DE602005005999T2

DE602005005999T2 - Modifizierte hiv-1-peptide und ihre verwendung beim nachweisen von anti-hiv-antikörper

Info

Publication number: DE602005005999T2
Application number: DE602005005999T
Authority: DE
Inventors: Stephane Gadelle; Francois Rieunier
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-07-27
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2025-07-28
Also published as: US20090263785A1; CN101035804B; ATE391721T1; US7988975B2; JP2008509112A; FR2874017A1; ES2302236T3; CN101035804A; JP4476327B2; DE602005005999D1; CA2576715C; FR2874017B1; EP1778721A1; CA2576715A1; WO2006024752A1; RU2007108306A; EP1778721B1; RU2352579C2

Description

Die Erfindung betrifft synthetische Peptide, die in immunologischen Assays zur Detektion von auf HIV-1-Viren zurückzuführenden Infektionen verwendbar sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, Zusammensetzungen und Kits, die solche Peptide enthalten, die Verwendung solcher Peptide zu diagnostischen Zwecken sowie immunologische Assayverfahren, in welchen sie zur Detektion von Anti-HIV-Virus-Antikörpern verwendet werden.
Der Retrovirus vom Typ HIV-1 (humaner Immunschwächevirus vom Typ 1 oder HIV-1 auf Englisch) ist dafür bekannt, dass er historisch das erste für Aids beim Menschen verantwortliche Agens ist. Heutzutage werden die Viren vom Typ HIV-1, die HIV-1-Viren der Gruppe M (Hauptgruppe) und die HIV-1-Viren der Gruppe O (Nebengruppe, die ursprünglich als Untertyp O bezeichnet wurde), die sich unter anderem genomisch und immunologisch unterscheiden, unterschieden. Seit 1986 (Clavel et al., Science, Bd. 233, 343–346, 18. Juli 1986) ist ein zweiter für Aids beim Menschen verantwortlicher Virustyp, der als HIV-2 bezeichnet wird, bekannt.
Aus Gründen der Vereinfachung werden die HIV-1-Viren der Gruppe M im Folgenden mit "HIV-1 M" und die HIV-1-Viren der Gruppe O mit "HIV-1 O" abgekürzt.
Der Retrovirus vom Typ HIV-1 ist ursprünglich in Form von 3 unterschiedlichen Isolaten entdeckt worden. Diese Isolate wurden als LAV, HTLV-III und ARV bezeichnet, wobei dieses Isolat mitunter auch als ARV-2 bezeichnet wurde. Hierzu kann man sich unterrichten aus den Aufsätzen von Barre-Sinoussi et al. (Science, 220, 868–871, 20. Mai 1983), Popovic et al. (Science, 224, 497–500, 4. Mai 1984), Gallo et al. (Science, 224, 500–503, 4. Mai 1984) und Levy et al. (Science, 225, 840–842, 24. August 1984), die über die Entdeckung dieser Isolate berichten. Diese 3 Isolate gehören heutzutage zur Kategorie der HIV-1-M-Viren. Die HIV-1-O-Viren sind deutlich später, ab 1990, beschrieben worden, wobei ihre Isolate verschiedene Bezeichnungen wie HIV-3 oder ANT 70 (europäische Patentanmeldung EP 345 375 und De Leys et al., Journal of Virology, Bd. 64, Nr. 3, 1207–1216, März 1990) oder später MVP5180/91 (Gürtler et al., Journal of Virology, Bd. 68, Nr. 3, 1581–1585, März 1994, und europäische Patentanmeldung EP 0 591 914 ) getragen haben. Weitere Isolate der Gruppe O wie HIV-1_VAU, HIV-1_DUR und MVP2901/94 sind seitdem beschrieben worden.
Die Sequenz der ersten Isolate des Retrovirus HIV-1 M ist zu Beginn des Jahres 1985 aufgeklärt und veröffentlicht worden, wobei man sich unterrichten kann aus den Aufsätzen von Wain-Hobson et al. (Cell, 40, 9–17, Januar 1985), Ratner et al. (Nature, 313, 277–287, 24. Januar 1985) und Sanchez-Pescador et al. (Science, 227, 484–492, 1. Februar 1985). Die Viren LAV, HTLV-III und ARV/ARV-2 sind seitdem als Varianten desselben Aids-Virus erkannt worden, der jetzt unter der Bezeichnung HIV-1 (für humanes Immunschwächevirus) (Ratner et al., Nature, Bd. 313, 636–637, 21. Februar 1985) bekannt ist.
Die ersten Assays zur in-vitro-Diagnostik der Infektion mit HIV-1 M. die 1984 bis 1985 begannen, wurden durch Immunoassays realisiert und waren auf die Detektion des Vorhandenseins von Anti-HIV-1-M-Antikörpern in humanen biologischen Proben wie Serum oder Plasma gerichtet. Für diese ersten Immunoassays zur Detektion von Anti-HIV-1-M-Antikörpern wurde virales Lysat als Antigen-Target zum Andocken der gesuchten Antikörper (dies waren Immunoassays der ersten Generation) verwendet. Da sie mitunter falsch negative und/oder falsch positive Ergebnisse aufgrund des ungenügenden Reinheitsgrades des Antigen-Präparates, das für sie verwendet wurde, ergaben, wurde dann auf Gentechnik zurückgegriffen, um Antigene zu erzeugen, die besser kontrolliert und homogener waren und sich als sensibler und spezifischer erwiesen. Dazu sind beispielsweise die Arbeiten, die von mehreren Teams zu verschiedenen Antigenformen des Transmembran-Hüllglykoproteins, des gp41, des HIV-1-M durchgeführt wurden, und die Immunoassays, in welchen diese verwendet wurden, zu nennen, Arbeiten, die beispielsweise in den Aufsätzen von Chang et al. (Science, 228, 93–96, 5. April 1985), Crowl et al. (Cell, 41, 979–986, Juli 1985), Chang et al. (BioTechnology, 3, 905–909, Oktober 1985) und Cabradilla et al. (BioTechnology, 4, 128–133, Februar 1986) mitgeteilt wurden. Diese Immunoassays auf der Basis eines rekombinierten Antigens bildeten dann die Immunoassays der zweiten Generation. Obwohl sie einen großen Fortschritt darstellten, erlaubten diese neuen Immunoassays immer noch nicht, alle Seren von mit HIV-1 M infizierten Personen zu detektieren.
Auf der Suche nach immer höherer Sensibilität und Spezifität haben sich einige Teams synthetischen Peptiden, die kurz (im Allgemeinen weniger als 50 Aminosäuren), leicht herzustellen und zu kontrollieren und als Antigen-Targets zur Detektion der Anti-HIV-1-M-Antikörper verwendbar sind, zugewandt. So haben Wang et al. (PNAS, Bd. 83, 6259–6163, August 1986) die Verwendung eines Peptids des gp41 eines HIV-1 M mit der Sequenz RILAVERYLKDQQLLGIWGC₆₀₃S (SEQ ID Nr. 8) als Andockantigen für Antikörper beschrieben.
Auf dieselbe Weise ist in der Patentanmeldung WO86/06414 von Genetic Systems Corporation eine Reihe von kurzen Peptiden beschrieben worden, von welchen einige vom gp41 des HIV-1 M_BRU abgeleitet sind, wie das Peptid (X) (39), das der sehr ähnlichen Sequenz RILAVERYLKDQQLLGIWGC₆₀₃SGKLIC₆₀₉ (SEQ ID Nr. 9) entspricht.
In dem Patent US 4 879 212 (Wang et al.) ist ein etwas längeres Peptid des gp41 des HIV-1 M (35 Aminosäuren) mit der Sequenz: RILAVERYLKDQQLLGIWGC₆₀₃SGKLIC₆₀₉TTAVPWNAS (SEQ ID Nr. 10) beschrieben.
Die Peptide von Wang et al. und diejenigen der Patentanmeldung WO86/06414 verleihen den neuen Immunoassays auf der Basis von Peptiden, die als Immunoassays der dritten Generation bezeichnet werden, eine sehr große Sensibilität und Spezifität. Zahlreiche Autoren haben den Weg von kurzen Peptiden für die Entwicklung neuer Reagenzien und seitdem von zahlreichen kommerziellen Kits für die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern, die sie enthalten, befolgt.
Das Team von John W. Gnann, an der Scripps-Klinik von La Jolla, Kalifornien, hat sogar in dem obigen Peptid (X) (39) ein Epitop identifiziert, das aufgrund der Tatsache diagnostisch sehr bedeutend ist, da es gleichzeitig sehr immunoreaktiv und für HIV-1 M sehr spezifisch ist; dies ist das immunodominante Epitop mit der Sequenz WGC₆₀₃SGKLIC₆₀₉ des gp41 des HIV-1 M (Gnann et al., Journal of Virology, 2639–2641, August 1987, und Gnann et al., Science, Bd. 237, 1346–1349, 11. September 1987). Gnann et al. hatten die Idee entwickelt, dass in diesem immunodominanten Epitop die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den zwei Cysteinen C₆₀₃ und C₆₀₉ eine Schlüsselrolle bei der Antigenkonformation des Epitops spielen könnte, indem es potentiell die Schaffung einer cyclischen Struktur begünstigt.
Wenig später wurden in den Patentanmeldungen WO89/03844 von AB Ferring und EP 0 326 490 A2 von IAF Biochem International Peptide des gp41 des HIV-1 M beschrieben, die das "Epitop von Gnann et al." in einer Form tragen, die absichtlich durch eine Disulfidbrücke zwischen den zwei Cysteinen C₆₀₃ und C₆₀₉ cyclisiert worden war, und die ganz allgemein, vereinfacht und symbolisiert mit der folgenden willkürlichen Formel bezeichnet werden können:
Sie bestätigten die Pioniervermutung von Gnann et al.
In der Patentanmeldung EP 0 326 490 A2 ist unter anderem das 35mer Peptid des gp41 des HIV-1 M des US-Patents 4 879 212 (Wang et al.) beschrieben, aber in cyclisierter Form und mit der Sequenz (I):
Die von solchen so cyclisierten Peptiden beigetragene Verbesserung ist jedoch immer noch Gegenstand von Kontroversen, da diese Peptide eine ausreichend zeitige Detektion bestimmter Serokonversionsproben des HIV-1 M nicht erlauben. So sind insbesondere die Eigenschaften des obigen cyclischen Peptids mit der Sequenz (I) hinsichtlich der Sensibilität noch ungenügend, da es dieses Peptid nicht erlaubt, alle positiven Serokonversionsproben aus Anti-HIV-1- M-Antikörpern zu detektieren, und es außerdem Probleme hinsichtlich Syntheseausbeute und Löslichkeit verursacht.
Zusammengefasst bleiben, unabhängig davon, welches das Peptid des gp41 ist, das als Target-Antigen für die Detektion der Anti-HIV-1-M Serokonversionen verwendet wird, noch einige schwach positive Proben, die sich mit diesen Immunoassays der dritten Generation nicht detektieren lassen. Es besteht deshalb im Stand der Technik Bedarf an verbesserten Reagenzien, die löslich und für die Detektion von positiven Proben aus Anti-HIV-1-M-Antikörpern verwendbar sind. Insbesondere besteht Bedarf an Reagenzien mit erhöhter Sensibilität, die eine noch frühzeitigere Detektion der Serokonversionen erlauben. Es ist in der Tat für eine Bluttransfusion von entscheidender Bedeutung, so schnell wie möglich jede mit HIV-1 M infizierte Probe detektieren zu können. Das Gewinnen von sei es nur einer Woche, welche die Detektion eher erfolgen kann, ist von sehr großer Bedeutung, um beispielsweise die Übertragung des Virus auf einen mit einer Bluttransfusion versorgten Menschen zu verhindern. Von den Erfindern ist somit begonnen worden, danach zu suchen, ein dem cyclischen Peptid mit der Sequenz (I) ähnliches Peptid, aber leichter, das heißt mit einer besseren Ausbeute, herstellen zu können. Von mehreren möglichen Ansätzen bestand einer darin, einfach die Größe des Peptids zu verkleinern, und ein weiterer, die Reste von Aminosäuren, die in der Lage sind, eine Senkung der Syntheseausbeute (beispielsweise Probleme mit Löslichkeit, Kopplung und Nebenreaktionen) zu verursachen, zu ersetzen. Ein anderer möglicher Ansatz bestand beispielsweise in der Verlängerung des Peptids mittels hydrophiler Aminosäuren, um zu versuchen, es löslicher zu machen.
Von den Erfindern ist der Tryptophanrest in Position 615 durch verschiedene Reste ersetzt worden, um ein (zwischen den zwei Cysteinresten nicht cyclisiertes) lineares Peptid mit der folgenden Sequenz (II) zu erhalten:
worin
X eine Aminosäure bedeutet, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die von F und G gebildet wird, und
die zwei Aminosäuren aa₁ und aa₂ entweder fehlen oder

aa₁:: Alanin
aa₂:: Serin

Dabei ist es dem Fachmann bekannt, dass die Buchstaben F und G die Aminosäuren Phenylalanin (F) und Glycin (G) symbolisieren.
Durch direkte Oxidation der zwei Cysteine an Peptiden mit der Sequenz (II) haben die Erfinder anschließend cyclisierte Peptide hergestellt, die der folgenden Formel (III) entsprechen:
wobei
X eine Aminosäure bedeutet, die aus der von F und G gebildeten Gruppe ausgewählt ist, und
die zwei Aminosäuren aa₁ und aa₂ entweder fehlen oder

aa₁:: Alanin
aa₂:: Serin

Es wurden insbesondere die folgenden cyclisierten Peptide synthetisiert, die mit SEQ ID Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 bzw. Nr. 4 bezeichnet werden:
Überraschenderweise und vollkommen unerwartet unter Berücksichtigung der Tatsache, dass einerseits bei bestimmten Peptiden die ursprünglich lange Sequenz aus 35 Aminosäuren gekürzt wurde, mit der Gefahr, dass so ein funktionelles Epitop verlorengeht, und dass andererseits teilweise künstliche Sequenzen erzeugt wurden, die sich in natürlichen Virenquellen nicht finden, ist von den Erfindern festgestellt worden, dass, indem so das cyclische Peptid mit der Formel (I) des Standes der Technik, das nicht alle positiven Serokonversionsproben aus Anti-HIV-1-M-Antikörpern detektiert, modifiziert wird, neue Peptide erhalten werden, die Peptide mit der Sequenz (III), die in der Lage sind, alle diese Proben zu detektieren.
Die Erfindung hat somit zum Gegenstand ein cyclisches Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III):
worin
X eine Aminosäure bedeutet, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die von F und G gebildet wird, und
die zwei Aminosäuren aa₁ und aa₂ entweder fehlen oder

aa₁:: Alanin
aa₂:: Serin

Die Erfindung hat weiterhin zum Gegenstand eine Zusammensetzung, insbesondere eine Antigen-Zusammensetzung, die ein Peptid mit der Sequenz (III) umfasst.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand ein Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III), das aus der Gruppe ausgewählt ist, die von folgenden Peptiden gebildet wird:
Die Erfindung hat außerdem zum Gegenstand eine Zusammensetzung, insbesondere eine Antigen-Zusammensetzung, die ein Peptid mit der Sequenz (III) umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die von den vorhergehenden Peptiden mit den SEQ ID Nrn. 1 bis 4 gebildet wird.
Unter einer erfindungsgemäßen "Zusammensetzung" ist jede flüssige oder feste Anlagerung aus mehreren molekularen Komponenten zu verstehen. Bestimmte Zusammensetzungen oder Gemische bestehen aus flüssigen oder festen wässrigen Lösungen und umfassen eine oder mehrere interessierende chemische Komponenten. Eine solche wässrige Lösung kann aus einem Puffer mit einem pH-Wert von im Allgemeinen in der Nähe der Neutralität (vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 9) und vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren Protiden (das heißt Proteinen, Polypeptiden, Oligopeptiden und/oder Aminosäuren), die für den gewünschten Zweck nützlich sind, bestehen. Von den dem Fachmann bekannten Puffern sind beispielhaft Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Boratpuffer zu nennen. Von den in den Puffern verwendbaren Proteinen sind unter anderem beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA) zu nennen. Oft wird ein Konservierungsstoff wie Natriumnitrid sowie gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel solchen Zusammensetzungen zugegeben.
Unter einer erfindungsgemäßen "Antigen-Zusammensetzung" ist jede weiter oben genannte Zusammensetzung zu verstehen, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid (mit der Sequenz [III]) in einer solchen Form enthält, dass dieses im Wesentlichen seine ursprüngliche Antigen-Reaktivität, das heißt, sein Vermögen, von Anti-HIV-Antikörpern erkannt zu werden, behält. Solche Antigen-Zusammensetzungen können auch ein Antigen des HIV-2 und/oder ein Antigen des HIV-1 O, das/die immunoreaktiv gehalten worden ist/sind, enthalten.
Solche Antigen-Zusammensetzungen können zur in-vitro-Diagnostik in einer Probe aus einem humanen biologischen Fluid einer Infektion durch ein HIV und insbesondere, aber nicht ausschließlich, zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer dem Fachmann an sich bekannten beliebigen Form einer Immunoassayvorschrift (siehe auch unter anderem den anschließenden Abschnitt "Spezielle Beschreibung der Erfindung", Abschnitt 4) dienen.
Solche Antigen-Zusammensetzungen können in flüssiger oder trockener Form in Kits für die in-vitro-Diagnostik einer HIV-Infektion, insbesondere in Kits für die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern, eingebaut werden. Diese Antigen-Zusammensetzungen können auf einer festen Phase immobilisiert oder in ein Detektionsantigen wie ein insbesondere beispielsweise mit einem Enzym markiertes Antigen entsprechend dem Fachmann an sich bekannten Verfahren eingebaut werden.
Die Erfindung hat darüber hinaus zum Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit der Sequenz (III), insbesondere eines Peptids, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die von den Peptiden SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 gebildet wird.
Die Erfindung hat außerdem zum Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die ein Peptid mit der Sequenz (III) umfasst, insbesondere ein Peptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die von den Peptiden SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 gebildet wird.
Die Erfindung hat zusätzlich zum Gegenstand ein Verfahren zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe, das das

a) In-Berührung-Bringen der biologischen Probe entweder mit einem Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III), insbesondere einem Peptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die von den Peptiden SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 gebildet wird, und/oder einer ein solches Peptid umfassenden Zusammensetzung oder mit einer Kombination von Peptiden mit der Sequenz (III),
b) Inkubieren des Gemischs unter Bedingungen, welche die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen erlauben, und
c) Nachweisen und Detektieren der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch ein Detektionsmittel, das gegebenenfalls von einem HIV-1-Antigen gebildet wird, das gegebenenfalls ein erfindungsgemäßes Peptid mit der Sequenz (III), das markiert und in der Lage ist, an einen angedockten Anti-HIV-1-Antikörper zu binden, umfasst,

Die Erfindung hat noch zum Gegenstand das vorhergehende Verfahren zum Detektieren von Anti-HIV-Antikörpern, dessen Stufe a) das In-Berührung-Bringen der biologischen Probe mit einem Gemisch, das aus mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid des gp41 mit der Sequenz (III) und einem Antigen des HIV-2 und/oder einem Antigen des HIV-1 O besteht, umfasst.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand einen Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe, der ein Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III), insbesondere ein Peptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Peptiden SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 besteht, oder eine Zusammensetzung, die ein solches Peptid, gegebenenfalls zusammen mit einem Antigen des HIV-2 und/oder einem Antigen des HIV-1 O umfasst, enthält.
Die Erfindung hat noch zum Gegenstand die Verwendung mindestens eines Peptids des gp41 des Virus HIV-1 mit der Sequenz (III), insbesondere eines Peptids, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Peptiden SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 besteht, gegebenenfalls zusammen mit einem Antigen des HIV-2 und/oder einem Antigen des HIV-1 O, für die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern.
Spezielle Beschreibung der Erfindung
1. Biologische Proben:
Unter der Bezeichnung "biologische Probe" ist erfindungsgemäß eine Probe einer beliebigen humanen Körperflüssigkeit wie Blut, Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Sperma, Zerebrospinalflüssigkeit und eine beliebige andere Körperflüssigkeit, die in der Lage ist, Anti-HIV-Antikörper zu enthalten, zu verstehen.
2. Herstellung erfindungsgemäßer Peptide:
Vorzugsweise werden, da praktischer, aber nicht ausschließlich, die erfindungsgemäßen Peptide mit der Sequenz (III) durch dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren hergestellt. Beispielsweise ist die Merrifield-Synthese (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149–2154 [1963]) zu nennen. Weiterhin kann die "Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-Synthese" angewendet werden, die aus Gründen der Reinheit, der Antigen-Spezifität, des Fehlens unerwünschter Nebenprodukte und der Leichtigkeit ihrer Durchführung vorteilhaft ist.
Die Peptidsynthese kann mittels Syntheseautomaten automatisiert werden, beispielsweise vom Typ des Syntheseautomaten "Pioneer" von Perspective, des Syntheseautomaten "433A" von ABI (Applied Biosystems Inc.) oder des Syntheseautomaten "Symphony" von Rainin.
Die Peptide können auch durch Synthese in der homogenen Phase gemäß dem Fachmann an sich bekannter Verfahren erhalten werden.
Die Cyclisierung linearer Peptide, um erfindungsgemäße cyclisierte Peptide mit der Formel (III) zu erhalten, kann auf dem Fachmann an sich bekannte verschiedene Arten und Weisen realisiert werden, insbesondere entsprechend einem der Verfahren, die in den Patentanmeldungen WO89/03844 (chemische Oxidationsstufe mit Iod in methanolischer Lösung) und EP 0 326 490 A2 (Kaliumeisen[III]-zyanid-Verfahren) erläutert sind.
Durch dem Fachmann an sich bekannte Verfahren können die erfindungsgemäßen Peptide gegebenenfalls in Puffer in Gegenwart von Proteinen, Polypeptiden, Oligopeptiden oder Aminosäuren und anderen chemischen Verbindungen, die zur Bildung der erfindungsgemäßen Antigen-Zusammensetzungen nützlich sind, eingebaut werden.
3. Weitere HIV-Antigene, die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern und im erfindungsgemäßen Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern verwendbar sind
Als HIV-2-Antigen kann eine Vielfalt von Antigenen, vorzugsweise das gp140 oder das Transmembranglykoprotein gp36 des HIV-2, und besonders bevorzugt ein Peptid, das mindestens das immunodominante Epitop (des gp36) von Gnann et al., das heißt mindestens die Aminosäuren WGCAFRQVC, enthält (siehe beispielsweise den Aufsatz von Gnann et al., Science, Bd. 237, 1346–1349, 11. September 1987, und den Aufsatz von Guyader et al., Nature, 326, 662–669, 16. April 1987, in welchen die komplette Sequenz des HIV-2_ROD beschrieben ist, oder die in dem Patent EP 0 239 425 angegebene Sequenz env) und am meisten bevorzugt ein Peptid, das mindestens die Aminosäuren WGCAFRQVC in durch eine Disulfidbrücke zwischen den zwei Cysteinen cyclisierter Form umfasst, verwendet werden.
Als Antigen des HIV-1 O kann eine Vielfalt von Antigenen, vorzugsweise das gp160 oder das gp41 des HIV-1 O, verwendet werden. Besonders bevorzugt kann ein Peptid, das das immunodominante Epitop (gp41) von Gnann et al. enthält und beispielsweise mindestens die Aminosäuren WGCKGKLIC (von MVP5180/91, beschrieben in der Sequenz env der Patentanmeldung EP 0 591 914 , oder die Sequenz, die aus der Datenbank GenBank unter der Zugangsnummer L20571 erhältlich ist, siehe Gürtler et al., Journal of Virology, Bd. 68, Nr. 3, 1581–1585, März 1994) umfasst, verwendet werden. Am meisten bevorzugt kann ein Peptid, das mindestens die Aminosäuren WGCKGKLIC in durch eine Disulfidbrücke zwischen den zwei Cysteinen cyclisierter Form umfasst, verwendet werden.
Alternativ können als Antigen des HIV-1 O beispielsweise die Aminosäuren WGCKGKLVC (des HIV-3/ANT70, eine Sequenz, die aus der Datenbank GenBank unter der Zugangsnummer L20587 erhältlich ist, siehe Gürtler et al., Journal of Virology, Bd. 68, Nr. 3, 1581–1585, März 1994) verwendet werden. Am meisten bevorzugt kann ein Peptid verwendet werden, das mindestens die Aminosäuren WGCKGKLVC in durch eine Disulfidbrücke zwischen den zwei Cysteinen cyclisierter Form umfasst.
4. Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern
Was mögliche Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern betrifft, so kann man sich vorteilhafterweise beispielsweise aus der Übersicht "A Decade of Development In Immunoassay Methodology" von James P. Gosling, Clinical Chemistry, 36/8, 1408–1427 (1990) unterrichten, in welcher eine große Anzahl von als Immunoassays zur Verfügung stehenden und bekannten Technologien und Abwandlungen genannt wird.
Das Verfahren zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe kann durch einen beliebigen Immunoassay im weitesten Sinne durchgeführt werden, das heißt einen immunologischen Assay, in welchem die Bildung eines Immunkomplexes zwischen mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid und mindestens einem Anti-HIV-Antikörper stattfindet. Die immunologischen Untersuchungsverfahren oder Immunoassays sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise vom Typ EIA (Enzyme Immuno Assay), ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) und FIA (Fluoro Immuno Assay) in Abhängigkeit von dem ausgewählten Marker und dem ausgewählten markierten Reagenz sein.
Dabei bezieht sich hier der Terminus "markiert" sowohl auf eine direkte Markierung (beispielsweise über Enzyme, Radioisotope, Fluorochrome und lumineszente Verbindungen) als auch auf eine indirekte Markierung (beispielsweise über Antikörper, die ihrerseits direkt oder mittels Reagenzien eines markierten "Affinitätspaars" wie beispielsweise das Paar markiertes Avidin-Biotin markiert sind). Das Detektionsmittel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern kann beispielsweise, aber nicht ausschließlich, aus einem markierten HIV-Antigen, einem markierten humanen Anti-Immunglobulin-Antikörper oder einem beliebigen anderen Molekül mit einer Affinität für ein Immunglobulin wie dem Protein A oder dem Protein G in markierter Form bestehen. Als Marker kann beispielsweise ein Enzym, ein Radioisotop, ein Fluorochrom und eine lumineszente Verbindung, das/die auf an sich bekannte Weise mit dem erfindungsgemäßen Peptid, dem Anti-Immunglobulin-Antikörper oder einem beliebigen anderen Molekül, das als Detektionsmittel ausgewählt worden ist (beispielsweise Protein A oder Protein G), gekoppelt worden ist, verwendet werden.
Erfindungsgemäß können Peptide mit der Meerrettich-Peroxydase entsprechend einer an sich bekannten Vorschrift wie dem Verfahren von Nakane und Kawaoki (J. Mistochem. Cytochem., 22, 1984 [1974]) oder durch ein beliebiges anderes dem Fachmann bekanntes Kopplungsverfahren markiert werden. Weitere Enzyme wie die alkalische Phosphatase können verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern kann in der Festphase (heterogener Assay) oder in der Flüssigphase (homogener Assay) durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäße Detektion der Anti-HIV-Antikörper kann verschiedene dem Fachmann bekannte Vorschriften umfassen: Vorschriften vom kompetitiven Typ, vom indirekten Typ oder auch vom klassischen Antigen-Antikörper-Antigen-Sandwich-Typ, auch als "Doppelantigensandwich" bezeichnet (Maiolini et al., Journal of Immunological Methods, 20, 25–34 [1978]), in einem Schritt oder in zwei Schritten.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform in der heterogenen Phase wird in einer indirekten Vorschrift oder auch in dem "Doppelantigensandwich-Verfahren" ein Hüllantigen des HIV-1 M, das dem gp160, dem gp41 oder einem erfindungsgemäßen Peptid entspricht, gegebenenfalls zusammen mit einem HIV-2-Antigen und/oder einem HIV-1-O-Antigen, und als Antigen für das Andocken der Antikörper verwendet wird, auf einer Festphase immobilisiert. Beispielhaft können als Festphase Mikrotiterplatten, insbesondere Polystyrolmikrotiterplatten wie diejenigen, die von der Gesellschaft Nunc, Dänemark, vertrieben werden, verwendet werden. Es können auch feste Teilchen oder Kugeln, paramagnetische Kugeln wie diejenigen, die von Dynal oder Merck-Eurolab (Frankreich) (unter der Marke Estapor^TM) geliefert werden, oder beispielsweise Polystyrol- oder Polypropylenreagenzgläser und Nitrocellulosestreifen verwendet werden.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform wird im "Doppelantigensandwich-Verfahren" (Maiolini et al., 1978) ein erfindungsgemäßes Peptid, das als Detektionsmittel markiert ist, das heißt als Antigen für den Nachweis der auf der Festphase gebildeten und immobilisierten Komplexe, verwendet.
Entsprechend einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann innerhalb der indirekten Vorschrift ein humaner Anti-Immunglobulin-Antikörper oder ein immunoreaktives Fragment (beispielsweise Fab und Fab') dieses Antikörpers als Detektionsmittel markiert, das heißt als Antikörper für den Nachweis der auf der Festphase gebildeten und immobilisierten Komplexe, verwendet werden.
5. Kits für die Detektion der Anti-HIV-Antikörper
Die Kits und Reagenzien, die für die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, können für eine erfindungsgemäße Verwendung geliefert werden, die leicht und für zahlreiche biologische Proben realisierbar ist.
Ein erfindungsgemäßer Gegenstand besteht somit in einem Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe, der:

– mindestens ein Andock- und/oder Detektionsantigen, das ein Peptid ist, das von einem erfindungsgemäßen Peptid mit der Sequenz (III) gebildet werden kann, oder eine ein solches Peptid enthaltende Antigen-Zusammensetzung ist, und
– mindestens ein Mittel zur Detektion der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe

Vorteilhafterweise kann dieser Kit mehrere Andock- und/oder Detektions-Antigene enthalten.
Wie weiter oben beschrieben, kann das Andock-Antigen vorteilhafterweise in einer auf einer Festphase wie einer Mikrotiterplatte immobilisierten Form vorliegen.
Ein bevorzugter Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe umfasst:

a) ein Andock-Antigen, das ein erfindungsgemäßes Peptid mit der Sequenz (III) ist, oder eine Antigen-Zusammensetzung, die ein solches Peptid enthält, wobei das Andock-Antigen auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, und
b) ein mit einem Enzym markiertes Detektions-Antigen.

Ein weiterer bevorzugter Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe umfasst:

a) ein Andock-Antigen, wobei das Andock-Antigen auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, und
b) ein mit einem Enzym markiertes Detektions-Antigen, das ein erfindungsgemäßes Peptid mit der Sequenz (III) oder eine ein solches Peptid enthaltende Zusammensetzung ist.

Ein anderer bevorzugter Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe umfasst:

a) ein Andock-Antigen, das ein erfindungsgemäßes Peptid mit der Sequenz (III) ist, wobei das Andock-Antigen auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, und
b) einen insbesondere mit einem Enzym markierten Anti-Immunglobulin-Antikörper.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne dabei deren Umfang zu beschränken.
Beispiel 1: Peptidsynthese
Die folgenden Synthesen wurden in einem Pioneer-Syntheseautomaten durchgeführt, indem die "Fmoc"-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-)Chemie angewendet wurde: In jeder Stufe wurden die Reagentien (das heißt die geschützte Aminosäure und die Kopplungsaktivatoren (TBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat)/HOBt(N-Hydroxybenzotriazol)) im Überschuss (in einem Verhältnis "Mole Reagentien/Mole an dem Harz substituierbare Gruppen" = 5) zugegeben. Am Ende der Synthese wurde das Peptid vom Harz durch eine Lösung auf der Basis von Trifluoressigsäure (Reagens K) abgetrennt. Das Peptid wurde anschließend in einer gekühlten Etherlösung ausgefällt und danach durch HPLC aufgereinigt.
Mit jedem synthetisierten linearen Peptid wurde eine chemische Oxidationsstufe durchgeführt, die es erlaubte, das Peptid an 2 Cysteinen zu cyclisieren.
Von den Erfindern wurde so die Synthese der folgenden cyclisierten Peptide durchgeführt:
Dieses Peptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10 wurde synthetisiert und in den anschließend beschriebenen Versuchen verwendet, da es gemäß den Erfindern das Peptid darstellt, das dem Stand der Technik am nächsten kommt. Aus diesem Grund wurde es in den anschließend erläuterten Vergleichen verwendet.
Jedes dieser Peptide wurde mit Meerrettichperoxydase konjugiert (markiert konjugiert) gemäß dem bekannten Verfahren von Nakane und Kawaoi (J. Histochem. Cytochem., 22, 1984 [1974]).
Beispiel 2: Verwendete Serumproben
Die für die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern verwendeten Seren waren:

– Proben von Serokonversionsgruppen, die von Boston Biomedica Inc. (7 Gruppen, 17 Proben), Nabi (5 Gruppen, 14 Proben) und Impath Bioclinical Partners (4 Gruppen BCP, 10 Proben) geliefert wurden,
– 4 an Anti-HIV-1-Antikörpern positive Serumproben (C4, C5, C9 und C10) einer internen Gruppe von Bio-Rad, Marnes 1a Coquette, 92430, Frankreich, und
– 13 Seren von normalen Spendern und negativen Personen wurden außerdem getestet, um den Grenzwert der Versuche zu bestimmen.

Beispiel 3: Immunoenzymassay, in welchem die Peroxydase-HIV-1-Peptide-Konjugate verwendet wurden
Die Detektion der Antikörper, die gegen das HIV-Virus gerichtet sind, basiert in dem nachfolgenden Beispiel auf dem Prinzip des Immunoenzymverfahrens vom Typ "Doppelantigensandwich". Der Versuch beruht auf der Verwendung einerseits einer Mikrotiterplatte (Festphase), die mit gereinigten Antigenen sensibilisiert worden ist, darunter dem Hüllglykoprotein (gp160) des Virus HIV-1 M, und andererseits eines Konjugats, das aus einem erfindungsgemäßen Peptid, das mit der Peroxydase markiert war, bestand, die im Sandwich einen zu detektierenden Anti-HIV-Antikörper einschlossen. Die angewendete Versuchsvorschrift war folgende: 100 μl jeder getesteten Serumprobe, auf ¾ verdünnt, wurden in eine Vertiefung der sensibilisierten Mikrotiterplatte gegeben, und das Gemisch wurde homogenisiert. Nach 60 Minuten langer Inkubation des Gemischs unter einem Klebestreifen bei 37°C und anschließendem Waschen der Mikrotiterplatte mit dem Puffer Tris-NaC1 wurden 100 μl des markierten Konjugats (mit der Peroxydase markiertes erfindungsgemäßes HIV-1-Peptid) zu jeder Vertiefung zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang unter dem Klebestreifen bei 18 bis 30°C inkubiert.
Nach der Entfernung der frei gebliebenen Konjugatfraktion durch Waschen mit dem weiter oben genannten Puffer Tris-NaCl wurde das Vorhandensein des auf den Komplexen immobilisierten Enzyms nachgewiesen. Dazu wurden zu jeder Vertiefung 80 μl einer Nachweislösung (enthielt H₂O₂-Substrat in einer Lösung von Zitronensäure und Natriumacetat und ein Chromogen, Tetramethylbenzidin oder TMB) zugegeben. Nach 30 Minuten langem Inkubieren des neuen Gemischs in der Dunkelheit bei 18 bis 30°C wurde der Nachweis durch die Zugabe von 100 μl 1N Schwefelsäure abgebrochen. Die optische Dichte wurde am Spektralphotometer bei 450/620 nm abgelesen.
Das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Anti-HIV-Antikörpern wurde bei den getesteten Proben durch Vergleich der gemessenen optischen Dichte ("DO") mit derjenigen des berechneten Grenzwerts (englisch "cut-off") (Grenzwert = Mittelwert der DO der negativen Proben + 0,100 DO-Einheit) bestimmt.
Eine Probe wurde als positiv (Träger von Anti-HIV-Antikörpern), wenn die erhaltene DO größer als diejenige des Grenzwerts war, und als negativ, wenn die DO kleiner als diejenige des Grenzwerts war, angesehen.
In Tabelle I sind die Vergleichsergebnisse gezeigt, die mittels 5 Konjugaten erhalten wurden, die unter denselben Bedingungen (Kopplung eines jeden weiter oben synthetisierten Peptids an die Peroxydase) hergestellt worden waren. Die verschiedenen hergestellten Konjugate werden nachfolgend beschrieben:

– Konjugat A: Peptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10, gekoppelt an die Peroxydase,
– Konjugat B: Peptid mit SEQ ID Nr. 1, gekoppelt an die Peroxydase,
– Konjugat C: Peptid mit SEQ ID Nr. 2, gekoppelt an die Peroxydase,
– Konjugat D: Peptid mit SEQ ID Nr. 3, gekoppelt an die Peroxydase,
– Konjugat E: Peptid mit SEQ ID Nr. 4, gekoppelt an die Peroxydase.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die angegebenen Ergebnisse Werte der DO, die nach Immunoenzymassays abgelesen wurden, die entsprechend der weiter oben beschriebenen Vorschrift und mit den beschriebenen Konjugaten A, B, C, D und E durchgeführt worden waren. Tabelle I – Ergebnisse, angegebenen in Einheiten der optischen Dichte

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum interne Versuchsgruppe
C4	0,107	0,204	0,153	0,230	0,220
C5	0,099	0,186	0,121	0,181	0,189
C9	0,129	0,196	0,206	0,179	0,174
C10	0,309	0,388	0,341	0,376	0,353

Tabelle I (Fortsetzung)

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe BCP
9017-3	0,025	0,054	0,044	0,053	0,044
9017-4	0,070	0,134	0,118	0,136	0,098
9017-5	0,144	0,254	0,219	0,229	0,191

9021-15	0,023	0,021	0,021	0,012	0,044
9021-16	0,139	0,231	0,187	0,107	0,098
9021-17	2,214	2,868	2,500	1,925	0,191

9023-21	0,009	0,013	0,011	0,010	0,017
9023-22	0,257	0,404	0,309	0,402	0,380

9032-8	0,010	0,035	0,017	0,026	0,033
9032-9	0,244	0,330	0,252	0,299	0,314

Tabelle I (Fortsetzung)

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe BBI
W9	0,016	0,023	0,019	0,017	0,015
W10	2,386	3,093	2,892	2,748	2,794

AQ3	0,017	0,014	0,015	0,008	0,012
AQ4	0,282	0,322	0,274	0,295	0,290

AT3	0,014	0,017	0,015	0,016	0,016
AT4	0,082	0,115	0,092	0,115	0,105
AT5	3,749	3,746	3,816	3,875	3,719

BC3	0,096	0,078	0,091	0,090	0,073
BC4	2,349	2,413	2,308	2,382	2,346

BF4	0,007	0,009	0,009	0,010	0,007
BF5	0,148	0,196	0,170	0,200	0,190

BG5	0,008	0,011	0,009	0,009	0,010
BG6	0,200	0,289	0,234	0,266	0,278
BG7	3,455	3,720	3,540	3,730	3,674

BI1	0,008	0,010	0,010	0,010	0,009
BI2	0,068	0,122	0,088	0,121	0,105
BI3	1,642	1,494	1,607	1,598	1,563

Tabelle I (Fortsetzung)

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe NABI
241-B	0,063	0,080	0,067	0,076	0,077
241-C	0,070	0,114	0,099	0,114	0,110
241-D	3,838	3,867	3,795	3,770	3,745

271-C	0,022	0,047	0,037	0,030	0,023
271-D	0,637	1,304	0,975	0,463	0,499

401-C	0,008	0,012	0,010	0,010	0,009
401-D	0,091	0,275	0,164	0,231	0,247
401-E	1,395	2,226	1,784	2,263	2,333

407-D	0,007	0,011	0,010	0,010	0,011
407-E	0,105	0,121	0,110	0,090	0,087
407-F	3,923	4,000	3,830	4,000	4,000

409-B	0,007	0,010	0,009	0,007	0,007
409-C	0,091	0,146	0,114	0,141	0,144
409-D	1,334	1,811	1,528	1,889	1,868

Tabelle I (Fortsetzung und Schluss)

Konjugat	A	B	C	D	E
Negative Seren N = 13
Mittelwert	0,008	0,009	0,009	0,10	0,009
Grenzwert	0,108	0,109	0,109	0,110	0,109

Die Konjugate B, C, D und E, die mit erfindungsgemäßen Peptiden erhalten worden waren, ergeben bei den getesteten positiven Proben und mit dem fast identischen Grenzwert einen DO-Wert, der deutlich höher als derjenige ist, der mit dem Konjugat A des 35mer Peptids des Standes der Technik (Peptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10) erhalten worden war.

In der nachfolgenden Tabelle II sind dieselben Ergebnisse als Verhältnis von DO Probe/Grenzwert (DO/VS) angegeben. Tabelle II – Ergebnisse, angegeben als Verhältnis von optischer Dichte/Grenzwert

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Interne Versuchsgruppe
C4	0,99	1,87	1,39	2,09	2,02
C5	0,92	1,71	1,10	1,65	1,73
C9	1,19	1,80	1,87	1,63	1,60
C10	2,86	3,56	3,10	3,42	3,24

Tabelle II (Fortsetzung)

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe BCP
9017-3	0,23	0,50	0,40	0,48	0,40
9017-4	0,65	1,23	1,07	1,24	0,90
9017-5	1,33	2,33	1,99	2,08	1,75

9021-15	0,21	0,19	0,19	0,11	0,19
9021-16	1,29	2,12	1,70	0,97	1,06
9021-17	20,50	26,31	22,73	1,50	17,92

9023-21	0,08	0,12	0,10	0,09	0,16
9023-22	2,38	3,71	2,81	3,65	3,49

9032-8	0,09	0,32	0,16	0,24	0,30
9032-9	2,26	3,03	2,29	2,72	2,88

Tabelle II (Fortsetzung)

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe BBI
W9	0,15	0,21	0,18	0,15	0,14
W10	26,26	28,38	26,29	24,98	25,63

AQ3	0,16	0,13	0,14	0,07	0,11
AQ4	2,61	2,95	2,49	2,68	2,66

AT3	0,13	0,16	0,13	0,15	0,15
AT4	0,76	1,06	0,84	1,05	0,96
AT5	34,71	34,37	34,69	35,23	34,12

BC3	0,89	0,72	0,82	0,82	0,67
BC4	21,75	22,14	20,98	21,65	21,52

BF4	0,06	0,08	0,08	0,09	0,06
BF5	1,37	1,80	1,54	1,82	1,74

BG5	0,07	0,10	0,08	0,08	0,09
BG6	1,85	2,65	2,13	2,42	2,55
BG7	31,99	34,13	32,18	33,91	33,71

BI1	0,07	0,09	0,09	0,09	0,08
BI2	0,63	1,12	0,80	1,10	0,96
BI3	15,20	13,71	14,61	14,53	14,34

Tabelle II (Fortsetzung und Schluss)

Konjugat	A	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe NABI
241-B	0,58	0,73	0,60	0,69	0,71
241-C	0,65	1,05	0,90	1,04	1,01
241-D	35,54	35,48	34,50	34,27	34,36

271-C	0,20	0,43	0,34	0,27	0,21
271-D	5,90	11,96	8,86	4,21	4,58

401-C	0,07	0,11	0,09	0,09	0,08
401-D	0,84	2,52	1,49	2,10	2,27
401-E	12,92	20,42	16,21	20,57	21,40

407-D	0,06	0,10	0,09	0,09	0,10
407-E	0,97	1,11	1,00	0,82	0,80
407-F	36,32	36,70	34,82	36,36	36,70

409-B	0,06	0,09	0,08	0,06	0,06
409-C	0,84	1,34	1,03	1,28	1,32
409-D	12,35	16,61	13,89	17,17	17,14

Bei fast identischem Grenzwert ergaben die Konjugate B, C, D und E, die mit erfindungsgemäßen Peptiden erhalten worden waren, bei den getesteten Proben Verhältnisse von DO/VS, die deutlich größer als diejenigen waren, die mit dem Konjugat A des 35mer Peptids des Standes der Technik (Peptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10) erhalten worden waren. Weiterhin waren bestimmte negative Proben mit dem Konjugat A des Peptids des Standes der Technik mit den erfindungsgemäßen Peptiden als positiv befunden worden.
Die Tabelle der Ergebnisse, angegeben als das Verhältnis von DO/VS (Tabelle III) zeigt die Probenverteilung in Abhängigkeit von den erhaltenen Verhältnissen von DO/VS. Tabelle III

Konjugat A B C D E

Positive Seren N = 45

Verhältnis DO/VS < 1 25 16 19 19 20

Verhältnis DO/VS > 1 20 29 26 26 25
Aus Tabelle III geht klar hervor, dass die positiv getesteten Seren sich besser mit den erfindungsgemäßen Peptiden als mit dem Peptid des Standes der Technik mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10 (Konjugat A) nachweisen ließen, da die Anzahl von Proben, die ein Verhältnis von DO/VS von größer als 1 ergaben, deutlich größer war.
Wie insgesamt die Tabellen I, II und III zeigen, erlauben die erfindungsgemäßen Peptide (Konjugate B, C, D und E mit der Sequenz [III]), die Serokonversionen deutlich früher als das Peptid des Standes der Technik mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10 (Konjugat A) zu detektieren.

In der nachfolgenden Tabelle IV ist die Immunoreaktivität der Konjugate B, C, D und E als Prozentsatz der Immunoreaktivität des Konjugats A, das als Referenz dient, angegeben. Tabelle IV – Ergebnisse, angegeben als Prozentsatz der Immunoreaktivität, bezogen auf das Konjugat A

Konjugat	B	C	D	E
Positives Serum interne Versuchsgruppe
C4	191%	133%	215%	206%
C5	188%	113%	183%	191%
C9	152%	168%	139%	135%
C10	126%	109%	122%	114%

Tabelle IV (Fortsetzung)

Konjugat	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe BCP
9017-3	216%	180%	212%	176%
9017-4	191%	161%	194%	140%
9017-5	176%	150%	159%	133%

9021-15	91%	95%	52%	91%
9021-16	166%	129%	77%	83%
9021-17	130%	109%	87%	88%

9023-21	144%	108%	111%	189%
9023-22	157%	111%	156%	148%

9032-8	350%	158%	260%	330%
9032-9	135%	102%	123%	129%

Tabelle IV (Fortsetzung)

Konjugat	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe BBI
W9	144%	113%	106%	94%
W10	109%	101%	97%	99%
AQ3	82%	96%	47%	71%
AQ4	114%	94%	105%	103%

AT3	121%	107%	114%	114%
AT4	140%	109%	140%	128%
AT5	100%	101%	103%	99%

BC3	81%	98%	94%	76%
BC4	103%	98%	101%	100%

BF4	129%	119%	143%	100%
BF5	132%	111%	135%	128%

BG5	138%	112%	113%	125%
BG6	145%	113%	133%	139%
BG7	108%	101%	108%	106%

BI1	125%	133%	125%	113%
BI2	179%	120%	178%	154%
BI3	91%	98%	97%	95%

Tabelle IV (Fortsetzung und Schluss

Konjugat	B	C	D	E
Positives Serum Versuchsgruppe NABI
241-B	127%	99%	121%	122%
241-C	163%	129%	163%	157%
241-D	101%	98%	98%	98%

271-C	214%	140%	136%	105%
271-D	205%	139%	73%	98%

401-C	150%	117%	125%	113%
401-D	302%	166%	254%	271%
401-E	160%	121%	162%	167%

407-D	157%	133%	143%	157%
407-E	115%	105%	86%	83%
407-F	102%	97%	102%	102%

409-B	143%	120%	100%	100%
409-C	160%	118%	155%	158%
409-D	136%	110%	142%	140%

Tabelle IV ist leicht zu entnehmen, dass die erfindungsgemäßen Peptide (Konjugate B, C, D und E mit der Sequenz [III]) eine Immunoreaktivität, die im Allgemeinen deutlich höher als diejenige des Peptids des Standes der Technik mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10 ist, und somit eine im Allgemeinen höhere Detektionssensibilität aufweisen.
Zusammengefasst zeigen die obigen Ergebnisse, dass die Detektion der an Anti-HIV-1-Antikörpern positiv getesteten Seren durch die erfindungsgemäßen Peptide (Konjugate B, C, D und E mit der Sequenz [III]) der durch ein Peptid des Standes der Technik (Konjugat A mit der Sequenz SEQ ID Nr. 10), dem ähnlichsten Peptid, erhaltenen Detektion deutlich überlegen war. Außerdem erlauben es die erfindungsgemäßen Peptide (Konjugate B, C, D und E mit der Sequenz [III]), die Serokonversionen noch frühzeitiger zu detektieren.
Die Erfindung löst somit durch die erfindungsgemäßen Peptide die gestellte Aufgabe.
SEQUENZLISTE

Claims

Cyclisches Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III):
worin X eine Aminosäure bedeutet, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die von F und G gebildet wird, und die zwei Aminosäuren aa₁ und aa₂ entweder fehlen oder aa₁: Alanin aa₂: Serin bedeuten.
Peptid nach Anspruch 1, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die von folgenden Peptiden gebildet wird:
Antigenzusammensetzung, die ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines in Anspruch 1 oder 2 definierten Peptids mit der Sequenz (III), wobei das Verfahren in der chemischen Synthese eines solchen Peptids besteht.
Verfahren zum in-vitro-Detektieren von Anti-HIV-1-Antikörpern in einer biologischen Probe, das die Stufen umfasst, die bestehen aus dem: a) In-Berührung-Bringen der biologischen Probe mit mindestens einem Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III), wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, und/oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 3, b) Inkubieren des Gemischs unter Bedingungen, welche die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zwischen dem/den Peptid/en mit der Sequenz (III) und den in der biologischen Probe vorhandenen Anti-HIV-1-Antikörpern erlauben, und c) Nachweisen und Detektieren der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe.
Detektionsverfahren nach Anspruch 5, in welchem die Stufe a) das In-Berührung-Bringen der biologischen Probe mit einer Antigenzusammensetzung umfasst, die aus mindestens einem Peptid des gp41 mit der Sequenz (III) und einem Antigen des HIV-2 und/oder einem Antigen des HIV-1 O besteht.
Kit zur Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe, wobei der Kit ein Peptid des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III), wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 3, gegebenenfalls zusammen mit einem Antigen des HIV-2 und/oder einem Antigen des HIV-1 O, enthält.
Verwendung eines Peptids des gp41 des HIV-1-Virus mit der Sequenz (III), wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 3 für die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe.