DE69836265T2 - Synthetische peptide für testverfahren zur bestimmung der infektion mit virus hiv1 der gruppe o - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft synthetische Peptide, die bei den biologischen Tests zum Nachweis der Infektionen aufgrund von HIV-1-Viren der Gruppe O geeignet sind, ihr Herstellungsverfahren, Zusammensetzungen und Kits (Testsätze), die solche Peptide enthalten, sowie die biologischen Tests, die solche Peptide einsetzen.
- HIV-1-Retroviren der Gruppe O sind aus der Technik bekannt. Die Patentschrift
EP 0 345 375 und die PatentanmeldungEP 0 657 532 beschreiben die Isolate ANT 70 und ANT 70 NA, die aus Kranken aus Kamerun isoliert wurden. Diese Dokumente beschreiben Antigene und Antigenzusammensetzungen, genauer, die Lysate oder Proteine dieser Isolate enthalten, die Nukleinsäuren, die der genomischen RNA entsprechen, Hybridisierungsverfahren, die diese Nukleinsäuren verwenden, Herstellungsverfahren der vorstehend genannten Isolate sowie Herstellungsverfahren von p12-, p16-, p25-, gp41, gp120-Proteinen dieser Retroviren. - Die Patentschrift
EP 0 591 914 beschreibt das Isolat MVP 5180/91. Dieses durch Western Blot charakterisierte Isolat weist wie das vorhergehende Isolat Unterschiede bezüglich der seit langem bekannten Isolate des HIV-1-Retrovirus auf. Die AnmeldungEP 0 591 914 beschreibt die DNA-Sequenz des Isolats MVP 5180/91 genau und gibt exakt die Lage der Gene gag, pol und env an. Die AnmeldungEP 0 591 914 beschreibt ferner synthetische Peptide der V3-Schleife sowie der immundominanten Region (gp41). Diese letzteren sind für biologische Assays, insbesondere zum Nachweis in vitro der HIV-1-Antikörper der Gruppe O geeignet. - Die Anmeldung
EP 0 673 948 beschreibt synthetische oder rekombinante Peptide, bestehend aus 15 bis 50 Aminosäuren (AA) und umfassend die Sequenz
-VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR-,
wobei X entweder einen Cysteinrest oder einen Serinrest darstellt. Diese Peptide sind im diagnostischen Bereich zum Nachweis der Infektionen aufgrund bestimmter Isolate von HIV-1-Retrovirus der Gruppe O geeignet. - Auch die Anmeldung
EP 0 727 483 ist bekannt, die das Isolat MVP 2901/94 beschreibt, das ebenfalls Teil der Retroviren ist, die der HIV-1-Familie der Gruppe O angehören. Diese Anmeldung beschreibt bestimmte Antigene mit gut bestimmten Peptidsequenzen. Diese Peptidsequenzen entsprechen einem Teil der Sequenz des gp120 und einem Teil des gp4l (immundominante Region) des Isolats MVP 2901/94. - Die Anmeldung WO 96/12809 beschreibt zwei neue Isolate, die der HIV-1-Familie der Gruppe O angehören. Es handelt sich um die Isolate VAU und DUR. Diese Anmeldung beschreibt bestimmte Peptidsequenzen, die von den zwei vorstehend zitierten Viren abstammen, die zum Nachweis von Antikörpern, die die peptidischen Sequenzen HIV-1-VAU oder HIV-1-DUR erkennen, geeignet sind.
- Die Anmeldung WO 96/32293 beschreibt zwei Antigene, die der Sequenz des Isolats ANT 70 entstammen. Es handelt sich um das als MDL061 bezeichnete Antigen und um das MDL056-Antigen der immundominanten Region des gp41. Erfindungsgemäß ist es zum Nachweis von 100 % der Proben einer begrenzten Sammlung von Seren von Kranken, die mit dem HIV-1-Virus der Gruppe O infiziert sind, notwendig, Zusammensetzungen zu verwenden, die diese beiden Peptide enthalten, da sich durch jedes isolierte Peptid allein keine zufriedenstellenden Ergebnisse erhalten lassen.
- In der Tat ist es hinsichtlich der bei den Isolaten des Virus der Gruppe O festgestellten genetischen Variabilität quasi unmöglich, die serologische Erkennung der kontaminierten Individuen durch Verwendung von Antigenen zu garantieren, die von ein und demselben Isolat stammen. Dies bedeutet, dass es nicht möglich ist, Reagenzien zu erhalten, die 100 % Empfindlichkeit garantieren. Somit ruft die Gruppe O zum ersten Mal ein bedeutendes Problem hervor; es handelt sich um die Nicht-Gleichwertigkeit von bestimmten serologischen Reagenzien zum Erkennen von kontaminierten Individuen durch besonders divergierende Gruppen oder Subtypen. Dies ist besonders bei den HIV-1 der Gruppe O der Fall.
- Die Anmeldung WO 96/40763 betont ebenfalls nachdrücklich die große Divergenz der Gruppe O. Diese Anmeldung beschreibt Peptide, die in einer natürlichen HIV-1-Sequenz vom Typ B einige kleine Modifikationen einschließen (Ersatz von einer oder von zwei Aminosäuren). Nach dieser Anmeldung sind diese Hybridpeptide in der Lage, mit Anti-Gruppe-O-Antikörpern zu reagieren.
- Die Anmeldung WO 96/27013 beschreibt eine Reihe von neuen HIV-1-Viren der Gruppe O, die als BCF01, BCF02, BCF03, BCF06, BCF07, BCF08, BCF09, BCF11, BCF12, BCFl3 und BCF14 bezeichnet werden, sowie eine Reihe von Peptiden der dominanten Region des entsprechenden gp41, die als ESS/BCF02, FAN/BCF01, LOB/BCF06, MAN/BCF07, NKO/BCF08, POC/BCF03, NAN/BCF11, BCF09, BCF12, BCF13 und BCF14 bezeichnet werden. Eine bestimmte Anzahl dieser Peptide sind aufgrund ihrer schwachen Löslichkeit zur Diagnose unhandlich, insbesondere das Peptid BCF13.
- Unerwarteterweise wurde nun gefunden, dass bestimmte synthetische Peptide diagnostische Reagenzien von überragender Qualität sind und das zufriedenstellende Erkennen der Infektionskrankheiten durch die HIV-1-Retroviren der Gruppe O erlauben. Diese Peptide bestehen aus variablen Sequenzen, die in stark konservierte kurze Sequenzen eingefügt sind, die in den Isolaten der HIV-1-Retroviren der Gruppe O vorhanden sind. Durch die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich Ergebnisse erhalten, die denen, die mit synthetischen Peptiden erhalten werden, die Träger von immundominanten Epitopen des gp41 (env) von bestimmten HIV-1-Isolaten der Gruppe O sind, bei weitem überlegen sind.
- Im Folgenden wird zur Bezeichnung der Aminosäuren die Dreibuchstaben-Nomenklatur verwendet.
- Die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide sind vom monomeren Typ mit 13 bis 33 Aminosäuren oder vom dimeren Typ mit 26 bis 66 Aminosäuren in linearer Form oder liegen in linearer Form oder in einer mit Hilfe von Disulfidbrücken zwischen Cysteinen cyclisierten Form vor und gehorchen der allgemeinen Formel (I):
- – Δ für einen Biotinylrest, einen Biocytinylrest, ein Wasserstoffatom, einen Acetylrest (CH3CO-), eine aliphatische Kette, die gegebenenfalls eine oder zwei Thiol-, Aldehyd- oder Aminfunktionen trägt, steht,
- – Z
für eine
Peptidsequenz einer der Formeln (II) bis (X) steht:
- – Ξ1 für eine Peptidsequenz mit 0 bis 9 Aminosäuren steht und
- – Ξ2 für eine Peptidsequenz mit 0 bis 5 Aminosäuren steht,
- – Θ für eine Peptidsequenz
der Formel (XI) steht:
- • (AA1) entweder für einen Lysinrest oder einen Argininrest oder einen Ornithinrest steht,
- • (AA2) entweder für einen Glycinrest oder einen Asparaginrest steht,
- • (AA3) entweder für einen Lysinrest oder einen Argininrest oder einen Ornithinrest steht,
- • (AA4) entweder für einen Leucinrest oder einen Isoleucinrest oder einen Glutaminrest steht, jedoch unter der Bedingung, dass (AA1), (AA2), (AA3), (AA4) und (AA5) niemals zusammen die Peptidsequenzen -Lys Gly Lys Leu Ile- und -Lys Gly Lys Leu Val- bilden,
- – Ω, das an
die Gruppe -CO- von Serin gebunden ist, Folgendes bedeutet:
– einen
Hydroxylrest (-OH) oder einen Aminorest (-NH2),
– einen
Alkoxyrest mit l bis 6 Kohlenstoffatomen,
– eine Peptidsequenz der Formel
(XII):
- • (AA6) für eine andere Aminosäure als Lysin steht,
- • (AA7) für eine Aminosäure steht,
- • (AA8) für einen Serin- oder Threoninrest steht, und Ψ, das an den freien Rest -CO- der Aminosäure AA6 gebunden ist, für eine Gruppe OH, NH2 oder einen Alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht,
- – eine
Peptidsequenz der Formel (XV):
- – oder eine Peptidsequenz einer
der Formeln (XVI) bis (XVIII):
- worin Z und Θ die für die Formel (I) angegebene Definition besitzen und Σ die für die Formel (XII) gegebene Definition besitzt und Ψ an den Rest -CO- des Serins, an den Rest -CO- der Aminosäure AA8 oder an den Rest -CO- des Valins gebunden ist, die gleiche Bedeutung aufweist wie für die Formel (XII).
- Die Verbindungen der Formel (I), worin (AA5) entweder einen Valinrest, einen Leucinrest oder einen Threoninrest darstellt, und wenn Ω eine Peptidsequenz der Formel (XII) darstellt, (AA6) entweder einen Glutaminrest oder einen Argininrest darstellt, sind bevorzugt.
- Bevorzugt sind die Peptide der Formel (I), worin:
- – Δ einen Biotinylrest, ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kette darstellt, die eine oder zwei Thiol-, Aldehyd- oder Aminfunktionen enthalten kann, wobei die aliphatische Kette vorzugsweise eine Alkylkette von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Aminoalkylcarbonylkette von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,
- – Z eine Peptidsequenz einer der Formel (II) oder (V), worin Ξ1 für eine Peptidsequenz mit zwei Aminosäuren steht und Ξ2 für eine Aminosäure steht oder eine Sequenz der Formel (IV), in der Ξ1 drei Aminosäuren darstellt oder eine Peptidsequenz der Formel (VIII), in der Ξ1 eine Peptidsequenz mit neun, acht oder drei Aminosäuren darstellt und Ξ2 eine Peptidsequenz mit fünf Aminosäuren darstellt, steht,
- – Θ eine Peptidsequenz
der Formel:
- – Ω für eine Hydroxylgruppe,
die Peptidsequenz (XV) oder eine der folgenden Sequenzen steht,
die der Peptidsequenz der Formel (XII) entsprechen:
- Vorzugsweise stellt Z eine Peptidsequenz der Formel:
- • -Leu Leu Ser Ser-
- • -Leu Leu Ser Leu-
- • -Leu Leu Asn Ser-
- • -Arg Leu Asn Ser-
- • -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-
- • -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-
- • -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-
- • -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser- oder
- • -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-
- Ebenfalls Teil der Erfindung sind die synthetischen Peptide, die 20 bis 50 Aminosäuren einschließen und der Formel (Ia) gehorchen:
- – Ξ1a für eine Peptidsequenz mit 1 bis 5 Aminosäuren steht und
- – Ξ2a für eine Aminosäure,
- – Ωa für
eine Peptidsequenz der Formel (XII), wie für Formel (I) definiert,
oder
eine Peptidsequenz der Formel (XVIIa):
- Bevorzugt sind die Peptide der Formel (I) oder (Ia), die eine der folgenden Sequenzen einschließt (diese Peptide können vom dimeren oder monomeren Typ, wie zuvor definiert, sein). Die Sequenzen sind nach der Ein- und Drei-Buchstaben-Nomenklatur angegeben: Sequenz Nr. 2Sequenz Nr. 3
Sequenz Nr. 4
Sequenz Nr. 5
Sequenz Nr. 8
Sequenz Nr. 9
Sequenz Nr. 10
Sequenz Nr. 11
Sequenz Nr. 12
Sequenz Nr. 13
Sequenz Nr. 14
Sequenz Nr. 15
Sequenz Nr. 16
- Die nachstehenden synthetischen Peptide sind besonders bevorzugte Peptide: Peptid Nr. 2 (3B): SEQ ID NO: 2Peptid Nr. 3 (4B): SEQ ID NO: 3
Peptid Nr. 4 (5B): SEQ ID NO: 4
Peptid Nr. 5 (6B): SEQ ID NO: 5
Peptid Nr. 8 (7B): SEQ ID NO: 8
Peptid Nr. 9 (12B): SEQ ID NO: 9
Peptid Nr. 10 (14B): SEQ ID NO: 10
Peptid Nr. 11 (18B): SEQ ID NO: 11
Peptid Nr. 12 (19B): SEQ ID NO: 12
Peptid Nr. 13 (20B): SEQ ID NO: 13
Peptid Nr. 14 (21B): SEQ ID NO: 14
Peptid Nr. 15 (22B): SEQ ID NO: 15
Peptid Nr. 16 (23B): SEQ ID NO: 16
- Die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide der Formel (I) können durch Festphasensynthese nach klassischen Verfahren erhalten werden: R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, Seiten 2149–2154; R.C. Sheppard, in "Peptides 1991 ", Nesvadba H. (Hrsg.) North Holland, Amsterdam, Seite 111; E. Atherton und R.L. Sheppard, in "Solid phase peptide synthesis, a practical approach", IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, Seiten 25–34. Als automatisches Synthesegerät kann das Synthesegerät "9050 Plus Pep Synthesizer" von Millipore oder ein gleichwertiges Synthesegerät verwendet werden.
- Der für die Synthesen verwendete feste Träger muss mit der Technik und Chemie, die eingesetzt werden, kompatibel sein. Für eine Synthese auf dem Synthesegerät "9050 Plus Pep. Synthesizer" wird die Verwendung eines Harzes beispielsweise empfohlen, das der Technik, die "kontinuierlicher Durchfluss" genannt wird, angepasst ist; die PEG PS-Harze gehorchen diesen Kriterien. Diese Träger bestehen aus einem Arm ("spacer") auf Polyethylenglycol-(PEG)-Basis, der zwischen der funktionellen Gruppe der Polystyrolkügelchen und dem Verankerungspunkt der ersten Aminosäure liegt. Die Natur dieses Verankerungspunktes kann je nach gewählter C-terminaler Funktion variieren. Im vorliegenden Fall wurden verschiedene PEG-PS-Harze verwendet.
- Das Ausgangsharz und die als Rohstoffe verwendeten Aminosäuren sind Produkte, die im Handel erhältlich sind (PerSeptive-Biosystem oder Neosystem).
- Für die Peptidsynthese wurden die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen verwendet:
- Der zeitweise Schutz der primären Aminfunktion α zu den Aminosäuren, der verwendet wird, ist die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)-Gruppe. Die Entschützung wird mit einer 20%igen Piperidinlösung in Dimethylformamid durchgeführt.
- Für die Kupplung wird vorzugsweise ein Überschuss von Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und von Hydroxy-1-benzotriazol (HOBt) verwendet.
- Nach der Synthese wird das Harz mit organischen Lösungsmitteln (Dimethylformamid, anschließend Dichlormethan) gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann mit einer Lösung auf Trifluoressigsäure-(TFA)-Basis, die auf 0°C abgekühlt wurde und entsprechende "Fänger" enthält, behandelt. Beispielsweise kann das Reagens K verwendet werden, das 82 % Trifluoressigsäure, 5 % Phenol, 5 % Wasser, 5 % Thioanisol und 3 % Ethandithiol enthält.
- Nach der Filtration des Harzes werden die synthetischen Peptide ausgefällt und mit Ether gespült.
- Die synthetischen Peptide werden anschließend durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, und ihre Reinheit wird durch Massenspektrometrie bestimmt. Als feste Phase kann beispielsweise die Bondapak C-18-Phase verwendet werden. Die Peptide werden unter Einsatz eines linearen Gradienten zwischen zwei Pufferlösungen eluiert, der erste im Wesentlichen wässrig (beispielsweise Wasser-TFA 0,1 %) und der zweite stärker organisch (beispielsweise ein Gemisch, das 60 % Acetonitril, 39,92 % Wasser und 0,08 % TFA enthält). Die gesammelten reinen Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum konzentriert und lyophilisiert.
- Für die Cyclisierung werden die synthetischen gereinigten Peptide in einer Ammoniumacetatlösung (10 mM) gelöst. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1 M Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wird kräftig gerührt. Die Cyclisierung ist nach 18 Stunden abgeschlossen. Der pH wird anschließend durch Zugabe von Essigsäure auf 6 herabgesetzt. Die cyclisierten Peptide werden lyophilisiert, anschließend durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, wie bereits zuvor beschrieben. Die Immunreaktivität der erfindungsgemäßen Peptide wird mit Hilfe von Seren aus Kranken, die überwiegend aus Kamerun stammen und mit HIV-1-Retroviren der Gruppe O infiziert waren, evaluiert. Die verschiedenen durchgeführten Tests haben gezeigt, dass sich durch die erfindungsgemäßen Peptide, allein oder in Kombination (Zusammensetzungen von Peptiden) 100 % durch HIV-1-Retroviren der Gruppe O infizierte Seren nachweisen lassen.
- Die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide finden demnach ihre Anwendung bei immunologischen Tests zum Nachweis der Infektionen aufgrund von HIV-1-Retroviren der Gruppe O. Es ist auch möglich, Kombinationen von mehreren synthetischen Peptiden der Formel I zu verwenden. Diese Kombinationen, die zwei oder mehrere Peptide der Formel I enthalten können, bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung. Kombinationen, die die Peptide Nr. 1 (2B) und Nr. 3 (4B) enthalten, sind bevorzugt.
- Es ist auch möglich, erfindungsgemäße synthetische Peptide der Formel (I) in Kombination mit rekombinanten HIV-1-Peptiden (rekombinanten Proteinen) der Gruppe O zu verwenden, wie sie durch klassische Verfahren erhalten werden können und beispielsweise mit in der Anmeldung
EP 0 591 914 beschriebenen Sequenzen erhalten werden können. Solche Zusammensetzungen gehören ebenfalls zum Umfang der vorliegenden Erfindung. - Die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide können auch in Kombination mit anderen synthetischen oder rekombinanten HIV-1-Peptiden (rekombinanten Proteinen) und/oder HIV-2-Peptiden verwendet werden, wie die Peptide, die in den Patentanmeldungen oder Patentschriften
EP 0 387 914 ,EP 0 239 425 ,EP 0 220 273 oderEP 0 267 802 beschrieben sind. Diese Liste von Patentanmeldungen oder Patentschriften ist nicht erschöpfend und ist als Beispiel angegeben. - Die Zusammensetzungen, die ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) und ein oder mehrere synthetische oder rekombinante HIV-1- oder HIV-2-Peptide enthalten, finden ihre Anwendung bei der Diagnose zum Nachweis von Infektionskrankheiten durch verschiedene HIV-Retroviren. Diese Zusammensetzungen stellen ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
- Die Zusammensetzungen, die ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) und ein oder mehrere synthetische oder rekombinante HIV-1- oder HIV-2-Peptide enthalten, finden ihre Anwendung bei der Diagnose zum Nachweis von Infektionskrankheiten durch verschiedene HIV-Retroviren. Diese Zusammensetzungen stellen ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
- Immunanalytische in vitro Verfahren, die ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) allein oder in Kombination mit rekombinanten HIV-1-Peptiden der Gruppe O oder synthetischen oder rekombinanten HIV-1- und/oder HIV-2-Peptiden verwenden, stellen ebenfalls einen Teil der Erfindung dar.
- Die Erfindung betrifft auch Kits (Testsätze) zur Durchführung von immunanalytischen Verfahren, wie ein Peptid der Formel (I), oder schließt eine Zusammensetzung ein, die mindestens ein Peptid der Formel (I) enthält.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht zur Einschränkung angegeben.
- BEISPIEL 1:
- Dieses Peptid wurde in Festphase synthetisiert. Die von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85, Seiten 2149–2154) entwickelte Technik besteht darin, die erste Aminosäure über seine Säurefunktion auf einem festen polymeren Träger (Harz) zu fixierten und die Peptidsequenz ausgehend von dieser ersten Aminosäure zu verlängern, wobei das Peptid während der Synthese auf dem Harz verankert bleibt.
- Für die Synthese des Peptids Nr. 2 wurde als Synthezizer das Synthesegerät "9050 Plus Pep Synthesizer" und als Harz das Harz Fmoc Thr (OtBu) PEG PS verwendet.
- Die verschiedenen Syntheseschritte sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefasst: Tabelle I
- Nach abgeschlossener Synthese wurde das Harz mit Dimethylformamid, anschließend mit Dichlormethan gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Anschließend wurde das Harz mit dem Reagens K (82 % Trifluoressigsäure; 5 % Phenol; 5 % Wasser; 5 % Thioanisol; 3 % Ethandithiol) behandelt. Das Peptid Nr. 2 (3B), das durch Präzipitation mit Diethylether isoliert wurde, wurde anschließend mit dem gleichen Lösungsmittel gespült. Somit wurden 140 mg des Peptids Nr. 2 (3B) erhalten.
- Das Peptid Nr. 2 (3B) wurde anschließend durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt. Als feste Phase wurde die Bondapak C-18 Phase verwendet. Das Peptid wurde unter Anwendung eines linearen Gradienten zwischen zwei Pufferlösungen, der erste im Wesentlichen wässrig (beispielsweise Wasser-TFA 0,1 %) und der zweite stärker organisch (beispielsweise ein Gemisch enthaltend: Acetonitril 60 %, Wasser 39,92 % und TFA 0,08 %), eluiert. Die gesammelten reinen Fraktionen wurden vereinigt, unter Vakuum konzentriert und lyophilisiert.
- Zur Cyclisierung wurde das so erhaltene gereinigte synthetische Peptid in einer Ammoniumacetatlösung (10 mM) gelöst. Der pH wurde anschließend durch Zugabe von 1 M Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wurde kräftig gerührt. Die Cyclisierung war nach 18 Stunden abge schlossen. Der pH wurde anschließend durch Zugabe von Essigsäure auf 6 herabgesetzt. Das cyclisierte Peptid wurde lyophilisiert und anschließend durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, wie bereits zuvor beschrieben, gereinigt.
- Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung: PEPTID Nr. 15 (22B)
- Dieses Peptid wurde als Peptid Nr. 2 (3B), allerdings unter Verwendung des Harzes FmocPAL PEG-PS als Harz synthetisiert.
- Die verschiedenen Syntheseschritte sind in der Tabelle II nachstehend zusammengefasst: Tabelle II
- Nach abgeschlossener Synthese wurde das Harz mit Dimethylformamid und anschließend mit Dichlormethan gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Anschließend wurde das Harz mit K-Reagens (Trifluoressigsäure 82 %; Phenol 5 %; Wasser 5 %; Thioanisol 5 %; Ethandithiol 3 %) behandelt. Das Peptid Nr. 7 (22B), das durch Präzipitation mit Diethylether isoliert wurde, wurde anschließend mit dem gleichen Lösungsmittel gespült. Somit wurden 140 mg Peptid Nr. 15 (22B) erhalten.
- Das Peptid Nr. 15 (22B) wurde anschließend durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, anschließend cyclisiert, lyophilisiert und wie zuvor für das Peptid Nr. 2 (3B) beschrieben gereinigt.
- Entsprechend wurden unter Verwendung der Harze und entsprechenden Aminosäuren die anderen erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisiert.
- Tabelle III gibt das Molekulargewicht von bestimmten Peptiden der Formel (I) in nicht cyclisierter Form an, bewertet durch Massenspektrometrie. Tabelle III
- BEISPIEL 2:
- Evaluierung der Immunreaktivität der erfindungsgemäßen Peptide durch immunoenzymatischen Test: Test Nr. 1
- Die verwendeten Seren ESS, DUR, VAU und HAD sind Seren von französischen Kranken, die mit HIV-1-Retroviren der Gruppe O infiziert waren. Die anderen Proben von Seren von Kranken, die mit HIV-1-Retroviren der Gruppe O infiziert waren, wurden vom Centre Pasteur de Yaounde, Kamerun, erhalten und wurden als Gruppe O gemäß dem serologischen Algorithmus der in AIDS (1977), 11, Seiten 445–453, beschrieben ist, serotypisiert.
- Die HIV-negativen Seren (n=48) wurden aus gesunden Freiwilligen erhalten.
- Die verwendeten synthetischen Peptide wurden in Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml (Stammlösung) gelöst. Für den Sensibilisierungsschritt der festen Phase (coating) wurden jeder MicrotiterTM (NUNC)-Mikrotiterplatten-Vertiefung 110 μl einer 2 μg/ml Lösung eines jeden Peptids (erhalten durch Verdünnung der Stammlösung mit 0,1 M Carbonatpufferlösung) zugesetzt. Nach Inkubation über Nacht bei Umgebungstemperatur wurden die Mikroplatten zuerst mit einer Tris-NaCl-Pufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,1 % Tween® 20 und Natriummerthiolat, 0,001 %, gewaschen, anschließend mit einer PBS-Lösung, enthaltend 0,5 % RegilaitTM (entcremte Trockenmilch), gesättigt. Nach Absaugen der Sättigungslösung wurden die Platten 10 Minuten bei 50°C erwärmt.
- Die Proben von Seren wurden mit einer Magermilchlösung (Citratpuffer, dem 0,01 % Phenolrot, 0,25 % Chloroform und 0,25 % Kathon® zugesetzt war) 1/5verdünnt, in die Vertiefungen der Platten gegeben und 30 Minuten bei 40°C inkubiert.
- Nach dem Waschen mit einer Tris-NaCl-Pufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,1 % Tween® 20 und 0,001 % Natriummerthiolat, wurden 100 μl einer Lösung von Anti-human-IgG- und IgM-Ziegen-Antikörper-Konjugat, markiert mit Raifort-Peroxidase, enthaltend als Konservierungsmittel 0,01 % Natriummmerthiolat, in Lösung in einer Citratpufferlösung, der 30 % Glycerin und normales 25 % fetales Kälberserum zugesetzt wurden, jeder Vertiefung von Platten zugesetzt, und anschließend wurden letztere 30 Minuten bei 40°C inkubiert.
- Nach dem Waschen mit einer Tris-NaCl-Pufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,1 % Tween® 20 und 0,001 % Natriummerthiolat, wurde die Entwicklung der Färbung durch Zugabe zu jeder Vertiefung von 100 μl O-Phenylendiamin in Lösung in Wasserstoffperoxid erhalten. Die Mikroplatten wurden anschließend 30 Minuten bei Umgebungstemperatur und im Dunkeln inkubiert. Die Färbereaktion wurde anschließend durch Zugabe von 100 μl 4 N Schwefelsäure angehalten. Die Extinktion (A) wurde bei 490 und 620 nm bestimmt.
- Die relative Extinktion (A490–A620), die in jeder Vertiefung abgelesen wurde, ist proportional zu der Immunreaktivität eines jeden Peptids. Dies gibt die Fähigkeit eines jeden Peptids an, mit der biologischen Probe zu reagieren, mit der der Test durchgeführt wurde. Der Schwellenwert (cut-off) wurde als Extinktion entsprechend 0,15 bestimmt. Sie entspricht dem Mittelwert von negativen Werten (n=48), Standardabweichung 12.
- Die Reaktivität der erfindungsgemäßen Peptide (Peptid Nr. 3 (4B) und Peptid Nr. 2 (3B), alle in cyclisierter Form) wurde mit derjenigen von zwei synthetischen Peptiden, mit einem Teil der natürlichen Sequenz des "Envelope" (env) des VAU-Isolats (HIV-1-Retrovirus der Gruppe O) als Sequenz und umfassend ein immunodominantes gp41-Epitop, verglichen.
- Diese beiden Peptide besitzen die folgende Sequenz: VAU 22 AAVAU 35 AA
- Für die Untersuchung wurden diese Peptide in cyclisierter Form verwendet. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle IV angegeben.
- Tabelle IV
-
- * Serotypen/Genotypen
- ** > = Signal, das größer ist als die Lesekapazität des Spektralphotometers
- Tabelle IV (Fortsetzung
-
- * Serotypen/Genotypen
- ** > = Signal, das größer ist als die Lesefähigkeit des Spektralphotometers
- *** nicht getestet
- Die Ergebnisse der Tabelle IV zeigen, dass das Peptid Nr. 3 (4B) die besseren Leistungen hinsichtlich derjenigen aufweist, die sich für die anderen Peptide ergeben haben. Durch dieses Peptid lassen sich die Seren von Kranken, die mit HIV-1-Retroviren der Gruppe O infiziert sind, bezüglich derjenigen Peptide mit einem Teil der Sequenz des VAU-Isolats, entsprechend dem immundominanten Epitop von gp41, besser diskriminieren. Ferner ist das erfindungsgemäße Peptid Nr. 2 (3B) immunreaktiver als das Peptid VAU 22 AA, das die gleiche Anzahl von Aminosäuren umfasst.
- BEISPIEL 3:
- Evaluierung der Immunreaktivität der erfindungsgemäßen Peptide durch einen immun-enzymatischen Test: Test Nr. 2
- Die Proben von Seren von Kranken, die mit HIV-1-Retroviren der Gruppe O infiziert waren, wurden vom Centre Pasteur de Yaoundé, Kamerun, erhalten und wurden als Gruppe O serotypisiert nach dem serologischen Algorithmus, der beschrieben ist in AIDS (1977), 11, Seiten 445–453. Eine Genotyp-Probe (Maryland) stammt aus den Vereinigten Staaten. Diese Proben wurden zuvor mit negativem Humanserum in den in der Tabelle V angegebenen Verdünnungen verdünnt, um über ein ausreichendes Volumen für die verschiedenen Immunreaktivitätstests zu verfügen.
- Die verwendeten synthetischen Peptide wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in Wasser gelöst (Stammlösung). Für den Sensibilisierungsschritt der festen Phase ("coating") wurde, wie bereits in Beispiel 2 beschrieben, vorgegangen.
- Die Proben von Seren wurden mit einer Magermilchlösung (in Citratpuffer, dem 0,01 % Phenolrot, 0,25 % Chloroform und 0,25 % Kathon® zugesetzt waren) 1/5 verdünnt, in die Vertiefungen der Platten gegeben und 30 Minuten bei 40°C inkubiert.
- Nach dem Waschen mit einem Tris-NaCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1 % Tween® 20 und 0,001 % Natriummerthiolat, wurden 100 μl einer Lösung von Anti-human-IgG- und -IgM-Ziegen-Antikörper-Konjugat, markiert mit Raifort-Peroxidase, enthaltend als Konservierungsmittel 0,01 % Natriummerthiolat, in Lösung in einer Citratpufferlösung, der 30 % Glycerin und 25 % normales Kälberserum zugegeben wurden, jeder Vertiefung der Platte zugesetzt, anschließend wurden diese 30 Minuten bei 40°C inkubiert.
- Nach dem Waschen mit einem Tris-NaCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1 % Tween® 20 und 0,001 % Natriummerthiolat, wurde die Entwicklung der Färbung, wie in Beispiel 2 beschrieben, erhalten.
- Die relative Extinktion (OD) (A490–A620), die in jeder Vertiefung abgelesen wurde, ist proportional zu der Immunreaktivität eines jeden Peptids. Dies gibt die Fähigkeit eines jeden Peptids an, mit der biologischen Probe, mit der der Test durchgeführt wird, zu reagieren. Die Reaktivität der erfindungsgemäßen Peptide, Peptide Nr. 10 (14B), Nr. 11 (18B), Nr. 12 (19B), Nr. 14 (21B), Nr. 15 (22B), Nr. 16 (23B), alle in cyclisierter Form, wurde mit derjenigen von drei synthetischen homologen Peptiden mit einem Teil der natürlichen "Envelope-" (env) Sequenz des HIV-1-Retrovirus der Gruppe O als Sequenz verglichen. Diese Peptide sind zwei Peptide, die sich von dem VAU-Isolat ableiten – das Peptid VAU 22 AA und das Peptid VAU 35 AA – und das Peptid MVP 5180 (als «MVP 5180» in der Tabelle V bezeichnet. Die Peptide VAU 22 AA und VAU 35 AA (deren Struktur in Beispiel 2 angegeben ist) und das Peptid MVP 5180, umfassen ein immundominantes Epitop von gp41.
- Alle diese Peptide wurden in cyclisierter Form verwendet. Die Sequenz des Peptids MVP 5180 ist folgende: MVP 5180
- Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle V angegeben.
- Tabelle V
-
- FESTE PHASE* : PEPTID 2 μg/ml
- Für jedes getestete Peptid wurden die Proben in vier Klassen (a, b, c und d) eingeteilt, entsprechend verschiedenen relativen Extinktionsniveaus, die bei den Wellenlängen A492–A620 abgelesen wurden:
- • für a: OD > 0,100
- • für b: 0,100 > OD > 0,500,
- • für c: 0,500 > OD > 1,000,
- • für d: OD > 1,000,
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle VI angegeben.
- Tabelle VI
-
- FESTE PHASE*: PEPTID 2 μg/ml
- Die Ergebnisse zeigen, dass sämtliche erfindungsgemäße getesteten Peptide eine bessere Leistung in der Immunreaktivität ausführten als die Referenzpeptide der bisherigen Technik, die aus natürlichen Isolaten (MVP 5180, VAU) stammten. Die erfindungsgemäßen Peptide Nr. 15 (22B), Nr. 14 (21B) und Nr. 16 (23B) erwiesen sich als besonders immunreaktiv.
- BEISPIEL 4:
- Evaluierung der Immunreaktivität der Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Peptide enthalten, durch immunenzymatischen Test
- Für diesen Test wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll vorgegangen, und die gleichen Seren wurden verwendet. Die verwendeten Mikroplatten wurden mit dem cyclisierten Peptid Nr. 3 (4B) sensibilisiert. In jede Vertiefung wurden 100 μl einer Lösung, enthaltend 2 μg/ml Peptid Nr. 3 (4B), vorgelegt.
- Die Ergebnisse dieses Tests sind in der Tabelle VII angegeben.
- Tabelle VII
-
-
- * > = Signal, das über dem Lesevermögen des Spektralphotometers liegt.
- Die Ergebnisse von Tabelle VII zeigen, dass die Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Peptide bei Verwendung bei der Diagnostik den Nachweis in allen Seren von mit den HIV-1-Retroviren der Gruppe O infizierten Kranken erlauben. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (15)
- Synthetische Peptide des monomeren Typs mit 13 bis 33 Aminosäuren oder des dimeren Typs mit 26 bis 66 Aminosäuren in linearer Form oder in einer mithilfe von Disulfidbrücken zwischen Cysteinen cyclisierten Form der allgemeinen Formel (I):
- Synthetische Peptide der Formel (I) nach Anspruch 1, worin die durch Δ dargestellte aliphatische Kette eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkenylkette mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Aminoalkylcarbonylkette mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
- Synthetische Peptide der Formel (I) nach Anspruch 1 oder 2, worin (AA5) entweder für einen Valinrest oder einen Leucinrest oder einen Threoninrest steht und, wenn Ω einer Peptidsequenz der Formel (XII) oder (XIV) entspricht, (AA6) entweder für einen Glutaminrest oder einen Argininrest steht.
- Synthetische Peptide der Formel (I) nach Anspruch 1 oder 2, worin – Δ für einen Biotinylrest, ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kette, die gegebenenfalls eine oder zwei Thiol-, Aldehyd- oder Aminfunktionen trägt, steht, wobei die aliphatische Kette eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Aminoalkylcarbonylkette mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, – Z für eine Peptidsequenz einer der Formel (II) oder (V), worin Ξ1 für eine Peptidsequenz mit zwei Aminosäuren steht und Ξ2 für eine Aminosäure steht, oder eine Sequenz der Formel (IV), in der Ξ1 drei Aminosäuren darstellt, oder eine Peptidsequenz der Formel (VIII), in der Ξ1 eine Peptidsequenz mit neun, acht oder drei Aminosäuren darstellt und Ξ2 eine Peptidsequenz mit fünf Aminosäuren darstellt, steht – Θ für eine Peptidsequenz der Formel:
- Synthetische Peptide der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin Z eine Peptidsequenz der Formel: • -Leu Leu Ser Ser • -Leu Leu Ser Leu • -Leu Leu Asn Ser • -Arg Leu Asn Ser • -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser • -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu • -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile- • -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser oder • Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser- darstellt.
- Synthetische Peptide mit 20 bis 50 Aminosäuren nach Anspruch 1 der Formel (Ia):
- Synthetische Peptide der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die eine der folgenden Sequenzen umfassen: Sequenz Nr. 2
Sequenz Nr. 3
Sequenz Nr. 4
Sequenz Nr. 5
Sequenz Nr. 8
Sequenz Nr. 9:
Sequenz Nr. 10:
Sequenz Nr. 11:
Sequenz Nr. 12:
Sequenz Nr. 13
Sequenz Nr. 14:
Sequenz Nr. 15:
Sequenz Nr. 16:
- Synthetische Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit der Sequenz: PEPTID Nr.2 (3B)PEPTID Nr 3 (4B)
PEPTID Nr.4 (5B)
PEPTID Nr. 5 (6B)
PEPTID Nr.8 (7B)
PEPTID Nr. 9 (12B)
PEPTID Nr. 10 (14B)
PEPTID Nr. 11 (18B)
PEPTID Nr. 12 (19B)
PEPTID Nr. 13 (20B)
PEPTID Nr. 14 (21B)
PEPTID Nr. 15 (22B)
PEPTID Nr. 16 (23B)
- Zusammensetzung, die ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.
- Zusammensetzung nach Anspruch 9, die das Peptid Nr. 3 (4B) enthält.
- Zusammensetzung, die ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) nach Anspruch 1 und ein oder mehrere rekombinante Peptide VIH-1 der Gruppe O enthält.
- Zusammensetzung, die ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) nach Anspruch 1 und ein oder mehrere synthetische oder rekombinante VIH-1- und/oder VIH-2-Peptide enthält.
- Verfahren zur immunologischen In-vitro-Quantifizierung unter Verwendung eines oder mehrerer synthetischer Peptide der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
- Verfahren zur immunologischen In-vitro-Quantifizierung unter Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12.
- Diagnostisches Kit, das ein oder mehrere synthetische Peptide der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12 enthält.
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