DE69223250T3

DE69223250T3 - Detektion des immunschwäche-virus aus felis

Info

Publication number: DE69223250T3
Application number: DE69223250T
Authority: DE
Inventors: Bruce Ernest Kew KEMP; Carmel Judith Paddigton HILLYARD; Dennis Brian Woodridge RYLATT; Peter Gregory Fig Tree Pocket BUNDESEN
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2012-06-13
Also published as: AU1973992A; EP0602046A4; ATE160358T1; JPH07502484A; EP0602046A1; DE69223250D1; AU667669B2; EP0602046B1; CA2111325C; US5591572A; CA2111325A1; WO1992022573A1; DE69223250T2; EP0602046B2; JP3356280B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Säugerimmunschwächeviren, und insbesondere Peptide, die zur Verwendung in Immuntests zum Nachweis von Antikörpern gegen solche Viren geeignet sind.
Hintergrund und Stand der Technik
Seit Kenntnis des humanen erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) in 1981 gab es intensive Untersuchungen bezüglich des verursachenden Virus, dem humanen Immunschwächevirus (HIV), zuvor bekannt als humaner T-Zellen-lymphotroper Virustyp III (HTLV-III) oder Lymphadenopathie-assoziierter Virus (LAV). Es war nicht bekannt, daß HIV-spezifische Antikörper in Seren nicht nur bei den meisten Patienten mit AIDS oder AIDS-verwandtem Komplex, sondern auch in den Seren von asymptomatischen Individuen, die dem Virus ausgesetzt waren, vorliegen.
In jüngster Zeit wurde gefunden, daß ein variantes Virus, bekannt als HIV-2, ebenfalls in der Lage ist, AIDS zu verursachen. Immuntestverfahren, wie ELISA, unter Verwendung verschiedener Polypeptide, die durch das HIV-Virus kodiert werden, wurden am meisten bei der Diagnose und Screenen eingesetzt. In den meisten Fällen werden die Polypeptide entweder direkt aus viralem Material hergestellt oder aus in vitro-Expressionssystemen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie abgeleitet, obwohl solche Materialien nicht ideal sind. Material, das von viralen Präparationen stammt, kann mit lebensfähigem Virus verunreinigt sein, was ein Risiko für das Personal, welches mit dem Material arbeitet, darstellt. Rekombinant abgeleitetes Material kann durch Nicht-HIV- Protein verunreinigt sein, was zu einem möglichen Verlust an Spezifität führt.
Bei einem Versuch, dieses Problem zu überwinden, wurden Polypeptide von HIV unter Verwendung chemischer Synthesemittel hergestellt; Peptidfragmente einer Vielzahl von HIV-Antigene sind in der australischen Patentanmeldung Nr. 597884 (57733/86) von der Genetic Systems Corporation offenbart, und in US-Patenten Nr. 4735896 und Nr. 4879212 , beide von der United Biochemical Inc. Insbesondere offenbaren diese drei Beschreibungen eine konservierte immundominante Region des gp41-Glycoproteins, eine Region des Haupthüllproteins von HIV-1. Eine analoge Region des gp36-Proteins von HIV-2 wurde ebenfalls synthetisiert. Diese Regionen, die dem Transmembranteil des Hüllproteins entsprechen, ermöglichen eine zwischen HIV-1 und HIV-2 unterscheidende Diagnose und liefern Tests von hoher Empfindlichkeit und Spezifität.
Die Erforschung retroviraler Infektionen und insbesondere solcher, die mit Immunschwächeerkrankungen einhergehen, hat gezeigt, daß Immunschwächeviren unter Säugerspezien weit verbreitet sind. Zum Beispiel wurden Affen-Immunschwächeviren (SIV-Stämme) in einer Vielzahl von Affen in der Alten Welt und Affenarten, wie Makakken, Gibbons und Schimpansen gefunden. Es wurde gefunden, daß ähnliche Viren Rinder infizieren (Rinderimmunschwächevirus, BIV) und Feliden (felines Immunschwächevirus, FIV). FIV ist ein Retrovirus, das ursprünglich aus Hauskatzen isoliert wurde, und es wurde gezeigt, daß es zur gleichen Gruppe wie HIV gehört (Pederson, N.C. et al.; Science (1987) 235 790). Dieses Virus wurde in Hauskatzen in allen getesteten Ländern gefunden und ist mit ähnlichen Begleitumständen verbunden wie diejenigen, die bei AIDS-Patienten gefunden werden; jedoch waren die beobachteten Infektionen nur solche, die normalerweise in Hauskatzen vorkommen. Pilzinfektionen, wie Cryptococcosen, sind besonders häufig und reagieren gut auf symtomatische Behandlung. Obwohl FIV nicht zu katastrophalen Infektionen führt, wie diejenigen, die man bei Menschen mit HIV beobachtet, und obwohl das Virus in der felinen Population für mindestens 20 Jahre vor seiner Entdeckung vorhanden zu sein schien, ist die Infektion sehr weit verbreitet und verursacht deutliche Belastung und Leiden. Es gibt auch andere Langzeitimplikationen.
Zum Beispiel wurde jüngst gefunden, daß FIV-Antikörper in Großkatzen, wie Löwen, Jaguare, Leoparden und Pumas, sowohl in Zoopupulationen als auch Tieren der freien Wildbahn weit verbreitet sind (Barr M.C., Calle P.R. et al.; J. Zoo and Wildlife Med. (1989) 20 285; Sabine M. und Walker C.; Today's Life Science, 1991 3 34). Obwohl in der australischen Untersuchung von Sabine und Walker ein Kontakt zwischen Zootieren und Hauskatzen nicht ausgeschlossen werden konnte, hatten die Zookatzen in den Vereinigten Staaten in der Untersuchung von Barr and Calle et al. weder mit Hauskatzen noch mit anderen infizierten exotischen Katzen Kontakt. Im Gegensatz zu den Manifestationen von FIV-Infektion in Hauskatzen zeigten die Großkatzen keine Korrelation zwischen der Infektion mit dem Virus und der klinischen Erkrankung. Im Hinblick auf die Tatsache, daß viele Großkatzenarten in Gefahr der Ausrotten stehen, ist es von großer Bedeutung zu bestimmen, ob FIV-Infektion einen deutlichen Einfluß auf die Gesundheit oder Fortpflanzungseffizienz von Wildpopulationen hat.
Obwohl FIV antigenisch mit HIV nicht verwandt ist, und obwohl die Sequenzen der FIV-Proteine unähnlich denjenigen von HIV sind, ermöglicht die Erfahrung, die bei der Entwicklung von HIV-Tests erworben wurde, einen raschen Fortschritt bei der Produktion eines FIV-Tests. ELISA-Test-Kits für FIV, unter Verwendung des p26-Antigens, sind handelsüblich erhältlich ("Pet Chek"; Idexx Corporation). Wie bei der HIV-Infektion wurde bei der Infektion mit FIV gefunden, daß ihr eine Produktion von Antikörpern zusammen mit einer andauernden Präsenz des Virus im Wirtskörper folgt. Es wurde jedoch gefunden, daß unter Verwendung dieses Tests falsche Negativergebnisse häufiger vorkommen als in analogen Test für HIV-Virus bei Menschen.
FIV in Hauskatzen befällt T-Zellen auf die gleiche Weise wie HIV bei Menschen. Aus diesem Grund wurde FIV als experimentelles Modell für AIDS, z.B. beim Testen von Impfstoffen und therapeutischen Mitteln, vorgeschlagen. Rasche genaue Diagnose von FIV ist wesentlich für solche Zwecke.
Es wurde eine Nukleotidsequenz für vier Stämme von FIV berichtet. In diesen bekannten Isolaten ist eine Sequenz konserviert, jedoch treten Variationen an beiden Enden auf. Zwei Stämme aus den Vereinigten Staaten, bezeichnet als FIV-Petaluma und FIV-PPr werden in den folgenden Referenzen beschrieben: Olmsted, R.A., Barnes, A.K., Yamamoto, J.K., Hirsch, V.M., Purcell, R.H. und Johnson, P.R. (1989) Molecular cloning of feline immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2448-2452; Olmstedt, R.A., Hirsch, V.M., Purcell, R.H. and Johnson, P.R. (1989), Nucleotide sequence analysis of feline immunodeficiency virus: genome organization and relationship to other lentiviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8088-8092; Talbott, R.L., Sparger, E.E., Lovelace, K.M., Fitch, W.M., Petersen, N.C., Luciw, P.A. and Elder, J.H. (1989). Nucleotide sequence and genomic Organisation of feline immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acac. Sci. USA 86: 5743-5747, and zwei Stämme aus Japan, bezeichnet als FIV TM1 und FIV TM2, werden von Maki, N., Miyazawa, T., Fukasawa, T., Fukasawa, M., Hasegawa, A., Hayami, M., Miki, K. und Mikami, T. (1992) in Arch. Virol. 123: 29-45 beschrieben: Molecular characterization and heterogeneity of feline immunodeficiency virus isolates.

Die env-Proteine dieser Isolate haben die folgende Sequenz in der Transmembranregion:

Aminosäure Nr.	Sequenz	Isolate
(678-708)	KVEAMEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCEIPKE	PPR
(680-711)	KVEAMEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPLE	Petaluma
(679-710)	KVEAIEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPPS	TM1
(779-710)	RVEAIEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPPS	TM2

WO 90/13573 offenbart ein antigenes Polypeptid von FIV, das als ein Impfstoff verwendet wird. WO 92/09632 offenbart Peptidfragmente der env-Region von FIV, Antikörper und ihre Verwendung.
Die gegenwärtig erhältlichen Testsysteme für FIV verwenden Polypeptidmaterial, das entweder vom Vollvirus oder von rekombinant-abgeleitetem Protein stammt, oder alternativ dazu monoklonale Antikörper, die gegen Epitope solcher Peptide gerichtet sind. Siehe z.B. die Internationalen Patentanmeldungen Nr. WO 90/1357 und Nr. WO 90/06510 von Idexx Corporation, deren gesamte Offenbarung hiermit unter Bezugnahme mitaufgenommen ist.
Es besteht daher ein dringendes Bedürfnis nach einem raschen, einfachen und ökonomischen Test, der ein synthetisches Peptid-Antigen verwendet, um die Kosten zu reduzieren, und um ein Risiko für das Personal zu vermeiden. Zur Vermeidung unnötiger Manipulationen von Blutproben, die selbst das Risiko für das Personal, welches das Material handhabt, darstellen können, ist ein Test besonders bevorzugt, der mit Vollblutproben durchgeführt werden kann. Ein solcher Test wird in unseren vorhergehenden australischen Patentanmeldungen Nr. 22224/88 und Nr. 24182/88 von Agen Limited beschrieben und wird unter dem Namen SimpliRED vermarktet.
Wir haben nun unerwartet gefunden, daß es möglich ist, eine immundominante Region in der hochkonservierten Region des Transmembranteils des Hüllproteins eines felinen Immunschwächevirus zu identifizieren. Diese Sequenz kann synthetisiert werden unter Verwendung normaler Peptidsynthetischer Verfahren, und kann in Immuntests zum Nachweis von gegen das Virus gerichteten Antikörpern verwendet werden. Diese Erkenntnis ist insbesondere überraschend im Hinblick auf die bekannten Unterschiede in den Proteinen und in der Antigenität von Immunschwächeviren aus verschiedenen Spezies.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Disulfid-Schlaufenpeptid einer immundominanten Region eines Hüllproteins eines felinen Immunschwächevirus zur Verfügung gestellt.
Das Peptid ist abgeleitet von einem ein felines infizierenden Immunschwächevirus. Der Begriff "felin" soll alle Mitglieder der Ordnung Felidae umfassen, einschließlich Hauskatzen, Löwen, Tiger, Jaguare, Leoparden, Pumas, Ozelots usw.
Wenn das Immunschwächevirus FIV ist, umfaßt das Peptid vorzugsweise die Aminosäuren 680 bis 711 des env gp40-Proteins des FIV-Petaluma-Stamms wie folgt:
KVEAMEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPLE,
oder eine Sequenz von 8 oder mehr, vorzugsweise 10 bis 20, besonders bevorzugt 20 bis 25, am meisten bevorzugt 25 bis 35 Aminosäuren innerhalb der Sequenz.
Für FIV können auch andere Isolate, die die entsprechenden Regionen umfassen, verwendet werden.

Die obige Sequenz wird als Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code, wie in Tabelle 1 angegeben: TABELLE 1

Aminosäure	Ein-Buchstaben-Abkürzung
Alanin	A
Arginin	R
Asparagin	N
Asparaginsäure	D
Cystein	C
Glutaminsäure	E
Glutamin	Q
Glycin	G
Histidin	H
Isoleucin	I
Leucin	L
Lysin	R
Methionin	M
Phenylalanin	F
Prolin	P
Serin	S
Threonin	W
Tyrosin	Y
Valine	V

Obwohl ein Peptid gemäß der Erfindung unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie bei Einsatz der entsprechenden, aus der Sequenz des geeigneten Virus FIV, DNA-Sequenz synthetisiert werden kann, wird es bevorzugt unter Einsatz konventioneller Verfahren des Fest-Peptid-Phasensynthese chemisch synthetisiert.
Ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der gegen ein Eisulfid-Schlaufenpeptid einer immundominanten Region eines Hüllproteins eines felinen Immunschwächevirus gerichtet ist, werden beschrieben. Solche Antikörper können hergestellt werden nach einer Vielzahl konventioneller Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Antikörper, die verwendet werden können, umfassen polyklonale und monoklonale Antikörper oder immunologisch funktionale Fragmente davon, einschließlich der F(ab)-, F(ab)₂-,Fv- , Einzelketten-Fv- oder V_H-Fragmente. Die Fragmente können nach konventionellen oder rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Immuntest zum Nachweis von Antikörper gegen einen felinen Immunschwächevirus in einer biologischen Probe aus einem Säuger, der dem Virus ausgesetzt war, zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte der Verwendung eines Reagens, enthaltend ein Peptid wie oben beschrieben. Vorzugsweise wird der Immuntest in Form eines Test-Kits bereitgestellt.
Solche Tests umfassen z.B. ELISA, Partikel-Agglunitationstest, autologe rote Blutzellen-Agglutinationstests, andere Agglutinationstests, Radioimmuntests und Fluoreszenz-Immuntests. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Test ein direkter oder indirekter Vollblut-Agglutinationstest, wie in den australischen Patentanmeldungen Nr. 22224/88 und Nr. 24182/88 beschrieben, deren gesamte Offenbarung hiermit unter Bezugnahme mitaufgenommen ist.
Ein Immunadsorbens für ein felines Immunschwächevirus zur Verfügung gestellt, welches einen Antikörper umfaßt, der gegen ein oben beschriebenes Peptid gerichtet ist, wird hier ebenfalls beschrieben.
Ferner ist es selbstverständlich, daß die Erfindung Peptide von Subtypen von FIV, Immunschwächeviren, Analoge zu HIV-1 und HIV-2 umfaßt.
Obwohl die spezifischen Peptide, auf die oben bezug genommen wird, ferner ca. 35 Aminosäuren einschließlich der spezifizierten Sequenzen umfassen, ist klar, daß unter der Voraussetzung, daß die von dem geeigneten Antikörper erkannte Konformation konserviert ist, Peptide gemäß der Erfindung analoge oder konservative Substitutionen für die in der Sequenz wiedergegebenen Aminosäuren umfassen können. Es ist auch zu berücksichtigen, daß die Sequenz entweder durch Addition weiterer Aminosäuren an beiden Termini der obenliegenden Sequenz verlängert werden kann, insbesondere Verlängerungen, die von der bekannten Sequenz des geeigneten env-Proteins abgeleitet sind, oder daß alternativ die Sequenz durch Deletion von Aminosäuren von einem der Enden modifiziert werden kann.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele beschrieben und auf die begleitende Zeichnung, worin:
1 das Ergebnis eines ELISA-Assays unter Verwendung eines synthetischen FIV-Peptid-Antigens und FIV-positiven Antiserums illustiert.
Beispiel 1: Synthese von Peptiden
FIV (680-711) wie oben beschrieben wurde synthetisiert unter Verwendung des Merrifield-Verfahrens der Festphasensynthese unter Verwendung eines Applied Biosystems Automated Peptid Synthesiser mit Boc-Aminosäuren (Kemp, B.E. et al., Science (1988) 241 1352-1354). Es können alternative chemische Verfahren eingesetzt werden, z.B. solche unter Verwendung von Fmoc und anderer geschützter Derivate, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Die Peptide wurden hergestellt als ihre Carboxy-terminale Amine unter Verwendung eines 4-Methylbenzhydrylaminharzes. Das Peptid wurde von dem Festphasenharz abgespaltet, und gleichzeitig wurden die Schutzgruppen durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt. Das freigesetzte Peptid wurde entweder durch Kationen- oder Anionen-Austauschchromatografie je nach seiner Aminosäure-Zusammensetzung, und dann durch Umkehrphasenchromatografie entweder in 0,1 % Trifluoressigsäure oder 0,1 M Ammoniumbicarbonat (Kemp, B.E. und Pearson R.B.; "Design and Use of Peptide Substrates for Protein Kinases" in Protein Phosphorylation (erschienen bei T. Hunter und B.M. Sefton) Methods in Enzymology, 1991 200 12-134, gereinigt.
Die gemäß diesem Verfahren synthetisierten Peptide sind hochreaktiv gegen Antikörper gegen FIV und können für verschiedene Immuntests, einschließlich der autologen roten Blutzellen-Agglutination, Partikel-Agglutination, Enzymimmuntests und Radioimmuntest verwendet werden.
Peptide mit diesen Sequenzen enthalten interne Disulfidbindungen. Sie können entweder in der oxidierten oder reduzierten Form verwendet werden, oder in Konjunktion mit konjugierten oder protektiven Gruppen. Zum Beispiel können sie an Trägermoleküle konjugiert werden.
Beispiel 2: ELISA-Test unter Verwendung synthetischer Peptide von FIV (680-711)
Microtiterplattenvertiefungen wurden mit 0,25 bis 1 g Peptid in Carbonatpuffer in 30 % Essigsäure beschichtet. Testseren wurden in den Vertiefungen mit einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Das Sekundärreagenz war Protein-A-Meerrettich-Peroxidase. Die Reaktion wurde mit ABTS für 20 Minuten entwickelt, und in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 405 nm abgelesen. Die Ergebnisse wurden wie folgt definiert:
"Positiv"-Ergebnisse hatten eine optische Dichte größer als 0,3;
"Beinahe"-Ergebnisse hatten eine optische Dichte zwischen 0,2 und 0,5; und
"Starke" Ergebnisse hatten eine optische Dichte zwischen 1,0 und 3,0.
Die Titer von infizierten Katzen lagen im allgemeinen zwischen 800 und 1600, aber erreichten bis zu 6400.
Die Ergebnisse unter Verwendung von rohem Peptid-Antigen sind in 1 zusammengefaßt. Ein Standard von 1 μg Peptid und eine Verdünnung von 1:100 Serum wurde für die Verwendung beim Routine-Screening ausgewählt.
8 Jungtieren wurden experimentell mit FIV durch subkutane Injektion mit einer Virusprobe, isoliert in Westaustralien, infiziert und wurden unter Verwendung des Tests nach Inokulation getestet. Nach zwei Wochen waren alle Jungtiere serumnegativ, sie waren jedoch nach vier Wochen serumpositiv. Die Titer erreichten einen Peak nach sechs Wochen und lagen im Bereich von 400 bis 6400.
Beispiel: 3 Vergleich mit dem ELISA-Test für FIV p26-Protein
Der ELISA unter Verwendung des 36 Aminosäure-Peptids wurde mit handelsüblich erhältlichem ELISA, beruhend auf dem FIV p26-Antigen ("Pet Chek"; Idexx Corporation) verglichen. Dieser Vergleich zeigte eine Anzahl voneinander abweichender Ergebnisse, wie in Tabelle 2 zusammengefaßt. TABELLE 2

36 Aminosäure-Peptid [FIV (680-771)] "Pet CHEK"

113 -

44 + +

14 + -

2 +
Vierzehn der sechzehn von einander abweichenden Ergebnisse waren in der Nähe der "cut-off"-Werte von einem oder beiden Tests. Die Ergebnisse legen nahe, daß der ELISA unter Verwendung des synthetischen Peptids sowohl eine größere Empfindlichkeit zeigte, darin, daß er in der Lage war, positive Reaktionen nachzuweisen, die im Pet-Chek-Test nicht zu sehen waren, als auch eine größere Spezifität dahingehend, daß es scheint, daß der letztere falsch-positive Ergebnisse zeigte.
Beispiel: 4 Vollblutagglutinations-Test
Feline Blutproben wurden ebenfalls unter Verwendung des in den australischen Patentanmeldungen Nummern 22224/88 und 24182/88 beschriebenen Vollblutagglutinations-Tests, und auch wie bei Wilson, K.M. et al., J. Immunol. Methods, 1991 138 119-128 beschrieben, deren gesamte Offenbarung hiermit unter Bezugnahme mitaufgenommen ist, getestet. Das Verfahren wurde zur Verwendung mit FIV und Katzenblut unter Verwendung des synthetischen FIV-Peptids der Erfindung und des gegen feline rote Blutzellen gerichteten Antikörpers angepaßt. Dieser Antikörper wurde durch Immunisierung unter Verwendung konventioneller Methoden hergestellt.
Vollblutagglutinations-Test-Kit für FIV KOMPONENTEN:

1. Anti-Erythrocyten-Antikörper: H74.53.4C1/180 Extinktions-Coeffizient 1,0
2. Anti-Peptid-Antikörper a) Affinitätssäule und Meerrettich-Peroxidasemarkierung: K20.83.4D4/4-91 IgG1. Extinktions-Coeffizient 1,65 b) Positive Kontrolle: K21.83.1B5/25 IgM.
3. FIV-Peptid K V E A M E K F L Y T A F A M Q E L G C N Q N Q F F C K I P L E – NH₂ , entsprechend einer immundominanten Region des Haupthüllproteins von FIV 680-711 (gp40)

(a) Herstellung von Erythrocyten bindendem Molekül H74.53.4C1/180
Der gegen feline rote Blutzellen gerichtete Antikörper wurde unter Verwendung konventioneller Immunisierung und Screening-Prozeduren hergestellt. Mäuse wurden mit felinen roten Blutzellen immunisiert und monoklonale Antikörper durch Fusionieren von Milzzellen der immunisierten Tiere mit Maus-Myelomzellen hergestellt. Die Antikörper wurden durch Spinn-Agglutinationstest gescreent. Die Spinn-Agglutination erfolgte durch eine Modifikation des Verfahrens von Wyat & Street, Aust J Med Lab Sci, 4 48-50. 50 μl Zellkulturüberstand wurden mit 50 μl einer 1%igen roten Blutzell-Suspension in einer Mikrotiterplatte vermischt. Für dieses Beispiel wurden Antikörper, die Glycophorin banden, jedoch nicht Agglutinat, ausgewählt. Von 384 Vertiefungen wurden 50 Primärclone ausgewählt. Anschließende Absorptionsstudien erfolgten (50 feline Vollblutproben) und monoklonaler Antikörper H74.53.4C1/180 (4C1/180) wurde ausgewählt.
Intakter Antikörper wurde nach dem Prosep A-Produktionsverfahren gereinigt. Der gereinigte monoklonale Antikörper 4C1/180 wurde mit 1 % Gew./Gew. Pepsin 40 min bei 37°C verdaut. Der Antikörper wurde mit 1/10 12%iger Essigsäure auf pH 3,5 angesäuert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3,5M tris-Puffer pH 8,0 unter Erhöhung des pHs auf 8 abgebrochen und das F(ab)₂-Fragment wurde durch S200 Gel-Filtrationschromatografie gereinigt.
Die F(ab)₂-Fragmente wurden durch Inkubation mit einer Endkonzentration von 10 mM Mercaptoethylamin 30 min bei 37°C reduziert. Die teilweise reduzierten Fab-Fragmente wurden durch Reaktion mit 10 mg/ml DTNB 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Zugabe einer Endkonzentration von 30 mM Jodacetamid für 30 min bei Raumtemperatur stabilisiert. Das hergestellte Fab-TNB-Ac-Fragment wurde dann auf einer Ultrogel AcA 44-Gelfiltrationschromatografie gereinigt.
(b) FIV-Peptid-Herstellung:
Das Peptid, das einer immundominanten Region des Haupthüllproteins von FIV 680-711 (gp40) (obige Sequenz) entsprach, wurde mit 0,5M Dithiotreitol 30 min bei Raumtemperatur reduziert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 mM HCl abgebrochen. Die Mischung wurde auf eine Sep-pak C18-Kartusche (Millipore Waters) aufgegeben, die mit 10 ml einer 40:60 Acetonitril:HCl-Lösung behandelt wurde. Das reduzierte Peptid wurde dreimal durch die Sep-pak geleitet, mit 20 ml 10 mM HCl vor Flution mit 5 ml 40:60 Acetonitril:HCl gewaschen. Das reduzierte Peptid wurde dann über Nacht gefriergetrocknet.
(c) Konjugation des Peptids und Antikörper und Reinigung des FIV-Reagens:
Das Peptid unter "b" oben wurde in 6M Guanidin-HCl gelöst und mit 4C1/180 Tab-TNB-Ac-Mischung aus (a) oben einem Peptid:Antikörper-Molverhältnis von 0,5(1,0):1,0 für eine Minute bei Raumtemperatur vermischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer Endkonzentration von 30 mM Jodacetamid für 30 min bei Raumtemperatur abgebrochen.
Die Erstreinigung erfolgte auf einer Ultrogel-AcA44-Gelfiltrationssäule unter Entfernung des freien Peptids worauf Affinitätsreinigung auf einer Anti-Peptid-Antikörpersäule (K20.83.4D4/4-91) unter Entfernung von freime 4C1/180-Antikörper folgte. Die Endreinigung erfolgte dann auf einer Ultrogel AcA 44-Gelfiltratinssäule.
(d) Formulierung des FIV-Reagens und Testverfahren:
Das FIV-Reagens wurde auf 15 μg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4, die 10 μg/ml 2-NBA, 0,5 % Fischgelatine und 0,5 mg/ml 3A1/48 Fab-Ac-Blocker-Antikörper enthielt, formuliert.

Für den Test wurden 10 μl antikoaguliertes Blut auf einen Plastikträger gegeben, und es wurden 25 μl FIV-Reagens zugegeben und vermischt. Der Träger wurde 2 min geschüttelt und die Agglutination abgelesen. Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigen die Ergebnisse aus dem Test FIV-positiver und FIV-negativer Proben. TABELLE 3 Zusammenfassung der getesteten Positivproben:

Probe	Anzahl positiv	% Empfindlichkeit
Gesamtplasmaproben	104/104	100 %
W.A. 2 Wochen nach Infektion	2/12	16 %
W.A. 4 Wochen nach Infektion	12/12	100 %
Chatswood, VPS & SA-Proben	7/7	100 %
Gesamtzahl der getesteten Proben > 4 Wochen nach Infektion	104/104	100 %

TABELLE 4 Anzahl der getesteten FIV-Negativproben:

Probe	Anzahl negativ	% Spezifität
Gesamtblut S.A. Gilles-Plains	47/49*	95,9 %
W.A. Vorinfektion	24/24	100 %
Chatswood Vet-Surgery	18/18	100 %
Plasma
Negative Plasmen	91/91	100 %
Gesamtproben getestet	180/182	98,9 %

* Eine dieser Proben wurde als positiv bei der ersten Entnahme, jedoch als negativ bei der folgenden Entnahme bestätig.

Beispiel 5: Empfindlichkeit und Spezifität eines ELISA-Tests unter Verwendung synthetischer Peptide von FIV (680-711)
Es erfolgte eine weitere Untersuchung zur Beurteilung der Empfindlichkeit und Spezifität des ELISA-Tests unter Verwendung der synthetischen Peptide von FIV (680-711). Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit 1 μg Peptid in Carbonatpuffer oder in 30 % Essigsäure beschichtet. Testseren wurden in den Vertiefungen mit einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Das Sekundärreagens war Protein A-Meerrettich-Peroxidase. Die Reaktion wurde mit 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenthiazolin)sulfonsäure (Sigma) 20 min entwickelt und einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 420 nm abgelesen. Die Ergebnisse aus den Tests von 91 positiven und 91 negativen Proben sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Ergebnisse wurden wie folgt definiert:
"Negativ"-Ergebnisse hatten eine optische Dichte von kleiner als 0,5;
"Beinahe"-Ergebnisse hatten eine optische Dichte von 0,5 bis 1,5; und
"positive" Ergebnisse hatten eine optische Dichte von größer als 1,5. TABELLE 5 Absorptionsablesung bei A 420 nm

Proben OD 420 nm < 0,5 OS 420 0,5-1,5 OD 420 nm > 1,5

Negativplasma

Anzahl getested 91 87 4* keine

Positivplasma

Anzahl getestet 91 4** keine 87

* Keine dieser Proben ergab positive Agglutination mit dem FIV-Reagens (s. Beispiel 4)
** Eine Probe war aus einer 2-wöchigen experimentellen Infektion, die anderen drei Proben wurden als negativ bestätigt.

Vorteile der Erfindung
Das erfindungsgemäße Peptid wird chemisch synthetisiert oder durch rekombinante Proteinexpression produziert, ohne daß es erforderlich ist, entweder den gesamten Virus oder Viruslysate zu verwenden. Die Verwendung von Peptiden, im Gegensatz zur Verwendung von viralen Lysaten oder unreinen rekombinanten Proteinpräparationen, vermeidet das Problem, falsch-positive Ergebnisse aufgrund der kontaminierenden Proteine oder nicht-spezifischer Kreuzreaktivität, die durch das Vorhandensein von nicht-essentiellen Regionen von Virusproteinen, die nicht notwendig für den Nachweis sind, verursacht werden. Da die Peptide der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung chemisch synthetisiert werden, kann die Qualität kontrolliert werden, was die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse sicherstellt. Es wurde auch gefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide starke humorale und celluläre Immunreaktionen auslösen. Zum Beispiel lieferte wiederholte Immunisierung eines Schafes ein Immunserum mit einem Titer von 1:50000 aus. Man erwartet daher, daß sie nützlich als Immunabsorbenzien sind.
Es ist selbstverständlich, daß die Erfindung in ihren allgemeinen Aspekten nicht auf die spezifischen Details, auf die oben bezug genommen wurden, beschränkt ist.

Claims

Peptid, bestehend aus einer immundominanten Region eines Hüllproteins eines felinen Immunschwächevirus, wobei das Peptid zwei Cysteinreste umfaßt, die wahlweise unter Bildung einer Disulfidschleife verbunden sind; wobei das Peptid mindestens acht aufeinanderfolgende Aminosäuren, abgeleitet von den Aminosäuren 680 bis 711 des env gp 40-Proteins des felinen Immunschwächevirus mit der Sequenz KVEAMEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPLE umfaßt, oder ein Peptid, umfassend analoge oder konservative Substituenten für die in der Sequenz wiedergegebenen Aminosäuren, oder worin die Sequenz durch Aufnahme weiterer Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der Sequenz verlängert ist, oder worin die Aminosäuren aus dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus der Sequenz deletiert sind, worin das Peptid eine solche Konformation beibehält, daß es durch einen gegen die immundominante Region des felinen Immunschwächevirus-Hüllproteins gerichteten Antikörper erkannt wird.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend 10 bis 20 Aminosäuren.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend 20 bis 25 Aminosäuren.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend 25 bis 36 Aminosäuren.
Peptid nach Anspruch 4, worin die beiden Cysteinreste nicht unter Bildung einer Disulfidschleife verbunden sind.
Peptid nach Anspruch 4, worin die beiden Cysteinreste unter Bildung einer Disulfidschleife miteinander verbunden sind.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellung der Sequenz des Peptids und (ii) Verwendung der Sequenz zur Herstellung des Peptids nach einem Verfahren, ausgewählt aus rekombinanter DNA-Technologie und chemischer Synthese.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend den Schritt der Anwendung einer chemischen Synthesetechnik.
Immuntest zum Nachweis eines Antikörpers gegen einen felinen Immunschwächevirus in einer biologischen Probe aus einem felinen Säuger, der dem Virus ausgesetzt war, umfassend die Schritte: (i) Inkontaktbringen einer Probe einer physiologischen Flüssigkeit aus dem Säuger mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, (ii) Entfernen von ungebundenem Reagenz, (iii) Zugabe eines Reagenzes, das zur Bindung an das feline Immunglobulin in der Lage ist, wobei das Reagenz an einen detektierbaren Marker gebunden ist, (iv) Entfernung von ungebundenem Reagenz und (v) Nachweis von gebundenem Marker.
Testkit zur Durchführung eines Immuntests nach Anspruch 9, umfassend: (i) Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und (ii) ein Reagenz, das zur Bindung an felines Immunglobulin in der Lage ist, wobei das Reagenz an einen nachweisbaren Marker gekoppelt ist.
Immuntest nach Anspruch 9, worin der Test ein direkter oder indirekter Vollblutagglutinationstest ist.
Testkit nach Anspruch 10, wobei das Kit ferner eine positive Kontrollprobe enthält.
Testkit zur Durchführung eines Immuntests nach Anspruch 10, umfassend: (i) ein Reagenz, worin das Peptid an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden ist, die feline rote Blutzellen erkennen, und (ii) eine positive Kontrollösung.
Testkit nach Anspruch 13, worin das Peptid an das Antikörperfragment gekoppelt ist, welches feline rote Blutzellen erkennt, wobei die Kupplung durchgeführt wird durch Ausbilden einer Disulfidbindung zwischen Sulfhydrylgruppen auf dem Antikörperfragment und Sulfhydrylgruppen der Peptidcysteinreste.