuencia de
aminoácidos derivada de la misma (SEC ID Nº 10).
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la secuencia nucleotídica encontrada
de la Tabla 1 con las secuencias homólogas en el banco de datos
GENEBANK (publicación 83, junio de 1994), así como el banco de datos
EMBL (publicación 38, marzo de 1994), y la secuencia de proteína
derivada de la misma con el banco de datos de proteínas SWISSPROT
(publicación 28, febrero de 1994) con la ayuda del programa
informático GCG (Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin EE.UU.
versión 7.1, marzo de 1992). En estos bancos de datos, están
contenidas la mayoría de las secuencias nucleotídicas conocidas
hasta julio de 1994 de virus de inmunodeficiencia de origen humano y
de aislamientos de primates.
La secuencia nucleotídica de la Tabla 1 muestra
en el mejor caso un 79,6% de homología con un aislado de subtipo O
de VIH-1. La mejor homología con otro subtipo de
VIH-1 asciende a un 59,6%. Con aislados de
VIH-2, el ADN de la Tabla 1 es homólogo en el mejor
caso un 51,6%.
\newpage
La secuencia de aminoácidos de la Tabla 1 es
homóloga en el mejor caso un 72,7% con el tramo de proteína de
cubierta correspondiente de un representante del subtipo O de
VIH-1 y en el mejor caso un 52,1% con el aislado
VIH-1-Mal de VIH-1.
Con proteínas de cubierta de VIH-2, la homología con
la secuencia de aminoácidos de la Tabla 1 asciende en el mejor caso
a un 37,0% (aislado HIV2ROD).
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a la comparación de homología, el
aislamiento MVP-2901/94 es el más similar a ambos
aislados temporalmente designados como subtipo O de
VIH-1 MVP-5180/91 y ANT70. No
obstante, corresponde a ambos aislados un nivel relativamente alto
de heterología de secuencia de al menos un 20,9% a nivel
nucleotídico y al menos un 27,3% a nivel proteico.
En la región de ENV, se trata de la región
relevante para diagnóstico de la proteína de cubierta, que se da en
la Tabla 1 tanto como secuencia nucleotídica como secuencia de
aminoácidos.
Para la valoración de la importancia de este
virus para diagnóstico sérico, se analizó una muestra de suero de
pacientes infectados con 2901 en distintos ensayos de cribado
anti-VIH-1/2 comerciales.
En la Tabla 3, se representan los resultados de
estos análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se deduce de la Tabla 3 que ninguno de los kits
de ensayo obtenibles comercialmente incluye esta muestra. En cambio,
en caso de utilizar un ELISA novedoso en el que se emplea como
antígeno en fase sólida un péptido (NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN) que
corresponde a la secuencia de 2901 con la excepción de un aminoácido
(NQQRL en lugar de NQQLL) y como reactivos líquidos los reactivos
anti VIH-1/2 de Enzygnost, se incluye seguro la
muestra. Las transferencias Western obtenibles comercialmente como,
por ejemplo, de la compañía Pasteur, no incluyen esta muestra
MVP2901/94 (sin figura). Dichas transferencias Western
proporcionarían por tanto muy probablemente un resultado falso
negativo con muestras basadas en infección por MVP2901/94.
Es una región especialmente preferida de la
secuencia de aminoácidos representada en la Tabla 1 la región que
empieza con la secuencia de aminoácidos NQQLL... (esta región
empieza aproximadamente en el nucleótido 1010 según la numeración
usada en la Tabla 1.
El ejemplo 4 prueba también que para la
evaluación de diagnóstico de la divulgación de la presente invención
pueden llevarse a cabo alteraciones insignificantes en la secuencia
de aminoácidos sin que se influya desventajosamente en la validez
diagnóstica de un ensayo correspondiente.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Behringwerke Aktiengesellschaft
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Postfach 11 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Marburg
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 35001
\vskip0.800000\baselineskip
- TÍTULO DE LA SOLICITUD: Retrovirus del grupo de VIH y su uso (MVP-2901/94)
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PADAT Sequenzmodul versión 1.0
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1070 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 10:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1070 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 356 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interior.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 12:
Claims (10)
1. Virus de inmunodeficiencia del grupo VIH,
que se ha depositado en la European Collection of Animal Cell
Cultures (ECACC) con el número V 95012601 con la referencia
MVP-2901/94, y que presenta una secuencia de ARN que
es complementaria de la secuencia de ADN de la Tabla 1 y presenta
una homología con la secuencia de la Tabla 1 de al menos un 85%.
2. ADNc que comprende la secuencia de ácido
nucleico de SEC ID Nº 10 o su complemento.
3. ADN recombinante, caracterizado
porque presenta el ADNc según la reivindicación 2.
4. Antígeno que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 12.
5. Kit de ensayo para la detección de
anticuerpos contra virus causantes de inmunodeficiencia,
caracterizado porque presenta un antígeno según la
reivindicación 4.
6. Kit de ensayo según la reivindicación 5,
caracterizado porque es una transferencia Western
7. Kit de ensayo según la reivindicación 5,
caracterizado porque es un ensayo ELISA o un ensayo de
detección de anticuerpo por fluorescencia.
8. Uso de un virus de inmunodeficiencia según
la reivindicación 1 o un ADNc según la reivindicación 2 y/o un
antígeno según la reivindicación 4 para la detección de retrovirus
que causan inmunodeficiencia.
9. Uso de un retrovirus según la reivindicación
1, un ADNc según la reivindicación 2 y/o un antígeno según la
reivindicación 4 para la preparación de vacunas
10. Ácido ribonucleico, caracterizado
porque codifica el virus de inmunodeficiencia según la
reivindicación 1 y presenta una secuencia de ARN que es
complementaria de la secuencia de ADN de la Tabla 1 y presenta una
homología con la secuencia de la Tabla 1 de al menos un 85%.
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