JP2000230930A

JP2000230930A - Ｈｉｖグル−プに属するレトロウイルス、ｍｖｐ−２９０１／９４、およびその変異体を検出する診断方法及びそのための試験キット並びにワクチン

Info

Publication number: JP2000230930A
Application number: JP2000032366A
Authority: JP
Inventors: Hans-Peter Hauser; ハンス−ペ−タ−・ハオザ−; Stefan Knapp; シュテファン・ナップ; Stefan Dr Brust; シュテファン・ブルスト; Lutz G Guertler; ルッツ・ゲ−・ギュルトラ−; Josef Eberle; ヨ−ゼフ・エバ−レ; Lazare Kaptue; ラザレ・カプチュ−; Leopold Achenqui Zekeng; レオポルト・アヒェンギ・ツェケンク
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2000-08-22
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: CA2169603C; DK0727483T3; JPH08280389A; DE59611486D1; CA2169603A1; ES2316151T3; ZA961174B; AU4554596A; AU697040B2; US6162631A; EP0727483A3; KR100216417B1; JP2006008653A; JP3851480B2; KR960031609A; US5798205A; PT727483E; DE19505262A1; EP0727483A2; EP0727483B1

Abstract

(57)【要約】【課題】免疫不全症候群を惹起する新規レトロウイルス
とその変異体を検出する診断方法及びそのための試験キ
ット並びにワクチンを提供する。【解決手段】ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有し、
欧州動物細胞収集機関（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ９５０１
２６０１のもとに寄託されている新規免疫不全ウイルス
の外被糖タンパク質ｇｐ４１の塩基配列を開示する。か
かる塩基配列に基ずいてこのウイルスを検出するための
特異的抗原を得ることができ、当該新規レトロウイルス
及びその変異体の診断方法及びワクチンの開発が可能で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＭＶＰ−２９０１
／９４なる名称を有し、欧州動物細胞培養収集機関（ヨ
−ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カ
ルチャ−ズ；ＥＣＡＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０
１号として寄託されているレトロウイルスに相当する形
態学的および免疫学的性質を有する、ＨＩＶグル−プに
属する免疫不全ウイルスまたはＲＮＡの相同性が少なく
とも７５％である該ウイルスの変異体を抗原・抗体反応
によって検出する診断方法及びかかる診断方法に用いる
試験キット並びに前記ウイルス及び／又はその変異体を
抑制・阻害するワクチンにおいて、特異的抗原として前
記免疫不全ウイルスの外被糖タンパク質ｇｐ４１をコ−
ドする表１のＤＮＡ配列又はこの配列との相同性が少な
くとも７５％であるＤＮＡ配列から演繹されるペプチド
を特異的抗原として使用することを特徴とする、診断方
法、試験キット及びワクチンに係わる。

【０００２】

【従来の技術】いわゆるＨＩＶグループに属するレトロ
ウイルスは、ヒトに感染した場合、免疫不全即ちエイズ
（ＡＩＤＳ；後天性免疫不全症候群）なる総称で概括さ
れる疾患症状の原因となる。

【０００３】疫学的研究の結果、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）がエイズ（後天性免疫不全症候群）症例の圧
倒的大部分の発病因子であることが証明されている。１
９８３年に一人の患者から単離され次いで特性化された
レトロウイルスは、ＨＩＶ−１と命名された（Barre-Si
noussi、F. et al., Science 220, 868-871 1983) 。Ｈ
ＩＶ−１の一変異株については、ＷＯ８６／０２３８３
に記載されている。

【０００４】ヒト免疫不全ウイルスの第二のグループが
１９８５年に西アフリカで確認され（Clavel, F. et a
l., Science 233, 343-346 1986）、ヒト免疫不全ウイ
ルスタイプ２（ＨＩＶ−２）と命名された（ＥＰ−Ａ−
Ｏ２３９４２５）。ＨＩＶ−２レトロウイルスはＨＩＶ
−１とは明らかに相違するが、サル免疫不全ウイルス
（ＳＩＶ−２）に関連性がある。ＨＩＶ−１と同様、Ｈ
ＩＶ−２もエイズの症候を惹起する。

【０００５】最近、ＡＮＴ７０（J. Vir., 1994, Vol.
68, No. 3, pp. 1586-1596) およびＭＶＰ−５１８０／
９１（J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1581-158
5) で表示される新らしいウイルスが報告されている
が、これらはＨＩＶ−１サブタイプＡ−Ｆに分類できな
いものである。これらの単離株は、既知のＨＩＶ−１株
とは構造上明瞭に相違するため暫定的に共にサブタイプ
Ｏに分類されている(G. Meyers, Los Alamos Data Bas
e) ものの、ゲノムヌクレオチド配列は相互に明らかに
異なっている。

【０００６】高度の変異性を示しそのために異なる分離
株の比較可能性が著しく錯綜することになるのが、ヒト
免疫不全ウイルスの一つの特徴である。異なるＨＩＶ−
１分離株を比較する場合、たとえば、ゲノムのいくつか
の領域、特に外被糖タンパク質をコ−ドするｅｎｖ遺伝
子領域において高度の変異性が見られるのに対して他の
ゲノム領域は比較的によく保存されている場合がある
（Benn, S. et. al., Science, 230, 949-951 1985) 。
ＨＩＶ−２が極めて高い多型性を示すことも報告されて
いる（Clavel, et. al., Nature 324, 691- 6951986)。
即ち、構造的にも酵素的にも必須であるタンパク質をコ
−ドするｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子諸領域が、遺伝的安
定性が最も大きいのであるが、これとは対照的にｅｎｖ
遺伝子中のいくつかの領域及び調節タンパク質をコ−ド
する遺伝子（ｖｉｆ，ｖｐｒ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｎｅ
ｆ）は変異性が極めて高いのである。

【０００７】さらに、ＨＩＶ−１に対する抗血清は、仮
に配列相同性が低くても、ＨＩＶ−２のｇａｇおよびｐ
ｏｌ遺伝子産物とも交差反応することが証明されてい
る。これら２種のウイルスの間でのハイブリダイゼーシ
ョンも、厳密性の極めて低い条件を用いない限り、大き
な意義を持つものとはならなかったという（Clavel, e
t. al., Nature 324, 691-695 1986) 。

【０００８】ＨＩＶグル- プに属するレトロウイルスが
広く分布しかつ感染時点と病的変化の明確な症状が認め
られる時点との間に数年から数十年（２〜２０年）もの
期間が経過するため、ＨＩＶグル- プのレトロウイルス
による感染をできるだけ早期の段階でしかも特に信頼性
の高い方法で確認することは、疫学的にきわめて重要で
ある。このことは、免疫不全の幾つかの徴候を示してい
る患者の診断において重要であるばかりでなく、給血者
のスクリ−ニングにおいても殊更に重要である。ＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２型のレトロウイルスまたはこれら
の成分を検出システムに使用する場合、血清によって
は、血清を採取した患者に免疫不全の徴候が現われてい
るにも関わらず、抗体も検出できないかまたは感度が極
めて低い状態でしか検出できないことが今までに起きて
いる。本発明のＨＩＶグループのレトロウイルスを用い
ると、場合によってはかかる検出が可能である。

【０００９】ＨＩＶウイルスの遺伝子型の多様性は、特
に診断上大きな問題となっている。ＨＩＶ−１ウイルス
の場合、各複製サイクル毎にゲノム当り１個のヌクレオ
チドが変化すると推定されている。このような遺伝的変
異性があるため、ＨＩＶウイルスは、生体内選択圧力に
対して異常なほど柔軟に対応することが可能でありまた
生理活性物質に抵抗性を有するかまたはある程度の免疫
学的防御を構築している個体を攻撃することが出来る突
然変異体を生み出す能力を有するのである（Sharp et a
l., "Origins and diversity of human immunodeficie
ncy viruses",AIDS 1994, vol. 8, Suppl. 1; pp. 27-4
2)。

【００１０】特に輸血に関連するばかりでなく臓器提供
に関連した感染の蔓延を阻止するために、ＨＩＶウイル
ス感染を可能ならば１００％の確実性で確認できなけれ
ばならない。この理由によって、現在のところは幾つか
の地域に分布しているだけであるが、適切な予防措置を
講じなければ欧州およびアメリカ合衆国に容易に蔓延す
る可能性があるウイルスに起因する感染症を検出するこ
とが診断学上からも必要とされている。

【００１１】免疫不全の徴候を呈していたカメルーン出
身の２４歳の女性患者の末梢リンパ球から１９９４年に
単離された、以下ＭＶＰ−２９０１／９４と称する新規
のヒト免疫不全ウイルスの単離および特性について以下
に記述する。地理的観点からすれば、このレトロウイル
スは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスによる感染
が風土病となっている西アフリカと伝播しているのがほ
とんどすべてＨＩＶ−１である東アフリカとの間に位置
するアフリカのある地域を起源としている。従って、本
発明は、ＭＶＰ−２９０１／９４と呼ばれるＨＩＶサブ
タイプＯグル−プの新種レトロウイルスに関する診断方
法、そのために使用する試験キット及びワクチンに係わ
るのである。

【００１２】ＭＶＰ−２９０１／９４は、ＭＴ２細胞系
およびジャ−カット(Jurkat)細胞系内で増殖することが
出来る。ウイルス類の単離および増殖については、成書
「ＨＩＶ感染におけるウイルス数量化(Viral Quantitat
ion in HIV Infection）、ジャン＝マリ− アンドリュ
−（Jean-Marie Andrieu）編、ジョン・リビ−・ユウロ
テクスト（John Libbey Eurotext）、１９９１年」に記
載されている。該書に記載されている操作法を引用する
ことにより本出願における開示に代える。

【００１３】本発明のＭＶＰ−２９０１／９４とＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２レトロウイルスとの差をよりよく
理解出来るようにするため、免疫不全を惹起するレトロ
ウイルスの構造を先ず簡単に説明する。ウイルスの中心
には、ＲＮＡが円錐形のコア部の中に位置しており、該
コアはｐ２４（ｐはタンパク質の意）と称されるタンパ
ク質サブユニットから組立られている。この内側コア
は、タンパク質ｐ１７から構築されたタンパク質コ−ト
（外側コア）ならびに糖タンパク質外被によって囲にょ
うされており、該糖タンパク質外被は、宿主細胞由来の
脂質に加えて、膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１および外被
糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）を含んでいる。この
ｇｐ１２０が、次に宿主細胞のＣＤ−４受容体に結合す
る。

【００１４】公知の範囲では、ＨＩＶウイルス類のＲＮ
Ａは単純化して記述すると、下記する遺伝子領域を有し
ている：各端末に存在するいわゆる長い末端反復（ＬＴ
Ｒ）及び次の遺伝子領域：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよ
びｎｅｆ。ｇａｇ遺伝子は、とりわけ、コア蛋白質ｐ２
４およびｐ１７をコ−ドしており、ｐｏｌ遺伝子は逆転
写酵素、プロテアーゼ、ＲＮＡ分解酵素Ｈおよびインテ
グラーゼをコ−ドしておりまたｅｎｖ遺伝子はウイルス
外被の糖タンパク質ｇｐ４１およびｇｐ１２０をコード
している。ｎｅｆ遺伝子は、調節機能を有するタンパク
質をコードしている。ＨＩＶタイプのレトロウイルスの
ゲノムの構成を図１に概略図として示す。

【００１５】いわゆるＰＣＲ（ポリメラ−ゼ連鎖反応）
が、多様な利用可能性を持つ遺伝子操作法の一つとなっ
ており、この方法を実施するのに必要な構成成分は購入
可能である。この方法を用いれば、増幅するべき配列を
有するのいくつかのＤＮＡ領域が公知であれば、ＤＮＡ
配列を増幅することが可能である。そこで次には簡単に
言えば、増幅するべき核酸のある短い領域にアニ−ルす
る相補的ＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド＝プライマ
−）を合成しなければならない。試験を実施するには、
それらプライマ−とともに、ＨＩＶ核酸ならびにポリメ
ラ−ゼおよびヌクレオシド三燐酸類を含有する反応混合
物中に導入する。重合（ＤＮＡ合成）を所定時間実施
し、つぎに、核酸鎖を加熱により解離させる。冷却後
は、重合が再度進行する。それゆえ本発明のレトロウイ
ルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスである場合
は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスの既知の配列
の中に保存されているプライマ−を用いて核酸を増幅で
きるはずである。この種のいくつかのプライマ−が既に
記載されている（ｐｏｌ３およびｐｏｌ４については、
Laure et al., Lancet ii, (1988) 538-54 及びｓｋ３
８／３９、ｓｋ６８／６９については Ou C. Y. et a
l., Science 239 (1988) 295-297）。

【００１６】しかしながら、これらのプライマ−は、Ｈ
ＩＶ分離株ＭＶＰ−５１８０／９１からＤＮＡを増幅さ
せる能力はない（J. Vir., 1994, vol. 68, no. 3, pp.
1581-1585)。同様に、これらのプライマ−を使用して
も、ＭＶＰ−２９０１／９４分離株からＤＮＡを増幅さ
せることはできなかったのであるが、このことは、当該
分離株がＨＩＶ−１の共通配列から大幅に異なっている
という見解を支持するものである。従って、既知の配列
から誘導されかつ保存度を可能な限り高くした極めて多
様な新規プライマ−を構築すること並びに反応条件を変
えながらこのようなプライマ−を出来るだけ多くの組み
合わせで使用することが必要であった。驚くべきこと
に、実施例４に記載した反応条件において、ＭＶＰ−５
１８０／９１分離株の配列から誘導したプライマ−２１
２および４１２の組合せを用いて、ＭＶＰ−２９０１／
９４のＤＮＡを増幅することが可能であり、かくして該
分離株の配列についての最初の手掛かりを得ることがで
きることが見出されたのである。（配列識別番号１）５’ ３’ ２１２ＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣＴＡＴＧ（配列識別番号２）５’ ３’ ４１２ＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡこの場合におけるように、一旦ＨＩウイルスの配列の一
構成成分領域が解読さると、公知の標準的な分子生物学
的方法を用いて、そのウイルスのゲノム全体をクロ−ン
化し、配列決定することができる。

【００１７】１）このような配列決定は例えば、下記す
る方法でＤＮＡをクロ−ン化することにより達成でき
る：適当な量（およそ１リットル）の培養液からウイル
スを沈降させ、燐酸緩衝食塩水に再懸濁させる。次いで
これを、（２０％）スクロ−スクッションを通してペレ
ット化する。このウイルスペレットは、３０ｍＭジチオ
スレイト−ルと０．５％ノニデットＰ４０中に溶かした
６Ｍの塩化グアニジニウム溶液に懸濁させればよい。Ｃ
ｓＣｌを２モルの濃度まで加え、破砕されたウイルスを
含有する溶液を塩化セシウムクッションに載置する。次
いでこのウイルスＲＮＡを遠心分離によってペレット化
し、溶解させ、フェノ−ルで抽出し、エタノ−ルおよび
塩化リチウムで沈澱させる。第一のｃＤＮＡ鎖の合成
は、オリゴ（ｄＴ）プライマ−を用いてかかるウイルス
ＲＮＡまたはその部分上で行なう。逆転写酵素を加える
目的で行う合成は市販のキットを用いて実施出来る。第
二鎖の合成を行うためには、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ドのＲＮＡ鎖をＲＮＡ分解酵素Ｈで消化し、大腸菌由来
ＤＮＡポリメラ−ゼＩを用いて第二鎖を合成する。次
に、Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて平滑末端を生成さ
せ、これらの末端を適当なリンカ−に結合させて、制限
切断部位を生じさせればよい。適当な制限エンドヌクレ
ア−ゼを用いて制限消化を行った後、アガロ−スゲルか
らｃＤＮＡ断片を単離し、予め適当に切断しておいたベ
クタ−に連結させる。次いで、ｃＤＮＡ挿入片を含むベ
クタ−を用いて、受容能のある大腸菌を形質転換するこ
とができる。得られたコロニ−を次に膜に転写し、細胞
溶解し、変性させ、最後にジゴキシゲニンまたはビオチ
ンで標識した核酸とハイブリダイズさせることにより検
出する。相当するｃＤＮＡを遺伝子操作によって一旦調
製すると、レトロウイルスに由来する所望のＤＮＡ断片
を単離することが可能である。次にこれらの断片を適当
な発現ベクタ−に組み込めば、所望のタンパク質または
タンパク質断片を発現させ、診断試験に使用することが
可能となる。

【００１８】２）上記方法の代替法として、免疫不全ウ
イルスの核酸をＰＣＲ技術を用いてクロ−ン化すればよ
い。このようなクロ−ン化を行うには夫々の場合に、当
該配列の内の未知の領域からプライマ−を幾つか決定す
る必要があるのであって、かかるプライマ−は、当該配
列の内の既知部分から導かれたプライマ−と組み合わせ
て分離株のＤＮＡの増幅を行うこと可能ならしめるもの
である。

【００１９】３）既知配列のセグメントから出発してウ
イルスをクロ−ン化するもう一つの可能性は、ウイルス
のプロウイルスゲノムＤＮＡをクロ−ン化する方法であ
る。このためには、感染細胞系からのゲノムＤＮＡをま
ず標準的方法によって精製する。次いで宿主のゲノムに
組み込まれたプロウイルスＤＮＡは、ゲノムライブラリ
−の構築してスクリ−ンした後クロ−ン化すればよい。
このようなクロ−ン化を行うには、ゲノムＤＮＡを部分
的に断片化し、長さ約１０−２５ｋｂの断片を含有する
画分を単離し、この長さの断片を収容できるベクタ−
系、たとえばコスミドまたはラムダファ−ジ中にクロ−
ン化する。選択したベクタ−系を用いて、ゲノム断片の
混合物を大腸菌株に導入し、形質転換させる。次いでウ
イルスゲノムを含有するベクタ−は、探索したウイルス
のクロ−ン化ＤＮＡ断片とハイブリダイゼ−ションさせ
て同定し、その後に単離すればよいのであるが（プラ−
クスクリ−ニングまたはコロニ−スクリ−ニング）、前
記ＤＮＡ断片は放射能又は他の何らかの方法で標識して
おくのである。かくして、かかるウイルスゲノムは、配
列分析を行ない、次いで当該タンパク質を発現させるの
に利用可能となるわけである。

【００２０】異なるウイルス分離株の間の類似性は、核
酸またはタンパク質の配列の間の相同性の度合によって
表わすことができる。例えば、相同性５０％とは、配列
中の１００個のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置のう
ちの５０個が相互に一致することを意味するのである。
このようなタンパク質の相同性は、配列分析により求め
る。相同性のＤＮＡ配列も、ハイブリダイゼ−ション手
法により同定することが出来る。

【００２１】

【課題を解決するための手段】従って本発明は、欧州動
物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に第Ｖ９５０１
２６０１号として１９９５年１月２６日に寄託され、Ｍ
ＶＰ−２９０１／９４なる名称を有するレトロウイルス
に相当する形態学的および免疫学的性質を有するＨＩＶ
グル−プの新規な免疫不全ウイルスまたはこのウイルス
の変異株について、適した診断方法とそのために使用す
る試験キット及びワクチンに関わるものである。

【００２２】免疫不全ウイルスの本質的な形態学的およ
び免疫学的性質とは、該ウイルスの免疫学的特性化を行
う上で決定的に重要である構造を意味するものと解され
る。かかる意味で、感染者において抗体産生を増幅させ
かつウイルスを異なるサブクラスおよびサブタイプに分
類するのに適しているエピト−プが特に重要である。従
って、この意味において重要性を持つエピト−プはとり
わけ、ＨＩＶ−１グル−プおよび／またはＨＩＶ−２グ
ル−プのウイルスにも存在するエピト−プではなくむし
ろ本発明に係わる寄託ウイルスたるＭＶＰ−２９０１／
９４ウイルスという狭いグル−プに属するその変異株に
のみ存在するエピト−プである。ウイルスの形態学的お
よび免疫学的性質は、外被糖タンパク質の内の診断上該
当する領域にも反映されている。

【００２３】本発明は、寄託されている該ウイルス及び
ＲＮＡとの相同性がゲノム全体を基準として少なくとも
７５％であるＲＮＡ配列を有する免疫不全ウイルスにも
関わるものである。

【００２４】好ましい免疫不全ウイルスは、寄託されて
いる該ウイルスのＲＮＡとの相同性がゲノム全体を基準
として少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９
０％であるＲＮＡ配列を有する免疫不全ウイルスであ
る。ことのほか特に好ましい免疫不全ウイルスは、寄託
されている該ウイルスのＲＮＡとの相同性がゲノム全体
を基準として９２％又は９５％であるＤＮＡ配列を有す
る免疫不全ウイルスである。

【００２５】前記免疫不全ウイルスは、表１に記載した
ＤＮＡ配列に相補的でありかつ表１のかかる配列と相同
性が少なくとも７５％であるＲＮＡ配列を包含して有す
る。好ましい一つの実施態様においては、本発明に係わ
る免疫不全ウイルスは、表１のＤＮＡ配列に対して相補
的でありかつ表１のかかる配列との相同性が少なくとも
８５％であるＲＮＡ配列を包含して有するのである。こ
れに関して言えば、当該配列の相同部分は長さがヌクレ
オチドで少なくとも５０個であり、好ましい実施態様に
おいては、長さがヌクレオチドで少なくとも１００個で
ある。

【００２６】前記免疫不全ウイルスは、表１に記載した
配列に相補的であるか又はこの配列と相同性がある配列
または構成成分配列を有し、表１に示した配列との配列
差が、診断上該当する領域を基準としてヌクレオチドレ
ベルで高々２０％でありかつタンパク質レベルで２５％
である。

【００２７】好ましい一つの実施態様において、表１に
記載した配列との配列差が、診断上該当する領域を基準
としてヌクレオチドレベルで高々１０％でありかつタン
パク質レベルで１５％である。

【００２８】本発明はまた、欧州動物細胞培養コレクシ
ョン（ＥＣＡＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０１号と
して寄託されている免疫不全ウイルスＭＶＰ−２９０１
／９４、即ち本発明に関わるウイルスについて、そのＲ
ＮＡに対して相補的であるｃＤＮＡにも関する。

【００２９】かかる好ましい実施態様においては、かか
るＤＮＡは、組換えＤＮＡの形状である。

【００３０】本発明はまた、本発明に係わるｃＤＮＡま
たは組換えＤＮＡを用いて又はそのｃＤＮＡから演繹さ
れるアミノ酸構造を使用することをも包含する。

【００３１】好ましい一つの実施態様においては、本発
明において使用する特異的抗原は、第１表及び第 2表に
記載したアミノ酸配列またはその構成成分配列に相当す
るアミノ酸配列から成るポリペプチドである。

【００３２】該抗原は好ましくは、第１表及び第 2表に
記載したアミノ酸配列から選択された少なくとも１０
個、特に好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸から成
る構成成分配列を有するペプチドである。

【００３３】特に好ましい一実施態様においては、本発
明に係わる抗原は、アミノ酸配列ＮＱＱＬＬＮＬＷＧＣ
ＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮまたはその内の連続した少
なくとも１０個のアミノ酸から成るその構成成分配列の
ポリペプチドである。

【００３４】本発明に係わる抗原は、組換え手段によっ
て調製するのが好ましいが、合成法により、例えば固相
合成によって該抗原を調製することも可能である。

【００３５】本発明はまた、免疫不全症惹起ウイルスを
検出する診断方法に使用するための試験キットをも包含
する。

【００３６】該試験キットは、ウェスタンブロット、Ｅ
ＬＩＳＡ試験または蛍光抗体検出法に依拠するものであ
ればよい。これらの方法は、ウイルス核酸またはその特
定の領域を増幅させるものであり、ウイルス特にＨＩＶ
ウイルスの診断に対して極めて感度が高くかつ有効であ
ることが、最近明らかになっている。

【００３７】公知の検出法の一つとして、ポリメラ−ゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）法がある。この変法として、ＨＩＶ
感染の検出を行うために競争ポリメラ−ゼ連鎖反応も使
用することが出来る（例えば、AIDS (1993), 7, Suppl.
2; pp. 65-71)。

【００３８】特にＨＩＶ診断に関連して最近重要性の増
している他の検出法として、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基
づいた増幅）法がある。この方法は例えば、AIDS (199
3), 7( Suppl. 2): pp. 107-110に記載されている。こ
の方法においては、Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼを用いて一
本鎖ＲＮＡ又は他の場合二本鎖ＤＮＡを増幅し、次いで
検出を行うのである。

【００３９】ＨＩＶウイルスを検出する別の一方法は、
分枝ＤＮＡを用いたシグナル増幅によって検出する方法
である。これについては例えば、AIDS (1993), 7( Supp
l. 2): pp. 11-14に記載されている。この方法において
は、ウイルス核酸を、固相に結合させたプロ−ブにハイ
ブリダイズさせるのである。更には、検出分子（分枝Ｄ
ＮＡ構造）を前記プロ−ブとハイブリダイズさせ、次い
で酵素法により検出する。

【００４０】上記諸方法に共通する一つの特徴は、検出
すべきウイルスに特異的である明確に定義された核酸配
列を検出法に使用していることである。これらの検出法
の場合、明確に定義された短い核酸断片は、具体的には
ＤＮＡ断片であるが、これらを選択して、検出法に使用
するのである。

【００４１】本発明に関わる前記免疫不全ウイルス、本
発明に関わるｃＤＮＡおよび特異的抗原は、免疫不全症
を惹起するレトロウイルスの検出に使用出来る。

【００４２】前記特異的抗原は、前記免疫不全ウイルス
を抑制・阻害するためのワクチンの製造にも利用出来る
のであり、本発明はかかるワクチンをも包含する。

【００４３】本発明の範囲内において、診断のために特
に関連し、該当する外被糖タンパク質の一部の配列が決
定されたのである。かかる部分は、いわゆるＶ３ル−プ
の区域を包含するエンベロ−プ領域である；本発明の範
囲内において配列決定された領域は、いわゆるｇｐ４１
領域に及ぶものである。

【００４４】本発明の範囲内において、変異が最も高い
頻度で生起する外被糖タンパク質の一部が初めて配列決
定され、その結果この配列がＨＩＶタイプの他のウイル
スの対応する配列とは比較的低度の相同性しか示さな
ず、従って新規なレトロウイルスの亜型（ｓｕｂ−ｔｙ
ｐｅ）であることが確立された。デ−タベ−スを用いて
行なった各ＨＩＶ配列との比較により、とくにｇｐ４１
領域は、ヌクレオチドレベルで、高々７９．１％しか相
同でないことが示され、新規のレトロウイルスであるこ
とは明らかである。

【００４５】本発明に関わるウイルスの配列は、既知ウ
イルスのそれとは異なっている。従って本発明は、かか
るウイルス及びこれに対応するＤＮＡとアミノ酸配列に
関連するものであって、該アミノ酸配列は本発明のウイ
ルスの配列と実質的に一致するものであるが、その偏差
の程度は相同性の度合によって決まる。従って例えば、
８５％以上の相同性とは、１００個のヌクレオチドまた
はアミノ酸のうち少なくとも８５個が同じヌクレオチド
またはアミノ酸であって残余は異なっていてよいとされ
るような配列が包含されることを意味する。相同性を確
定するに際しては、二つの配列を相互に対応するヌクレ
オチドまたはアミノ酸が可能な限り多数相互に一致する
ように並列させ、比較するのである。

【００４６】単離された配列に基づいて、免疫優性エピ
ト−プ（ペプチド）を構造作成して、合成すればよい。
当該ウイルスの外被糖タンパク質ｇｐ４１の核酸配列が
既知となったので、当業者は、かかる配列からアミノ酸
配列を演繹可能である。このアミノ酸配列を表１に示
す。従って、本発明はまた、表１に記載した情報を用い
て調製できる特異的抗原、即ちタンパク質、オリゴペプ
チドまたはポリペプチドにも関する。これらの特異的抗
原、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチド
は、表１に示したアミノ酸配列を有する。かかる抗原ま
たはペプチドは、第１表に図示してあるアミノ酸配列の
内の比較的短い構成成分配列を有するものであってもよ
い。当業者にとって公知であるように、このようなアミ
ノ酸配列は、抗原決定基としては長さが少なくとも１０
個のアミノ酸であれば抗体産性のためには充分であり、
好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは２５個の
アミノ酸である。これらのペプチドは、組換え技術を利
用することに加えて合成法によっても調製すること出来
る。適合した調製ル−トはメリフィ−ルドタイプの固相
合成である。本方法及び現行の技術水準から公知である
他の方法については、詳細な記述は、文献、例えばボダ
ンスキ−ら（M. Bodansky et al.）、Peptide Synthes
is，John Wiley & Sons, 2nd Ed., 1976においてなされ
ている。

【００４７】診断試験においては、検査を受ける人から
採取した血清試料を、ＭＶＰ−２９０１／９４に由来す
る一種以上の蛋白質または糖タンパク質（真核細胞系で
発現可能である）の蛋白鎖またはそれらの部分を適宜の
支持体に固定して接触させればよい。好ましい試験法と
しては、免疫蛍光検査法または酵素免疫検査法（たとえ
ばＥＬＩＳＡおよび免疫ブロット）が挙げられる。

【００４８】酵素免疫検査法（ＥＬＩＳＡ）において
は、ＭＶＰ−２９０１／９４又はその変異体由来の抗原
を例えばマイクロタイタ−プレ−トの壁面に結合させれ
ばよい。これに関連して使用する使用量は、試験システ
ム及びマイクロタイタ−プレ−トの処理に本質的に依存
して異なる。検査を受ける人に由来する血清または血清
希釈液を次いでマイクロタイタ−プレ−トのウエルに加
える。所定のインキュベ−ション期間が経過した後、プ
レ−トを洗って、特異的免疫複合体をヒト免疫グロブリ
ンと特異的に結合する抗体で検出するのであるが、かか
る抗体は、例えば西洋わさびペルオキシダ−ゼ、アルカ
リホスファタ−ゼなどの酵素又は酵素で標識された抗原
に予め結合させておく。これらの酵素は、無色の基質を
高度に着色した生成物に変換させることが出来ので、特
異的抗ＨＩＶ抗体の存在を、その色の強度から判定する
ことが出来る。本発明に関わるウイルスを種々の試験系
に使用する上で可能性のある用途は、ウェスタンブロッ
トに使用する用途である。

【００４９】免疫不全ウイルスに対して常に特異的であ
るワクチンを調製することは、変異が高頻度に生起する
ため極めて困難であることが証明されつつあるとはい
え、本発明に関わる新規な免疫不全ウイルスについて
は、レトロウイルスワクチンのタ−ゲットとなるウイル
ス外皮糖タンパク質の塩基配列が同定されたために免疫
優性エピト−プおよび細胞性免疫誘導物質、または組換
え技術により特異的抗原が調製可能となり、ワクチンの
開発と製造にも充分使用することも出来るのである。

【００５０】

【実施例】実施例１（ウイルスの培養）本発明の免疫不全ウイルスＭＶＰ−２９０１／９４を、
免疫不全の徴候を示す女性患者の血液から単離した。こ
のような単離するために、末梢単核細胞（末梢血リンパ
球、ＰＢＬ）およびＨＩＶに感染していないドナ−の血
液の末梢リンパ球（ＰＢＬ）を、植物凝集素で刺激し、
培養させた。このためにウシ胎児血清を１０％含有する
慣用のＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。培養条件は、
Ａ．ランデイら（Landay A., et al. ）、J. Inf. Di
s., 161 (1990) pp. 706 - 710に記載されている。巨細
胞の形成は一切認められなかった。ＨＩウイルスの産生
は、アボット社から市販されている試験キットを用いて
ｐ２４抗原を測定することにより決定した。ウイルスの
増殖を決定するために用いた他の試験は、粒子結合逆転
写酵素を用いる試験（Everle J., Seibl R., J. Virol.
Methods 40, 1992, pp.347 - 356)であった。その結
果, ウイルス産生をモニタ−するために、週に１回また
は２回培養上澄み中の酵素活性に基づいて、ウイルスの
増殖を測定した。週に１回、新しいドナ−リンパ球を加
えた。

【００５１】ＨＩウイルスの増殖が一旦確立すると、Ｈ
ＩＶに感染していない健康なドナ−の血液から得た新鮮
な末梢リンパ球（ＰＢＬ）を、最初の培養液の上澄み液
で感染させる。この工程を繰り返し、次いでＭＴ２また
はジャ−カット（Jurkat）細胞を前記上澄み液で感染さ
せた。このようにして、免疫不全ウイルスを永続的に生
産することが可能であった。実施例２ＨＩＶ分離株ＭＶＰ−２９０１／９４のゲノムの一区画
（外被糖タンパク質ｇｐ４１をコ−ドする）のＤＮＡ単
離と増幅及び構造特性化ゲノムＤＮＡをＭＶＰ−２９０１／９４感染血液リンパ
球から標準的方法（Current Protocols in Molecular B
iology、Wiley International, 1994)を用いて単離し
た。

【００５２】ＭＶＰ−２９０１／９４単離株のゲノムの
種々の領域の特性を知るために、ｇｐ４１外被タンパク
質領域からのプライマ−対を幾つ用いてＰＣＲ（ポリメ
ラ−ゼ連鎖反応）実験を実施した。ＰＣＲ（Saik et a
l., Science 239: 487-491,1988) は、下記する修正を
加えて実施した：ＨＩＶに特異的なＤＮＡ領域を増幅す
るために、ＭＶＰ−２９０１／９４感染血液リンパ球か
ら得たゲノムＤＮＡ５μl （２００μｇ／ｍｌ）をピペ
ットを用いて、１００μl の反応混合物（０．２５ｍＭ
ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマ−、１０ｍＭトリス／
ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、０．００１％ゼラチン、２．５単位のＴａ
ｑポリメラ−ゼ（パ−キン・エルマ−社））に加え、次
の温度プログラムに従って増幅させた：１．初期変性：
９５℃で３分間、２．増幅：９４℃で９０秒間、５６℃
で６０秒間、７２℃で９０秒間（３０サイクル）。

【００５３】このようなＰＣＲおよびヌクレオチド配列
決定に用いたプライマ−は、バイオサ−チ（Biosearc
h）８７５０オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成
したもので、かかる次の配列を有するものであった：（配列識別番号３〜９）５’ ３’ ２１２ＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣＴＡＴＧ２１４ＴＴＴＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣ４１２ＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡ４２５ＴＣＧＧＴＡＣＧＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＴ４３１ＡＣＴＡＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＴＡＡＴＧＡ４３８ＡＡＣＴＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡ４４７ＡＧＴＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＧ文献に記載されているプライマ−を用いても（ｐｏｌ３
およびｐｏｌ４についの Laure et al., Lancet ii,
(1988) 538-541 及びｓｋ３８／３９、ｓｋ６８／６９
についての Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295
-297）前記単離株を増幅することが可能でなかったの
で、既知配列から導かれかつ可能な限り強度に保存され
ている広範な種類の新規プライマ−を構築し、反応条件
を変化させながら考え得る全ての組み合わせで使用し
た。驚くべきことに、単離株ＭＶＰ−５１８０／９１の
配列から導いたプライマ−２１２と４１２との組合せに
より、ＭＶＰ−２９０１／９４のＤＮＡを増幅させるこ
とが可能となり、かくしてこの分離株の配列について最
初の手掛かりが得られることが明かとなったのである。

【００５４】最初に増幅した試料の配列を決定した結
果、ＭＶＰ−２９０１／９４に特異的であるプライマ−
４２５および４３１を設計することが可能となった。か
くして既知となった領域をさらに拡大するために、新規
プライマ−を上記した基準に従って設計し、プライマ−
４２５またはプライマ−４３１と組合せて使用した。次
いでＭＶＰ−５１８０／９１から誘導したプライマ−２
１４を４２５と組合せて使用することにより、３’方向
の拡張が達成されまた５’方向の拡張は、４３１／４３
８および４３１／４４７の組合せを用いて達成したが、
プライマ−４３８および４４７は、殆どのＨＩＶ−１サ
ブタイプにおいて保存されている領域から導いたもので
ある。

【００５５】増幅したＤＮＡを、３％”Nusieve”アガ
ロ−スゲル（Biozyme社製）を用いて分画し、増幅され
た断片を切り出し、等量の緩衝液（１ｘＴＢＥ（０．０
９Ｍtris／瑙酸塩、０．００２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０) ）で処理した。このＤＮＡ／アガロ−ス混合物
を７０℃で１０分間インキュベートし、その後フェノー
ルで抽出したのち、１／１０容量の３ＭＮａＡｃ、ｐ
Ｈ５．５および２容量のエタノールを加えて、ＤＮＡを
水相から−２０℃にて１５分間沈澱させ、エッペンドル
フ遠心分離器でペレット化した（１３０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間）。ペレット化したＤＮＡを乾燥し、水に
とり、次いでベックマン分光光度計により２６０ｎｍで
測光してＤＮＡ濃度を定量した後、サンガー法(F. Sang
er, Proc.Natl. Acad., 74:5436, 1977) により配列を
決定した。クレノウＤＮＡポリメラ−ゼを用いて配列決
定する代わりに、アプライド・バイオシステムズ社製の
キット（"Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencin
g" 、注文番号４０１１５０）を用いて、配列決定反応
を行った。このＰＣＲに用いたプライマーの一つを夫々
の場合に個々の配列分析反応におけるプライマ−として
使用した（各場合とも１μＭ）。この配列決定反応は、
アプライド・バイオシステムズ社の３７３ＡＤＮＡシー
クエンサ−を用いてメーカーの指示に従って解析した。

【００５６】増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
及びそれから演竏されるアミノ酸配列を表１に示す（配
列識別番号１０）。表１ ############################################################ TCAGGTAATATCTTAGTGACCCTAAATTCTACTATAAACATGACCTGCGTGAGGCCAGGA 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+60 AGTCCATTATAGAATCACTGGGATTTAAGATGATATTTGTACTGGACGCACTCCGGTCCT S G N I L V T L N S T I N M T C V R P G AATAATCCAGTACAGGAGATAAGGATAGGTCCAATGGCTTGGTACAGTATGGGACTTGAG 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TTATTAGGTCATGTCCTCTATTCCTATCCAGGTTACCGAACCATGTCATACCCTGAACTC N N P V Q E I R I G P M A W Y S M G L E AGAGGGTATACAAATAAATCAAGAATAGCTTATTGTGCCTATAATGTCACAAAATGGAAA 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCTCCCATATGTTTATTTAGTTCTTATCGAATAACACGGATATTACAGTGTTTTACCTTT R G Y T N K S R I A Y C A Y N V T K W K GAAACCTTGCSSGGGATAGCTGAAAGGTATTTAGAACTTGTAAATTATTCAAGAAACATG 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CTTTGGAACGTTCCCTATCGACTTTCCATAAATCTTGAACATTTAATAAGTTCTTTGTAC E T L Q G I A E R Y L E L V N Y S R N M ACCATAACATTCAATAGCAGCATTGGTGGAGGAGATATAGAAGTAACCCGTTTGCATTTT 241---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TGGTATTGTAAGTTATCGTCGTAACCACCTCCTCTATATCTTCATTGGGCAAACGTAAAA T I T F N S S I G G G D I E V T R L H F AACTGTCATGGAGAATTCTTTTATTGTAACACAAGTCAAATGTTTAATTATACATTCAAA 301---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TTGACAGTACCTCTTAAGAAAATAACATTGTGTTCAGTTTACAAATTAATATGTAAGTTT N C H G E F F Y C N T S Q M F N Y T F K TGTAATAACTCCAAATGTAATACTCATAATGACAATAATACTTATGAGAACAGTACAAGA 361---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ACATTATTGAGGTTTACATTATGAGTATTACTGTTATTATGAATACTCTTGTCATGTTCT C N N S K C N T H N D N N T Y E N S T R ATAATATATTGCCAGTTGAGACAGGTAGTAAGGTCATGGATGAGGGGAGGGTCAGGGCTC 421---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TATTATATAACGGTCAACTCTGTCCATCATTCCAGTACCTACTCCCCTCCCAGTCCCGAG I I Y C O L R Q V V R S W M R G G S G L TATGCACCTCCTATCAGAGGTAATCTAACCTGCAATTCAAACATAACTGGATTGATTCTA 481---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ATACGTGGAGGATAGTCTCCATTAGATTGGACGTTAAGTTTGTATTGACCTAACTAAGAT Y A P P I R G N L T C N S N I T G L I L CAAATGGATACACCATATAATAAAAGCTCCAACATCACATTTAGACCAATAGGAGGAGAT 541---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTTTACCTATGTGGTATATTATTTTCGAGGTTGTAGTGTAAATCTGGTTATCTCTCTCTA C M D T P Y N K A A N I T F R P I G G D ATGAAGGATATATGGAGAACCCAAATGTAQCAATTACAAAGTAGTAAGGGTAAAATCTTTT 601---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TACTTCCTATATACCTCTTGGGTTTACATGTTAATGTTTCATCATTCCCATTTTAGAAAA M K D I W R T Q M Y N Y K V V R V K S F AGTGTAGCACCTACTAAGATTAGTAGACCAGTTATAGGCACTAACCATCAAAGAGAAAAA 661---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCACATCGTGGATGATTCTAATCATCTGGTCAATATCCGTGATTGGTAGTTTCTCTTTTT S V A P T K I S R P V I G T N H Q R E K AGGGCAGTAGGATTGGGAATGCTATTCTTGGGGGTTCTAAGTGCAGGTAGCAGCACTATG 721---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCCCGTCATCCTAACCCTTACGATAAGAACCCCCAAGATTCACGTCGTCCATCGTGATAC R A V G L G M L F L G V L S A A G S T M GGCGCAGCGGGAGTAACGCTGTCGGTACGAACCCACTCATTAATGAGGGGTATAGTGCAA 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CCGCGTCGCCCTCATTGCGACAGCCATGCTTGGGTGAGTAATTACTCCCCATATCACGTT G A A G V T L S V R T H S L M R G I V Q CAGCAGGACAACCTGCTGAGAGCAATACAGGCCCAGCAACATCTGCTGAGGTTATCTGTA 841---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTCGTCCTGTTGGACGACTCTCGTTATGTCCGGGTCGTTGTAGACGACTCCAATAGACAT Q Q D N L L R A I Q A Q Q H L L R L S V TGGGGTATTAGACAACTCCGAGCTCGCCTGCAAGCCTTAGAAACCCTTATGCAGAATCAG 901---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ACCCCATAATCTGTTGAGGCTCGAGCGGACGTTCGGAATCTTTGGGAATACGTCTTAGTC W G I R Q L R A R L Q A L E T L M Q N Q CAACTCCTAAACCTGTGGGGCTGTAAAGGAAAATTAATCTGCTACACATCAGTAAAATGG 961---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTTGAGGATTTGGACACCCCGACATTTCCTTTTAATTAGACGATGTGTAGTCATTTTACC Q L L N L W G C K G K L I C Y T S V K W AACGAAACATGGGGAGGAAATCTCTCAATTTGGGACAGCTTAACATGGCA 1021---------+---------+---------+---------+---------+1070 TTGCTTTGTACCCCTCCTTTAGAGAGTTAAACCCTGTCGAATTGTACCGT N E T W G G N L S I W D S L T W ########################################################## 実施例３単離株ＭＶＰ−２９０１／９４を他のＨＩＶ単離株から
識別する方法表１に示した、今回発見されたヌクレオチド配列につ
き、ＧＥＮＥＢＡＮＫデ−タベ−ス（Release 83, June
1994)及びＥＭＢＬデ−タベ−ス（Release 38March, 1
994)において相同配列があるか否かを検索し、又同時に
このヌクレオチドから演竏されるタンパク質配列につい
て、ＧＣＧコンピュ−タプログラム（Genetic Computer
Group, Inc. Wisconsin USA, version 7.1, March 199
2)を用いてＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質デ−タベ−ス
（Release 28, February 1994)で検索した。これらのデ
−タベ−スには、ヒト起源の免疫不全ウイルスおよび霊
長類からの分離株について１９９４年７月にて既知とな
っているヌクレオチド配列の大半が包含されている。

【００５７】表１のヌクレオチド配列は最善の場合で、
ＨＩＶ−１サブタイプＯの一つの分離株と７９．６％の
相同性を有しているのであるが、他のＨＩＶ−１サブタ
イプとの最善の相同性は５９．６％である。表１のＤＮ
Ａは、ＨＩＶ−２分離株との相同性がせいぜい５１．６
％である。

【００５８】表１のアミノ酸配列は最善の場合で、ＨＩ
Ｖ−１サブタイプＯの代表的な株の相応する外被タンパ
ク質区画との相同性が２．７％であり、またＨＩＶ−１
分離株ＨＩＶ−１−Ｍａｌとの相同性は最善の場合でも
５２．１％である。表１のアミノ酸配列は、ＨＩＶ−２
外被タンパク質（ＨＩＶ−２ＲＯＤ分離株）とは相同性
がせいぜい３７．０％である。

【００５９】表２相同性比較の結果に基づくと、ＭＶＰ−２９０１／９４
は、これまで暫定的にＨＩＶ−１サブタイプＯと称され
てきた２つの分離株ＭＶＰ−５１８０／９１およびＡＮ
Ｔ７０に極めて類似している。しかしながら、これら２
つの分離株に関しては、ヌクレオチドレベルで少なくと
も２０．９％またタンパク質レベルで少なくとも２７．
３％という比較的大きい配列異常が存在している。

【００６０】本発明は従って、組換え技術によりまたは
合成により調製可能でありかつ表１に記載した配列また
はその構成成分配列を有するペプチドに関する。なお前
記構成成分配列は、少なくとも１０個の連続したアミノ
酸、好ましくは少なくとも２０個また特に好ましくは少
なくとも２５個の連続したアミノ酸を有するものである
とする。

【００６１】本発明は従って、ウイルス、ＤＮＡ配列、
アミノ酸配列およびそれらの構成成分配列であって、表
１に記載された配列との相同性が、診断上該当する遺伝
子座を基準として少なくとも表３において％数値で表し
た割合だけ相違するような前記ウイルス、ＤＮＡ配列、
アミノ酸配列およびそれらの構成成分配列に関する。表３遺伝子座を基準とした相同性、タンパク質配列における
最大の差として表示。

【００６２】遺伝子座差好ましい差特に好ましい差ＥＮＶ２５％１５％１０％ＥＮＶ領域は、表１にヌクレオチド配列としてまたアミ
ノ酸配列として示した診断上該当する外被タンパク質領
域である。

【００６３】表３において％値で示した相同性数値は、
表１のタンパク質配列を他のウイルス由来の配列と比較
した場合、多くとも上記した百分率に相当する配列割合
のみが相違していることが許容されることを意味してい
る。実施例４ＭＶＰ−２９０１／９４に関する血清学的デ−タ本ウイルスが持つ血清学的診断法上の重要性を評価する
ために、２９０１に感染した患者に由来する血清試料を
市販の種々の抗ＨＩＶ−１／２スクリ−ニング試験器で
検査した。

【００６４】これらの検討の結果を表４に示す。

【００６５】表４表４から明らかなように、市販試験キットのいずれもこ
の試料を検出するこよはない。これとは逆に一つのアミ
ノ酸を除いて（ＮＱＱＬＬの代わりにＮＱＱＲＬ）２９
０１の配列に相当するペプチド（ＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣ
ＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮ）を固相抗原として使用し
またEnzygnost抗ＨＩＶ−１／２試薬を液体試薬として
使用する新らしいＥＬＩＳＡを用いると、かかる試料は
容易に検出される。例えばPasteur製などの市販のウェ
スタンブロット材は、このようなＭＶＰ−２９０１／９
４試料（図示していない）を検出することはない。従っ
て、このようなウエスタンブロット材は、ＭＶＰ−２９
０１／９４感染症に由来する資料については間違って陰
性の結果を与えることは極めて可能性が高いであろう。

【００６６】表１に記載したアミノ酸配列の内で特に好
ましい領域は、アミノ酸配列ＮＱＱＬＬ・・・から開始
する領域である（この領域は、表１において用いた配列
・数列法に従えば、ヌクレオチド番号１０１０のところ
から概略始まる）。

【００６７】実施例４の結果から、本発明に係わるかか
る開示を診断法に利用するために、アミノ酸配列に僅か
な変更を幾つか加えても、相応する試験が有する診断上
の関連性に有害な影響を及ぼすことはないことが明らか
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶタイプレトロウイルスのゲノムの構成を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/70 1/70 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (72)発明者シュテファン・ナップドイツ連邦共和国、35041 マルブルク、ベ−ルホイザ−・シュトラ−セ、６番 (72)発明者シュテファン・ブルストドイツ連邦共和国、35041 マルブルク、アム・バル、32ベ− (72)発明者ルッツ・ゲ−・ギュルトラ− ドイツ連邦共和国、81249 ミュンヒェン、トイフェルスベルクシュトラ−セ、15番 (72)発明者ヨ−ゼフ・エバ−レドイツ連邦共和国、85356 フライジンク、ゾンネンシュトラ−セ、７セ− (72)発明者ラザレ・カプチュ− カメル−ン国、ヤウンデ、ビーピ−1937 (72)発明者レオポルト・アヒェンギ・ツェケンクカメル−ン国、ヤウンデ、ビ−ピ−13162

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有
し、欧州動物細胞培養収集機関（ヨ−ロピアン・コレク
ション・オブ・アニマル・セル・カルチャ−ズ；ＥＣＡ
ＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０１号として寄託され
ているレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学
的性質を有する、ＨＩＶグル−プに属する免疫不全ウイ
ルスまたはＲＮＡの相同性が少なくとも７５％である該
ウイルスの変異体を抗原・抗体反応によって検出する診
断方法において、前記免疫不全ウイルスの外被糖タンパ
ク質ｇｐ４１をコ−ドする表１のＤＮＡ配列又はこの配
列との相同性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列から
演繹されるポリペプチドを特異的抗原として使用するこ
とを特徴とする、前記診断方法。
【請求項２】表１のアミノ酸配列またはその内の少
なくとも１０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的抗
原として使用することを特徴とする、請求項１に記載さ
れた診断方法。
【請求項３】表１のアミノ酸配列の内の少なくとも２
０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的抗原として使
用することを特徴とする、請求項１に記載された診断方
法。
【請求項４】アミノ酸配列がＮＱＱＬＬＮＬＷＧＣＫ
ＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮであるかまたはその配列の内
の少なくとも１０個の連続したアミノ酸から成るペプチ
ドを特異的抗原として使用することを特徴とする、請求
項１に記載された診断方法。
【請求項５】表１のＤＮＡ配列又はこの配列との相同
性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列を含んで成る発
現ベクタ−を含有するコンピ−テントセルを培養するこ
とによって得られる組換え型ペプチドを特異的抗原とし
て使用することを特徴とする、請求項２乃至４の内のい
ずれか一項に記載された診断方法。
【請求項６】合成によって調製されたペプチドを使用
することを特徴とする、請求項２乃至４の内のいずれか
一項に記載された診断方法。
【請求項７】請求項１乃至６の内のいずれか一項に記
載された診断方法のために使用する試験キット。
【請求項８】ウェスタンブロットを用いることを特徴
とする、請求項７に記載された試験キット。
【請求項９】ＥＬＩＳＡ試験または蛍光抗体検出試験
を用いることを特徴とする、請求項７に記載された試験
キット。
【請求項１０】ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有
し、欧州動物細胞培養収集機関（ヨ−ロピアン・コレク
ション・オブ・アニマル・セル・カルチャ−ズ；ＥＣＡ
ＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０１号として寄託され
ているレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学
的性質を有する、ＨＩＶグル−プに属する免疫不全ウイ
ルスまたはＲＮＡの相同性が少なくとも７５％である該
ウイルスの変異体を抑制・阻害するためのするワクチン
であって、抗原として前記免疫不全ウイルスの外被糖タ
ンパク質ｇｐ４１をコ−ドする表１のＤＮＡ配列又はこ
の配列との相同性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列
から演繹されるペプチドを特異的抗原として調製される
ことを特徴とする、前記ワクチン。
【請求項１１】表１のアミノ酸配列またはその内の
少なくとも１０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的
抗原として調製されることを特徴とする、請求項１０に
記載されたワクチン。
【請求項１２】表１のアミノ酸配列の内の少なくとも
２０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的抗原として
調製されることを特徴とする、請求項１０に記載された
ワクチン。
【請求項１３】ＮＱＱＬＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹ
ＴＳＶＫＷＮなるアミノ酸配列またはその配列の内の少
なくとも１０個の連続したアミノ酸配列から成るペプチ
ドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、請
求項１０に記載されたワクチン。
【請求項１４】表１のＤＮＡ配列又はこの配列との相
同性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列を含んで成る
発現ベクタ−を含有するコンピ−テントセルを培養する
ことによって得られる組換え型ペプチドを特異的抗原と
して調製されることを特徴とする、請求項１０に記載さ
れたワクチン。
【請求項１５】合成によって調製されたペプチドを特
異的抗原として調製されることを特徴とする、請求項１
０に記載されたワクチン。