DE68925043T3

DE68925043T3 - Synthetische Peptide und deren Mischungen für den Nachweis von HIV-Antikörpern

Info

Publication number: DE68925043T3
Application number: DE68925043T
Authority: DE
Inventors: Francesco Bellini; Gervais Dionne; Martial Lacroix
Original assignee: Adaltis Inc
Current assignee: Adaltis Inc
Priority date: 1988-01-27
Filing date: 1989-01-26
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2009-01-27
Also published as: ATE131492T1; IL88963A; ES2083387T3; EP0326490A3; EP0326490B2; JP2001055400A; DE68925043T2; AU2851389A; ES2083387T5; IL88963A0; AU629528B2; JP3851761B2; EP0326490A2; JPH01224397A; JPH08245693A; DE68925043D1; EP0326490B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue cyclische synthetische Peptide und Kombinationen davon mit linearen synthetischen Peptiden zur Detektierung von HIV-Antikörpern.
Hintergrund der Erfindung
Es wurde vorgeschlagen, daß erworbene Immunabwehrschwäche (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS), AIDS-bezogener Komplex (ARC) und Prä-AIDS durch einen Retrovirus verursacht werden, den menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1; auch bekannt als HTLV-III, LAV-1 und ARV). Kürzlich wurde ein anderer pathogener menschlicher Retrovirus, genannt HIV-2 (früher LAV-2) aus westafrikanischen Patienten mit AIDS isoliert (Montagnier et al. in PCT/FR87/00025, veröffentlicht am 30. Juli 1987 als internationale Veröffentlichung Nr. WO87/04459). Es wurde kürzlich gezeigt (Guyader et al., Nature 326, 662–669, 1987), daß HIV-2 eine Anzahl von konservativen Sequenzen mit HIV-1 und dem Simian-Immunschwächevirus (SIV) teilt.
Auch wenn andere Numerierungssysteme im Stand der Technik, auf den hier Bezug genommen wird, verwendet werden, ist das hierin verwendete Numerierungssystem für Aminosäuren das von Ratner et al., Nature 313, 277–284, 1985 für die HIV-1-Proteine und das von Guyader et al., Nature 326, 662–669 (1987) für die HIV-2-Proteine. Die hierin in den Peptiden verwendeten Aminosäuren sind mit dem einfachen Buchstabencode wie folgt angegeben: Ala = A, Arg = R, Asn = N, Asp = D, Cys = C, Gln = Q, Glu = E, Gly = G, His = H, Ile = I, Leu = L, Lys = K, Met = M, Phe = F, Pro = P, Ser = S, Thr = T, Trp = W, Tyr = Y und Val = V.
Die anfänglichen immundiagnostischen Tests zur Detektion von Antikörpern im Serum von Patienten, die mit HIV-1 infiziert waren, verwendeten das ganze Virus als Antigen. Die Tests der zweiten Generation nutzten Polypeptidsequenzen, die durch die rekombinante DNA-Verfahrensweise erhalten wurden. Cabradilla et al., Bio/Technology 4, 128–133 (1985) und Chang et al., Bio/Technology 3, 905–909 (1985) gelang es, über Bakterien synthetisierte virale Proteinfragmente von 82 bzw 102 Aminosäureresten zu erhalten. EP 86202314 und 86114243 beschreiben rekombinante Polypeptide, die Regionen des gp41 und gp120 enthalten, die allein oder in Gemischen immunoreaktiv sind. Shoeman et al., Anal. Biochem. 161, 370–379 (1987) beschreiben auch einige Polypeptide aus gp41, die immunoreaktive Eigenschaften mit Antikörpern aufweisen, die in Seren von mit HIV-1 infizierten Patienten vorliegen. Keines der obigen Assayverfahren ist annehmbar. Ihr Mangel an Sensitivität ist ernst, da er erlauben könnte, daß Blut, das den Virus enthält, der Detektion entgeht und dabei möglicherweise in der Infektion von Blutproduktempfängern resultiert. Die in diesen Antigenpräparationen vorliegenden Verunreinigungen sind auch verantwortlich für unannehmbar hohe Anteile von falsch-positiven Ergebnissen, wodurch gesunde Individuen Kummer erleiden.
Es wurde dann offensichtlich, daß eine Tendenz des Standes der Technik die Identifizierung von kürzeren Epitopen war. Dies aufgrund der Einfachheit und niedereren Kosten, mit denen sie hergestellt werden konnten und wichtiger aufgrund des verringerten Risikos, falsch-positive Testergebnisse aufgrund des Vorliegens von gemeinsamen Epitopen mit viralen Proteinen, die nicht mit AIDS in Verbindung stehen, zu erhalten. In diesem Zusammenhang hat Gallaher (Cell 50, 327–328, 1987) herausgefunden, daß eine Region des gp41 von HIV-1 eine Sequenz von 5 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten mit dem respiratorischen syncytialen Virus (respiratory syncytial virus) und von 4 gleichverteilten Aminosäuren des Masernvirus-Fl-Glykoproteins teilt. Somit würden auch hochgereinigte rekombinante Polypeptide, die diese Region enthalten oder andere übliche Regionen, die noch zu entdecken sind, möglicherweise für falsch-positive Ergebnisse verantwortlich sein.
Abgesehen von seiner besseren Spezifität macht die Identifizierung von kürzeren Peptidsequenzen, die einzigartigen und hochkonservativen Epitopen des HIV-Virus entsprechen, seine Herstellung durch chemische Synthese einfacher und billiger. Empirische Verfahren wurden beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen eine Hilfestellung bei der Auswahl von kurzen Aminosäuresequenzen, die sich wahrscheinlich an der Oberfläche des nativen Proteins befinden (für einen Überblick siehe Hopp und Woods, J. Immunol. Meth. 88: 1–18, 1986). Auch wenn einigermaßen nützlich, sind diese Verfahren nicht mehr als andeutend. Trotzdem wurden sie von vielen für die Identifizierung von Epitopen angewendet, die auf dem Protein des für AIDS verantwortlichen Viruses vorliegen. Z. B.: US-Patent 4,629,783, internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US86/00831 und EP-Anmeldung Nr. 86303224 offenbaren verschiedene synthetische Peptide aus den p18-, p25-, gp41- und gp120-Proteinen von HIV-1, die als geeignet in diagnostischen Kits für AIDS beansprucht werden.
Der Trend zu kleineren Antigenen wird jedoch begleitet von einem Risiko, daß das synthetisierte Epitop nicht in der Lage ist, eine starre Konformation einzunehmen, die durch den Antikörper erkannt wird. Auch wenn die Anzahl von in jedem dieser Fälle untersuchten Serumproben sehr beschränkt ist, wurde eine sehr hohe Spezifität (95% bis 100%) mit kleinen synthetischen Peptiden gefunden, aber die mittlere Sensitivität variierte zwischen 80 und 100%. In dem einzigen Beispiel, in dem 100% Sensitivität erreicht wurden, waren nur 10 Proben untersucht worden.
Smith et al. (J. Clin. Microbiol. 25, 1498–1504, 1987) beschrieben zwei überlappende Peptide E32 und E34, die hochimmunoreaktiv sind. Keine falsch-positiven Ergebnisse wurden von 240 seronegativen Proben erhalten, aber der Test übersah 3 seropositive Proben von 322 (Sensitivität von 99,1%). Wang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6159–6163, 1986) bschrieben eine Reihe von überlappenden Peptiden (einschließlich der Aminosäurereste der E32- und E34-Peptide, die von Smith et al. entdeckt wurden), unter denen ein 21-mer Peptid 100% Spezifität und 98% Sensitivität zeigte (von 228 seropositiven Proben, die von Patienten mit AIDS genommen wurden, wurden 224 mit diesem Peptid als positiv erkannt).
In der US-Anmeldung Nr. 120 027, eingereicht am 13. November 1987, ist ein kurzes synthetisches Peptid offenbart, das die Reste 606 bis 620 (SGKLICTTAVPWNAS) von gp41 (HIV-1) überdecken, von dem behauptet wird, daß es mit Antikörpern von mit AIDS-Virus infizierten Patienten immunoreaktiv ist. In diesem Beispiel war die Spezifität ebenfalls hervorragend (63/63), aber 6 seropositive Proben von 57 bestätigt positiven konnten nicht detektiert werden (Sensitivität von 89%).
Gnann et al. (J. Virol. 61, 2639–2641, 1987 und J. Insec. Dis. 156, 261–267, 1987) berichteten auch eine Reihe von überlappenden Peptiden aus einer immunodominanten Region von gp41 (HIV-1). Von besonderem Interesse war ihre Entdeckung, daß ein Peptid mit der Sequenz SGKLIC (606–611) nicht immunoreaktiv mit einem der untersuchten 22 HIV-Positivseren war. Das Anhängen eines Cysteinrests an den N-Terminus ergab etwas Immunoreaktivität, 21 von 44 Seren reagierten mit dem 7-mer-Peptid (48% Sensitivität). Gnann et al. schlossen, daß Cystein 605 wesentlich für die Immunreaktivität dieses Segments des gp41 (HIV-1)-Proteins war.
Gnann et al. haben auch vermutet, daß die Cysteinreste an den Positionen 605 und 611 (nach Ratners Numerierungssystem) aus gp41 (HIV-1) eine entscheidende Rolle in der antigenen Konformation dieser Region des Proteins spielen könnten, möglicherweise durch die Bildung einer Schleife über eine Disulfidbindung. Die Versuche der Autoren, die Bildung der Disulfidbindung zu identifizieren und zu überprüfen, sind jedoch fehlgeschlagen. Da Gnann et al. niemals zeigten, daß sie ein synthetisches Peptid hatten, das die Aminosäure-Teilsequenz 605–611 enthielt, worin die zwei terminalen Cysteingruppen durch Disulfidbindungen gebunden waren, sind die Eigenschaften eines Peptids, das eine solche Disulfidbindung aufweist, unbekannt und nicht vorhersagbar.
Die Teilsequenz mit 7 Aminosäuren, die zwei Cysteinreste an Position 605–611 enthält, wurde auch in anderen Dokumenten offenbart, wie etwa in der PCT/US86/00831, veröffentlicht am 06. November 1986 unter der internationalen Publikationsnummer WO86/06414, worin Peptid X(39), das durch die Region von ungefähr bp 7516 bis 7539 codiert ist und Peptid XIII (79), das durch die Region, die sich von ungefähr bp 7543 bis bp 7593 erstreckt, codiert ist, jeweils die Sequenz mit 7 Aminosäuren (Aminosäuren 605–611) enthalten, die bei Gnann et al. in der oben angeführten Publikation diskutiert werden. Die Peptide werden als linear bezeichnet und die Autoren haben keinerlei Bildung von cyclischen Strukturen erwähnt.
Rosen et al. haben in der PCT/US87/00577, veröffentlicht am 08. Oktober 1987 unter der internationalen Publikationsnummer WO87/06005 berichtet, daß eine Reihe von synthetischen Peptiden, umfassend die Cys (605)–Cys (611) Reste des HIV-1 Hüllglykoproteins (gp41) eine Reihe von spontanen oxidativen Transformationen nach Solubilisierung in neutralem oder basischem wäßrigen Puffer eingehen. Die Autoren haben vermutet, daß unter diesen Bedingungen die in ELISAs verwendeten Peptide eine zufällige Mischung von linearem Monomer, cyclischem Monomer, linearen oder cyclischen Dimeren und linearen Polymeren unterschiedlicher Längen sind. Die Erfinder prüften jedoch nicht das Vorliegen von cyclischen Bestandteilen und haben die anderen vorliegenden unterschiedlichen Dimere und Polymere nicht charakterisiert und sie haben vermutet, daß die Polymerformen die wichtigsten Bestandteile für die Reaktivität in ELISA-Untersuchungen sind.
Gnann et al. (Science, 237, 1346–1349, 1987) berichteten ein kurzes lineares synthetisches Peptid, das die Reste 592 bis 603 aus gp42 (HIV-2) enthielt, das zwei Cysteine in einer zu der auf gp41 (HIV-1) homologen Region einschließlich Cys (605) und Cys (611) enthält. Dieses Peptid reagierte mit 5 von 5 Seren, die von HIV-2-infizierten Patienten entnommen wurden.
Auch wenn die oben diskutierten Literaturstellen Peptide bereitstellen, die nützlich zur Identifizierung von HIV-1-Antikörpern sind, zeigen sie auch bestimmte Nachteile, wie etwa Unfähigkeit einer vollständigen Detektion (100%) von positiven Serumproben. Z. B. detektierten Gnann et al. (J. Virol. 61, 2639–2661, (1987)) in ihren Untersuchungen mit ihrer 600–611-Aminosäuresequenz 22 von 22 positiven Seren, gaben jedoch auch an, daß in ähnlichen Tests, die durch einen anderen Autor am Centers for Disease Control, Atlanta, Ga. mit der gleichen Sequenz mit 12 Aminosäuren (600 bis 611) durchgeführt wurde, 78 von 79 positiven Seren detektiert wurden. Gnann et al. zeigten in J. Infect. Dis., 156, 261– 267, 1987 daß die gleiche Sequenz mit 12 Aminosäuren aus gp41-(HIV-1) mit 131 von 132 HIV-infizierten Patienten aus den Vereinigten Staaten reaktiv war.
In dem gleichen Artikel ist ebenfalls deutlich gezeigt, daß, wenn die HIV-1-positiven Seren um einen Faktor größer als 500 verdünnt werden, einige dieser verdünnten Seren als negativ erkannt werden, wodurch eine niedrige Sensitivität angezeigt wird.
Ein weiterer möglicher Nachteil dieser Assays des Standes der Technik ist ihre Verwendung einer gering definierten und unvorhersagbaren Peptidmischung als Sonde. Diese Mischung umfaßt Peptide, die viele oxidative Formen von Cystein aufweisen, die spontan während der Peptidherstellung, -verarbeitung und -verwendung erzeugt wurden.
Es erscheint hoch wünschenswert, Peptide oder Peptidgemische bereitzustellen, die beständig gegenüber spontaner Oxidation sind. Solche Peptide würden somit eine gut definierte Struktur aufweisen. Darüber hinaus würden solche Peptide unter normalen Testbedingungen alle HIV-1 und/oder HIV-2 Antikörper enthaltenden Proben als positiv detektieren, selbst wenn äußerst niedrige Antikörpermengen vorliegen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Peptide bereitgestellt, die insbesondere zur Detektion von 100% von HIV-1 und HIV-2 Antikörpern geeignet sind und die noch fähig sind, alle HIV-1 und HIV-2 Antikörper vollständig zu detektieren, selbst wenn die Seren hochverdünnt sind.
Genauer sind die neuen Peptide der vorliegenden Erfindung in Anspruch 1 des Anspruchssatzes für die Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE definiert.
Auch im Umfang der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination oder ein Gemisch von synthetischen Peptiden, umfassend mindestens ein Peptid wie in Anspruch 1 des Anspruchssatzes für die Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE definiert,
in Verbindung mit

– einem Peptid aus gp120, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 497 bis 518 (gp120-HIV-1) erstreckt oder
– einem Peptid aus gp120, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 497 bis 518 (gp120-HIV-1) erstreckt, einem Peptid aus p24, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 241 bis 263 (p24-HIV-1) erstreckt oder
– einem Peptid aus gp120, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, sich von 497 bis 518 (gp120-HIV-1) erstreckt und einem Peptid aus gp41, das sich von 586 bis 620 (gp41-HIV-1) erstreckt.

Erfindungsgemäß werden auch neue Peptide bereitgestellt, die geeignet sind zur Identifizierung von 100% von Seren, die von einer kleinen Anzahl von mit HIV-2 infizierten Patienten entnommen wurden. Es ist somit möglich, einige der Peptide oder Peptidgemische, die in dieser Erfindung beschrieben werden, zur Detektion von sowohl HIV-1 als auch/oder HIV-2 zu verwenden.
Genauer sind die neuen Peptide dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung in Anspruch 3 des Anspruchssatzes für die Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE; und in Anspruch 1 des Anspruchssatzes für die Vertragsstaaten GR, ES definiert.
Auch im Umfang der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination oder ein Gemisch von synthetischen Peptiden, die mindestens ein cyclisches Peptid, wie in Anspruch 3 des Anspruchssatzes für die Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE; und in Anspruch 1 des Anspruchssatzes für die Vertragsstaaten GR, ES definiert, umfassen in Verbindung mit einem Peptid, das Peptid 203 genannt wird, des externen Hüllglykoproteins (EGP) und gekennzeichnet ist durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 486 bis 508 erstreckt, oder einem Peptid, das Peptid 204 genannt wird, des EGPs, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 486 bis 501 erstreckt.
Weiterhin liegt es im Umfang der vorliegenden Erfindung, Kombinationen von synthetischen Peptiden der vorliegenden Erfindung zu verwenden, in Abwesenheit oder in Verbindung mit einem oder mehreren linearen Peptiden aus den gp120- und/oder p24- und/oder EGP-Aminosäuresequenzen wie vorher definiert.
Ein unerwarteter Vorteil der neuen Gemische der vorliegenden Erfindung ist, daß sie eine vollständige Detektion von HIV-Antikörpern bereitstellen können, die von einem großen Panel von Seren stammen, das aus 1378 HIV-1-positiven und 5 HIV-2-positiven Personen besteht. Ein anderer Vorteil ist der hohe Grad an Spezifität, der durch die Gemische der vorliegenden Erfindung erhalten wird, der eine minimale Anzahl von falsch-positiven Ergebnissen ergibt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Auswahl von Peptiden zur Synthese
Peptide wurden zur Synthese auf der Grundlage der bekannten Aminosäuresequenzen der HIV-1-Isolate sowie der Kenntnis, welche Regionen erhalten werden, ausgewählt. Vor kurzem wurde gezeigt, daß HIV-2, ein kürzlich auftauchender neuer Virus, beträchtliche Homologie mit HIV-1 teilt. Es ist somit möglich, einige der Peptide oder Peptidgemische, die in dieser Erfindung beschrieben werden, zur Detektion von sowohl HIV-1 als auch/oder HIV-2 zu verwenden.
Zusätzlich zu bekannten Aminosäuresequenzen wurden mögliche Epitope ausgewählt unter Verwendung verschiedener physiochemischer Prinzipien, die bei der Vorhersage helfen, welche Teile der Polypeptide am wahrscheinlichsten an der Oberfläche orientiert und deshalb immunogen sind. Diese beinhalten die Hydrophilizitätplots von Hopp und Woods (Proc. Nat. Acad. Sci. 78, 3824–3828, 1981) und einen ähnlichen Versuch von Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105–132, 1982). Auch die empirische Vorhersage der Proteinkonformation (Chou und Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47, 251–276, 1978) ist ein nützlicher Führer zur Vorhersage, welche Teile des Polypeptids wahrscheinlich immunogen sind. Auch wenn diese theoretischen Ansätze nützliche Führer sind, gibt es doch viele Ausnahmen einschließlich einiger, die im Verlauf der vorliegenden Untersuchungen entdeckt wurden.
Es ist oftmals wünschenswert, natürlich auftretende Sequenzen zu modifizieren, um das Peptid geeigneter als immunodiagnostisches Reagenz zu machen, ohne seine antigenen Eigenschaften zu verändern. Solche Veränderungen beinhalten:

– Zugabe eines Cysteinrests an den Amino- oder Carboxyterminus, um Koppeln des Peptids an ein Trägerprotein mit heterobifunktionellen Quervernetzungsreagenzien, wie etwa Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, einem bevorzugten Reagenz zur Bewirkung solcher Verknüpfungen, zu erleichtern;
– Zugabe von bestimmten Aminosäuren an den COOH- oder NH₂-Terminus eines Oligopeptids, um Bindung der Peptide aneinander zu erleichtern, zur Kopplung an einen Träger oder ein großes Peptid oder zur Modifizierung der physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids. Solche Veränderungen werden durch Additionen von Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure bewirkt, welche als Linker über eine Veresterungsreaktion verwendet werden können und von Lysin, welches durch eine Schiff'sche Base oder Amidbildung verknüpft werden kann;
– Derivatisierung durch terminale NH₂-Acylierung, Thioglykolsäureamidierung, terminale COOH-Amidierung, z. B. Ammoniak, Methylamin. Diese Modifikationen resultieren in Veränderungen der Nettoladung auf dem Peptid und können auch kovalente Bindung des Peptids an ein festes Trägermaterial, einen Carrier oder ein anderes Peptid erleichtern. Diese Modifikationen resultieren wahrscheinlich nicht in Veränderungen der Immunoreaktivität des Peptids;
– Methionin, eine Aminosäure, die anfällig für spontane Oxidation ist, kann üblicherweise durch Norleucin ohne Veränderung der Antigenizität ersetzt werden.

Peptidsequenzen können konservativen Substitutionen unterzogen werden.
Es kann günstig sein, einen "Schwanz" hinzuzufügen, der aus einer kleinen Zahl (1 bis 10) hydrophober Aminosäuren besteht, um passive Adsorption eines Peptids an einen festen Träger zu erleichtern. Diese Veränderung kann entweder am COOH- oder am NH₂-Terminus gemacht werden. Die bevorzugte Anlagerung ist Phe-Ala-Phe-Ala-Phe.
Erfindungsgemäß sind die bevorzugten cyclischen Peptide, die geeignet zur Detektion von HIV-1-Antikörpern sind, solche, worin:
a-x NH₂-RILAVERYLKDQQLLGIWG- und y-b -TTAVPWNAS-COOH darstellt (87c).
Ebenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten cyclischen Peptide, die geeignet zur Detektion von HIV-2-Antikörpern sind, solche, worin
a-x¹ NH₂-RVTAIEKYLQDQARLNSWG- und y¹-b HTTVPWVNDS-COOH darstellt (Peptid 202).
Die am meisten bevorzugten cyclischen Peptide sind die Peptide 87c und 202.
Tabelle 1 zeigt die Aminosäurepositionszahlen für HIV-1 bezogen auf die von Ratner et al., Nature 313, S. 277–284 (1985) veröffentlichte Sequenz und die für HIV-2 bezogen auf die von Guyader et al., Nature 326, 662–669 (1987) veröffentlichte Sequenz für die bevorzugten cyclischen Peptide der vorliegenden Erfindung.
TABELLE 1
Herstellung von linearen und cyclischen Peptiden.
Der Harzträger ist jedes geeignete Harz, das üblicherweise im Stand der Technik zur Festphasenherstellung von Polypeptiden eingesetzt wird, bevorzugt p-Benzyloxyalkoholpolystyrol und p-Methylbenzydrylaminharz. Nach der Kopplung der ersten geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die Aminoschutzgruppe durch Standardverfahren entfernt, die üblicherweise im Stand der Technik der Festphasen-Peptidsynthese eingesetzt werden. Nach Entfernung der Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden α-aminogeschützten und, falls nötig, seitenkettengeschützten Aminosäuren nacheinander in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt, um das Produkt zu erhalten. Alternativ können viele Aminosäuregruppen unter Verwendung von Lösungsverfahrensweisen vor der Ankopplung an die Aminosäuresequenz auf dem Harzträger gekoppelt werden.
Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsreagenz richtet sich nach dem Stand der Technik. Z. B. sind geeignete Kopplungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), entweder allein oder bevorzugt zusammen mit 1-Hydroxybenzotriazol. Ein anderes geeignetes Kopplungsverfahren verwendet vorbereitete symmetrische Anhydride von geschützten Aminosäuren.
Die für jede Aminosäure, die in die wachsende Polypeptidkette eingeführt wird, eingesetzte notwendige α-Aminoschutzgruppe ist bevorzugt 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), auch wenn jede andere geeignete Schutzgruppe eingesetzt werden kann, solange sie keinen Abbau unter den Kopplungsbedingungen erleidet, während sie leicht selektiv in Anwesenheit von anderen Schutzgruppen, die bereits in dem wachsenden Molekül vorliegen, entfernbar ist.
Die Kriterien zur Auswahl von Gruppen für die Seitenkettenaminosäuren sind: (a) Stabilität der Schutzgruppe gegenüber den verschiedenen Reagenzien unter Reaktionsbedingungen, die selektiv zur Entfernung der α-Aminoschutzgruppe bei jedem Schritt der Synthese sind: (b) die Schutzgruppe muß ihre strategischen Eigenschaften behalten (d. h. unter Kopplungsbedingungen nicht abgespalten werden) und (c) die Schutzgruppe muß leicht entfernbar sein nach Abschluß der Polypeptidsynthese und unter Bedingungen, die ansonsten die Polypeptidstruktur nicht beeinflussen.
Die vollständig geschützten Peptide auf dem Harzträger werden von p-Benzyloxyalkoholharz mit einer 50 bis 60%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid für 1 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von geeigneten Spülmitteln, wie etwa Anisol, Thioanisol, Ethylmethylsulfid, 1,2-Ethanoldithiol und ähnlichen Reagenzien abgespalten. Gleichzeitig werden die meisten säureempfindlichen Schutzgruppen der Seitenketten entfernt. Säurestabilere Schutzgruppen werden durch HF-Behandlung entfernt.
Cyclische Peptide dieser Erfindung werden durch die direkte oxidative Überführung von geschützten oder ungeschützten SH-Gruppen in eine Disulfidbindung durch die folgenden, allgemein im Stand der Technik von Peptidsynthesen bekannten Techniken hergestellt. Das bevorzugte Verfahren beinhaltet die direkte Oxidation von freien SH-Gruppen mit Kaliumhexacyanoferrit. Solche cyclischen Peptide nehmen eine starrere Konformation an, welche Bindung zu dem Antikörper begünstigen kann. Es ist nicht bekannt, ob Cystein-Cystein-Disulfidbindungen in den nativen viralen Proteinen vorhanden sind.
Peptidgemische
Auch im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen Gemische von cyclischen und linearen Peptiden, von welchen überraschenderweise herausgefunden wurde, daß sie eine vollständige Detektion von HIV-1- und HIV-2-Antikörpern, die von einem großen Panel von Seren von 1378 HIV-1-positiven Personen und 5 HIV-2-positiven Personen stammen. Es wurde auch herausgefunden, daß die neuen Gemische der vorliegenden Erfindung einen hohen Grad an Spezifität bereitstellen, wodurch sich eine minimale Anzahl von falsch-positiven Ergebnissen ergibt.
Darüber hinaus umfassen die erfindungsgemäßen Gemische mindestens ein cyclisches Peptid der allgemeinen Formel
worin x, y, a und b wie vorher definiert sind in Verbindung mit

– einem linearen Peptid aus gp120 (HIV-1) oder
– einem linearen Peptid aus gp120 (HIV-1), einem linearen Peptid aus p24 (HIV-1) und einem linearen Peptid aus gp41 (HIV-1) oder
– einem linearen Peptid aus gp120 (HIV-1) und einem linearen Peptid aus gp41 (HIV-1).

Andere erfindungsgemäße Gemische umfassen mindestens ein cyclisches Peptid der allgemeinen Formel:
worin x¹ und y¹ wie oben definiert sind, in Verbindung mit einem der linearen Peptide des EGP von HIV-2.
Auch wenn die cyclischen Peptide, die von gp41-(HIV-1) und gp42-(HIV-2) stammen, eine hochkonservative und immunodominante Region nachahmen, wurde es als sicherer empfunden, andere Peptidsequenzen von gp41 (HIV-1) und einige von zwei anderen immunogenen Proteinen von (HIV-1) einzuschließen. Falls eine Mutation dieses Epitop soweit verändern würde, daß in dem Serum einer solchen infizierten Person enthaltene Antikörper nicht mehr in der Lage waren, cyclische Peptide zu binden, könnte dieses Serum immer noch als positiv erkannt werden aufgrund der anderen, gegen die anderen Epitope gerichteten Antikörper, die in dem Assaysystem enthaltenen sind. Es gibt aber eine Grenze für die Zahl von Peptiden, die in einem Gemisch verwendet werden können. Zunächst können zu viele verschiedene Peptide die Zahl von falsch-positiven Ergebnissen erhöhen. Insbesondere wurde oftmals gefunden, daß viele Peptide aus dem p24 (HIV-1)-Protein verantwortlich für unannehmbar niedrige Spezifität sind. Zweitens würde die Zugabe von zu vielen Peptiden zu einem Gemisch das Immunodominante (die Immunodominanten) verdünnen und die Sensitivität des Tests verringern.
Genauer hat das lineare Peptid aus gp120 (HIV-1) die Aminosäuresequenz, die sich von 497 bis 518 erstreckt und entspricht der Formel NH₂-CGKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR-COOH (71)
Das lineare Peptid aus p24 (HIV-1) hat die Aminosäuresequenz, die sich von 241 bis 263 erstreckt und entspricht der Formel NH₂-CGSTLQEQIGWNTNNPPIPVGEIYK-COOH (61)
Die linearen Peptide aus EGP (HIV-2) haben Aminosäuresequenzen, die sich von 486 bis 501 (Peptid 204) oder von 486 bis 508 (Peptid 203) erstrecken. NH₂-LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR-COOH (203) NH₂-LVEITPIGFAPTKEKR-COOH (204)
HIV-Antikörperdetektion
Die Peptide und die Peptidgemische der vorliegenden Erfindung werden als diagnostische Reagenzien zur Detektion von AIDS-assoziierten Antikörpern gemäß im Stand der Technik gut bekannten Verfahren verwendet. Der Hauptvorteil der vorliegenden Peptide bei der Bestimmung von Antikörpern gegen AIDS liegt in ihrer Spezifität im Vergleich zu bisher verwendeten bekannten Antigenen.
Gemäß einem Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen den AIDS-Virus wird die sogenannte "Western Blot"-Analyse verwendet (Towbin, H., Staehelin, Th. und Gordon, J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354 (1979)). Gemäß dieser Technik wird oder werden ein Peptid oder Peptide der vorliegenden Erfindung auf Nitrocellulosepapier aufgebracht. Dieses Nitrocellulosepapier wird gesättigt und dann mit dem zu untersuchenden Serum behandelt. Nach Waschen wird das Nitrocellulosepapier mit einem Anti-Human-IgG, das mit einem Enzym markiert ist, behandelt. Die Enyzmaktivität wird dann durch ein geeignetes Substrat bestimmt. Natürlich können andere Markierungen, wie radioaktive oder fluoreszierende Markierungen, verwendet werden.
Eine bevorzugte, geeignete und klassische Technik zur Bestimmung von Antikörpern gegen den AIDS-Virus unter Verwendung eines Peptids oder eines Peptidgemisches der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym-Immunosorbent Assay (ELISA). Gemäß diesem Test wird ein Peptid oder Peptidgemisch der vorliegenden Erfindung an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die Vertiefungen werden dann mit den zu testenden Seren behandelt. Nach waschen wird Anti-Human-IgG, das mit Peroxidase markiert ist, zu den Vertiefungen zugegeben. Die Bestimmung der Peroxidase wird mit einem entsprechenden Substrat, z. B. mit o-Phenylendiamin, durchgeführt. In diesem Verfahren kann die Peroxidase auch durch eine andere Markierung ausgetauscht werden, z. B. durch eine radioaktive oder fluoreszierende Markierung.
In dem ELISA-Test ist es möglich, einzelne Peptide oder eine Kombination davon zu verwenden. Das letztere ist bevorzugt, da es einem ermöglicht, die wirksamsten Peptide zur Detektierung von Antikörpern zu kombinieren, während zur gleichen Zeit solche, die zu falschen Antworten beitragen, ausgeschlossen werden. Es wurde im Verlauf dieser Untersuchungen entdeckt, daß einige Serumproben korrekte positive Ergebnisse mit Peptidgemischen ergaben, während sie ungewisse Antworten mit einzelnen Peptiden als Antigen ergaben. Somit kann ein vollständig verläßlicher Test für HIV-1- und HIV-2-Antikörper nur mit einer geeigneten Kombination von Peptidantigenen erzielt werden.
Ein anderes Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen den AIDS-Virus mit den Peptiden oder Peptidgemischen der Erfindung ist ein enzymimmunologischer Test gemäß dem sogenannten "Doppel-Antigen-Sandwich-Verfahren". Dieses Verfahren basiert auf der Arbeit von Maiolini, R. I., wie beschrieben in Immunological Methods 20, 25–34 (1978). Gemäß diesem Verfahren wird das zu untersuchende Serum mit einer Festphase in Kontakt gebracht, auf der ein Peptid oder ein Peptidgemisch der vorliegenden Erfindung aufgetragen ist (Fangschicht) und mit einem Peptid oder einem Peptidgemisch der vorliegenden Erfindung, das mit Peroxidase (Sondenschicht) markiert ist. Die immunologische Reaktion kann in einem oder zwei Schritten durchgeführt werden. Wenn die immunologische Reaktion in zwei Schritten durchgeführt wird, dann wird ein Waschschritt zwischen den zwei Inkubationen durchgeführt. Nach der immunologischen Reaktion oder den immunologischen Reaktionen wird ein Waschschritt durchgeführt. Danach wird die Peroxidase mit einem Substrat, z. B. mit o-Phenylendiamin, nachgewiesen.
Geeignete Festphasen sind organische und anorganische Polymere (Amylasen, Dextrane, natürliche oder modifizierte Cellulosen, Polyethylen, Polystyrol, Polyacrylamide, Agarosen, Magnetit, poröses Glaspulver, Polyvinyldienfluorid (Kynar) und Latex), die Innenwand von Testgefäßen (Teströhrchen, Titerplatten oder Küvetten aus Glas oder künstlichem Material) sowie die Oberfläche von Festkörpern (Stangen aus Glas und künstlichem Material, Stangen mit dickem Ende, Stangen mit terminalen Erhebungen oder Lamellen). Kugeln aus Glas und künstlichem Material stellen besonders geeignetes Festphasen-Trägermaterial dar.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidgemische sind nicht nur geeignet zur Bestimmung von Antikörpern gegen den AIDS-Virus, sondern auch zur Bestimmung des AIDS-Virus selbst, da diese Peptide entweder frei, polymerisiert oder konjugiert an einen geeigneten Träger geeignet sind, Antikörper hervorzurufen, insbesondere monoklonale Antikörper gegen den AIDS-Virus. Solche Antikörper können durch Injizieren einer ausreichenden Menge eines Peptids oder Peptidgemisches der vorliegenden Erfindung in ein Säugetier oder einen Vogel und Gewinnen der Antikörper aus dem Serum der Tiere erzeugt werden.
Geeignete Wirtstiere zum Erzeugen von Antikörpern beinhalten Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Mäuse, Kühle, Schafe etc.
Verschiedene Verfahren, die allgemein bekannt sind, können zur Bestimmung des AIDS-Virus oder eines Teils davon eingesetzt werden.
In einem solchen Verfahren werden bekannte Mengen einer zu untersuchenden Serumprobe, radiomarkierte cyclische Peptide oder Peptidgemische der vorliegenden Erfindung, und ein unmarkiertes Peptid oder Peptidgemisch der vorliegenden Erfindung miteinander gemischt und stehengelassen. Der Antikörper/Antigen-Komplex wird von den ungebundenen Reagenzien durch im Stand der Technik bekannte Verfahren abgetrennt, d. h. durch Behandlung mit Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol, einem zweiten Antikörper, entweder im Überschuß oder an einen unlöslichen Träger gebunden, dextranbeschichtete Kohle und ähnliches. Die Konzentration des erfindungsgemäßen markierten Peptids oder Peptidgemisches wird entweder in der gebundenen oder ungebundenen Phase bestimmt und der AIDS-Gehalt der Probe kann durch Vergleich des Gehalts der beobachteten markierten Komponente zu einer Standardkurve in einer an sich bekannten weise bestimmt werden.
Ein anderes geeignetes Verfahren ist der "Doppel-Antikörper-Sandwich-Assay". Gemäß diesem Assay wird die zu untersuchende Probe mit zwei verschiedenen Antikörpern behandelt. Einer dieser Antikörper ist markiert und der andere ist auf eine Festphase beschichtet. Die geeigneten Festphasen sind solche, die vorher in dieser Anmeldung erwähnt wurden. Geeignete Markierungen sind Enzyme, z. B. Peroxidase, radioaktive Markierungen oder fluoreszierende Markierungen. Die bevorzugte Festphase ist ein Kunststoffkügelchen und die bevorzugte Markierung ist Meerrettichperoxidase. Verschiedene Antikörper können durch Immunisierung verschiedener Tiere, z. B. Schaf und Kaninchen, erzeugt werden.
Ein anderes Verfahren besteht in der Verwendung der gutbekannten Koehler und Milstein-Technik zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern. Um monoklonale Antikörper, die gegen das gleiche Antigen, aber gegen verschiedene Epitope gerichtet sind, zu unterscheiden, kann das Verfahren von Stähli et al. (J. of Immunological Methods 32, 297–304 (1980)) verwendet werden.
Es ist natürlich auch möglich, ein Antiserum (polyklonaler Antikörper) und einen monoklonalen Antikörper zu verwenden.
Gemäß dem "Doppel-Antikörper-Sandwich-Verfahren" wird die Probe mit dem Festphasenantikörper und dem markierten Antikörper inkubiert. Es ist möglich, die Probe zuerst mit dem Festphasenantikörper zu behandeln und nach Waschen die Probe mit dem markierten Antikörper zu behandeln.
Es ist jedoch auch möglich, die Probe zuerst mit dem Festphasenantikörper und nach einer gewissen Zeit mit dem markierten Antikörper zu behandeln. Zusätzlich und bevorzugt ist es möglich, die Probe gemeinsam mit dem Festphasen- und dem markierten Antikörper zu behandeln.
Nach der immunologischen Reaktion (den immunologischen Reaktionen) wird ein Waschschritt durchgeführt. Nach dem Waschen wird die Markierung gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt. Falls Peroxidase als die Markierung verwendet wird, wird die Bestimmung mit dem Substrat, z. B. mit o-Phenylendiamin oder mit Tetramethylbenzidin, durchgeführt. Die Menge der markierten Komponente ist proportional zur Menge des Antigens (der Antigene), die in der Probe vorliegen.
Die Verfahren zur Bestimmung des AIDS-Virus oder von Antikörpern gegen den AIDS-Virus, wie oben beschrieben, können in geeigneten Testkits durchgeführt werden, umfassend, in einem Behälter, ein cyclisches Peptide der vorliegenden Erfindung oder Antikörper gegen den AIDS-Virus, die durch ein cyclisches Peptid oder ein Gemisch von cyclischen und linearen Peptiden der vorliegenden Erfindung hervorgerufen wurden.
Panel der untersuchten Seren
Das Panel der Seren, die mit den Produkten der vorliegenden Erfindung wurden, wurde von einer breiten Vielzahl von Individuen erhalten und beinhaltet 845 Proben, die als seronegativ bekannt waren und 1378 Proben, die als seropositiv für HIV-1 bestätigt waren und 5 Proben, die als seropositiv für HIV-2 bestätigt waren.
Die Tabelle 2 zeigt eine Beschreibung der Personen, von denen die Serumproben genommen wurden sowie ihren HIV-serologischen Status.
Tabelle 2
Ergebnisse
Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptide und ihre Gemische mit einem oder oder mehreren linearen Peptiden wurden gemäß dem vorher beschriebenen ELISA-Test gegen eine Vielzahl von Seren, von denen einige positiv und andere negativ bestätigt waren, untersucht.
Tabelle 3 zeigt Ergebnisse von einzelnen Peptiden, die individuell zur Identifizierung von bekannten HIV-1-positiven Seren beurteilt wurden.
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse von einzelnen Peptiden, die individuell zur Identifizierung von bekannten HIV-2-positiven Seren beurteilt wurden.
Tabelle 5 ist gezeigt, um die Sensitivität von cyclischen gegenüber nichtcyclischen Peptiden in dem ELISA-Test durch Vergleich der Ergebnisse von einigen Seren bei verschiedenen Verdünnungen zu veranschaulichen. Es wird bemerkt werden, daß in jedem Paar das cyclische Analogon aktiver ist als sein lineares Gegenstück. Diese Daten zeigen deutlich die Wichtigkeit einer cyclischen Struktur von bestimmten Peptiden bei der Reaktion mit dem Antikörper.
Es wurde kürzlich gefunden, daß unter einigen zur Beschichtung eingesetzten Bedingungen (Carbonatpuffer, pH 9,6) lineare Peptide, die zwei Cysteine in ihrer Sequenz besitzen, interne Cyclisierung und Polymerisierung eingehen können. Auch wenn die in Tabelle 5 vorgestellten Ergebnisse deutlich die Überlegenheit von cyclischen Peptiden gegenüber ihrem linearen Gegenstück bei der Detektion von HIV-1-Antikörpern zeigen, könnte die erhöhte Sensitivität aufgrund von wahrscheinlicher Cyclisierung und Polymerisierung der linearen Peptide nach Solubilisierung in einem Carbonatpuffer (pH 9,6) unterschätzt worden sein. Das Experiment wurde mit den linearen 87- und cyclischen 87c-Peptiden wiederholt, die in einem Carbonatpuffer (pH 9,6) wie zuvor und auch in 10 Essigsäure (pH 2,7) gelöst wurden. HPLC-Analyse der Peptide bestätigte, daß in dem Carbonatpuffer das verwendete lineare Peptid 87 Cyclisierung und Polymerisierung einging, wenn es in Lösung bei Raumtemperatur gehalten wurde. Es wurde vermutet, daß Cyclisierung und Polymerisierung auch an den Vertiefungen der Mikrotiterplatten auftraten, auch wenn das genaue Verhältnis von an die Platten gebundenem cyclischen Peptid zu linearem noch nicht bestimmt wurde.
Entgegen dem, was im Carbonatpuffer beobachtet wurde, blieb das lineare Peptid 87 gelöst in 10%iger Essigsäure linear, wie durch HPLC und durch Ellman's Test angezeigt.
Das in 10% Essigsäure gelöste cyclische Peptid 87c blieb cyclisch (aus HPCL-Analyse und negativen Ellman's Test).
Die in diesem Experiment verwendeten Platten waren mit 10 μg/ml mit Lösungen von Peptiden beschichtet. (Experimentelle Ergebnisse der Tabelle 5 wurden mit Platten erhalten, die mit Peptiden mit 0,5 μg/ml beschichtet waren). Vier verschiedene HIV-1-positive Serumproben wurden der Reihe nach verdünnt und ihre Titer bestimmt. Der Titer wurde definiert als die Serumverdünnung, die eine Absorbanzablesung von 1,0 bei den Bedingungen des bereits beschriebenen ELISA-Verfahrens ergab.
Wie bereits in Tabelle 5 gezeigt, ist es auch aus Tabelle 6 klar, daß das cyclische Peptid 87c die für HIV-1 spezifischen Antikörper mit einer höheren Sensitivität als sein lineares Gegenstück, Peptid 87, detektieren kann. Die Verhältnisse der mit dem cyclischen Peptid gemessenen Sensitivitäten gegen die des linearen Peptids variieren zwischen 1,3 und 2,2 mit einem Mittel von 1,8. Diese Verhältnisse sind sogar größer, variierend von 3,0 bis 4,5, wenn die Sensitivität des ELISA-Test unter Verwendung des cyclischen 87c-Peptids verglichen wird unter Verwendung von Bedingungen (saurer pH), bei denen das lineare 87-Peptid linear bleibt und nicht cyclisieren oder polymerisieren kann.
Ähnliche Experimente, die die Sensitivität von Platten, die mit dem gut definierten cyclischen Peptid 87c beschichtet sind, mit anderen die mit einem Pool von chromatographischen Fraktionen, die nur verschiedene Polymere von Peptid 87 enthalten, vergleichen, zeigen auch die Überlegenheit des cyclischen Peptids 87c bei der Detektion von HIV-1-Antikörpern mit maximaler Sensitivität. Im Verlauf dieser Experimente wurde auch unerwarteterweise gefunden, daß die Untergrundwerte wesentlich höher auf Platten sind, die mit dem linearen Peptid 87 (0,144 ± 0,010 gegen 0,006 ± 0,002) beschichtet sind und das veranschaulicht einen weiteren Vorteil der Verwendung des vollständig oxidierten cyclischen Peptids 87c in AIDS-Tests.
In Tabelle 7 werden Gemische von cyclischen und linearen Peptiden bei der Identifizierung von bekannten HIV-1- oder HIV-2-positiven Seren beurteilt und Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der gleichen Gemische gegen HIV-1- oder HIV-2-negative Seren.

Die in Tabelle 7 und 8 verwendeten Gemische sind wie folgt.

Gemisch Nr.	Peptide im Gemisch
1	lineare Peptide 41, 42, 56 und 71
2	lineare Peptide 23, 29, 42, 56 und 71
3	cyclisches Peptid 80 und lineare Peptide 61, 71 und 87
4	cyclisches Peptid 80 und lineare Peptide 71 und 87
5	cyclische Peptide 80 und 87c und lineares Peptid 71
6	cyclische Peptide 200, 201, 202 und lineare Peptide 203 und 204
7	cyclische Peptide 80, 87c, 202 und lineare Peptide 71, 203 und 204.

In diesen Gemischen haben die Peptide 23, 29, 203 und 204 die folgende Sequenz. AcNH-YGCSGKLIC-CONH₂ (23) NH₂-CGVKNWMTETLL-COOH (29) NH₂-LVEITIGFAPTKEKRYSSAHGR-COOH (203) NH₂-LVEITPIGFAPTKEKR-COOH (204)
Tabelle 9 zeigt einen Vergleich eines Tests zwischen Gemisch 4 der vorliegenden Erfindung und dem Western-Blot-Test bei der Untersuchung von 167 HIV-1-positiven Seren und 51 HIV-1- und HIV-2-negativen Seren. Die Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Gemisch 3 in dem ELISA-Test eine höhere Sensitivität und Spezifität als der Western-Blot-Test ergab.
Tabelle 10 zeigt einen immunofluoreszierenden Assay bei der Untersuchung von 822 HIV-1-positiven Seren und 114 HIV-1- und HIV-2-negativen Seren. Die Ergebnisse zeigen, daß das Gemisch 4 in dem ELISA-Test eine höhere Sensitivität und Spezifität als der immunofluoreszierende Assay ergab.
Tabelle 3 Wirksamkeit von Peptiden bei der Identifizierung von HIV-1-positiven Seren
Aminosäuresequenz der Peptide von Tabelle 3
Tabelle 4 Wirksamkeit von Peptiden bei der Identifizierung von HIV-2-positiven Seren
Tabelle 5 Relative Leistung von cyclischen und nichtcyclischen Peptiden in ELISA (optische Dichte-Einheiten)
Tabelle 6 Vergleich von Serumtitern von Seren, die auf Platten gemessen wurden, die mit einem cyclischen gegenüber seinem linearen Gegenstück beschichtet waren
Tabelle 7 Leistung von Peptidgemischen bei der Identifizierung von HIV-1- oder HIV-2-positiven Seren
Tabelle 8 Leistung von Peptidgemischen bei der Identifizierung von HIV-1- oder HIV-2-negativen Seren
Tabelle 9
Tabelle 10
Die Ergebnisse zeigen deutlich die Überlegenheit von bestimmten Peptidgemischen, insbesondere der bevorzugten Nr. 5, bei der korrekten Identifizierung von bekannten HIV-1-positiven Seren und von Gemisch 6 bei der korrekten Identifizierung von bekannten HIV-2-positiven Seren und schließlich Gemisch 7 bei der korrekten Identifizierung von sowohl HIV-1 als auch HIV-2-positiven Serumproben. Die Verwendung eines Gemisches anstelle eines einzelnen Peptids minimiert die Chancen, die Identifizierung eines atypischen Serums mit Niedrigtiter zu verpassen, in dem Antikörper gegen eine sehr begrenzte Anzahl von Epitopen gerichtet sein können. Alle seropositiven Proben wurden durch ELISA getestet und durch Western-Blot- oder immunofluoreszierenden Assay bestätigt. Im Fall eines Unterschieds wurde die Probe durch einen Radioimmunofällungsassay untersucht, der als endgültiger Referenzstandard genommen wurde.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das allgemeine Verfahren für die Synthese und Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide.
Beispiel 1
Herstellung von Harzen, die den Nα-Fmoc geschützten Aminosäurerest enthalten
Der gewünschte Nα-Fmoc geschützte Aminosäurerest wurde in einem Gemisch aus Methylenchlorid (CH₂Cl₂) und Dimethylformamid (DMF) (4 : 1) zu einer Suspension des p-Benzyloxyalkoholharzes in CH₂Cl₂ : DMS (4 : 1) bei 0°C zugegeben. Das Gemisch wurde manuell für ein paar Sekunden gerührt und dann mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) behandelt, gefolgt von einer katalytischen Menge von 4-(Dimethylamino)pyridin. Das Gemisch wurde bei 0°C für weitere 30 Minuten gerührt und dann bei Raumtemperatur über Nacht. Das gefilterte Harz wurde nacheinander mit CH₂Cl₂, DMF und Isopropanol (jeweils 3 Waschungen) und schließlich mit CH₂Cl₂ gewaschen. Das Harz wurde in CH₂Cl₂ suspendiert, in einem Eisbad abgekühlt, und zu der gerührten Suspension wurde rückdestilliertes Pyridin, gefolgt von Benzoylchlorid zugegeben. Das Rühren wurde bei 0°C für 30 Minuten fortgesetzt und dann bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Nach der Filtration wurde das Harz nacheinander mit CH₂Cl₂, DMF und Isopropanol (jeweils 3 Waschungen) und schließlich mit Petrolether (2×) gewaschen, bevor es unter Hochvakuum auf ein konstantes Gewicht getrocknet wurde. Spektrophotometrische Bestimmung der Substitution gemäß Meienhofer et al. (Int. J. Peptide Protein Res, 13, 35, 1979) zeigte den Substitutionsgrad auf dem Harz an.
Beispiel 2
Koppeln der nachfolgenden Aminosäuren
Das den Nα-Fmoc geschützten ersten Aminosäurerest enthaltende Harz wurde in ein Reaktionsgefäß eines Labortec SP 640 Peptidsynthesizers gegeben und wie folgt behandelt:

1) gewaschen mit DMF (zwei mal für jeweils 1 Minute)
2) vorgewaschen mit einer 20%igen Lösung von Piperidin in DMF (3 Minuten)
3) die Schutzgruppen wurden mit einer 20%igen Lösung von Piperidin in DMF (10 Minuten) entfernt
4) gewaschen mit DMF (vier mal für jeweils 30 Sekunden)
5) gewaschen mit Isopropanol (zwei mal für jeweils 30 Sekunden)
6) gewaschen mit DMF (zwei mal für jeweils 45 Sekunden)
7) überprüft auf freie Aminogruppen-Kaisertest (muß posistiv sein)
8) das Peptidharz wird dann vorsichtig für 2 Minuten geschüttelt mit 3 molaren Äquivalenten der gewünschten F-moc-geschützten Aminosäure und 3,6 molaren Äquivalenten 1-Hydroxybenzotriazol, die alle in trockenem redestilliertem DMF gelöst sind
9) festes DCC (3,3 molare Äquivalente) wird dann zu dem Reaktionsgefäß zugegeben
10) Schütteln des Reaktionsgemisches für 2 Stunden
11) gewaschen mit DMF (zwei mal für jeweils 45 Sekunden)
12) gewaschen mit Isopropanol (zwei mal für jeweils 45 Sekunden)

Nach Schritt 12 wird ein Teil für einen Ninhydrintest entnommen. Wenn der Test negativ ist, geht man zurück zu Schritt 1 zur Kopplung der nächsten Aminosäure. Wenn der Test positiv oder leicht positiv ist, werden die Schritte 6 bis 12 wiederholt.
Das obige Schema wurde zur Kopplung von jeder der Aminosäuren der in der Erfindung beschriebenen Peptide verwendet. N-α-Protektion mit Fmoc wird mit jeder der verbleibenden Aminosäuren für die Synthese verwendet.
Radiomarkierte Peptide werden durch die Inkorporation von ³H-Glycin unter Verwendung des obigen Kopplungsprotokolls erhalten.
Nach der Zugabe der letzten Aminosäure wird das Nα-Fmoc des N-terminalen Rests durch Zurückgehen zu den Schritten 1 bis 7 des obigen Schemas entfernt. Das Peptidharz wird mit CH₂Cl₂ gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um das rohe, geschützte Peptid zu ergeben.
Beispiel 3
Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung der Peptide von dem Harz
Das geschützte Peptid-Harz wird in einer 55%igen Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) in CH₂Cl₂, enthaltend 2,5% Ethandithiol und 2,5% Anisol, suspendiert. Die Mischung wird mit N₂ gespült und für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird filtriert und das Harz mit CH₂Cl₂ gewaschen. Das Harz wird erneut mit 20% TFA in CH₂Cl₂ für 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wird gefiltert und das Harz mit 20% TFA in CH₂Cl₂ gewaschen und dann mit CH₂Cl₂ gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter Vakuum unterhalb von 35°C eingedampft und der Rückstand mehrmals mit trockenem Diethylether verrieben. Der Feststoff wird in 10% wäßriger Essigsäure aufgelöst und lyophilisiert, um das rohe Produkt zu ergeben.
Die Arg- und Cys-Reste enthaltenden Peptide werden weiter von den Schutzgruppen befreit durch HF-Behandlung bei 0°C für eine Stunde in der Anwesenheit von Anisol und Dimethylsulfid. Die Peptide werden mit 10%iger wäßriger Essigsäure extrahiert, mit Diethylether gewaschen und lyophilisiert, um die rohen Peptide zu ergeben.
Beispiel 4
Reinigung der Peptide
Die rohen Peptide wurden durch präparative HPLC auf einer Vydac-Säule (2,5 × 25 mm) mit C₁₈ oder C₄ reverser Phase mit einem Gradienten der mobilen Phase gereinigt. Der Ausfluß wird bei 220 nm beobachtet und anschließend durch analytische HPLC.
Relevante Fraktionen werden gesammelt, evaporiert und lyophilisiert. Die Identität der synthetischen Peptide wird durch analytische Chromatographie mit reverser Phase und durch Aminosäureanalyse bestätigt.
Beispiel 5
Cyclisierung der Peptide
Eine Lösung von Kaliumcyanoferrit (0,1 M, pH 7,0) wird langsam zu einer verdünnten wäßrigen Lösung (0,5 mM) des linearen Peptids bei pH 7,0 zugegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird der pH auf 5,0 verringert und die Lösung mit einem Ionenaustauschharz (Bio-Rad Ag-3-X4a, Cl-form) für 30 Minuten behandelt. Die Suspension wird filtriert und das Filtrat lyophilisiert, um das rohe, cyclische Peptid zu ergeben. Das Peptid wird durch präparative HPLC mit reverser Phase gereinigt und durch Aminosäureanalyse charakterisiert. Nachweis einer cyclischen Struktur wird durch Vergleich der HPLC-Mobilität des cyclischen Peptids mit dem linearen Ausgangspeptid erhalten durch Reduzieren eines Teil des cyclischen Peptids zurück zum linearen Peptid und auch durch Beobachten des Verschwindens von freien Sulfhydrylgruppen (Ellman's Test) nach der Cyclisierung.
Um den physiochemischen Unterschied zwischen cyclischen Peptiden und ihren entsprechenden linearen Peptiden zu veranschaulichen, kann auf Tabelle 11 hingewiesen werden, welche die Unterschiede in der Retentionszeit in der HPLC zeigen Tabelle 11

Peptid Nr. Retentionszeit in Minuten

77(l) 36,6

80(c) 39,1

87(l) 49,3

87c(c) 46,1

81(l) 49,2

88(c) 48,7

95(l) 48,3

96(c) 48,5

(l): linear
(c): cyclisch

Beispiel 6
Konjugation der Peptide an Rinderserumalbumin oder Keyhole Limpet Hemocyanin
Die Peptide werden an BSA oder KLH, die zuvor mit Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (Sulfo-SMPB) derivatisiert wurden, konjugiert.
Eine wäßrige Lösung von Sulfo-SMPB (Pierce Chemicals) wird zu einer Lösung von BSA oder KLH in 0,02 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 45 Minuten geschüttelt und der aktivierte Träger sofort auf eine Sephadex G-25 Säule aufgebracht, die mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0 bei 4°C äquilibriert wurde.
Die Fraktionen des ersten Peaks einer Absorption (280 nm), die dem aktivierten Trägermaterial entsprechen, werden in einem Rundkolben vereinigt, wozu eine Lösung von Peptid in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,2 zugegeben wird. Das Gemisch wird gründlich mit NH₂ gespült und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kopplungseffizienz wird beobachtet unter Verwendung von ³H-markiertem Peptid und durch Aminosäureanalyse des Konjugats.
Beispiel 7
Detektion von Antikörpern gegen HIV durch einen Enzym Immunosorbent Assay (ELISA)
Jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wird mit 100 μl einer Lösung gesättigt, die ein Peptid oder ein Peptidgemisch (5 μg/ml) enthält und über Nacht stehengelassen. Die Vertiefungen werden geleert und zwei mal mit einem Waschpuffer (Tris, 0,043 M; NaCl, 0,5 M; Thimerosal, 0,01% w/v (Gewicht/Volumen); Tween 20, 0,05% v/v; pH 7,4) gewaschen. Die Vertiefungen werden dann mit 0,35 ml Waschpuffer für 1 Stunden bei 37°C gesättigt und einmal mit dem gleichen Puffer gewaschen. Zu analysierende Serumproben werden mit Probenpuffer (Waschpuffer plus Casein 0,05% w/v) verdünnt. Die Vertiefungen werden mit Waschpuffer vor der Zugabe der verdünnten Serumprobe (0,1 ml) gespült. Diese werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur zum Inkubieren stehengelassen. Die Vertiefungen werden dann geleert, zweimal schnell gewaschen und dann einmal für 2 Minuten mit Waschpuffer. Die Konjugatlösung (affinitätsgereinigter Ziegenantikörper gegen Human-IgG, peroxidasemarkiert, 0,5 mg in 5 ml 50%igem Glycerin) verdünnt mit 1% w/v Rinderserumalbumin in Waschpuffer wird zu jeder Vertiefung (0,1 ml) zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden dann geleert und 2 mal schnell mit Waschpuffer gewaschen und dann 5 mal, wobei der Puffer mit der Vertiefung 2 Minuten pro Waschen in Kontakt war. Die Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 8 mg pro ml DMSO) wird mit 100 Volumenteilen 0,1 M Citrat-Acetatpuffer, pH 5,6 enthaltend 0,1% v/v 30%iges H₂O₂ verdünnt und zu jeder Vertiefung (0,1 ml pro Vertiefung) zugegeben. Nach 10 Minuten wird der Inhalt jeder Vertiefung mit 0, 1 ml 2 N H₂SO₄ behandelt und die optische Dichte bei 450 nm abgelesen. Alle Bestimmungen wurden 2× durchgeführt.

Claims

Ein, im wesentlichen reines, Peptid der Formel
worin x unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RILAVERYLKDQQLLGIWG und korrespondierenden N-terminalen Peptiden, die aus homologen Regionen von anderen HIV-1 Isolaten abgeleitet sind, und Peptiden, die von den obigen als Folge konservativer Aminosäuresubstitutionen abweichen; y, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -TTAVPWNAS und korrespondierenden C-terminalen Peptiden, die aus homologen Regionen von anderen HIV-1 Isolaten abgeleitet sind, und Peptiden, die von den obigen als Ergebnis konservativer Aminosäuresubstitutionen abweichen; a einen Amino-Terminus darstellt oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Cysteinrest, einem Tyrosin, einer Glutaminsäure, einer Asparaginsäure und einem Lysin, was das Peptid nützlicher als ein immunodiagnostisches Reagenz ohne Veränderung seiner antigenen Eigenschaften macht; b einen Carboxy-Terminus darstellt oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Cysteinrest, einem Tyrosin, einer Glutaminsäure, einer Asparaginsäure und einem Lysin, was das Peptid nützlicher als ein immunodiagnostisches Reagenz ohne Veränderung seiner antigenen Eigenschaften macht; und Peptide, die von den obigen als Ergebnis einer Modifizierung durch terminate NH₂-Acylierung, Thioglycolsäure-Amidierung, terminale COOH-Amidierung abweichen oder in denen Methionin durch Norleucin ersetzt wurde, was kovalentes Koppeln des Peptids an feste Träger erleichtert und/oder das Peptid nützlicher als ein immunodiagnostisches Reagenz ohne Veränderung seiner antigenen Eigenschaften macht.
Peptid nach Anspruch 1, worin a-x NH₂-RILAVERYLKDQQLLGIWG- darstellt und y-b -TTAVPWNAS-COOH darstellt.
Ein, im wesentlichen reines, Peptid der Formel:
worin x¹, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: RVTAIEKYLQDQARLNSWG und korrespondierenden N-terminalen Peptiden, die aus homologen Regionen von anderen HIV-2 Isolaten abgeleitet sind, und Peptiden, die von den obigen als Ergebnis konservativer Aminosäuresubstitutionen abweichen; y¹, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -HTTVPWVNDS und korrespondierenden C-terminalen Peptiden, die aus homologen Regionen von anderen HIV-2 Isolaten abgeleitet sind, und Peptiden, die von den obigen als Ergebnis konservativer Aminosäuresubstitutionen abweichen; a einen Amino-Terminus darstellt oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Cysteinrest, einem Tyrosin, einer Glutaminsäure, einer Asparaginsäure und einem Lysin, was das Peptid nützlicher als ein immunodiagnostisches Reagenz ohne Veränderung seiner antigenen Eigenschaften macht; b einen Carboxy-Terminus darstellt oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Cysteinrest, einem Tyrosin, einer Glutaminsäure, einer Asparaginsäure und einem Lysin, was das Peptid nützlicher als ein immunodiagnostisches Reagenz ohne Veränderung seiner antigenen Eigenschaften macht; und Peptide, die von den obigen als Ergebnis einer Modifizierung durch terminale NH₂-Acylierung, Thioglycolsäure-Amidierung, terminale COOH-Amidierung abweichen oder in denen Methionin durch Norleucin ersetzt wurde, was kovalentes Koppeln des Peptids an feste Träger erleichtert und/oder das Peptid nützlicher als ein immunodiagnostisches Reagenz ohne Veränderung seiner antigenen Eigenschaften macht.
Peptid nach Anspruch 3, worin a-x¹ NH2-RVTAIEKYLQDQARLNSWG- darstelht und y¹-b -HTTVPWVNDS-COOH darstellt.
Immunoreaktives Gemisch, welches mindestens ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt, in Beimischung mit: – einem Peptid aus gp120, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 497 bis 518 gp120 HIV-1 erstreckt, oder – einem Peptid aus gp120, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 497 bis 518 gp120 HIV-1 erstreckt und einem Peptid aus p24, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 241 bis 263 p24 HIV-1 erstreckt, oder – einem Peptid aus gp120, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 497 bis 518 gp120 HIV-1 erstreckt und einem Peptid aus gp41 HIV-1, das sich von 586 bis 620 erstreckt.
Immunoreaktives Gemisch, welches mindestens ein Peptid nach Anspruch 3 oder 4 umfaßt, in Beimischung mit: – einem Peptid aus EGP (HIV-2), gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 486 bis 501 erstreckt, oder – einem Peptid aus EGP (HIV-2), gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die sich von 486 bis 508 erstreckt.
Verfahren zur Detektion von Antikörpern gegen HIV-1 und/oder HIV-2, welches die Verwendung eines Peptids oder Peptidgemisches nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Immunoassay-Verfahren ein ELISA-, ein Hämagglutinations-, ein Einpunkt- oder ein Mehrpunkt-Streifen-Assay-Verfahren ist.
Test Kit zur Detektion von Antikörpern gegen HIV-1 und/oder HIV-2 und zur Diagnose von AIDS, ARC und prä-AIDS Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß das immunochemische Reagenz ein Peptid oder Peptidgemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.
Immunogen zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen HIV-1 und/oder HIV-2 in Säugetieren unter Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Peptid an einen beliebigen geeigneten Träger gekoppelt ist.
Verfahren zur Detektion des HIV-1 und/oder des HIV-2 unter Verwendung der Antikörper, die von dem Immunogen nach Anspruch 10 stammen und Detektion der Anwesenheit des Virus.