KR100451312B1 - 그룹 오 에이취아이브이-1 바이러스에 기인하는 감염의 검출을 위한 생물학적 시험에 사용가능한 합성 펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 그룹 O HIV-1 바이러스에 기인하는 감염의 검출을 위한 생물학적 시험에 적용되는 합성 펩티드, 이를 제조하는 방법, 이러한 펩티드를 포함하는 조성물 및 키트, 및 이러한 펩티드를 사용한 생물학적 시험에 관한 것이다.
Description
그룹 O HIV-1 레트로바이러스는 종래에 알려져 있다. 유럽 특허 제 0,345,375 호 및 유럽 특허출원 제 0,657,532 호는 카메룬(Cameroonian) 환자로부터 분리한 ANT 70 및 ANT 70 NA 분리물을 기술하고 있다. 이들 문헌들은 항원, 세포용해물 또는 이들 분리물의 단백질을 함유하는 항원 조성물, 게놈 RNA에 해당되는 핵산, 이들 핵산을 사용한 하이브리드화 방법, 상기 지적된 분리물을 생산하는 방법 및 이들 레트로바이러스의 p12, p16, p25, gp41 및 gp120 단백질을 제조하는 방법을 보다 정확하게 기술하고 있다.
유럽특허출원 제 0,591,914 호는 MVP 5180/91 분리물을 기술하고 있다. 웨스턴 블로팅에 의해 확인되는 이 분리물은 앞에 언급한 분리물과 같이 오랜 기간 알려져 온 HIV-1 레트로바이러스 분리물과 관련하여 차이점을 나타내고 있다. 유럽특허출원 제 0,591,914 호는 MVP 5180/90 분리물의 DNA 서열을 정확하게 기술하고 있으며, gag, pol 및 env 유전자의 위치를 정확하게 지적하고 있다. 또한, 상기 유럽특허출원 제 0,591,914 호는 면역우성 영역(gp41) 뿐만아니라 V3 루프의 합성 펩티드를 기술하고 있다. 이들은 생물학적 시험, 특히 그룹 O HIV-1 항체의 시험관내 검출을 위해 유용하다.
유럽특허출원 제 0,673,948 호는 15개 내지 50개의 아미노산들(AA)로 구성된 합성 또는 재조합 펩티드를 기술하고 있는데, 이들은 다음의 서열로 구성되어 있다:
-VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR-
상기 서열에서 X는 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 나타낸다.
이들 펩티드는 소정의 그룹 O-HIV-1 레트로바이러스 분리물에 기인하는 감염의 검출을 위한 진단분야에서 유용하다.
유럽특허출원 제 0,727,483 호는 그룹 O HIV-1 패밀리에 속하는 레트로바이러스의 일부를 또한 형성하는 MVP 2901/94 분리물을 기술하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 출원은 잘 결정된 펩티드 서열을 갖는 일정 항원을 기술하고 있다. 이들 펩티드 서열은 상기 MVP 2901/94 분리물의 gp120 서열 일부 및 gp41 (면역우성 영역)의 일부에 해당한다.
국제특허출원 제 WO 96/12809 호는 그룹 O HIV-1 패밀리에 속하는 2개의 신규한 분리물을 기술하고 있다. 이들은 VAU 및 DUR 분리물이다. 이 출원은 전술한 2개의 바이러스로부터 유래한 일정 펩티드 서열을 기술하고 있는데, 이 서열은 HIV-1 VAU 또는 DUR 펩티드 서열을 인지하는 항체의 검출에 유용하다.
국제특허출원 제 WO 96/32293 호는 ANT 70 분리물의 서열에서 유래한 2개의항원을 기술하고 있다. 이들은 gp41의 면역우성 영역에서 MDL061 및 MDL056로 불리는 항원들이다. 본 발명에 따르면, 그룹 O HIV-1 바이러스에 의해 감염된 환자의 제한된 혈청 수집물의 샘플을 100% 검출하기 위해서는 상기 2개의 펩티드를 함유하는 조성물을 사용하는 것이 필요한데, 이는 각각 분리된 펩티드 그 자체로는 만족스러운 결과를 얻을 수 없기 때문이다.
실제, 그룹 O 바이러스의 분리물에 의해 보여지는 유전적 다양성의 관점에서, 동일 및 유일의 분리물로부터 유래한 항원의 사용으로 감염된 개체를 혈청학적으로 가려내는 것을 보장하는 것은 사실상 불가능하다. 이는 100% 감수성을 보장하는 시약을 얻는 것이 불가능함을 의미한다. 따라서, O 그룹은 첫째로 다음과 같은 주요문제를 일으킨다. 즉, 소정의 혈청학적 시약이 특히 다양성을 가진 그룹 또는 서브타입으로 감염된 개체를 인지할 수 없게 된다. 이는 정확하게 그룹 O HIV-1 바이러스의 경우이다.
또한, 국제특허출원 제 WO 96/40763 호는 O 그룹의 큰 다양성에 대해 강조하고 있다. 이 출원은 천연 HIV-1 타입 B 서열, 즉 약간의 변형물 (하나 또는 2개의 아미노산 대체)로 통합되는 펩티드를 기술하고 있다. 이 출원에 따르면, 이들 하이브리드 펩티드는 항-O 그룹 항체와 반응할 수 있다.
국제특허출원 제 WO 96/27013 호는 BCF 01, BCF 02, BCF 03, BCF 06, BCF 07, BCF 08, BCF 09, BCF 11, BCF 12, BCF 13 및 BCF 14로 명명되는 일련의 신규한 그룹 O HIV-1 바이러스와, ESS/BCF02, FAN/BCF01, LOB/BCF06, MAN/BCF07, NKO/BCF08, POC/BCF03, NAN/BCF11, BCF09, BCF12, BCF13 및 BCF14로 불리는, 대응하는 gp41 우성영역의 일련의 펩티드를 기술하고 있다. 수많은 이들 펩티드는 특히, BCF13 펩티드는 낮은 용해도 때문에 진단시 다루기가 어렵다.
본 발명은 그룹 O HIV-1 바이러스에 기인하는 감염의 검출을 위한 생물학적 시험에 사용가능한 합성 펩티드, 이를 제조하는 방법, 이러한 펩티드를 함유하는 조성물 및 키트, 및 이러한 펩티드를 사용한 생물학적 시험에 관한 것이다.
예기치 않게도, 본 발명자들은 일정 합성 펩티드들이 우수한 특성의 진단시약이며, 이들이 그룹 O HIV-1 레트로바이러스로 감염된 환자를 만족스럽게 가려낼 수 있음을 발견하였다. 이들 펩티드들은 그룹 O HIV-1 레트로바이러스의 분리물에 존재하는, 고도로 보존된 짧은 서열 근처에서 분절된 가변서열로 구성되어 있다. 본 발명의 펩티드는 일정 그룹 O HIV-1 분리물의 gp41(env)의 면역우성 에피토프를 운반하는 합성 펩티드에 의해 얻어지는 결과보다 우수한 결과를 얻을 수 있다.
이후에는, 아미노산의 명명을 위해 3개 문자의 명명법이 사용될 것이다.
본 발명의 합성 펩티드는 다음의 일반식 (Ⅰ)에 해당한다:
Δ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ω (Ⅰ)
상기 일반식에서, Δ는 비오티닐 기, 비오시티닐 기, 수소원자, 아세틸(CH3CO-)기, 1개 또는 2개의 티올, 알데히드 또는 아민 관능기를 함유할 수 있는 지방족 사슬, 탄소수 1 내지 6개의 알킬 사슬, 탄소수 2개 내지 6개의 알케닐 사슬, 또는 탄소수 2개 내지 6개의 아미노알킬카르보닐 사슬인 지방족 사슬이며;
Z는 다음의 일반식 (Ⅱ) 내지 (Ⅹ) 중 하나의 펩티드 서열을 나타내는데,
-Ξ1-Ser-Ξ2- (Ⅱ)
-Ser-Ξ2- (Ⅲ)
-Ξ1-Ser- (Ⅳ)
-Ξ1-Gln-Ξ2- (Ⅴ)
-Gln-Ξ2- (Ⅵ)
-Ξ1-Gln- (Ⅶ)
-Ξ1-Asn-Ξ2- (Ⅷ)
-Asn-Ξ2- (Ⅸ)
Ξ1-Asn- (Ⅹ)
여기서, -Ξ1은 0 내지 9개의 아미노산 펩티드 서열, -Ξ2는 0 내지 5개의 아미노산 펩티드 서열을 나타낸다;
-Θ는 다음 일반식 (ⅩⅠ)의 펩티드 서열을 나타내는데,
-(AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)- (ⅩⅠ)
여기서, (AA1), (AA2), (AA3), (AA4) 및 (AA5)는 -LysGlyLysLeuIle- 및 -LysGlyLysLeuVal- 펩티드서열을 함께 형성하지 않는다는 조건하에, (AA1)은 리신 잔기, 아르기닌 잔기 또는 오르니틴 잔기, (AA2)는 글리신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, (AA3)는 리신 잔기, 아르기닌 잔기 또는 오르니틴 잔기, (AA4)는 루신 잔기, 알라닌 잔기, 이소루신 잔기 또는 글루타민 잔기, (AA5)는 이소루신 잔기, 발린 잔기,루신 잔기, 트레오닌 잔기, 노르루신 잔기 또는 노르발린 잔기를 나타낸다;
-세린의 -CO-기에 부착된 Ω는,
-히드록시(-OH) 라디칼 또는 아미노(-NH2) 라디칼;
-탄소수 1개 내지 6개로 구성된 알콕시 라디칼;
-다음 일반식 (ⅩⅡ)의 펩티드 서열;
-Val-Σ-Ψ (ⅩⅡ)
여기서, Σ는 다음 일반식 (ⅩⅢ) 또는 일반식 (ⅩⅣ)의 서열을 나타내고,
-(AA6)-TrpAsn-(AA7)-(AA8) (ⅩⅢ)
-(AA6)-TrpHis-(AA7)-(AA8) (ⅩⅣ)
[(AA6)은 리신과 상이한 하나의 아미노산, (AA7)은 하나의 아미노산, (AA8)은 세린 또는 트레오닌 잔기를 나타냄],
유리 AA8아미노산의 CO 잔기에 부착된 Ψ는 OH 또는 NH2그룹, 또는 탄소수 1개 내지 6개로 구성된 알콕시 라디칼을 나타낸다;
- 다음 일반식 (ⅩⅤ)의 펩티드 서열;
-Val-Ψ (ⅩⅤ)
(여기서, 발린의 CO 잔기에 부착된 Ψ는 일반식 (ⅩⅡ)에서와 같은 의미임), 또는
- 다음 일반식 (ⅩⅥ) 내지 일반식 (ⅩⅧ) 중 하나의 펩티드 서열을 나타낸다;
-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ψ (ⅩⅥ)
Val-Σ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ (ⅩⅦ)
Val-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Ψ (ⅩⅧ)
여기서, Z 및 Θ는 일반식 (Ⅰ)에서의 정의와 같고, Σ은 일반식 (ⅩⅡ)에서의 정의와 같으며, 세린의 CO 잔기, AA8아미노산 CO 잔기 또는 발린 CO 잔기에 부착된 Ψ는 일반식 (ⅩⅡ)에서와 같은 의미이다.
Ω가 일반식 (ⅩⅥ) 내지 일반식 (ⅩⅧ) 중 하나의 펩티드 서열을 나타낼 때, 일반식 (Ⅰ)의 펩티드는 크기가 26 내지 66개 아미노산으로 가변하는 이량체가 된다. Ω가 일반식 (ⅩⅥ) 내지 일반식 (ⅩⅧ) 중 하나의 펩티드 서열을 나타내지 않을 때, 일반식 (Ⅰ)의 펩티드는 크기가 13 내지 33개 아미노산으로 가변하는 단량체이다.
본 발명에 따르는 펩티드는 선형이거나 시스테인간 이황화 다리에 의해 고리화된 형태일 수 있다.
일반식 (Ⅰ)의 화합물에서 (AA5)는 발린 잔기, 루신 잔기, 트레오닌 잔기가 바람직하며, Ω가 일반식 (ⅩⅡ)의 펩티드 서열에 해당될 때, (AA6)은 글루타민 또는 아르기닌 잔기를 나타낸다.
일반식 (Ⅰ)의 펩티드는 다음과 같은 것이 바람직하다:
-Δ는 비오티닐 라다칼, 수소원자, 하나 또는 2개의 티올, 알데히드 또는 아민 작용기를 포함하는 지방족 사슬, 탄소수 1 내지 6개의 알킬 사슬, 또는 탄소수 2개 내지 6개의 아미노알킬카르보닐 사슬인 지방족 사슬이며;
-Z는 일반식 (Ⅱ) 또는 일반식 (Ⅴ)의 펩티드 서열(여기서, Ξ1은 2개의 아미노산 펩티드 서열, Ξ2는 하나의 아미노산 서열을 나타냄), 일반식 (Ⅳ)의 서열(여기서, Ξ1은 3개의 아미노산을 나타냄), 또는 일반식 (Ⅷ)의 펩티드 서열(Ξ1은 9개, 8개, 또는 3개의 아미노산의 펩티드 서열, Ξ2는 5개의 아미노산 펩티드 서열을 나타냄)을 나타내고;
-Θ는 다음의 서열중 하나의 펩티드 서열이며;
-LysGlyArgLeuVal-
-ArgGlyLysAlaVal-
-ArgGlyArgLeuVal-, 또는
-ArgGlyArgAlaVal-
-Ω는 히드록시 기, 일반식 (ⅩⅤ)의 펩티드서열, 또는 일반식 (ⅩⅡ)의 펩티드 서열에 해당하는 하기 서열들 중의 하나를 나타낸다;
-ValArgTrpAsnGluThr-Ψ,
-ValGlnTrpAsnGluThr-Ψ, 또는
-ValGlnTrpAsnSerThr-Ψ.
한편, Z는 다음의 펩티드서열들 중 하나인 경우가 바람직하다:
-LeuLeuSerSer-
-LeuLeuAsnSer-
-LeuLeuGlnSer-
-ArgLeuAsnSer-
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnSer-
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAspLeu-
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnIle-
-LeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSer- 또는
-ArgAlaLeuGluThrLeuLeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSer-.
또한, 본 발명의 일부를 이루는 합성펩티드는 20개 내지 50개 아미노산으로 구성되어 있으며, 다음의 일반식 (Ⅰa)에 해당된다:
Δ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ωa(Ⅰa)
상기 식에서, Za는 다음의 일반식 (Ⅱa)내지 일반식 (Ⅹa)의 기를 나타내고;
-Ξ1a-Ser-Ξ2a- (Ⅱa)
-Ser-Ξ2a- (Ⅲa)
-Ξ1a-Ser- (Ⅳa)
-Ξ1a-Gln-Ξ2a- (Ⅴa)
-Gln-Ξ2a- (Ⅵa)
-Ξ1a-Gln- (Ⅶa)
-Ξ1a-Asn-Ξ2a- (Ⅷa)
-Asn-Ξ2a- (Ⅸa)
Ξ1a-Asn- (Ⅹa)
여기서, -Ξ1은 1 내지 5개의 아미노산 펩티드 서열, -Ξ2는 하나의 아미노산 을 나타내고;
-Ωa는 일반식 (Ⅰ)에 정의된 바와 같이 일반식 (ⅩⅡ)의 펩티드 서열 또는 다음의 일반식 (ⅩⅦa)의 펩티드 서열을 나타낸다;
Val-Σ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ (ⅩⅦa)
여기서, Za는 일반식 (Ⅰa)에서와 같은 의미이며, Δ,Θ,Σ 및 Ψ는 일반식 (Ⅰ)에서와 같은 의미이다.
하기 서열들 중(이들 서열은 상기 정의된 이량체형 또는 단량체형일 수 있음)의 하나를 포함하는 일반식 (Ⅰ) 또는 일반식 (Ⅰa)의 펩티드가 바람직하다. 이들 서열은 1문자 및 3문자 명명법에 따라 제시된다.
서열 번호 1
-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyLysAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 2
-LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 3
-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 4
-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnSerThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 5
-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST- 또는
-LeuLeuGlnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnSerThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 6
-LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuAsnSerTrpGlyCysArgGlyLysAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 7
-LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyArgAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 8
-LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysArgGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
서열 번호 9
-LLSSWGCKGRLVCYTS- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSer-
1 5 10 15
서열 번호 10
-LLNSWGCKGRLVCYTS- 또는
-LeuLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSer-
1 5 10 15
서열 번호 11
-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET- 또는
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnSerTrpGlyCysArgGly
1 5 10 15
ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr-
20 25 30
서열 번호 12
-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET- 또는
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnIleTrpGlyCysArgGly
1 5 10 15
ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr-
20 25 30
서열 번호 13
-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET- 또는
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAspLeuTrpGlyCysArgGly
1 5 10 15
ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr-
20 25 30
서열 번호 14
-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- 또는
-LeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerVal-
1 5 10 15 20
서열 번호 15
-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- 또는
-ArgAlaLeuGluThrLeuLeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSerTrpGlyCysLys
1 5 10 15
GlyArgLeuValCysTyrThrSerVal-
20 25
서열 번호 16
-RLNSWGCKGRLVCYTSV- 또는
-ArgLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerVal-
1 5 10 15
하기의 합성펩티드가 특히 바람직한 펩티드이다.
펩티드 번호 1(2B): 서열 1
-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyLysAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 2(3B): 서열 2
-LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 3(4B): 서열 3
-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 4(5B): 서열 4
-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnSerThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 5(6B): 서열 5
-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST- 또는
-LeuLeuGlnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnSerThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 6: 서열 6
-LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuAsnSerTrpGlyCysArgGlyLysAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 7: 서열 7
-LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyArgAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 8(7B): 서열 8
-LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysArgGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
펩티드 번호 9(12B): 서열 9
-LLSSWGCKGRLVCYTS- 또는
-LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSer-
1 5 10 15
펩티드 번호 10(14B): 서열 10
-LLNSWGCKGRLVCYTS- 또는
-LeuLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSer-
1 5 10 15
펩티드 번호 11(18B): 서열 11
-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET- 또는
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnSerTrpGlyCysArgGly
1 5 10 15
ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr-
20 25 30
펩티드 번호 12(19B): 서열 12
-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET- 또는
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnIleTrpGlyCysArgGly
1 5 10 15
ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr-
20 25 30
펩티드 번호 13(20B): 서열 13
-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET- 또는
-AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAspLeuTrpGlyCysArgGly
1 5 10 15
ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr-
20 25 30
펩티드 번호 14(21B): 서열 14
-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- 또는
-LeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerVal-
1 5 10 15 20
펩티드 번호 15(22B): 서열 15
-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- 또는
-ArgAlaLeuGluThrLeuLeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSerTrpGlyCysLys
1 5 10 15
GlyArgLeuValCysTyrThrSerVal-
20 25
펩티드 번호 16(23B): 서열 16
-RLNSWGCKGRLVCYTSV- 또는
-ArgLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerVal-
1 5 10 15
본 발명의 대상인 일반식 (Ⅰ)의 합성펩티드는 통상의 방법에 따른 고체상 합성에 의해 수득할 수 있다(R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963),85, pp.2149-2154; R.C. Sheppard, in "Peptides 1971", Nesvadba H.(ed.) North Holland, Amsterdam, pp. 111; E. Atherton and R.L. Sheppard, in "Solid phase peptide synthesis, a practical approach", IRL PRESS,(1989), Oxford University Press, pp. 25-34 참조). 자동합성기로서는 밀리포어(Millipore)의 "9050 플러스 펩 신디사이저(9050 Plus Pep Synthesizer)" 또는 이와 동등한 합성기를 사용할 수 있다.
합성을 위한 고상 지지체는 사용되는 기술 및 화학물질과 호환가능해야 한다. 예를 들어, 합성기 "9050 플러스 펩 신디사이저"에서의 합성의 경우 소위 "연속적인 플로우(continuous flow)"기술에 적합한 수지를 사용하는 것이 권장된다. PEG PS수지가 이러한 기준을 충족시킨다. 이들 지지체는 폴리스티렌 비드의 작용기와 제 1 아미노산 부착점 사이에 위치하는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 기초로 하는 암("스페이서")로 구성된다. 고착점의 특성은 선정된 C-말단 작용기에 따라 가변적이다. 본 발명의 경우, 다양한 PEG-PS 수지가 사용된다.
원료로서 사용되는 출발 수지와 아미노산은 구입가능한 제품이다(PerSeptive-Biosystem 또는 Neosystem).
펩티드 합성의 경우 하기의 측쇄 보호기가 사용된다:
아미노산
보호기
아르기닌 펜타메틸-2,2,4,6,7-디히드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf)
아스파라긴, 글루타민 트리틸(Trt)
시스테인 트리틸(Trt) 또는 아세트아미도메틸(Acm)
세린, 트레오닌, 티로신 t-부틸 에테르(tBu)
리신, 트립토판 t-부틸옥시카르보닐(Boc)
사용되는 아미노산의 α 위치에서의 1차 아민 관능기의 임시보호기는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 그룹이다. 탈보호는 디메틸포름아미드에 녹인 20% 피페리딘 용액으로 수행한다.
커플링을 위해 과량의 디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 사용하는 것이 바람직하다.
합성후, 수지는 유기용매(디메틸포름아미드, 후속하는 디클로로메탄)로 세척하고, 진공하에서 건조시킨후, 0℃로 냉각시키고 적정한 불순물제거제를 함유하는 트리플루오로아세트산(TFA) 기본 용액으로 처리한다. 예를 들어, 82%의 트리플루오로아세트산, 5%의 페놀, 5%의 물, 5%의 티오아니솔(thioanisole) 및 3%의 에탄디티올을 함유하는 K 시약이 사용될 수 있다.
상기 수지의 여과후, 합성 펩티드는 침전되고 에테르로 헹궈진다.
그런 다음, 합성펩티드를 역상 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고, 정제물을 질량분석법에 의해 결정한다. 고상으로서, 예를 들어, 본다팩 C-18 페이즈(Bondapak C-18 phase)를 사용할 수 있다. 펩티드는 2개의 완충용액 사이의 선형구배를 형성하여 용리되는데, 제 1 완충용액은 주로 수용액(예를 들어 물-TFA 0.1%)이며, 제 2 완충용액은 유기용액(예를 들어 60%의 아세토니트릴, 39.92%의 물 및 0.08% TFA를 함유하는 혼합물)이다. 수집된 순수 분획은 합쳐지고, 진공하에서 농축되고, 동결건조된다.
고리화를 위해, 정제된 합성 펩티드는 암모늄 아세테이트 용액(10mM)에 용해시킨다. pH는 1M 수산화 암모늄을 첨가하여 8.5로 조정한다. 상기 용액을 격렬하게교반시킨다. 고리화는 18시간후 완료된다. 그 다음, pH는 아세트산을 첨가하여 6으로 감소시킨다. 고리화된 펩티드는 동결건조된 후, 전술한 역상 액체 크로마토그래피에 의해 정제된다.
본 발명의 펩티드의 면역반응성은 그룹 O HIV-1 레트로바이러스로 감염된, 주로 카메룬 지방의 환자로부터의 혈청의 도움으로 평가되었다. 실시된 다양한 시험들은 본 발명의 펩티드가 단독으로 또는 조합(펩티드 조성물)으로 사용시 그룹 O HIV-1 레트로바이러스로 감염된 혈청을 100% 검출가능하게 하고 있음을 보이고 있다.
따라서, 본 발명의 합성 펩티드는 그룹 O HIV-1 레트로바이러스에 기인하는 감염을 선별하는 면역학적 시험에 적용될 수 있다. 또한, 일반식 (Ⅰ)의 여러 합성 펩티드의 조합을 사용할 수 있다. 또한, 일반식 (Ⅰ)의 2개 이상의 펩티드를 포함하는 조합은 본 발명의 일부를 구성한다. 펩티드 번호 1(2B) 및 펩티드 번호 3(4B)를 포함하는 조합이 바람직하다.
또한, 통상의 방법으로 수득할 수 있고, 전술한 서열, 예를 들어 유럽특허출원 제 0,591,914 호에 기술된 서열을 갖는 그룹 O HIV-1 재조합 펩티드(재조합 단백질)와 조합하여 본 발명의 일반식 (Ⅰ)의 합성 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 본 발명의 범위내이다.
또한, 본 발명의 합성 펩티드는 여러 특허된 또는 출원된 문헌에 기술된 펩티드 예를 들어, 유럽특허 제 0,387,914 호, 제 0,239,425 호, 제 0,220,273 호 또는 제 0,267,802 호에 기술된 펩티드와 같은 다른 HIV-2 및/또는 HIV-1 재조합 펩티드(재조합 단백질) 또는 합성 펩티드와 조합하여 사용될 수 있다. 상기 출원 또는 특허 리스트는 한정적인 것이 아니며, 예시로서 제시된 것이다.
하나 이상의 일반식 (Ⅰ)의 합성 펩티드 및 하나 이상의 HIV-1, 또는 HIV-2 재조합 펩티드 또는 합성펩티드를 함유하는 조성물은 다양한 HIV 레트로바이러스로 감염된 환자를 선별하기 위한 진단에 적용될 수 있다. 또한, 이들 조성물은 본 발명의 일부를 구성한다.
하나 이상의 일반식 (Ⅰ)의 합성 펩티드 단독, 또는 그룹 O HIV-1 재조합 펩티드, 또는 HIV-1, HIV-2, 또는 HIV-1 및 HIV-2 재조합 펩티드 또는 합성 펩티드를 조합하여 사용하는 면역분석방법 역시 본 발명의 일부를 구성한다.
또한, 본 발명은 면역 분석을 수행하기 위한 일반식 (Ⅰ)의 펩티드를 포함하는 키트, 또는 하나 이상의 일반식 (Ⅰ)의 펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
다음의 실시예들은 본 발명의 설명을 위한 것이며, 제한하기 위한 것이 아님을 밝혀 둔다.
실시예 1
본 발명에 따른 화합물의 제조: 펩티드 번호 2(3B)
-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET- 또는
-LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyLysAlaValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr-
1 5 10 15 20 22
상기 펩티드는 고상에서 합성되었다. Merrifield에 의해 1963년 개발된 기술은 아미노산의 관능기에 의해 제 1 아미노산을 폴리머 고체 지지체(수지)로 부착시키고, 상기 제 1 아미노산으로부터 펩티드 서열을 연장시키며, 수지에 고착된 상태로 상기 펩티드를 합성하는 것으로 구성되어 있다(J. Am. Chem. Soc. (1963)85, pp. 2149-2154 참조).
펩티드 번호 2를 합성하는 경우, 합성기로서 "9050 플러스 펩 신디사이저"가 사용되며, 수지로서는 수지 Fmoc Thr(OtBu)PEG PS가 사용되었다.
다양한 합성단계들이 하기의 표 1a 및 표 1b에 요약되어 있다.
| 아미노산 잔기 | NH2보호 | 측쇄보호 | 커플링 방법 | EQ수-커플링기간 |
| Glu | Fmoc | OtBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Asn | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Trp | Fmoc | Boc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Gln | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Val | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Ser | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Thr | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Tyr | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Cys | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Val | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Arg | Fmoc | Pbf | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Gly | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Arg | Fmoc | Pbf | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Cys | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Gly | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Trp | Fmoc | Boc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Ser | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 | |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-30분 |
합성 종료시, 상기 수지는 디메틸포름아미드로 세척하고, 그 다음 디클로로메탄으로 세척한 후, 진공하에서 건조시켰다.
다음으로, 상기 수지는 K 시약(82% 트리플루오로아세트산; 5% 페놀; 5% 물; 5% 티오아니솔; 3% 에탄디티올)으로 처리하였다. 그런 다음, 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켜 분리한 펩티드 번호 2(3B)를 동일한 용매로 헹궜다. 140 mg의 펩티드 번호 2(3B)를 수득하였다.
그런 다음, 역상 액체 크로마토그래피에 의해 펩티드 번호 2(3B)를 정제하였다. 고상으로, 본다팩 C-18 페이즈(Bondapak C-18)를 사용하였다. 펩티드는 2개의 완충용액 사이의 선형구배를 형성하여 용리되었는데, 제 1 완충용액은 주로 수용액(예를 들어 물-TFA 0.1%)이며, 제 2 완충용액은 유기용액(예를 들어 60%의 아세토니트릴, 39.92%의 물 및 0.08% TFA를 함유하는 혼합물)이다. 수집된 순수 분획은 합쳐지고, 진공하에서 농축되고, 동결건조되었다.
고리화를 위해, 수득되고 정제된 합성 펩티드를 암모늄 아세테이트 용액(10mM)에 용해시켰다. pH는 1M 수산화 암모늄을 첨가하여 8.5로 조정하였다. 상기 용액을 격렬하게 교반시켰다. 고리화는 18 시간 후 완료하였다. 그 다음, pH는 아세트산을 첨가하여 6으로 감소시켰다. 고리화된 펩티드는 동결건조된 후, 전술한 역상 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
본 발명에 따른 화합물의 제조: 펩티드 번호 15(22B)
본 펩티드는 수지로서 FmocPAL PEG-PS를 사용하는 것을 제외하고는 펩티드 번호 2(3B)와 같이 합성하였다.
다양한 합성단계들이 하기의 표 2에 요약되어 있다.
| 아미노산잔기 | NH2보호 | 측쇄보호 | 커플링 방법 | EQ수-커플링기간 |
| Val | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Ser | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Thr | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Tyr | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Cys | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Val | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Arg | Fmoc | Pbf | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Gly | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Lys | Fmoc | Boc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Cys | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Gly | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Trp | Fmoc | Boc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Ser | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Asn | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Arg | Fmoc | Pbf | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Gln | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Gln | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Asn | Fmoc | Trt | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Thr | Fmoc | tBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Glu | Fmoc | OtBu | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
| Leu | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Ala | Fmoc | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 | |
| Arg | Fmoc | Pbf | DIPCDI/HOBt | 5eq-45분 |
합성의 최종단계에서, 수지는 디메틸포름아마이드와 뒤이어서 디클로로메탄에 의해서 세척되고 진공상태에서 건조된다.
다음으로, 수지는 K시약(82%의 트리플루오로아세트산, 5%페놀, 5%물, 5%티오아니솔과 3%에탄디티올로 이루어짐)과 반응시킨다. 디에틸에테르에 의해 침전되어 분리된 펩타이드 7번(22B)은 같은 용매에 의해 린스된다. 140 mg의 펩타이드 15번(22B)가 수득된다.
그리고 나서, 펩타이드 15번(22B)는 역상 액체 크로마토그래피에 의하여 정화되고 나서 결정화되고 냉동 건조되고 펩타이드 2번(3B)에 대하여 상기에서 기재되어 있는 바와 같이 정화된다.
같은 방식으로 적당한 수지와 아미노산을 사용하여 본발명의 다른 화합물들이 합성된다.
표 3은 질량분광계로 평가된 비고리화 형태로서의 일반식 (Ⅰ)의 펩티드의 분자량을 나타낸다.
실시예2:
면역효소시험에 의한 펩티드의 면역활성의 평가: 시험1번
ESS, DUR, VAU, HAD로 사용되는 혈청들은 O HIV-1 종양바이러스로 감염된 프랑스 환자들로부터 얻어진 혈청들이다. O HIV-1 종양바이러스로 감염된 한자들로부터 얻은 다른 혈청들은 카메룬(Cameroon)에 있는 야운데 파스퇴르 센타(Yaunde Pasteur Centre)에 의해 획득되었으며 AIDS(1977), 11, pp445-456에 기재되어 있는 혈청학상의 연산방식에 의해 그룹 O로 혈청형이 결정되었다.
HIV-음성 혈청(n=48)은 건강한 지원자들로부터 얻어졌다.
사용된 합성펩티드는 1mg/ml농도(저장 용액)로 물에서 용해되었다. 고체상 감작 단계(코팅)를 위하여 각 펩티드(0.1M Carbonate 완충 용액으로 저장용액을 희석하여 얻은) 의 2㎍/ml용액의 110㎕가 마이크로티트르 플레이트 마이크로티털(microtitre plates MicrotiterTM(NUNC)의 각각에 추가된다. 실온에서 밤동안 배양한 후에 마이크로플레이트는 첫째로 0.1%의 트윈20(Tween20)과 0.001%의 염화 메티올레이트를 함유하는 pH7.4의 Tris-NaCl 완충용액으로 세척되고 그리고 나서 0.5% 레길레이트(RegilaitTM)(건조되고 얇은 막으로 덮여진 우유)를 함유하는 PBS용액으로 포화된다. 상기 포화용액을 빨아들인 후에, 플레이트는 50℃에서 10분간 가열된다.
혈청 샘플은 얇은 막으로 덮여진 우유 용액(0.01%페놀 레드, 0.25%클로로포름과 0.25%카톤"Kathon"으로 보충된 시트레이트 완충용액)로 1/5로 희석되고 플레이트의 웰"well"에 저장되어 40℃에서 30분간 배양된다.
0.1%의 트윈20(Tween20)과 0.001%의 염화 메티올레이트를 함유하는 pH7.4의 Tris-NaCl 완충용액으로 세척한 후에, 방부제로 0.01% 염화 메티올레이트를 함유하는 홀스레디쉬(horseradish) 과산화수소-표시된 항-인체 IgG과 IgM염소 항체로 이루어진 100㎕의 용액이 30%글리세롤과 25% 노르말 태아 송아지 혈청으로 보충된 시트레이트 완충용액에서 각 플레이트의 웰에 추가되어 40℃에서 30분간 배양된다.
0.1%의 트윈20(Tween20)과 0.001%의 염화 메티올레이트를 함유하는 pH7.4의 Tris-NaCl 완충용액으로 세척된 후에, 과산화수소 용액에서 O-페닐렌디아민 100㎕을 각각의 웰에 추가함으로써 색채가 개발되었다. 마이크로플레이트는 그리고나서 어두운 곳에서 실온에서 30분간 배양되었다. 색채반응은 4N황산 100㎕의 추가에 의해 멈추어 진다. 흡광도(A)가 490에서 620nm로 측정되었다.
각 웰에서 판독된 상대적 흡광도(A490-A620)가 각 펩티드의 면역활성에 비례한다. 흡광도는 시험이 실행되는 생물학상의 샘플과 반응하는 각 펩티드의 능력을 나타낸다. 컷-오프(cut-off) 값은 0.15와 동등한 흡광도로 결정된다. 그것은 음의 값(n=48)에 12표준편차를 더한 평균에 해당한다.
본 발명의 펩티드의 반응성은 (펩티드 번호3(4B), 펩티드 번호2(3B)와 펩티드 번호1(2B), 모두 고리형태로) 차례로 VAU 분리물(그룹 O HIV-1 레트로바이러스)의 껍질의 자연적 서열의 부분을 가지고 gp41의 면역적으로 우세한 항원결정기를 포함하는 두가지 합성펩티드의 반응성과 비교된다.
이 두가지 펩티드는 다음 서열을 가진다.
VAU 22 AA
LeuLeuAsnLeuTrpGlyCysLysAsnArgAlalleCysTyrThrSerValLysTrpAsnLysThr
1 5 10 15 20 22
VAU 35 AA
ArgLeuLeuAlaLeuGluThrPhelleGluGluAsnGluLeuLeuAsnLeuTrpGlyCysLysAsnArgAlalle
1 5 10 15 20 25
CysTyrThrSerValLysTrpAsnLysThr
30 35
연구를 위하여 이러한 펩티드들은 고리화된 형태로 사용되어진다. 이 연구의 결과는 표Ⅳ에 나타나 있다.
★혈청형/ 유전형
★★>=분광 광도계의 판독 능력보다 큰 신호
★혈청형/ 유전형
★★>=분광 광도계의 판독 능력보다 큰 신호
★★★아직 시험되지 않음
표Ⅳ의 결과는 펩티드 번호3(4B)가 다른 펩티드에서 주목되는 것과 관련하여 가장 뛰어난 실행을 함을 나타내는 것을 입증한다. 이 펩티드는 gp41의 면역적으로 우세한 항원결정기에 대응하여 VAU 분리물 서열의 부분을 가지는 두가지 펩티드와 비교하여 그룹 O HIV-1레트로바이러스에 의해 감염된 환자의 혈청을 가장 잘 구별되게 해 준다. 더욱이, 펩티드 번호2(3B)와 번호1(2B)는 같은수의 아미노산을 포함하는 VAU 22 AA보다 더욱 면역학적으로 반응성이 높다.
실시예3 :
본 발명에 의한 펩티드의 면역반응성의 면역효소학적 시험에 의한 평과
그룹 O HIV-1 레트로바이러스로 감염된 환자들로부터 얻은 혈청은 카메룬(Cameroon)에 있는 야운데 파스퇴르 센타(Yaounde Pasteur Centre)에 의해 획득되었으며, AIDS(1977), 11, pp445-456에 기재되어 있는 혈청학상의 연산방식에 의해 그룹 O로 혈청형이 결정되었다. 유전자형이 결정된 샘플은 미국의 메릴랜드(Maryland)로부터 얻었다. 이러한 샘플들은 다른 면역반응성 시험을 위하여 충분한 부피를 가지기 위하여 표Ⅴ에서 주어진 희석도로 음성 인체 혈청에서 미리 희석되었다.
사용된 합성 펩티드는 1mg/ml(저장 용액)의 농도로 물에 용해되었다. 고체상 감작 단계("코팅")를 위하여, 과정은 실시예 2에서 기재된바와 같이 실행된다.
혈청 샘플은 얇은 막으로 덮여진 우유 용액(0.01%페놀 레드, 0.25%클로로포름과 0.25%카톤"Kathon"으로 보충된 시트레이트 완충용액)으로 1/5로 희석되고, 플레이트의 웰에 저장되어 40℃에서 30분간 배양된다.
0.1%의 트윈20(Tween20)과 0.001%의 염화 메티올레이트를 함유하는 pH7.4의 Tris-NaCl 완충용액으로 세척된 후에, 방부제로 0.01% 염화 메티올레이트를 함유하는 홀스레디쉬(horseradish) 과산화수소-표시된 항-인체 IgG과 IgM염소 항체로 이루어진 100㎕의 용액이 30% 글리세롤과 25% 노르말 태아 송아지 혈청으로 보충된 시트레이트 완충용액에서 각 플레이트의 웰에 추가되어 40℃에서 30분간 배양된다.
0.1%의 트윈20(Tween20)과 0.001%의 염화 메티올레이트를 함유하는 pH7.4의 Tris-NaCl 완충용액으로 세척된 후에, 색채는 실시예2에 기재되어 있는 바와 같이 개발되었다.
각 웰에서 읽혀진 상대적 흡광도(OD)(A490-A620)가 각 펩티드의 면역반응성에 비례적이다. 흡광도는 시험이 실행되는 생물학상의 샘플과 반응하는 각 펩티드의 능력을 나타낸다.
본 발명의 펩티드의 반응성은 (펩티드 번호10(14B), 펩티드 번호11(18B)와 펩티드 번호12(19B), 펩티드 번호14(21B), 펩티드 번호15(22B), 펩티드 번호16(23B) 모두 고리형태로) 차례로 그룹 O HIV-1 레트로바이러스의 껍질의 자연적 서열의 일부를 가지는 세가지 일치하는 합성펩티드의 반응성과 비교된다.
이러한 펩티드들은 펩티드 VAU 22 AA 와 펩티드 VAU 35 AA인 VAU isolate 와 펩티드 MVP 5180(P45에서 "MVP 5180"으로 표시된)로부터 얻어낸 두가지 펩티드들이다. 펩티드 VAU 22 AA 와 펩티드 VAU 35 AA( 상기 구조는 실시예2에 나타나 있음)와 펩티드 MVP 5180은 gp41의 면역학적으로 우세한 항원결정기를 포함한다.
모든 이러한 펩티드들은 고리화된 형태로 사용되며 MVP 5180 펩티드의 서열은 다음과 같다.
MVP 5180
ArgLeuGlnAlaLeuGluThrLeulleGlnAsnGlnGlnArgLeuAsnLeuTrpGlyCysLysGlyLysLeulle
1 5 10 15 20 25
CysTyrThrSerValLysTrpAsnThrSer
30 35
연구의 결과는 표Ⅴ에 나타나 있다.
고체상★: 펩티드 2㎕/㎖
시험된 각 펩티드에 대해서, A492-A620의 파장에서 읽혀지는 상대적 흡광도의 다양한 수준에 대응하여 샘플들이 네가지 클라스로(a, b, c와 d) 정리된다.
-a : OD〈0.100,
-b : 0.100〈OD〈0.500,
-c : 0.500〈OD〈1.000,
-d : OD〉1.000,
따라서 펩티드들의 면역반응성의 정도를 평가하는 것이 가능하게 된다. 가장 면역반응성이 높은 펩티드들에 대해서 가장 높은 흡광계수에 해당하는 클라스에서 발견되는 가장 높은 수의 샘플들이 발견된다.
결과를 표 Ⅵ에 나타내었다.
고체상★: 펩티드 2㎕/㎖
결과는 시험된 본 발명의 모든 펩티드들이 자연적 분리물(MVP 5180, VAU)로부터 얻어진 종래기술의 펩티드들보다 면역반응성에서 더 나은 결과를 얻는다는 것을 보여준다. 본 발명의 펩티드들, 번호 15(22B), 번호 14(21B), 및 번호 16(23B)가 가장 면역반응이 높은 것으로 발견되었다.
실시예4 :
면역효소학적 시험에 의한 본 발명의 펩티드를 함유하는 조성물의 면역반응성 평가
본 시험을 위한 과정은 실시예 2에 기재되어 있는 방법으로 실행하였다. 사용된 마이크로플레이트는 고리화된 펩티드 번호 1(2B), 또는 고리화된 펩티드 번호 3(4B), 또는 상기 두개의 펩티드(1:1 w/w)를 포함하는 조성물로 감작된다. 각 웰에는 2 ㎕/㎖의 펩티드 번호 1(2B)를 함유하는 100 ㎕의 용액, 또는 2 ㎕/㎖의 펩티드 번호 3(4B)를 함유하는 100 ㎕의 용액, 또는 1 ㎕/㎖의 펩티드 번호 1(2B)와 펩티드 번호 3(4B)를 함유하는 100 ㎕의 용액이 들어있다.
이 시험의 결과는 표Ⅶ에 나타나 있다.
★★>=분광 광도계의 판독 능력 보다 큰 신호
★★>=분광 광도계의 판독 능력 보다 큰 신호
표 Ⅶ의 결과는 본 발명의 펩티드 조성물이 진단용으로 사용될 경우 그룹 O HIV-1 레트로바이러스에 의해 감염된 환자들의 모든 혈청을 검출할 수 있음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> BIO-RAD PASTEUR <120> Synthetic peptides which can be used in biological tests for the detection of infections due to group O HIV-1 viruses <130> BET 99/0876 <140> KR 7009296/1999 <141> 1998-04-06 <150> FR 97/04356 <151> 1997-04-09 <150> FR 98/02212 <151> 1998-02-24 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 1 Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Glu Thr 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 2 Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Glu Thr 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <400> 3 Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Glu Thr 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 4 Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Ser Thr 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 5 Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Ser Thr 20 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 6 Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Glu Thr 20 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 7 Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Glu Thr 20 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 8 Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val Gln Trp Asn Glu Thr 20 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 9 Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 10 Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 11 Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 20 25 30 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 12 Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 20 25 30 <210> 13 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 13 Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 20 25 30 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 14 Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu 1 5 10 15 Val Cys Tyr Thr Ser Val 20 <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 15 Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp 1 5 10 15 Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val 20 25 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> peptide <400> 16 Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Val 8
Claims (24)
- 일반식 (I)에 해당하는, 선형이거나 또는 시스테인간 이황화 다리에 의해 고리화된 형태의 합성 펩티드.Δ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ω (Ⅰ)[상기 일반식 (I)에서,- Δ는 비오티닐 라디칼, 비오시티닐 라디칼, 수소 원자, 아세틸(CH3CO-) 라디칼, 1개 또는 2개의 티올을 함유할 수 있는 지방족 사슬, 알데히드 작용기 및 아민 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되며,- Z는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 서열이고:LeuLeuSerSerLeuLeuAsnSerArgLeuAsnSerAlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnSerAlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAspLeuAlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnIleLeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSer, 및ArgAlaLeuGluThrLeuLeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSer;- Θ는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티트 서열이며:ArgGlyArgLeuIleArgGlyArgLeuValArgGlyLysLeuIleArgGlyLysLeuValLysGlyArgLeuIleLysGlyArgLeuVal- 세린의 -CO-기에 부착된 Ω는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:히드록시기 및하기의 식을 갖는 펩티드 서열Val-ΨValArgTrpAsnGluThr-Ψ,ValGlnTrpAsnGluThr-Ψ, 및ValGlnTrpAsnSerThr-Ψ,(상기 식에서, 발린 또는 트레오닌의 -CO- 잔기에 부착된 Ψ는 OH기, NH2기, 1개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된다)
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- 제 1 항에 있어서,상기 Δ는 1개 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 사슬, 2개 내지 6개의 탄소 원자의 알케닐 사슬, 및 2개 내지 6개의 탄소 원자의 아미노알킬카르보닐 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방족 사슬인 것을 특징으로 하는 일반식 (I)의 합성 펩티드.
- 제 1 항에 있어서,다음 서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 일반식 (Ⅰ)의 합성 펩티드.서열 번호 2LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET 또는LeuLeuSerLeuTrpGlyCysArgGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr1 5 10 15 20 22서열 번호 3LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET 또는LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr1 5 10 15 20 22서열 번호 4LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST 또는LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnSerThr1 5 10 15 20 22서열 번호 5LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST 또는LeuLeuGlnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnSerThr1 5 10 15 20 22서열 번호 8LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET 또는LeuLeuSerSerTrpGlyCysArgGlyArgLeuValCysTyrThrSerValGlnTrpAsnGluThr1 5 10 15 20 22서열 번호 9LLSSWGCKGRLVCYTS 또는LeuLeuSerSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSer1 5 10 15서열 번호 10LLNSWGCKGRLVCYTS 또는LeuLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSer1 5 10 15서열 번호 11ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET 또는AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnSerTrpGlyCysArgGly1 5 10 15ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr20 25 30서열 번호 12ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET 또는AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAsnIleTrpGlyCysArgGly1 5 10 15ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr20 25 30서열 번호 13ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET 또는AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuAspLeuTrpGlyCysArgGly1 5 10 15ArgLeuValCysTyrThrSerValArgTrpAsnGluThr20 25 30서열 번호 14LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV 또는LeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerVal1 5 10 15 20서열 번호 15RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV 또는ArgAlaLeuGluThrLeuLeuAsnGlnGlnArgLeuLeuAsnSerTrpGlyCysLys1 5 10 15GlyArgLeuValCysTyrThrSerVal20 25서열 번호 16RLNSWGCKGRLVCYTSV 또는ArgLeuAsnSerTrpGlyCysLysGlyArgLeuValCysTyrThrSerVal1 5 10 15
- 제 1 항의 일반식(I)의 하나 이상의 합성 펩티드를 함유하는 조성물로서, 상기 펩티드는 동결-건조되거나 또는 물로 희석되어 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 17 항에 있어서,일반식 (I), 서열 번호 3, 및 서열 번호 1 중 하나 이상의 합성 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항의 일반식 (I)의 하나 이상의 합성 펩티드와 하나 이상의 그룹 O HIV-1 재조합 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항의 일반식 (I)의 하나 이상의 합성 펩티드와 하나 이상의 HIV-1, HIV-2, 또는 HIV-1 및 HIV-2 재조합 또는 합성 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 그룹 O HIV-1 감염을 검출하는 면역분석 방법으로서,a) 항-그룹 O HIV-1 항체를 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 시료를 취하는 단계;b) 검출가능하게 표시된 제 1 항의 일반식 (I)의 하나 이상의 합성 펩티드를 상기 시료와 접촉시키는 단계;c) 상기 펩티드와 상기 항체 사이의 복합체의 존재 여부를 검출하는 단계; 및d) 선택적으로 시료내의 상기 항체의 양을 분석하는 단계(여기서, 상기 펩티드와 상기 항체 사이의 복합체의 존재는 그룹 O HIV-1 감염을 나타냄)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 그룹 O HIV-1 감염을 검출하는 면역분석 방법으로서,a) 항-그룹 O HIV-1 항체를 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 시료를 취하는 단계;b) 검출가능하게 표시된 제 17 항의 일반식 (I)의 하나 이상의 합성 펩티드를 상기 시료와 접촉시키는 단계;c) 상기 펩티드와 상기 항체 사이의 복합체의 존재 여부를 검출하는 단계; 및d) 선택적으로 시료내의 상기 항체의 양을 분석하는 단계(여기서, 상기 펩티드와 상기 항체 사이의 복합체의 존재는 그룹 O HIV-1 감염을 나타냄)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 그룹 O HIV-1 특이성 항체를 검출하는 진단 키트(diagnostic kit)로서,a) 제 1 항의 일반식 (I)의 하나 이상의 합성 펩티드를 포함하는 제1 용기(first container), 및b) 상기 항체와 상기 펩티드 사이의 복합체를 검출하는 적당한 수단을 포함하는 제2 용기(second container)를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
- 그룹 O HIV-1 특이성 항체를 검출하는 진단 키트로서,a) 제 17 항의 일반식 (I)의 하나 이상의 합성 펩티드를 포함하는 제1 용기, 및b) 상기 항체와 상기 펩티드 사이의 복합체를 검출하는 적당한 수단을 포함하는 제2 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
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