BR9809078B1 - peptìdeo sintético utilizáveis nos testes biológicos para a detecção das infecções devido aos vìrus hiv1 do grupo o, composição que os compreende, processo de imunodosagem in vitro e kit de diagnóstico. - Google Patents
peptìdeo sintético utilizáveis nos testes biológicos para a detecção das infecções devido aos vìrus hiv1 do grupo o, composição que os compreende, processo de imunodosagem in vitro e kit de diagnóstico. Download PDFInfo
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO SINTÉTICO UTILIZÁVEIS NOS TESTES BIOLÓGICOS PARA A DETEC- ÇÃO DAS INFECÇÕES DEVIDO AOS VÍRUS HIV1 DO GRUPO O, COM- POSIÇÃO QUE OS COMPREENDE, PROCESSO DE IMUNODOSAGEM IN VITRO E KIT DE DIAGNÓSTICO".
A invenção refere-se aos peptídeos sintéticos utilizáveis nos tes- tes biológicos para a detecção das infecções devido aos vírus HIV-1 do grupo O, seu processo de preparo, das composições e dos feixes contendo esses peptídeos, assim conforme os testes biológicos que utilizam esses peptídeos. Retrovírus HIV-1 do grupo O são conhecidos na técnica anterior.
A patente EP O 345 375 e o pedido de patente EP O 657 532 descrevem os isolados ANT 70 e ANT 70 NA isolados em doentes do Cameuroun. Esses documentos descrevem mais precisamente antígenos e composições anti- gênicas contendo Iisatos ou proteínas desses isolados, os ácidos nucléicos correspondentes ao RNA genômico, métodos de hibridação que utilizam es- ses ácidos nucléicos, métodos de produtos dos isolados denominados aci- ma, assim conforme processos de preparo de proteínas p12, p16, p25, gp41, gp120 desses retrovírus.
O pedido EP 0 591 914 descreve o isolado MVP 5180/91. Esse isolado caracterizado por Western Blot apresenta, como o isolado preceden- te, diferenças em relação aos isolados do retrovírus HIV-1 conhecidos há muito tempo. O pedido EP 0 591 914 descreve precisamente a seqüência de DNA do isolado MVP 5180/91 e indica precisamente a localização dos genes gag, pol e env. O pedido EP 0 591 914 descreve ainda peptídeos sintéticos do circuito V3, assim como da região imunodominante (gp41). Estes são Ci- teis para testes biológicos, notadamente para a detecção, in vitro, dos anti- corpos HIV-1 do grupo O.
O pedido EP 0 673 948 descreve peptídeos sintéticos ou recombi- nados constituídos de 15 a 50 ácidos aminados (AA) e comportando a seqüência -VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR, na qual X representa seja um resíduo de cisteína, seja um resíduo de serina. Esses peptídeos são úteis no domínio diagnóstico para a detecção das infecções devido a certos isolados de retrovírus HIV-1 do grupo O.
Conhece-se igualmente o pedido EP 0 727 483 que descreve o isolado MVP 2901/94 que faz também parte dos retrovírus pertencentes à família HIV-1 do grupo O. Esse pedido descreve certos antígenos com se- qüências peptídicas bem determinadas. Essas seqüências peptídicas cor- respondem a uma parte da seqüência da gp120 e a uma parte da gp41 (região imunodominante) do isolado MVP 2901/94.
O pedido WO 96/12809 descreve dois novos isolados perten- centes à família HIV-1 do grupo O. Trata-se dos isolados VAU e DUR. Esse pedido descreve certas seqüências peptídicas oriundas dos dois vírus cita- dos acima úteis para a detecção de anticorpos reconhecendo as seqüências peptídicas HIV-1 VUA ou DUR.
O pedido WO 96/32293 descreve dois antígenos oriundos da seqüência do isolado ANT 70. Trata-se do antígeno denominado MDL061 e do antígeno MDL056, da região imunodominante da gp41. De acordo com essa invenção, para detectar 100% das amostras de uma coleção limitada de soros de doentes infectados pelo vírus HIV-1 do grupo O, é necessário utilizar composições contendo esses dois peptídeos, já que cada peptídeo isolado não permite que ele sozinho obtenha resultados satisfatórios. Com efeito, é quase impossível, observando-se a variabilidade
genética revelada pelos isolados do vírus do grupo O, garantir o despista- mento sorológico dos indivíduos contaminados pelo uso de antígenos oriun- dos do mesmo e único isolado. Isto significa que não é possível obter rea- gentes que garantam 100% de sensibilidade. O grupo O assim destaca pela primeira vez um problema importante; trata-se da inadequação de certos reagentes sorológicos a serem reconhecidos dos indivíduos contaminados por grupos ou subtipos particularmente divergentes. É exatamente o caso dos HIV1 do grupo O.
O pedido WO 96/40763 insiste também na grande divergência do grupo O. Esse pedido descreve peptídeos que incorporam, em uma se- qüência natural HIV-1 de tipo N, algumas pequenas modificações (substi- tuição de um ou de dois ácidos aminados). De acordo com esse pedido, es- ses peptídeos híbridos são capazes de reagir com anticorpos antigrupo O.
O pedido WO 96/27013 descreve uma série de novos vírus HIV1 do grupo O designados BCF 01, BCF 02, BCF 03, BCF 06, BCF 07, BCF 08, BCF 09, BCF 11, BCF 12, BCF 13 e BCF 14, assim como um série de peptídeos da região dominante da gp41 correspondente denominados ESS/BCF 02, FAN/BCF 01, LOB/BCF 06, MAN/BCF 07, NKO/BCF 08, POC/BCF 03, NAN/BCF 11, BCF 09, BCF 12, BCF 13 e BCF 14. Um certo número desses peptídeos são pouco manejáveis em diagnóstico por causa da pouca solubilidade, notadamente o peptídeo BCF13. De maneira inesperada, foi então constatado que certos peptí-
deos sintéticos são reagentes diagnósticos de qualidade superior e permi- tem despistar de maneira satisfatória os doentes infectados pelos retrovírus HIV-1 do grupo O. Esses peptídeos são compostos de seqüências variáveis articuladas em torno de curtas seqüências muito conservadas, presentes nos isolados dos retrovírus HIV-1 do grupo O. Os peptídeos da invenção permitem obter resultados bem superiores àqueles conseguidos com peptí- deos sintéticos portadores de epitopos imunodominantes da gp41 (env) de certos isolados VIH-1 do grupo O.
Na seqüência, para denominar os ácidos aminados, utilizar-se-á nomenclatura com três letras.
Os peptídeos sintéticos da invenção correspondem à fórmula
geral (l):
A-Z-TrpGIyCys-Q-CysTyrThrSerQ (I)
na qual:
- Δ representa um radical biotinila, um radical biocitinila, um
átomo de hidrogênio, um radical acetila (CH3CO-), uma cadeia alifática po- dendo conter uma ou duas funções tio!, aldeído ou amina, a cadeia alifática sendo, de preferência, uma cadeia alquila de 1 a 6 átomos de carbono ou uma cadeia alcenila de 2 a 6 átomos de carbono, ou uma cadeia aminoal- quilcarbonila de 2 a 6 átomos de carbono,
- Z representa uma seqüência peptídica de uma das fórmulas (II)
a (X): S1-Ser-E2- (II) Ser-E2- (III) ΐ-ι-Ser- (IV) E1-Gln-E2- (V) -GIn-E2- (VI) -E1-GIn- (VII) -E1-Asn-E2- (VIII) -Asn-E2- (IX) -E1-Asn- (X)
nas quais:
- E1 representa uma seqüência peptídica de O a 9 ácidos amina-
dos
e
- E2 representa uma seqüência peptídica de 0 a 5 ácidos amina-
dos;
-Θ representa uma seqüência peptídica de fórmula (XI): . (AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)- (XI)
na qual:
. (AAi) representa seja um resíduo lisina, seja um resíduo argi- nina, seja um resíduo ornitina;
. (AA2) representa seja um resíduo glicina, seja um resíduo as-
paragina;
. (AA3) representa seja um resíduo lisina, seja um resíduo argi- nina, seja um resíduo ornitina;
. (AA4) representa seja um resíduo leucina, seja um resíduo ala- nina, seja um resíduo isoleucina, seja um resíduo glutamina;
(AA5) representa seja um resíduo isoleucina, seja um resíduo valina, seja um resíduo leucina, seja um resíduo treonina, seja um resíduo norleucina, seja um resíduo norvalina,
à condição, todavia, que (AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5) jamais formem juntos as seqüências peptídicas -Lys Gly Lys Leu Ile- e - Lys Gly Lys Leu Vai-, -Ω, fixado sobre o grupo -CO- da serina representa:
- um radical hidroxila (-OH) ou um radical amino (-NH2);
- um radical alcóxi, comportando de 1 a 6 átomos de carbono; - uma seqüência peptídica de fórmula (XII):
-Val-Σ-Ψ (XII)
na qual Σ representa um seqüência de fórmula (XIII) ou de fórmula (XIV): -(AA6)-TrpAsn-(AA7)-(AA8) (XIIl)
- (AA6)-Trp His-(AA7)-(AA8) (XIV)
nas quais:
. (AA6) representa um aminoácido diferente da lisina; . (AA7) representa um aminoácido; . (AA8)representa um resíduo serina ou treonina e Ψ fixado sobre o resto -CO- do aminoácido AA8 livre, representa um grupo OH, NH2, ou um radical alcóxi, comportando de 1 a 6 átomos de carbono;
- uma seqüência peptídica de fórmula (XV):
- Val-Ψ (XV)
na qual Ψ, fixado sobre o resto -CO- da valina, tem a mesma significação que para a fórmula (XII); - ou uma seqüência peptídica de uma das fórmulas (XVI) a
(XVIII):
-Z-TrpGIyCys-O-CysTyrSer-xP (XVI)
Val-E-Z-TrpGlyCys-O-CysTyrThrSerVaI-Z-T (XVII) Val-Z-TrpGlyCys-O-CysTyrThrSerVaI-vP (XVIII) nas quais ZeO têm a definição dada pela fórmula (I) e Σ tem a
definição dada pela fórmula (XII) e Ψ fixado sobre o resto -CO- da serina, sobre o resto -CO- do aminoácido AA8 ou sobre o resto -CO- da valina, têm a mesma significação que para a fórmula (XII).
Quando Ω representa uma seqüência peptídica de uma das fórmulas (XVI) a (XVIII), o peptídeo de fórmula (I) se torna um dímero, cujo tamanho pode variar de 26 a 66 ácidos aminados. Quando Ω não repre- senta uma seqüência peptídica de uma das fórmulas (XVI) a (XVIII), os peptídeos de fórmula (I) são de tipo monômero e seu tamanho pode variar de 13 a 33 ácidos aminados.
Os peptídeos, de acordo com a invenção, podem estar seja sob a forma linear, seja sob a forma ciclizada por intermédio de pontes di- sulfetos inter-cisteínas.
Preferem-se os compostos de fórmula (I), na qual (AA5) repre- senta seja um resíduo valina, seja um resíduo leucina, seja um resíduo treo- nina, e, quando Ω corresponde a uma seqüência peptídica de fórmula (XII), (AA6) representa seja um resíduo glutamina, seja um resíduo arginina.
Preferem-se os peptídeos de fórmula (I), na qual:
- Δ representa um radical biotinila, um átomo de hidrogênio, ou uma cadeia alifática que pode conter uma ou duas funções tiol aldeído ou amina, a cadeia alifática sendo, de preferência, uma cadeia alquila de 1 a 6 átomos de carbono, ou uma cadeia aminoalquilcarbonila de 2 a 6 átomos de
carbono;
-Z representa uma seqüência peptídica de fórmula (II) ou (V), na qual E1 representa uma seqüência peptídica de dois ácidos aminados e E2 representa um aminoácido, ou uma seqüência de fórmula (IV), na qual E1 representa três ácidos aminados, ou uma seqüência peptídica de fórmula
(VIII), na qual E1 representa uma seqüência peptídica de nove, oito ou três ácidos aminados e E2 uma seqüência peptídica de cinco ácidos aminados;
- Θ representa uma seqüência peptídica de fórmula:
- Lys Gly Arg Leu Val-;
- Arg Gly Lys Ala Val-;
- Arg Gly Arg Leu Val-;
ou
-Arg Gly Arg Ala Val-;
- Ω representa um grupo hidroxila, a seqüência peptídica (XV) ou uma das seqüências apresentadas a seguir que correspondem à se- qüência peptídica de fórmula (XII): - Val Arg Trp Asn Glu Thr-Ψ;
- Val Gln Trp Asn Glu Thr-Ψ
ou
- Val Gln Trp Asn Ser Thr-Ψ.
De preferência, Z representa uma seqüência peptídica de fór- mula:
. -Leu Leu Ser Ser- . -Leu Leu Asn Ser- . -Leu Leu Gln Ser- . -Arg Leu Asn Ser-
. -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser- . -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu- . -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile- . -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-
ou
. -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn
Ser-
Fazem igualmente parte da invenção, os peptídeos sintéticos comportando de 20 a 50 ácidos aminados e correspondentes à fórmula (Ia):
A-Za-TrpGIyCys-Q-CysTyrThrSerQa (Ia) na qual Za representa um radical de fórmulas Ila a Xa:
H1a-Ser-H2a- (IIa) -Ser-H2a- (IIIa) H1a-Ser- (IVa) -H1a-GIn-H2a- (Va) -GIn-H2a- (VIa) -H1a-GIn- (VIIa) -H1a-Asn-H2a- (VIIIa) -Asn-H2a- (IXa) -H1a-Asn- (Xa)
nas quais
-H1a representa uma seqüência peptídica de 1 a 5 ácidos amina- dos e
-E2a um aminoácido;
Qa representa uma seqüência peptídica de fórmula (XII)1 tal como definida para fórmula (I), ou uma seqüência peptídica de fórmula (XVI Ia):
Val-I-Za-TrpGlyCys-Q-CysTyrThrSerVaI-E-vF (XVIIa) na qual Za tem a definição dada para a fórmula (Ia) e
Δ, Θ, Σ e Ψ têm a mesma significação que para a fórmula (I).
Preferem-se os peptídeos de fórmula (I) ou (Ia), incluindo uma
das seqüências a seguir (esses peptídeos podem ser de tipo dímero ou de tipo monômero conforme definido anteriormente). As seqüências são dadas conforme as nomenclaturas com uma e três letras: Seqüência N01
-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET- ou
-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Glu Thr- 22
15
Seqüência N0 2
-LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET- ou
-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20
Glu Thr- 22 Seqüência N0 3 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET-
OU
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Glu Thr- 22
Seqüência N0 4
-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Ser Thr- 22
Seqüência N0 5
-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou
-Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Ser Thr- 22
Seqüência N0 6
-LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET- ou
-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20
Glu Thr- 22
Seqüência N0 7
-LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET-
ou
10 -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Glu Thr- 22
Seqüência N0 8
-LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET-
ou
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Glu Thr- 22
Seqüência N0 9
-LLSSWGCKGRLVCYTS-
ou
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser- 10 15
Seqüência N010
-LLNSWGCKGRL VCYTS- ou
-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-
10 15
Seqüência N011
-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET-
ou
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly
10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr- 25 30 Seqüência N012
-AL ETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVR WNET- ou
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly
10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr- 25 30
Seqüência N013
-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET-
ou
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly
10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr- 25 30
Seqüência N014
-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- ou
-Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr
10 15
Thr Ser Val- 20
Seqüência N015
-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-
ou
- Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys
1 5 10 15
Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val- 25
Seqüência N016
-RLNSWGCKGRLVCYTSV- ou
- Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val- 10 15
Os peptídeos sintéticos a seguir são peptídeos particularmente
preferidos: Peptideos N01 (2B): SEQ ID N0 1 LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET
OU
Leu Leu Ser Leu Trp GIy Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Glu Thr 22
Peptídeos N0 2 (3B): SEQ ID N0 2
LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET ou
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20
Giu Thr 22
Peptídeos N0 3 (4B): SEQ ID N0 3
LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET
ou
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn
1S 10 15 20
Glu Thr 22
Peptídeos N0 4 (5B): SEQ ID N0 4
LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST ou
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Ser Thr 22
Peptídeos N0 5 (6B): SEQ ID N0 5
LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST ou
Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Ser Thr 22 Peptideos N0 6: SEQ ID N0 6
LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET ou
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20
Glu Thr 22
Peptídeos N0 7: SEQ ID N0 7
LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET ou
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 10 15 20
Glu Thr 22
Peptídeos N0 8 (7B): SEQ ID N0 8
LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET ou
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20
Glu Thr
22
Peptídeos N0 9 (12B): SEQ ID N0 9
LLSSWGCKGRLVCYTS ou
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 15
Peptídeos N010 (14B): SEQ ID N010
LLNSWGCKGRLVCYTS
ou
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 15 Peptideos N011 (18B): SEQ ID N011
ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET
ou
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln GIn Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly
10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 25 30
Peptídeos N012 (19B): SEQ ID N012
ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET ou
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly
10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 25 30
Peptídeos N013 (20B): SEQ ID N013
ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET ou
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly
10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 25 30
Peptídeos N014 (21B): SEQ ID N014
LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV _
ou
Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 10 15
Thr Ser Val
20
Peptídeos N015 (22B): SEQ ID N015
RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV ou
Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys 10 15
Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val 25 Peptideos N016 (23B): SEQ ID N016
RLNSWGCKGRLVCYTSV
ou
Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val
10 15
Os peptídeos sintéticos de fórmula (I), objeto da presente inven- ção, podem ser conseguidos por síntese em fase sólida, segundo métodos tradicionais: R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soe. (1963), 85, pp. 2149-2154; R.C, Sheppard, in "Peptides 1971", Nesvadba H. (ed.) North Holland, Ams- terdam, pp. 111; E. Atherton and R.L. Sheppard, in "Solid phase peptide synthesis, a praticai approach", IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, pp.25-34. Como sintetizador automático, pode-se utilizar o sintetiza- dor "9050 Plus Pep Synthesizer" da Millipore ou um sintetisador equivalente.
O suporte sólido, utilizado para as sínteses, deve ser compatível com a técnica e a química aplicadas. Por exemplo, para uma síntese sobre o sintetizador "9050 Plus pep. Synthesizer", é recomendado utilizar uma resina adaptada à técnica dita "em fluxo contínuo"; as resinas PEG PS res- pondem a esses critérios. Esses suportes são constituídos de um braço es- paçador à base de polietileno glicol (PEG) situado entre o grupamento fun- cional das esferas de poliestireno e o ponto de encaixe do primeiro aminoá- cido. A natureza desse ponto de fixação pode variar segundo a função C- terminal escolhida. No caso presente, diferentes resinas PEG-PS foram uti- lizadas.
A resina de partida e os ácidos aminados utilizados como maté- rias primas são produtos disponíveis no comércio (PerSeptive-Biosystem, ou Néosystem). Para a síntese peptídica, os grupamentos protetores de cadeias laterais a seguir foram utilizados:
Ácidos aminados Grupamento protetor Arginina Pentametil-2,2,4,6,7-di-hidrobenzofurano-5- sulfonila (Pbf) Asparagina, Glutamina Tritila (Trf) Cisteína Tritila (Trt) ou Acetamidometila (Acm) Serina, Treonina, Tirosina Éter terc-butila (íBu) Lisina, Triptofano Terc-butiloxicarbonila (Boc)
A proteção temporária da função amina primária em α dos áci- dos aminados utilizada é o grupamento 9-fluorenilmetiloxilcarbonila (Fmoc). A desproteção é feita por uma solução de piperidina a 20% em dimetilfor- mamida.
Para o acoplamento, utiliza-se, de preferência, um excesso de diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) e de hidróxi-1-benzotriazol (HOBt).
Após síntese, a resina é lavada com solventes orgânicos, (dimetilformamida, depois diclorometano) seca sob vácuo, depois tratada por uma solução à base de ácido trifluoroacético (TFA) resfriada a 0 0C e contendo seqüestrantes apropriados. Pode-se utilizar, por exemplo, o rea- gente K contendo 82% de ácido trifluoroacético, 5% de fenol, 5% de água, 5% de tioanisol e 3% de etanoditiol.
Após filtração da resina, os peptídeos sintéticos são precipita- dos e enxaguados ao éter.
Os peptídeos sintéticos são em seguida purificados por croma- tografia líquida em fase inversa e sua pureza é determinada por especto- metria de massa. Como fase sólida, podem-se utilizar, por exemplo, a fase Bondapak C-18. Os peptídeos são misturados, realizando-se um gradiente linear entre duas soluções tampões, a primeira essencialmente aquosa (por exemplo água-TFA 0,1%) e o segundo antes de tudo orgânico (por exemplo uma mistura contendo acetonitrila 60%, água 39,92% e TFA 0,08%). As fra- ções puras coletadas são reunidas, concentradas sob vácuo e liofilizadas.
Para a ciclização, os peptídeos sintéticos purificados são dissol- vidos em uma solução de acetato de amônio (10mM). O pH é ajustado em 8,5 por adição de amoníaco 1 Μ. A solução é vigorosamente agitada. A ci- clização é completa após 18 horas. O pH é em seguida baixado para 6, por adição de ácido acético. Os peptídeos ciclizados são liofilizados, depois purificados por cromatografia líquida em fase inversa conforme foi descrito anteriormente.
A imunorreatividade dos peptídeos da invenção foi avaliada com o auxílio de soros de doentes majoritariamente originários do Cameroun in- fectados por retrovírus HIV-1 do grupo O. Os diferentes testes feitos de- monstraram que os peptídeos da invenção, sozinhos ou em associação (composições de peptídeos), permitem detectar 100% dos soros infectados por retrovírus HIV-1 do grupo O.
Os peptídeos sintéticos da invenção encontram, portanto, sua aplicação nos testes imunológicos para o despistamento das infecções de- vido aos retrovírus HIV-1 grupo O. É igualmente possível utilizar associa- ções de vários peptídeos sintéticos de fórmula I. Essas associações, que podem conter dois ou vários peptídeos de fórmula I, fazem também parte da invenção. Preferem-se associações contendo os peptídeos N0 1(2B) e N0 3 (4B).
É igualmente possível utilizar peptídeos sintéticos de fórmula (I) da presente invenção em associação com peptídeos recombinados (proteínas recombinantes) HIV-1 do grupo O, tais que podem ser consegui- dos por métodos tradicionais e tendo as seqüências descritas, por exemplo, no pedido EP 0 591 914. Essas composições entram também no âmbito da presente invenção.
Os peptídeos sintéticos da invenção podem ser igualmente utili-
zados em associação com outros peptídeos sintéticos ou recombinados HIV-1 (proteínas recombinantes) e/ou HIV-2, tais como os peptídeos des- critos nos pedidos de patentes ou patentes EP 0 387 914, EP 0 239 425, EP 0 220 273, ou EP 0267 802. Essa lista de pedidos de patentes ou patentes não é exaustiva e foi dada a título de exemplo.
As composições contendo um ou vários peptídeos sintéticos de fórmula (I) e um ou vários peptídeos sintéticos ou recombinados HIV-1 ou HIV-2 encontram sua aplicação em diagnóstico para a despistamento de doentes infectados por diferentes retrovírus HIV. Essas composições fazem igualmente parte da presente invenção.
Processos de imunodosagem utilizando um ou vários peptídeos recombinados HIV-1 do grupo O ou peptídeos sintéticos ou recombinados HIV-1 e/ou HIV-2 fazem igualmente parte da invenção.
A invenção visa igualmente feixes, para a utilização de imuno- dosagens, que incluem um peptídeo de fórmula (I) ou uma composição que contém pelo menos um peptídeo de fórmula (I). Os exemplos seguintes ilustram a invenção e são dados a título
não limitativo. EXEMPLO 1
Preparação de um composto de acordo com a invenção: peptí- deo N0 2 (3B)
LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET
ou
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn
1 5 10 15 20
Glu Thr
15
22
Esse peptídeo foi sintetizado em fase sólida. A técnica desen- volvida em 1963 por Merrifield (J. Am. Chem. Soe. (1963) 85, pp. 2149- 2154) consiste em fixar o primeiro aminoácido sobre um suporte sólido poli- mérico (resina) por sua função ácida e em alongar a seqüência peptídica a partir desse primeiro aminoácido, o peptídeo em curso de síntese permane- cendo fixado sobre a resina.
Para a síntese do peptídeo N0 2, foram utilizados, como sinteti- zador, o sintetizador "9050 Plus Pep Synthetizer" e, como resina, a resina Fmoc Thr (OtBu) PEG PS.
As diferentes etapas da síntese foram resumidas na tabela a
seguir. TABELA I
Resíduo aminoácido Proteção NH2 Proteção lateral Método de acoplamento Número de eq. Dura- ção de acoplamento Glu Fmoc OtBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Trp Fmoc Boe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Gln Fmoe Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Val Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Ser Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Thr Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Tyr Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Cys Fmoe Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Val Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Arg Fmoe Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Gly Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Arg Fmoe Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Cys Fmoe Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Gly Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Trp Fmoe Boe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Ser Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min
Após o final da síntese, a resina foi lavada com dimetilformami- da, depois com diclorometano e seca sob vácuo.
Em seguida, a resina foi tratada com reagente K (ácido trifluoro- acético 82%; fenol 5%; Água 5%; tioanisol 5%; etanoditiol 3%). O peptídeo N0 2 (3B), isolado por precipitação como auxílio de óxido dietílico, foi em seguida enxaguado com o mesmo solvente. Foram conseguidos assim 140 mg do peptídeo N0 2 (3B).
O peptídeo N0 2 (3B) foi em seguida purificado por cromatogra- fia líquida em fase inversa. Como fase sólida, foi utilizada a fase Bondapak C-18. O peptídeo foi misturado, realizando-se um gradiente linear entre du- as soluções tampões, a primeira essencialmente aquosa (por exemplo água-TFA 0,1%) e a segunda antes de tudo orgânica (por exemplo uma mistura contendo: acetonitrila 60%, água 39,92% e TFA 0,08% ). As frações puras coletadas foram reunidas, concentradas sob vácuo e liofilizadas.
Para a ciclização, o peptídeo sintético purificado, assim obtido foi dissolvido em uma solução de acetato de amônio (10mM). O pH foi ajus- tado em 8,5 por adição de amoníaco 1 Μ. A solução foi vigorosamente agita- da. A ciclização foi completa, após 18 horas. O pH foi em seguida baixado para 6 por adição de ácido acético. O peptídeo ciclizado foi liofilizado, de- pois purificado por cromatografia líquida em fase inversa como foi descrito anteriormente.
Preparação de um composto, de acordo com a invenção: peptí- deo N015 (22B)
Esse peptídeo foi sintetizado como o peptídeo N0 2 (3B), mas utilizando-se como resina, a resina FmocPAL PEG-PS. As diferentes etapas da síntese foram resumidas na tabela Il a
seguir.
TABELA Il
Resíduo aminoácido Proteção NH2 Proteção lateral Método de acoplamento Número de eq. Dura- ção de acoplamento Val Fmoc DIPCDl/HOBt 5 eq - 45 min Ser Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Thr Fmoe tBu DIPCDl/HOBt 5 eq - 45 min Tyr Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Cys Fmoe Trt DIPCDl/HOBt 5 eq - 45 min Val Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Arg Fmoe Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Gly Fmoe DIPCDl/HOBt 5 eq - 45 min Lys Fmoe Boe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Cys Fmoe Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Gly Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Trp Fmoe Boe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Ser Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Asn Fmoe Trt DIPCDl/HOBt 5 eq - 45 min Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min TABELA Il (Continuação)
Resíduo aminoácido Proteção NH2 Proteção lateral Método de acoplamento Número de eq. Dura- ção de acoplamento Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Gln Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Gln Fmoe Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Asn Fmoe Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Thr Fmoe tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Glu Fmoe OtBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Leu Fmoe DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Ala Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min Arg Fmoe Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 min
Após o final da síntese, a resina foi lavada com dimetilformami- da, depois com diclorometano e seca sob vácuo.
Em seguida, a resina foi tratada com reagente K (ácido trifluora- cético 82%; fenol 5%; água 5%; tioanisol 5%; etanoditiol 3%). O peptídeo N0 7 (22B), isolado por precipitação com o auxílio de óxido de dietila, foi em seguida enxaguado como mesmo solvente. Obtiveram-se assim 140 mg do peptídeo N015 (22B).
O peptídeo N0 15 (22B) foi em seguida purificado por cromato- grafia líquida em fase inversa, depois ciclizado, Iiofilizado e purificado como descrito anteriormente para o peptídeo N0 2 (3B).
De maneira equivalente, e utilizando-se as resinas e ácidos aminados apropriados, os outros compostos da invenção foram sintetizados.
A tabela Ill indica o peso molecular de certos peptídeos de fór- mula (I), sob a forma não ciclizada, avaliado por espectometria de massa. TABELA Ill
Peptídeo N0 Peso molecular (Dáltons) 1 (2B) 2512 2 (3B) 2583 3 (4B) 2528 4 (5B) 2586 (6B) 2527 9 (12B) 1772 (14B) 1799 11 (18B) 3752 12 (19B) 3778 13 (20B) 3780 14 (21B) 2538 (22B) 3222 16 (23B) 1941
EXEMPLO 2
Avaliação da imunorreatividade dos peptídeos, de acordo com a invenção, por teste imuno-enzimático: teste N01.
Os soros utilizados ESS, DUR1 VAU e HAD são soros de doen-
tes franceses infectados por retrovírus HIV-1 do grupo O. As outras amos- tras de soros de doentes infectados por retrovírus HIV-1 grupo O foram con- seguidos pelo Centro Pasteur de Yaoundé no Cameroun e foram sorotipa- dos grupo O, segundo o algoritmo serológico descrito em AIDS (1977), 11, pp 445-453.
Os soros HIV negativos (n = 48) foram conseguidos a partir de voluntários sadios.
Os peptídeos sintéticos utilizados foram dissolvidos na água a uma concentração de 1 mg/ml (solução mãe). Para a etapa de sensibiliza- ção da fase sólida (revestimento), 110 μΙ de uma solução a 2 μ9/ιηΙ de cada peptídeo (conseguida por diluição da solução mãe com aso tampão carbo- nato 0,1 M) foram acrescentados a cada cúpula das placas de microtitula- ção Microtiter™ (NUNC). Após incubação, durante uma noite, à temperatura ambiente, as microplacas foram inicialmente lavadas com uma solução tam- pão Tris NaCI pH 7,4 contendo 0,1% de Tween® 20 e mertiolate de sódio 0,001%, depois saturados com uma solução de PBS contendo 0,5% de Ré- gilait™ (creme de leite dissorado). Após aspiração da solução de saturação, as placas foram aquecidas durante 10 minutos a 50 0C.
As amostras de soros foram diluídas em 1/5 com uma solução
de creme de leite (tampão citrato adicionado de 0,01 de vermelho de fenol, de clorofórmio a 0,25% e de Kathon® a 0,25%), depositados sobre as cú- pulas das placas e postos para incubar durante 30 minutos a 40 0C.
Após lavagem com uma solução tampão Tris NaCI pH 7,4 con- tendo 0,1% de Tween® 20 e mertiolato de sódio a 0,001%, 100 μΙ de uma solução de conjugado anticorpo de cabra anti IgG e IgM humanos marcados à peroxidase do rábano bastardo, contendo como conservante 0,01% de mertiolate de sódio, em solução em uma solução tampão citrato adicionado de glicerol a 30% e do soro normal de bezerro fetal a 25% foram acrescen- tados a cada cúpula de placas, depois estas foram colocadas para incubar, durante 30 minutos a 40°C.
Após lavagem com uma solução tampão Tris NaCI pH 7,4 con- tendo 0,1% de Tween®20 e mertiolate de sódio a 0,001%, o desenvolvi- mento da coloração foi obtido por adição, em cada cúpula, de 100 μΙ de O- fenileno diamina em solução em peróxido de hidrogênio. As microplacas foram em seguida colocadas para incubar, durante 30 minutos, à temperatu- ra ambiente de 100 μΙ de ácido sulfúrico 4N. A absorvência (A) foi determi- nada a 490 e 620 nm.
A absorvência relativa (A490-A620) lida em cada cúpula foi pro- porcional à imunorreatividade de cada peptídeo. Isto indica a aptidão de cada peptídeo para reagir com a amostra biológico com a qual foi feito o teste. O valor limite (cut-off) foi determinada como sendo uma absorvência igual a 0,15. Ela corresponde à média de valores negativos (n = 48) mais 12 desvios-padrões.
A reatividade dos peptídeos da invenção, peptídeo N0 3 (4B),
peptídeos N°2 (3B) e peptídeos N0 1 (2B), todos sob forma ciclizada, foi comparada àquela de dois peptídeos sintéticos tendo como seqüência uma parte da seqüência natural do envoltório (env) do isolado VAU (retrovírus HIV-1 do grupo O) e comportando um epitope imunodominante de gp41. Esses dois peptídeos têm a seguinte seqüência:
VAU 22 AA
Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Asn Arg Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn 10 15 20
Lys Thr 22
VAU 35 AA
Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Ile Glu Glu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15 20
Lys Asn Arg Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Lys Thr 30 35
Para o estudo, esses peptídeos foram utilizados sob a forma ciclizada. Os resultados desse estudo foram indicados na tabela IV.
TABELA IV
SORO ABSORVÊNCIA PEPTÍDEO N0 3 (4B) PEPTÍDEO N0 2 (3B) PEPTÍDEO N0 1 (2B) VAU 22 AA VAU 35 AA ESS* > 2,494 > > DUR* > > > 0,118 0,872 HAD > 0,518 0,041 0,789 0,871 VAU* 1,342 > > > > 3935 > 0,893 0,307 0,138 0,227 6891 > 0,614 0,062 0,359 0,496 6512* 0,746 0,785 > 0,120 0,174 1105* 1,421 1,031 > 0,099 0,129 4021* 0,430 0,119 > 0,050 1,957 5969* > 0,282 > 2,491 > 2700 > 0,274 > > > 5453 0,555 0,081 > 1,267 1,482 5931 > > > 0,202 2,225 3136 > 0,992 0,302 > > 3653 1,352 > 0,044 1,441 1,322 TABELA IV (continuação)
SORO ABSORVÊNCIA PEPTÍDEO N0 3 (4B) PEPTÍDEO N0 2 (3B) PEPTÍDEO N0 1 (2B) VAU 22 AA VAU 35 AA 2352 > > 0,205 > > 3016 > > 0,243 > > 3302 > > 0,386 > > 2294 > > 0,447 > > 3771 > > 0,544 > > 1581 > > > 1,112 0,894 5373 > > > 1,359 0,856 7443 > > > 0,920 0,574 3637 > > > 0,779 1,647 6295* 1,718 1,063 > 0,972 > 6689* 0,710 > > > > 1754 > > > 1,263 1,948 4489* > > > 1,318 1,718 4364 > > 1,382 > > 3884* > > 1,839 > > 3529 > > 1,803 > > 3482 2,402 > 1,473 > > 1702 > > 1,162 > > 6487 > 1,017 2,687 2,889 2,891 5164 > > > > > 5766* > > > > > 3945 > > > > >
* Sorotipados/genotipados
** > = sinal superior à capacidade de leitura do espectrofotômetro *** Não testado
TABELA IV (continuação)
SORO ABSORVÊNCIA PEPTÍDEO N0 3 (4B) PEPTÍDEO N0 2 (3B) PEPTÍDEO N0 1 (2B) VAU 22 AA VAU 35 AA 4434 > > > 2,273 > 4288* > > 2,802 2,337 N.T.*** TABELA IV (continuação)
SORO ABSORVÊNCIA PEPTÍDEO N0 3 (4B) PEPTÍDEO N0 2 (3B) PEPTÍDEO N0 1 (2B) VAU 22 AA VAU 35 AA 6782 > 2,091 2,462 2,190 2,214 2313 > > > > > 2312 > > > > > 1062 > > > > > 402 > > > > > 134 > > > > > 7120 > > > > > 7212 > > > > > 6976* > > > > > 3600* > > 2,743 > > 3236 > > > > > 3235 > > > > > 2551 > "-S. > > > 5270* > > > > > 5210 > > > > > 5149* > > > > > 4477 > > > 2,511 > 3891 > > 2,780 > > 3627* > > 2,910 > > 7258* > > 2,477 > > 7007 2,136 2,334 > > 2,151 6697 > > > > > 6998 > > > > > 6627 > > > > > 6198* > > > > > 6165 > > 2,714 > > 7439 > > > > > 7297* > > > > > 6111 > > > > > 625 > > > > 2,885
Os resultados da tabela IV demonstraram que o peptídeo N0 3 (4Β) apresenta os melhores desempenhos em relação àqueles revelados pelos outros peptídeos. Esse peptídeo permite a melhor discriminação dos soros de doentes infectados por retrovírus HIV do grupo O em relação aos dois peptídeos que têm uma parte da seqüência do isolado VAU correspon- dente ao epitope imunodominante da gp41. Por outro Iado1 os peptídeos N0 2 (3B) e N01 (2B) da invenção são mais imuno-reagentes do que o peptídeo VAU 22 AA que comporta o mesmo número de ácidos aminados. EXEMPLO 3
Avaliação por teste imunoenzimático da imunorreatividade dos peptídeos, de acordo com a invenção: teste N0 2.
As amostras de soros de doentes infectados por retrovírus HIV-1 do grupo O foram conseguidas pelo Centre Pasteur de Yaoundé no Came- roun e foram serotipados grupo O, segundo o algoritmo sorológico descrito em AIDS (1977), 11, pp. 445-453. Uma amostra (MaryIand) genotipada pro- vêm dos Estados Unidos. Essas amostras foram previamente diluídas no soro humano negativo nas diluições dadas na tabela V, a fim de dispor de um volume suficiente para os diferentes testes de imunorreatividade.
Os peptídeos sintéticos utilizados foram dissolvidos na água a uma concentração de 1 mg/ml (solução mãe). Para a etapa de sensibiliza- ção da fase sólida ("revestimento"), foi procedido como foi descrito para o exemplo 2.
As amostras de soros foram diluídas em 1/5 com uma solução de creme de leite (em tampão citrato adicionado de vermelho de fenol a 0,01%, de clorofórmio a 0,25% e de Kathon® a 0,25%), depositados nas cúpulas das placas e colocados para incubar, durante 30 min, a 40°C.
Após lavagem com uma solução tampão Tris NaCI pH 7,4 con- tendo 0,1% de Tween® 20 e mertiolate de sódio a 0,001%, 100 μΙ de uma solução de conjugado de anticorpos de cabra anti IgG e IgM humanos mar- cados à peroxidase do rábano bastardo, contendo como conservante merti- olate de sódio a 0,01%, em solução em uma solução tampão citrato adicio- nada de glicerol a 30% e do soro normal de bezerro fetal a 25%, foram acrescentados a cada cúpula das placas, depois estas foram colocadas para incubar durante 30 minutos a 40°C.
Após lavagem com uma solução tampão Tris NaCI pH 7,4 con- tendo Tween® 20 a 0,1% e mertioiate de sódio a 0,001%, o desenvolvi- mento da coloração foi obtido conforme foi descrito no exemplo 2.
A absorvência (DO) relativa (A490-A620) lida em cada cúpula é
proporcional à imunorreatividade de cada peptídeo. Isto indica a aptidão de cada peptídeo para reagir com a amostra biológica com a qual foi feito o teste.
A reatividade dos peptídeos da invenção, peptídeos N010 (14B), N0 11 (18B), N0 12 (19B), N0 14(21B), N0 15 (22B), N0 16 (23B), todos sob a foram ciclizada, foi comparada àquela de três peptídeos sintéticos homólo- gos, tendo como seqüência uma parte da seqüência natural do envoltório (env) de retrovírus HIV-1 do grupo O. Esses peptídeos são dois peptídeos derivados do isolado VAU, - o peptídeo VAU22 AA e o peptídeo VAU 35 AA- e o peptídeo MVP 5180 (designado "MVP 5180) na tabela V). Os peptídeos VAU 22 AA e VAU 35 AA (cuja estrutura foi indicada no exemplo 2) e o peptídeo MVP 5180 comportam um epitope imunodominante da gp41.
Todos esses peptídeos foram utilizados sob a forma ciclizada. A seqüência do peptídeo MVP 5180 é o seguinte: MVP 5180
Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Cys
10 15 20
Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Thr Ser
Os resultados desse estudo foram indicados na tabela V.
TABELA V
PEPTÍDEOS * SORO N0 10 N0 11 N0 12 N0 14 N0 15 N0 16 MVP 5180 VAU 35 AA VAU 22 AA ABSORVÊNCIA (DO) 4280 a 1/50 0,022 0,686 0,201 0,286 0,689 0,033 0,382 0,013 0,021 TABELA V (continuação)
PEPTÍDEOS * SORO N0 10 N0 11 N0 12 N0 14 N0 15 N0 16 MVP 5180 VAU 35 AA VAU 22 AA ABSORVÊNCIA (DO) NGO a 1/50 0,067 0,335 0,193 0,157 0,315 0,110 0,184 0,055 0,040 NJEM a 1/100 0,032 0,811 0,391 0,277 0,939 0,025 0,146 0,159 0,024 MBASSI a 1/100 1,217 1,150 0,747 2,134 2,010 2,683 0,248 0,120 0,257 WANG a 1/50 0,698 0,234 0,124 2,397 2,680 1,290 0,075 0,025 0,041 258 OUDI a 1/100 0,587 0,373 0,226 0,764 1,184 1,692 0,116 0,058 0,100 D015 a 1/100 1,613 0,859 1,286 3,357 3,693 2,088 3,038 0,673 0,036 0,075 DJOU a 1/100 1,268 0,482 0,419 1,998 2,166 0,203 0,022 0,042 3600 a 1/100 0,482 0,360 0,249 0,716 0,801 0,933 0,206 0,025 0,058 3613 a 1/400 1,108 0,837 0,773 1,508 1,627 1,679 0,478 0,250 0,396 6111 a 1/100 0,596 0,348 0,202 0,850 1,207 1,009 0,226 0,087 0,180 625 a 1/50 0,838 0,338 0,264 2,045 2,122 1,791 0,202 0,069 0,165 Maryland a 1/400 0,524 0,370 0,285 0,734 0,844 1,229 0,241 0,054 0,168 3653 a 1/10 0,347 0,337 0,247 0,072 0,380 0,406 0,401 0,021 0,310
FASE SÓLIDA* : peptídeo 2 μ9/ιτιΙ.
Para cada peptídeo testado, as amostras foram arrumadas em quatro classes (a, b, c, d) correspondentes a diversos níveis de absorvência relativa lida nos comprimentos de onda A492-A620: • - para a: DO < 0,100 • - para b: 0,100 < DO < 0,500
• - para c: 0,500 < DO < 1,000
• - para d: DO > 1,000
permitindo assim avaliar o grau de imunorreatividade dos peptídeos. Os peptídeos os mais imunorreagentes são aqueles para os quais o maior nú- mero de amostras é encontrado nas classes correspondentes às absorvên- cias as mais elevadas.
Os resultados foram indicados na tabela Vl
TABELA Vl
PEPTÍDEOS * CLASSE N0 10 N011 N0 12 N0 14 N0 15 N0 16 MVP VAU VAU 5180 35 AA 22 AA Número de amostras a 3 0 0 1 0 2 1 11 7 b 2 9 11 3 2 2 12 3 7 C 5 4 2 4 4 1 1 0 0 d 4 1 1 6 8 9 0 0 0
FASE SÓLIDA*: PEPTÍDEO 2 ng/ml
Os resultados mostram que todos os peptídeos da invenção testados têm um melhor desempenho em, imunorreatividade do que os peptídeos de referência da técnica anterior que derivam de isolados natu- rais (MVP 5180, VAU). Os peptídeos da invenção N015 (22B), N014 (21B) e N016 (23B) se mostraram os mais imuno-reagentes. EXEMPLO 4
Avaliação da imuno-reatividade das composições contendo peptídeos, de acordo com a invenção, por teste imuno-enzimático.
Para esse teste, foi procedido, conforme o protocolo descrito no exemplo 2 e os mesmos soros foram utilizados. As microplacas utilizadas foram sensibilizadas seja com o peptídeo N0 1 (2B) ciclizado, seja com o peptídeos N°3(4B) ciclizado, seja com uma composição contendo esses dois peptídeos (1:1 p/p). Em cada cúpula foram depositados, seja 100 μΙ de uma solução contendo 2 μς/ιηΙ de peptídeo N°3(4B), seja 100 μΙ de uma solução contendo 1 μς/ιτιΙ de peptídeo N01 (2B) e 1 μg/m\ de peptídeos N°3 (4B). Os resultados desse teste foram dados na tabela VII.
TABELA Vll
SORO ABSORVÊNCIA Peptídeo N0 1 (2B) (2 ng/ml) Peptídeo N0 3 (4B) (2 ng/ml) Peptídeo N0 1 (2B) (1 ng/ml) + Peptídeo N0 3 (4B) (1 ng/ml) 3529 1,803 >* > 1105 > 1,421 > 3891 2,780 > > 3235 > > > 2700 > > > 5931 > > > 3935 0,307 > > 7443 > > > 1062 > > > 1754 > > > 3136 0,302 > > 6891 0,062 > > 5149 > > > 5270 > > > 2551 > > > 3600 2,743 > > 6976 > > > 4489 > > > 6165 2,714 > > 6198 > > > 6627 > > > 6998 > > > 6697 > > > 7258 2,477 > > 3627 2,910 > > 4477 > > > 3771 0,544 > > 1702 1,016 > > 2294 0,447 > > 2352 0,205 > > 3016 0,243 > > TABELA Vll
SORO ABSORVÊNCIA Peptídeo N0 1 (2B) (2 ng/ml) Peptídeo N0 3 (4B) (2 ng/ml) Peptídeo N0 1 (2B) (1 ng/ml) + Peptídeo N0 3 (4B) (1 μρ/ητιΙ) 3302 0,386 > > 3482 1,473 > > 3653 0,044 1,322 1,105 4364 1,382 > > 3637 > > > 4288 2,802 > > 5969 > > > 258 > > > 6111 > > >
* > = sinal superior à capacidade de leitura do espectrofotômetro.
TABELA Vll (continuação)
SORO ABSORVÊNCIA Peptídeo N01 (2B) (2 ng/ml) Peptídeo N0 3 (4B) (2 μς/ίπΙ) Peptídeo N0 1 (2B) (1 ng/ml) + Peptídeo N0 3 (4B) (1 ng/ml) 625 > > > 6853 > 2,769 > 3136 0,302 > > 6689 > 0,710 > 6295 > 1,718 > 4021 > 0,430 2,381 3884 1,839 > > 6512 > 0,746 > 6487 2,687 > > ESS 2,494 > > HAD 0,041 > > DUR > > >
* > = sinal superior à capacidade de leitura do espectrofotômetro.
Os resultados da tabela Vll demonstram que as composições
dos peptídeosda invenção, quando utilizadas em diagnóstico permitem a de- tecção de todos soros de doentes infectados por retrovírus HIV-1 do grupo O. LISTA DE SEQÜÊNCIAS
(I) Informação geral
(I) Depositante
(A) Nome: Pasteur Sanofi Diagnostics (B) Rue: 3 boulevard Raymond Pincaré
(C) Ville: Marnes Ia Coquette
(E) País: França
(F) Código Postal : 92430
(G) Telefone: 0153774000 (H) FAX: 153774133
(II) Título da invenção: peptídeos sintéticos utilizáveis nos testes biológicos para a detecção das infecções devido ao vírus HIV-1 do grupo O
(III) Número de seqüências: 16
(IV) Forma legível por computador: (A) Tipo de suporte: Floppy disk
(B) Computador: IBM PC compatível
(C) Sistema de exploração: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIN Release n° 1.0, Version n° 1.25 (OEB)
2. Informação para a seqüência ID N01:
I) Características da seqüência:
(A) Extensão: 22 ácidos aminados
(B) Tipo: aminoácido
II) Tipo de molécula: peptídeo
(XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N01:
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Se^
10 I5
Val Gln Trp Asn Glu Thr 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 2:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido (II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 2
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 15
Val Gln Trp Asn Glu Thr 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 3:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo
(XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 3
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 I5
Val Gln Trp Asn Glu Thr 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 4:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 4
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser
1 5 io
Val Gln Trp Asn Ser Thr 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 5: (I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido (II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 5
15 Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 I5
Val Gln Trp Asn- Ser Thr
20
(2) Informação para a seqüência ID N0 6:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 6
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tvr Thr Ser 1 5 10 15
Val Gln Trp Asn Glu Thr 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 7:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 7
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser
10 15
Val Gln Trp Asn Glu Thr 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 8:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 8
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser
15
Val Gln Trp Asn Glu Thr- 20
(2) Informação para a seqüência ID N0 9:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 16 ácidos aminados
(B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N0 9
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 15
(2) Informação para a seqüência ID N010:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 16 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo
(XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N010
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 10 15
(2) Informação para a seqüência ID N011:
(I) Características da seqüência:
A) Extensão: 32 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N011
a Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly
Al
1 5 ίο 15-
Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 25 30
(2) Informação para a seqüência ID N012:
(I) Características da seqüência:
(A) Extensão: 32 ácidos aminados
(B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N012
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn. Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly 10 15
Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 25 30
(2) Informação para a seqüência ID N013:
(!) Características da seqüência:
(A) Extensão: 32 ácidos aminados
(B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N013
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly 1S 10 15
Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr 25 30
(2) Informação para a seqüência ID N014:
(I) Características da seqüência:
(A) Extensão: 22 ácidos aminados (B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N014
Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu 10
15
Val Cys Tyr Thr Ser Val 20
(2) Informação para a seqüência ID N015:
(I) Características da seqüência:
(A) Extensão: 28 ácidos aminados
(B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo (XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N015
Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp 10 15
Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys" Tyr Thr Ser Val 25
(2) Informação para a seqüência ID N016:
(I) Características da seqüência:
(A) Extensão: 17 ácidos aminados
(B) Tipo: aminoácido
(II) Tipo de molécula: peptídeo
(XI) Descrição da seqüência: seqüência ID N016
Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser
1. 5 10 15
Val
Claims (7)
1. Peptídeo sintético, caracterizado pelo fato de que consiste uma das seqüências a seguir: Seqüência N0 2 -LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn Glu Thr- 22 Seqüência N0 3 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn GIuThr- Seqüência N0 4 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn SerThr- Seqüência N0 5 -LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou -Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn SerThr- Seqüência N0 8 -LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn Glu Thr- Seqüência N0 11 -ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET- ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr- Seqüência N0 12 -ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVR WNET- ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr- Seqüência N0 13 -ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET- ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr- Seqüência N0 14 -LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- ou -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val- Seqüência N0 15 -RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV- ou - Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val- Seqüência N016 -RLNSWGCKGRLVCYTSV- ou - Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-
2. Composição, caracterizada pelo fato de que contém vários peptídeos sintéticos, como definidos na reivindicação 1.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que um dos vários peptídeos sintéticos, como definidos na rei- vindicação 1, é o peptídeo N0 3 (4B).
4. Composição de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracteri- zada pelo fato de que contém o peptídeo N0 3 (4B) e o peptídeo N0 1 (2B).
5. Processo de imunodosagem in vitro para a detecção das in- fecções de vírus HIV-1 do grupo O, caracterizado pelo fato de que utiliza um ou mais peptídeos sintéticos, como definidos na reivindicação 1.
6. Processo de imunodosagem in vitro para a detecção das in- fecções de vírus HIV-1 do grupo O, caracterizado pelo fato de que utiliza uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4.
7. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que inclui pelo menos um peptídeo sintético, como definido na reivindicação 1, ou uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4.
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