FI102834B - Kysteiinitioli-suojatut peptidit käytettäviksi immunologisissa määrity ksissä - Google Patents

Description

102834

Kysteiinitioli-suojatut peptidit käytettäviksi immunologisissa määrityksissä

Keksinnön aihepiiri 5 Esillä oleva keksintö koskee epitooppeja jäljitte leviä peptidejä käytettäviksi immunologisissa määrityksissä ja tarkemmin ottaen aiempaa parempia hapetettuja peptidejä, joiden epitooppiesitys on aiempaa parempi ja jotka reagoivat immunologisesti retroviruksen natiivin proteii-10 nin vastaisten vasta-aineiden kanssa. Keksintö koskee myös peptidien käyttöä immunomäärityksissä ja immunomääritysvä-lineiden valmistuksessa.

Keksinnön tausta Tällä hetkellä yksilöt, joilla on ihmisen immuuni-15 katoviruksen (HIV:n) kanssa reagoivia vasta-aineita, määritetään immunologisilla määrityksillä, jotka edustavat tavanomaista "sandwich"-ELISA-muotoa. Näissä määrityksissä käytetään immobilisoitua viruslysaattia, joka saatetaan kosketuksiin veren tai seerumin kanssa, jonka epäillään 20 sisältävän HIV-vasta-aineita. Vaikka olemassa olevilla ·' ’ kaupallisilla testeillä on ilmeisesti merkittävästi vähen- > : netty HIV:n siirtymistä verituotteiden välityksellä, vi- w ruslysaattipohjaisilla testeillä on useita merkittäviä • · f-· haittapuolia. Näitä haittapuolia ovat mainittuihin kui- 25 tenkaan rajoittumatta tarve kasvattaa ja käsitellä suuria :*·*: määriä elävää tarttuvaa virusta; mahdollisuus, että elävää virusta mahdollisesti pääsee testimateriaaleihin; saatavan lysaatin vaihteleva luonne; ja väärien positiivisten ja • · · väärien negatiivisten tulosten huomattava lukumäärä, joka • · · 30 tekee välttämättömäksi täydentävän lisätestauksen, kuten '*'· Western blot -määrityksen, käytön.

* ’·**· Yhteisesti omistetussa US-patentissa julkaisunro « :. 4 629 783, joka on Cosandin nimissä ja joka sisällytetään

( (I

(iii; tähän viitteksi, julkistetaan useita synteettisiä pepti- 35 dejä, jotka jäljittelevät immunologisesti reaktiivisia 2 102834 virusproteiiniepitooppeja. Näistä peptidin, joka käsittää gp41:stä 26 aminohapon sekvenssin ja joka on nimetty- peptidiksi 39, todettiin reagoivan kaikkien tunnettujen HIV-l-positiivisten seerumien kanssa, jotka testattiin, 5 eikä se reagoinut yhdenkään testatuista negatiivisista näytteistä kanssa. Sittemmin useat ryhmät ovat tunnustaneet Cosandin määrittelemän peptidi 39 -alueen merkityksen sen sisältäessä dominoivan antigeenimääreen. Katso Wang, e£. ai. , Proc.Natl.Acad.Sei. 83 (1986) 6159; 10 Shoeman, R.L., ai.. Analvt.Biochem. 161 (1987) 370;

Gnann, J.W., e£ ai. . J.Virol. 61 (1987) 2639; ja Gnann, J.W., et aL. J. Infect .Dis. 156 (1987) 261.

Synteettiset peptidit tarjoavat merkittäviä etuja viruslysaatteihin verrattuna. Etuja ovat mainittuihin 15 kuitenkaan rajoittumatta spesifisyys, puhtaus, tuotannon helppous jne. Mahdollisia haittapuolia ovat tarve käyttää useampaa kuin yhtä peptidiä kaikkien viruskantojen toteamiseksi; sekä se, että koska peptidit ovat luontaisesti pienikokoisia, immunologista reaktiivisuutta menetetään 20 kiinteään faasiin immobilisoitaessa.

'·’ ' Pienet peptidit, joita käytetään immobilisoituina . : antigeeneinä immunologisissa määrityksissä, syntetisoidaan yleensä kiinteäfaasimenetelmillä, jolloin kukin aminohap- • · jj | po, joka kuuluu peptidiin, lisätään sarjassa suojatussa : · 25 muodossa kasvavan peptidiketjun ollessa immobilisoitu liu- ·*;*. kenemattomaan hartsitukeen. Synteesimenetelmän aikana tiettyjen, kasvavassa ketjussa olevien aminohappojen sivu-ketjut on suojattu, salvattu erilaisilla kemiallisilla • · · l.’. ryhmillä, jotka pysyvät paikallaan, kunnes valmis peptidi • · · 30 poistetaan liukenemattomasta hartsituesta, tavallisesti reaktiossa konsentroidun fluorivety- tai trifluorietikka- *:*·: hapon kanssa. Pilkkomisen aikana valtaosa suojaryhmistä ;.j poistuu ja valmista peptidiä puhdistetaan jollain erilai- • · · sista alalla hyvin tunnetuista menetelmistä.

• · 3 102834

Epäpuhdas tai puhdistettu peptidi immobilisoidaan sitten kiinteään faasiin erilaisilla menetelmillä, mukaan lukien suora konjugointi, konjugointi liukoiseen immuno-logisesti ei reaktiiviseen proteiiniin tai muuhun in-5 erttiin molekyyliin, tai suoraan adsorboimalla kiinteään faasiin. US-patenttijulkaisussa 4 629 783 julkistetaan esimerkkejä useista näistä menetelmistä.

Peptidejä, jotka jäljittelevät epitooppeja HIV-2:n gp36-proteiinista, jonka glykoproteiinin arvellaan ole-10 van retroviraaliselta funktioltaan verrattavissa HIV-l:n gp41:een, kuvataan EP-patenttihakemusjulkaisussa 284383, joka sisällytetään tähän viitteeksi. Näistä peptidin, joka nimettiin 41-2-1:ksi ja joka koostuu 26 aminohaposta, jotka on kooditettu peptidin 39 HIV-l:ssä alueeseen nähden 15 samanlaiselle alueelle, todettiin reagoivan kaikkien tunnettujen HIV-2-positiivisten seerumien kanssa, jotka testattiin, eikä se reagoinut tarkoituksenmukaisten kynnys-tasojen yläpuolella testattujen negatiivisten näytteiden kanssa. Lyhennetyn version peptidistä 41-2-1, joka nimet-20 tiin 41-2-3:ksi ja joka käsittää aminohappotähteitä pepti- ' din 41-2-1 karboksyylipäästä, todettiin niinikään rea- goivan HIV-2-seerumin kanssa, jolloin se joissain tapauk-sissa toimi paremmin kuin peptidi 41-2-1.

· Peptidit 39, 41-2-1 ja 41-2-3 kukin sisältävät 25 aminohapposekvenssissään kaksi kysteiinitähdettä. Kys- :*;*· teiinitähteiden läsnäolo peptidisekvenssissä mahdollistaa molekyylien välisten ja molekyylin sisäisten disulfidisil-tojen muodostuksen puhdistuksen, immobilisoinnin aikana • · « sekä suojaryhmiä vailla olevan peptidin pitkäaikaisessa • · · 30 varastoinnissa. Tämän vuoksi tällaiset peptidikoostumukset * immobilisoidaan tavallisesti kiinteään faasiin erilaisten *·*"· hapettavien muotojen, joihin sisältyy monomeeriä, dimeeriä ;·. ja eri kokoisia polymeerejä, seoksena. Varotoimiin ei [ yleensä ryhdytä kiinteään faasiin immobilisoitujen pepti- 35 dien hapettavan muodon kontrolloimiseksi. Rosen, J.I., 4 102834 et ai. (W087/06005) totesivat, että tietyt peptidit, jotka oli saatu HIV-l-:n erittäin antigeeniseltä alueelta, jonka tunnisti Cosand, suora. ja jotka sisälsivät enemmän kuin yhden kysteiinitähteen, immobilisoituivat erilaisten ha-5 pettävien muotojen seoksena, ja he esittivät, että peptidin hapettavalla muodolla, etenkin polymeereillä, voi olla merkitystä tiettyjen peptidien reaktiivisuudelle. Rosen et ai. julkistavat, että joissain tapauksissa tiettyjen peptidien syklinen muoto sitoutuu vähemmän tehokkaasti 10 kiinteisiin pintoihin kuin polymeeriset muodot. Peptidien hapettavien muotojen moninaisuus saattaa olla vaihtelun lähde herkissä immunologisissa määrityksissä ja tällä saattaa niinikään olla vaikutusta näihin määrityksiin perustuviin tuloksiin.

15 Täten alalla on olemassa merkittävä tarve saada peptidikoostumuksia, joiden reaktiivisuus on aiempaa parempi ja jotka tuottavat niin vähän vääriä negatiivisia ja vääriä positiivisia tuloksia kuin mahdollista. Esillä oleva keksintö täyttää nämä tarpeet ja muita tarpeita.

20 Yhteenveto keksinnöstä I I ·

• I

’ Käyttöön annetaan aiempaa parempia peptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia HIV-virusten tai HIV-virusten vastaisen vasta-aineen toteamiseksi. Kuvataan myös mene- • « : telmiä aiempaa parempien peptidikoostumusten valmistami- •:"i 25 seksi, jotka mahdollistavat peptidien hapettavan muodon kontrollin ja jotka käsittävät mainitun koostumuksen ennen immobilisointia kiinteään faasiin sekä tämän jälkeen anti-geeniksi immunologisiin määritysmenetelmiin. Hapettavan I.! muodon kontrollilla saadaan peptidikoostumuksia, joiden • · < \ 30 immunologinen reaktiivisuus on aiempaa parempi mitattuna spesifisyydestä ja herkkyydestä. Peptidit syntetisoidaan *:*·: käyttäen tavanomaisia kiinteäfaasipeptidisynteesimenetel- ;·[ miä lukuunottamatta, että kysteiinitioliryhmien tavanomai- • · · [ . sesti käytetty S-bentsyylisalpaus korvataan kemiallisesti 35 reversiibelillä suojakeinolla, joka sietää erittäin happa- 5 102834 mia pilkkomisolosuhteita. Kemiallisesti reversiibeli suojaus voi käsittää esimerkiksi etyylikarbamoyylin, asetami-dometyylin, 3-nitro-2-pyridiinisulfinyylin, difenyyli-4-pyridyylimetyylin ja muita samankaltaisia.

5 Vaihtoehtoinen suoritusmuoto saadaan, kun kysteii- nitioliryhmien reversiibeli suojaus suoritetaan aminohapposekvenssin kokoamisen jälkeen. Peptidikoostumuksen pelkistäminen ennen peptidin suojaamista on välttämätöntä, jotta voidaan varmistaa, ettei disulfidisiltoja ole jäl-10 jellä ennen suojausta. Samoin kysteiinitiolisuojaus voidaan poistaa ennen immobilisointia, jolloin suojaryhmien poistaminen ja peptidin hapettaminen suoritetaan liuoksessa ennen hapetetun peptidikoostumuksen immobilisointia kiinteään faasiin. Hapetusolosuhteet valitaan siten, että 15 ne suosivat molekyylin sisäisten disulfidisiltojen muo dostusta, eli hyvin laimeat ja neutraalista heikosti al-kaliseen olevat olosuhteet.

Keksinnön tietyissä suoritusmuodoissa peptidit koostuvat yleisesti aminohapposekvenssistä: 20 (I) Y-Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-:,j Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys*-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys*-X; 25 :T: (II) Y-Arg-Val-Thr-Ala-Ile-Glu-Lys-Tyr-Leu-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg- • · ·

Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys*-X; tai • · * 30 (III) • · ;·, Y-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-

[ . Arg-Gln-Val-Cys*-X

35 6 102834 joissa X on OH tai NH2, Y käsittää lisää aminohappoja, jotka lisätään peptidien reaktiivisuuden parantamiseksi, ja Cys* on kysteiinitähde, joka käsittää tioliryhmän, joka on suojattu kemiallisesti reversiibelilla tavalla. Erityi-5 sen edullinen suoritusmuoto saadaan, jos Y on sekvenssi Cys-Gly-Gly.

Keksinnön mukaiselle peptidille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Laajassa valikoimassa immunologisia määritysjärjestelyjä voidaan käyt-10 tää peptidikoostumuksia, jotka peptidit voivat olla liuoksessa tai immobilisoitu kiinteään faasiin. Voidaan käyttää erilaisia kiinteitä faaseja mukaan lukien latekseja (mik-rohiukkasjakoisia) piidioksidista, selluloosasta, fluori-hiili (vety) polymeereistä, polyakryyliamidista ja polysty-15 reenistä. Voidaan myös käyttää kiinteitä faaseja, jotka käsittävät esim. piidioksidia, selluloosaa, fluorihii-li(vety)polymeerejä, nylonia, polyakryyliamidia ja polys-tyreeniä. Immobilisointi kiinteään faasiin voi tapahtua joko adsorboimalla tai kovalenttisesti sitomalla. Keksin-,,, 20 nön mukaiselle peptidin käytölle peptidillä päällystetyn ' kiinteän faasin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 8 esitetään.

Yksi immunologinen määritysjärjestely, joka tässä • ' : kuvataan HIV-virusten vastaisten vasta-aineiden tai HIV- II· ( ·:*: 25 virusten antigeenien läsnäolon määrittämiseksi ruumiin :*·*: nesteestä, käsittää yleisesti vaiheet, joissa (a) immobi- lisoinnin sallivissa olosuhteissa saatetaan keskenään kos-ketuksiin kiinteä faasi ja koostumus, jossa on ainakin • · # s··' yhtä peptidiä, joka käsittää aminohapposekvenssin: • · · 30 ·:··: (I) • · Y-Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-' ; Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys*-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys*-X; 35 7 102834 (II) Y-Arg-Val-Thr-Ala-Ile-Glu-Lys-Tyr-Leu-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys*-X; tai 5 (III) Y-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-

Arg-Gln-Val-Cys*-X

10 joissa X on OH tai NH2, Y käsittää lisää aminohappoja, jotka lisätään peptidien reaktiivisuuden parantamiseksi, ja Cys* on kysteiinitähde, joka käsittää tioliryhmän, joka on suojattu kemiallisesti reversiibelillä tavalla; (b) immo-15 bilisoidun peptidin kysteiinitioliryhmistä poistetaan kemiallisesti reversiibeli suojaryhmä; (c) immobilisoitua peptidiä inkuboidaan olosuhteissa, jotka johtavat disulfi-disiltojen muodostumiseen; (d) olosuhteissa, jotka sallivat immunologisesti spesifisen sitoutumisen, saatetaan 20 keskenään kosketuksiin ruumiin neste ja immobilisoitu pep- • · « ’ tidi reaktioseoksen muodostamiseksi; (e) todetaan, onko immobilisoidun peptidin ja ruumiin nesteen vasta-aineosan •välillä tapahtunut immunologisesti spesifistä sitoutumis-f I ta, jolloin immunologisesti spesifisen sitoutumisen totea- ’:"i 25 minen osoittaa HIV-virusten vastaisten vasta-aineiden läs- :*·’· näolon ruumiin nesteessä.

Toinen immunologinen määritysmuoto käsittää vai-heet, joissa (a) kysteiinitioliryhmistä poistetaan ke- • i · miallisesti reversiibeli suojaus; (b) suojaryhmiä vailla « # · 30 olevaa peptidiä inkuboidaan olosuhteissa, jotka johtavat molekyylin sisäisten disulfidisiltojen muodostumiseen, * peptidikoostumuksen muodostamiseksi; (c) peptidikoostumus ;·. immobilisoidaan kiinteään faasiin; (d) olosuhteissa, jotka sallivat immunologisesti spesifisen sitoutumisen, saate-35 taan keskenään kosketuksiin ruumiin neste ja immobili- 8 102834 soitu peptidikoostumus reaktioseoksen muodostamiseksi; ja (e) todetaan, onko immobilisoidun peptidikoostumuksen ja ruumiin nesteen vasta-aineosan välillä tapahtunut immuno-logisesti spesifistä sitoutumista, jolloin immunologisesti 5 spesifisen sitoutumisen toteaminen osoittaa HIV-virusten vastaisten vasta-aineiden läsnäolon ruumiin nesteessä.

Immunologisesti spesifinen sitoutuminen voidaan todeta poistamalla sitoutumatta jääneet osat immunologiseen reaktioseokseen muodostuneista reaktiotuotteista, 10 minkä jälkeen immunologiseen reaktioseokseen lisätään leimattua vasta-ainetta, joka leimattu vasta-aine kykenee sitoutumaan immunologisesti spesifisesti reaktiotuotteen osaan ja joka leima tuottaa todettavan signaalin. Sitoutumatta jääneet osat voidaan poistaa reaktioseoksesta 15 suodattamalla.

Keksinnön mukaiselle peptidin käytölle HIV-l:n, HIV-2:n, HTLV-I:n tai HTLV-II:n vastaisten vasta-aineiden tai niiden antigeenien määrittämiseksi biologisesta näytteestä on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 12 20 esitetään.

'·’ ' Keksinnön muita näkökohtia tulee ilmeisiksi tutus- • tuttaessa seuraavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen sekä : ·, oheisiin patenttivaatimuksiin.

j ·' | IV. Kuvaus spesifisistä suoritusmuodoista i 25 Tässä kuvataan aiempaa parempia peptidikoostumuksia käytettäviksi immunologisissa määritysmenetelmissä vasta-aineiden tai antigeenien kvantitoimiseksi ja/tai toteami-seksi. Tietyissä suoritusmuodoissa peptidejä käytetään vi- • · · .··!, rusantigeenien tai niiden vastaisten vasta-aineiden totea- • · · 30 miseksi, ja tarkemmin ottaen antigeenien tai vasta-ainei- *·**· den, jotka liittyvät retroviruksiin, kuten HIV-1 ja HIV-2 *ί**ί ja lentivirusten liittyvä ryhmä. Toiset mallipeptidit jäl- jittelevät HTLV-I:n ja HTLV-II:n epitooppialueita.

• «· I ". Voidaan tunnistaa peptidejä, jotka kykenevät si- • * 35 toutumaan vasta-aineisiin, jotka on synnyttänyt vieras- 9 102834 isäntään viety proteiini. Monissa tapauksissa Cys-tähteet edustavat osaa peptidiepitoop(e)ista, joka tunnistaa vasta-aineet ja sitoutuu niihin. Suojaamalla Cys-tähteet peptidien synteesin ajaksi estetään peptidien hapettavien 5 muotojen kehittyminen ja parannetaan peptidin immunologista reaktiivisuutta mitattuna esim. kasvaneena herkkyytenä ja/tai spesifisyytenä.

Esillä olevan keksinnön mukaisissa peptideissä kys-teiinitähteet mainitussa sekvenssissä ovat kemiallisesti 10 modifioituja ollakseen reversiibelisti suojattuja reaktiolta, esim. hapettumiselta. Täten esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoisessa peptidissä on ainakin kaksi Cys-tähdettä, jotka myötävaikuttavat peptidin konformaati-oon, joka kykenee sitoutumaan natiivin proteiinin synnyt-15 tämiin vasta-aineisiin. Yleensä ainakin kaksi Cys-tähteis-tä kykenee muodostamaan molekyylin sisäisiä disulfidisil-toja. Molekyylin sisäisten siltojen muodostamiseksi Cys-tähteitä erottaa ainakin yksi aminohappotähde, tyypillisesti ainakin kaksi, ja tavallisemmin noin 3 - noin 15 tai 20 suurempi luku tähteitä. Tietyissä edullisissa suoritusmuo- I r « ' doissa Cys-tähteitä erottaa noin 5-8 tähdettä. Muodosta- ·’ essaan ketjun sisäisiä disulfidisiltoja vierekkäiset Cys- ' tähteet tuottavat silmukan, tai syklisen peptidialueen, · - joka saattaa olla tärkeä parantuneelle immunologiselle ':": 25 reaktiivisuudelle.

Esillä olevan keksinnön mukaiset peptidit voidaan t valmistaa monin eri tavoin. Peptidit käsittävät yleensä noin 6 - noin 50 aminohappotähdettä, tyypillisemmin noin 6 • i « .··*. - noin 35 aminohappoa. Niiden suhteellisen lyhyen pituuden • * · 30 johdosta ne voidaan syntetisoida liuoksessa tai kiinteällä tuella tavanomaisten tekniikoiden mukaan. Katso esimerkik- *”**· si Stewart ja Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2.

:·. painos, Pierce Chemical Company, 1984; ja Tam et al..

|tii. J.Am.Chem. Soc. 105 (1983) 6442, jotka sisällytetään tähän 1 · 35 viitteiksi.

10 102834

Vaihtoehtoisesti hybridi-DNA-teknologiaa voidaan käyttää halutun peptidin ilmentämiseksi transformoiduissa eukaryoottisissa tai prokaryoottisissa isäntäsoluissa. Katso esimerkiksi Maniatis et ai., "Molecular Cloning: 5 A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982, joka sisällytetään tähän viitteeksi. Luonnollisesti tulee ymmärtää, että peptidillä tarkoitetaan sekvenssiä, jossa on ainakin noin 6 aminohappoa, tyypillisesti 10 tai enemmän, aina 200 aminohappoon tai yli asti, mukaan lukien 10 kokonaisia proteiineja. Ilmennetty peptidi voidaan sitten eristää ja suojata kuten tässä kuvataan.

Esillä olevien peptidien kysteiinitiolisivuketjun reversiibeli kemiallinen suojaus voidaan suorittaa pepti-disekvenssiä koottaessa peptidikoostumuksen kemiallisella 15 synteesillä. Kun kyseinen peptidikoostumus kootaan tavanomaisilla kiinteäfaasitekniikoilla, kemiallisesti reversiibeli suojaryhmä valitaan sietokyvyn mukaan olosuhteille, joita käytetään aminohappolisäyskierroksilla, sekä niille korkeille happopitoisuuksille, joita käytetään 20 peptidin lohkaisemiseksi kiinteäfaasihartsista. Useista • · « ' käytettävissä olevista tiolin suojaryhmistä jonkin nimen- • omaisen synteesin valinta riippuu todennäköisesti synteti- • soitavan peptidin rakenteesta sekä muiden syntetisoitavien f · ·· suoja- tai salparyhmien luonteesta, sekä siitä, mikä ni- 'i”i 25 menomainen reagenssi valitaan peptidin lohkaisemiseksi :*·*: hartsista. Suojaryhmiä, jotka sopivat käytettäviksi esillä olevassa keksinnössä, ovat esimerkiksi mainittuihin kui-tenkaan rajoittumatta asetamidometyyli (Stewart ja Young, • * · .···, suora) , 3-nitro-2-pyridiinisulfinyyli (Matsueda, et ai., 30 Int. J. Peptide Res. 28 (1986) 167; Ridge, R.J., et ai.,

Int. J. Peptide Res. 19 (1986) 490) ja difenyyli-4-pyridyy-limetyyli (Coyle, S., et ai.. J. Chem.Soc.Chem.Comm. 1976 980). Erityisen edullinen suoja on S-(N-etyylikarbamoyy- li). Katso St. Gutmann (Helv.Chim.Acta 49 (1966) 83) ja 35 Storey, H.T., et ai. (J.Amer.Chem.Soc. 94 (1972) 6170).

• V · 11 102834

Kukin edeltävistä julkaisuista sisällytetään tähän viitteeksi .

Vaihtoehtoisesti kysteiinitioliryhmät voidaan suojata reversiibelisti aminohapposekvenssin kokoamisen jäl-5 keen. Tässä suoritusmuodossa peptidi, joka voi olla puhdistettu tai muutoin rikastettu syklisiin tai polymeerisiin muotoihin, pelkistetään ennen peptidin suojausta sen varmistamiseksi, että disulfidisiltoja on läsnä vain harvoja jos lainkaan.

10 Tioli-suojatuista peptideistä poistetaan suojaryh- mät niiden käyttämiseksi immunologisissa määrityksissä. Peptidiä voidaan käyttää liuoksessa, joko vapaana tai sidottuna kantajaan, tai adsorboituna kiinteään faasiin. Kysteiinitioli-suoja voidaan poistaa ennen immobilisoin-15 tia, jos peptidi on määrä kiinnittää kiinteään faasiin, jolloin suojaryhmien poistaminen peptidistä ja sen hapettaminen suoritetaan liuoksessa. Keinot suojaryhmien poistamiseksi vastaavat suuressa määrin käytettyä nimenomaista suojaryhmää ja ovat alan taitajille hyvin tuttuja. Vaihto-20 ehtoisesti suojaryhmien poistaminen ja hapettaminen voi-

I I I

' f daan suorittaa immobilisoinnin aikana tai sen jälkeen.

: Hapetusolosuhteet valitaan siten, että ne suosivat mole- ' ' ' kyylin sisäisten disulfidisiltojen muodostumista, eli hy- « : ; · vin laimeat ja neutraalista heikosti alkaliseen olevat ""i 25 olosuhteet.

s*i'i HIV-, etenkin HIV-1-, vastaisten vasta-aineiden toteamiseksi ja/tai kvantitoimiseksi mallipeptidi, joka kykenee jäljittelemään HIV-l-glykoproteiinia, gp41:tä, • ( sisältää seuraavan peptidisekvenssin, jossa oligopeptide- • · · *· ^ 30 jä, joissa on ainakin noin 7 aminohappoa ja vähemmän kuin * * noin 50, sisältyy sekvenssiin: • · I « I • fl « f 4 i r i i • · 12 102834 (I) Y-Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-

Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys*-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys*-X; 5 jossa X on OH tai NH2, Y käsittää mahdollisesti läsnä olevia aminohappoja, jotka on lisätty peptidien reaktiivisuuden parantamiseksi, ja Cys* on kysteiinitähde, joka käsittää kemiallisesti reversiibelein keinoin suojatun tioli-10 ryhmän.

HIV-2-vastaisten vasta-aineiden toteamiseksi ja/tai kvantitoimiseksi mallipeptidit, jotka kykenevät jäljittelemään HIV-2-glykoproteiinia, gp36:ta, sisältävät seuraa-vat peptidisekvenssit, joissa oligopeptidejä, joissa on 15 ainakin noin 7 aminohappoa ja vähemmän kuin noin 50, si sältyy sekvenssiin: (II) 20 Y-Arg-Val-Thr-Ala-Ile-Glu-Lys-Tyr-Leu-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-

Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys*-X; tai » i i f * t I « « (III) I I f ( < 25 Y-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-

i Arg-Gln-Val-Cys*-X

• · *·· • · · ’·' ‘ joissa X on OH tai NH2, Y käsittää mahdollisesti läsnä ole via aminohappoja, jotka on lisätty peptidien reaktiivisuu- * · \V 30 den parantamiseksi, ja Cys* on kysteiinitähde, joka käsit-• · « : tää kemiallisesti reversiibelein keinoin suojatun tioli- ryhmän.

• t HTLV-I- ja HTLV-II-vastaisten vasta-aineiden to- teamiseksi ja/tai kvantitoimiseksi mallipeptidit, jotka • '· 35 kykenevät jäljittelemään HTLV-I- ja HTLV-II-transmembraa- • · 13 102834 niglykoproteiineja, jotka kummatkin on nimetty gp21:ksi, sisältävät seuraavia peptidisekvenssejä, joissa oligopep-tidejä, joissa on ainakin noin 7 aminohappoa ja vähemmän kuin noin 50, sisältyy sekvensseihin: 5 j (IV) (HTLV-I) Y-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Trp-Glu-Gln-Gly-Gly-Leu-Cys*-Lys-Ala-Leu-Gln-Glu-Gln-Cys*-X; ja 10 (V) (HTLV-II) Y-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Trp-Glu-Gln-Gly-

Gly-Leu-Cys*-Lys-Ala-Ile-Gln-Glu-Gln-Cys*-X; 15 joissa X on OH tai NH2, Y käsittää mahdollisesti läsnä olevia aminohappoja, jotka on lisätty peptidien reaktiivisuuden parantamiseksi, ja Cys* on kysteiinitähde, joka käsittää kemiallisesti reversiibelein keinoin suojatun tioli-20 ryhmän.

Huomattakoon, että esillä olevan keksinnön mukais-ten peptidien ei tarvitse olla identtisiä mihinkään nimen-omaiseen proteiini- tai retrovirussekvenssiin nähden, ku- fill , ten HIV-polypeptidisekvenssiin nähden, kunhan kyseiset • i t ;"t't 25 peptidit kykenevät jäljittelemään epitooppia ja siten tar- • · φ * joamaan jossain määrässä immunologista kilpailua natiivin proteiinin kanssa, esim. gp41-glykoproteiinin ainakin yh- • · t '·’ ' destä HIV-l-kannasta tai natiivin gp36-glykoproteiinin ainakin yhdestä HIV-2-kannasta kanssa.

• · \V 30 Esimerkiksi kiinnostavia peptidejä voidaan modi- • · · ;.· ·* fioida suorittamalla säilyviä tai tilapäisiä substituu- tioita peptideihin, tavallisesti vähemmän kuin 20 %, ta- • « <i<<; vallisemmin vähemmän kuin 10 % vaihdettavien aminohappojen lukumäärästä. Saattaa olla toivottavaa vaihdella yhtä tai : 35 useampaa nimenomaista aminohappoa natiivin proteiinin, •Mil I · 14 102834 kuten esimerkiksi erilaisten retroviruskantojen, erilaisten epitooppien tehokkaammaksi jäljittelemiseksi.

Tämän vuoksi kyseisiin polypeptideihin voidaan suorittaa erilaisia muutoksia, kuten insertioita, delee-5 tioita ja substituutioita joko säilyvästi tai tilapäisesti, silloin kun tällaisilla muutoksilla saataisiin mahdollisesti tiettyjä etuja niiden käytössä. Säilyvillä substituutioilla tarkoitetaan sellaisia yhdistelmiä kuten gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; 10 lys, arg; ja phe, tyr. Tavallisesti sekvenssi ei poikkea enempää kuin 20 %:lla sekvenssistä ainakin yhdessä HIV-kannassa lukuunottamatta tapausta, jossa lisää aminohappoja voidaan lisätä jompaankumpaan päähän "varren" saamiseksi, jonka välityksellä kyseiset peptidit voidaan esi-15 merkiksi immobilisoida kätevästi.

Lisäksi peptidisekvenssi voi erota luontaisesta sekvenssistä pää-NH2:n modifioinnissa asyloimalla, esim. asetyloimalla, tai tioglykolihappoamidoimalla, pääkarbok-syyli amidoimalla, esim. ammoniakilla, metyyliamiinilla 20 jne. Joissain tapauksissa nämä modifikaatiot saattavat tarjota kohtia tukeen tai muuhun molekyyliin kytkemiseksi.

Kuten edellä mainittiin, peptidin tai oligopeptidin C- ja/tai N-pää voidaan varustaa aminohappovarsilla. Jos . varsia on läsnä, ne ovat tavallisesti ainakin yksi amino- .']! 25 happo ja voivat olla 50 aminohappoa tai useampia, useammin « · · **' ; 1 - 10 aminohappoa, ja edullisesti vähemmän kuin 5 amino- happoa, synteesin helpottamiseksi. Varsilla voi olla eri- • · · ’·* ' laisia käyttötarkoituksia, kuten toimia ulokkeina, pepti dien kiinnittämiseksi kantajaan, peptidien immobilisoi- • · :,V 30 miseksi kiinteään faasiin jne. Käyttökelpoisten funktio- • ♦ « : naalisuuksien saamiseksi kytkemiseksi kantajaan, kiinteään faasiin tai korkeamman asteisten rakenteiden, kuten dimee-_ . rien, trimeerien tai muiden multimeerien muodostamiseksi, . aminohappoja kuten tyrosiini, kysteiini, asparagiinihappo, • ’·· 35 tai vastaavia, voidaan liittää C- ja/tai N-päässä olevaan • · 15 102834 varteen tai peptidiin. Epitooppiesityksen parantamiseksi erityisen kiinnostava on 1 - 10 aminohapon läsnäolo C- ja/tai N-päässä, edullisemmin 1-5 aminohapon, ja edullisimmin noin 1 - 3:n. Erityisen edullisia suoritus-5 muotoja tietyistä tässä kuvatuista peptideistä saadaan lisäämällä 3 aminohappoa varreksi, yleensä N-päähän, jolloin varren N-päätähde on edullisesti Cys. Mallisuoritus-muodoissa peptidin ja funktionaalisen pääryhmän väliset uloketähteet ovat Gly. Täten erityisen edullisessa pepti- 10 dissä on varsi, joka käsittää sekvenssin Cys-Gly-Gly, jossa Cys on N- tai C-päätähde. Cys-päätähde voidaan myös kytkeä disulfidisillan välityksellä ditio- tai tio-funk-tionalisoituun tukeen tai tioeetterisidoksella aktivoituun olefiinitukeen.

15 Peptidisekvenssejä, jotka ovat erityisen kiinnos

tavia HIV-l-vastaisten vasta-aineiden toteamiseksi, saadaan Cosandin, suora. määrittelemän peptidin 39 sekvenssistä. Peptidi 39GC koostuu 26 aminohaposta peptidistä 39, edellä, jolloin Y koostuu sekvenssistä Cys-Gly-Gly- ja X

20 koostuu -NH2:sta. Peptidi koostuu siten aminohapposekvens sistä :

• I I

Peptidi 39GC

25 Cys-Gly-Gly-Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-

Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys*-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys*-NH2 • · * · · « jossa Cys* edustaa kysteiinitähteitä, jotka on suojattu » t 30 kemiallisesti reversiibelein keinoin.

• · · V ·* Vastaavasti peptidisekvenssejä, jotka ovat erityi-

sen kiinnostavia HIV-2-vastaisten vasta-aineiden totea-. miseksi, saadaan peptidin 41-2-1 sekvenssistä, jolloin Y

koostuu sekvenssistä Cys-Gly-Gly- ja X koostuu -NH2:sta. i ’· 35 Peptidiä esittää siten aminohapposekvenssi: • · 102834

Peptidi 41-2-1GC

Cys-Gly-Gly-Arg-Val-Thr-Ala-Ile-Glu-Lys-Tyr-Leu-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-5 Cys*-NH2 jossa Cys* edustaa kysteiinitähteitä, jotka on suojattu kemiallisesti reversiibelein keinoin.

Peptidi 41-2-3GC koostuu sekvenssistä 41-2-3, 10 edellä, jolloin Y on sekvenssi Cys-Gly-Gly ja X on NH2, ja sitä esittää aminohapposekvenssi:

Peptidi 41-2-3GC

15 Cys-Gly-Gly-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys*-

Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys*-NH2 jossa Cys* edustaa kysteiinitähteitä, jotka on suojattu kemiallisesti reversiibelein keinoin.

20 Peptidisekvenssejä, jotka ovat erityisen kiinnos tavia HTLV-I-vastaisten vasta-aineiden toteamiseksi, saa-daan peptidin IV gp21-sekvenssistä. Edullisessa suoritus- muodossa, peptidissä 121-1GC1, Y koostuu sekvenssistä f"’I Cys-Gly-Gly- ja X koostuu -NH2:sta. Peptidiä esittää siten 25 aminohapposekvenssi: • · · • · · · 121-1GC1 • · · • « · i i < *

Cys-Gly-Gly-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Trp-30 Glu-Gln-Gly-Gly-Leu-Cys*-Lys-Ala-Leu-Gln-Glu-Gln-Cys*-NH2 • · · « · i I · · « jossa Cys* edustaa kysteiinitähteitä, jotka on suojattu « ( , kemiallisesti reversiibelein keinoin.

. ' Peptidisekvenssejä, jotka ovat erityisen kiinnos- j 35 tavia HTLV-II-vastaisten vasta-aineiden toteamiseksi, 17 102834 saadaan peptidin V gp21-sekvenssistä. Edullisessa suoritusmuodossa, peptidissä 221-1GC1, Y koostuu sekvenssistä Cys-Gly-Gly- ja X koostuu -NH2:sta. Peptidiä esittää siten aminohapposekvenssi: 5 221-1GC1

Cys-Gly-Gly-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Trp-Glu-Gln-Gly-Gly-Leu-Cys1-Lys-Ala-Ile-Gln-Glu-Gln-10 Cys1-NH2; jossa Cys1 edustaa kysteiinitähteitä, jotka on suojattu kemiallisesti reversiibelein keinoin. Huomattakoon, että huomattavan sekvenssihomologian johdosta tässä kuvattujen 15 HTLV-I- ja HTLV-II-peptidien välillä, peptidien välillä on odotettavissa jonkin verran ristireagointia.

Immunologisen määrityksen muoto, jossa esillä olevan keksinnön mukaan valmistettuja peptidejä käytetään, riippuu siitä, onko määrä määrittää vasta-aine vai anti-20 geeni. Alalla tunnetaan hyvin immunologisen määrityksen muotoja, jotka on suunniteltu vasta-aineen tai antigeenin : toteamiseksi. Kuitenkin ennen näytteen saattamista rea- j goimaan peptidin kanssa tai sen tapahtuma-ajankohtana ke- » M « . .·. miallinen suojaus poistetaan peptidistä ja suojaryhmiä : .·. 25 vailla olevaa peptidiä inkuboidaan olosuhteissa, jotka • · · ”^1 johtavat disulfidisiltojen muodostukseen. Määritysmuo- ... doissa, joissa peptidi on immobilisoitu kiinteään faasiin, • · · ’·1 1 peptidin kysteiinitähteistä voidaan poistaa suojaryhmät liuoksessa olosuhteissa, jotka johtavat molekyylin sisäis- • · 30 ten disulfidisiltojen muodostukseen, ennen immobilisointia

M

V · tai sen jälkeen.

....: Peptidikoostumuksia voidaan käyttää leimaamattomina • · tai leimattuina riippuen niiden käytöstä. (Leimalla tarkoitetaan molekyyliä, joka tuottaa suoraan tai epäsuorasti • · " 35 todettavan signaalin). Voidaan käyttää erilaisia leimoja, « 18 102834 kuten radionuklideja, entsyymejä, fluoresoivia aineita, kemiluminoivia aineita, entsyymisubstraatteja, -kofakto-reita tai -inhibiittoreita, hiukkasia, esim. magneettisia hiukkasia, ligandien ja reseptorien yhdistelmiä, esim.

5 avidiinia ja biotiinia, tai vastaavia. Lisäksi polypepti-dejä voidaan modifioida eri tavoin niiden sitomiseksi johonkin pintaan, esim. mikrotiitterilevypintaan, lasi- tai lateksihelmiin, putkiin, suodattamiin, kromatografisiin pintoihin, esim. paperiin, selluloosaan, silikageeliin, 10 tai vastaaviin. Nimenomainen tapa, jolla peptidejä voidaan liittää toiseen yhdisteeseen tai kiinteäfaasipintaan, on tavanomainen, ja sitä on esitelty runsaasti kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisut nrot 4 371 515; 4 487 715; ja niissä mainitut patenttijulkai-15 sut. Tällaisiin tarkoituksiin käytetään yleisesti p-male-imidobentsoehapon, p-metyyliditiobentsoehapon, maleiini-happoanhydridin, meripihkahappoanhydridin, glutaarialdehy-din, heterobifunktionaalisten ristikytkijöiden ja vastaavien kaltaisia reagensseja.

20 Erilaisia määritysjärjestelyjä voidaan käyttää joko retroviraalisten proteiinien vastaisten vasta-aineiden tai itse retroviraalisten proteiinien läsnäolon toteamiseksi. ·; Peptidiä voidaan käyttää leimattuna reagenssina, jolloin lll| ; leima tarjoaa todettavan signaalin. Vaihtoehtoisesti pep- I I · : .·. 25 tidi voidaan immobilisoida joko suoraan tai epäsuorasti • · ·

Ml · ..... pintaan, jolloin peptidin vastainen vasta-aine näytteessä • · ... sitoutuu peptidiin pinnalla. Peptidiin sitoutuneen ihmis- • · * • · · * vasta-aineen läsnäolo voidaan sitten todeta käyttämällä ksenogeenistä vasta-ainetta, joka on spesifinen ihmisimmu- • · · *·*.* 30 noglobuliinille, normaalisti sekä ihmis-IgG:lie että ih- ·♦· V : mis-lgM:lle, tai leimattua proteiinia, joka on spesifinen immuunikomplekseille, esim. Rf-tekijä tai S_^ aureus -pro- ____: teiini-A.

* ·

Voidaan käyttää erilaisia heterogeenisiä menette- • · ’ " 35 lyjärjestelyjä, joko kilpailevia tai ei-kilpailevia. Pep- « 19 102834 tidi voidaan sitoa pintaan tai tukeen ja antaa leimatun vasta-aineen kilpailla vasta-aineen näytteessä kanssa rajoitetusta määrästä sidottua peptidiä. Tukeen sitoutuneen leiman määrä olisi verrannollinen kilpailevan vasta-aineen 5 määrään näytteessä.

Vasta-aine voitaisiin sitoa tukeen ja yhdistää näyte leimattuun peptidiin. Reaktioseos saatettaisiin kosketuksiin sidotun vasta-aineen kanssa, minkä jälkeen tukeen sitoutuneen leiman määrä olisi verrannollinen sa-10 mansukuisen vasta-aineen määrään näytteessä.

Ksenogeeninen anti-ihmisvasta-aine, esim. IgG:n ja IgM:n (immunoglobuliineja) Fc:n vastaisia vasta-aineita, voitaisiin sitoa tukeen. Näyte saatettaisiin kosketuksiin immunoglobuliinien ja leimatun peptidin kanssa, jolloin 15 tukeen sitoutuneen leimatun peptidin määrä osoittaisi sa-mansukuisten vasta-aineiden läsnäoloa.

Esimerkki määritystekniikasta on immuunikonsen-troinnin, esim. suodatuksen, käyttö, jolloin kyseinen peptidikoostumus tai sen konjugaatit adsorboidaan kiin-20 teään faasiin, esim. lateksihelmiin, joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti. Näytettä, biologista nestenäytet-: : : tä, esim. sylkeä, virtsaa, selkäydinnestettä, verta, j· plasmaa tai seerumia, voidaan esikäsitellä laimentamalla • · · t . määritysväliaineeseen, joka on tavallisesti vesipitoinen : 25 puskuroitu väliaine, jossa käytetään yhtä erilaisista • « I # puskureista, kuten fosfaatti, Tris tai vastaava, minkä · ... jälkeen se yhdistetään antigeenillä päällystettyihin la- I I · • # · • teksihelmiin astiassa, jossa on suodatinmembraani, ja annetaan kulua riittävän ajan kompleksimuodostukseen pepti- • · · *.·.* 30 di(e)n ja mahdollisten samansukuisten vasta-aineiden • · · ·.· · näytteessä välillä. Supernatantin annetaan kulkea suodat- timen läpi ja suodatin, jolle päällystetyt helmet on im-: mobilisoitu, pestään ei-spesifisesti sitoutuneiden pro teiinien poistamiseksi.

• · * »li t « » 20 102834

Toteamisessa käytetään leimattua spesifistä sitou-tumisproteiinia, joka sitoutuu spesifisesti kompleksiin. Immunologisesti reaktiiviseen membraaniin voidaan lisätä ksenogeenista vastaseerumia ihmisimmunoglobuliinille, 5 etenkin anti-ihmis-IgG:tä ja -IgM:ää, sopivasti puskuroidussa väliaineessa. Ksenogeeninen vastaseerumi on normaalisti leimattu todettavalla leimalla, esim. entsyymillä tai radionuklidilla. Vastaseerumin asemesta voidaan käyttää immuunikompleksille spesifisiä proteiineja, esim. 10 aureus -proteiini-A:ta. Leima voidaan sitten todeta.

Esimerkiksi entsyymin kyseessä ollen ei-spesifisesti sitoutuneen entsyymileiman poistamisen jälkeen lisätään ke-hitysliuos. Kehitysliuos sisältää entsyymisubstraattia ja mahdollisesti entsyymikofaktoreita, kromogeeneja jne., 15 jotka reagoidessaan muodostavat värillisen tai fluoresoivan tuotteen, joka voidaan todeta kolorimetrisesti tai vastaavasti fluorometrisesti.

Seuraavat esimerkit esitetään havainnollistamis-eikä rajaustarkoituksessa.

20 Esimerkki 1

Tioli-ei-suojatuilla peptideillä todetaan Hiv-l- ja : HIV-2-vastaisia vasta-aineita

Peptidien synteesi

« « I I

. .·, Peptidin 39 johdannaisia koottiin kytkemällä sar- • * f : .·, 25 jassa t-butyylioksikarbobyyli-suojattuja aminohappoja • * · 0,40 millimooliin p-metyylibentshydryyliamiinihartsia • i ... (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Aminohappojen • · · ·* ’ sivuketjut oli suojattu tavanomaisilla bentsyylipohjaisil- la ryhmillä. Tryptofaani oli suojattu formyyliryhmällä. ·.*.* 30 Haluttaessa kysteiinitähteen kemiallisesti reversiibeli

• M

: suojaus tämä suoritettiin käyttämällä etyylikarbamoyyli- suojausta ja kytkeminen suoritettiin käyttämällä tavan- • ψ lllt>· omaista hydroksibentsotriatsoliesterikemiaa kuten käyte- • tään glutamiinille tai asparagiinille.

• · · '•'Il • « 21 102834 N-t-butyylioksikarbonyyli-S-etyylikarbamoyylikys-teiini valmistettiin kuten ovat kuvanneet St. Gutmann sekä Storey et ai., supra. Suppeasti 15,3 ml trifluorietikka-happoa lisättiin tipoittain seokseen, jossa oli 24,2 g 5 L-kysteiiniä (vapaa emäs) ja 200 ml dimetyyliformamidia (DMF) 0 °C:ssa samalla jatkuvasti sekoittaen. Sitten lisättiin tipoittain etyyli-isosyanaattia (17,8 ml) ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan. Saatu seos haihdutettiin tyhjössä kuiviin ja jäännös liuotettiin 10 180 ml:aan vettä. Kaksi erää eetteriä (100 ml), jotka oli jäähdytetty 0 °C:seen, käytettiin vesiliuoksen pesussa ja pH säädettiin 7,0:ksi lisäämällä natriumhydroksidia. Lisättiin absoluuttista etanolia (550 ml) ja tuotteen annettiin kiteytyä yön yli 4 °C:ssa. Pesemällä kiteinen kiinteä 15 aine kylmällä 20 % etanoli/vedellä ja eetterillä ja sitten suodattamalla saatiin 18,9 g S-etyylikarbamoyylikysteii-niä.

N-t-butyylioksikarbonyylijohdannaisen valmistamiseksi 23 g kiinteää di-t-butyylidikarbonaattia lisättiin 20 hitaasti kiivaasti sekoitettuun seokseen, jossa oli 18,9 g S-etyylikarbamoyylikysteiiniä, 180 ml dimetyylisulfoksidia ja 16,4 ml di-isopropyylietyyliamiinia. Seosta sekoitet- j. tiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen li- . sättiin 400 ml jäävettä sekä 100 ml kyllästettyä natrium- : ,·, 25 kloridiliuosta. Kloorivetyhappoa lisättiin seoksen pH:n * * ’''tj säätämiseksi 2,0:ksi ja vesiseos pestiin kahdella 200 ml:n • · ... erällä etyyliasetaattia. Saadut orgaaniset uutteet yhdis- • · t • * tettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännös uudel- leenkiteytettiin etyyliasetaatti/heksaanista, minkä jäi- • 4 \V 30 keen se uudelleenkiteytettiin 20 % etanoli/vedestä. Saa- • · · V : tiin 19,4 g:n saanto N-t-butyylioksikarbonyyli-S-etyyli- ....: karbamoyylikysteiiniä.

• ·

Lopputuote osoitettiin homogeeniseksi ohutlevykro- • t • matografisesti silikageelissä käyttäen kloroformi/etikka- : ’·· 35 happo- (15:1) liuotinta; Rf = 0,25. Tuotteen sulamispiste 22 102834 oli 144 - 146 °C, joka vastaa aiemmin raportoitua 139 -140 °C (Storey, supra).

Valmiista peptideistä poistettiin suojaryhmät ja ne lohkaistiin hartsista tavanomaisella korkea-HF-menettelyl-5 lä tai alhainen-korkea-HF-menettelyllä Tamin et ai. mukaan (J.Amer.Chem.Soc. 105 (1983) 6442). Peptidi uutettiin hartsista 50-%:isessa etikkahapossa ja sillä suoritettiin geelikromatografia-ajo 20-%:ista etikkahappoa käyttäen G-25-Sephadex-geelissä. Peptidiä sisältävät fraktiot 10 yhdistettiin pooliksi ja kylmäkuivattiin.

Immunologinen reaktiivisuus

Peptidin 39 ja sen analogien immunologista reaktiivisuutta testattiin koeputkimäärityksellä, jolloin peptidit immobilisoitiin adsorboimalla tai kovalenttisesti 15 sitomalla lateksihelmiin.

Peptidin 39GC ja suojaryhmiä vailla olevan peptidin 39GC adsorptio lateksihelmiin suoritettiin pesemällä ensin helmet (5 mg, IDC, Interfacial Dynamics Corporation, Portland Oregon, 1 pm:n halkaisija) tislatulla vedellä, 20 minkä jälkeen ne uudelleenlietettiin 0,5 ml:aan 0,1 M He-pes-puskuria, pH 7,4, kiivaasti sekoittaen. Laimennettua ’ I f V ' peptidiä 4 mg/ml 6 M GuHCl-varastoliuoksesta lisättiin pestyihin helmiin (25 - 200 pg peptidiä) 550 pl:n loppu-: :** tilavuuteen. Seosta sekoitettiin kiivaasti 30 sekunnin \ 25 ajan, minkä jälkeen sekoitettiin pienemmällä teholla yön ··· i ....: yli. Yön yli jatkuneen inkuboinnin jälkeen 500 pl tislat- • · ··. tua vettä lisättiin ja helmet otettiin talteen sentrifu- • * · w · · goimalla. Helmet pestiin 1 ml :11a tislattua vettä kahdes-. . ti, minkä jälkeen ne lietettiin 100 pl:aan tislattua vettä 30 ja lisättiin 100 pl 0,5 N NaOH-liuosta sekoittaen välittö- • t « ** ' mästi kysteiinitähteiden suojaryhmien poistamiseksi adsor- boidusta peptidistä. Suojaryhmien poisto keskeytettiin ;..j lisäämällä 1 ml 0,25 N Hepes-puskuria, pH 7,4.

,,· Peptidi/helmi-liuosta hapetettiin ilmassa yön yli " 35 huoneenlämpötilassa. Peptidi/helmi-liuokseen lisättiin 23 102834 kaliumferrisyanidia hapetuksen päättämiseksi. Putken sisältö sentrifugoitiin ja helmet pestiin 3 kertaan 1 ml:11a tislattua vettä. Peptidi/helmi-kompleksia voidaan käyttää välittömästi tai se voidaan varastoida vesilietteinä 5 4 °C:seen aina 6 kuukauden aikajaksoiksi ilman merkittävää reaktiivisuuden menetystä.

Peptidi 39, jossa X on -OH, Y on -NH2 ja kysteii-nitioliryhmät eivät ole EC-suojattuja, adsorboitiin la-teksihelmiin lisäämällä 0,1 ml peptidin 39 2 mg/ml pepti-10 divarastoliuosta 6 M guanidiini-HCl:ssä pestyihin latek-sihelmiin (jotka valmistettiin kuten edellä), jotka oli uudelleenlietetty 0,9 ml:aan 0,2 M Tris-puskuria, pH 8,0. Peptidilateksihelmilietettä inkuboitiin yön yli 45 °C:ssa vesihauteessa. Inkuboinnin jälkeen helmet otettiin talteen 15 sentrifugoimalla ja pestiin kerran 0,01 M PBSrssä, pH 7,0.

Peptidillä päällystetyt helmet voidaan salvata tarvittaessa ei-spesifisen sitoutumisen eston helpottamiseksi lisäämällä 20 μΐ päällystettyjen helmien 0,84-%:ista (w/v) lietettä 1 ml:aan l-%:ista nautaseerumialbumiini- (BSA-) 20 liuosta ja sekoittamalla kiivaasti. Helmet otettiin talteen sentrifugoimalla ja supernatantti poistettiin. Pesu-vaiheet toistettiin sitten kahdesti.

'' Testattava seerumi tai plasma laimennettiin 1:80 : näytelaimennuspuskuriin (2,5 % (w/v) rasvatonta maitojau- • « i ; 25 hetta, 15 miljoonaosaa Kathon CG -valmistetta, 0,01 % ··# · vaahdonestoainetta A 0,01 M natriumfosfaattiliuoksessa, • · .··. pH 7,2, 0,15 M natriumkloridi), ja 100 μΐ lisättiin sai- • · ♦ vatun peptidin ja lateksihelmien konjugaattiin sekoittaen . , vortex-sekoittimella. Näytettä inkuboitiin peptidi/latek- • · · *;*·* 30 sihelmi-konjugaatilla 15 minuutin ajan huoneenlämpötilas- * « « ’·* * sa, minkä jälkeen lisättiin 0,9 ml pesuliuosta (0,05 % a ·;··· Tween 20 -valmistetta Tris-suolaliuoksessa, 1 mM magne- •.j siumkloridi), sekoitettiin vortex-sekoittimella ja sent- rifugoitiin peptidi/helmi-konjugaatin ottamiseksi talteen.

• " 35 Peptidi/helmi-konjugaatti pestiin taas ja otettiin talteen » i * i » 24 102834 sentrifugoimalla ja 100 μΐ 1:100-laimennosta anti-ihmis-IgG,A:sta ja M-alkalinen fosfataasi -konjugaatista lai-mennuspuskurissa lisättiin 15 minuutiksi huoneenlämpötilassa. Peptidi/helmi-konjugaatti pestiin jälleen kuten 5 edellä.

Peptidien immunologinen reaktiivisuus todettiin epäsuorasti alkalisen fosfataasin aktiivisuudesta. Ent-syymipuskuria (0,8 ml, 0,1 M Tris-HCl/0,1 M NaCl/5 mM MgCl2, pH 9,5) lisättiin, minkä jälkeen lisättiin 100 μΐ 10 substraattia (9 mg p-nitrofenyylifosfaattia entsyymipus- kurissa). Substraattia inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä 100 μΐ 3 N natriumhydroksidiliuosta. Helmet pelletoitiin sentrifugoimalla ja supernatantin absorbanssi mitattiin 15 spektrofotometrillä 405 nmrssä. Peptidit 39GC ja suojaryh- miä vailla oleva 39GC osoittivat huomattavaa parannusta peptidiin 39 verrattuna tässä määritysmuodossa.

Vaihtoehtoisesti peptidit immobilisoitiin kova-lenttiseti lateksihelmiin karboksyylipään välityksellä. 20 Karboksyylipään konjugoinnissa käytettiin peptidi 39 -analogia nimeltä 39-1, joka koostuu seuraavasta sekvens-: : sistä: i «II, ; .'. Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-

I I I

: 25 Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys*-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys*-Thr- «M ·

Gly-SH

• ·

• M

! · · • · · ’ Kysteiinitähteet suojattiin etyylikarbamoyyliryh millä ja peptidi syntetisoitiin kuten edellä kuvattiin.

• · · *·'·* 30 Valmis peptidi lohkaistiin kiinteästä faasista käyttäen ··· V· 90 % fluorivetyhappo/10 % anisolia 0 °C:ssa tyhjössä sa- maila sekoittaen. Fluorivetyhappo haihdutettiin pois ja ; jäännös pestiin etyyliasetaatilla, minkä jälkeen epäpuhdas * · peptidi liuotettiin 6 M Gu-HCl/0,4 M kaliumfosfaattiliuok- • t ! *’ 35 seen. Raakapeptidi sitrakonyloitiin käyttäen Blaken et 25 102834 ai. menettelyä (Int.J.Peptide Res. 17 (1981) 273;

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78 (1981) 4055, jotka molemmat julkaisut sisällytetään tähän viitteiksi), minkä jälkeen suoritettiin geelisuodatus käyttäen ammoniumbikarbonaat-5 tipuskuria. Saatu peptidi, 39-IX, koostui aminopäästä ja lysiinitähteistä, jotka oli sitrakonyloitu, formyyli-tryp-tofaanista, etyylikarbamoyyli-kysteiineistä ja C-päätio-glysiinitähteestä.

Peptidi 39-IX konjugoitiin vapaisiin aminoryh-10 miin pentalysiineissa, jotka oli konjugoitu karboksy-loituihin lateksihelmiin (Seradyne, 1,1 pm:n halkaisija, 0,01 mekv./g) karbodi-imidiaktivaatiota käyttäen. Helmi-lietenäyte (0,3 ml) sentrifugoitiin helmien ottamiseksi talteen. Helmet pestiin kerran tislatulla vedellä, otet-15 tiin talteen ja lietettiin liuokseen, jossa oli H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-amidia vedessä. pH säädettiin välille 5,0 - 5,5, minkä jälkeen lisättiin l-etyyli-3-(3-dimetyyliamino-propyyli)karbodi-imidi (EDC). Helmiä seisotettiin yön yli, minkä jälkeen ne otettiin talteen ja pestiin tislatulla 20 vedellä kuten edellä.

Puolta saaduista helmistä käsiteltiin seoksella, jossa oli 27 pg/mg peptidi-39-lX-helmiä vesiliuoksessa, • · « jossa oli hopeanitraattia ja 0,1 M N-hydroksisukkinimidiä, pH:ssä 7,4 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Helmet pes- • · · 25 tiin 0,2 M natriumsyanidiliuoksella ja varastoitiin etik- • · · ··· | kahapon 15-%:iseen vesiliuokseen yön yli sitrakonyyliryh- ’ * mien poistamiseksi. Etyylikarbamoyyli- ja formyylisuoja- • · · * ryhmät poistettiin käsittelemällä nopeasti 0,2 N natrium- hydroksidiliuoksella. Kysteiinitähteiden annettiin hapet- :V: 30 tua ilmassa yön yli, minkä jälkeen ne saatettiin reagoi- maan kaliumferrisyanidin kanssa täydellisen hapettumisen m ’ . varmistamiseksi.

• t Jäljellä olevia pentalysiini-konjugoituja lateksi-helmiä käsiteltiin samalla tavalla kuin edellä paitsi, v · 102834 26 ettei hopeanitraattia lisätty. Saadut helmet toimivat sokeana kokeena vertailua silmällä pitäen.

Peptidi 39 -johdannaisia immobilisoitiin samoin kovalenttisesti aminopään välityksellä karboksyyli-modi-5 fioituihin lateksihelmiin (Polysciences) käyttäen karbodi-imidiaktivaatiota. 8 mg lateksihelmiä sijoitettiin mikro-fugiputkeen ja lisättiin 0,5 ml tislattua vettä. Helmet otettiin talteen sentrifugoimalla ja supernatantti poistettiin. Aktivointi suoritettiin lisäämällä 0,5 ml 0,2 M 10 EDC-liuosta (38,2 mg/ml) ja 0,1 M N-hydroksisukkinimidi-liuosta (22 mg/ml) ja reaktion annettiin kestää 90 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pyörösekoittimella sekoittaen. Aktivoidut helmet otettiin talteen kuten edellä ja noin 50 μΐ lukuunottamatta supernatantti kokonaisuudessaan 15 poistettiin. Pelletti dispergoitiin ja 250 μΐ 1 M Hepes-puskuria, pH 7,5, joka sisälsi vaihtelevia pitoisuuksia peptidiä 39, lisättiin (190 - 760 pg). Peptidin annettiin reagoida aktivoitujen helmien kanssa yön yli huoneenlämpö-tilassa samalla pyörösekoittimella sekoittaen. Helmet 20 otettiin talteen kuten edellä ja pestiin 0,1 M Hepes-pus-kurilla, pH 7,5. Kaksi pesua lisää suoritettiin käyttäen l-%:ista BSA-liuosta Tris-suolaliuoksessa (0,1 M, pH 7,4) ja peptidi/lateksi-helmet uudelleenlietettiin 0,5 ml:aan . 1 % BSA/Tris-suolaliuosta.

· 25 Vaihtoehtoisesti N-pää immobilisoitiin kovalentti- • · « *’* * sesti muodostamalla tioeetterisidos. Peptidi 39GC konju- tmm" goitiin NH2-modifioituihin lateksihelmiin (Pandex, Munde- • · · *·* lein, IL). 5 mg helmiä pestiin kerran tislatulla vedellä ja uudelleenlietettiin 200 pl:aan 0,1 M Hepes-liuosta, *.*.· 30 pH 7,4. N-sukkinimidyyli-4-(N-maleirnidometyyli )syklohek- V · saani-l-karboksylaattia (SMCC, 100 μΐ 1 mg/100 μΐ -liuosta DMF:ssä) lisättiin helmilietteeseen ja annettiin reagoida » ψ . 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa samalla jatkuvasti se- • · . koittaen. Aktivoidut helmet otettiin talteen kuten edellä, ; ’·· 35 pestiin kahdesti tislatulla vedellä ja kerran 0,1 M Hepes- • · 27 102834 liuoksella, pH 7,4, joka sisälsi pitoisuuden 5 mM EDTA. Valmistettiin 200 μΐ lietettä, jossa oli aktivoituja helmiä Hepes-puskurissa, ja lisättiin 200 pg peptidiä 39GC 100 pl:ssa 6 M GuHCl:ää. Konjugoinnin annettiin jatkua yön 5 yli huoneenlämpötilassa rotaattorissa. Peptidiin konjugoi-dut helmet otettiin talteen kuten edellä, pestiin 3 kertaan tislatulla vedellä ja lietettiin 0,84 %:n pitoisuuteen tislattuun veteen. Immunologinen ristireaktiivisuus testattiin kuten kuvattiin edellä.

10 Vaihtoehtoisia menetelmiä immunologisen ristireak- tiivisuuden testaamiseksi käytettiin niinikään. Yhdessä tällaisessa menetelmässä peptidejä 39 ja 39GC testattiin ELISA:11a kuten on aiemmin kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 629 783. Suppeasti, varastoliuokset peptideistä 39 ja 15 39GC valmistettiin 6 M Gu-HCl:ään. Työlaimennokset, jotka sisälsivät pitoisuudet 20 pg/ml ja vastaavasti 6 pg/ml, valmistettiin laimentamalla varastoliuosta 0,05 M karbo-naatti/bikarbonaattipuskuriin, pH 9,5. Mikrotiitterilevy-kuopat täytettiin 100 pl:lla peptidien työlaimennosta ja 20 jätettiin seisomaan yön yli huoneenlämpötilaan. Päällys-tysliuos poistettiin ja 300 μΐ salpausliuosta, supra, joka sisälsi 0,5 M etanoliamiinia, lisättiin 1 tunniksi huo-.j. neenlämpötilassa. Salpausliuos poistettiin ja levyt käy-

I I I I

. tettiin välittömästi tai niiden annettiin kuivaa ja ne : 25 varastoitiin silmällä pitäen myöhempää käyttöä.

• · · *’1 l Plasmanäytteitä laimennettiin (katso taulukko 1) ... näytelaimennuspuskuriin (edellä) ja 100 μΐ lisättiin yk- • · · *·1 ' sittäisiin kuoppiin. Näytteitä inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne poistettiin ja kuopat • · *.·.· 30 pestiin 6 kertaan 0,15 M NaCl-liuoksella, jossa oli 0,05 % • · · V · Tween 20 -valmistetta. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 30 mi- ....: nuutiksi 37 °C:ssa 100 μΐ vuohen anti-ihmis-Ig-piparjuuri- i(ti: peroksidaasikonjugaattia, joka oli laimennettu sitraatti- « . puskuriin, pH 7,0 ja jossa oli 1 % normaalia vuohiseeru- i '·’ 35 mia, minkä jälkeen kuopat pestiin 6 kertaan kuten edellä.

• · 102834 28 ELISA-määritys kehitettiin lisäämällä 100 μΐ/kuoppa subst-raattiliuosta (80 pg/ml tetrametyylibentsidiiniä, 0,0015 % vetyperoksidia sitraatti/fosfaattipuskurissa, pH 6,0) 30 minuutiksi huoneenlämpötilassa. Reaktiot keskeytettiin 5 lisäämällä 100 μΐ 1 N H2S04:ää kuoppaa kohden ja optisen tiheyden 450 nm:ssä suhde siihen 630 nm:ssä määritettiin automaattisella ELISA-lukijalla. Positiivisen tuloksen kynnysarvo asetettiin kohtaan 0,225 absorbanssiyksikköä keskimääräisen absorbanssin yläpuolella, joka saatiin 10 3 tunnetulle negatiiviselle näytteelle. Tuloksista taulu kossa 1 ilmenee, että peptidi 39GC kykeni tuottamaan positiivisen tuloksen korkeampana laimennoksena kuin peptidi 39.

Erillisissä kokeissa tioli-suojattu peptidi 39GC 15 osoitti määrityksissä merkittävästi alentunutta immunologista reaktiivisuutta verrattuna tioli-ei-suojattuun peptidiin 39GC. Samankaltaisia tuloksia todettiin HIV-2-pep-tidillä, 41-2-3GC.

20 Taulukko 1

Laimennuspaneelivertailu peptidistä 39 ja pepti-distä 39GC ELISA: 11a . . ' Diagnoosi Varaa sero- Peptidi Peptidi : 25 Käyte 39CC/39 positiivinen 39GC 39

* I

• · · ··· · PlasmaO (1:40) pos/pos kyllä 1,439 0,859

PlasmaO (1:80) pos/pos kyllä 1,010 0,547 «·· PlasmaO (1:160) pos/pos kyllä 0,742 0,351 • 30 PlasmaO (1:320) pos/neg kyllä 0.397 0,197

PlasmaO (1:640) neg/neg kyllä 0.279 0,128 β·β· PlasmaO (1:1280) neg/neg kyllä 0.165 0,078 • · • · PlasmaO (1:40) pos/pos kyllä 0.895 0.585 • « · • · PlasmaO (1:80) pos/neg kyllä 0,820 0,321 * # 35 PlasmaO (1:160) pos/neg kyllä 0.575 0.241 * ' PlasmaG (1:320) neg/neg kyllä 0,349 0,148

PlasmaG (1:640) neg/neg kyllä 0.179 0,092 , PlasmaG (1:1280) neg/neg kyllä 0.107 0,078 ; Kynnysarvo 0.348 0,341 1 29 102834

Esimerkki II

Immunologinen membraanikonsentraatiomääritys HIV-1-vastaisille vasta-aineille suojaryhmiä vailla olevia peptidejä käyttäen 5 Erilaisia tunnettuja seerumi- ja plasmanäytteitä seulottiin immunologisen ristireaktiivisuuden suhteen käyttäen modifioitua mikrohiukkasmäöritystä käyttäen esillä olevan keksinnön mukaisia aiempaa parempia menetelmiä ja koostumuksia. Kyseiset peptidikoostumukset im-10 mobilisoitiin lateksihelmiin ja suljettiin mikrohuokoiseen membraaniin absorbenttimateriaalille HIV-vastaisten vasta-aineiden määrittämiseksi ja/tai kvantitoimiseksi. Esimerkit tällaisista immunologisista määrityslaitteista ja -menetelmistä ovat kohteena US-patenttijulkaisuissa 15 4 633 901 ja 4 727 019, jotka molemmat sisällytetään tähän viitteiksi. Immunologisessa membraanikonsentraatiomääri-tyksessä käytetään 3 inkubointia, jolloin kokonaismääri-tysaika on 10 minuuttia. Testatut peptidit adsorboitiin lateksihelmiin edellä kuvatuilla menetelmillä.

20 Kukin näyte testattiin suodatusyksikössä, joka kä sitti 3 täplää nylonmembraanilla, jonka huokoskoko oli 1,2 pm. Yksi täplä käsitti testipeptidi/lateksihelmi-val-misteen, yksi täplä käsitti positiivisen menettelyverrokin • •Il . ja viimeinen täplä käsitti negatiivisen menettelyverrokin.

25 Peptidi/lateksihelmi-valmiste lietettiin 0,1 M

i Tris-puskuriin, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 0,01 M MgClz, 10 % sakkaroosia, 2 % vasikansikiöseerumia. Membraaneille ase- '·’ ‘ tettiin täplät peptidi/helmi-valmistetta 0,1 - 0,2-%:isena lietteenä. Negatiiviset menettelyverrokkitäplät käsitti- • · ·.·. 30 vät lateksihelmiä, jotka oli päällystetty adsorboimalla « · · ! BSA:lla, kun taas positiiviset menettelyverrokkitäplät käsittävät lateksihelmiä, jotka oli päällystetty adsor- fii). boimalla vuohen anti-ihmisimmunoglobuliineilla.

• « . Seerumi- tai plasmanäytteitä (40 μΐ) laimennettiin • *· 35 1:10 laimennuspuskuriin (10 % lämmöllä inaktivoitua nor- • · 30 102834 maalia vuohiseerumia, 1 % dekstraanisulfaattia, 0,2 %

Tween 20 -valmistetta, 2,5 % rasvatonta maitojauhetta, 15 miljoonaosaa Kathon CG -valmistetta, 0,005 % vaahdones-toainetta A, 20 mM natriumsitraattipuskurissa, pH 7,4).

5 Laimennettu näyte lisättiin membraanin pinnalle ja sen annettiin absorboitua täydellisesti. Näytteen lisäyksen jälkeen odotettiin 2 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 1 ml pesupuskuria (0,01 M Tris-puskuroitua suolaliuosta, pH 6,0, 0,05 M NaCl, 0,005 M MgCl2, 0,1 % natriumatsidia, 10 10 pg/ml nitrosinitetratsoliumia, 0,5 M kaliumtiosyanaat-

ti), jonka annettiin täysin absorboitua membraanin läpi. Membraaniin lisättiin noin 0,150 ml (3 pisaraa) vuohen anti-ihmis-lg-alkalinen fosfataasi -konjugaattia, joka oli laimennettu 10 mM fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, 15 pH 7,4, 0,2 % vuohigammaglobuliinia, .1 % nautaseerumial-bumiinia, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2, ja annettiin absorboitua täydellisesti. Membraani pestiin kahdesti kuten edellä (2 ml) ja noin 0,150 ml (3 pisaraa) substraattia (1 M

2-amino-2-metyyli-l-propanoli, pH 10,3, 5 mg/ml 3-indok-20 syylifosfaattia) lisättiin ja annettiin absorboitua täydellisesti. Noin 5 minuutin kuluttua noin 1 ml 0,5 M EDTA-liuosta, pH 7,4, käytettiin membraanin läpi reaktion keskeyttämiseksi. Kun pysäytysliuos oli täysin absorboi- . tunut, yksiköt luettiin visuaalisesti tai puolikvantita- 25 tiivisesti heijastumissuhteesta.

• · *

Tulos oli negatiivinen, jos ainoastaan positiivinen ... verrokkitäplä osoitti mitään merkkejä värin kehityksestä • · · • * eivätkä testitäplä ja negatiivinen verrokkitäplä osoitta neet lainkaan värin kehitystä. Positiivinen tulos oli saa- • · 1 • ♦ ♦ *.·.* 30 tu, jos testitäplä osoitti jonkin tasoista värin kehitty- • · · V · mistä (jäljistä -* 4+), positiivinen verrokkitäplä osoitti värin kehittymistä eikä negatiivinen verrokkitäplä osoit-tanut värin kehitystä. Testi katsottiin mitättömäksi, jos kaikki täplät osoittivat jossain määrin värin kehitystä, * · " 35 värin kehitystä ei esiintynyt positiivisessa verrokissa 3i 102834 tai jos negatiivinen verrokkitäplä osoitti missään määrin värin kehitystä.

Laaja valikoima positiivisia, negatiivisia, EIA-positiivisia/Western blot -epätyypillisiä ja immuuni-5 herkistettyjä näytteitä testattiin edullisella peptidi 39 -analogilla, peptidillä 39GC, testiantigeenina. Positiiviset näytteet osoittivat asteittaista reaktiivisuutta 0,5+ -+ 4+, jolloin kaikista päteväksi katsotuista testeis tä saatiin selvärajaisia värillisiä täpliä puhtaan valkoi-10 selle taustalle. Negatiivinen verrokki ei osoittanut lainkaan värin kehitystä ja positiivinen verrokki antoi värityksen noin 2+.

Taulukko 2 15 Yhteenveto tuloksista, jotka saatiin eri tyyppi sillä näytteillä, jotka testattiin immunologisella memb-raanikonsentraatiomäärityksellä käyttäen peptidiä 39GC antigeeninä 20 Luokka kpl pos./kokonais-lkm

Normaalit veripankkiluovuttajat 0/1187 · Western blot -neg./LAV-EIA-pos. 0/79 ,! Western blot p25 -neg./LAV-EIA-pos. 0/39 25 (epätyypillisiä 1) •tj/ Western blot p25 -pos. /LAV-EIA-pos. 0/170 J , (epätyypillisiä 2) • · · *** * Western blot -pos./LAV-EIA-pos. (opt.tih. < 1,5) 120/120 * · Western blot -pos./LAV-EIA-pos. (opt.tih. > 1,5) 29/29 .·:·. 30 Autoimmuunlnäytteetl 0/51

Sekundaarinen, epätyypillinen kuppaseerumi/HIV-neg. 0/26

Sekundaarinen, epätyypillinen kuppaseerumi/HIV-pos. 4/4 J J J Ongelmalliset HIV-I-seronegatiiviset näytteet2 0/72 '.t n = 1777 ...

*·| 35 1. Autoimmuuninäytteisiin lukeutui 11 astmapoti- ·:**: lasta, 11 Sjögrenin oireyhtymä -potilasta, 7 systeemistä punahukkaa sairastavaa potilasta, 4 selkärankareumapoti-lasta, 3 tuntematonta tilaa ja 15 sekalaista oireyhty- • " mää/sairautta.

• · 32 1 0 2 8 3 4 2. Ikteerisiä, lipeemisiä, baktereemisiä, askor-biinihapolla ja erilaisilla hyytymistä estävillä aineilla käsiteltyjä näytteitä.

Kyseisen keksinnön mukaisia erilaisia peptidikoos-5 tumuksia on testattu käyttäen joitakin edellä kuvattuja määritysmuotoja. Yhteenveto tuloksista esitetään seuraa-vissa taulukoissa. Taulukossa 3 esitetään tulokset vertailusta ELISA:n ja immunologisen membraanikonsentraatio-määrityksen peptidillä 39 ja kokovirus-ELISA:n välillä 10 epätyypillisillä näytteillä. Kymmenen 11 epätyypillisestä näytteestä antoi positiivisen testituloksen kokovirus-ELISA:lla, jolloin niitä ei vahvistettu positiivisiksi Western blot -määrityksellä. Kaikki todettiin negatiivisiksi käytettäessä peptidiä 39 immobilisoituna antigeeninä 15 sekä ELISA :11a että membraanikonsentraatioimmuunimäärityk-sellä.

Taulukossa 4 esitetään tulokset kokovirus-ELISA:sta sekä tulokset ELISA:sta ja membraanikonsentraatioimmuuni-määrityksestä peptidiä 39GC käyttäen sekä ELISA:sta pepti-20 diä 39 käyttäen kahdella serokonversiopaneelilla. Peptidi 39GC ja peptidi 39 antoivat positiivisen tuloksen aikai-semmin kuin kokovirus-ELISA. Peptidi 39GC antoi positiivi- « sen tuloksen aikaisemmin kuin peptidi 39 toisessa serokon-versiopaneelissa.

• · · • · · · • · • · · • · · • · « • · • · · • · · • · « · · • · · • · · • · » · I «( 102834

Taulukko 3

Vertailu entsyymiliitteisestä immuuniniääritykses-tä käyttäen peptidiä ja kokonaista virusta antigeeninä Western blot -määrityksessä epätyypillisillä seeruminäyt-5 teillä

Diagnoosi Varaa LAV Peptidi 39 Peptidi 39 Näyte LKV/peptidit seropoe. ELISA ELISA MCI1 10 Y34150 pos/neg ei 0.526 0.063 neg Z00132 neg/neg ei 0,307 0,003 neg H62111 ροε/neg ei 0,751 0,047 neg V45719 ροε/neg ei 0,581 0,048 neg Y49300 ροε/neg ei 0,523 0,048 neg 15 V44932 ροε/neg ei 0,617 0,068 neg G16211 pos/neg ei 0,387 0,027 neg G15694 pos/neg ei 0,367 0,078 neg Y40646 pos/neg ei 0,655 0,057 neg H63547 pos/neg ei 0,901 0,092 neg 20 Y38248 pos/neg ei 0,386 0,048 neg * Membraanikonsentraatioimmuunimääritys

Taulukko 4

Vertailevat tulokset käyttäen peptidiä antigeeninä 25 ELISA- ja membraanikonsentraatioimmuunimääritysmuodoissa kahdelle serokonversiopaneelille

^ '· Käyte- Varaa LAV Peptidi Peptidi MCI

* t

' 1 1 nuaero Diagnoosi seropos. ELISA 39GC 39 39GC

: 30

• · · I

BBI-1 negatiivinen ei 0,067 0,347 0,128 • · BBI-2 negatiivinen ei 0,075 0,317 0,129 • · · ·'· · BBI-3 pos/neg kyllä 0,180 0.842 0,514 1· BBI-4 positiivinen kyllä 0.858 1,105 0,632 + ♦ 35 BBI-5 positiivinen kyllä 1.164 1,757 1,098 ♦♦ • · · BBI-6 positiivinen kyllä 1,359 2,160 1,531 ♦1 • BBI-7 positiivinen kyllä 1.430 1.986 1,307 +♦ • 9 · ", BBI-S positiivinen kyllä 1.556 2.317 1,688 + ···· BBI-9 positiivinen kyllä 1,507 2,328 2,122 ♦♦♦ 4° Kynnysarvo 0.291 0,384 0,341 9 • · · 34 102834 BBI-20 negatiivinen ei 0,038 0,136 0,037 BBI-21 negatiivinen ei 0,055 0,156 0,053 BBI-22 pos/neg kyllä 0,057 0,450 0.244 ♦ BBI-23 pos/neg kyllä 0,123 0,890 0,540 ♦ 5 BBI-24 pos/neg kyllä 0,127 1,064 0,636 ♦ BBl-25 pos/neg kyllä 0,216 0.845 0.553 ++ BBI-26 pos/neg kyllä 0,259 0.852 0.445 +4 BBI-27 positiivinen kyllä 0,335 1,104 0,590 + + BBI-28 positiivinen kyllä 0,431 1,177 0,769 ♦♦ 10 BB1-29 positiivinen kyllä 0,718 2,085 1,566 ♦ ♦ BBI-30 positiivinen kyllä 0,837 2,214 1,871 *** BBI-31 positiivinen kyllä 0.798 2,207 1,812 ♦♦+ BBI-32 positiivinen kyllä 0,920 2,263 1,925 ♦♦+ BBI-33 positiivinen kyllä 0,833 2,277 1,961 ♦♦+ 15 BBI-34 positiivinen kyllä 0,728 1,622 1-363 ♦♦ + BBI-35 positiivinen kyllä 0,902 2,198 1,861 ♦ + + ' BBI-36 positiivinen kyllä 0,881 2,265 1.959 ♦♦♦ BBI-37 positiivinen kyllä 0,953 2,105 1.530 ++1

Kynnysarvo 0,291 0,384 0.341 20

Esimerkki III

HIV-2-vastaisten vasta-aineiden toteaminen käyttäen suojaryhmiä vailla olevia peptidejä Määritettiin immunologinen reaktiivisuus HIV-2-25 peptideille, jotka oli syntetisoitu käyttäen suojattuja kysteiinitioliryhmiä. HIV-2-peptidi 41-2-3 syntetisoitiin

f I I » I I

' kuten kuvattiin esimerkissä I, jolloin Cys-ryhmät oli suojattu ja N-päässä oli Cys-Gly-Gly, ja saatiin peptidi 41-2-3GC. EIA:t suoritettiin kuten on kuvattu edellä

• 30 käyttäen HIV-1- ja HlV-2-viruslysaatteja ja peptidejä 39GC

IM · (HIV-1) ja 41-2-3GC. Reaktiivisuus määritettiin laimennok-sille kahdesta HIV-2-positiivisesta seerumista, jotka oli- • a « vat F504282, joka saatiin newyorkilaisesta potilaasta, ja . . "GOM", joka saatiin Pasteur-instituutilta. Tulokset, jotka 35 esitetään taulukossa 5, osoittavat, että synteettiset pep- I I · "·] ’ tidit selvästi erottavat HIV-l:n ja HlV-2-:n toisistaan ja ?··: niillä saadaan varsinkin parempi spesifinen immunologinen ·· · reaktiivisuus verrattuna tuloksiin, jotka saadaan kokovi- .ruslysaatti-EIA-määrityksillä, • 1 i ( i 102834

Taulukko 5: HIV-2-positiivisista näytteistä val mistettujen laimennussarjojen reaktiivisuudet EIA:ssa 5 HIV—1— HIV-2- IIIV-1- HIV-2-

Laimennu· peptidi 39GO peptidi 41-2-3GC lysaatti lysaatti 10 sfellaise- „ 075 3 ,ooo ho* 2,026 1:S 0,049 3,000 0.494 1,808 1:10 0 042 3,000 S+mi' 1/687 1:20 0,037 3,000 0,170 1,405 1:40 0,035 2,828 0,101 1,182 1:80 0,033 2,107 0,072 0,876 1:160 0,040 1,441 0,046 0,597

1:320 0,031 0,941 0,039 S,.35Z

1:640 0,031 0,588 0,014 0,171

1:1280 0,039 0,302 MO MD

1:2560 0,030 0,180 MD MD

15 B* 1:2 0,052 3,000 0,839 2,111 1:4 0,037 3,000 0,510 1,953 1:8 0,040 3,000 fi+312 1.703 1:16 0,031 3,000 0,177 1,433 1:32 0,035 3,000 0,099 1,083 1:64 0,074 2,524 0,060 0.736 1:128 0,031 2,202 0,047 0j552 1:256 0,035 1,452 MD fif-llS! 1:512 0,040 0,811 HD 0,176 20 1:1024 0,037 0J571 HD 0,114 * A on seerumi potilaasta F504282, B on seerumi potilaasta 25 G0M.

* ND = ei määritetty.

’** * Viiva esittää kynnystä, jonka yläpuolella olevat arvot *>t* ovat positiivisia ja jonka alapuolella olevat katsotaan ‘ negatiivisiksi.

30 Ei-suojatun HIV-2-peptidin 41-2-3 immunologista • · ;,V reaktiivisuutta verrattiin suojaryhmiä vailla olevaan ϊΤ: muotoon, jossa oli Cys-Gly-Gly-jatke N-päässä (41-2-3GC), sekä HIV-2-kokoviruslysaattiin. EIA-määritykset suoritet- « · . tiin yleensä kuten on kuvattu edellä käyttäen vaihtelevia

I M M

, 35 laimennuksia HIV-2-positiivisia seeruminäytteitä. Tulokset • '<· edustaville seerumeille esitetään taulukossa 6.

r r · i * $ 36 102834

Taulukko 6: Valittujen HIV-2-seerumien reaktiivisuus suojaryhmiä vailla olevien ja ei-suojattujen HIV-2-peptidien ja HIV-2-viruslysaattien kanssa Näyte Laimennus__41-2-3GC_41-2-3_Lysa^tti_ 5 "GOM" 1ί2 3 , 000 2,239 2,113 1:4 3 r000 1,932 1,953 1:8 3.000 1,517 1,703 1:16 3 f 000 1,143 1,433 1:32 3,000 0,693 1,083 1:64 2,524 0,343* 0,736 1:128 2,202 0,228 0,552 1n 1:256 1,452 0,092 0f280 1:512 0,811 0,069 0,176 1:1024 0,571 0,058 0,114 "PIN” 1:2 3,000 2,082 1,336 1:4 3,000 1,695 1,035 1:8 2,596 1,154 0,834 1:16 1,940 0.607 0,711 15 1:32 1,209 0,369 0,387 1:64 0,582 0,182 0,188 1:128 0,368 0,123 0,147 1:256 0,186. 0,091 0,087 "SAMB" 1:2 3,000 1,535 . 1,047 1:4 3,000 1,089 0,968 9 1:8 2,854 0,659 0J7O8 1:16 2,710 0.433 0,485 1:32 2,112 0,239 0,398 1:64 1,400 0,121 0,289 1:128 0,834 0,081 0,144

1:256 0,404 ND* ND

"S” 1:2 3,000 2,208 1,855 . .·. 25 1:4 3,000 1,942 1,806 1:8 3,000 1,440 1,590 • 1:16 3,000 0,910 0,917 ’* : 1:32 2,632 0,581 0,647 1:64 2,155 0,273 0,455 1:128 1,442 0,159 0,289 1:256 0,725 0,089 0,157 30 1:512 0,516 0,061 0,103 • · _ • · · " — I — I.w - — -1 - — - ' -——I- -- ' —........ 1 ' ...... —” --- • » · • ·

Mi V · * ND = ei määritetty.

* Viiva edustaa kynnystä, jonka yläpuolella olevat arvot ovat positiivisia ja jonka alapuolella olevat katsotaan - 35 negatiivisiksi.

102834

Esimerkki IV

HTLV-I-vastaisten vasta-aineiden toteaminen suoja-ryhmiä vailla olevia peptidejä käyttäen

Erään alueen HTLV-I-transmembraaniglykoproteiinista 5 gp21 tunnistettiin vastaavan HIV-l:n ja HIV-2:n transmemb-raanialueita, ja olevan täten mahdollisesti immuunidomi-nantti. HTLV-I:n tunnetun aminohapposekvenssin nojalla valmistettiin synteettisiä peptidejä. Peptidit syntetisoitiin ja suojattiin yleisesti esimerkissä I esitettyjen 10 menettelyjen mukaan. Määritykset suoritettiin yleisesti kuten kuvattiin esimerkeissä I ja II. Tulokset esitetään taulukossa 6.

Taulukko 6: HTLV-I-peptidit, joiden reaktiivisuus 15 HTLV-I-vastaisten vasta-aineiden suhteen testattiin

Seeruminäyte

Peptidi"/sekvenssi___40359 0435 032EC1 121-1G1 H- QHRRGLDLLFWEQGGLC KALQEQC -NH2 jälkiä on 121-1GC1 1 1 H- CGG-QNRRGLDLLFWEQGGLC KALQEQC -NH, 3+ 1+

121-2G1 A

H- GLDLLFWEQGGLC KALQEQC -NH2 - 121-2GC1 H- CGG-GLDLLFWEQGGLC KALQEQC -lJn2 3+ 0 .5+ ·' ' ' 121-3G1 H- NRRGLDLLFWEQGGLC -NH2 - 121-3GC1 H- CGG-HRRGLDLLFWEQGGLC -NH2 3+ : ' 0 121-3EG1 . . H- C GG-NRRGLDLLFWEQGGLC -HH, ND - - : 121-iDi H-QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC-OH HD - -

i I

· f

• · I

• I t

Peptidien päällystystaso lateksimikrohiukkasilla oli . 30 50 yg peptidiä/5 mg helmiä/550 yl:n tilavuus.

*"·’ 1 Seeruminäytteet 40359 ja 0435 ovat HTLV-I-EIA-positiivi- * · · * siä verrokkiseerumeja, joita käytettiin laimentamat tornina; ;<·; 032EC1 on HTLV-I-EIA-negatiivinen verrokki.

* Merkitsee, että Cys-tähde oli suojattu synteesin aikana 35 etyylikarbamoyylisuojausta käyttäen.

38 102834

Tuloksia määrityksistä peptidillä 121-1GC1 verrattiin tuloksiin, jotka saatiin muilla HTLV-I/II-testeillä, kuten polymeraasiketjureaktiolla (PCR), radioimmuunisaos-tuksella (RIP), Western blot - (WB-) määrityksellä ja vi-5 ruslysaatti-EIA-määrityksillä. Peptidille 121-1GC1 käy tettiin esimerkissä II kuvattua menettelyä lukuunottamatta, että käytettiin kahta pisaraa näytteitä ja konjugaat-tia käytettiin 2x korkeampana pitoisuutena. Määritykset suoritettiin 10 seeruminäytteellä, joiden epäiltiin si- 10 sältävän HTLV-I- ja/tai HTLV-II-vastaisia vasta-aineita.

HTLV-II:n PCR-määritys suoritettiin yleisesti julkaisun "PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification", toim. H.A. Ehrlich, Stockton Press, N.Y., 1989, mukaan, joka sisällytetään tähän viitteeksi. Tulok-15 set esitetään taulukossa 7.

Taulukko 7: HTLV-I/II-määritysten vertailu käytettäessä suojaryhmiä vailla olevaa peptidiä 121-1GC1

Näyte- PCR EIA RIP WB

20 nro HTLV-II HTLV-I HTLV-I HTLV-I Status 121-1GC1 89379 + + + + + jälkiä 89365 + + - vw1 Ind# 0,5+ 39266 + + - vw Ind jälkiä 25 89430 + + - + Ind jälkiä • 1 : 89433 + + Ind 1+ *J‘15 89442 - + - Ind Ind jälkiä 89232 + + + + + jälkiä 89283 + + + + + 1 + ·1·1· 30 89359 + + + + + 1+ • · · 88002 • · · 12-97-854 * ’ Päällystystaso: 80 pg peptidiä/5 mg helmiä/550 pl:n tilavuus.

35 1 vw merkitsee hyvin heikkoa reaktiota.

iiu; 1 Ind on määrittelemätön status.

• · 39 102834

Muissa kokeissa seulottaessa HTLV-I-peptidiä erilaisissa muodoissa vastaan seerumipaneelia epäillyistä HTVL-I/II-positiivisista yksilöistä saatiin ei sitovia tuloksia verrattuna tuloksiin, jotka saatiin RIP:llä, 5 Western blot -määrityksellä ja kaupallisesti saatavana olevilla HTLV-I-EIA-määrityksillä. Jotkut näytteet, jotka olivat oletettavasti positiivisia tietyillä testeillä, olivat negatiivisia peptidillä 121-1GC1. Nämä tulokset saattavat johtua useista tekijöistä, mukaan lukien mah-10 dollisuudesta, että näytteet, jotka olivat negatiivisia peptidillä 121-1GC1 ja positiivisia muilla kriteereillä, sisälsivät vasta-aineita, jotka reagoivat pääasiassa viruksen ydinantigeenien kanssa eivätkä membraanin lävistävien glykoproteiiniantigeenien kanssa.

15 Vaikka esillä olevaa keksintöä on kuvattu jossain määrin yksityiskohtaisesti havainnollistaen ja esittäen esimerkkejä selkeyden ja ymmärtämisen edesauttamiseksi, on selvää, että tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan tehdä oheisten patenttivaatimusten puitteissa.

f i

I I I

• I I

• I I

• · • · · • · · · · · • · • · · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · · • f ·

V

m • # 1 I · • ·

Claims (14)

102834

1. Hapetettu peptidi, joka reagoi immunologisesti retroviruksen natiivin proteiinin vastaisten vasta-ainei- 5 den kanssa, tunnettu siitä, että peptidi on immo-bilisoitu kiinteään faasiin ja käsittää 7-50 aminohapon aminohapposekvenssin sisältäen ainakin 7 peräkkäistä aminohappoa seuraavista sekvensseistä

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, t u n - _ 35 n e t t u siitä, että Cys-tähteet on suojattu hapettumi-

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen peptidi, t u n -5 n e t t u siitä, että Cys-tähteet on suojattu hapettumiselta etyylikarbamoyylillä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi N-päässä Cys-tähteen, jota ei ole suojattu hapettumiselta.

4. I I I I 4i 102834 seita etyylikarbamoyylillä, asetamidometyylillä, 3-nitro- 2-pyridiinisulfinyylillä tai difenyyli-4-pyridyylimetyy-lillä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen peptidi, tun nettu siitä, että N-pään aminohapot käsittävät sekvenssin Cys-Gly-Gly.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että C-pään aminohappo on amidoitu.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tun nettu siitä, että Cys-tähteitä erottaa toisistaan noin 4-6 ei-Cys-tähdettä.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen peptidin käyttö peptidillä päällystetyn kiinteän faasin val-20 mistamiseksi retroviruksen natiivin proteiinin vastaisen vasta-aineen toteamiseksi ja/tai kvantitoimiseksi immuno-logisesti, jolloin syntetisoidaan jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen tiolilla suojattu peptidi, 25 suojattu peptidi immobilisoidaan kiinteään faasiin, « · · Σ.! ί kemiallisesti reversiibeli suojaus poistetaan immo- bilisoidusta peptidistä, ja • · · V · immobilisoitua peptidiä inkuboidaan olosuhteissa, jotka johtavat disulfidisidosten muodostumiseen. ;*·*' 30

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kysteiinitioliryhmät suoja-•. taan ennen peptidin synteesiä.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kiinteä faasi on lateksi, 35 piidioksidi, selluloosa, fluorihiili (vety)polymeeri, ny- 42 102834 Ion, polyakryyliamidi tai polystyreeni.

10 HIV-l-gp41 Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu- Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys, HIV-2-gp36

15 Arg-Val-Thr-Ala-Ile-Glu-Lys-Tyr-Leu-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg- Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys, HTLV-I-gp21 Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Trp-Glu-Gln-Gly-20 Gly-Leu-Cys-Lys-Ala-Leu-Gln-Glu-Gln-Cys, tai HTLV-II-gp21 Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Trp-Glu-Gln-Gly- Gly-Leu-Cys-Lys-Ala-Ile-Gln-Glu-Gln-Cys, 25 : jolloin peptidin sekvenssi käsittää ainakin kaksi Cys-täh- dettä, joita erottaa toisistaan ainakin noin kaksi, mutta i/. .* vähemmän kuin 20 ei-Cys-aminohappotähdettä ja joiden Cys- tähteiden tioliryhmät on suojattu hapettumiselta peptidin 30 valmistuksen aikana kemiallisesti reversiibeleillä ryhmil-lä, jotka kestävät hyvin hapanta pilkkomista ja altiste-• # taan sitten hapettaville olosuhteille, jotka johtavat di- sulfidisiltojen muodostumiseen.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että peptidin suojaus poistetaan olosuhteissa, jotka johtavat molekyylin sisäisten disulfi- 5 disidosten muodostumiseen, ja peptidi immobilisoidaan sitten kiinteään faasiin.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen peptidin käyttö HIV-l:n, HIV-2:n, HTLV-I:n tai HTLV-II:n vastaisten vasta-aineiden tai niiden antigeenien määrittä- 10 miseksi biologisesta näytteestä, jolloin biologinen näyte saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 8 kuvauksen mukaisesti valmistetun immobi-lisoidun peptidin kanssa olosuhteissa, jotka johtavat immunologisesti spesifiseen sitoutumiseen reaktioseoksen 15 muodostamiseksi, ja todetaan, onko immunologisesti spesifistä sitoutumista tapahtunut, jolloin immunologisesti spesifisen sitoutumisen toteaminen osoittaa, että mainittuja vasta-aineita tai antigeenejä esiintyy biologisessa näytteessä.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että immunologisesti spesifinen sitoutuminen todetaan erottamalla sitoutumatta jääneet aineosat immunologisesta reaktioseoksesta, reaktioseokseen lisätään leimattu vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan 25 reaktiotuotteen aineosaan, ja todetaan, sitoutuuko leimat- • · · ··· ί tu vasta-aine reaktiotuotteeseen.

* : *· 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, • ·· V ; tunnettu siitä, että erotus suoritetaan suodatta malla . • · • fr • · • · • · · • f · • · f • I f i ( I < 43 1 0 2 8 3 4