JPH01224397A - Ｈｉｖ抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＨＩＶ抗体を検出するための新規の環状合成
ペプチド及び線状の合成ペプチドとその組合せに関する
。

〔発明の背景〕

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）　、ＡＩＤＳ関連複
合体（ＡＲＣ）及び前−ＡＩＤＳは、レトロウィルス、
すなわちヒト免疫欠損ウィルスタイプ１　（ＨＩＶ−１
；また）ＩＴＬＶ−１、ＬＡＶ−１及び八ＲＶとしても
知られている）により引き起こされると思われて来た。

最近、ＨＩＶ−２（正式には冒シー２）と呼ばれるもう
１種の病原性ヒトレトロウィルスが、ＡＩＤＳを有する
西アフリカの患者から単離された（ＭｏｎＬａｇｎｉｅ
ｒＡ煮０、国際公表番号何０８７１０４４５９として１
９８７年、７月３０日に公表されたＰＣＴ／ＦＲＢ？１
０００２５）。）ＨＩＶ゛−２は、）ｌＩ％Ｌ−１及び
５１ｍ１ａｎ免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）と多くの配列
を共有することが最近示された（Ｇｕｙａｄｅｒ７７Ｊ
、　、Ｎａｔｕｒｅ、　３２６　：　６６２”６６９゜
１９８７）　　。

たとえ他の番号システムが本発明に関する従来技術に使
用されても、本発明に使用されるアミノ酸のための番号
システムは、ＨＩＶ−１タンパク質のためには、Ｒａｔ
ｎｅｒ星＆、　、Ｎａｔｕｒｅ、　３１３　：　２７７
〜２８４、１９８５のシステム及びＨＩＶ−２９７バク
質のためには、Ｇｕｙａｄｅｒ星＆、　、Ｎａｔｕｒｅ
、　３２６　：　６６２〜６６９（１９８７）のシステ
ムである。ペプチドにおける本発明に使用されるアミノ
酸は、次のような単一の文字コードにより与えられる：
　　ａｌａ＝Ａ、　ａｒｇ−Ｒ，ａｓｎ−Ｎ、　ａｓｐ
＝Ｄ、　ｃｙｓ＝Ｃ，ｇｌｎ＝Ｑ、　ｇｌｕ＝Ｅ。

ｇｌｙ＝Ｇ＋　　ｈｉｓ＝ｌ１、　　１ｌｅ＝Ｉ、　　
Ｉｅｕ＝Ｌ、　　Ｉｙｓ＝に＋　　ｍｅむ＝Ｍ、　ｐｈ
ｅ＝Ｆ、　ｐｒｏ＝Ｐ＋　５ｅｒ＝Ｓ、　ｔｈｒ＝Ｔ、
　ｔｒｐ＝Ｗ。

ｔｙｒ＝Ｙ及びｖａｌ＝ν。

ＨＩＶ−１により感染された患者の血清中の抗体の検出
のための初期免疫診断試験は、抗原とじて完全なウィル
スを使用した。第２世代試験は、組換えＤＮＡ方法によ
り得られたポリペプチド配列を使用した。Ｃａｂｒａｄ
　ｉ　Ｉ　Ｉａ　ｆｔ　ｅ　、、Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏ　　＋３　：　　１２！３〜１３３（１９８５）
及びＣｈａｎｇ星＆、　、影旦Ｚｋ的並ハ■、３：’９
０５〜９０９（１９８５）は、それぞれ８２個及び１０
２個のアミノ酸残基の細菌により合成されたウィルスタ
ンパク質を得ることに成功した。Ｅ、Ｐ、８６２０２３
１４号及び８６１１４２４３号は、単独で又は混合して
免疫反応性であるｇｐ４１及びｇｐ１２０の領域を包含
する組換えポリペプチドを記載する。

ＳｈｏｅｍａｎＩ裏：、？、　　、　　八ｎａｌ　、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　　　↓６１　　：　　３７０〜３７９
（１９８７）はまた、ＨＩＶ−１により感染された患者
からの血清中に存在する抗体との免疫反応特性を有する
、ｇｐ４１からのいくつかのポリペプチドを記載する。

上記アッセイ方法は許容されない。それらの怒度の欠乏
は、それが検出から漏れ、そして血液生成物受容体を感
染せしめるウィルスを含む血液を可能にする場合、重大
である。これらの抗原調製物中に存在する不純物は、健
康な個人を苦悩にする、許容できない高レベルの誤った
陽性結果の原因である。

次に、従来技術においては、より短いエピトープの同定
が行なわれたことが明らかになった。こ、れは、それら
が容易且つ低費用で調製され得るためであり、そしてよ
り重要なことには、ＡＩＤＳに関係しないウィルスタン
パク質との共有エピトープの存在による誤った陽性の試
験結果の危険性を減じるためである。これに関しては、
Ｇａ１ｌａｈｅｒ。

如旦、堕：３２７〜３２８．１９８７は、旧シー１のｇ
ｐ４１の領域が、呼吸シンシチウムウィルスとの５個の
隣接するアミノ酸残基の配列及びはしかウィルスＦｉ＃
Ｈタンパク質の４個の等しく分配されたアミノ酸の配列
を共有することを見出した。従って、この領域又は発見
されるべきいづれが他の共通領域を含むさらに高く精製
された組換えポリペプチドが、誤った陽性結果を潜在的
に担当するであろう。

卓越した特異性とは別に、ＨＩ　Ｖウィルスのユニーク
且つ高く保存されたエピトープに対応するより短いペプ
チド配列の同定が、化学合成にょるその産生をより容易
且つより安価にする。実験的な方法が記載されて来た。

これらの方法は、活性タンパク質の表面上に暴露される
予定である短いアミノ酸配列の選択に関与することがで
きる（ｌ（ｏρｐａｎｄ　ｌ１ｏｏｄｓ、　　Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏ１、ＭｅＬ、　　８８：　１〜１８＋　１９８
６を参照のこと）。いく分有用であるけれども、これら
の方法はほとんど表示的でない。それにもかかわらず、
それらは、ＡＩＤＳの原因であるウィルスのタンパク買
上に存在するエピトープの同定のために多く適用されて
来た。たとえば、アメリカ特許筒４，６２９，７８３号
、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６１００８３１及び
Ｅ、Ｐ、出願第８６３０３２２４号は、＾ＩＤＳの診断
キットニ有用である。ＨＩＶ−１のｐ１８．Ｐ２５゜ｇ
ｐ４１及びｇｐ１２０タンパク質からの種々の合成ペプ
チドを開示する。

しかしながら、より小さな抗原に対するこの傾向は、合
成されたエピトープが、抗体により認識される厳密な立
体配座を推定することができない危険性を伴う。これら
の場合のそれぞれにおいて試験される血清サンプルの数
はひじょうに制限されるけれども、小さな合成ペプチド
による特異性は、ひじょうに高いことが見出され（９５
％〜１００％）なか、しかし、全体の感度は８０〜１０
０％の間であった。１００％の感度が達成される例のみ
においては、単に１０種のサンプルが試験された。

Ｓｍ１ｔｈ次炙、　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
１、　　２５：　１４９８〜１５０４．１９８７は、高
い免疫反応性である２種のオーバラップペプチド、Ｅ３
２及びＥ３４を記載する。

２４０種の血清陰性検体から誤った陽性結果は得られな
かったが、しかしその試験は３２２種のうち３種の血清
陽性サンプルを見落とした（９９．１％の感度）　　、
　　ＷａｎｇスＣｅ　、　　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　　８３　　：６１５９〜６１６
３．１９８６は、１つの２１−マーペプチドが１００％
の特異性及び９８％の感度を示す（ＡＩＤＳの患者から
取られた２２８種の血清陽性サンプルのうち、２２４種
がこのペプチドに対して陽性であることが見出された）
一連のオーバーラツプペプチド（たとえばＳｍ１ｔｈｅ
＆、によって発見されたＥ３２及びＥ３４ペプチドのア
ミノ酸１ｉ５基）を記載する。

１９８７年１１月１３日に出願されたアメリカ特許出願
筒１２０，０２７号においては、ＡＩＤＳウィルスによ
り感染された患者の抗体と免疫反応する、ｇｐ４１（Ｈ
ＩＶ−１）の残基６０６〜６２０（ＳＧＫＬＩＣＴＴＡ
ＶＰＷＮＡ、Ｓ）を包含する短い合成ペプチドが開示さ
れる。この例においては、特異性がまた卓越している（
６３／６３）が、しかし５７種の確かな陽性のうち６種
の血清陽性検体が検出され得なかった（８９％の感度）
。

Ｇｎａｎｎ７Ｗ＋？、　、Ｊ、Ｖｉｒｏ１、旦：　２６
３９〜２６４１．１９８７及びＪ、Ｔｎｆｅｃ、Ｄｉｓ
、　　１５６　：　２６１〜２６７、１９８７はまた、
ｇｐ４１（ＨＩＶ−１）の免疫優性領域から一連のオー
バーラツプペプチドを報告する。配列５ＧＫＬＩＣ（６
０６〜６１１）を有する１つペプチドが試験される２２
　）＋１Ｖ−１陽性血清のいづれとも免疫反応しなかっ
たそれらの発見が特に興味あるものであった。Ｎ−末端
へのシスティン残基の付加はある免疫反応性を回復した
。すなわち４４種の血清のうち２１種が７−マーのペプ
チドと反応した（４８％の感度）。

Ｇｎａｎｎ　ｆＡ　煮、　は、ｃｙｓ−６０５がｇｐ４
１−　（ＨＩＶ−１）タンパク質のセグメントの免疫反
応性のために不可欠であることの結論を下した。

Ｇｎａｎｎなどはまた、ｇｐ４１　（ｔｌｌＶ−１）の
位置６０５及び６１１（Ｒａｔｎｅｒの番号システム）
でのシスティン残基が、ジスルフィド結合を通してのル
ープの形成によりたぶんタンパク質のこの領域の抗原立
体配座に臨界的な役割をはだすことができることを推定
した。しかしながら、ジスルフィド結合の形成を同定し
、そして証明するための著者による試みは失敗した。Ｇ
ｎａｎｎＺｅ、は、それらが一部のアミノ酸配列６０５
〜６１１（ここで２個の末端のシスティン基はジスルフ
ィド結合により結合されている）を含む合成ペプチドを
有することを決して示さなかったので、そのようなジス
ルフィド結合を有するペプチドの性質は不明であり且つ
推定できない。

位置６０５〜６１１で２個のシスティン残基を含む７−
アミノ酸の一部の配列は、国際公開番号−０８６１０６
４１４として１９８６年１１月６日に発表されたＰＣＴ
／ｕｓ８６１００８３１のような他の記録に開示されて
いて、ここで約ｂｐ７５１６〜７５９３の領域によりコ
ードされるペプチドＸ　（３９）及び約ｂｐ７５４３〜
ｂｐ７５９３の領域によりコードされるペプチド■（７
９）の両者は、上記刊行物においてＧｎａｎｎ　ｔｌ　
ｅ　、により論じられた７−アミノ酸配列（アミノ酸６
０５〜６１１）を含む。

、そのペプチドは線状ペプチドとして報告され、そして
その著者は、環状構造のいづれの形成をも言及していな
い。

国際公開番号ＷＯ３７１０６００５として１９８７年１
０月８日に発表されたＰＣＴ／ＵＳ８７１００５７７に
おいてＲｏｓｅｎ星煮、は、ＨＩＶ−１のエンベロープ
糖タンパク質（ｇｐ４１）のＣｙｓ（６０５）　　Ｃｙ
ｓ（６１１）を包含する一連の合成ペプチドが、中性又
は塩基性水性緩衝液中での溶解に基づいて一連の自発的
な酸化形質転換を受けることを報告している。その発明
者は、これらの条件下で、ＥＬＩＳＡに使用されるペプ
チドが線状モノマー、環状モノマー、線状又は環状ダイ
マー及び種々の長さの線状ポリマーのランダム混合物で
あることを推定している。しかしながら、その発明者は
、環状成分の存在を証明していす、そして存在する他の
種々のダイマー及びポリマーを特徴づけていす、そして
彼らは、そのポリマー形がＥＬＩＳＡ試験における反応
性のために最っとも重要な成分であることを推定してい
る。

Ｇｎａｎｎ　ｆｌ　煮、、５ｃｉｅｎｃｅ　　２３７　
：　１３４６〜１３４９．１９８７は、ｇｐ４１　（Ｈ
ＩＶ−１）上の１つに相同する領域に２つのシスティン
、たとえばＣｙｓ　（６０５）及びＣｙｓ（６１１）を
含むｇｐ４２　（ＨＴＶ　−２）　ｃ７）残基５９２〜
６０３を包含する短い線状合成ペプチドを報告する。こ
のペプチドは、ＨＩＶ−２により感染された患者から取
られた５種の血清のうち５種と反応した。

上記引用文献は、旧ソ−１抗体を同定することにおいて
有用であるペプチドを提供するけれども、それらはまた
、陽性の血清サンプルを完全（１００％）に検出できな
いようなある欠点をも示す。たとえば、Ｇｎａｎｎ久＆
、　、Ｊ、Ｖｉｒｏ１、　　旦：　２６３９〜２６４１
（１９８７）は、６００〜６１１のアミノ酸配列に関す
るそれらの試験において、２２種の陽性血清のうち２２
種すべてを検出し、そして彼らはまた、Ｃｅｎ　ｔｅｒ
ｓｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏ１、　Ａｔ１
ａｎｔａ、　Ｇａでの他の発明者に行なわれた、その同
じ１２−アミノ酸配列（６００〜６１１）に関する類似
する試験が７９種の陽性血清のうち７８種を検出したこ
とを述べている。

Ｊ、　ＩｎｆｅｃＬ、Ｄｉｓ、、　１５６　：　　２６
１〜２６７、１９８７においてソノ同じ著者は、ｇｐ４
１−（ＨＩＶ−１）からの同じ１２−アミノ酸配列が、
アメリカ合衆国からの１３２人のＨＩＶ−１感染患者の
うち１３１人と反応することを示した。

同じ文献において、ｏｒシー１陽性血清が５００倍以上
に希釈される場合、これらの希釈された血清のいくつか
が、低感度を示す陰性であることが見出された。

他の欠点は、被覆段階の間、システィンを含むペプチド
の多くの酸化形の形成に起因する十分に定義されていす
且つ推定できない混合物のＥＬＩＳＡにおける使用であ
る。

ひじょうに低レベルの抗体が存在する場合でさえ、ＨＩ
Ｖ−１及び／又はＨＩＶ−２抗体を含むすべてのサンプ
ルを正常な試験条件下で陽性として検出できる十分に定
義された構造の最終生成物のみをＥＬＩＳＡに使用する
ために、被覆段階の間、自発的な酸化に耐性であるペプ
チド又はペプチド混合物を提供することがひじょうに所
望されるように思われる。

〔発明の要約〕 本発明によれば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体を１０
０％検出することに特に適合され、そして血清がひじょ
うに希釈される場合でさえ、すべての旧ソ−１抗体を完
全に検出できる新規の一連のペプチド又はアミノ酸配列
が提供される。

より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、５８６〜６２
９のいづれかのアミノ酸配列（ｇｐ４１−　ＨＩＶ−１
）を含んで成り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配
列において、次の一部配列： を提供するためにジスルフィド結合により結合される、
６０５〜６１１のアミノ酸配列のそれぞれの末端でシス
ティン残基を含むアミノ酸配列が常に存在する。

さらにより詳しくは、本発明の新規の環状ペプチドは、
その中に下記一般式： ］ ％式％（１） 〔式中、Ｘはアミン末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸
６０４から始まり、そしてアミノ酸５８６まで戻るアミ
ノ酸配列（ｇｐ４１−　ＨＩＶ−１）を表わし；そして
ｙはカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸６
１２から始まり、そしてアミノ酸６２９まで延びるアミ
ノ酸配列（ｇｐ４１−１１１Ｖ−１）を表わす〕で表わ
されるアミノ酸配列６０５〜６１１（ｇｐ４１−旧ν−
１）を含んで成る。

より特定には、Ｘは５８６から６０４まで延びる次ノア
ミノ酸配列（ｇｐ４１−　ＨＩＶ−１）ノ１　ツを表わ
し：Ｇ ＷＧ Ｇｌ匈Ｇ ＧＩＷＧ ＬＧＩＷＧ ＱＬＬＧＩＷＧ ＱＱＬＬＧＩＷＧ ＤＱＱＬＬＧＩＷＧ にＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＬＫＤＱＱＬＩＧＩ誓Ｇ ＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧｒＷＧ ＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ νＥＲＹＬＫＤ（１（ＩＬＬＧＩ誓Ｇ ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＲＩＬＡＶＥＲ
ＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ　、そしてｙは力）Ｌｔボキ
シル基又は６１２から６２９まで延びる次の１又は複数
のアミノ酸配列（ｇｐ４１−　ＨＩＶ−１）を表わす二
Ｔ ＴＴ八 ＴＡＶ ＴＡＶＰ ＴＡＶＰＷ ＴＴＡＶＰＷＮ ＴＴＡＶＰＷＮＡ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱ ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱＧＴＴＡＶＰＷＮ
ＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱＧＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫ
ＳＬＥＱＩ。

下記の一般式（Ｉ）： 〔式中、Ｘ及びｙは前記に定義された通りである〕で表
わされる少なくとも１つのペプチド及び−４９７から５
１８まで延びるアミノ酸配列（ｇｐ１２０ＨＴＶ−１）
により特徴づけられるｇｐ１２０のペプチド、又は −４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列軸ｐ１２０
１＋１Ｖ−１）により特徴づけられるｇｐ１２０のペプ
チド及び２４１から２６３まで延びるアミノ酸配列（ｐ
２４ＨＩＶ−１）により特徴づけられるｐ２４のペプチ
ド、又は −４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列（ｇｐ１２
０ＨｒＶ−１）により特徴づけられるｇｐ１２０のペプ
チド及び５８６から６２０まで延びるｇｐ４１旧Ｖ−１
のペプチドの組合せ又は混合物もまた本発明の範囲内に
存在する。

本発明によれば、ＨＩＶ−２により感染された少数の患
者から取られた血清の１００％を同定することに有用で
ある一連の新規ペプチド又はアミノ酸配列もまた提供さ
れる。ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２の両者を検出す
るために本発明に記載されたペプチド又はペプチドの混
合物のいくらかを使用することが可能である。

より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、５７８〜６１
３のいづれかのアミノ酸配列（ｇｐ４２−　ＨＩＶ　−
２として言及されるであろう推定上のｇｐ４１．７）を
含んで成り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配列に
おいて、次の一部配列： を提供するためにジスルフィド結合により結合される、
５９７〜６０３（ｇｐ４２−　ＨＩＶ−２）（７）７−
、　／酸配列のそれぞれの末端でシスティン残基を含む
アミノ酸配列が常に存在する。

さらにより詳しくは、本発明の新規の環状ペプチドは、
その中に下記一般式（■）： 〔式中、ｘｌはアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ
酸５９６から始まり、そしてアミノ酸５７８まで戻るア
ミノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わし；そして
ｙｌ　はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ
酸６０４から始まり、そしてアミノ酸６１３まで延びる
アミノ酸配列（ｇｐ４２−　ｔｌｌＶ−２）を表わす〕
で表わされるアミノ酸配列（ｇｐ４２−　ＨＩＶ−２）
を含んで成る。

より特定には、Ｘｌは５７８から５９６まで延びる次の
アミノ酸配列（ｇｐ４２−　ＨＩＶ−２）の１つを表わ
し： Ｇ ＷＧ ＳＷＧ Ｎ５ＷＧ ＬＮＳＷＧ ＡＲＬＮＳＷＧ 口＾ＲＬＮＳＷＧ ＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＱＤＱＡＲＬＮＳ匈Ｇ ＬＱＤＱ＾ＲＬＮＳＷＧ ＹＬＱＤｇＡＲＬＮＳＷＧ ＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳ讐Ｇ ＩＥＫＹＬＱＤ口八ＲＬＮＳＷへ へＩＥＫＹＬＱＤＯＡＲＬＮＳＷＧ ＴへＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳ讐Ｇ ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＲＶＴＡＩＥＫ
ＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧそしてｙｌは６０４から６１
３に延びる次のアミノ酸配列（ｇｐ４２−　ｔｌｌＶ−
２）（７）　１　ツを表わす：Ｔ ＴＴ ＴＴＶ １ＴＴＶＰ ＋１ＴＴＶＰ賀 ＨＴＴＶＰＷＶ ＨＴＴＶＰＷＶＮ ）ＨＴＴＶＰＷＶＮ口 ＋１ＴＴＶＰＷＶＮＤｓ。

下記一般式（■）： 〔式中、Ｘｌ及びｙｌは前記に定義された通りである〕
で表わされる少なくとも１つの合成ペプチド及び外部エ
ンベロープ糖タンパク質（ＥＧＰ）の及び４８６から５
０８まで延びるアミノ酸配列により特徴づけられるペプ
チド２０３と呼ばれるペプチド、又はＥＧＰの及び４８
６から５０１まで延びるアミノ酸配列により特徴づけら
れるペプチド２０４と呼ばれるペプチドの組合せ又は混
合物もまた、本発明の範囲内にあ゛る。

さらに、前記定義されたｇｐ１２０及び／又はｐ２４及
び／又はＥＧＰアミノ酸配列配列又は複数の線状ペプチ
ドの不在又は存在−中で、式Ｉの少なくとも１つのペプ
チド及び式■の１つのペプチド（ここで、Ｘ　＋　３’
　＋　Ｘ　’及びｙｌは前記の通りである）を含んで成
る合成ペプチドの組合せを使用することも、本発明の範
囲内にある。

本発明の新規混合物の１つの意外な利点は、それらが、
１３７８人の旧Ｖ−１陽性の被検者及び５人の旧シー２
陽性の被検者から成る大パネルの血清に由来するＨ　Ｉ
　Ｖ抗体の完全な検出を提供することができることであ
る。もう１つの利点は、最少の誤った陽性をもたらす本
発明の混合物により保持される高レベルの特異性である
。

〔本発明の特定の記載〕

（合成のためのペプチドの選択） ペプチドが、ＩＩＩシー１単雌体の既知のアミノ酸配列
及び保存される領域の知識に基づく合成のために選択さ
れた。つい最近、ＨＩＶ−２（最近出願した新しいウィ
ルスである）は、ＨＩＶ−１とのイ゛ロ当の相同性を共
有することが示された。従って、＋１１Ｖ−１及び／又
は旧シー２の両者を検出するために本発明に記載される
ペプチド又はペプチドの混合物を使用することが可能で
ある。

既知のアミノ酸配列の他に、ポリペプチドの一部が表面
配向され、そして従って免疫原性であることを推定する
ことを助ける種々の生理化学的原理を用いることによっ
て、可能性あるエピトープが選択される。これらは、ｔ
ｌｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７８．３８２４〜３Ｅ！
２８．１９８１）の親水性プロット及びＫｙｔｅ　ａｎ
ｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

、１５７．１０５〜１３２．１９８２）による類イ以す
るアプローチを含む。また、タンパク質立体配座の実験
的な推定（Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｆａｓｍａｎ、　Ａｎｎ
、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　４７．２５１〜２７６
、１９７８）は、そのポリペプチドの一部が免疫原性で
あることを推定することにおいて有用なガイドである。

これらの理論的なアプローチは有用なガイドであるけれ
ども、本発明の研究の間、発見された多くの例外が存在
する。

多くの場合、免疫診断試薬としてより有用なペプチドを
製造するためには、その抗原特性を変えないで、天然に
存在する配列を変性することが所望される。そのような
変性とは、 −へテロ二価性架橋試薬、たとえばスルホスクシンイミ
ジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（結
合をもたらすための好ましい試薬）によりキャリヤータ
ンパク質へのペプチドの結合を促進するためにアミノ又
はカルボキシル末端でのシスティン残基の付加； 支持ペプチド又は大きなペプチドへの結合のために又は
ペプチドの物理的又は化学的性質を変性するために、ペ
プチドのお互いの結合を促進するためのオリゴペプチド
のＣ０ＯＨ又はＮＨ，末端でのあるアミノ酸の付加を含
む。そのような変性は、エステル化反応を通してリンカ
−として使用され得るチロシン、グルタミン酸又はアス
パラギン酸の付加により、及びシッフ塩基又はアミド形
成、すなわち末端−ＮＨ２アシル化、チオグリコール酸
アミド化、末端−ＣＯＯＮアミド化による誘導体化、た
とえばアンモニア、メチルアミン形成により結合され得
るリジンの付加によりもたらされる。これらの修飾は、
ペプチド上の実効電荷の変化をもたらし、そしてまた、
固体支持体、キャリヤー又は他のペプチドへのそのペプ
チドの共有結合も促進することができる。これらの修飾
は、ペプチドの免疫反応性の変化をもたらさない。すな
わち、自発的に酸化する傾向があるアミノ酸であるメチ
オニンが、抗原性を変えないでノルロイシンにより通常
置換され得る。

ペプチド配列は、種々の変化、たとえば挿入、欠失及び
置換（保存性又は非保存性のいづれか）にゆだねられ得
、そしてそのような変化は、それらの使用においである
利点を提供するであろう。

これらの変化は、たとえばｇｌｙ、　ａｌａ；　ｖａ１
、　ｉｌｅ。

１ｔ３ｔｌ；　ａＳｐ＋　ｇｌｕ、　ａｓｎ、　ｇｌｎ
；　Ｓｅｒ＋　ｔｈｒ；　ｌｙｓ＋　ａｒｇ；ｐｈｅ、
　ＬｙｒＨａｌａ＋　ｓｅｒ；　ａｌａ、　ｔｈｒ；　
ａｌａ、　ｖａｌ；　ａｌａ。

ｐｒｏ；　ａｌａ、　ｇｌｕ；　ｌｅｕ、　ｇｌｎ；　
ｇｌｙ、　ｐｈｅ；　ｉｌｅ、　ｓｅｒ；及びｉｌｅ、
　ｓｅｔの組合せを含む。

ペプチドの受動的な吸収を促進するために少数（１〜１
０）の疎水性アミノ酸から成るパテール”を固体支持体
に付加することが便利である。この修飾は、Ｃ０ＯＨ又
はＮＨ２末端のいづれかで行なわれ得る。好ましい付加
はｐｈｅ　−ａｌａ　−ｐｈｅ　−ａｌａ　−ｐｈｅで
ある。

本発明によれば、ＨＩＶ−１抗体の検出のために有用な
選択された環状ペプチドは、５８６〜６２９のアミノ酸
配列（ｇｐ４１−　＋１１Ｖ−１）を含んで成るペプチ
ドであり、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配列に
おいては、式Ｉの環状ペプチドを提供するためにシステ
ィン残基がジスルフィド結合により、６０５〜６１１の
ｇｐ４１−　（ＨＩＶ−１）　７−、　／酸配列のそれ
ぞれの末端で結合されているアミノ酸配列が常に存在す
る。好ましい環状ペプチドは、次の条件のペプチドであ
る： ＸがＮＨ２Ｇであり、　そしてｙがＴＴＡＶＰＷＮＡＳ
　−ＣＯＯＨ（８０）であり； ＸがＮＨ２ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（ｌＬＬｆｄＷＧ
　　Ｔ：あり、そしてｙが−ＴＴＡＶＰＷＮＡＳ　−Ｃ
ＯＯ１１であり　（８７ｃ）　；ＸがＮＨ，−ＶＥＲＹ
ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ−４’あり、そしてｙが−ＴＴ
ＡＶＰＷＮＡＳ　−Ｃ０ＯＨであり　（８Ｂ）　　；Ｘ
がＮｉｌ□−Ｇであり、そしてｙが −ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱＧＣ−ＣＯＯＨ
”ｉ’あり　（１０３）、そして ＸがＮＨｚ　　Ｇであり、そしてｙが −ＴＴＡＶｌ’ＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱ　Ｉ−Ｃ００
Ｉ＋　テある　（９６）。

また、本発明によれば、ＨＩＶ−２抗体の検出のために
有用な選択された環状ペプチドは、５７８〜６１３のア
ミノ酸配列（ｇｐ４２−　ＨＩＶ−２）を含んで成るペ
プチドであり、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配
列においては、式■の部分配列を提供するために、シス
ティン残基がジスルフィド結合により５９７〜６０３の
アミノ酸配列（ｇｐ４２−　ＨＩＶ　−２）のそれぞれ
の末端で結合されているアミノ酸配列が常に存在する。

本発明の式（Ｉｌ）の好ましい環状ペプチドは、次の条
件のペプチドである： ｘｌがＮ１１ｚ　　ＲＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮ
ＳＷＧ−であり、そしてｙＩが−ＣＯＮＩＩ□であり　
（ペプチド１４６）　；ｘｌが＋１４１ｚ　　ＱＤＱＡ
ＲＬＮＳＷＧ−であり、そしてｙｌカーＨＴＴＶＰＷＶ
ＮＤＳ−ＣＯＮＨｚ　テあり　（ペプチド１４７）　；
ＸＩがＡｃ、口ＤＱＡＲＬＮＳＷＧ−であり、そしてｙ
ｌが−ＣＯＮＨ，であり　（ペプチド２００）　；ｘｌ
がＮＨ２Ｇ−であり、そしてｙＩが−ＩＩＴＴＶＰＷＶ
ＮＤｓ　−Ｃ０ＯＨであり　（ペプチド２０１）　；そ
して ｘｌ　がＮｔｈ　　ＲＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮ
ＳＷＧ　　’Ｉｆ：あり、そしてｙＩがＩＩＴＴＶＰＷ
ＶＮＤＳ−ＣＯＯＨテあル（ペプチド２０２）。

最っとも好ましい環状ペプチドは、ペプチド８０゜８７
ｃ、　１４６．１４７．２００．２０１及び２０２であ
る。

第１表は、本発明の好ましい環状ペプチドのために、Ｒ
ａｔｎｅｒ＆Ｊ、　、Ｎａｔｕｒｅ　　３１３：　　２
７７〜２８４（１９８５）により公表された配列に基づ
いての旧Ｖ−１のためのアミノ酸の位置番号及びＧｕｙ
ａｄｅｒ肢、、ハＵ尿　α世：６６２〜６６９（１９８
７）により公表された配列に基づいてのＨＩＶ−２のた
めのアミノ酸の位置番号を提供する。

第一」−一表 ペプチド番号　　　　アミノ酸の位置番号：ｇｐ４１−
　ＨＩＶ−１ｇｐ４２−　＋１１Ｖ−２８７ｃ　　　　
５８６−６２０ １０３　　　　６０４−６２８−ＧＣ 同定される領域は、旧Ｖ−１及びＨＩＶ−２に対する抗
体を検出することにおいてひじように免疫反応性である
ので、いづれかＨＩＶ単離体のその対応する領域がまた
興味の対象であることは明らかである。同様に、ＨＩＶ
の他の単離体又は他の血清タイプに見出される配列もま
た、本発明の範凹円にある。

１又は２個のチオールを含有する残基、たとえばシステ
ィンを線状ペプチド配列番こ付加し、それによって対応
する環状ペプチドの調製のためＧこ残基を付与すること
もまた、本発明の範囲内Ｇこある。

−船釣に言えば、脱アミノージカルノＮ相同体力く、ｇ
ｐ４１−　（ＨＩＶ−１）の位置６１１又はｇｐ４２−
（ＨＩＶ　−２）　（Ｄ位置６０３でアミノスペリン酸
（Ａｓｕ）＆こよるジスルフィド架橋に含まれる２個の
システィンの置換により合成され得る。

複数のペプチド配列を共有結合し、又は複数のペプチド
から成るポリマーを形成することカベ所望される。その
ような変性は、抗原性質を失わなし１で固体表面上への
抗原の受動的吸着を促進・仕しめることができる。

（線状及び環状ペプチドの調製） 樹脂支持体は、ポリペプチドの固相調製のために当業界
において通常使用される適切な樹脂であり、好ましくは
ｐ−ベンジルオキシアルコールポリスチレン 脂である。初めの保護されたアミノ酸の樹脂支持体への
結合に続いて、アミノ保護基が、当業界で従来使用され
ている固相ペプチド合成の標準方法により除去される。

アミノ保護基の除去の後、残る保護されたα−アミノ基
及び必要なら、側鎖を保護されたアミノ酸が、所望する
生成物を得るために引き続いて結合される。他方、多重
アミノ酸基が、樹脂支持性アミノ酸配列との結合の前、
溶液方法を用いて結合され得る。

適切な結合試薬の選択は、当業界で確立している。たと
えば、適切な結合試薬は、単独で又は好ましくは１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールの存在下でＮ，Ｎ’−ジイ
ソプロピルカルボジイミド又はＮ，Ｎ’−ジシクロへキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。もう１つの有用
な結合方法は、保護されたアミノ酸の予備形成された対
称無水物を使用する。

成長するポリペプチド鎖上に導入されるそれぞれのアミ
ノ酸のために使用される必要なα−アミノ保護基は、好
ましくは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ
＋ｏｃ）である。しかしながら、保護基が結合条件下で
分解せず、そして成長分子にすでに存在するいづれか他
の保護基の存在下で選択的に容易に除去できるかぎり、
どんな保護基でも使用され得る。

側鎖アミノ酸のための基を選択するための基準は次の条
件である：　（ａ）合成のそれぞれの段階でα−アミノ
保護基の除去のための選択的な反応条件下での種々の試
薬に対する保護基の安定性：（ｂ）保護基はその戦略的
特性を保持すべきであること（すなわち、結合条件下で
分離しないこと）及び（Ｃ）保護基は、ポリペプチド合
成の終結後及びポリペプチド構造に影響を及ぼさない条
件下で容易に除去できるべきであること。

完全に保護された樹脂支持性ペプチドは、適切なスカベ
ンジャー、たとえばアニソール、チオアニソール、エチ
ルメチルスルフィド、１．２−エタンジチオール及び関
連する試薬の存在下で室温で１〜６時間、塩化メチレン
中、トリフルオロ酢酸の５０〜６０％溶液によりｐ−ペ
ンゼルオキシアルコール樹脂から分離される．同時に、
はとんどの酸不安定側鎖保護基が除去される。より酸耐
性の保護基は、ＨＦ処理により除去される。

、本発明の環状ペプチドは、当業界で一船釣知られてい
るペプチド合成の次の技法により、保護された又は保護
されていないＳＨ−基のジスルフィド結合への直接的な
酸化転換により調製される。

好ましい方法とは、フェリシアン化カリウムによる遊離
ＳＨ−基の直接的な酸化を包含する。そのような環状ペ
プチドは、抗体への結合を助けることができるより固定
されたコンホメーションを取る。システィン−システィ
ンのジスルフィド結合が天然のウィルスタンパク質に存
在するかどうかは知られていない。

（ペプチド混合物） １３７８人のＨＩＶ−　１陽性被検者及び５人の旧ソ−
２陽性被検者の血清に由来するＨＩＶ抗体の完全な検出
を提供することが見出されている環状及び線状ペプチド
の混合物もまた、本発明の範囲内にある。また、本発明
の新規混合物は、最少数の誤った陽性をもたらす高レベ
ルの特異性を提供することが見出された。

さらに、本発明の混合物は、下記一般式：〔式中、Ｘ及
びｙは前記定義通りである〕で表わされる少なくとも１
種の環状ペプチド及び−ｇρ１２０の線状ペプチド、又
は −ｇρ１２０の線状ペプチド、ｐ２４の線状ペプチド及
びｇρ４１の線状ペプチド、又は −ｇｐ１２０の線状ペプチド及びｇｐ４１の線状ペプチ
ドを含んで成る。

本発明の他の混合物は、下記一般弐： 〔式中、ｘｌ及び戸は前記定義通りである〕で表わされ
る少なくとも１種の環状ペプチド及びＨＩＶ−２のＥＧ
Ｐの線状ペプチドの１つを含んで成る。

ｇｐ４１−　（ＨＩＶ−１）及びｇｐ４２−　ＣＩＩ　
ＩＶ　−２）　ニ由来する環状ペプチドがひじょうに保
存され且つ免疫優性の領域をまねたとしても、ｇｐ４１
の他のペプチド配列及びＨＩＶの他の２種の免疫原タン
パク質からのいくらかを含むことは、より安全であるこ
とが見出された。そのような感染された個人の血清中に
含まれる抗体がもはや環状ペプチドに結合できない程度
に突然変異がこのエピトープを変性する場合、この血清
は、アッセイシステムに含まれる他のエピトープに対し
て向けられた他の抗体によりなお陽性であることが見出
された。しかしながら、混合物に使用され得るペプチド
の数は限定される。まず第１に、多過ぎる異なったペプ
チドは、誤った陽性結果の割合を高めるであろう。特に
、ｐ２４タンパク質の多くのペプチドは、しばしば許容
できない低い特異性を招くことが見出された。

第２に、混合物中における多過ぎるペプチドの付加は、
免疫優性ペプチドを希釈し、そして試験の感度を低める
であろう。

より特定には、ｇｐ１２０の線状ペプチドは、４９７〜
５１８のアミノ酸配列を有し、そして次の式：％式％ 相当する。

ｐ２４の線状ペプチドは、２４１〜２６３のアミノ酸配
列を有し、そして次の式： ％式％（６１） に相当する。

ＥＧＰ　（ＨＩＶ−２）の線状ペプチドは、４８６〜５
０１のアミノ酸配列（ペプチド２０４）又は４８６〜５
０８のアミノ酸配列（ペプチド２０３）を有し、そして
それぞれ次の式： ％式％） （）ＩＩＶ抗体の検出） 本発明のペプチド及びペプチド混合物は、当業界におい
て良く知られている方法に従ってＡＩＤＳ関連抗体の検
出のための診断試薬として使用される。

ＡＩＤＳに対する抗体の決定における本発明のペプチド
の主な利点は、これまで使用されて来た既知の抗原と比
べてのそれらの特異性にある。

ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のための１つの方
法に従えば、いわゆる“ウェスターンプロット”分析が
使用される（Ｔｏｓ４ｂｉｎ、　Ｈ，，５ｔａｅｈｅｌ
ｉｎ。

Ｔｈ、ａｎｄ　Ｇｏｒｄｏｒ＋＋　Ｉｌｌ　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　７６゜４３５０〜
４３５４（１９７９）　）。この方法によれば、本発明
のペプチド又は複数のペプチドがニトロセルロース紙上
に適用される。このニトロセルロース紙は含浸され、そ
して次に試験されるべき血清により処理される。洗浄の
後、そのニトロセルロース紙は、酵素によりラベルされ
た抗−ヒトＩｇＧにより処理される。次に、その酵素活
性が適切な基質により決定される。もちろん他の放射性
ラベル又は螢光ラベルも使用され得る。

本発明のペプチド又はペプチド混合物を用いての＾■Ｄ
Ｓウィルスに対する抗体の決定のための好ましい便利且
つ従来の方法は、酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）である。この試験によれば、本発明のペプチド又
はペプチド混合物が、ミクロタイタープレートの壁土に
吸着される。次に、その壁は、試験されるべき血清によ
り処理される。洗浄の後、ペルオキシダーゼによりラベ
ルされた抗−ヒトＩｇＧがその壁に付加される。そのペ
ルオキシダーゼの決定は、対応する基質、たとえば〇−
フヱニレンジアミンにより行なわれる。また、この方法
において、ペルオキシダーゼは、他のラベル、たとえば
放射性又は螢光ラベルにより交換され得る。

ＥＬＩＳＡ試験においては、個々のペプチド又はその組
合せを使用することが可能である。誤った応答の原因と
なる抗体を同時に排除しながら、抗体を検出するための
最っとも効果的なペプチドを組。

合すことを可能にするので、後者が好ましい。いくつか
の血清サンプルが、抗原として個々のペプチドとの不確
かな応答を示しながら、ペプチドの混合物との正しい陽
性結果を示すことが、これらの研究の間、発見された。

従って、ＨＩＶ抗体のための信頼すべき試験は、ペプチ
ド抗原の適切な組合せによってのみ達成され得る。

本発明のペプチド又はペプチド混合物による、ＡＩＤＳ
ウィルスに対する抗体の決定のためのもう１つの方法は
、いわゆる“二抗原−サンドイッヂ法”による酵素免疫
試験である。この方法は、垣ニー■１μ上１匹神０毅＝
２５〜３４　（１９７８）に記載されるＭａｉｏｌｉｎ
ｉ、　Ｒ，１，の研究に基づかれている。この方法によ
れば、試験されるべき血清が、本発明のペプチド又はペ
プチド混合物が被覆されている固相（捕獲層）及びペル
オキシダーゼによりラベルされている本発明のペプチド
又はペプチド混合物（プローブ層）と接触せしめられる
。その免疫反応は、１又は２段階で行なわれ得る。その
免疫反応が２段階で行なわれる場合、洗浄段階が２回の
インキュベーションの間で行なわれる。免疫反応の後、
洗浄段階が行なわれる。その後、ペルオキシダーゼが、
基質、たとえば０−フェニレンジアミンにより決定され
る。

適切な固相は、有機及び無機ポリマー〔アミラーゼ、デ
キストラン、天然又は変性されたセルロース、ポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース
、磁鉄鉱、多孔性ガラス粉末、ポリビニリデンフルオリ
ド（Ｋｙｎａｒ）及びラテックス〕、試験容器（試験管
、タイタープレート又はガラス又は人工的な材料のキュ
ベツト）の内壁及び固体物（ガラス及び人工的な材料の
ロッド、末端が太くなったロッド、末端のロープ又はラ
メラを有するロッド）の表面である。ガラス及び人工的
材料からの球体は、特に適切な固相キャリヤーである。

本発明のペプチド及びペプチド混合物は、ＡＩＤＳウィ
ルスに対する抗体の決定において有用であるのみならず
、またＡＩＤＳウィルス自体の決定のためにも有用であ
る。なぜならば、これらのペプチド（遊離、重合されて
いる又は適切なキャリヤーに接合されている）は、ＡＩ
ＤＳウィルスに対する抗体、特にモノクローナル抗体を
誘発することにおいて有用であるからである。そのよう
な抗体は、本発明のペプチド又はペプチド混合物の十分
な量を哺乳類又は鳥類に注射し、そして前記動物の血清
から前記抗体を回収することによって産生され得る。

抗体を誘発するための適切な宿主動物は、哺乳類、たと
えばウサギ、ウマ、ヤギ、テンジクネズミ、ラット、マ
ウス、ウシ、ヒツジ、等を包含する。

一般的に知られている種々の方法は、ＡＩＤＳウィルス
又はその一部の決定に使用され得る。

１つのそのような方法においては、アンセイされるべき
血清サンプルの既知量、本発明の放射性ラベルされた環
状ペプチド又はペプチド混合物及び本発明のラベルされ
ていないペプチド又はペプチド混合物が一緒に混合され
、そして静置される。

抗体／抗原複合体が、当業界において既知の方法により
、すなわち硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール
、第二抗体（過剰量か又は不溶性支持体に結合されてい
る）、デキストラン被覆性木炭及び同様のものによる処
理により、結合されていない試薬から分離される。本発
明のラベルされたペプチド又はペプチド混合物の濃度は
、結合された又は結合されていない相のいづれかにおい
て決定され、そしてサンプルのＡＩＤＳ含有量は、それ
自体既知の方法で標準曲線と観察されるラベルされた成
分のレベルとを比較することによって決定され得る。

もう１つの適切な方法は、“二抗体サンドイッチアッセ
イ゛である。このアッセイによれば、試験されるべきサ
ンプルが２種の異なった抗体により処理される。これら
の抗体の１つはラベルされ、そして他は固相上に被覆さ
れる。固相として、本明細書において前で言及されたも
のが考慮される。

適切なラベルは、酵素、たとえばペルオキシダーゼ、放
射性ラベル又は螢光ラベルである。好ましい固相はプラ
スチックビーズであり、そして好ましいラベルは、ホー
スラディシュペルオキシダーゼである。種々の抗体が、
種々の動物、たとえばヒツジ及びウサギを免疫化するこ
とによって高められ得る。

もう１つの方法は、モノクローナル抗体を産生ずるため
の良く知られたＫｏｅｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ技法を用いることにある。同じ抗原に対して（但し
異なったエピトープに対してではない）向けられるモノ
クローナル抗体を識別するために、５ｔｉｈｌｉｆ＆、
、　、Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　３２　：　　２９７〜３０４　（１９８０
）の方法が使用され得る。

もちろん、抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクロ
ーナル抗体を使用することも可能である。

“二抗体サンドインチ法°”によれば、サンプルが固相
抗体及びラベルされた抗体と共にインキュベートされる
。まず、固相抗体によりサンプルを処理し、そして洗浄
の後、ラベルされた抗体によりサンプルを処理すること
が可能である。しかしながら、まず固相抗体によりサン
プルを処理し、そして一定の時間の後、ラベルされた抗
体により処理することも可能である。さらに及び好まし
くは、固相抗体及びラベルされた抗体により一緒にサン
プルを処理することが可能である。

免疫反応の後、洗浄段階が行なわれる。洗浄の後、当業
界で既知の方法に従って、ラベルが決定される。ラベル
としてペルオキシダーゼが使用される場合、その決定は
、基質、たとえばフェニレンジアミン又はテトラメチル
ベンジジンにより行なわれる。ラベルされた成分の量は
、サンプル中に存在する抗原の量に比例する。

ＡＩＤＳウィルス又はＡＩＤＳウィルスに対する抗体の
決定のための上記のような方法は、容器中に、本発明の
環状ペプチド又はＡＩＤＳウィルスに対する抗体（本発
明の環状ペプチド又は環状及び線状ペプ、千ドの混合物
により誘発された）を含んで成る適切な試験キットで行
なわれ得る。

さらに、本発明の環状ペプチド及び本発明の環状及び線
状ペプチドの混合物は、ＡＩＤＳウィルスに対する保護
免疫性を誘発できるワクチンとして使用される。投与の
ルート、抗原投与量、注入の回数及び頻度は、個人ごと
に異なり、そして他のウィルス感染において免疫性を提
供することに現在使用されている方法に匹敵することが
できる。ワクチンは、既知の方法に従って調製される。

ワクチン組成物は、便利には、生理学的に許容できるキ
ャリヤー物質と共に組合されるであろう。そのワクチン
組成物は、アジュバント又は免疫応答のいづれか他のエ
ンハンサ−を含むことができる。

さらに、そのワクチン組成物は、ＡＩＤＳの他に他の疾
病に対する免疫性を提供するために他の抗原も含むこと
ができる。

（試験されたパネル血清） 本発明の生成物により試験されたパネル血清を、広範囲
の種類の個人から得、そしてそれは、ＨＩＶ−１に対し
て血清陰性であることが知られている８４５個のサンプ
ル及びそれに対して血清陽性であることが確認されてい
る１３７８個のサンプル並びにＩＩＩシー２に対して血
清陽性であることが確認されている５個のサンプルを含
む。

゛第２表は、血清サンプルが取られた被検体及びそれら
のＨＩＶ血清学的状態の説明を示す。

勇−じし−表 輸血 受容者： −サラセミア　　　　　　　　　　　９３−腎臓移植　
　　　　　　　　　　　２１１−へモフィルス　　　　
　　　　　　　３８３１−他　　　　　　　　　　　　
　　１０２ｉノ」弓り艮染ニ ーニブスティンーバーウィルス　　　５０〇−サイトメ
ガロウィルス　　　　　　２１７−乳頭腫　　　　　　
　　　　　　　１２〇−肝炎（非−Ａ、非−Ｂ）　　　
　　　１　　　０−狼　癒　　　　　　　　　　　　２
１〇−重度のりウマチ様関節炎　　　　　２００−同性
愛者　　　　　　　　　　　　３２３７−明示されてい
ない　　　　　　　６１０　　　１２９７１１Ｖ−２ 合計　　　　　　８４５　１３８３ （結　果） 本発明の環状ペプチド及び１又は複数の線状ペプチドと
のそれらの混合物が、種々の血清（このいくらかは陽性
であり、そして他は陰性であることが確められている）
に対して、前記ＥＬＩＳＡ試験に従って試験された。

第３表は、既知のＨＩＶ−１陽性血清を同定することに
おいて個々に評価された単一のペプチドの結果を提供す
る。

第４表は、既知のＨＩＶ−２陽性血清を同定することに
おいて個々に評価された単一のペプチドの結果を提供す
る。

第５表は、種々の希釈度でのいくつかの血清の結果を比
較することによって、ＥＬＩＳＡ試験における環状ペプ
チド対非環状ペプチドの感度を例示するために提供され
る。それぞれの対内で、環状相同体がその線状相同体よ
りもより活性であることが注目されるであろう。これら
のデータは、抗体との反応において、一定のペプチドの
環状性の重要性を明確に示す。

最近、被覆のために使用されるいくつかの条件（炭酸緩
衝液、ｐＨ９，６）において、それらの配列中に２個の
システィンを有する線状ペプチドが内部環状化及び重合
を受けることが見出された。第５表に示される結果が旧
Ｖ−１抗体を検出することにおいて線状ペプチドよりも
環状ペプチドの卓越性を明確に示したとしても、その高
められた感度は、炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中に溶解さ
れた後、線状ペプチドの可能性ある環状化及び重合ため
に過小評価されて来た。その実験は、前記のとおり・炭
酸緩衝液（９１１９，６）及びまた１０％酢酸（ｐＨ２
，７）中に溶解される線状８７ペプチド及び環状８７ｃ
ペプチドによりくり返えされた。ペプチドのＨＰＬＣ分
析は、炭酸緩衝液中において、使用される線状ペプチド
８７が、室温でその溶液中に維持される場合、環状化及
び重合を受けることを確証した。プレートに結合される
線状ペプチドに対する環状ペプチドの正確な割合はまだ
決定されていないけれども、環状化及び重合がマイクロ
タイタープレートのウェル中において生じたと思われる
。

炭酸緩衝液中に見られるのとは反して、１０％酢酸中に
溶解された線状ペプチド８７は、ＨＰＬＣ及びエルマン
試験によって指摘されるように線状のまま残存した。

１０％酢酸中に溶解された環状ペプチド８７ｃは、環状
のまま残存した（）ＩＰＬＣ分析及び負のエルマン試験
から）。

この実験に使用されるプレートは、１０ｇ／ｍでのペプ
チドの溶液により被覆された（第５表の実験結果が０．
５　ｔｒｇ／　ＩＩＥｆ！でのペプチドにより被覆され
たプレートにより得られた）。４種の異なった＋１ＴＶ
−１陽性サンプルが連続的に希釈され、そしてそれらの
力価が決定された。その力価を、すでに記載されたＥＬ
ＩＳ八方法へ条件下で１．０の吸光度を示す血清希釈度
として定義した。

第５表においてすでに示されたように、環状ペプチド８
７ｃは、その対応する線状ペプチド８７よりも高い感度
で、ＨＩＶ−１に対して特異的な抗体を検出することが
できることが第６表において明確である。線状ペプチド
８７に対する環状ペプチドにより測定される感度の割合
は、■、３〜２゜２の間であり、そして平均１，８であ
る。環状８７ｃペプチドを用いてのＥＬＴＳＡ試験の感
度が、線状ペプチド８７が線状で残存し、そして環状化
又は重合されない条件（酸性ｐＨ）を用いて比較される
場合、これらの割合はさらに高く、３．０〜４．５であ
る。

十分に定義された環状ペプチド８７ｃにより被覆された
プレートの感度とペプチド８７の種々のポリマーのみを
含むクロマトグラフィー画分のプールにより被覆された
他のプレートの感度とを比較する類似実験はまた、最大
感度での旧Ｖ−１抗体の検出において、環状ペプチド８
７ｃの卓越性を示す。これらの実験の間、バックグラウ
ンド読みが線状ペプチド８７により被覆されたプレート
上で有意に高＜　（０，１４４±０．０１０対０□００
６±０．００２）、そしてＡＩＤＳ試験において十分に
酸化された環状ペプチド８７ｃを用いることの１つの利
点を示すことがまた突然見出された。

第７表において、環状及び線状ペプチドの混合物は、既
知のＨＩＶ陽性血清を同定することにおいて評価され、
そして第８表はＨＩＶ陰性血清に対するその同じ混合物
の結果を示す。

第７及び第８に使用される混合物は、次の通りである。

■立立■且号　　　　°４　　のペプチド１　　　線状
ペプチド４１　、４２　、５６及び７１２　　　線状ペ
プチド２３　、２９　、４２　、５６及び７１３　　　
環状ペプチド８０及び線状ペプチド６１゜７１及び８７ ４　　　環状ペプチド８０及び線状ペプチド７１及び８
７ ５　　　環状ペプチド８０及び８７ｃ及び線状ペプチド
７１ ６　　　環状ペブチＦ２００．２０１．２０２及び線状
ペプチド２０３及び２０４ ７　　　環状ペプチド８０　、８７ｃ　、　２０２及び
線状ペプチド７１　、２０３及び２０４゜これらの混合
物において、ペプチド２３　、２９　、２０３及び２０
４は、次の配列を有する： ＡｃＮＨＹＧＣＳＧＫＬＩＣＣ０ＮＩＩｚ　　　　　　
　　（２３）ＮＨｚ　　ＣＧＶＫＮＷＭＴＥＴＬＬ　　
ＣＯＯＨ　　　　　　　（２９）ＮＨｚ　　　ＬＶＥＩ
ＴＰＩＧＦＡＰＴＫＥＫＲＹＳＳＡＨＧＲＣ０ＯＨ（２
０３）Ｎｌｌｚ　　−ＬＶＥＩＴＰＩＧＦＡＰＴＫＥＫ
Ｒ−ＣＯＯＨ（２０４）。

第９表は、１６７種のＨＩＶ−１陽性血清及び５１種の
ＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおける本発明の混
合物４とウェスターンプロット試験との間の試験の比較
を示す。その結果は、ＥＬＩＳＡ試験における本発明の
混合物４がウェスターンプロット試験よりも高い感度及
び特異性を与えることを示す。

第１０表は、８２２種のＨＩＶ−１陽性血清及び１１４
種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおける免疫螢
光アッセイを示す。その結果は、ＨＬＩＳＡ試験におけ
る混合物４が免疫螢光アッセイよりも高い感度及び特異
性を与えることを示す。

第一」Ｌ−表 ｔｔｔｖ−ｉ陽性血清を同定することにおけるペプチド
の効力 ４２　　　　ｇｐ４１　　　　　　　５　　　　　　　
７３５６　　　　ｇｐ４１　　　　　　　　１００　　
　　　　１７７７　　　　ｇｐ４１　　　　　　　１０
０　　　　　　３７７８　　　　ｇｐ４１　　　　　　
　　１００　　　　　　３７８０　　　　ｇｐ４１　　
　　　　　１００　　　　　　３４８１　　　　ｇｐ４
１　　　　　　　　１００　　　　　　３４８７　　　
　ｇｐ４１　　　　　　　９９　　　　　　　１４９８
７ｃ　　　ｇｐ４１　　　　　　　．９９　　　　　　
　１１４８８　　　　ｇｐ４１　　　　　　　１００　
　　　　　１４９１　　　　ｇｐ４１　　　　　　　９
４　　　　　　　３２９５　　　　ｇｐ４１　　　　　
　　　１００　　　　　　１４９６　　　　ｇｐ４１　
　　　　　　１００　　　　　　１４９７　　　　ｇｐ
４１　　　　　　　１００　　　　　　１３９８　　　
　ｇｐ４１　　　　　　　１００　　　　　　１４９９
　　　　ｇｐ４１　　　　　　　１００　　　　　　１
５１０３　　　ｇｐ４１　　　　　　　１００　　　　
　　１３第−」Ｌ−表 ＋＋１Ｖ−２陽性血清を同定することにおけるペプチド
の効力 １４６　　　ｇｐ４２　　　　　１００　　　　　　５
１４７　　　　ｇｐ４２　　　　　１００　　　　　　
５２００　　　ｇｐ４２　　　　　１００　　　　　　
５２０１　　　　ｇｐ４２　　　　　１００　　　　　
　５２０２　　　ｇｐ４２　　　　　１００　　　　　
　５２０３　　　　Ｅ　Ｇ　Ｐ　　　　　１００　　　
　　　５２０４　　　　Ｅ　Ｇ　Ｐ　　　　　１００　
　　　　　５勇−」Ｌ−表 ＢＬＩＳＡにおける環状及び非環状ペプチドのＭ−５１
１５０１，７１９２，１０４１，８０９＞２．０１／１
００　１．４５９　　１．８８１　　１．６８５　　＞
２．０１／２００　１．２４８　　１．５９９　　１．
５１３　　＞２．０１／４００　０．９５９　　−−−
−−　　１．４１８　　＞２．０１／８００　０．０５
７　　０．７６７　　１．０１２　　１．８５４Ｍ−７
１１５００，１４２０，１９１１，５０４＞２．０１／
ｌｏｏ　　Ｏ，０２５０，０６７１，３２９＞２．０１
／２００　０．００７　　０．０１９　　１．１８４　
　１．７２９１／４００　０．００１　　０．０１０　
　０．９２３　　１．３４８１／８００　０．０００　
　０．００５　　０．５７１　　０．６１１Ｍ−８１１
５００，７９５１，０２６１，３９０＞２．０１／１０
０　０．５０７　　０．７３７　　１．０８７　　＞２
．０１／２００　０．３７６　　０．５２０　　０．８
８３　　１．６５５１／４００　０．２０９　　０．３
４０　　０．５９３　　１．０６４１／　８００　０．
０６２　　０．１５９　　０．２４０　　０．３８４策
ｌ聚ユ肱１− ＥＬＩＳＡにおける環状及び非環状ペプチドのＭ−１６
１１５０１，２１９１，６０１１，８４６＞２．０１／
１００　０．９６２　　１．３００　　１．７８４　　
＞２．０１／２０（１０，６１３０，９０３１，７４０
＞２．０１／４００　０．３０１　　０．５８３　　１
．６３４　　＞２．０１／８００　０．２０５　　０．
３２９　　１．５３７　　１．９６２８７Ｖ１０３　１
１５０　０．０００　０．００３　０．００５　０．０
１１１４２８　　１１５０　０．９２６　１．０４７　
１．４６３　　＞２．０第一」Ｌ−衷 環状ペプチド対その対応する線状ペプチドにより被覆さ
れたプレート上で測定された血清の血清力価の比較 １０％酢酸　　Ｍ−５１３５００４５００３，０（ｐＨ
２，７）　　　Ｍ　−７９０００２３００３，９Ｍ−８
６３００１４００４，５ Ｍ−１６５６０００１５０００３，７ 炭酸塩　　　　Ｍ−５１３５００１０５００１，３炭酸
水素塩　　Ｍ−７１１０００６００ＯＬ８０．１Ｍ　　
　　　Ｍ−８６５００２９００２，２（ｐ）１９．６　
）　　　Ｍ　−１６５６０００３３０００１，７芽−二
り一表 ＨＩ　Ｖ陽性血清を同定することにおけるペプチド混合
物の性能 庇−」Ｌ−人 ＨＩＶ陰性血清を同定することにおけるペプチド混合物
の性能 ４　　　　　９９．４　　　　　　　　８４５確認され
たＰＯ３１６７１５８ 誤ったＮＥＧ　　　　　　０　　　　　　８確認された
ＮＥＧ　　　　　５１　　　　　　４６諜呉った　ＰＯ
３０５ 試験された合計　　　　２１８　　　　　２１８第一１
灸−麦 確認されたＰＯ３８２２８００ 誤ったＮＥＧ　　　　　　　０　　　　　　１確認され
たＮＥＧ　　　　１１４　　　　　　１１１誤ったｐｏ
ｓ　　　　　　　ｏ　　　　　　　。

結果は、既知のＨＩＶ−１陽性血清を正しく同定するこ
とにおけるあるペプチド混合物、特に好ましい混合物４
及び５の卓越性及び既知のＨＩＶ−２陽性血清を正しく
同定することにおける混合物６の卓越性並びにＨＩＶ−
１及びＨＩＶ−２陽性血清サンプルの両者を正しく同定
することにおける最終混合物７の卓越性を明確に示す。

単一のペプチドよりもむしろ混合物の使用が、抗体がひ
じょうに限定された数のエピトープに対して向けられて
いる低い力価の異常な血清を同定する失敗の可能性を最
少にする。すべての血清陽性サンプルがＥＬＩＳＡによ
り試験され、そしてウェスターンプロット又は免疫螢光
アッセイにより確認された。矛盾する場合、サンプルは
、最終の対照標準として取られ、るラジオイムノ沈殿ア
ッセイによりアッセイされた。

次の例は、本発明のペプチドの合成のための一般的な方
法及びそのペプチドの利用を例示する。

ｍｌ：Ｎａ−Ｆｗｏｃにより保護されたアミノ酸残基を
担持する樹脂の調製。

塩化メチレン（Ｃ１（□ｃｈ）及びジメチルボルムアミ
ド（ＤＭＦ）の混合物（４：１）中、所望するＮａ−Ｐ
＋ｗｏｃ保護性アミノ酸残基を、Ｃ１１２Ｃｌ　２　：
　ＤＭＦ（４：　１）中、ｐ−ベンジルオキシアルコー
ル樹脂の懸濁液にＯ″Ｃで添加した。その混合物を数秒
間、手で撹拌し、そして次にＮ、Ｎ’−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）、次いで４−（ジメチルア
ミノ）ピリジンの触媒量により処理した。

その混合物を、０″Ｃでさらに３０分間撹拌し、そして
次に室温で一晩撹拌した。濾過された樹脂を、ＣＨ，Ｃ
１２、ＤＭＦ及びインプロパツール（それぞれ３回）及
び最後にＣＨ□ｃｌｚにより連続的に洗浄した。その樹
脂をＣ１ｌ□ｃｆｚ中に懸濁し、水浴中に冷却し、そし
てその撹拌された懸濁液に、再蒸留されたピリジン、続
いて塩化ベンゾイルを添加した。

撹拌を０°Ｃで３０分間続け、そして次に室温で６０分
間続けた。濾過の後、その樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ　ｚ。

ＤＭＦ及びイソプロパツール（それぞれ３回）及び最終
的に石油エーテル（２度）により連続的に洗浄し、その
後、真空下で乾燥せしめ、一定の重量にした。Ｍｅｉｅ
ｎｂｏｆｅｒ７ｊＪ、（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　
ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、、　１３．３５．１９７９）に
よる置換の分光光度決定は、樹脂上の置換の程度を示し
た。

例２：連続するアミノ酸の結合。

Ｎα−Ｆｍｏｃ保護性第１アミノ酸残基を担持する樹脂
を、Ｌａｂｏｒｔｅｃ　５Ｐ６４０　Ｐｅｐｔｉｄｅ　
５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒの反応容器中に添加し、そして
次のようにして処理した： （１）ＤＭＦによる洗浄（それぞれ１分間、２度）、（
２）ＤＭＦ中、ピペリジンの２０％？容液による予備洗
浄（３分間）、 （３）ＤＭＦ中、ピペリジンの２０％溶液による保護解
除（１０分間）、 （４）ＤＭＦによる洗浄（それぞれ１秒間、４度）、（
５）イソプロパツールによる洗浄（それぞれ３０秒間、
２度）、 （５）ＤＭＦによる洗浄（それぞれ４５秒間、２度）、 （７）″ｔ１離アミノ基のためのチエツク−Ｋａｉｓｅ
ｒ試験（陽性であるべきである）、 （８）そのペプチド樹脂を、所望するＦ−ｍｏｃ−保護
性アミノ酸３モル当量及び両蒸留された乾燥ＤＭＦ中に
すべて溶解されたｌ−ヒドロキシベンゾトリアソ゛−ル
３モル当量と共に２分間、軽く振盪すること、 （９）次に、固体ＤＣＣ（３，３モル当量）を、反応容
器に添加すること、 （１０）その反応混合物の２時間の振盪、（１１）ＤＭ
Ｆによる洗浄（それぞれ４５秒間、２度）、 （１２）イソプロパツールによる洗浄（それぞれ４５秒
間、２度）。

１２段階の後、ニンヒドリン試験のためリアリコートを
取る。その試験が陰性である場合、次のアミノ酸の結合
のために段階ｌに戻す。その試験が陽性であり又はわず
かに陽性である場合、段階６〜１２をくり返す。

本発明に記載されるペプチドのアミノ酸のそれぞれの結
合のために上記スケムを用いる。ＦｍｏｃによるＮ−α
保護を、合成を通して残るアミノ酸のそれぞれにより使
用する。

放射性ラベルされたペプチドを、上記結合方法を用いて
３Ｈ−グリシンの導入により得る。

最後のアミノ酸の付加の後、Ｎ−末端残基のＮα−Ｐｍ
ｏｃを、上記スケムの段階１〜７に戻すことによって除
去する。ペプチド樹脂をＣＨ２ＣＬにより洗浄し、そし
て真空乾燥せし′め、保護された粗ペプチドを得る。

例３：保護解除及び樹脂からペプチドの切断。

保護されたペプチド−樹脂を、２．５％エタンジチオー
ル及び２．５％アニソールを含む、ＣＩｌ□ＣＩ！、□
中、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の５５％溶液中に懸濁
する。その混合物をＮ２によりフラッシュし、そして室
温で１．５時間撹拌する。その混合物を濾過し、そして
その樹脂をＣＨｔＣ１、ｚにより洗浄する。その樹脂を
、Ｃ１，Ｃｆ、中、２０％ＴＦＡにより室温で５分間再
び処理する。その混合物を濾過し、そして樹脂をＣ１，
ＣＡ、中、２０％ＴＦＡにより洗浄し、そして次にＣＨ
ｚＣｆｚにより洗浄する。集められた濾液を３５°Ｃ以
下で真空蒸発せしめ、そして残留物を、乾燥ジエチルエ
ーテルにより数度こまかくすり砕（、固形物を１０％水
性酢酸中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍結乾
燥する。

ａｒｇ及びｃｙｓ残基を含むペプチドをさらに、アニソ
ール及びジメチルスルフィドの存在下で０℃で１時間、
ＨＦ処理により保護解除する。固形物を１０％水性酢酸
中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍結乾燥せし
める。

例４：ペプチドの精製。

粗ペプチドを、移動相のグラジェントを有するＣｌｌ１
又はＣ４逆相のＶｙｄａｃカラム（２，５Ｘ２５ｍｍ）
上で分離用ＨＰＬＣにより精製する。流出液を２２０ｎ
ｍでモニターし、そして続いて分析用ＨＰＬＣによりモ
ニターする。

適切な両分をプールし、蒸発せしめ、そして凍結乾燥せ
しめる。合成ペプチドの同定を、分析用逆相クロマトグ
ラフィー及びアミノ酸分析により確証する。

例５：ペプチドの環状化。

フェロシアン化カリウムの？容ｉ夜（０，１Ｍ　、　ｐ
Ｈ７，０）を、線状ペプチドの希釈水溶液（０，５ｍＭ
）にｐＨ７，０でゆっくりと添加する。室温で２時間放
置した後、そのｐＨを５．０に下げ、そしてその？容ン
夜をイオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ａｇ　−３−Ｘ
４ａ、　Ｃ１−形）により３０分間処理する。その懸濁
液を濾過し、そしてその濾液を凍結乾燥せしめ、粗環状
ペプチドを得る。そのペプチドを、分離用逆相ＨＰＬＣ
により精製し、そしてアミノ酸分析により特徴づける。

環状化の証明を、環状ペプチドのＨＰＬＣ移動性と出発
の線状ペプチドとを比較することによって、線状ペプチ
ドに戻る環状ペプチドのアリコートを還元することによ
って及びまた、環状化の後、遊離スルフヒドリル基の消
失（エルマン試験）を観察することによって得る。

環状ペプチドとそれらの対応する線状ペプチドとの間の
生理化学的相違を示すために、ＩＩＰＬｃにおける保持
時間の相違を示す第１１表に言及する。

７７（ｆｆｉ）　　　　　　　　３６．６８０（ｃ）　
　　　　　　　３９．１ ８７（ｆｆｉ）　　　　　　　　　４９．３８７ｃ（ｃ
）　　　　　　　　４６．１８１（ｆ）　　　　　　　
　　４９．２８８（ｃ）　　　　　　　　４８．７ ９５（４２）　　　　　　　　４８．３９６　（ｃ）　
　　　　　　　４Ｂ、５（１）：線状 （Ｃ）：環状 例６：ウシ血清アルブミン又はキーホールリムペット（
アオガイ）ヘモシアニンへのペプチドの接合。

ペプチドを、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）
により前もって誘導体化されたＢＳＡ又はＫＬＨに接合
せしめる。

スルホ−ＳＭＰＢ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
）の水溶液を、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）中、ＢＳＡ又はＫＬＨの溶液に添加する。

その混合物を室温で４５分間振盪し、そして活性化され
たキャリヤーをすぐに、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６，０）により平衡化された５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ　−２５カラムに４°Ｃで適用する。

活性化されたキャリヤーに対応する、最初のピークの吸
光度の両分を丸底フラスコに集め、それに０．０５Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，２）中、ペプチドの溶
液を添加する。その混合物をＮ２により十分にフラッシ
ュし、そして室温で一晩インキユヘートする。その結合
効力を、′Ｈによりラベルされたペプチドを用いて及び
接合体のアミノ酸分析によりモニターする。

例７：酵酵素台性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によ
るＨＩＶに対する抗体の検出。

マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを、ペプ
チド又はペプチド混合物を含む溶液（５ｎ／ａｄり１０
０μｌにより飽和せしめ、そして−晩装置する。ウェル
を空にし、そして洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ。

０．０４３Ｍ　；　　Ｎａｃ　ｌ　、　０．５Ｍ　；チ
メロザル、０．０１％匈／Ｖ　；　Ｔｗｅｅｎ　２０．
０．０５％Ｖ／Ｖ　；　ｐＨ７，４）により２度洗浄す
る。次に、ウェルを、洗浄緩衝液０．３５ｄにより３７
°Ｃで１時間飽和せしめ、そして同じ緩衝液により１度
洗浄する。分析されるべき血清サンプルを、検体緩衝液
（洗浄緩衝液＋カゼイン、０．０５％Ｗ／Ｖ）により希
釈する。ウェルを洗浄緩衝液によりすすぎ、その後希釈
された血清サンプル（０，１ｄ）を添加する。これらを
室温で１時間インキュベートする。次にウェルを空にし
、洗浄緩衝液によりすぐに２度洗浄し、そして次に２分
間１度洗浄する。洗浄緩衝液中、１％−／Ｖウシ血清ア
ルブミンにより希釈された接合体溶液（ラベルされたヒ
トＩｇＧペルオキシダーゼに対するアフィニティ精製さ
れたヤギ抗体、５０％グリセロール５　ｍｌ中０．５　
ｍｇ　）を、それぞれのウェルに添加しく０．１ｍｆｆ
１）、そして室温で１時間インキュベートする。次にウ
ェルを空にし、そして急速に洗浄緩衝液により２度洗浄
し、そして次に５度洗浄し、ここで緩衝液は洗浄当り２
分間、ウェルを接触せしめる。基質溶液（３，３’、５
．５’−テトラメチルベンジジン、ＤＭＳＯｌｄ当り８
ｍｇ）を、３０％ＨｚＯｚ　０．１％Ｖ／Ｖを含む０．
１Ｍのクエン酸塩−酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）　１０
０体積により希釈し、そしてそれぞれのウェルに添加す
る（ウェル当り０．１ｄ）。１０分後、それぞれのウェ
ルの内容物を、２ＮのＩＩ、Ｓｏ、　０．１　ｍｌによ
り処理し、そして４５０ｎｍで吸光度を読む。すべての
測定は２度行なわれる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸
   ６０４から始まり、そしてアミノ酸５８６まで戻るアミ
   ノ酸配列（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）を表わし；そしてｙ
   はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸６１
   ２から始まり、そしてアミノ酸６２９まで延びるアミノ
   酸配列（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）を表わす〕で表わされ
   る環状合成ペプチド。２、前記ｘが５８６から６０４ま
   で延びる次のアミノ酸配列（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）を
   表わし：【遺伝子配列があります】 そして前記ｙが６１２から６２９まで延びる次のアミノ
   酸配列（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）を表わす請求項１記載
   の環状合成ペプチド： 【遺伝子配列があります】 ３、前記ｘがＮＨ＿２Ｇ−であり、そして前記ｙがＴＴ
   ＡＶＰＷＮＡＳ−ＣＯＯＨである請求項２記載の環状合
   成ペプチド。 ４、前記ｘがＮＨ＿２ＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ
   であり、そして前記ｙが−ＴＴＡＶＰＷＮＡＳ−ＣＯＯ
   Ｈである請求項２記載の環状合成ペプチド。 ５、前記ｘがＮＨ＿２−ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬ
   ＬＧＩＷＧであり、そして前記ｙが−ＴＴＡＶＰＷＮＡ
   Ｓ−ＣＯＯＨである請求項２記載の環状合成ペプチド。 ６、前記ｘがＮＨ＿２Ｇ−であり、そして前記ｙが−Ｔ
   ＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱＧＣ−ＣＯＯＨであ
   る請求項２記載の環状合成ペプチド。 ７、前記ｘがＮＨ＿２Ｇ−であり、そして前記ｙが−Ｔ
   ＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＥＱＩ−ＣＯＯＨである
   請求項２記載の環状合成ペプチド。 ８、下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｘ＾１はアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミ
   ノ酸５９６から始まり、そしてアミノ酸５７８まで戻る
   アミノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わし；そし
   てｙ＾１はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミ
   ノ酸６０４から始まり、そしてアミノ酸６１３まで延び
   るアミノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わす〕で
   表わされる環状合成ペプチド。 ９、前記ｘ＾１が５７８から５９６まで延びる次のアミ
   ノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わし：【遺伝子
   配列があります】 そして前記ｙ＾１が６０４から６１３まで延びる次のア
   ミノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わす請求項８
   記載の環状合成ペプチド： 【遺伝子配列があります】 ＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳ。 １０、前記ｘ＾１がＮＨ＿２−ＲＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤ
   ＱＡＲＬＮＳＷＧであり、そして前記ｙ＾１が−ＣＯＮ
   Ｈ＿２である請求項９記載の環状合成ペプチド。 １１、前記ｘ＾１がＮＨ＿２−ＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧで
   あり、そして前記ｙ＾１が−ＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳ−Ｃ
   ＯＮＨ＿２である請求項９記載の環状合成ペプチド。 １２、前記ｘ＾１がＡｃ−ＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧであり
   、そして前記ｙ＾１が−ＣＯＮＨ＿２である請求項９記
   載の環状合成ペプチド。 １３、前記Ｘ＾１がＮＨ＿２であり、そして前記ｙ＾１
   がＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳ−ＣＯＯＨである請求項９記載
   の環状合成ペプチド。 １４、前記ｘ＾１がＮＨ＿２−ＲＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤ
   ＱＡＲＬＮＳＷＧであり、そして前記ｙ＾１がＨＴＴＶ
   ＰＷＶＮＤＳ−ＣＯＯＨである請求項９記載の環状合成
   ペプチド。１５、免疫反応性混合物であって； 下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸
   ６０４から始まり、そしてアミノ酸５８６まで戻るアミ
   ノ酸配列（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）を表わし；そして前
   記ｙはカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸
   ６１２から始まり、そしてアミノ酸６２９まで延びるア
   ミノ酸配列（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）を表わす〕で表わ
   される少なくとも１種の合成環状ペプチド及び −４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列（ｇｐ１２
   ０ＨＩＶ−１）により特徴づけられるｇｐ１２０のペプ
   チド、又は −４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列（ｇｐ１２
   ０ＨＩＶ−１）により特徴づけられるｇｐ１２０のペプ
   チド及び２１４から２６３まで延びるアミノ酸配列（Ｐ
   ２４ＨＩＶ−１）により特徴づけられるｐ２４のペプチ
   ド、又は−４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列（
   ｇｐ１２０ＨＩＶ−１）により特徴づけられるｇｐ１２
   ０のペプチド及び５８６から６２０まで延びるｇｐ４１
   ＨＩＶ−１のペプチドを含んで成る免疫反応性混合物。 １６、免疫反応性混合物であって； 下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｘ＾１はアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミ
   ノ酸５９６から始まり、そしてアミノ酸５７８まで戻る
   アミノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わし；そし
   て前記ｙ＾１はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又は
   アミノ酸６０４から始まり、そしてアミノ酸６１３まで
   延びるアミノ酸配列（ｇｐ４２−ＨＩＶ−２）を表わす
   〕で表わされる少なくとも１種の合成環状ペプチド及び −４８６から５０１まで延びるアミノ酸配列により特徴
   づけられるＥＧＰ（ＨＩＶ−２）のペプチド、又は−４
   ８６から５０８まで延びるアミノ酸配列により特徴づけ
   られるるＥＧＰ（ＨＩＶ−２）のペプチドを含んで成る
   免疫反応性混合物。 １７、請求項１３記載の１又はそれ以上の合成ペプチド
   及び請求項１６記載の１又はそれ以上の合成ペプチドか
   ら成る免疫反応性混合物。 １８、請求項１又は８記載のペプチド又はペプチド混合
   物を用いることを含んで成るＨＩＶ−１及び／又はＨＩ
   Ｖ−２に対する抗体の検出方法。 １９、前記イムノアッセイ方法がＥＬＩＳＡ、血球凝集
   反応、単一ドット又は多数ドットストリップアッセイ方
   法である請求項１８記載の方法。 ２０、免疫化学試薬が請求項１又は８記載のペプチド又
   はペプチド混合物であることを特徴とする、ＨＩＶ−１
   及び／又はＨＩＶ−２に対する抗体の検出及びＡＩＤＳ
   （後天性免疫不全症候群）、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連複合
   体）及び前−ＡＩＤＳ状態の診断のための試験キット。 ２１、請求項１又は８記載のペプチド（該ペプチドはい
   づれか適切なキャリヤーに結合されている）を用いるこ
   とによって哺乳類中においてＨＩＶ−１及び／又はＨＩ
   Ｖ−２に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体
   を産生するための免疫原。 ２２、請求項２１記載の免疫原に由来する抗体を用いて
   ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２を検出し、そして前記
   ウィルスの存在を検出するための方法。 ２３、請求項１又は８記載のペプチド（該ペプチドは生
   理学的に許容できるキャリヤーに結合されている）を用
   いて哺乳類中においてＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２
   に対する抗体の産生を誘発するためのワクチン。