JP2001519800A

JP2001519800A - グループｏｈｉｖ−１ウイルスによる感染検出用の生物学的アッセイに有用な合成ペプチド

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Publication number: JP2001519800A
Application number: JP54245598A
Authority: JP
Inventors: シェネボー，デニ・マリー・ベルナール; デラニョー，ジャン−フランソワ・ユベール; ガデル，ステファーヌ・ジャン・グザヴィエ; リウニエ，フランソワ・イヴ
Original assignee: ビオ―ラド・パストゥール
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2001-10-23
Anticipated expiration: 2018-04-06
Also published as: CZ300927B6; CA2286344A1; AU740231B2; US7053175B1; NO994929L; BRPI9809078B8; KR20010006216A; CN1256695A; BR9809078B1; RU2184742C2; JP3560987B2; PT973802E; WO1998045323A1; TR199902757T2; EP0973802A1; ATE343590T1; DE69836265T2; CA2286344C; US7838001B2; AU7338698A

Abstract

(57)【要約】本発明は、グループＯＨＩＶ−１ウイルスによる感染を検出するための生物学的アッセイに使用されるペプチド、その製造方法、このペプチドを含有する組成物およびキット、ならびにこのペプチドを使用する生物学的アッセイに関する。

Description

【発明の詳細な説明】グループＯＨＩＶ−１ウイルスによる感染検出用の生物学的アッセイに有用な合成ペプチド本発明は、グループＯＨＩＶ−１ウイルスによる感染を検出するための生物学的試験に使用され得る合成ペプチド、その製造方法、このペプチドを含有する組成物およびキット、ならびにこのペプチドを使用する生物学的試験に関する。グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスは先行技術において公知である。特許ＥＰ０，３４５，３７５および特許出願ＥＰ０，６５７，５３２は、カメルーン人患者から単離されたＡＮＴ７０およびＡＮＴ７０ＮＡ単離物を記載している。より詳細には、これらの文献は、これらの単離物の溶解物またはタンパク質を含有する抗原および抗原性組成物、ゲノムＲＮＡに対応する核酸、これらの核酸を使用するハイブリダイゼーション法、上記単離物の製造方法、ならびにこれらのレトロウイルスのｐ１２、ｐ１６、ｐ２５、ｇｐ４１およびｇｐ１２０タンパク質の製造方法を記載している。ＥＰ０，５９１，９１４は、ＭＶＰ５１８０／９１単離物を記載している。ウェスタンブロッティングによって特徴付けられたこの単離物は、上記単離物と同様に、長く知られていたＨＩＶ−１レトロウイルス単離物との差異を示す。詳細には、ＥＰ０，５９１，９１４は、ＭＶＰ５１８０／９１単離物のＤＮＡ配列を記載し、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の位置を示している。ＥＰ０，５９１，９１４はさらに、Ｖ３ループおよび免疫優性領域（ｇｐ４１）の合成ペプチドを記載している。これらは、生物学的試験、特に、グループＯＨＩＶ−１抗体のインビトロ検出に有用である。ＥＰ０，６７３，９４８は、１５〜５０アミノ酸（ＡＡ）からなり、配列− ＶＷＧＩＲＱＬＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＸＫＧＫＬＩＸＹＴＳＶＫＷＮＴＳＷＳＧＲ−［式中、Ｘはシステイン残基またはセリン残基のいずれかを表す］を含む合成または組換えペプチドを記載している。このペプチドは、特定のグループＯＨＩＶ−１レトロウイルス単離物による感染を検出するための診断分野において有用である。これもまたグループＯＨＩＶ−１ファミリーに属するレトロウイルスの部分を形成するＭＶＰ２９０１／９４単離物を記載しているＥＰ０，７２７，４８３も公知である。この出願は、十分に決定されたペプチド配列を有する特定の抗原を記載している。このペプチド配列は、ＭＶＰ２９０１／９４単離物のｇｐ１２０の配列の部分およびｇｐ４１（免疫優性領域）の部分に対応する。ＷＯ９６／１２８０９は、グループＯＨＩＶ−１ファミリーに属する２つの新たな単離物を記載している。これらは、ＶＡＵよびＤＵＲ単離物である。この出願は、上記２つのウイルス由来の特定のペプチド配列を記載しており、それらはＨＩＶ−１ＶＡＵまたはＤＵＲペプチド配列を認識する抗体の検出に有用である。ＷＯ９６／３２２９３は、ＡＮＴ７０単離物の配列由来の２つの抗原を記載している。これらはｇｐ４１の免疫優性領域の、ＭＤＬ０６１と称する抗原および抗原ＭＤＬ０５６である。この発明によれば、グループＯＨＩＶ−１ウイルスに感染した患者由来の血清の限定された収集物の試料の１００％を検出するために、これら２つのペプチドを含有する組成物を使用する必要がある。なぜなら、各々の単離ペプチド単独では、満足な結果が得られないからである。実際、グループＯウイルスの単離物によって示される遺伝子可変性の観点から、同一かつ単一の単離物由来の抗原を使用することによって、感染個体の血清学的スクリーニングを保証することは事実上不可能である。このことは、１００％の感度を保証する試薬を得ることは不可能であることを意味する。従って、Ｏグループは、初めて、大きな問題を提起する；それは、特定の血清学的試薬が、特定の分岐をしたグループまたはサブタイプに感染した個体を認識できないことである。これは正にグループＯＨＩＶ−１ウイルスの事情である。ＷＯ９６／４Ｏ７６３も、グループＯの大きな分岐を強調している。この出願は、天然ＨＩＶ−１タイプＢ配列中にいくつかの微細な改変（１個または２個のアミノ酸の置換）を組込んだペプチドを記載している。この出願によれば、このハイブリッドペプチドは、抗グループＯ抗体と反応することができる。ＷＯ９６／２７０１３は、ＢＣＦ０１、ＢＣＦ０２、ＢＣＦ０３、ＢＣＦ０６、ＢＣＦ０７、ＢＣＦ０８、ＢＣＦ０９、ＢＣＦ１１、ＢＣＦ１２、ＢＣＦ１３およびＢＣＦ１４と称する一連の新たなグループＯＨＩＶ−１ウイルスならびにＥＳＳ／ＢＣＦ０２、ＦＡＮ／ＢＣＦ０１、ＬＯＢ／ＢＣＦ０６、ＭＡＮ／ＢＣＦ０７、ＮＫＯ／ＢＣＦ０８、ＰＯＣ／ＢＣＦ０３、ＮＡＮ／ＢＣＦ１１、ＢＣＦ０９、ＢＣＦ１２、ＢＣＦ１３およびＢＣＦ１４と称する対応するｇｐ４１優性領域の一連のペプチドを記載している。多数のこれらのペプチドは、その低い可溶性のために（特に、ペプチドＢＣＦ１３）、診断において取り扱いが困難である。予期せぬことに、特定の合成ペプチドは優れた質の診断試薬であり、それらによってグループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した患者を満足にスクリーニングできることがここで見出された。このペプチドは、グループＯＨＩＶ− １レトロウイルスの単離物中に存在する高度に保存された短い配列の周囲に接合された可変配列から構成されている。本発明のペプチドによって、特定のグループＯＨＩＶ−１単離物のｇｐ４１（ｅｎｖ）の免疫優性エピトープを有する合成ペプチドを用いて得られる結果より非常に優れた結果を得ることができる。以下、アミノ酸を名付けるために、３文字表記を使用する。本発明の合成ペプチドは、一般式（Ｉ）：［式中： −Δはビオチンラジカル、ビオシチンラジカル、水素原子、アセチル（ＣＨ₃ ＣＯ−）ラジカル、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖（該脂肪族鎖は、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル鎖もしくは炭素原子２〜６個のアルケニル鎖である）または炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖を表し、 -Ｚは式（ＩＩ）〜（Ｘ）：｛式中： -Ξ₁は０〜９アミノ酸のペプチド配列を表し、 -Ξ₂は０〜５アミノ酸のペプチド配列を表す｝の１つで表されるペプチド配列を表し、 -Θは式（ＸＩ）：｛式中：・(AA₁)はリジン残基、アルギニン残基またはオルニチン残基のいずれかを表し、・(AA₂)はグリシン残基またはアスパラギン残基のいずれかを表し、・(AA₃)はリジン残基、アルギニン残基またはオルニチン残基のいずれかを表し、・(AA₄)はロイシン残基、アラニン残基、イソロイシン残基またはグルタミン残基のいずれかを表し、・(AA₅)はイソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、トレオニン残基、ノルロイシン残基またはノルバリン残基のいずれかを表すが、 (AA₁)、(AA₂)、(AA₃)、(AA₄)および(AA₅)は一緒にペプチド配列-Lys Gly Ly s Leu Ile-および-Lys Gly Lys Leu Val-を形成しない｝で表されるペプチド配列を表し、セリンの−ＣＯ−基に結合している-Ωは： − ヒドロキシル（−ＯＨ）ラジカルまたはアミノ（−ＮＨ₂）ラジカル、 − １〜６個の炭素原子を含むアルコキシラジカル、 − 式（ＸＩＩ）：｛式中、Σは式（ＸＩＩＩ）または式（ＸＩＶ）：（式中：・(AA₆)はリジンとは異なるアミノ酸を表し・(AA₇)はアミノ酸を表し・(AA₈)はセリンまたはトレオニン残基を表し、遊離AA₈アミノ酸の−ＣＯ−残基に結合しているΨは、ＯＨもしくはＮＨ₂ 基または炭素原子１〜６個を含むアルコキシラジカルを表す）で表される配列を表す｝で表されるペプチド配列、 − 式（ＸＶ）：｛式中、バリンの−ＣＯ−残基に結合しているΨは、式（ＸＩＩ）について定義したとおりである｝で表されるペプチド配列、または − 式（ＸＶＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）：｛式中、ＺおよびΘは式（Ｉ）について定義したとおりであり、Σは式（ＸＩＩ）について定義したとおりであり、セリンの−ＣＯ−残基、AA₈アミノ酸の −ＣＯ−残基またはバリンの−ＣＯ−残基に結合しているΨは式（ＸＩＩ）について定義したとおりである｝の１つで表されるペプチド配列を表す］に対応する。 Ωが式（ＸＶＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）の１つで表されるペプチド配列を表す場合、式（Ｉ）で表されるペプチドはその大きさが２６〜６６アミノ酸で変動し得るダイマーになる。Ωが式（ＸＶＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）の１つで表されるペプチド配列を表さない場合、式（Ｉ）で表されるペプチドはモノマータイプでありその大きさは１３〜３３アミノ酸で変動し得る。本発明によるペプチドは、直鎖形態またはシステイン間ジスルフィド架橋によって環化された形態のいずれであってもよい。 (AA₅)がバリン残基、ロイシン残基またはトレオニン残基のいずれかを表す式（Ｉ）で表される化合物が好ましく、Ωが式（ＸＩＩ）で表されるペプチド配列に対応する場合、(AA₆)はグルタミン残基またはアルギニンン残基のいずれかを表す。 -Δがビオチンラジカル、水素原子、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖（該脂肪族鎖は、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル鎖である）または炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖を表し、 -Ｚが式（ＩＩ）または（Ｖ）［式中、Ξ₁は２アミノ酸のペプチド配列を表し、Ξ₂はアミノ酸を表す］で表されるペプチド配列、式（ＩＶ）［式中、Ξ₁は３アミノ酸を表す］で表される配列、または式（ＶＩＩＩ）［式中、Ξ₁は９、８もしくは３アミノ酸のペプチド配列を表し、Ξ₂は５アミノ酸のペプチド配列を表す］で表されるペプチド配列を表し、 -Θが式：で表されるペプチド配列を表し、 -Ωがヒドロキシル基、ペプチド配列（ＸＶ）または式（ＸＩＩ）で表されるペプチド配列に対応する以下の配列：の１つを表す式（Ｉ）で表されるペプチドが好ましい。好ましくは、Ｚは式：で表されるペプチド配列を表す。２０〜５０アミノ酸を含み、式（Ｉａ）：［式中、Ｚ_aは式ＩＩａ〜Ｘａ：｛式中： -Ξ_1aは１〜５アミノ酸のペプチド配列を表し、 -Ξ_2aはアミノ酸を表す｝で表されるラジカルを表し、 -Ω_aは式（Ｉ）について定義される式（ＸＩＩ）で表されるペプチド配列または式（ＸＶＩＩａ）：｛式中、Ｚ_aは式（Ｉａ）について定義したとおりである｝で表されるペプチド配列を表し、 Δ、Θ、ΣおよびΨは式（Ｉ）について定義したとおりである］に対応する合成ペプチドも、本発明の一部を形成する。以下の配列の１つを含む式（Ｉ）または（Ｉａ）で表されるペプチド（これらのペプチドは、上記で定義したように、ダイマータイプであってもよく、モノマータイプであってもよい）が好ましい。配列を１文字表記および３文字表記で示す：以下の合成ペプチドは特に好ましいペプチドである：本発明の主題である式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、常法に従って固相合成によって得ることができる：Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３），８５，ｐｐ．２１４９−２１５４；Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１９７１」，ＮｅｓｖａｄｂａＨ．（編）ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．１１１；Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｌ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，「Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ」，ＩＲＬＰＲＥＳＳ，（１９８９），ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ｐｐ．２５−３４。自動合成機としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの合成機「９０５０ＰｌｕｓＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」または等価な合成機を使用することが可能である。合成に使用する固体支持体は、使用する技術および化学反応に適合性であるべきである。例えば、合成機「９０５０Ｐｌｕｓｐｅｐ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」での合成用には、いわゆる「連続フロー」技術に適切な樹脂を使用することが推奨される；ＰＥＧＰＳ樹脂はこの基準に合致する。この支持体は、ポリスチレンビーズの官能基と第１のアミノ酸の結合点との間に位置する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づくアーム（「スペーサー」）からなる。この結合点の性質は、選択したＣ末端官能基に従って変動し得る。本発明の場合、種々のＰＥＧ−ＰＳ樹脂を使用した。原材料として使用する出発樹脂およびアミノ酸は、市販されている製品である（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ−ＢｉｏｓｙｓｔｅｍまたはＮｅｏｓｙｓｔｅｍ）。ペプチド合成用に、以下の側鎖保護基を使用した：使用する、アミノ酸のα位の第１級アミン官能基の一次的保護は、９−フルオレニルメチルオキシルカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。脱保護は、ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジン溶液を用いて実施する。カップリングには、好ましくは、過剰のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使用する。合成後、樹脂を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタン）で洗浄し、真空下で乾燥させ、次いで０℃に冷却し適切な「スカベンジャー」を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に基づく溶液で処理する。例えば、８２％のトリフルオロ酢酸、５％のフェノール、５％の水、５％のチオアニソールおよび３％のエタンジチオールを含有するＫ試薬を使用してもよい。樹脂の濾過後、合成ペプチドを沈殿させ、エーテルでリンスする。次いで、合成ペプチドを逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、その純度を質量分析によって測定する。固相としては、例えば、ＢｏｎｄａｐａｋＣ −１８相を使用することができる。ペプチドを２つの緩衝液（本質的に水性の第１の緩衝液（例えば、水−ＴＦＡ０．１％）およびむしろ有機性の第２の緩衝液（例えば、６０％アセトニトリル、３９．９２％水および０．０８％ＴＦＡを含有する混合物））の間の直線勾配を形成させることによって溶出させる。採集した純粋な画分を合し、真空下で濃縮し、凍結乾燥する。環化のために、精製合成ペプチドを酢酸アンモニウム溶液（１０ｍＭ）中に溶解する。１Ｍ水酸化アンモニウムを添加することによって、ｐＨを８．５に調整する。溶液を激しく撹拌する。環化は１８時間後に完了する。次いで、酢酸を添加することによって、ｐＨを６に下げる。環化したペプチドを凍結乾燥し、次いで、上記のように逆相液体クロマトグラフィーによって精製する。本発明のペプチドの免疫反応性を、グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した主にカメルーン起源の患者由来の血清を用いて評価した。実施した種々の試験は、本発明のペプチド（単独でまたは組み合わせで（ペプチドの組成物））によって、グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した血清を１００％検出することができることを示した。それゆえ、本発明の合成ペプチドは、グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスによる感染のスクリーニングのための免疫学的試験に適用される。式Ｉで表されるいくつかの合成ペプチドの組み合わせを使用することも可能である。式Ｉで表されるペプチドを２つ以上含有し得るこの組み合わせも、本発明の一部を形成する。ペプチド番号１（２Ｂ）および番号３（４Ｂ）を含有する組み合わせが好ましい。本発明の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、常法によって得ることができ、例えば、ＥＰ０，５９１、９１４に記載の配列を有するグループＯＨＩＶ− １組換えペプチド（組換えタンパク質）との組み合わせで使用することもできる。本発明の合成ペプチドを、特許出願または特許ＥＰ０，３８７，９１４、ＥＰ０，２３９，４２５、ＥＰ０，２２０，２７３またはＥＰ０，２６７，８０２に記載のペプチドのような他のＨＩＶ−２および／またはＨＩＶ−１組換え（組換えタンパク質）または合成ペプチドと組み合わせて使用することもできる。この特許出願または特許のリストは、網羅しているのではなく例示のために挙げている。１つ以上の、式（Ｉ）で表される合成ペプチドおよび１つ以上の、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２組換えまたは合成ペプチドを含有する組成物は、種々のＨＩＶレトロウイルスに感染した患者のスクリーニング用の診断に適用される。この組成物も本発明の一部を形成する。１つ以上の、式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、単独でまたはグループＯＨＩＶ−１組換えペプチドまたはＨＩＶ−１および／もしくはＨＩＶ−２組換えもしくは合成ペプチドと組み合わせて使用するイムノアッセイ法も本発明の一部を形成する。本発明は、式（Ｉ）で表されるペプチドまたは少なくとも１つの、式（Ｉ）で表されるペプチドを含有する組成物を含む、イムノアッセイを実施するためのキットにも関する。以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１：本発明による化合物の製造：ペプチド番号２（３Ｂ）このペプチドを固相で合成した。１９６３年にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３）８５，ｐｐ．２１４９−２１５４）によって開発された技術は、第１のアミノ酸をポリマー固体支持体（樹脂）上にその酸官能基によって結合させ、合成されるペプチドが樹脂に結合されたまま、ペプチド配列をこの第１のアミノ酸から伸張させることからなる。ペプチド番号２の合成用に、合成機として、合成機「９０５０ＰｌｕｓＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」を使用し、樹脂として、樹脂ＦｍｏｃＴｈｒ（ＯｔＢｕ）ＰＥＧＰＳを使用した。合成の各工程を下記の表Ｉにまとめる：合成の最後に、樹脂をジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタンで洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、樹脂をＫ試薬（８２％トリフルオロ酢酸；５％フェノール；５％水；５％チオアニソール；３％エタンジチオール）で処理した。次いで、ジエチルエーテルを用いた沈殿によって単離したペプチド番号２（３Ｂ）を、同じ溶媒でリンスした。こうして、１４０ｍｇのペプチド番号２（３Ｂ）を得た。次いで、ペプチド番号２（３Ｂ）を、逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。固相として、ＢｏｎｄａｐａｋＣ−１８相を使用した。ペプチドを、２つの緩衝液（本質的に水性の第１の緩衝液（例えば、水−ＴＦＡ０．１％）およびむしろ有機性の第２の緩衝液（例えば、６０％アセトニトリル、３９．９２％水および０．０８％ＴＦＡを含有する混合物））の間の直線勾配を形成させることによって溶出させた。採集した純粋な画分を合し、真空下で濃縮し、凍結乾燥させた。環化のために、このようにして得た精製合成ペプチドを酢酸アンモニウム溶液（１０ｍＭ）中に溶解した。１Ｍ水酸化アンモニウムを添加することによって、ｐＨを８．５に調整した。溶液を激しく撹拌した。環化は１８時間後に完了した。次いで、酢酸を添加することによって、ｐＨを６に下げた。環化したペプチドを凍結乾燥させ、次いで、上記のように逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。本発明による化合物の製造：ペプチド番号１５（２２Ｂ）このペプチドを、樹脂として樹脂ＦｍｏｃＰＡＬＰＥＧ−ＰＳを使用した以外、ペプチド番号２（３Ｂ）のように合成した。合成の各工程を下記の表ＩＩにまとめる：合成の最後に、樹脂をジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタンで洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、樹脂をＫ試薬（８２％トリフルオロ酢酸；５％フェノール；５％水；５％チオアニソール；３％エタンジチオール）で処理した。次いで、ジエチルエーテルを用いた沈殿によって単離したペプチド番号７（２２Ｂ）を、同じ溶媒でリンスした。こうして、１４０ｍｇのペプチド番号１５（２２Ｂ）を得た。次いで、ペプチド番号１５（２２Ｂ）を、ペプチド番号２（３Ｂ）について上記したように、逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、次いで環化させ、凍結乾燥し、精製した。同様に、適切な樹脂およびアミノ酸を使用して、本発明の他の化合物を合成した。表ＩＩＩは、質量分析によって評価した、非環化形態の、式（Ｉ）で表されるいくつかのペプチドの分子量を示す。実施例２：本発明によるペプチドの免疫反応性の免疫酵素試験による評価：試験番号１使用した血清ＥＳＳ、ＤＵＲ、ＶＡＵおよびＨＡＤは、グループＯＨＩＶ− １レトロウイルスに感染したフランス人患者由来の血清である。グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した患者由来の他の血清試料は、カメルーンのＹ（１９７７），１１，ｐｐ．４４５−４５３に記載の血清学アルゴリズムに従ってグループＯに血清型決定された。ＨＩＶ陰性血清（ｎ＝４８）を、健常ボランティアから得た。使用した合成ペプチドを、水中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した（ストック溶液）。固相の感受性化工程（コーティング）のために、各ペプチドの２μｇ／ｍｌの溶液（ストック溶液を０．１Ｍ炭酸緩衝液で希釈することによって得た）１１０μｌを、マイクロタイタープレートＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ^TM（ＮＵＮＣ）の各ウェルに添加した。一晩室温でインキュベートした後、マイクロプレートを、ウムを含有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で洗浄し、次いで０．せた。飽和溶液を吸引した後、プレートを１０分間５０℃で加熱した。血清試料をスキムミルク溶液（０．０１％のフェノールレッド、０．２５％の１／５希釈し、プレートのウェルに入れ、３０分間４０℃でインキュベートした。ムを含有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で洗浄した後、３０％グリセロールおよび２５％正常ウシ胎児血清を補充したクエン酸緩衝液中の、保存剤として０．０１％のメルチオレートナトリウムを含有する、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭヤギ抗体からなる結合体の溶液１００μ ｌをプレートの各ウェルに添加し、次いで、プレートを３０分間４０℃でインキュベートした。ムを含有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で洗浄した後、過酸化水素中のＯ−フェニレンジアミン溶液１００μｌを各ウェルに添加することによって発色させた。次いで、マイクロプレートを３０分間室温で暗所でインキュベートした。次いで、発色反応を１００μｌの４Ｎ硫酸を添加することによって停止した。４９０および６２０ｎｍで吸光度（Ａ）を測定した。各ウェルで読み取った相対的吸光度（Ａ４９０−Ａ６２０）は、各ペプチドの免疫反応性に比例する。これは、各ペプチドが、試験を実施した生物学的試料と反応する能力を示す。カットオフ値を、０．１５に等しい吸光度として決定した。これは、陰性値の平均（ｎ＝４８）＋１２標準偏差に相当する。本発明のペプチド（ペプチド番号３（４Ｂ）、ペプチド番号２（３Ｂ）およびペプチド番号１（２Ｂ）、全て環化形態）の反応性を、配列としてＶＡＵ単離物（グループＯＨＩＶ−１レトロウイルス）のエンベロープ（ｅｎｖ）の天然配列の一部を有し、ｇｐ４１の免疫優性エピトープを含む２つの合成ペプチドの反応性と比較した。これら２つのペプチドは、以下の配列を有する：この研究用に、これらのペプチドを環化形態で使用した。この研究の結果を表ＩＶに示す。 ^*血清型／遺伝子型^** ＞＝分光光度計の読み取り能力より高いシグナル。 ^*血清型／遺伝子型^** ＞＝分光光度計の読み取り能力より高いシグナル。^*** 試験せず表ＩＶの結果は、ペプチド番号３（４Ｂ）が、他のペプチドについて示された性能に対して最良の性能を示すことを示す。このペプチドは、ｇｐ４１の免疫優性エピトープに対応するＶＡＵ単離物の配列の一部を有する２つのペプチドに比較して、グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した患者の血清間での最良の識別を可能にする。さらに、本発明のペプチド番号２（３Ｂ）および番号１（２Ｂ）は、同数のアミノ酸を含むＶＡＵ２２ＡＡペプチドよりも免疫反応性が高い。実施例３：本発明によるペプチドの免疫反応性の免疫酵素試験による評価：試験番号２グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した患者由来の血清試料は、カＡＩＤＳ（１９７７），１１，ｐｐ．４４５−４５３に記載の血清学アルゴリズムに従ってグループＯに血清型決定された。遺伝子型決定された試料（Ｍａｒｙｌａｎｄ）をアメリカ合衆国から得た。異なる免疫反応性試験のために十分な容量を得るために、これらの試料を、表Ｖに示す希釈率で陰性ヒト血清中で事前に希釈した。使用した合成ペプチドを、水中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した（ストック溶液）。固相の感受性化工程（「コーティング」）のために、実施例２に記載のように手順を実施した。血清試料をスキムミルク溶液（０．０１％のフェノールレッド、０．２５％の１／５希釈し、プレートのウェルに入れ、３０分間４０℃でインキュベートした。ムを含有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で洗浄した後、３０％グリセロールおよび２５％正常ウシ胎児血清を補充したクエン酸緩衝液中の、保存剤として０．０１％のメルチオレートナトリウムを含有する、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭヤギ抗体からなる結合体の溶液１００μ ｌをプレートの各ウェルに添加し、次いで、プレートを３０分間４０℃でインキュベートした。ムを含有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で洗浄した後、実施例２に記載のように発色させた。各ウェルで読み取った相対的吸光度（ＯＤ）（Ａ４９０−Ａ６２０）は、各ペプチドの免疫反応性に比例する。これは、各ペプチドが、試験を実施した生物学的試料と反応する能力を示す。本発明のペプチド（ペプチド番号１０（１４Ｂ）、番号１１（１８Ｂ）、番号１２（１９Ｂ）、番号１４（２１Ｂ）、番号１５（２２Ｂ）、番号１６（２３Ｂ）、全て環化形態）の反応性を、配列としてグループＯＨＩＶ−１レトロウイルスのエンベロープ（ｅｎｖ）の天然配列の一部を有する３つの相同合成ペプチドの反応性と比較した。これらのペプチドは、ＶＡＵ単離物由来の２つのペプチド − ペプチドＶＡＵ２２ＡＡおよびペプチドＶＡＵ３５ＡＡ −ならびにペプチドＭＶＰ５１８０（表Ｖ中「ＭＶＰ５１８０」と記す）である。ペプチドＶＡＵ２２ＡＡおよびＶＡＵ３５ＡＡ（その構造は実施例２に示す）ならびにペプチドＭＶＰ５１８０は、ｇｐ４１の免疫優性エピトープを含む。これら全てののペプチドを環化形態で使用した。ＭＶＰ５１８０ペプチドの配列は下記のとおりである：この研究の結果を表Ｖに示す。固相^*：ペプチド２μｇ／ｍｌ試験した各ペプチドについて、波長Ａ４９２−Ａ６２０で読み取った種々のレベルの相対的吸光度に対応する４つのクラス（ａ、ｂ、ｃおよびｄ）に試料を整理した：・ − ａ：ＯＤ＜０．１００、・ − ｂ：０．１００＜ＯＤ＜０．５００、・ − ｃ：０．５００＜ＯＤ＜１．０００、・ − ｄ：ＯＤ＞１．０００、このようにして、ペプチドの免疫反応性の程度を評価することが可能になった。最も免疫反応性が高いペプチドは、最大数の試料が最高の吸光度値に対応するクラスに見出されるペプチドである。結果を表ＶＩに示す。固相^*：ペプチド２μｇ／ｍｌ結果は、試験した全ての本発明のペプチドが、天然単離物に由来する先行技術の対照ペプチド（ＭＶＰ５１８０、ＶＡＵ）よりも良好な免疫反応性の性能を達成することを示す。本発明のペプチド、番号１５（２２Ｂ）、番号１４（２１Ｂ）および番号１６（２３Ｂ）は、最も免疫反応性が高いことが見出されている。実施例４：本発明によるペプチドを含有する組成物の免疫反応性の免疫酵素試験による評価この試験のために、実施例２に記載のプロトコルに従って手順を実施し、同じ血清を使用した。使用したマイクロプレートを、環化したペプチド番号１（２Ｂ）もしくは環化したペプチド番号３（４Ｂ）またはこれら２つのペプチドを含有する（１：１ｗ／ｗ）組成物のいずれかを用いて感受性化した。各ウェル中に、２μｇ／ｍｌのペプチド番号１（２Ｂ）を含有する溶液１００μｌ、２μｇ／ｍｌのペプチド番号３（４Ｂ）を含有する溶液１００μｌまたは１μｇ／ｍｌのペプチド番号１（２Ｂ）および１μｇ／ｍｌのペプチド番号３（４Ｂ）を含有する溶液１００μｌのいずれかを入れた。この試験の結果を表ＶＩＩに示す。 ^*＞＝分光光度計の読み取り能力より高いシグナル。 ^*＞＝分光光度計の読み取り能力より高いシグナル。表ＶＩＩの結果は、診断に使用した場合、本発明のペプチドの組成物によって、グループＯＨＩＶ−１レトロウイルスに感染した患者由来の全ての血清の検出が可能になることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ガデル，ステファーヌ・ジャン・グザヴィエフランス、エフ―91570ビーヴル、シュマン・ドゥ・ラ・パテュール (72)発明者リウニエ，フランソワ・イヴフランス、エフ―78330フォントネー・ル・フルリー、シュマン・デ・グラヴィエ６番

Claims

【特許請求の範囲】１．１３〜３３アミノ酸を有するモノマータイプまたは２６〜６６アミノ酸を有するダイマータイプの、直鎖形態またはシステイン間ジスルフィド架橋によって環化された形態の合成ペプチドであって、一般式（Ｉ）：［式中： -Δはビオチンラジカル、ビオシチンラジカル、水素原子、アセチル（ＣＨ₃ＣＯ−）ラジカル、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖（該脂肪族鎖は、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル鎖もしくは炭素原子２〜６個のアルケニル鎖である）または炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖を表し、 -Ｚは式（ＩＩ）〜（Ｘ）：｛式中： -Ξ₁は０〜９アミノ酸のペプチド配列を表し、 -Ξ₂は０〜５アミノ酸のペプチド配列を表す｝の１つで表されるペプチド配列を表し、 -Θは式（ＸＩ）：｛式中：・(AA₁)はリジン残基、アルギニン残基またはオルニチン残基のいずれかを表し、・(AA₂)はグリシン残基またはアスパラギン残基のいずれかを表し、・(AA₃)はリジン残基、アルギニン残基またはオルニチン残基のいずれかを表し、・(AA₄)はロイシン残基、アラニン残基、イソロイシン残基またはグルタミン残基のいずれかを表し、・(AA₅)はイソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、トレオニン残基、ノルロイシン残基またはノルバリン残基のいずれかを表すが、 (AA₁)、(AA₂)、(AA₃)、(AA₄)および(AA₅)は一緒にペプチド配列-Lys Gly Ly s Leu Ile-および-Lys Gly Lys Leu Val-を形成しない｝で表されるペプチド配列を表し、セリンの−ＣＯ−基に結合している-Ωは： − ヒドロキシル（−ＯＨ）ラジカルまたはアミノ（−ＮＨ₂）ラジカル、 − １〜６個の炭素原子を含むアルコキシラジカル、 − 式（ＸＩＩ）：｛式中、Σは式（ＸＩＩＩ）または式（ＸＩＶ）：（式中：・(AA₆)はリジンとは異なるアミノ酸を表し・(AA₇)はアミノ酸を表し・（AA₈)はセリンまたはトレオニン残基を表し、遊離AA₈アミノ酸の−ＣＯ−残基に結合しているΨは、ＯＨもしくはＮＨ₂ 基または炭素原子１〜６個を含むアルコキシラジカルを表す）で表される配列を表す｝で表されるペプチド配列、 − 式（ＸＶ）：｛式中、バリンの−ＣＯ−残基に結合しているΨは、式（ＸＩＩ）について定義したとおりである｝で表されるペプチド配列、または − 式（ＸＶＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）：｛式中、ＺおよびΘは式（Ｉ）について定義したとおりであり、Σは式（ＸＩＩ）について定義したとおりであり、セリンの−ＣＯ−残基、AA₈アミノ酸の −ＣＯ−残基またはバリンの−ＣＯ−残基に結合しているΨは式（ＸＩＩ）について定義したとおりである｝で表されるペプチド配列を表す］に対応する合成ペプチド。２．(AA₅)がバリン残基、ロイシン残基またはトレオニン残基のいずれかを表し、Ωが式（ＸＩＩ）または（ＸＩＶ）で表されるペプチド配列に対応する場合、(AA₆)がグルタミン残基またはアルギニンン残基のいずれかを表す、請求項１記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチド。３．-Δがビオチンラジカル、水素原子、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖（該脂肪族鎖は、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル鎖である）または炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖を表し、 -Ｚが式（ＩＩ）または（Ｖ）［式中、Ξ₁は２アミノ酸のペプチド配列を表し、Ξ₂はアミノ酸を表す］で表されるペプチド配列、式（ＩＶ）［式中、Ξ₁は３アミノ酸を表す］で表される配列、または式（ＶＩＩＩ）［式中、Ξ₁は９、８もしくは３アミノ酸のペプチド配列を表し、Ξ₂は５アミノ酸のペプチド配列を表す］で表されるペプチド配列を表し、 -Θが式：で表されるペプチド配列を表し、 -Ωがヒドロキシル基、ペプチド配列（ＸＶ）または式（ＸＩＩ）で表されるペプチド配列に対応する以下の配列：の１つを表す、請求項１記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチド。４．Ｚが式：で表されるペプチド配列を表す、請求項１〜３のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチド。５．式（Ｉａ）：［式中、Ｚ_aは式ＩＩａ〜Ｘａ：｛式中： -Ξ_1aは１〜５アミノ酸のペプチド配列を表し、 -Ξ_2aはアミノ酸を表す｝で表されるラジカルを表し、 -Ω_aは式（Ｉ）について定義される式（ＸＩＩ）で表されるペプチド配列または式（ＸＶＩＩａ）：で表されるペプチド配列を表し、 Δ、Θ、ΣおよびΨは式（Ｉ）について定義したとおりである］で表される、請求項１記載の２０〜５０アミノ酸の合成ペプチド。６．以下の配列の１つを含む請求項１〜５のいずれか一項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチド：７．以下の配列の請求項１〜６のいずれか１項記載の合成ペプチド：８．１つ以上の、請求項１〜７のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを含有する組成物。９．ペプチド番号３（４Ｂ）およびペプチド番号１（２Ｂ）を含有する請求項８記載の組成物。１０．１つ以上の、請求項１記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドおよび１つ以上のグループＯＨＩＶ−１組換えペプチドを含有する組成物。１１．１つ以上の、請求項１記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドならびに１つ以上の、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２組換えまたは合成ペプチドを含有する組成物。１２．１つ以上の、請求項１〜７のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを使用するイムノアッセイ法。１３．請求項８〜１１のいずれか１項記載の組成物を使用するイムノアッセイ法。１４．少なくとも１つの、請求項１〜７のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドまたは請求項８〜１１のいずれか１項記載の組成物を含む診断キット。