FI101797B - STLV-III-virukseen liittyvät polypeptidit, diagnostiset järjestelmät j a määritysmenetelmät - Google Patents

Description

101797 STLV—IΙΙ-virukseen liittyvät polypeptidit, diagnostiset järjestelmät ja määritysmenetelmät

Oheinen keksintö kohdistuu apinavirukseen STLV—III liittyvään uuteen polypeptidiantigeeni in sekä sen käyttöön diagnostisissa järjestelmissä ja määritysmenetelmissä.

Immuunikato (AIDS) on levinnyt kaikkialle maailmassa ja se vaikuttaa olevan akuutti kansanterveydellinen ongelma, erityisesti Afrikassa. Eräs retrovirus, josta käytetään nykyään nimitystä "ihmisen immuunikadon virus, tyyppi 1" (HIV—1), mutta joka tunnettiin aikaisemmin lyhenteillä LAV, HTLV-III tai ARV, todettiin AIDS:in aiheuttajaksi eri seuduilla, joissa esiintyi tätä epidemiaa, Pöhjois—Amerikka, läntinen Eurooppa ja Keski-Afrikka mukaan lukien.

liolekyyl i tasol la toteutetut HIV-l-tutkimukset ovat paljastaneet eräitä eroja nukleoidi ketjussa Pohjois—Amerikasta ja Afrikasta eristettyjen virusten välillä. Ketjun tällaista vaihtelua esiintyy, vaikkakin vähäisemmässä määrässä, myös USA:ssa eri viru5eristeiden välillä. Kuitenkin Pöhjois-Amerikassa, Länsi-Euroopassa ja Keski-Afrikassa eristetyillä viruksilla vaikuttaa olevan samankaltaiset biologiset ominaisuudet sekä antigeeni— sesti ristireagoivat proteiinit, joilla on sama suhteellinen molekyylipaino.

HIV-l-viruksel1 a infektoituneet yksilöt kehittävät vasta-aineita viruksen oao-aeeniin koodautuneita ydinproteiineja, joista käytetään merkintää pl9 ja p24, sekä niiden esiasteproteii-nia, josta käytetään merkintää p55, vastaan. Tämän lisäksi ollaan todettu vasta-aineita env-geeni in koodautuneita kuori-osan glykoproteiineja gpl20 (solun ulkopuolinen glykoproteiini eli EGP), gp41 (transmembraaniproteiini eli TMP) sekä niiden esiasteena toimivaa glykoproteiinia, josta käytetään merkintää gpl60, vastaan.

101797 2

Suuressa osassa AIDS-poti1 ai ta havaitaan HIV-l-ydinproteiineja vastaan kohdistuvien vasta-aineiden katoamista tämän sairauden edistyneessä vaiheessa kuoriosan antigeenien kanssa immuuni -reaktiivisten vasta-aineiden säilyessä. Kuoriosan tuotteita saadaan säännöllisesti ilmaistuksi vasta-aineiden avulla potilaiden seerumista HIV— 1— infektion eri vaiheissa. Vaikka saatavilla onkin vain hyvin vähän julkaisuja HIV-l-viruksen aikaansaamasta serokonversiosta, niin kuitenkin kuoriosan proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaantumista vaikuttaa edeltävän ydinproteiineja vastaan kohdistuvien vasta-aineiden 1yhytaikainen ilmaantuminen. Katso Carlson et ai., Lancet. i:361-362 (1987). Näistä syistä env-geenin tuotteita edustavien antigeenien käyttö on ratkaisevan tärkeätä immuunikatoon liittyville retroviruksi1le altistumista diagnostoitaessa.

Koska immuunikato voi siirtyä verituotteiden mukana, niin siitä lähtien, kun tämä sairaus todettiin ensimmäisen kerran, alalla ollaan pyritty kaikin keinoin kehittämään diagnostisia kokeita tälle infektoivaile virukselle spesifisten vasta-aineiden tai antigeenien määrittämiseksi verestä. Tällä alueella tehdyt ponnistelut ovat tuottaneet tuloksia, .ia vuoden 1985 loppuun mennessä viidelle yhtiölle on annettu lupa markkinoida testejä HIV-l-virusta vastaan kohdistuvien vasta-aineiden ilmaisemiseksi. Nämä kaikki kokeet näiden vasta—aineiden ilmaisemiseksi perustuvat HIV-infektoitujen T—1ymfosyyttien viljelmistä saatujen virusproteiinien käyttöön. Näistä viljellyistä soluista ·.·.1 saatu virus hajotetaan (esimerkiksi pinta-aktiivisella aineel- • · :,V la), jolloin saadaan "virushajotteena" tunnettua nestemäistä ainetta. Tämän jälkeen tätä hajotetta (joka sisältää viruksen ja soluproteiinin monia erilaisia kappaleita) käytetään tyypillisesti immuunikokeessa kiinteänä faasina olevana komponent— tina.

* · · · • · · • · ·

Vaikuttaa siltä, että olemassa olevien kokeiden ansiosta HIV-·.’·· l-viruksen siirtyminen verituotteiden välityksellä on vähen- tynyt merkittävästi, mutta näihin virushajotteisiin perustu-viin kokeisiin liittyy kuitenkin merkittäviä haittoja, mukaan lukien väärien positiivisten tulosten suuren osuuden. Näiden 101797 3 väärien positiivisten tulosten oletetaan johtuvan osittain siitä, että virushajotepreparaateissa, joita käytetään nykyisissä kokeissa kiinteänä faasina, on läsnä muualta kuin viruksesta peräisin olevia proteiineja Väärien positiivisten tulosten osuuden vähentämiseksi alalla on alettu kehittää kohtaohjautuvia serologisia kokeita, joissa käytettävät synteettiset polypeptidit jäljittelevät virusprote-iineissa luonnollisesti esiintyviä antigeenisiä determinantteja. Esimerkiksi patenttijulkaisussa US 4 629 783, joka on myönnetty nimellä Cosand, julkaisussa Wang et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83;6159-6163 (1986) sekä julkaisussa Kennedy et ai., Science 231;1556-1559 (1986) kuvataan lukuisia poly— peptidejä, joilla näiden julkaisujen mukaan voidaan jäljitellä erilaisten HIV-l-protei inien, TliP (gp41> mukaan lukien, muodostamia antigeenisiä determinantteja. US-patenttihakemuksissa 843 437, jätetty 24. maaliskuuta 1986, sekä 25 108, jätetty 30. maaliskuuta 1987, joiden molempien hakijoina ovat Johnson & Johnson, Inc., New Brunswick, NJ, kuvataan samoin HIV-1-ΤΙΊΡ:η kaltaisia polypeptidejä. Rosen et ai. kuvasivat toisessa kansainvälisessä AIDS-konferenssissa (Second International . .·. Conference on AIDS, Pariisi, Ranska, kesäkuu 1986) edellä en- • · · simmäi seksi mainitussa hakemuksessa esitettyjen pol ypepti di en ."I kaltaisia pol ypepti de jä.

: Nykyisten menetelmien, joilla diagnostoidaan immuunikatoon *..· liittyville viruksille altistumista, toinen merkittävä haitta • · ·.·.* on se, että ne perustuvat HIV-l-viruksesta peräisin olevien antigeenien käyttöön, jolloin näistä menetelmistä saadaan vääriä negatiivisia tuloksia niiden yksilöiden tapauksessa, jotka yksilöt ovat olleet altiina AIDSiiin liittyville länsiafrikka-laisille, anti geeni sesti erilaisille retroviruksille, joista • » « m»m»m käytetään ohessa merkintää HIV tyyppi 2 (HIV—2) . Enemmän kuin • · · V. 20 HIV-2-eristettä ollaan saatu immuunikadosta ja samankaltai- \ *: sista tiloista kärsivistä potilaista, jotka ovat pääasiassa länsiafrikkalaisia, mutta joukossa on myös muutama eurooppalai-nen. Näin ollen alalla tarvitaan HIV—2—spesifinen määritys— . menetelmä luovutetun veren seulontaa ja HIV—2-infektion diag— 101797 4 nostointia varten. Bruin-Vezinet, Lancet. 1_; 128-132 (1987).

HIV-2 on rakenteellisesti, biologisesti ja antigeenisesti sa-mankal täinen kuin HIV-l-virus ja apinan T-lym-fotroo-finen virus, tyyppi III, joka on eristetty makaakkiapinoista (STLV-IIIffl.c). ja joka virus aiheuttaa immuunikadon kaltaista tautia apinaisännässään. Nämä kaikki virukset vaikuttavat sisältävän EMP- ja TMP-proteiineja, joita muodostuu esiasteproteiinin pilkkoutuessa. Kunkin näiden proteiinin ilmeinen molekyylipaino vaihtelee HIV-1-, HIV-2- ja STLV-III-viruksen välillä, ja tämä on näin ollen eräs piirre, jota voidaan käyttää näiden virusten erottamiseen toisistaan. Esimerkiksi viruksista HIV-1, HIV-2 ja STLV-I 11 «.«e peräisin olevien TMP-polypeptidien ilmeinen molekyylipaino on vastaavasti 41, 36 ja 32.

Kukin virus HIV-1, HIV-2 ja STLV-IIIm«= on myös sytopatogeeni-nen CD4(T4)-anti geeni π (T4-1ymfosyyttejä) käsittävissä soluissa ja trooppinen tällaisille soluille. Tämän lisäksi kaikilla näillä kolmella viruksella on antigeenisesti ristireaktiivisia ydinproteiineja. Daniel et ai., Science. 228;1201—04 (1985); Bruin-Vezinet et el., edellä. Vaikka virusten HIV-2 ja STLV-. Uimme kuoriosan proteiinit, TMPst mukaan lukien, ovatkin anti- ·.._ geenisesti r i st i reakt i i vi si a, niin niillä kummallakaan ei näytä !'! olevan yhteisiä antigeenisiä determinantteja HIV—1 TMP:n kans- t' ; sa. Clavel et ai., Science. 233;343-346 (1986).

» · ·

» I

• · • · · STLV-I I Im«=—vi ruksen env-geenin DNA-ketjua ei olla julkaistu, • · kun taas julkaisussa Guyader et ai., Nature. 326; 662-669 (1987) esitetään sekä HIV-2 env-geenin DNA-ketju että siitä päätelty, tähän geeeniin koodautuneiden proteiinituotteiden aminohappo-jäännösten ketju. Kun Guyader et ai. vertasivat toisiinsa HIV-1- ja HI V-2-vi rusten EGP-protei ineja, he totesivat ne • · · "hyvin etäisesti toistensa kaltaisiksi", koska niiden amino— • · · *.*. happojäännösten ketjussa homologisuus oli vain 44,8 Samoin ·. ·· homologisuus HIV-1- ja HIV—2—vi ruksi ssa esiintyvän TMP-prote- • f >·* iinin aminohappojäännösten ketjussa oli vain 44,8 %. Kuitenkin edes tällaisen homologi an saavuttamiseksi tutkijoiden Guyader t ’ et ai. oli sijoitettava suuria istutteita aminohappojäännösten • · 5 101797 ketjuun erityisesti verrattaessa toisiinsa EGP-proteiineja, joissa ainoastaan lyhyet, toisistaan kaukana sijaitsevat do-meenit ovat säilyneet HIV-1- ja HIV-2-virusten välillä.

Guyader et ai. ovat esittäneet samoin, että HIV—lsn kuoriosan proteiineissa esiintyvistä 23 kysteiinijäännöksestä 22 jäännöksen voidaan katsoa vastaavan vastaavissa HIV—2—proteiineissa todettuja kysteiinijäännöksiä. HIV-2-proteiinien todettiin kuitenkin sisältävän lisäksi seitsemän muuta kysteiinijäännöstä, jotka sijaitsivat pääasiassa HIV-l:n suhteen istutteita edustavissa alueissa. Tämän perusteella vedettiin se johtopäätös, että "HIV-2 EGP—proteiinin laskostuminen voi olla erilainen HIV-l:een verrattuna, ja näin ollen jotkut alueet voivat olla paljaana eri tavalla". Julkaisussa ei esitetä yhtään syytä, joka osoittaisi, ettei samanlainen johtopäätös päde HIV-1-ja HIV-2-virusten TMP-proteiinei1le.

Julkaisussa Hirsch et ai., Cel1. 49:307-319 (1987) esitetään STLV-III-viruksen (STLV-III.em>, joka on eristetty afrikkalaisista vihreistä marakateista, perimän nukleotidi ketju. Tämän julkaisun Hirsch et ai. mukaisesti STLV-III«„m TMP on 140 ami-. .·, nohappoa lyhyempi kuin HIV-l-TMP, ja se vaikuttaa sisältävän 1!! vähemmän mahdollisia glykosylaatiokohtia. Julkaisussa Hirsch ♦ · et ai. esitetään kuitenkin samanaikaisesti, että virusten STLV— * < III.am ja HIV-1 TMP-protei i ni t vastaavat suhteellisen hyvin ! aminohappoketjultaan toisiaan, 49 prosentin aminohapoista oi — • · ·,·,· lessa samoja ja 32 '/. edustaessa ominaisuudet säilyttäviä ("kon- • · ϊ servati i visia") substi tutioi ta.

Lopuksi, julkaisun Hirsch et ai. mukaisesti, sen puitteissa tutkittu STLV-III.am_eriste oli käytännöllisesti katsoen DNA-hybridi saati on perusteella identtinen erään STLV-I I Im.c-eri s- *·* * . . teen kanssa, mutta se voitiin erottaa helposti restriktiokoh- • i « ? • · · tien kartoituksen avulla toisesta STLV-IIIm.e-eristeestä. Näin '/·· ollen virusten STLV-I 11«,««=, STLV-III.em ja HIV-1 välistä yhtä- ' it’ Iäisyyttä ei tunneta tällä hetkellä hyvin.

• · i * »

> ' > I

e 101797 6

Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan kohtaohjautuvat serologiset reagenssit, määritysmenetelmät ja diagnoosipakkaukset, joita voidaan käyttää immuunikatoon (AIDS) liittyville länsiafrik-kalaisille retroviruksille (HIV-2- ja STLV-III-retroviruksille) altistumisen diagnostointiin. Toisin sanoen, oheisessa keksinnössä saadaan aikaan STLV-III-virukseen liittyvä polypeptidi, joka ristireagoi immunologisesta ihmisissä HIV-2- infektioiden indusoimien vasta-aineiden kanssa.

Näin ollen, oheinen keksintö kohdistuu STLV-III-virukseen liittyvään polypeptidiin, jonka määritellään koostuvan olennaisesti sellaisesta polypeptidistä, joka 1) sisältää kaavan: -CAFRQVC- mukaisen aminohappojäännösten ketjun, 2) sisältää korkeintaan noin 50 aminohappojäännöstä, ja 3) kykenee immuunireagoimaan HIV-2-retroviruksen indusoi mien vasta-aineiden kanssa.

STLV-III-virukseen liittyvä polypeptidi sisältää edullisesti korkeintaan 33 aminohappojäännöstä ja sen ketju on homologinen kuviossa 1 esitetyn ketjun osan kanssa. Keksinnön oleelliset . tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

• · · • · • · .v. Keksinnön kohteena on myös menetelmä anti-HIV-2-vasta-aineiden • · . .·. läsnäolon määrittämiseksi ruumiinnesteestä otetusta näytteestä.

Tässä menetelmässä muodostetaan immuunireagoiva seos sekoitta- • « · \\ maila määritettävään näytteeseen oheisen keksinnön mukaista, * * STLV-III-virukseen liittyvää polypeptidiä. Tämän jälkeen seosta säilytetään niin pitkän ajanjakson ajan, että näytteessä mah- • · • '* dollisesti läsnäolevat anti-HIV-2 vasta-aineet ehtivät immuuni- *«» ·.* * reagoida STLV-III-virukseen liittyvän polypeptidiantigeenin . kanssa polypeptidiä sisältävän immuunireaktion tuotteen muodos- • · · .*··. taen. Mahdollisen, tällöin muodostuneen, polypeptidiä sisältä- *’ vän immuunireaktion tuotteen läsnäolon määrittäminen tuottaa • · · ···! mitan anti-HIV-2 vasta-aineiden läsnäolosta näytteessä.

• · « « « • «« • ·

Oheinen keksintö kohdistuu edelleen reagenssipakkauksena olevaan diagnoosijärjestelmään, jota voidaan käyttää keksinnön kohteena olevien määritysmenetelmien toteuttamiseen. Tämä jär- 101797 7 jestelmä käsittää pakkauksen, joka sisältää oheisen keksinnön mukaista, STLV-III-virukseen liittyvää polypeptidiä sellaisen määrän, joka riittää vähintään yhden määrityksen toteuttamiseen .

Tämä diagnostinen järjestelmä sisältää lisäksi joko HIV—1—kaltaista di-cys—polypeptidiä tai HIV—1—kaltaista di—leu—polypep-tidiä tai kumpaakin niistä määränä, joka riittää vähintään yhteen kokeeseen HIV—1—virusta vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon määrittämiseksi. Reagenssipakkaus sisältää edullisesti molempia HIV—1—kaitäisiä di—cys— ja di-leu-poly-peptidejä toisiinsa sekoitettuna. Eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa reagenssi pakkaukseen on sisällytetty STLV— III-kaltäistä, HIV-l-kaltäistä di-cys-polypeptidiä ja IV-1-kaltaista di—leu-polypeptidiä toisiinsa sekoitettuna. Kaikkein edullisimpia ovat reagenssipakkaukset, joihin sisällytetyt STLV-III-kaltai set ja HIV—1—kai taiset polypeptidit, jotka ovat joko toisistaan erillään tai toisiinsa sekoitettuna, on kiinnitetty toimivasti kiinteään matriisiin tällä tavalla kiinteän kantajan muodostaen.

Näin ollen oheisella keksinnöllä on lukuisia etuja ja ansioita. Eräänä tämän keksinnön mukaisten diagnostisten järjestelmien !*! ja menetelmien etuna on se, että niiden avulla ruumiinnestees tä, kuten veri tuotteesta, voidaan määrittää altistuminen im— ·· : muuni katoon liittyvän viruksen molemmille tällä hetkellä tun- netuille tyypeille. Lisäksi, koska oheisessa keksinnössä saa- « · ·.·.· daan aikaan immunologiset kohtaspesifiset diagnostiset reagens— sit, niin altistuminen HIV-1—viruksel1 e saadaan edullisesti erotetuksi HIV-2—virukselle altistumisesta.

Oheisen keksinnön muuna etuna on se, että keksinnön kohteena • * · oleva järjestelmä ja menetelmät, joilla voidaan diagnostoida • · * altistuminen molemmille immuunikatoa aiheuttaville HIV—1— ja HIV-2-viruksi 1le, voidaan valmistaa mahdollisesti injektoivaa geneettistä materiaalia tuottamatta ja näin ollen ilman tähän tuotantoon liittyviä vaikeuksia, toisin kuin siinä tapauksessa, ____; että antigeeninä käytetään virushajotetta.

« · 101797 8

Piirustuksissa, Jotka ovat osa tähän keksintöön liittyvästä Julkaisusta:

Kuvio 1 esittää osaa STLV-IIImee: TMP-proteiinin aminohappojään-nösten ketjusta. Tämä ketju esitetään vasemmalta oikealle, aminopäätteestä karboksipäätteeseen käyttäen yksikirjaimisia tunnisteita. Jäännösten asemat on numeroitu numeroilla 1 -33, kuten kuviossa esitetään.

Kuvio 2 esittää kuviossa 1 esitetyn kaltaisesti osaa HIV-1 TMP-proteiinin aminohappojäännösten ketjusta, ja se edustaa gp41:n aminohappojäännöksiä 589 — 610, jotka kuvataan julkaisussa Ratner et ai., Nature. 313:277-283 (19B5). Kuitenkin tarkastelun helpottamiseksi näiden jäännösten asemat on numeroitu uudestaan esitetyllä tavalla numeroilla 1 - 32.

Kuvio 3 käsittää kaksi osaa, jotka havainnollistavat vasta-aineiden määrittämistä keksinnön mukaista diagnostista järjestelmää käyttäen (a) Ginea-Bissaun asukkaista saadusta 20 seeruminäytteestä, joilla henkilöillä oli aikaisemmin todettu vasta-aineita HI V—kai tai si a viruksia vastaan (1 änsi a-f r i kkal ai set) , (b) HIV-l-infektoiduista henkilöistä saadusta 20 seeruminäyt-. .·. teestä sekä (c) verenluovuttajilta saaduista 20 seeruminäyt— .···_ teestä, joilla luovuttaji 1 la ei esiintynyt vasta-aineita HIV- 1- tai HIV-2-viruksia vastaan. Seeruminäytteitä pidettiin positiivisina (umpinaiset symbolit), kun niiden tuottamat optisen ·;· tiheyden (OD) arvot olivat yli 0,150 (negatiivisten näytteiden 0D-keskiarvo plus 6 standardipoi kkeamaa) . Avoimet symbolit ·.·.· edustavat negatiivisia seerumeita.

Kuvio 3A esittää tuloksia, jotka saatiin käyttäen kiinteätä kantajaa, jossa kohdeantigeeninä oli olennaisesti vain STLV-111-kal tai sta polypeptidiä p80.

• · • · · t · · • · • · Kuvio 3B esittää tuloksia, jotka saatiin käyttäen kiinteätä • « • · · *. '! kantajaa, jossa kohdeanti geeninä oli olennaisesti HIV—1—kai— täisten polypeptidien (III) ja (IV) yhdistelmä.

• · ____: Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 101797 9 Määritelmiä

Aminohappo; Kaikki ohessa tunnistetut aminohappo.!äännökset ovat luonnollisessa L-kon-f i guraatiossa. Ohessa noudatetaan polypeptidien vakiintunutta nimistöä [J. Biol Chem.. 245;5557-59 (1969)3, ja aminohappojäännösten lyhenteet esitetään seuraa-vassa vastaavuustaulukossa:

Vastaavuustaul ukko

SYMBOLI

1-kirjaiminen 5-kirjaminen AMINOHAPPO

Y Tyr L—tyrosiini G Gly glysiini F Phe L—fenyylialaniini M Met L—metioniini A Ala L—ai aniini S Ser L—seriini I Ile L—isoleusiini L Leu L-leusiini T Thr L-treoniini V Vai L—väliini : ‘ P Pro L—proliini K Lys L—lysiini H His L-histidiini Q Gin L-glutamiini E Glu L-gl utaamihappo l * W Try L—trypto-faani

III

*·’·* R Arg L—arginiini D Asp L-aspartiinihappo N Asn L-asparagiini C Cys L-kysteiini • ·· • · » ___ —______„___ _ | --- ---- --- . ,--,·___, ________

• I I

• · · • » · » · .* I Huomautettakoon, että kaikki aminohappojäännösten ketjut esite- • · · tään ohessa kaavoilla, joiden suunta vasemmalta oikealle on *· ·* perinteinen suunta aminopäätteestä karboksipäätteeseen. Edel- ]’ leen huomautettakoon, että aminohappojäännösten ketjun alussa 101797 10 tai lopussa oleva yhdysviiva tarkoittaa sidosta yhden tai useamman aminohappojäännöksen käsittävään muuhun ketjuun siten, että polypeptidiketjussa on yhteensä korkeintaan noin 50 jäännöstä.

Polypeptidi ja peptidi: Polypeptidi ja peptidi ovat käsitteitä, joita käytetään ohessa synonyymeinä, ja niillä tarkoitetaan korkeintaan noin 50 aminohappojäännöksen suoraketjuista sarjaa, jossa jäännökset ovat kytkeytyneet toisiinsa vierekkäisten jäännösten al-fa-aminoryhmän ja karboksiryhmän välisellä peptidi si doksella.

Protei i ni: Ohessa käytetyllä käsitteellä proteiini tarkoitetaan useamman kuin 50 aminohappojäännöksen suoraketjuista sarjaa, jossa aminohappojäännökset ovat kytkeytyneet toisiinsa samalla tavalla kuin polypeptidissä.

Kaikkien ohessa kuvattujen polypeptidien tunnusomaisena piir— teenä on se, että ne sisältävät erityisen aminohappojäännösten ketjun, koska kussakin tapauksessa tämän erityisen ketjun on todettu kykenevän jäljittelemään immunologisesti lineaarista . .·. tai jatkuvaa antigeenistä determinanttia.

Tämän lisäksi kaikki oheisen keksinnön mukaiset pol ypepti di t / ; sisältävät korkeintaan noin 50, tavallisesti vähemmän kuin ··· " noin 35 ja edullisesti vähemmän kuin noin 25 aminohappojään— *.*.* nöstä. Keksinnön kohteena olevien polypeptidien käsittämien • · ·.·.· ami nohappojäännösten lukumäärän ylärajalle asetettu vaatimus määräytyy immunologisen kohtaspesi-fisyyden toivotun määrän mukaan, siitä suoraan riippuen, ja kuten alalla hyvin tunnetaan, siitä ei ilmene muiden jäännösten kuin erityisesti määri— tellyn ketjun tarve määrätyn lineaarisen, ohessa käyttökel — poisen antigeenisen determinantin muodostamiseksi. Täten vaikka i · · '· · ylimääräiset aminohappojäännökset, jotka muodostavat erityi — • · ·. *: sesti määriteltyä ketjua reunustavan ketjun, pienentävätkin • · · tyypillisesti kohtaspesi f isyyttä, koska ne saavat aikaan kyvyn muodostaa muita lineaarisia antigeenisiä determinantteja, niin tällaiset ylimääräiset ketjut eivät kuitenkaan estä toivotun 101797 11 lineaarisen, oheisessa keksinnössä käyttökelpoisen antigeenisen determinantin muodostumista.

Oheisen keksinnön mukaiset peptidit sisältävät vähintään yhden kysteiinijäännöksen ja tietyissä tapauksissa kaksi tällaista jäännöstä. Näin ollen keksinnön kohteena olevat peptidit voivat esiintyä eri tavoin hapettuneissa muodoissa. Monomeerisen muodon, johon kystei ini jäännöksen (-jäännösten) sul-fhydryyl iryhmä on pelkistynyt, lisäksi myös dimeerisiä tai polymeerisiä muotoja voi esiintyä, joissa muodoissa kahteen tai useampaan pep-tidimolekyyliin kuuluvat sul-fhydryyliryhmät hapettuvat ja muodostavat peptidien välisiä ja peptidien sisäisiä disulfidi— sidoksia. Keksinnön kohteena olevat, vain yhden kysteiinijäännöksen käsittävät peptidit voivat muodostaa ainoastaan lineaarisia dimeerejä, kun taas kaksi kysteiinijäännöstä käsittävät peptidit voivat muodostaa syklisiä monomeereja tai lineaarisia tai syklisiä dimeerejä sekä eri pituisia lineaarisia polymeerejä. Nämä eri tavoin hapettuneet muodot katsotaan osaksi oheista keksintöä ja ne sisältyvät käsitteisiin "polypeptidi" ja "peptidi".

. .·. Oheisen keksinnön mukainen polypeptidi voidaan syntetoida millä • '•a tahansa pol ypepti di ai an asiantuntijan tuntemalla tekniikalla, » « mukaan lukien yhdistelmä-DNA-tekni i kat. Synteesi kemian tarjoa-mat tekniikat, kuten kiinteään faasiin perustuva, Merrifield- ·'·' ·' tyyppinen synteesi, ovat edullisia puhtauteen, antigeeniseen « · 11« *.·.* spesifisyyteen, epätoivottujen sivutuotteiden puuttumiseen, • · *.ϊ.· tuotannon helppouteen ja muihin vastaaviin tekijöihin liitty vistä syistä. Erinomainen yhteenveto monista käytettävissä olevista tekniikoista on löydettävissä teoksista J.M. Steward ja J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis'1, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, et al., "Peptide Syn- • · * thesis", John Wiley & Sons, toinen laitos, 1976; sekä J. Meien— ♦ · · *.*. hofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, sivu 46, Aca- :.'·ί demic Press (New York), 1983, kiinteään faasiin perustuvan :it>* peptidisynteesin tapauksessa ja teoksesta K. Kubke, "The Pep— » · .:, tides", voi. 1, Academic Press (New York), 1965, perinteisten, \ liuoksessa toteutettavien synteesien tapauksessa, jotka kaikki 1C 1797 12 tekniikat liitetään oheen tällä viittauksella. Näissä synteesimenetelmissä käyttökelpoisia sopivia suojäävia ryhmiä on kuvattu edellä mainituissa Julkaisuissa sekä teoksessa J.F.W. Mc-Omie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, Joka liitetään oheen tällä viittauksel1 a.

Yleisesti näissä menetelmissä yksi tai useampi aminohappoJäännös tai sopivasti suojattu aminohappojäännös lisätään peräjälkeen kasvavaan peptidi ketjuun. Normaalisti Joko ensimmäisen aminohappojäännöksen amino- tai karboksyyliryhmä suojataan sopivalla, selektiivisesti poistettavissa olevalla suojaavalla ryhmällä. Erilaista, selektiivisesti poistettavissa olevaa suojaavaa ryhmää käytetään reaktiivisen sivuryhmän sisältävien aminohappojen, kuten lysiinin, tapauksessa.

Esimerkkinä esitettävässä, kiinteään faasiin perustuvassa synteesissä suojattu tai Johdannaisekseen muutettu aminohappo kiinnitetään inerttiin kiinteään kantajaan suojaamattomasta karboksyyli- tai aminoryhmästä. Tämän Jälkeen amino- tai kar— boksyvliryhmää suojaava ryhmä poistetaan selektiivisesti ja sitten ketjun seuraava, sopivasti suojatun täydentävän (amino-, tai karboksyyl i-) ryhmän käsittävä aminohappo sekoitetaan kiin- ,···, teään kantajaan jo kiinnitettyyn jäännökseen ja saatetaan rea-

* I

!'! goimaan sen kanssa ami di sidoksen muodostumiseen sopivissa olo— ; suhteissa. Tämän jälkeen amino- tai karboksyyliryhmää suojaava ·'· 1 ryhmä poistetaan tästä juuri lisätystä aminohappojäännöksestä, *·*·' Ja sitten lisätään seuraava, sopivasti suojattu aminohappo, • « ·,·.* ja niin edelleen. Sen jälkeen, kun kaikki toivotut aminohapot on kytketty asianmukaiseksi ketjuksi, mahdollisesti jäljellä olevat päätteitä ja sivuryhmiä suojaavat ryhmät (ja kiinteä kantaja) poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti lopullisen polypeptidin saamiseksi.

t · » · · • · · • · * « Keksinnön mukainen STLV—111—kai täinen polypeptidi sisältää • · • « . vähintään 7, edullisesti vähintään 12 aminohappo jäännöstä ja • » · ·,,,· se käsittää kaavan: —CAFRQVC— : mukaisen aminohappojäännösten ketjun. Tämän lisäksi keksinnön 101797 13 mukainen STLV-III-kaltäinen polypeptidi on tunnettu kyvystään immuunireagoida HIV—2 TMP:n indusoimien vasta—aineiden kanssa ja edullisesti indusoida vasta-ainemolekyylejä, jotka immuuni-reagoivat luonnollisen HIV-2-viruksen kanssa.

Edulliset STLV—III-kaltäiset polypeptidit sisältävät korkeintaan 33 aminohappojäännöstä, niiden aminohappojäännösten ketjun osana on ketju -CAFRQVC- ja ne ovat homologisia, edullisesti ilman istutteita tai häviämiä, ja edullisemmin identtisiä kuviossa 1 esitetyn ketjun osan kanssa. Näin ollen edulliset STLV-III-kaltäiset polypeptidit ovat yhdisteitä, jotka koostuvat olennaisesti vähintään 7 aminohappojäännöksestä ja korkeintaan 50 aminohappojäännöksestä. Kuviosta 1 voidaan nähdä, että ketju -CAFRQVC- vastaa järjestykseltään, vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karboksipäätteeseen, asemia 17 — 23 kuviossa 1 esitetyssä aminohappojäännösten ketjussa. Täten edullinen polypeptidi voi käsittää aminopäätteessään O - 16 tähän päätteeseen rajoittuvaa aminohappojäännöstä kuvion 1 mukaisesti asemissa 1 - 16, ja se voi käsittää karboksipäätteessään O -10 tähän päätteeseen rajoittuvaa aminohappojäännöstä kuvion 1 mukaisesti asemissa 24 - 33.

Toisin sanoen, edulliset, oheisen keksinnön mukaiset STLV-III- ♦ » · kaltaiset polypeptidit ovat yhdisteitä, joita määrittää seuraa- * * « • van kaavan mukaisen aminohappojäännösten ketju: —BAFRQVB* -; •; missä B valitaan aminohappojäännösten seuraavista ketjuista: :··*·: AIEKYLEDQAQLNAWGC, IEKYLEDQAQLNAWGC, EKYLEDQAQLNAWGC, KYLEDQAQLNAWGC, :T: YLEDQAQLNAWGC, LEDQAQLNAWGC, • · ♦ * EDQAQLNAWGC, DQAQLNAWGC, :····' QAQLNAWGC, • · AQLNAWGC, ··. : QLNAWGC, 101797 14 LNAWGC, NAWGC, AWGC, WGC, GC, ja C; ja jossa B' valitaan aminohappojäännösten seuraavista ketjuista: CHTTAVPWPNAS, CHTTAVPWPNA, CHTTAVPWPN, CHTTAVPWP, CHTTAVPW, CHTTAVP, CHTTAV, CHTTA, CHTT, CHT, CH, ja C.

Edullisimmissa suoritusmuodoissa oheisen keksinnön mukainen STLV-III-kaltainen polypeptidi käsittää aminohappo jäännösten ketjun, jolla on kaava: :Y: -AWGCAFRQVC-.

1 · I

i i < • 4 « «

Oheisen keksinnön mukainen STLV-III-kaltainen polypeptidi kä-

« I I

•I' sittää kaikkein edullisimmin aminohappojäännösten ketjun, joka * * valitaan seuraavien ketjujen muodostamasta ryhmästä: -AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC-, • * * * - AWCAFRQVCHTTVPWPNAS - , • « » : -AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC-, : -avekylkdqaqlnawgcafrqvc-, .·**. -AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC- , • · *: ’ -SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT-, • · ·: ’ -AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS-, :. ‘ · ί -AWGCAFRQVCHITVPWPNAS- j a -CAFRQVC-.

101797 15

Kaikkein edullisimpiin spesifisiin, STLV-IIl-kaltaisiin poly-peptideihin kuuluvat yhdisteet, joiden aminohappojäännösten ketju esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1

Nimitys Aminohappo!äännösten ketiu

p80 AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC

p81 AWCAFRQVCHTTVPWPNAS

p82 AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC

p 8 3 AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC

p84 AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC

p85 SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT

p86 AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS

p87 AWGCAFRQVCHITVPWPNAS ja

p88 CAFRQVC

Tulee ymmärtää, ettei oheisen keksinnön mukaisen polypeptidin tarvitse olla identtinen STLV-III TMP-proteiinin (gp32) aminohappo jäännös ten ketjun kanssa, kunhan vain keksinnön kohteena olevat polypeptidit käsittävät vaaditun ketjun ja kykenevät immuunireagoimaan HIV-2 TMP:n indusoimien vasta-aineiden kans-:t>fJ sa. Näin ollen oheisessa STLV-III-kaltaisessa polypeptidissä voi esiintyä erilaista vaihtelua, kuten istutteita ja häviämiä.

/ I

; Esimerkiksi kuvion 1 asemassa 16 sijaitseva glysiinijäännös on hävinnyt polypeptideistä p80 ja p81.

• I

% · · * « ·

Mahdollista on myös yhden aminohapon ominaisuudet säilyttävä .. tai ominaisuuksia muuttava korvautuminen toisella, missä täl- laiset muutokset saavat aikaan tiettyjä etuja polypeptidin käy- » · ' *·’ ’ tössä. Ominaisuudet säilyttävä (konservatiivinen) korvautuminen : ·*; on tapahtuma, jossa yksi aminohappojäännös korvautuu toisella, • · * biologisesti samankaltaisella jäännöksellä. Esimerkkeinä omi- 4 · · *, naisuudet säilyttävistä korvauksista voidaan mainita hydrofo- bisen jäännöksen, kuten isoleusiinin, valiinin, leusiinin tai < I ( '· "· metioniinin, korvautuminen toisella hydrofobisella jäännök sellä, tai yhden polaarisen jäännöksen korvautuminen 16 A n a '7 r·r7

Ib 1/ W

toisella polaarisella Jäännöksellä, kuten arginiinin Ja lysii— nin välinen korvautuminen, glutaamihapon Ja asparagiinihapon välinen korvautuminen tai gl iltamiini n Ja asparagiinin välinen korvautuminen Ja muut vastaavat. Käsite "ominaisuudet säilyttävä korvautuminen" kattaa myös substituoituneen aminohapon käytön substituoitumattoman alkuperäisen aminohapon sijasta edellyttäen, että tällaisella polypeptidi 11ä on myös vaadittavaa sitovaa aktiivisuutta.

Kun oheisen keksinnön mukaisen polypeptidin ketju ei ole samanlainen kuin luonnollisen, STLV-III-kaltai sen TMP:n ketju yhden tai useamman, ominaisuudet säilyttävän tai sai 1yttämättömän substitution seurauksena, niin tällöin tavallisesti korkeintaan noin 30 prosenttia, tavallisemmin korkeintaan 20 prosenttia ja edullisesti korkeintaan 10 prosenttia aminohappojäännök-sistä, niiden lukumäärästä laskien, on korvautunut paitsi milloin ylimääräisiä jäännöksiä on lisätty jompaan kumpaan päätteeseen "kytkijän" aikaansaamiseksi, jonka kytkijän avulla tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan kiinnittää tarkoituksenmukaisesti merkkiaineeseen tai kiinteään matriisiin tai kantajaan. Merkkiaineita, kiinteitä matriiseja ja kantajia, joita voidaan käyttää yhdessä tämän keksinnön mukaisten poly— peptidien kanssa, kuvataan jäljempänä.

Aminohappo jäännöksistä muodostuvat kytkijät käsittävät vähin-·.· · tään yhden jäännöksen ja niissä voi olla 40 tai sitäkin useam— ::: pia jäännöksiä, tavallisemmin 1—10 jäännöstä. Tyypillisiä, kytkemiseen käytettyjä aminohappojäännöksiä ovat tyrosiini, kysteiini, lysiini, glutaami- ja aspartiinihappo tai muut vastaavat. Lisäksi keksinnön mukainen polypeptidi ketju voi erota luonnollisesta ketjusta siten, että ketjua on muokattu asyloi— ... maila päättävä NH*—ryhmä, esimerkiksi asetyloimalla se tai • · « ♦ · · * , amidoimalla se tioglykolihapolla, päättävällä karboksyyliami— • · · *·*·] daatiolla, esimerkiksi ammoniakilla, metyyliamiini 1 la ja muilla :*·.· vastaavilla.

V Kun oheisen keksinnön mukainen, STLV—III—kaltainen polypeptidi ·· yhdistetään kantajaan kytkijän avulla alalla kantajan ja hap— 101797 17 teenin välisenä konjugaaattina tunnetun muodosteen aikaansaamiseksi, niin tällöin tämä polypeptidi kykenee indusoimaan HIV-2 ΤΜΡϊπ kanssa immuunireagoivia -vasta-aineita. Immunologisen rrs-tireaktiivisuuden hyvin vakiintunut periaate huomioon ottaen oheinen keksintö kohdistuu näin ollen taulukossa 1 esitettyjen polypeptidien antigeenisesti samankaltaisiin muunnoksiin. "An-tigeenisesti samankaltainen muunnos" on polypeptidi, joka sisältää korkeintaan noin 50 aminohappojäännöstä, käsittää aminohappo jäännösten ketjun -CAFRQVC- ja kykenee indusoimaan vasta-ainemolekyylejä, jotka immuunireagoivat taulukossa 1 esitettyjen polypeptidien ja HIV-2 TMP:n kanssa.

Eräässä suoritusmuodossa oheisen keksinnön mukainen, HIV-1-kaltainen di-cys-polypeptidi sisältää vähintään 7, edullisesti vähintään 12, aminohappojäännöstä ja käsittää aminohappojäännösten ketjun, jolla on kaava: —CS6KLIC—.

Tämän lisäksi nämä polypeptidit kykenevät jäljittelemään HIV—1 TMP-proteiinin immunologisia ominaisuuksia, mukaan lukien kyvyn 1) immuunireagoida luonnollisen HIV-1—viruksen indusoimien vasta-aineiden kanssa ja 2) indusoida luonnollisen HIV-l-viruksen kanssa immuuni reagoi via vasta-aineita.

Edulliset HIV-l-kaltaiset di-cys-polypeptidit sisältävät korkeintaan 32 aminohappojäännöstä, käsittävät ketjunsa osana | ketjun -CSGKLIC- ja ovat homologisia, edullisesti ilman istut- : : : teitä tai häviämiä, kuviossa 2 esitetyn ketjun osan kanssa.

:V: Toisin sanoen, edullinen HIV-l-kaltäinen di-cys-polypeptidi vastaa ketjultaan kuviossa 2 esitettyä ketjua asemasta 17 asemaan 23 ja käsittää aminopäätteessään lineaarisen, aminopäät— teeseen rajoittuvan, 1-16 aminohappojäännöstä käsittävän ... ketjun, jonka järjestys esitetään kuviossa 2 asemina 1 - 16.

* , Tämän lisäksi tämä polypeptidi käsittää karboksipäätteessään * · « ’·*·] lineaarisen, karboksi päätteeseen rajoittuvan, 1-9 aminohappo- jäännöstä käsittävän ketjun, jonka järjestys esitetään kuviossa ; 1 asemina 24 - 32.

Toinen tapa määritellä keksinnön mukaiset, edulliset, HIV-1- ιβ 101797 kaltaiset di—cys—polypeptidit on se, että ne käsittävät aminohappojäännösten ketjun, jolla on kaava: —JSGCLIJ’—; missä J valitaan seuraavista aminohappojäännösten ketjuista: AVERYLKDQQLLGIWGC, VERYLKDQQLLGIWGC, ERYLKDQQLLGIWGC, RYLKDQQLLGIWGC , YLKDQQLLGIWGC, LKDQQLLGIWGC, KDQQLLGIWGC, DQQLLGIWGC, QQLLGIWGC, QLLGIWGC, LLGIWGC, LGIWGC, GIWGC, IWGC, WGC, GC ja C ja missä J’ valitaan seuraavista aminohappojäännösten ketjuista: CTT AVPWNAS, CTTAVPWNA, CTTAVPWN, jCTTAVPW, :V: cttavp, • · ::: cttav, CTT A, CTT, CT ja • tl C.

• · · '* J on edullisesti IMGC.

• · • · · • · · • ·

Edullisia HIV-l-kal tai si a di-cys-polypeptidejä ovat esimerkiksi . ne, joiden aminohappojäännösten ketju on esitetty taulukossa V 2.

101797 19

Taulukko 2 Kaavan merkintä Aminohappojäännösten ketju

(I) CSGKLIC

(II) IWGCSGKLICTTAVP

(III) IWGCSGKLICTTAVPWNAS

(V) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS

(VII) LLGIWGCSGKLIC

(VIII) QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS

(IX) IWGCSGKLICTTAVPWN

(X) CSGKLICTTAVPWNAS

(XII) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC

(XIII) GCSGKLICTTAVPWN

Oheisessa keksinnössä tarkastellaan lisäksi sitä havaintoa, että HIV-l-virusta torjuvien vasta—aineiden havaitseminen immunologisissa kokeissa paranee merkittävästi, mikäli edellä kuvattuja HIV-l-kaltai si a di-cys-polypeptidejä käytetään yhdessä toisen HIV-l-kaltai sen polypeptidin, jota kutsutaan di-1eu-polypeptidiksi, kanssa.

HIV-l-kaltai set di—1eu-polypeptidit koostuvat olennaisesti vähintään 15 aminohappojäännöksestä, ja ne sisältävät amino— happojäännösten ketjun, jolla on kaava: • j| —ZLLG(X)WZ’ —, : : : missä X valitaan jäännösten I, L, li tai F muodostamasta ryh- mästä; • · missä Z valitaan aminohappojäännösten ketjusta, joka sijaitsee HIV-l-viruksen gp41-proteiinissa välittömästi L-leusiinijäännöksen, joka sijaitsee gp41-proteiinin asemassa 599, vieressä, ... ami nopäät teen puolella (kuviossa 2 ami nohappo jäännös 11); • · · • · · *t missä Z’ valitaan aminohappojäännösten ketjusta, joka sijaitsee » · · *-*·" HIV-l-viruksen gp41-protei inissa välittömästi L—tryptof aani — :*·„· jäännöksen, joka sijaitsee gp41-proteiinin asemassa 603, vie- ressä, karboksipäätteen puolella (kuviossa 2 aminohappojäännös 15); ja · missä jomman kumman ketjuista pituus voi olla O jäännöstä ja « · 20 101797 missä Z ja Z’ yhdessä käsittävät vähintään 10 jäännöstä.

Edulliset HIV-l-kaltai set di-1eu-polypeptidit sisältävät kor— keintaan 32 aminohappojäännöstä, näiden polypeptidien ketjun osana on ketju, jolla on kaava: -ZLLG(X)WZ’—, ja ne ovat, paitsi silloin kun X on muu kuin I, homologisia kuviossa 2 esitetyn ketjun osalle. Näin ollen edullisissa suoritusmuodoissa Z on lineaarinen, viereinen, 1-10 aminohappo-jäännöstä käsittävä ketju, jonka järjestys on esitetty kuviossa 2 asemasta 1 asemaan 10, ja Z* on lineaarinen, viereinen, 1 -17 aminohappojäännöstä käsittävä ketju, jonka järjestys on esitetty kuviossa 2 asemasta 16 asemaan 32. Toisin sanoen, edullisissa suoritusmuodoissa Z on seuraavien ketjujen joukosta valittu aminohappojäännösten ketju: AVERYLKDQQ, VERYLKDQQ, ERYLKDQQ, RYLKDQQ, YLKDQQ, LKDQQ, KDQQ, *: DQQ, ··.* QQ ja V.: Q; ja | j j Z’ on seuraavien ketjujen joukosta valittu aminohappojäännösten ketju: • · gcsgklicttavpwnas, • · GCSGKLICTTAVPWNA, GCSGKLICTTAVPWN, GCSGKLICTTAVPW, ... GCSGKL I CTT A VP, i i « ' GCSGKLICTTAV, ;·*ί GCSGKL I CTT A, gcsgkl i ctt, « · ; GCSGKL I CT, GCSGKLIC, • · GCSGKLI, „ 101797 21 GCSGKL, GCSGK, GCSG, GCS, GC ja G.

Huomattakoon, että X vastaa asemaa 602 HIV-l-viruksen TMP-(gp41—) proteiinissa, Ja mikäli X on 1, niin sisältyvä ketju vastaa HIV-1 TMP-proteiinissa aminohappojäännösten ketjua asemasta 598 asemaan 604, eli kuviossa 2 esitetyn polypeptidin asemia 10 - 16. Toisaalta erilaisten, erilaisista HIV—1—eristeistä saatujen TMP—proteiinien aminohappojäännösten ketjuihin kohdistuneen tutkimuksen perusteella uskotaan, että asemassa 602 sijaitsevan jäännöksen I korvaaminen jäännöksellä L, M tai F johtaa antigeenisesti samanarvoiseen polypeptidiin.

Esimerkkeinä edullisista HIV—1-kaltaisista di—1eu—polypepti— deistä voidaan mainita ne, joiden aminohappojäännösten ketju on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 5 Kaavan merkintä Aminohappojäännösten ketju

;,V <IV> AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI

· (VI) LKDGGLLGIWGCSGLKI

:Y: (xiv) lkdqqllgiwgcsgk • ·

:Υ· (XV) RILAVERYLKDQQLLGIWGCS

• · HIV-l-kaltäisten di-cys- ja di-1eu—polypeptidien edullisiin ... yhdistelmiin kuuluvat peptidi (IV) tai (XII) peptidin (III), * · · ), (XIII) tai (X) kanssa, yhdistelmien, jotka käsittävät peptidin *·|·| (III) peptidin (IV) kanssa ja peptidin (XIII) peptidin (IV) ' ' : kanssa, ollessa erityisen edullisia.

*

Eräässä toisessa suoritusmuodossa oheinen keksintö kohdistuu HIV—1—kaitäiseen polypeptidiin, jonka aminohappojäännösten 101797 22 ketjulla on seuraava kaava. Josta käytetään merkintää (XI): SGKLICTTAVPWNAS.

Esimerkeissä tarkastellut tulokset huomioon ottamalla on selvää, että edellä kuvatun kaavan (I) mukainen, seitsemän amino-happojäännöstä käsittävä ketju määrittää HIV-l-viruksen merkittävän antigeenisen determinantin (tai sisältyy siihen), joka reagoi HIV-l-viruksen indusoimien vasta-aineiden kanssa. Lisäksi vaikka kukin oheisen keksinnön mukainen HIV-l-kaltäinen polypeptidi reagoikin useimpien HIV-l-positiivisten seerumeiden kanssa, niin potilaiden erillisten seerumeiden on todettu reagoivan spesifisesti jonkin HIV-l-kaltäisen peptidin, muttei muiden, kanssa. Tämä havainto osoittaa, että pitemmissä, kaavan (I) mukaisen ketjun sisältävissä peptideissä, kuten taulukossa 2 esitetyissä peptideissä, esiintyy muita antigeenisiä determinantteja. Peptidi synteesi in liittyvän alan asiantuntija kykenee vaivattomasti valmistamaan HIV—1—kai taisten peptidien kappaleita niissä läsnäolevien antigeenisten ja immunogenisten osien määrittämiseksi. Täten tällaisia antigeenisiä ja immunogeenisia kappaleita voidaan käyttää oheisen keksinnön mukaisissa diagnoosi järjestelmissä ja -menetelmissä. Lisäksi asiantuntija toteaa, että HIV-l ΤΙΊΡ—protei inin osaa vastaavat pitemmät peptidit, jotka ovat oheisen julkaisun mukaisia, toimivat samoin oheisen keksinnön mukaisissa määritysjärjestelmissä ja -(ηβηθ-ν.: tel missä.

Eräässä toisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukaista STLV-III-kal täistä polypeptidiä tai sen anti geenisesti samankaltaista muunnosta käytetään -farmaseuttisesti hyväksyttävässä, vesipitoisessa laimennetussa seoksessa rokotteen muodostamiseksi, joka rokote tehokkaana määränä annettuna kykenee indusoimaan STLV-III- ja HIV-2-virusten kanssa immuunireagoivia • · · ’·' * vasta-aineita.

•\j Käsitteellä "rokote" ja sen erilaisilla kieliopillisilla muo- .··. doilla tarkoitetaan ohessa seosta, joka sisältää keksinnön • · mukaista polypeptidiä aktiivisena komponenttinaan, ja jota . : käytetään HIV-2—virusta torjuvien vasta-aineiden valmistami- 101797 23 seen. Kun polypeptidiä käytetään vasta-aineiden indusoimiseen, niin tulee ymmärtää, että tätä polypeptidiä voidaan käyttää yksinään tai kantajaan kytkettynä konjugaattina tai polypep- ‘ tidin polymeerinä, mutta kuvauksen helpottamiseksi tämän keksinnön mukaisten polypeptidien erilaisiin suoritusmuotoihin viitataan ohessa yhteisellä käsitteellä "polypeptidi" sekä sen erilaisilla kieliopillisilla muodoilla.

Vähemmän kuin noin 35 aminohappojäännöstä sisältävän polypepti-din tapauksessa on edullista käyttää kantajaan sidottua peptidiä vasta-aineiden tuotannon indusoimi seksi edellä esitetyllä tavalla.

Samoin edellä esitetyllä tavalla polypeptidin amino- tai kartioksi päätteeseen voidaan lisätä yksi tai useampi ylimääräinen aminohappojäännös, joka helpottaa polypeptidin sitomista kantajaan. Polypeptidin amino— tai karboksipäätteeseen lisätyt kys— teiinijäännökset on todettu erityisen käyttökelpoisiksi ajatellen kon jugaatti en muodostamista di sul-f i di sidosten välityksellä. Kuitenkin myös muita alalla hyvin tunnettuja menetelmiä konjugaatti en muodostamiseksi voidaan käyttää. Esimerkkeinä muista kytkentätoimenpiteistä voidaan mainita Michaeliin additioreak— tion tuotteiden, di —aldehydien kuten glutaraldehydin, käyttö, ‘ ··’ Klipstein et ai., J. Infect. Dis. . 147. 318-326 (1983) ja muut ·.·.* vastaavat tai karbodi-imidiin perustuvan tekniikan käyttö, ·,· | kuten käytettäessä vesiliukoista karbodi-imidiä ami di sidosten : : : muodostamiseksi kantajaan. Yleiskatsaus proteiinin konjugoin- • · nista tai kytkemisestä aktivoitujen -funktionaalisten ryhmien avulla on löydettävissä julkaisusta Aurameas, et ai., Scand.

J. Immunol., voi. 8, tyädennös 1, 7, 7 — 23 (1978).

... Käyttökelpoiset kantajat ovat alalla hyvin tunnettuja, ja ne • · · ovat yleensä itse proteiineja. Esimerkkeinä tällaisista kanta- • · ♦ ***** jista voidaan mainita erään nilviäisen (keyhole limpet) hemo— syaniini (KLH) , edestiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten • « ; naudan seerumin albumiini (BSA) tai ihmisen seerumin albumiini (HSA), punaiset verisolut kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), · · ··· tetanustoksoidi, koleratoksoidi sekä polyaminohapot kuten po— • · 101797 24 ly(D—lysiini : D-glut aarni happo) _ia muut vastaavat.

Kantajan valinta riippuu suurimmaksi osaksi rokotteen lopullisesta käytöstä Ja se perustuu kriteereihin, Jotka eivät erityisemmin liity oheiseen keksintöön. Tällöin tulisi esimerkiksi valita sellainen kantaja, Joka ei saa aikaan haitallista reaktiota erityisessä rokotettavassa eläimessä.

Oheinen rokote sisältää tehokkaan, immunogeenisen määrän oheisen keksinnön mukaista polypeptidiä, tyypillisesti kantajaan kytkettynä konjugaattina. Polypeptidin tehokas määrä yksikkö-annosta kohden riippuu muun muassa rokotettavasta eläinlajista, eläimen ruumiin painosta sekä valitusta injektiOtavasta, kuten alalla hyvin tunnetaan. Rokotteet sisältävät polypeptidiä tyypillisesti pitoisuutena, Joka on noin 10 mikrogrammaa — 500 milligrammaa rokoteannosta kohden, edullisesti noin 50 mikrogrammaa - 50 milligrammaa annosta kohden.

□heisen keksinnön mukaisiin rokotteisiin liittyvällä käsitteellä "yksi kköannos" viitataan -fysikaalisesti erillisiin yksikköihin, joita voidaan käyttää yksikköannoksina eläimissä, kunkin . tällaisen yksikön sisältäessä ennalta määrätyn määrän aktii— II* vista materiaalia, jonka määrän on laskettu tuottavan toivotun ·’ immunogeenisen vaikutuksen tarvittavaan laimentajaan, eli kan- tajaan tai kuljettimeen, yhdistettynä. Keksinnön mukaisen ro-• kotteen uuden yksikköannoksen määritelmän määräävät (a) aktii— ·,·'· visen materiaalin ainutlaatuiset ominaisuudet ja tavoiteltava erityinen immunologinen vaikutus sekä (b) rajoitukset, jotka • · liittyvät tällaisen aktiivisen materiaalin immunologiseen käyttöön eläimissä, ja riippuu suoraan näistä tekijöistä, kuten ohessa yksityiskohtaisesti esitetään, tämän määritelmän ollessa ... oheisen keksinnön eräs piirre.

• · · • · • · · ·_·’ Rokotteet valmistetaan tyypillisesti kuivatusta kiinteästä polypeptidi konjugaatista dispergoimalla polypeptidi kon jugaatti ; -fysiologisesti siedettyyn (hyväksyttävään) laimentimeen, kuten veteen, suolaliuokseen tai fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen vesipitoisen seoksen muodostamiseksi.

25 101797

Rokotteet voivat myös sisältää apuainetta 1aimentimen osana. Sellaiset apuaineet, kuten Freund:in täydellinen apuaine <CFA), Freund:in epätäydellinen apuaine (IFA) Ja aluma ovat alalla hyvin tunnettuja materiaaleja, Ja niitä on saatavana kaupallisesti useita eri lähteistä.

Käsitteen "vasta-aine" erilaisilla kieliopillisilla muodoilla tarkoitetaan ohessa immunoglobuliinimolekyylejä Ja immunoglobu-1iinimolekyylien, eli vasta—aineen sitovan kohdan tai paratoo— pin sisältävien molekyylien immunologisesti aktiivisia osia. Esimerkkeinä vasta-ainemolekyyleistä voidaan mainita ehyet immunoglobuliinimolekyylit, olennaisesti ehyet immunoglobulii-nimolekyylit ja immunoglobuliinimolekyylin ne osat, jotka sisältävät paratoopin, mukaan lukien alalla lyhenteillä Fab,

Fab’, F(ab')a ja F(v) tunnetut osat.

Oheisen keksinnön mukainen vasta-ainekoostumus on tunnettu siitä, että se sisältää tämän keksinnön mukaisen, HIV-2 TMPsn ja STLV/-II I-kal tai sen polypeptidin kanssa immuuni reagoi via vasta— ainemolekyylejä, sen ollessa olennaisesti vapaa vasta—aineista, jotka immuunireagoivat jonkin muun HIV-2-kaltaisen proteiinin kanssa.

·...’ Oheisen keksinnön mukainen vasta-ainekoostumus tuotetaan tyy— pillisesti immunoimalla laboratorionisäkäs oheisen keksinnön : mukaisella rokotteella sellaisten vasta-ainemolekyylien indu- soimiseksi tällä tavalla tässä nisäkkäässä, joilla vasta-aine- • · molekyyleillä on immuunispesi-fisyyttä asianmukaisille polypep- • · tideille. Tämän jälkeen nämä vasta-ainemolekyylit otetaan talteen tästä nisäkkäästä ja ne eristetään toivotussa määrin hyvin tunnetuilla tekniikoilla, kuten esimerkiksi immuuniaffiniteet— tiin perustuvalla kromatografisella menetelmällä. Tällä tavalla • · · *·* ‘ tuotettua vasta-ainekoostumusta voidaan käyttää muun muassa • · • · · oheisen keksinnön mukaisissa diagnostisissa menetelmissä ja • · -järjestelmissä HIV-2-viruksen ilmaisemiseksi ruumiin näyt— teestä.

• · • · 26 1 0 1 7 9 7 Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin indusoima, keksinnön mukainen vasta-ainekoostumus, Joka sisältää oiigomeerista poly-peptidiä ja polypeptidin polymeeriä, voidaan kuvata oligoklo-naaliseksi verrattuna luonnossa esiintyviin polyklonaalisiin vasta-aineisiin, koska niiden aiheuttaja on immunogeeni (suhteellisen pieni polypeptidi), jossa on suhteellisen harvoja epitooppeja verrattuna ehyessä HIV-2 TMP-molekyylissä esiintyviin epitooppeihin. Näin ollen tämän keksinnön mukaiset reseptorit sitoutuvat polypeptidin epitooppeihin, kun taas luonnossa esiintyvät, koko TMP-molekyylin aiheuttamat vasta-aineet sitoutuvat kaikkialla TMP—molekyylissä esiintyviin epitooppeihin, ja niitä kutsutaan polyklonaalisiksi.

Oheinen keksintö kohdistuu myös monoklonaalisten vasta-aineiden koostumukseen. Monoklonaalisten vasta-aineiden koostumus sisältää ilmaistavien rajojen puitteissa vasta-aineen vain yhdenlaisen sitovan kohdan, joka kykenee sitomaan tehokkaasti HIV-2 TMP-proteiinin. Täten, oheisen keksinnön mukaisella monoklo-naalisten vasta-aineiden koostumuksella on tyypillisesti vain yhdenlaista sitovaa, HIV-2 TMP-proteiiniin kohdistuvaa affiniteettia vaikka se voikin sisältää sellaisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitomaan muita proteiineja kuin HIV-2 TMP:tä.

Sopivia monoklonaalisessa muodossa olevia vasta-aineita, tyypillisesti kokonaisia vasta-aineita, voidaan myös valmistaa • käyttäen hybridomatekniikkaa, joka kuvataan julkaisussa Niman : : : et ai., Proc. Natl. Sei. USA. 80:4949—4953 (1983), joka kuvaus liitetään oheen tällä viittauksella. Lyhyesti, sen hybridoman, • · josta monoklonaalisen vasta—aineen koostumus tuotetaan, muodostamiseksi myeloomasolui inja tai jokin muu itse itseään ylläpitävä soiui inja sulautetaan yhteen tämän keksinnön mukaisella ... polypeptidillä hyperimmunoidun nisäkkään pernasta saatujen • · · • · · * # lymfosyyttien kanssa.

♦ · · • · · • · :*·.· On edullista, että myel oomasol ui in ja on peräisin samasta la- « · jista kuin lymfosyytit. Edullinen nisäkäs on tyypillisesti ·/ hiirikanta 129 G1X···. Sopivia, oheisessa keksinnössä käyttökel- ··· poisia hiiren myeloomasolulinjoja ovat esimerkiksi hypoksan— 101797 27 tiini-aminopteriini-tymidiini-herkät (HAT) solulinjat P3X63— Ag8.653 Ja Sp2/0-Agl4, Joita on saatavana kantakokoelmasta American Type Culture Collection, Rockville, MD tunnuksilla CRL 1580 ja CRL 1581, vastaavasti.

Splenosyytit sulautetaan tyypillisesti yhteen myeloomasolujen kanssa käyttäen polyetyleeniglykoli a (PEG) 1500. Yhteensulautu-neiden hybridien valinta perustuu niiden herkkyyteen HAT:ille. Tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä erittävät hybri-domat tunnistetaan käyttäen entsyymiin kytkettyyn immuunisor-benttiin perustuvaa koetta (ELISA), joka kuvataan esimerkissä 11.

Oheisen keksinnön mukainen monoklonaalisten vasta-aineiden koostumus voidaan tuottaa käynnistämällä monoklonaalisten hyb-ridomien viljelmä, joka käsittää asianmukaiselle polypeptidi1le spesifisiä vasta-ainemolekyylejä erittävän hybridoman sisältävää ravintoalustaa. Viljelmää pidetään yllä sellaisissa olosuhteissa ja sellaisen ajanjakson ajan, että hybridoma ehtii erittää vasta-ainemolekyylejä alustaan. Tämän jälkeen Vasta-ainetta sisältävä alusta otetaan talteen. Tämän jälkeen vasta-ainemolekyylit voidaan eristää edelleen hyvin tunnetuilla tek— ‘ : ’ ni i koi 11a.

» » i Näiden koostumusten valmistamiseen käyttökelpoiset järjestelmät j j ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on saatavana kaupalli- sesti , ja ne käsittävät synteettisiä vi 1 jelyalustoja, umpi — • · siitettyjä hiiriä ja muita vastaavia. Esimerkkinä synteetti- • · sestä alustasta voidaan mainita Dulbeccoin olennainen vähim— mäisaiusta CDMEM; Dulbecco et ai., Virol. 8:396 (1959)3, johon on lisätty täydennökseksi 4,5 g/1 glukoosia, 20 mM glutamiinia ... ja 20 7. siki öasteisen vasikan seerumia. Esimerkki umpisiittoi- • · · *’ * sesta hi iri kannasta on Balb/c.

» · · • · · ♦ ·

Edellä esitetyllä menetelmällä tuotettuja monoklonaal isten • · vasta—aineiden koostumuksia voidaan käyttää esimerkiksi diag— ·· nostisissa ja lääkinnällisissä menetelmissä, joissa HIV—2 • * TMP:tä sisältävän immuunireaktion tuotteen muodostuminen on • m 28 101797 toi vottavaa.

Oheisen keksinnön mukainen diagnostinen Järjestelmä käyttövalmiina reagenssipakkauksena sisältää vähintään yhteen määritykseen riittävän määrän oheisen keksinnön mukaista polypeptidiä, vasta-ainekoostumusta tai monoklonaalisen vasta-aineen koostumusta pakattuna reagenssina. Tämä reagenssipakkaus sisältää tyypillisesti käyttöohjeet reagenssien käyttämiseksi.

Ohessa käytetty käsite "pakkaus" tarkoittaa kiinteään matriisiin tai materiaaliin, kuten lasiin, muoviin, paperiin, kelmuun tai muuhun vastaavaan, joka kykenee pitämään kiinteiden rajojen si säilä oheisen keksinnön mukaista polypeptidiä, vasta-ainekoostumusta tai monoklonaalisten vasta-aineiden koostumusta. Täten pakkaus voi olla esimerkiksi pieni lasipullo, joka voi sisältää mi 11igrammamääriä kyseistä polypeptidiä, tai se voi olla mikrotiitterinlevyn kolo, johon kyseistä polypeptidiä on kiinnitetty toimivasti, eli kytketty siten, että vasta-aine kykenee sitomaan sen immunologisesti.

"Käyttöohjeet" käsittävät tyypillisesti ymmärrettävän kuvauksen reagenssien pitoisuudesta tai vähintään yhdestä määritysmene- » * · ‘ telmän parametristä, joista parametreistä mainittakoon reagens- sin ja näytteen suhteelliset, keskenään sekoitettavat määrät, :.V reagenssia ja näytettä sisältävien seosten ylläpitämisajät, ] lämpötila, puskuriolosuhteet ja muut vastaavat.

« i • · · t · · • ·

Edullisissa suoritusmuodoissa oheisen keksinnön mukainen diag-

« I

noosijärjestelmä sisältää edelleen merkkiainetta tai indikaattorin, joka kykenee viestittämään oheisen keksinnön mukaista polypeptidiä tai vasta-ainemolekyylejä sisältävän kompleksin ... muodostumisen.

i » t • · · • · «tl

Ohessa käytetyllä käsitteellä "kompleksi" viitataan spesi-fisen t * sitoutumisreaktion, kuten vasta-aineen ja antigeenin tai resep— • · torin ja ligandin välisen reaktion, tuotteeseen. Esimerkkinä komplekseista voidaan mainita immuunireaktion tuotteet.

« • ti.

» · i i » • « 29 101797

Ohessa käytetyn käsitteen "merkkiaine" ja "indikaattori" erilaisilla kieliopillisilla muodoilla viitataan yksittäisiin atomeihin ja molekyyleihin, jotka osallistuvat joko suoraan tai epäsuorasti ilmaistavissa olevan, kompleksin läsnäolon osoittavan signaalin muodostumiseen. Mikä tahansa merkkiaine tai indikaattori voidaan kytkeä tai sisällyttää ilmentyvään proteiini-, polypeptidi- tai vasta-ainemolekyyliin, joka on osa oheisen keksinnön mukaista vasta-ainekoostumusta tai mono-klonaalisen vasta-aineen koostumusta, tai sitä voidaan käyttää erillään, ja näitä atomeja tai molekyylejä voidaan käyttää yksinään tai muihin reagensseihin yhdistettynä. Tällaiset merkkiaineet itse ovat hyvin tunnettuja kliinisessä diagnoosi kemiassa ja ne muodostavat osan tästä keksinnöstä ainoastaan sikäli, mikäli niitä käytetään muutoin uusissa proteiinimenetelmissä ja/tai järjestelmissä.

Tämä merkkiaine voi olla -fluoresoiva merkkiaine, joka sitoutuu kemiallisesti vasta-aineisiin tai antigeeneihin niitä denaturoimatta fluorokromin (värin) muodostaen, jota väriä voidaan käyttää immuunif1uoresoivana jäijittimenä. Sopivia fluoresoivia merkkiaineita ovat fluorokromit, kuten fluoreseiini—isosya— . naatti (FIC), f luoresei ini—isotiosyanaatti (FITC) , 5—dimetyyli — .··, amiini-l-naftaleenisulfonyylikloridi (DANSC) , tetrametyyli- rodamiini-isotiosyanaatti (TRITC), lissamiini, rodamiini 8200 sulfonyyli-kloridi (RB 200 SC) ja muut vastaavat. Kuvaus immuuni f luoresenssiin perustuvista analyysitekniikoista on löy— *·’·* dettävissä teoksen DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", ar— tikkelista Antibody As a Tool. Marchalonis, et ai., toim., John Wiley & Sons, Ltd., sivut 189-231 (1982), joka liitetään oheen tällä viittauksella.

Edullisissa suoritusmuodoissa indikaattori on entsyymi, kuten piparjuuren peroksidaasi (HRP), glukoosi oksi daasi tai muu vas-·’· taava. Tällaisissa tapauksissa, joissa pääasiallinen indikaat- tori on entsyymi kuten HRP tai glukoosioksidaasi, järjestel— ,'· mässä tarvitaan muita reagensseja reseptorin ja ligandin väli- • · sen kompleksin (immuunireaktantin) muodostumisen saattamiseksi näkyvään muotoon. Tällaisia muita reagensseja HRPsn tapauksessa 101797 30 ovat vetyperoksidi ja värin hapetettava esiaste, kuten diamino-bentsidiini. Glukoosioksidaasin yhteydessä käyttökelpoinen muu reagenssi on 2,2’-atsino-di—<3-etyyli-bentstiatsoliini-G-sulfonihappo) (ABTS).Radioaktiiviset alkuaineet ovat myös käyttökelpoisia merkkiaineita ja niitä käytetään ohessa keksinnön havainnoi1istamiseksi. Esimerkki radioaktiivisesta merkkiaineesta on radioaktiivinen alkuaine, joka lähettää gammasäteitä. Alkuaineet, jotka itse lähettävät gammasäteilyä, kuten *2*I, 13=I, 12eI, XS2I ja eiCr, edustavat gammasäteilyä lähettävien radioaktiivisten alkuaineiden erästä ryhmää, jota voidaan käyttää indikaattorina. Erityisen edullinen on l2SI. Käyttökelpoisten merkkiaineiden toisen ryhmän muodostavat sellaiset alkuaineet kuten XiC, 1BF, 1S0 ja X3N, jotka itse lähettävät positroneja. Tällä tavalla lähetetyt positronit tuottavat gammasäteilyä kohdatessaan eläinruumiissa läsnäolevia elektroneja. Käyttökelpoisia ovat myös beetasäteilijät kuten 111indium tai 3H.

Merkkiaineiden kytkeminen eli polypeptidien ja proteiinien merkitseminen on alalla hyvin tunnettua. Esimerkiksi, hybrido-man tuottamat vasta-ainemolekyylit voidaan merkitä sisällyttämällä niihin aineenvaihdunnal1isesti radioisotooppeja sisältä-.viä aminohappoja, jotka ovat vi1jelyalustan komponentteina.

Katso esimerkiksi julkaisu Galfre et ai., Meth- Enzvmol. . 73 s 5-! 46 (1981). Tekniikat proteiinin konjugoimiseksi tai kytkemi— seksi aktivoitujen funktionaalisten ryhmien välityksellä ovat erityisen käyttökelpoisia. Katso esimerkiksi julkaisut Aura-’·’·* meas, et ai., Scand. J. Immunol., voi. 8 täyd. 7:7-23 (1978) ja Rodwell et ai., Biotech.. 3:889-894 (1984) sekä US-patentti-julkaisu no. 4 493 795.

:*·*: Diagnostiset järjestelmät voivat myös sisältää, edullisesti « erillisenä pakkauksena, spesifistä sitovaa ainetta. "Spesifinen • · .* * sitova aine" on molekyyliryhmä, joka kykenee sitomaan selektii- ’· ’· visesti oheisen keksinnön mukaisen reagenssi lajin tai tällaista lajia sisältävän kompleksin, mutta joka itse ei ole oheisen keksinnön mukainen polypeptidi eikä vasta—ainemolekyyli. Esi— ____: merkkeinä spesifisistä sitovista aineista voidaan mainita toi— 101797 31 set vasta-ainemolekyylit, vastinproteiinit tai sen kappaleet, S. aureus—oraanismin proteiini A ja muut vastaavat. Spesifinen sitova aine sitoo reagenssilajin edullisesti silloin, kun tämä laji on läsnä kompleksin osana.

Edullisissa suoritusmuodoissa tämä spesifinen sitova aine on merkitty. Mikäli kuitenkin tämä diagnostinen järjestelmä sisältää sitovan aineen, jota ei olla merkitty, niin tätä ainetta käytetään tyypillisesti vahvistavana keinona tai reagenssina. Näissä suoritusmuodoissa tämä merkitty spesifinen sitova aine kykenee sitomaan spesifisesti vahvistavan keinon, kun vahvistava keino on sitoutunut reagenssilajia sisältävään kompleksiin.

Oheisen keksinnön mukaisia diagnostisia reagenssipakkauksia voidaan käyttää "ELISA"-menetelmänä vähintään anti—HIV—2—vasta-aineiden läsnäolon tai määrän määrittämiseksi ruumiinnesteen kuten seerumin, plasman tai virtsan, näytteestä. "ELISA" tar— koittaa entsyymiin kytkettyyn immuunisorbenttiin perustuvaa määritysmenetelmää, jossa käytetään kiinteään faasiin sidottua vasta-ainetta tai antigeeniä sekä entsyymin ja antigeenin tai entsyymin ja vasta—aineen välistä konjugaattia näytteessä läsnäolevan antigeenin tai vasta-aineen ilmaisemiseksi ja määrän selvittämiseksi. Kuvaus ELISA—tekniikasta on löydettävissä teoksen D.P. Sites et ai., "Basic and Clinical Immunology", 4. laitos, kappaleesta 22 (julkaisija Lange Medical Publica— ; ; tions, Los Altos, CA, 1982) sekä US-patenttijulkaisuista *·*·* 3 654 090, 3 850 752 ja 4 016 043, jotka kaikki liitetään oheen tällä viittauksella.

Näin ollen edullisissa suoritusmuodoissa keksinnön mukainen : polypeptidi, vasta-ainemolekyylien koostumus tai monoklonaa— listen vasta—ainemolekyylien koostumus voidaan kiinnittää kiin- • · ; teään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi, joka kanta— • · · ;· ja muodostaa pakkauksen kyseisessä diagnoosijärjestelmässä.

’ Reagenssi kiinnitetään tyypillisesti kiinteään matriisiin vettä ·; · sisältävästä alustasta adsorption avulla, vaikka muitakin.

101797 32 alan asiantuntijalle hyvin tuttuja kiinnittämistapoja voidaan käyttää.

Käyttökelpoiset kiinteät matriisit ovat alalla myös tuttuja. Tällaiset materiaalit ovat veteen liukenemattomia ja niitä ovat esimerkiksi ristisidoksia käsittävä dekstraani, jota on saatavana tavaramerkkinä SEPHADEX yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agaroosi; polystyreenihelmet, joiden halkaisija on noin 1 mikronista noin 5 millimetriin, ja joita on saatavana yhtiöstä Abbot Laboratories, North Chicago, IL; polyvinyyliklori di, polystyreeni, ristisidoksia käsittävä poly-akryyliamidi, nitroselluloosaan tai nyloniin perustuvat kudokset kuten arkit, liuskat tai kappaleet; tai putket, levyt tai esimerkiksi polystyreenistä tai polyvinyylikloridista valmistettujen mikrotiitterilevyn kolot.

Minkä tahansa ohessa kuvatun diagnoosi järjestelmän reagenssi-lajit, merkityt spesifiset sitovat aineet tai vahvistava rea-genssi voi olla liuoksena, nestedispersiona tai olennaisesti kuivana jauheena, esimerkiksi 1 yo-fi 1 isoidussa muodossa. Mikäli indikaattori on entsyymi, niin tällöin järjestelmä voi myös käsittää tämän entsyymin substraattia erillisessä pakkauksessa. Kyseessä oleva diagnostinen määritysjärjestelmä voi sisältää myös kiinteän kantajan, kuten edellä kuvatun mi kroti itteri levyn • ! sekä yhtä tai useampaa puskuria toisistaan erilleen pakattuina elementteinä.

* * · • * » · • · · *·'·’ Ohessa diagnoosi järjestelmien yhteydessä tarkastellut pakkaus materiaalit ovat materiaaleja, joita käytetään tavallisesti diagnoosijärjestelmissä. Tällaisia materiaaleja ovat esimer— kiksi lasiset ja muoviset (esim. polyetyleeni, polypropyleeni ja polykarbonaatti) pullat, ampullit, muoviset ja muovikalvolla ·*·*. pinnoitetut kotelot ja muut vastaavat.

• · · ' * * « · • « • · Oheisen keksinnön mukaisen diagnoosijärjestelmän erästä suo ritusmuotoa voidaan käyttää HIV—2—viruksen indusoimien vasta-aineiden läsnäolon määrittämiseen. Tällainen järjestelmä käsit-tää reagenssipakkauksena tämän keksinnön mukaista, STLV-III- 101797 33 kaltaista polypeptidiä sisältävän pakkauksen. Järjestelmän sisältämä STLV-III-kaltäinen polypeptidi sisältää edullisesti korkeintaan 33 aminohappojäännöstä ja sen ketju on homologinen kuviossa 1 esitetyn ketjun osan kanssa. Tämä polypeptidi on edullisemmin p80, p81, p82, p83, p84, pB5, p86, pB7, p88 tai p89, edullisimmin p82 ja/tai p86, jotka kaikki ketjut on esitetty taulukossa 1.

Kun on toivottua saada aikaan sellainen diagnoosijärjestelmä, jota voidaan käyttää HIV-1- ja HIV-2-virukselle altistumisen ilmaisemiseksi ja erottamiseksi toisistaan, niin tällöin rea-genssipakkaus sisältää ohessa kuvattua HIV-l-kaltaista di-cys-tai di-leu-polypeptidiä STLV-III-kaltäisen polypeptidin ohella. Reagenssipakkauksen sisältämiä edullisia HIV-l-kaltaisia di-cys-polypeptidejä ovat ne, jotka sisältävät korkeintaan 32 aminohappojäännöstä, joiden ketjun osana on ketju —CSGKLIC— ja jotka ovat homologisia kuviossa 2 esitetyn ketjun osalle. Edullisemmin, reagenssipakkauksen sisältämällä HIV-l-kaltäisellä di-cys-polypeptidillä on ketju, joka valitaan taulukossa 2 esitetystä ryhmästä.

: Diagnostisen järjestelmän eräässä toisessa suoritusmuodossa, jota voidaan käyttää anti-HIV-1- ja anti-HIV-2-vasta-aineiden ilmaisemiseen ja erottamiseen toisistaan, reagenssi pakkaus . I sisältää tämän keksinnön mukaista HIV-l-kaltaista di-leu-poly- peptidiä STLV-I 11—kai täisen polypeptidin lisäksi. Reagenssi- • · · 101797 34 ilmaisemisen, keksintö kohdistuu myös diagnoosiJärjestelmään, jonka käsittämä reagenssipakkaus sisältää tämän keksinnön mukaista STVL-III-kaltäistä polypeptidiä sekä HIV-1 di-cys- ja HIV-1 di—leu-polypeptidien yhdistelmää seoksena.

Eräässä suoritusmuodossa STLV-III-kaltaisen polypeptidin ja HIV-l-kaltäisen polypeptidin yhdistelmä on erotettu -fysikaalisesti reagenssipakkauksessa, mikä tekee mahdolliseksi anti-HIV-1- ja anti-HIV—2-vasta-aineiden läsnäolon erottamisen.

Tämän tyyppisen reagenssipakkauksen esimerkki sisältää ensimmäistä kiinteätä kantajaa, jona toimivat mikrotiitterilevyn kolot, jotka kolot on pinnoitettu STLV—III—kaltaisella polypepti— dillä, eli joihin on kiinnitetty toiminnallisesti tällaista polypeptidiä, edullisesti polypeptidiä p82 ja/tai p86, sekä toista kiinteätä kantajaa, jona toimivat sellaiset mikrotiit-terilevyn kolot, jotka on pinnoitettu HIV—1—kaitaiSten poly— peptidien (III) ja (IV) seoksella, eli joihin on kiinnitetty toiminnallisesti tällaista seosta. STLV—III— ja HIV—1-polypep-tideillä pinnoitetut kolot voivat luonnollisestikin olla samalla levyllä tai eri levyillä.

: Eräässä muussa suoritusmuodossa reagenssi pakkaus sisältää STLV- 111-kal täisiä, HIV-l-kal tai si a di-cys-polypeptidejä ja HIV-1— kaltaisia di-leu-polypeptidejä näiden kaikkien kolmen polypep-

tidin seoksena, mikä tekee mahdolliseksi immuunikatoon AIDS

'1'.’ liittyvien virusten laajemmalle joukolle altistumisen seulonnan • * * * * kiinteätä kantajaa käyttäen. Tämän tyyppinen reagenssipakkaus • · · käsittää tyypillisesti kiinteän kantajan, kuten mikrotiitteri— levyn, jonka erilliseen koloon on kiinnitetty toiminnallisesti STLV-III-kaltaisen polypeptidin, joka on edullisesti p82 ja/tai p86, HIV-l-kaltai sen di-cys-polypeptidin (III) ja HIV—1—kai — täisen di-leu-polypeptidin (IV) seosta.

• · • » · • · · • · .* * Oheinen keksintö kohdistuu menetelmään HIV—2—viruksia (immuuni— 1 · katoon liittyvät länsia-fri kkalaiset retrovirukset) vastusta- « · ’ vien vasta-aineiden läsnäolon ja edullisesti määrän ilmaisemi seksi ruumiinnesteen näytteestä tuottamalla kompleksi, joka .. sisältää oheisen keksinnön mukaista polypeptidiä sekä tällaisia 101797 35 vasta-aineita. Alan asiantuntijoille on selvää, että käytettävissä on lukuisia hyvin tunnettuja kliinisiä, diagnoosi kemiassa käyttökelpoisia toimenpiteitä,' joita voidaan käyttää näiden kompleksien muodostamiseen. Täten, vaikka ohessa kuvataankin esimerkkejä näistä määritysmenetelmistä, niin keksintö ei kuitenkaan rajoitu niihin.

Erilaisia heterogeenisia ja homogeenisia, joko kilpailevia tai ei-kilpailevia määritysmenetelmiä voidaan käyttää HIV-2 TMP:tä vastustavien vasta-aineiden läsnäolon ja edullisesti määrän ilmeisemi seen ruumiinnesteen näytteestä käyttäen keksinnön mukaisia STLV-III-kaltäisiä polypeptidejä. Keksintö kohdistuu esimerkiksi menetelmään anti—HIV-2—vasta—aineiden läsnäolon määrittämiseksi ruumiin näytteestä, jonka menetelmän käsittämissä vaiheissa: (a) Ruumiinnesteen näytteeseen sekoitetaan oheisen keksinnön mukaista STLV-III-kaltaista polypeptidiä, joka on edullisesti p82 ja/tai p86, immuunireaktioseoksen muodostamiseksi. Ruumiinnesteen näyte on edullisesti tunnettu määrä verta tai verestä saatua tuotetta kuten seerumia tai plasmaa, vaikka näytteenä voidaankin käyttää myös virtsaa, sylkeä, siemennestettä, emät- : timen eritettä tai aivo-selkäydinnestettä (CSF). HIV—2-kaltais— ta polypeptidiä on edullisesti läsnä kiinteän kantajan osana, • · • · » esimerkiksi oheisen keksinnön mukaista HIV-2-polypeptidiä on kiinnitetty mikrotiitterilevyn kolon sisäseinämiin siten, että muodostuneessa immuunireaktion seoksessa on sekä kiinteä että nestemäinen -faasi.

• · * · · I | I • · (b) Seosta pidetään biologiselle määritykselle sopivissa olosuhteissa ennalta määrätyn ajanjakson ajan, esimerkiksi noin 10 minuutista noin 16 - 20 tuntiin, noin 4 - 45 *C:n lämpö-tilassa siten, että näytteessä mahdollisesti läsnäolevat anti- ·*.·. HIV-2-vasta-aineet saadaan immuuni reagoi maan polypeptidin kans- • · /· sa (sitoutumaan siihen immunologisesti) polypeptidiä sisältävän * f « '· · immuunireaktion tuotteen muodostamiseksi.

» * «

Biologiselle määritykselle sopivat olosuhteet ovat sellaiset, jotka säilyttävät tämän keksinnön mukaisten polypeptidimole- 101797 kyylien sekä määritettävien anti-HIV-2-vasta-aineiden biologisen aktiivisuuden, ja näihin olosuhteisiin kuuluvat noin alueella 4 - 45 *C oleva lämpötila, noin alueella 5-9 oleva pH-arvo sekä ionivahvuus, Joka vaihtelee tislatun veden ioni-vahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin ionivahvuuteen. Menetelmät näiden olosuhteiden optimoimiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.

(c) Mahdollisesti muodostuneen, polypeptidiä sisältävän immuunireaktion tuotteen läsnäolo määritetään. Jolloin samalla saadaan myös määritetyksi mahdollisten anti-HIV—2—vasta-aineiden läsnäolo immuunireaktioseoksessa. Edullisesti määritetään mahdollisen polypeptidiä sisältävän, muodostuneen immuunireaktion tuotteen määrä. Jolloin samalla saadaan selville näytteessä läsnäolevien anti-HIV-2-vasta-aineiden määrä.

Mahdollinen polypeptidiä sisältävä (anti-HIV-2-vasta-ainetta sisältävä) immuunireaktion tuote voidaan määrittää Joko suoraan tai epäsuoraan alalla hyvin tunnetuilla määritystekniikoilla. Esimerkiksi edullisissa suoritusmuodoissa vaiheen <b) polypeptidiä sisältävää immuunireaktion tuotetta käsitellään edel-.·. leen vaiheessa (c) tapahtuvaa määritystä varten seuraavilla .···. vaiheilla. Joissa: • . (i) polypeptidiä sisältävään immuunireaktion tuotteeseen sekoi- \ tetaan biologisesti aktiivista, merkittyä, spesifisesti sitovaa • ainetta merkityn reaktioseoksen muodostamiseksi. Tämä merkitty, t · *·’·* spesifisesti sitova aine kykenee sitoutumaan polypeptidiä si — • · • · · sältävässä immuunireaktion tuotteessa mahdollisesti läsnäolevan immunoglobuliinin kanssa merkityn kompleksin muodostamiseksi. Tämä merkitty, spesifisesti sitova aine käsittää edullisesti toisia vasta-ainemolekyylejä kuten heterologisia anti-ihmisen Fc-vasta-aineita. Lisäksi tämä merkitty, spesifisesti sitova reagenssi on spesifinen immunoglobuliiniluokan suhteen.

• · · • · • » '· *: (ii) Tällä tavalla muodostettua merkittyä reaktioseosta pide- ·. .* tään biologiselle määritykselle sopivissa olosuhteissa ennalta määrätyn ajanjakson ajan, jonka aikana merkitty, spesifisesti ____ sitova aine ehtii sitoutua mahdollisesti läsnäoleviin anti— 101797 37 HIV-2-vasta-aineisiin, Joita on läsnä polypeptidiä sisältävänä immuunireaktion tuotteena, merkityn kompleksin muodostamiseksi.

Määrittämällä merkityn kompleksin läsnäolo saadaan määritetyksi anti-HIV-2-vasta-aineiden läsnäolo näytteessä. Edullisissa suoritusmuodoissa määritetään merkityn, spesifisesti sitovan, kompleksiin osaksi sitoutuneen aineen määrä Ja näin ollen samalla saadaan määritetyksi anti—HIV—2—vasta—aineiden läsnäolo Ja määrä näytteessä. Tämä määrä voi olla nolla, mikä tarkoittaa sitä, ettei näyte sisällä lainkaan anti-HIV-2-vasta-aineita ilmaistavissa olevien rajojen puitteissa. Menetelmät merkityn, spesifisesti sitovan aineen läsnäolon ja määrän määrittämiseksi riippuvat käytetystä merkkiaineesta, tällaisten merkkiaineiden ja määritysmenetelmien ollessa alalla hyvin tunnettuja.

Vaihtoehtoisesti, vaiheessa (c) polypeptidiä sisältävän immuunireaktion tuotteen määrittämiseen voidaan käyttää homogeenisia määritysmenetelmiä, joita kuvataan esimerkiksi US-patenttijul-kai suissa 4 536 479; 4 233 401; 4 233 402 ja 3 996 345, joiden sisältä liitetään oheen tällä viittauksella.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on havainnollistaa oheista keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta.

! Esimerkki 1 HTLV—111—peptidin (II) synteesi • · • · ·.*.·' A. BOC-proliini hartsi n synteesi:

Kloorimetyloitu styreeni—divinyylibentseeni—polymeeri, joka sisältää 1,3 mooliekvivalentti a (meq) kloridia yhtä hartsi-grammaa kohden, esteröitiin Boc-proliini11 a vedettömässä N,N-dimetyylif ormamidissa (DMF) käyttäen kai iumjodidia (KI) kata-lyyttisenä aineena. Reaktio toteutettiin 55 eC:n lämpötilassa • · · 24 tunnin aikana tavalla, joka kuvataan teoksessa Steward 8« Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. laitos (1984), Pierce Chemical Co. Boc-proliinin substituoituminen oli 0,92 mmol/g määritettynä pi kriinihappoon perustuvalla menetelmällä suojaamattoman hartsin osasta.

o>8 101797 B. Peptidin (II) synteesi ja tunnusomaisten piirteiden sel-vi ttäminen:

Kaavan (II) mukaisen peptidin synteesi toteutettiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Merrifield, J.Am. Chem. Soc.. 85:2149-54 (1963). Peptidiketju IWGCSGKLICTTA VP syntetoitiin automaattisella Vega 250C-peptidisyntetisaattori 11a käyttäen kaksinkertaista kytkemisohjelmaa. Boc-proliinihartsi in (1,8326 g) kytkettiin kaksinkertaisesti peräkkäin seuraavat Boc-L-ami-nohapot, joita käytettiin 12 mooliekvivalentin ylimääränä, ja jotka oli saatu yhtiöstä Bachem Inc., Torrence, CA:

Ami nohappo Liuotin

Boc-Val CHaCla

Boc—Ala CHaCl2

Boc-(O-Bz1)-Thr CHaCl2

Boc-(O—Bz1)—Thr CHaCl2

Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCla

Boc—Ile CHaCl 2

Boc—Leu ΙΟ Ύ. DMF/CHaCla

Boc—(Cl—Z)—Lys CHaCla

Boc-Gly CHaCla

Boc—(O—Bx1)—Ser CHaCla ... Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCla

Boc-Gly CHaCla

Boc-Trp 10 7. DMF/CHaCl a I Boc-Ile CHaCl 2.

·'·' Edellä esitetyssä peräkkäisiin lisäyksiin perustuvassa menetel— mässä "Boc" on alfa-aminoa suojaavan tert. —butyloksi karbonyyl i-ryhmän kemiallinen lyhenne. Tämä funktionaalinen ryhmä poistetaan hydrolyysi 11 ä 50 V. tri f luorieti kkahappoa (TFA) ja 50 V. dikloorimetaania (CH2CI2) sisältävässä seoksessa sen jälkeen, kun aminohappo on kytketty kasvavaan peptidi ketjuun. Tämä toi-menpide paljastaa ketjun aminopäätteen, jolloin seuraava amino- • · · • · * * happo voidaan kytkeä tehokkaasti.

Jokaisessa aminohapossa olevan suojaavan Boc—ryhmän lisäksi myös eräiden aminohappojen sivuketjut suojataan peptidisynteesissä esiintyviltä kemiallisilta reaktioilta. Nämä kaikki suo- 39 101797 jaavat ryhmät, jotka esitetään suluissa edellä olevassa, peräkkäiseen lisäämiseen liittyvässä luettelossa, ovat stabiileja peptidisynteesin aikana vallitsevissa olosuhteissa, mutta ne voidaan kuitenkin poistaa helposti aminohaposta -fluorivety-hapossa pilkkomisen aikana. Anisoli (metyylifenyylieetteri) toimii nukleo-fiilisenä puhdistaja -fluorivedyssä toteutetun pi 1kkomisvaiheen aikana estäen peptidin aikyloitumisen vapautuvassa suojaavassa ryhmässä olevien karboniumionien seurauksena. Aminohappojen luetellut suojaavat ryhmät on määritelty seuraa-vassa: Q-bentsvvli; bentsyyliesteri; kiinnitetään sekä seriinin että treoniinin hydroksyylisivuketjuun peptidi ketjun asyloitumisen tai haaroittumisen estämiseksi.

MeQbzl: 4-metoksibentsyyli; kiinnitetään kysteiinin sulfhyd-ryyliryhmään sen hapettumisen estämiseksi peptidisynteesin ai kana.

Cl-Z: 2-klooribentsyylioksikarbonyyli; kiinnitetään lysiinin al-fa-aminoryhmään sivuketjun kehittymisen estämiseksi peptidin tästä kohdasta.

Peptidi irroitettiin hartsista 10 71 anisolilla fluorivetyhapos-: : : sa ja se uutetaan etikkahapon 20 71 vesiliuoksella. Tämä liuos suodatettiin kiinteän hartsin poistamiseksi ja se johdetaan suolaa poistavan Fractogel TSK HW—40F—kolonnin läpi käyttäen . I eluenttina etikkahapon 20 V. vesiliuosta. Kolonnin poisteesta kerättiin 10 mlsn suuruisia fraktioita ja tätä poistetta seu- • ** rattiin aallonpituudella 280 nanometriä (nm). Fraktiot, joilla • · · *»*·* saatiin positiivinen absorbanssi aallonpituudella 280 nm, lai mennettiin trifluorietikkahapon (TFA) 0,1 71 vesiliuoksella ja ne analysoitiin nestekromatografisesti erittäin suorituskykyisellä laitteella (HPLC) käyttäen seuraavia HPLC—analyysin olo— :*·*: suhteita:

Puskuri A: 0,1 71 TFA/tislattu, ioninvaihdettu vesi; • · .* * Puskuri B: 0,1 71 TFA/HPLC—1 aatuinen asetonitri i 1 i ; ♦ · · *; ’· Gradienttiolosuhteet: ’ · ·* tilanteesta 10 71 puskuria "B" tilanteeseen 50 71 puskuria "B" puskurissa •’A" 20 minuutin | aikana; 40 1 0 1 7 9 7

Aallonpituus: 214 nm;

Virtaus: 1,0 ml/minuutti (min);

Koi onni: Vydac 214TPS54 C-4 proteiinikoi onni, 250 x 4,5 mm.

Aallonpituudella 214 nm suurimman absorbanssipiikin retentio-ajaksi todettiin 12,42 minuuttia. Fractogel-kolonnin ne fraktiot, jotka sisälsivät enemmäin kuin 70 7. tätä piikkiä, yhdistettiin ja siitä käytettiin merkintää Fr:l. Fractogel-kolonnin ne fraktiot, jotka sisälsivät vähemmän kuin 70 7. mutta enemmän kuin 50 7. tätä piikkiä, yhdistettiin ja niistä käytettiin mer— kintää Fr:2.

Fr:1-fraktion HPLC-analyysi osoitti, että 12,42 minuutin kuluttua saatu piikki muodosti 87 7. koko alueesta. Lisäksi Fr:l-fraktion tunnusomaiset piirteet selvitettiin analysoimalla aminohapot aminohappoanalysaattorilla Alpha Amino Acid Analyzer malli 4150, LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD, määrittämällä aminohappojäännösten järjestys järjestyksen määrittävällä laitteella Protein sequencer, malli 470 A, Applied Biosystems, Foster City, CA, sekä määrittämällä peptidisisältö prosentteina tunnetun peptidimäärän aminohappoanalyysistä saa- , .·, duista tuloksista. Järjestys peptidissä analysoitiin myös pep- • · • ti di—hartsi-yhdistelmästä peptidin odotetun järjestyksen var— mi st ami seksi .

• « · • · • · · : C. Kaavan (II) mukaisen peptidin polymerointi

Yhdistämällä saadun Fr: 1-f raktion sisältämä ja osassa B kuvattu • ♦ *.·.· peptidi lyof i 1 isoi ti in etikkahapon poistamiseksi ja sitä liuo tettiin 200 pg/ml 0,1 M natriumbikarbonaattipuskuriin, pH 9,0. Tätä peptidi 1iuosta laimennettiin pitoisuuteen 20 mikrogram-maa/mi11i1itra (pg/ml) natriumbikarbonaattipuskuri 1la, ja tätä laimennosta käytettiin mikrotiitterilevyn kolojen pinnoittami- ♦ · · seen ELISA-määritystä varten taulukon 4 mukaisesti. Taulukoissa • · · *.*. 4-6 esitettyjä määrityksiä varten peptidiä liuotettiin veteen « « pitoisuudeksi 10 mikrogrammaa/mi 11 ilitra (pg/ml) ja laimennet-: · tiin pitoisuuteen 5 pg/ml fosfaattipuskurilla, pH 7,3 mikro- tiitterilevyn kolojen pinnoittamiseksi.

101797 41

Peptidi esiintyy Fr: 1—-Fraktiossa pääasiassa yhdessä muodossa, Jonka uskotaan olevan hapettumaton monomeeri. Koska kaavan (II) mukainen peptidi sisältää- kuitenkin kaksi kysteiiniä, niin se polymeroituu ilman läsnäollessa liuotettaessa sitä neutraaliin tai emäksiseen vesipitoiseen puskuriin.

Alla kuvatuissa ELISA-määrityksissä käytetty peptidi on seos, Joka sisältää hyvin pieniä määriä lineaarista monomeeria Ja suurempia määriä syklistä monomeeria (Joka on muodostunut poly-peptidin sisäisten disulfidi sidosten avulla) Ja vieläkin suurempia määriä eri kokoisia polymeerejä (Jotka ovat muodostunet polypeptidien välisten disulfidisidosten avulla). Hakijat uskovat, että polymeerimuodot ovat tärkeitä ohessa kuvatuille reaktiivisuuksille, tähän teoriaan kuitenkaan rajoittumatta. Syklisen monomeerimuodon, jossa osa polymeerimuodon antigeeni— syydestä on säilynyt, uskotaan sitoutuvan tehottomammin mikro-tiitterilevyn koloihin ja olevan näin ollen sopimattomampi ELISA-menetelmän kiinteäksi faasiksi. Oletettu syklinen monomeeri nähdään HPLC-analyysissä terävänä piikkinä, jonka reten-tioaika on noin 12,7 minuuttia, kun taas polymeeri saadaan leveänä piikkinä, jonka retentioaika on noin 15,9 minuuttia.

Hapetusolosuhteita voidaan muuttaa lämpötilan, pH-arvon, pepti- 1 * · di pitoisuuden ja muiden vastaavien parametrien suhteen, mikä • · t ! on tunnettua alan asiantuntijalle, preparaatti in jäävän mono- meerin, syklisen monomeerin ja polymeerin osuuden tai muodostu- ·'*’ neiden polymeerien koon muuttamiseksi. ELISA-määrityksessä • · · V.* käytetyissä peptidipreparaateissa voi myös olla läsnä pieniä määriä niinkutsuttuja häviämäpeptidejä (joista puuttuu yksi tai usemapi aminohappo) ja niiden hapettuneita muotoja, mutta nämä vähäiset epäpuhtaudet eivät vaikuta peptidin käyttöön.

• · · « · · • · $ ·*.*. Esimerkki 2 • · · ' - ' — • $ / ; HIV—1—polypeptidien (III) - (XI) synteesi ja tunnusomaisten • · * '· ’· piirteiden selvittäminen ·’ Nämä peptidit syntetoitiin olennaisesti samalla perinteisellä * Merrifield:in tekniikalla, joka kuvattiin aikaisemmin peptidin Λ Π ^ *7 π η I U I / KJ / 42 (II) yhteydessä. Peptidin (III) tapauksessa käytettiin Boc-seriini-hartsia, substitution ollessa 0,92 mmol/g. Peptidin (IV) tapauksessa käytettiin Boc-isoieusiini-hartsia substitution ollessa 0,8 mmol/g. Boc-seriini- ja Boc—isoieusiinihartsit syntetoitiin Sisin—menetelmällä edellä mainitussa julkaisussa Stewart & Young esitetyllä tavalla.

A. Peptidin (III) tapauksessa aminohappojäännösten ketju IWGCSGKLICTTAVPWNAS syntetoitiin käyttäen seuraavia Boc-L-ami-nohappoja 12 mooliekviValentin ylimääränä:

Aminohappo Liuotin

Boc-Ala CHaCla

Boc-Asn/Hobt DMF

Boc—Trp 10 ’/. DMF/CHsCla

Boc-Pro CHaCl a

Boc—Vai CHaCl a

Boc—AI a CHaCla

Boc-(0-Bz1)-Thr CHzCl2

Boc-(0-Bz1)—Thr CHsCla

Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCla

Boc—11 e CHaCl2

Boc—Leu 10 7. DMF/CHaCla

Boc-(Cl-Z)-Lys CHaCla

Boc-Gly CHaCl a : ί Boc-(0-Bz1)-Ser CHaCla *.*.* Boc-(MeOBz 1)-Cys CHaCl a :X: Boc-Gly CHaCl a

Boc-Tpr 10 7. DMF/CHaCl 2

Boc-I1e CHaCl2· B. Peptidin (IV) tapauksessa peptidi ketju AVERYLKDQQLLGIWG- * CSGLKI syntetoitiin käyttäen seuraavia Boc-L-aminohappoja 12 • · · *.*. mooliekviValentin ylimääränä: < · *,*·· Aminohappo Liuotin : Boc—Leu 10 7. DMF/CHaCla *·.’ Boc-(Cl-2)-Lys CHaCl a

Boc-Gly CHaCla 101797 43

Boc-(O-Bz1)-Ser CHaCla

Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCl=

Boc-Gly CHaCla

Boc-Trp lO /. DMF/CHaCl :*

Boc—He CHaCla

Boc-Gly CHaCla

Boc-Leu 10 7. DMF/CHaCl a

Boc-Leu lO 7. DMF/CH^Cl a

Boc—Gln/Hobt DMF

Boc-Gln/Hobt DMF

Boc-(Bzl ) —Asp CHaCla

Boc-(Cl-Z)—Lys CHaCla

Boc-Leu 10 7. DMF/CHaCl a

Boc—(Br—Z)—Tyr CHaCla

Boc— (Tosyyl i ) — Arg 10 7. DMF/CHaCl a

Boc-(Bzl)—Blu CHaCla

Boc-Val CHaCla

Boc—A1a CHaCla·

Kuten peptidin (II) tapauksessa, jokaisessa aminohapossa olevan suojaavan Boc-ryhmän lisäksi myös eräiden aminohappojen sivu-ketjut suojataan peptidisynteesissä esiintyviltä kemiallisilta reaktioilta. Peptidin (II) synteesissä käytettyjen aminohappo— ! jen tapauksessa kuvattujen suojaavien ryhmien lisäksi seuraavia • · i suojaavia ryhmiä käytettiin vain peptideissä (III) ja (IV) • · esiintyvien aminohappojen tapauksessa:

Hobt: 1-hydroksibentsotriatsol i ; käytetään ekvi mol aari sinä ·.·.· määrinä glutamiinin ja asparagiinin suojaamiseen kytkemisen aikana nitrii1imuotoon johtavan veden lohkeamisen estämiseksi. Tosvvl i ; p-tolueeni-sul-fonyyl i ; käytetään arginiinin sivuketjussa esiintyvän guanidiiniryhmän asyloimiseen.

Bzl: beeta-bentsyyliesteri | salpaa karboksyyliryhmät aspar— « tiinihapon ja glutaamihapon sivuketjussa.

• · ·

BrZ: 2-bromibentsyyl ioksi karbonyyli ; salpaa hydroksyyl iryhmän • · • · · *. tyrosiinin sivuketjussa.

Peptidit irroitetaan hartsista, suodatetaan, uutetaan etikka-hapolla ja johdetaan suolaa poistavan Fractogel—kolonnin läpi 44 101797 esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Peptidin (IV) tapauksessa Fractogel-kolonnista saadut -fraktiot analysoitiin analyyttisellä HPLC-menetelmäl1ä ja fraktiot, jotka sisälsivät suurena piikkinä, jonka retentioaika oli noin 14 minuuttia, vähintään 30 V. kokonaisabsorptiosta aallonpituudella 214 nm, yhdistettiin. Yhdistetyt fraktiot käsiteltiin kromatografisesti kar— boksimetyyliselluloosan a, joka oli tasapainotettu 0,01 M am-moniumasetaati1la, pH 4,4. Kolonnia eluoitiin ammoniumasetaa-tilla porrasgradienttia käyttäen ja se fraktio, joka eluoitui 0,2 M ammoniumasetaati1la, otettiin talteen, 1yofi1isoitiin ja analysoitiin analyyttisellä HPLC-menetelmäl1ä. Suuri piikki, jonka retentioaika oli 15 minuuttia, käsitti 30 - 40 7. koko-nai sabsorpti osta aallonpituudella 214 nm ja tämän materiaalin aminohapposisältö oli hyväksyttävä. Tämä materiaali liuotettiin uudestaan ja sitä käytettiin ELISA-menetelmässä peptidin (II) yhteydessä kuvatulla tavalla.

Peptidin (III) tapauksessa Fractogel-kolonnista saadut fraktiot analysoitiin samoin analyyttisellä HPLC-menetelmällä. Fraktiot, jotka sisälsivät vähintään 70 7. kokonai sabsorpti osta aallonpituudella 214 nm suurena piikkinä, jonka retentioaika oli arviolta 12,99 minuuttia, yhdistettiin, lyofi1isoitiin ja analysoitiin HPLC-menetelmällä ja tämän fraktion aminohappopitoisuus määritettiin. Tämä materiaali liuotettiin uudestaan ja sitä käytettiin ELISA-menetelmässä peptidin (II) yhteydessä kuvatulla tavalla.

Kun peptidejä (III) ja (IV) käytettiin yhdistelmänä ELISA-mene-telmässä kiinteän faasin muodostavana komponenttina, niin 1 mikrogramma peptidiä (III) ja 0,5 mikrogrammaa peptidiä (IV) käytettiin mikrotiitteri1evyn yhtä koloa kohden. Peptidi joko kuivattiin koloon 37 °C:n lämpötilassa tai se “märkäpakattiin" levylle inkuboimalla yön yli 4 °C:n lämpötilassa.

• · « · '· ” C. Peptidin (V) tapauksessa Boc-seriini—hartsia käytettiin ·...* peptidin (III) synteesin yhteydessä kuvatulla tavalla. Peptidin (V) synteesi toteutetaan samalla tavalla kuin peptidin (III) synteesi lisäämällä peptidin (III) C-päätteeseen isoleusiini.

101797 45

Sen jälkeen, (V)-ketjun täydelliseksi valmistamiseksi, noudatettiin menettelytapaa aminohappojen lisäämiseksi järjestyksessä AVERYLKDQQLLG peptidiin (IV).

Peptidi (V) irroitettiin hartsista, suodatettiin, uutettiin etikkahapolla ja johdettiin Fractogel-kolonnin läpi, aallonpituudella 280 nm suurimman piikin sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niistä käytettiin merkintää Fr:1. Fr:1—fraktiosta analysoitiin aminohappopitoisuus ja se todettiin hyväksyttäväksi. Tämä fraktio lyofilisoitiin ja sitä käytettiin ELISA-menetelmässä peptidin (II) yhteydessä kuvatulla tavalla.

D. Kaavojen (I) ja (VI) — (XVI) mukaiset peptidit valmistettiin samankaltaisia menettelytapoja noudattaen.

E. Peptidit (I) - (III), (V) ja (VII) - (X) sisältävät kaksi kysteiiniä. Näin ollen nämä peptidit voivat polymeroitua ja sykli soitua hapettumalla disulfidisidoksen muodostumisen seurauksena ilmakehän hapen toimiessa hapettimena. Neljän amino-happojäännöksen lisääminen ketjun (III) C-päätteeseen helpottaa ilmeisesti peptidin syklisen muodon sitoutumista muoviin ELISA-kokeessa. Tämän seurauksena peptidin (III) syklinen muoto on .·. tehokkaampi kiinteään faasiin perustuvassa ELISA-menetelmässä kuin syklinen peptidi (II). Peptidien (II), (III) ja (V) ne muodot, joita on tähän saakka käytetty ELISA-menetelmässä HIV- 1-vasta-aineen tunnistamisen määrittämiseksi, ovat tyypilli— ·'·' sesti olleet seos, joka sisältää lineaarista monomeeria, syk- • · • · lista monomeeria, dimeeriä ja polymeeriä.

Peptidit (IV), (VI) ja (XI) sisältävät vain yhden kysteiinin.

Nämä peptidit voivat muodostaa dimeerirakenteen disulfidisi- :*·*; doksen avulla.

« • · • · · • · · • · #· · Olosuhteissa, joissa peptidit liuotetaan ELISA-menetelmää var— ’· ten (esim. 0,1 M natriumbikarbonaatti, pH 9,0 ilman ja sen sisältämän hapen läsnäollessa), suurin osa peptidien (II), (III), (IV) ja (V) sulfhydryyliryhmistä on muuttunut disulfidi— muotoon.

101797 46

Esimerkki 3 HTLV—I11—vertai1upeptidi en vaimi stami nen

Esimerkeissä 2 Ja 3 esitettyjen menetelmien kaltaisilla menetelmillä syntetoitiin vertailun mahdollistamiseksi peptidit. Joilla on seuraavat kaavat:

Merkintä Ketju

(C-I) QLQ ARILAVERY

(C-II) AVERYLKDQQLLG

(C-III) LKDQQLLGIWGCS

(C-IV) IWGCSGKLI sekä (C-VIII) LICTTAVPWNASWSN.

Näiden kunkin peptidin ketju vastaa HIV-1-kuoriosan ketjua mutta ne eivät ole aikaisemmin kuvattuja di—cys— eivätkä di— leu-polypeptidejä. Erityisesti, kaavojen (C-I) ja (C-II) mukaiset peptidit ovat ketjuja, jotka sijaitsevat ylävirran puolella kaavan (I) eli CSGLKIC mukaisen ketjun aminopäästä. Kaavan (C—III) mukaiset peptidit sisältävät ainoastaan aminopäätteen puoleisen osan kaavan (I) mukaisesta ketjusta. Kaavan (C-IV) mukaiset peptidit sisältävät kaavan (I) koko ketjun karboksi-. .·. päätteen L-cys-jäännöstä lukuun ottamatta. Kuten ohessa kuva taan, yhdelläkään näistä peptideistä ei todeta toivottavia immuunireaktiivisia ominaisuuksia.

Esimerkki 4 "·’·* HIV—1 ELISA—määritystä varten tarkoitetun reagenssipakkauksen • · · valmistus ja menetelmä sen käyttämiseksi A. Menettelytapa 1 HIV-1 ELISA:n toteuttamiseksi (1) ELISA-levy pinnoitetaan peptidillä — 1 pg/50 μΐ/koko 0,1 M NaHCOs-liuoksessa, pH 9; (2) levyjen annetaan kuivua niitä peittämättä 37 eC:n lämpö— • · · • * tilassa, minkä jälkeen ne pestään PBS-1iuoksella; *· (3) levyjä suojataan suojaavalla puskurilla (5 7. NCS-PBS; 300 *...· μΐ/kolo) 2 tuntia 37 *Csn lämpötilassa; • * (4)_suojaava puskuri ravistellaan ulos ja kolot valutetaan ____: tyhjiin; 101797 47 (5) koloihin lisätään 50 μΐ/kolo kokeen antiseerumia (ensimmäinen vasta-aine) 30 — 120 minuutiksi 37 *C:n lämpötilassa. (Mikäli antiseerumi pitää -laimentaa, niin tällöin käytetään T—pesua.) Laimennoksia suhteessa 1:2 - 1:100 ollaan käytetty; (6) kokeen antiseerumi kaadetaan pois ja levy pestään kuusi kertaa PBS—Tween 20—seoksella; (7) levylle lisätään 100 μΐ/kolo merkittyä, spesifisesti sitovaa ainetta entsyymillä merkittynä toisena vasta—aineena laimennettuna suhteessa 1:4000 T-pesun avulla. Levyä pidetään 30 — 120 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa; (B) mahdollisesti reagoimatta jäänyt toinen vasta-aine kaadetaan pois ja levy pestään kuusi kertaa PBS—Tween 20—seoksella; (9) levylle lisätään 100 μΐ/kolo OPD-substraattia (tai 5 μΐ ABTS—1iuosta) 20 minuutiksi huoneen lämpötilassa; (10) levylle lisätään 50 μΐ/kolo 4N rikkihappoa H2SQ4. OPD-reaktion pysäyttämiseksi (tai 100 μΐ/kolo 1 7. SDS— liuosta ABTS-reaktiota varten); (11) tulokset lueteen levyjen mittauslaitteella MR 500 Micro— plate ELISA (aallonpituudella 490 nm 0PD:n tai 405 nm ABTS:n tapauksessa).

. ! Reagenssit: (1) 0,1 M NaHCOs, pH 9; '_· · (2) NCS-PBS: -fosfaatilla puskuroitu suolaliuos (PBS), joka '·*.* sisältää 5 7. normaalin vasikan seerumia; • · (3) T-pesu: (780 ml TBS + 20 ml NCS + 1,6 g naudan seerumin albumiinia (BSA) + 0,4 ml polyöksietyleeni (29) sorbitaani-monolauraattia (Tween 20); TBS: 12,22 g Tris—emästä ·:·. 17,5 g NaCl

1800 ml HaO

• · • · pH arvoon 7,6 HC1—1iuoksella (noin 3N) • · · ’· *· lopullinen tilavuus 2000 mi 11 i 1 i tr aksi.

'...· (4) Pesupuskuri PBS-Tween 20: 0,5 ml Tween 20 litrassa PBS— • « liuosta; 101797 48 (5) OPD-substraatti: yksi o—fenyleenidiamiini (OPD)-tabletti/3 ml HaO/1,24 μΐ 30 7. HzQ*; (6) 4 N HaSO*;

(7) ABTS:HaOs liuosten tilavuussuhteessa 1:1, toimittaja Kirke-gaard ja Perry Laboratories, Inc., Gaithersbury, MD. ABTS

= 2,2' -atsi no-di-C3-etyyl i bent st iät soi iini— sul-f onaatti ]; (8) 1 7. SD5: 1 % natriumdodekyylisulfaatti.

Vaiheessa 1 ELISA-levyn pinnoittamiseen käytetty materiaali □n kaavan (II), (III), (IV) tai (V) mukaista peptidiä tai niiden seosta, kuten edellä esitetään. Toinen vasta-aine on joko kaupallisesti saatavaa, peroksidaasilla merkittyä, polyklonaa-lista anti-ihmisen immunoglobuliinivasta-ainetta (Cappel Laboratories Catalog no. 3201-0231; vuohen anti-ihmisen immunoglo-buliinien peroksidaasiin konjugoitu IgG—fraktio) tai peroksidaasilla merkittyä hiiren monoklonaalista anti-ihmisen IgG— vasta-ainetta (Ortho-Diagnostics, Inc., Raritan, NJ) tai seos, joka sisältää peroksidaasilla merkittyä hiiren monoklonaalista anti-ihmisen IgG-, IgA- ja IgM-vasta-aineita.

B. Menettelytapa 2 HIV-1 ELISA:n toteuttamiseksi (Taulukot 10 ja 13): (1) ELISA-levy pinnoitetaan peptideillä - 1,0 pg peptidiä IV, • 0,5 pg peptidiä III, 200 pl/kolo 0,1 M karbonaattipusku- i rissa, pH 9,6; (2) levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa; (3) levyjä suojataan käyttäen 300 pl/kolo 1,0 7. BSA-PBS + lisä- • · • · · aineita 1,5 tuntia 37 *C:n lämpötilassa; (4) suojaava puskuri kaadetaan pois; (5) levyjä kuivataan 1,0 tuntia 37 *C:n lämpötilassa; (6) levyille lisätään 200 pl/kolo 1 7. naudan gammaglobuliinia - • 5 7. BSA - 0,5 7. Tween 20-PBS, pH 7,2; (7) levyille lisätään koeseerumeita 20 pl/kolo, ja niitä inku- • · · • · _· ‘ boidaan 30 minuuttia 37 °C:ssa; *· · (B) koeseerumit kaadetaan pois, levyt pestään 5κ PBS - 0,5 7.

Tween 20-1iuoksel1 a: (9) levyille lisätään 200 pl/kolo piparjuuren peroksidaasi11 a merkittyä monoklonaalista anti-ihmisen IgGrtä, joka on 101797 49 laimennettu suhteessa 1:3500 liuoksella, joka sisältää 50 7. sikiöasteisen vasikan seerumia, 1 7. hevosen seerumia ja 0,5 % Tween-PBS-seosta; (10) levyjä inkuboidaan 30 minuuttia 37 *C:ssa; (11) merkitty monoklonaalinen anti—ihmisen IgG kaadetaan pois ja levyt pestään 5x PBS - 0,05 7. Tween 20-seoksella; (12) levyille lisätään 200 μΐ/kolo OPD-substraattia ja niitä inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa; (13) levyille lisätään 50 μΐ/kolo 4N rikkihappoa HzSO* reaktion pysäyttämiseksi; (14) tulokset mitataan levyiltä aallonpituudella 490 nm mikro-tiitterilevyjen lukulaitteella MR 500.

Reaoenssit: (1) Fosfaatilla puskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,3; 8.0 g natriumkloridia; 0,2 g kaiiumfosfaattia, yksiemäksinen; 1,16 g natriumfosfaattia, kaksiemäksinen; 0,2 g kaiiumkloridia; 0,2 g timerosaalia; vettä 800 mi 11i1itraksi ja sekoitus, pH asetetaan mikäli tarpeen; \ vettä lisätään 1 litraksi.

(2) pinnoittava puskuri; pH 9,6, 0,01 M karbonaatti puskuri.

(3) Suojaava puskuri on PBS-liuosta, joka sisältää seuraavat lisäaineet: ’m 17. naudan seerumin albumiinia (Sigma A7030); • · ·*·* 10 KU/ml aprotiniinia; 10 pg/ml trypsiini-inhibiittoria; 10 mM EACA (E-aminokaproehappo); 0,5 mM PMSF (fenyyli-metyyli-sulfonyylifluoridi); :T: 2,0 mM EDTA; lO 7. glyserolia; • · .* * (4) Näytteen laimennin: ;· 10,0 g naudan gammaglobuliinia, fraktio II, lyofilisoitu; 50.0 g naudan albumiinia, fraktio V; 0,5 ml polysorbaattia 20 (Tween 20); Γ vettä lisätään litraksi ja sekoitetaan; 50 Λ Γ\ Λ Γγ ^ rv 10(/ y/ suodatetaan 0,2 mikronin suodattimen läpi.

(5) Konjugaatin laimennin: 490 ml PBS; 500 ml lämmöllä inaktivoitua sikiöasteisen naudan seerumia; 10 ml lämmöllä inaktivoitua hevosen seerumia; 0,1 g timerosaalia; 0,329 g kaiiumferrisyanidi a; vettä lisätään 1 Ultraksi, sekoitus; suodatus 0,2 mikronin suodattimen läpi.

Esimerkki 5 HIV-l-peptidiin II perustuvan ELISA:n arviointi

Esimerkissä 4A kuvatut, peptidiin II perustuvat reagenssipakkaukset ELISA-määritystä varten arvioitiin joukolla seerumeita, jotka käsittivät normaalikohteista saatuja seerumeita, immuunikatoon (AIDS) liittymättömistä häiriöistä tai sairauksista kärsivien potilaiden seerumeita, tunnettujen AIDS—potilaiden seerumeita, tunnettujen ARC-potilaiden seerumeita sekä seerumeita sellaisista potilaista, joiden diagnoosi on tuntematon, mutta jotka ovat HIV-2-vasta-aineiden suhteen positiivisia . kaupallisilla kokeilla tai Western:in täpläkokeella määritet- • · * .tynä. Tulokset on koottu yhteen taulukkoon 4 — 7. Vertailun vuoksi nämä samat seeruminäytteet määritettiin kaupallisesti \ saatavilla reagenssipakkauksi11 a, joissa käytetään hyväksi ;·· antiggeenina toimivaa virushajotetta, sekä Western:in täplä— *·’·' analyysillä. Näitä tutkimuksia varten valitut kaupalliset rea— • · • · · *.*.· genssipakkaukset olivat peräisin yhtiöistä Abbott Laboratories,

North Chicago, 111. ja Electro-Nucleonics, Inc., (END, Columbia, MD. Kunkin kaupallisen reagenssipakkauksen mukana seuranneita käyttöohjeita noudatettiin kutakin taulukoissa 4-7 esi-tettyä koetta toteutettaessa. Määritystä, jossa polypeptidiä *·.·. (II) käytetään kiinteän -faasin antigeeninä, sekä esimerkissä • · · • · • · 4A kuvattua menettelytapaa kutsutaan ,,EB"-määritykseksi näissä i '! taulukoissa. Seerumit, joilla saatiin samankaltaisia tuloksia

• < I

·...’ toteutetuissa määrityksissä, on ryhmitelty yhteen seuraavissa « « taulukoissa tulosten esityksen selkeyttämiseksi.

101797 51 A. Taulukossa 4 esitetään normaaleilla seerumeilla saadut tu-1okset.

Taulukko 4

Normaalien seerumeiden määrittäminen ELISA—menetelmällä peptidiä (II) käyttäen Näytteiden E8- ENI— Abbott— Diagnoosi;

1 ukumäärä_määritys_määritys_määritys_Näyte ID

198 - 5-, 194NT 41-, 156NT normaali 1 — — + normaali; 749 1. + NT NT normaal i; 200 2846

Normaalien keskimääräinen absorbanssi = 0,016 E8-kokeessa Standardipoikkeama (SD) keskiarvosta = 0,017 AbsDrbanssin cutoff-arvo keskiarvon kohdalla + SD = 0,104 Väärien positiivisten suhteellinen määrä 200 näytteen tapauksessa cutoff—arvon ollessa 0,104: 0,5 7. (1/200) NT = ei määritetty « · · Näyte ID = seerumin näytenumero.

« • · » « ( • · » ·'·' Kuten taulukosta 4 nähdään, tarkastellut seerumit. Jotka eivät i · • * « M ; sisällä HIV-l-virusta vastustavia vasta-aineita, eivät yleensä • ( reagoi peptidin (II) kanssa tavallisessa ELISA—määrityksessä.

• · ϊ Tämän avulla voidaan laskea absorption cutoff— arvo vasta—aineen suhteen negatiivisten Ja vasta—aineen suhteen positiivisten seerumien erottamiseksi toisistaan. Näiden 200 normaalin seerumin edellä esitetyssä määrityksessä cutoff-arvoksi valittiin .···, 0,104. Tällä cutoff-arvolla väärien positiivisten osuuden ole- < · · * . tetaan olevan 0,5 X tai sitä vähemmän.

• · · • · * · • · • ·,**: B. Jotta saataisiin osoitetuksi se, että väärät positiiviset tulokset saadaan eliminoiduksi tehokkaammin käyttämällä kaavan • · * (II) mukaista peptidiä verrattuna kaupallisesti saataviin rea— genssipakkauksiin, joissa kohdeantigeeninä käytetään virushajo- 101797 52 tetta, kahdesta AIDS:iin liittymättömästä häiriöstä, nimittäin nenänielun syövästä ja nivelreumasta (NR), kärsivistä potilaista saatuja lukuisia seerumeita määritettiin E8-kokeella ja kaupallisilla menetelmillä. Tulokset on koottu alla olevaan taulukkoon 5 ja niistä nähdään E8-määrityksen parempi spesifisyys. Useat näytteet, joilla saatiin vääriä positiivisia tuloksia kaupallisilla menetelmillä, tunnistettiin asianmukaisesti negatiivisiksi E8-määrityksessä.

Taulukko 5

Nenä-nielun syövästä ja nivelreumasta kärsiviin potilaisiin kohdistuvat määritykset Näytteiden E8— ENI— Abbott— Diagnoosi;

lukumäärä_määritys_määritys_määritys_Näyte ID

6 (+) NT (+) NPC/ei—AIDS

17 - NT (+> NPC/ei-AIDS

8 - NT - NPC/ei-AIDS

1 - NT NT NPC/ei-AIDS

1 - NT - NR/ei-AIDS

920

7 - 2-, 5NT 3-, 4NT NR/ei-AIDS

•i.: 1 - - (+) NR/ei-AIDS

615 (+) = väärä positiivinen NT = ei määritetty NPC = nenä-nielusyöpä NR = nivelreuma.

C. Jotta saataisiin osoitetuksi E8-määrityksen tehokkuus ajatellen HIV—1—vasta—aineiden määrittämistä AIDS/ARC—poti laiden *·* * seerumista kaupallisiin reagenssipakkauksiin verrattuna, niin *.*.· esimerkissä 4 menettelytapana A kuvattu ELISA—reagenssipakkaus • · : arvioitiin joukolla seerumeita, jotka oli saatu diagnostoi- ··. duista AIDS- ja ARC—potilaista. Tulokset on koottu taulukkoon 6 ja niistä nähdään, että tämä määritysmenetelmä vastaa täysin kaupallisia reagenssipakkauksia ajatellen sen kykyä tunnistaa 101797 53 HIV-l-virusta vastustavaa vasta-ainetta sisältävät seerumit. Taulukko 6 AIDS/ARC-seerumeiden määrittäminen Näytteiden E8- ENI- Abbott- Diagnoosi;

lukumäärä_määritvs_määritvs_määritys_Nävte ID

67 + + + (16NT) AIDS

2 (-) (-) (-) AIDS; 533, 3621 1(-)+ + AIDS; 653 2 + + (-) AIDS; 661, 662

21 + + + ARC

2 (-) (-) (-) ARC; 95 512, 529 (-) = väärät negatiiviset ARC = AIDS:iin liittyvä kompleksi NT = ei määritetty.

D. Väärien positiivisten tulosten suuri osuus, mikä on tunnus-omaista tällä hetkellä saataville reagenssipakkauksi 1 le käytettäessä virushajotetta antigeeninä, johtuu osittain solun antigeenien läsnäolosta hajotteessa, jotka antigeenit reagoivat sekä AIDS- että ei-AIDS-potilaiden seerumeissa läsnäolevien vasta-aineiden kanssa. Tämän lisäksi monimutkaiset antigeenit, j*.'. kuten esimerkiksi HIV-l-viruksesta peräisin olevat antigeenit, sisältävät useita epitooppeja, ja ne reagoivat todennäköisemmin epäspesifisesti ihmisen seerumissa läsnäolevien vasta-aineiden kanssa.

··· • t · ’ Peptidi (II) pienentää potilaan seerumin kanssa reagoitavan « · ’·*·’ antigeenin monimutkaisuutta siten, että läsnä on vain yksi • · tai ehkä muutama epitooppi. Näin ollen mahdollisuus epäspesi — • « fiseen vuorovaikutukseen muiden kuin HIV—1—vasta—aineiden kans— • · sa saadaan huomattavasti pienemmäksi. Epäspesifiset vuorovaiku tukset ovat kuitenkin edelleen mahdollisia, koska eräät vasta- 101797 54 aineet ovat "tahmeita" ja voivat sitoutua määrityksessä käytettyyn muoviseen kantajaan tai muihin proteiineihin kuten naudan seerumin albumiiniin tai vuohen seerumeihin, joita käytetään levyn suojaamiseen peptidin lisäämisen jälkeen.

Alla olevassa taulukossa 7 esitetään tulokset, jotka on saatu eri potilasseerumeiden määrityksistä. Tavallisen, peptidiä (II) käyttäen toteutetun määrityksen, joka kuvataan esimerkissä 4 menettelytapana A, lisäksi kukin seerumi määritettiin peptidiä (II) vastaan sen jälkeen, kun seeruminäytteeseen oli sekoitettu tehokkaasti suojaava määrä peptidiä (II). Taulukossa esitetään samoin tulokset, jotka saatiin määrittämällä kukin näyte kaupallisesti saatavilla reagenssipakkauksina.

Näiden tulosten perusteella on selvää, että ei—AIDS-potilaiden seeruminäytteet, jotka tunnistettiin asiattomasti positiivisiksi joko toisella tai molemmilla kaupallisesti saatavilla reagenssipakkauksi11 a, tunnistetaan asianmukaisesti negatiivisiksi käytettäessä peptidiki1pai1uun perustuvaa E8—koetta. Lisäksi jopa näytteet, jotka tunnistettiin asiattomasti positiivisiksi E8-määrityksellä, tunnistettiin asianmukaisesti ·'. negatiivisiksi peptidikilpailuun perustuvalla EB-määri tyksel lä.

Merkittävää on se, että suojaukseen tai kilpailuun perustuvaa määritystä voidaan käyttää varmistavana menetelmänä määritettäessä seeruminäytteitä, jotka sisältävät HIV—1—virusta torjuvia vasta—aineita. Viimeiset seitsemän taulukon 7 mukaisesti • ·’ määritettyä näytettä ovat positiivisia vasta—aineen suhteen • · • * sekä EB-menetelmällä että kaupallisesti saatavilla menetelmillä määritettynä (lukuunottamatta kahta väärää negatiivista tulosta Abbott:in reagenssipakkausta käytettäessä) sekä vaivalloisemmalla ja aikaa vievällä, Western:in täpliin perustuvalla mene-telmällä määritettynä. Näiden seerumeiden reaktiivisuus kiin-teän -faasin antigeeninä toimivan peptidin (II) kanssa salvataan • · · • * * tehokkaasti sekoittamalla kuhunkin seerumiin peptidiä (II), '· *· mikä osoittaa, että vasta-aineen reaktiivisuus peptidin kanssa ·...· on spesifinen peptidin suhteen, ja että nämä viimeiset seitse män näytettä ovat todella positiivisia.

55 101797

Taulukko 7

Kilpailuun perustuva määritys, jolla varmistetaan positiivi-nen/negatiivinen ELISA

ELISA-arvo & arvio Näyte peptidillä Abbott- ENI- Western- Diag- ID suojaa- suojattu määritys määritys määritys noosi _mat°n_(arvio)_

3615 0,031 0,033(-) RA

3195 0,026 0,045(-) - +* DP

3196 0,028 0,039(-) - + * DP

3197 0,065 0,073(-) - +* DP

3376 0,104 0,105(-) - +* UNK

3362 0,740 0,727(-) - +* UNK

912 0,055 0,065(-) +* NT - NPC

918 0,100 0,092(-) +* NT - NPC

922 0,127 0,103(-) +* NT NT NPC

923 0,114 0,080(-) + * NT NT NPC

3644 0,336 0,380(-) + * +* - UNK

. 3406 1,400 1,390(-) + * + * - DP

.'··. 3461 1,426 1,137(-) +* +* - DP

I 3532 1,770 0,080( + ) + + + UNK

• · ·

"Λ’* 3469 0,300 0,030( + ) + + + UNK

• · ·

3431 0,507 0,087( + ) NT + + UNK

*··:·' 644 0,160 0,024( + ) NT + + AIDS

659 0,510 0,042(+) + + + AIDS

• ·

661 0,500 0,031( + ) -** + + AIDS

··’:*·· 662 0,160 0,030( + ) -** + + AIDS

i * * i * · 4 1«

• S

56 101797 # = väärä positiivinen ** = väärä negatiivinen

DP = dialyysipotilas, ei-AIDS

NPC = nenä—nielusyöpä, ei-AIDS

UNK = tuntematon RA = nivelreuma, ei-aids (-) ja - = negatiivinen HIV-l-vasta-aineen suhteen (+) ja + = positiivinen HIV-l-vasta-aineen suhteen.

Esimerkki 6 HIV-l-peptidien (I) - (XV) ja (C—I) — <C—III) vertaaminen ELI— SA-menetelmäl1ä

Esimerkin 4 menettelytapana A kuvatut ELISA-reagenssipakkaukset tehtiin peptidejä (I) - (XV) sekä (C-I) - (C-III) käyttäen. Kukin ELISA—reagenssipakkaus arvioitiin kymmenen seeruminäytteen joukolla, joka käsitti kliinisesti positiivisia näytteitä, eli näytteitä, joissa HIV—1—infektion läsnäolo oli ilmeinen kaupallisilla määritysmenetelmillä ja Westernsin täpliin perustuvalla menetelmällä määritettynä. Näistä määrityksistä saadut tulokset esitetään alla olevassa taulukossa 8.

Peptidimääritystä pidetään positiivisena, mikäli absorbanssin (optisen tiheyden) taso ELISA-määrityksessä oli yli kaksinker— täinen taustaan verrattuna määritettäessä laskemalla kahdella normaalilla seerumilla saadun absorbanssin keskiarvo. Esitetty ·.·.· keskiarvo tarkoittaa optisen tiheyden keskiarvoa ELISA-määri- • « tyksessä tausta-arvon vähentämisen jälkeen laskien. Esitetty indeksi on tietyn peptidin painotettu aktiivisuus suhteessa kaavan (II) mukaisen peptidin aktiivisuuteen. Indeksi on painotettu tietyn peptidimäärityksen kyvyn osoittaa asianmukaisesti positiivinen arvo selvästi erottuneena normaalista taustasta « · · . eduksi. Kaava, josta tämä indeksi saadaan, on seuraava: • * · • · ·

Indeksi = :/·· (Z positiivisia)3 x keskiarvo : : (Z positiivisia**)3 x keskiarvo** missä Z positiivisia on Z positiivisia tietyssä peptidimäärityksessä; 101797 57 keskiarvo tarkoittaa tietyn peptidimäärityksen keskiarvoa; V. positiivi siä xx tarkoittaa 7. positiivisia kaavan (II) mukaiseen peptidiin perustuvassa määrityksessä; sekä keskiarvoxx on keskiarvo kaavan (II) mukaiseen peptidiin perustuvassa määrityksessä.

Kuten taulukosta 8 nähdään, kaikki kaavojen (I) - (V) mukaisia peptidejä käyttäen toteutetut määritykset tuottavat positiivisia tuloksia vähintään 50 7. tapauksista tai useammin, ja kussakin tapauksessa indeksiksi saadaan vähintään 0,1. Toisaalta yksikään vertailukappale, vaikka ne ovatkin hyvin lähellä toisiaan sijaitsevia, päällekkäin meneviä tai osittain päällekkäin meneviä kappaleita HIV—1-kuoriosasta, ei tuota tällaisia positiivisia tuloksia eikä tällaista suurta indeksiä. Samoin näistä tuloksista nähdään, että polypeptidien (III) ja (IV) seoksen käyttö tuottaa paremman tuloksen keskiarvoa ja indeksin arvoa ajatellen kuin polypeptidi (V), jonka ketju sisältää ketjujen (III) ja (IV) yhdistelmän.

• » « · 4 4 4

' · I

4 4 « < 4 4 • · • • · · « · · • · • · · • ♦ · • · « • · • · * • · · • · • · • · • · · • *4 • · « # • « 56 101797

Taulukko 8

Peptidin X posi- Keeki- kaava_Ket iu_tiivisia arvo_indeksi (II) IWGCSGKLICTTAVP 80 1,67+0,82 1,00 (C-V) QLTVWGIKQLQARIL 0 - - 0 (C-VI) GIKQLQARILAVERY 20 0,45+0,06 0.01 (C-I) QLQARILAVERY 0 - 0 (C-IX) QARILAVERYLKDQQ 0 - 0 (XV) RILAVERYLKOQQLLGIWGCS 90 2,01+1,40 1,56 (C-II) " AVERYLKDQQLLG 10 0,04 - <0,01 (C-VII) AVERYLKDQQLLGIW 60 1,18+0,68 0,35 (IV) * AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI 100 2,23+0,68 2,26 (XII) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC 100 1,95+0,27 2,Il (C-III) LKDQQLLGIWGCS 30 0,28+0,06 0,02 (XIV) LKDQQLLGIWCCSGK 90 1,69+0,65 1,43 (VI) . LKDQQLLGIWGCSGKLI 100 1,19+0,85 1,65 (VII) LLGIWGCSGKLIC 50 0,22+0,05 0,09 (XI) LLGI WGCSGK.L ICTT 80 1,53+0,77 0,96 (C-IV) 7UGCSGKLI 20 0,17+0,00 0,01 (I) CSGKLIC 60 0,34+0,11 0,19 (VIII) QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS 90 0,51+0,25 0,79 (IX) IWGCSGKLICTTAVPWN 70 0,86+0,45 0,48 (III) . IWGCSGKLICTTAVPWNAS 100 2,20+0,86 2,24 . „ (XIII) GCSGKLICTTAVPWN 100 2,14+0,58 2,21 V: (X) CSGKLICTTAVPWNAS 100 1,74+1,01 1,99 (XI) SCKLICTTAVPWNAS 50 0,86+0,63 0,17

(C-VIII) - LICTTAVPWNASWSN 0 - O

(V) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS 100 1,53+0,66 1,89 ... (Ill) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI + • « ·* * i (IV) IWGCSGKLICTTAVPWNAS 100 >3.0 - 2,62 * * * • · • e • · I < « · • · 59 101797

Esimerkki 7 ELISA-menetelmien vertaaminen käyttäen HIV-l-peptidejä (III) ja (IV)

Edelleen muita AIDS/ARC-potilaiden seerumeita määritettiin ELISA-menetelmillä käyttäen näitä kahta erittäin reaktiivista, kaavojen (III) ja (IV) mukaista peptidiä (esimerkki 4, menettelytapa 1). Taulukossa 9 esitetään eräiden näiden seerumeiden reaktiivisuus absorbanssiarvona ilmoittaen.

Taulukko 9

Peptidin kaava

Seeruminäyte (III) <IV) 3362 0,503 0,515 3412 >2,00 0,540 3693 0,559 0,120 3722 0,620 0,193 0649 1,756 0,379 3555 0,428 >2,00 . 3575 0,350 1,773 3744 0,311 1,326 • < ' : 3790 0,224 1,765 0509 0,403 2,000 0653 0,111 0,999 0662 0,301 1,392 « · » · · * · t __________________________________________ • · 3416 1,914 >2,00 3456 1,670 1,780 3666 >2,00 >2,00 3414 1,453 1,057 3411 >2,00 >2,00 • · » 3413 >2,00 >2,00 • « < · i « · --------— — -m mm m, m, - mm mm m ... -- - . , - • · t * • * < 101797

Suurin osa analysoiduista seerumeista reagoi erittäin hyvin kummankin peptidin kanssa, kuten taulukon 9 ryhmän C kohdalla voidaan todeta. Kuitenkin satunnaisesti tietyt näytteet olivat huomattavasti reaktiivisempia yhden peptidin kanssa kuin toisen, kuten taulukon 9 ryhmistä A ja B todetaan. Nämä tiedot osoittavat, että tässä 32:n aminohapon alueessa voi olla useampia kuin yksi epitooppi (esimerkiksi lineaarinen ja konformaa-tioon perustuva epitooppi tai kaksi lineaarista epitooppia), jonka HIV-l-virukselle altistuneet potilaat yleisesti tunnistavat. Kaavojen (III) ja (IV) mukaisten, liuoksena olevien peptidien erittäin suorituskykyinen nestekromatografinen analyysi (HPLC) osoittaa, että kaavan (III) mukaiset peptidit esiintyvät suureksi osaksi syklisinä monomeereina, kun taas kaavan (IV) mukaiset peptidit ovat useimmiten dimeerisessä muodossa. Näiden kahden peptidin disulfidisidoksista johtuvat rakenteelliset ominaisuudet liittyvät sekä kykyyn toimia antigeeninä että konformaatioon perustuvan epitoopin muodostumiseen.

Polypeptidi en (III) ja (IV) erilaista reaktiivisuutta tarkasteltiin edelleen vertaamalla kummankin peptidin tapauksessa ELISA-määrityksissä saatuja absorbanssiarvoja, jotka määritykset toteutettiin esimerkin 4B mukaisesti käyttäen peptidiä (III), peptidiä (IV) tai peptidien (III) ja (IV) yhdistelmää kiinteän faasin antigeeninä. Kullakin 37 seerumilla peptidiin ‘•V (III) perustuvassa ELISA—määrityksessä saadut absorbanssiarvot : jaettiin niillä arvoilla, jotka saatiin peptidiin (IV) perustuva vassa ELISA-määrityksessä. Tuloksena olevat absorbanssiarvojen : : : suhteet esitetään suuruusjärjestyksessä taulukossa 10.

Taulukosta 10 voidaan nähdä, että 37 tutkitusta seerumista 30:11a todettiin suurempaa immuunireaktiivisuutta peptidin Vi·, (III) kanssa kuin peptidin (IV) kanssa.

• · I

• · • t · • · · • · • I I • t i i 61 10179/

Taulukko 10

Polypeptidien (III) _ia (IV) vertaaminen Seerumin Suhde numero (III) (IV) (III) i (IV) (III)-KIV) 4099 2,000 Of 018 111,11 2,000 4074 0,980 0,019 51,58 1,260 4084 2,000 0,039 51,28 1,834 0641 0,641 0,014 45,79 0,834 4109 2,000 0,088 22,73 2,000 4100 2 j000 0,105 19,05 1,930 3228 1,682 0,125 13,46 1,538 3868 0,200 0,022 9,09 0,572 4062 0,187 0,022 8,50 0,422 4089 0,756 0,108 7,00 1,130 3869 0,548 0,134 4,09 1,019 4008 0,664 0,215 3,09 1,246 4067 1,806 0,644 2,80 1,780 4068 1,773 0,649 2,73 1,898 4007 —1,866 0,776 2,40 1,730 4086 1,503 0,644 2,33 1,473 3980 0,280 0,131 2,14 0,560 4082 1,518 0,786 1,93 1,781 3544 0,322 0,167 1,93 0,385 4006 0,214 0,120 1,78 0,340 4071 0,810 0,504 1,61 1,164 4117 2,000 1,262 1,58 1,955 4078 2,000 1,318 1,52 2,000 X; 4095 2,000 1,396 1,43 2,000 3281 0,804 0,569 1,41 1,544 4111 2,000 1,587 1,26 2,000 4092 0,552 0,462 1,19 1,764 4010 2,000 1,832 1,09 2,000 1 4063 0,642 0,597 1,08 0,848 3226 2,000 1,897 1,05 2,000 .·. : 4083 2,000 2,000 1,00 2,000 101797 62

Taulukko 10 (Jatkoa)

Seerumin Suhde numero (III) (IV) (III)s(IV) (III)+(IV) 4110 1,964 2,000. 0,98 2,000 3455 0,239 0,244 0,~98 0,196 3785 0,170 0,352 0,48 0,493 4077 0,400 i,040 °r38 1)290 4115 0,042 0,150 0,28 0,271 3983 0,070 li767 0,04 1,988

Esimerkki 8 HIV-l-peptidin kilpailevaan inhibitioon kohdistuvat tutkimukset

Lisäosoitusta siitä, että enemmän kuin yksi epitooppi on läsnä kaavojen (III) Ja (IV) mukaisissa peptideissä, saadaan kilpai-lututkimuksien tuottamista absorbanssiarvoista, Joista esimerkkejä esitetään taulukossa 11. Tässä esimerkkinä toimivassa tutkimuksessa kaavan (III) Ja (IV) mukaisten peptidien seosta laitettiin mikrotiitterilevylle immobi1isoiduksi, kiinteän -Faasin antigeeniksi ja ELISA-määritys (esimerkki 4A) toteutettiin viidessä erilaisissa olosuhteissa: ilman kilpailua tai kilpailu ylimäärällä kaavan (III) mukaista peptidiä, kaavan (IV) mukaisella peptidillä, kummankin peptidin (III) ja (IV) seoksella tai heterologisella peptidillä. Kilpailu toteutettiin lisäämällä asianmukaista peptidiä (peptidejä) laimennetuttuun seerumiin juuri ennen seeruminäytteen lisäämistä mikrotiitteri— levyn koloon.

• « · « · · • ·

Taulukko 11

Kilpailevan oeotidin kaava Suojaa— Hetero- Näyte maton (III) < IV) (III)-MIV) looinen 3412 1,450 0,113 1,182 0,059 1,348 3413 >2,00 0,381 2,032 0,068 2,026 /*· 3416 >2,00 1,811 1,055 0,197 2,041 :·**· 3544 1,810 0,876 0,137 0,048 1,750 • · » 3575 1,267 0,982 0,105 0,036 1,304 • · 3693 0,340 0,103 0,217 0,065 0,293 3790 1,558 1,320 0,635 0,134 1,349 101797 63 Näissä olosuhteissa on hyvin selvää, että eräät näytteet reagoivat erittäin hyvin kummankin tai molempien peptidien (III)

Ja (IV) kanssa. Esimerkiksi näyte 3416 reagoi hyvin molempia peptidejä sisältävän seoksen kanssa, koska kilpailu pelkän kaavan (III) mukaisen peptidin kanssa tuotti optiseksi tiheydeksi (OD) > 1,8, kilpailu kaavan (IV) mukaisen peptidin kanssa tuotti optiseksi tiheydeksi 1,055 ja molempien kilpailevien peptidien läsnäollessa optinen tiheys putosi olennaisesti tausta-arvojen tasolle. Muut seeruminäytteet, kuten 3412, reagoi paljon voimakkaammin yhden peptidin kanssa kuin toisen; tässä tapauksessa OD pieneni arvosta >1,4 arvoon 0,113 kaavan (III) mukaisella peptidillä suojattaessa, ja pysyi arvossa >1 kilpailun tapahtuessa kaavan (IV) mukaisen peptidin kanssa. Näytteessä on kuitenkin selvästi vähäistä reaktiivisuutta kaavan (IV) mukaisen peptidin kanssa, koska molempien peptidien läsnäollessa immuunireaktiivisuus lakkaa täysin (0,059). Edelleen, kilpailevina peptideinä toimiva peptidien (III) ja (IV) seos tuottaa aina paremman tuloksen kuin käytettäessä pelkästään jompaa kumpaa peptidiä.

Toinen ki1pai1ututkimus käyttäen peptidiä (I) levyllä kiinteän ·'· -Faasin antigeeninä sekä esimerkin 4A mukaista menettelytapaa .··. osoitti, ettei kaavan (IV) mukainen peptidi kilpaile tehokkaas- . ti kaavan (I) mukaisen peptidin kanssa vaikka kaavan (III) .‘ mukainen peptidi kilpaileekin hyvin tehokkaasti. Katso alla ' " 1 oleva taulukko 13.

• · • · *.V Taulukko 12

Kilpailevan peptidin kaava Suojaa- Hetero- Näyte maton (I) (III) (IV)_ looinen 013 1,177 0,038 0,046 0,770 0,865 ··· : 014 0,383 0,050 0,067 0,273 0,324 • « * · ♦ • · · ---1-----------— ——_______—————————————————— —— • · • « • i • · · Näin ollen näistä analyyseistä ilmenee se, että kaavan (III) '11. mukaisessa peptidissä läsnäoleva epitooppi on myös läsnä kaavan .. ·' (I) mukaisessa peptidissä, ja että tämä epitooppi eroaa olen— 64 1C 1797 naisesti kaavan (IV) mukaisessa peptidissä läsnäolevista epi-toopeista. Edelleen, tämän saman näytteen perusteella, käytännöllisesti katsoen kaikki seerumit reagoivat kaavojen (III) ja (IV) mukaisten peptidien käsittämien epitooppien kanssa, vaikkakin monissa tapauksissa voimakkaammin yhden peptidin kanssa kuin toisen.

Esimerkki 9 ELISA-määritys käyttäen HIV-l-peptidien (III) ja (IV) yhdistelmää Käyttäen esimerkin 4B mukaisessa ELISA-määrityksessä kiinteän -Faasin antigeeninä yhdistelmää, joka sisältää 1 pg kaavan (III) ja 0,5 pg kaavan (IV) mukaista peptidiä koloa kohden, todettiin, että tämän määrityksen spesifisyys ja herkkyys oli yhtä hyvä tai parempi verrattuna kaikkiin testattuihin, kaupallisesti saataviin, virushajotteeseen perustuviin, vasta-aineen ilmaisemiseen soveltuviin reagenssipakkauksiin.

Taulukossa 13 esitetään ELISA—tulokset, jotka on saatu potilaiden seerumeilla, normaaleilla seerumeilla sekä erilaisista sairauksista, mukaan lukien nivelreuma, nenä-nielusyöpä, Epstein— Barr—viruksen aiheuttama infektio, sytomegaloviruksen aiheuttama infektio, gram-negatiivinen sepsis, toksoplasma gondii, systeeminen lupous erythematosus sekä herpes—viruksen aiheuttama infektio, kärsivien potilaiden seerumeilla.

• · • · · • · · • · • · · • · · • t · 1 • i · • · · « · · • · • · « t • · · • «

Taulukko 13 65 101797

Seeru- (III) (III) Näyte mien ENI +(IV) ENI +(IV) ryhmä lkm. _pos. poa. neo. neo.

AIDS+ARC 458(234)* 449 450 9 8 oireellinen PLS 320(146) 239 242 81 78 oireeton/riskiryhmä immunologisia epänormaalisuuksia 135(87) 38 39 97 96 oireeton/riskiryhmä immunologisesti nor- 134(69) 10 10 124 124 maali normaali/ei-AIDS 728(728) 12 4 716 724 erilaisista sairauksista kärsivien ryhmä/ei-AIDS 387(387) 10 7 337 380 yhteensä ei-AIDS 1115 22 11 1039 1104 * Numerot suluissa tarkoittavat potilaiden lukumäärää.

Kun oletettujen normaaleiden seerumien reaktiivisuus määritettiin (III)+(IV)-menetelmällä sekä yhtiön Electronucleonics,

Inc. (ENI) markkinoimalla menetelmällä, niin (III)+(IV)-pepti-dimääritys tuotti merkittävästi pienemmän osuuden vääriä positiivisia tuloksia. Kuten taulukon 13 tuloksista nähdään, väärien positiivisten tulosten osuus ENI-määrityksessä oli 1,65 % . ,·. (2/728), kun taas (III) + (IV) -peptidimäärityksessä väärien posi- ·>>' tiivisten tulosten osuus oli vain 0,55 % (4/728). Tarkastelta- I * essa väärien positiivisten tulosten osuutta erilaisista sai- . raukeista kärsivien potilaiden ryhmässä todetaan, että peptidi- • · · määrityksessä väärien positiivisten tulosten osuus oli hieman • · · *·*·’ pienempi kuin ENI-määrityksessä eli 1,81 % verrattuna arvoon • * ·.·.* 2,58 % (7/387 verrattuna arvoon 10/387).

:Y: Esimerkki 10 • · STLV-III-kaltaisten polypeptidien synteesi

Polypeptidit p80 ja p81 syntetoitiin käyttäen olennaisesti samaa perinteistä Merrifield:in tekniikkaa, joka kuvataan edellä. Peptidin p80 tapauksessa käytettiin Boc-kysteiinihartsia • « 66 101797 substitution ollessa 0,71 mmool ia/gramma, esimerkin 2 mukaisesti valmistaen. Peptidin p81 tapauksessa käytettiin Boc-se-riinihartsia substitution ollessa 0,67 moolia/gramma, esimerkin 2 mukaisesti valmistaen.

A. Polypeptidin p80 tapauksessa aminohappojäännösten ketju AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC syntetoitiin käyttäen seuraavia Boc-L-aminohappoja 12 mooliekvivalentin (meq) ylimääränä:

Aminohappo Liuotin

Boc-Val CHaCla

Boc-Gln/Hobt DMF

Boc-(Tosyyli)-Arg 10 7. DMF/CHaCla

Boc-Phe CHaCl2

Boc Ala CHsCl2

Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCl2

Boc-Trp 10 7. DMF/CHaCl a

Boc-Ala CHaCl 2

Boc-Asn/Hobt DMF

Boc-Leu 10 7. DMF/CHaCla

Boc-Gln/Hobt DMF

Boc—AIa CHsCls

: Boc—Gln/Hobt DMF

Boc—(Bzl)—Asp CHaCl3

Boc-(Bxl )-Blu CH^Cla ; ' : Boc-Leu 10 7. DMF/CHaCl 2

Boc— (Br—Z) —Typ CHaCl 2

Boc— (Cl -Z) —Lys CHaCl2

Boc— (Bzl) —Glu CHaCl 2

Boc—Ile CHaCl=

Boc-Ala CHaCl3 B. Polypeptidin ρθΐ tapauksessa aminohappojäännösten ketju AWCAFRQVCHTTVPWPNAS syntetoitiin käyttäen seuraavia Boc-L-ami- » · ,· ] nohappoja 12 mooli ekvivalentin ylimääränä: 4 · < ; : Aminohappo Liuotin

Boc-Ala CHaCl 3 « «

··· Boc-Asn/Hobt DMF

• * » ·

Boc-Pro CHaCl a • · 101797 67

Boc—Trp 10 7. DMF/CHaCla

Boc-Pro CHaCla

Boc-Val CHaCla

Boc—(0—Bzl) —Thr CHaCla

Boc-(0—Bzl)-Thr CHaCla

Boc-(Z-karbobentsoksi)-His CHaCla

Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCl2

Boc-Val CHaCla

Boc—Gln/Hobt DMF

Boc-(Tosyyli)-Arg 10¾ DMF/CHaCla

Boc-Phe CHaCla

Boc-Ala CHaCla

Boc-(MeOBz1)-Cys CHaCla

Boc-Trp 10 7. DMF/CHaCl 2

Boc-Ala CHaCl a

Polypeptidit irroitettiin erikseen vastaavista hartseista, uutettiin etikkahapolla, johdettiin suolaa poistavan Fractogel-kolonnin läpi ja analysoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 11 STLV-III-polypeptidien p80 ja p81 arvioiminen erillisinä ja yhdistelmänä ELISA-menetelmällä .·.·' Alustavat tutkimukset käyttäen kahta seerumia, jotka sisälsivät suuria pitoisuuksia HIV-2-virusta vastustavia vasta-aineita, : toteutettiin ELISA-määrityksellä käyttäen kumpaakin peptidiä p80 ja p81 yksinään ja yhdistelmänä. Immunolon II-mikrotiit- « · terilevyjen (Dynatech, Alexandria, VA) koloihin sekoitettiin 100 mikrolitraa (μΐ) 0,01 M NaHC0s-liuosta, pH 9,6, joka sisältää 1 mikrogramman <pg) joko peptidiä p80 tai p81 tai niiden ... yhdistelmää (seosta) määrinä 1 pg p80- ja 1 pg p81-peptidiä.

* / Levyjä pidettiin noin 16 tuntia 4 °C:ssa, jotta polypeptidit • · · ·"·* voisivat adsorboitua kolojen seinämiin (pinnoittaa ne). Poly- peptidiä sisältävä pinnoittava liuos poistettiin ravistelemal- • · la, minkä jälkeen kuhunkin koloon lisättiin 300 pl PBS-liuosta, _· joka sisälsi 1 V. naudan seerumin albumiinia (BSA), 5 mM bants- amidiinia, lO kiloyksikköä aprotiniinia, 10 pg/ml trypsiini— 101797 68 inhibiittoria, 10 mM yhdistettä EACA, 0,5 mM yhdistettä PMSF, 2 mM yhdistettä EDTA ja 10 7. glyserolia, ylimääräisten proteiinin sitoutumiskohtien saipaamiseksi.

Koloja pidettiin 90 minuuttia 37 °C:ssa, salpaava liuos poistettiin ravistelemalla ja kolot kuivattiin pitämällä niitä 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, jolloin saatiin aikaan oheisen keksinnön mukainen diagnoosijärjestelmä, eli STLV-III-kal-taista polypeptidiä sisältävä kiinteä kantaja (polypeptidillä pinnoitettu kolo).

Polypeptidillä pinnoitettuun koloon sekoitettiin 200 μΐ kutakin seerumia laimennettuna suhteessa 1:10 TBS-1iuoksel1 a. Tuloksena olevaa, kiinteän ja nestemäisen faasin käsittävää immuunireaktion seosta pidettiin 37 eC:n lämpötilassa 30 minuuttia polypeptidiä sisältävien immuunireaktion tuotteiden muodostumiseksi. Sitten kolot huuhdottiin 5 kertaan PBS-1iuoksel1 a, joka sisälsi 0,05 7. tuotetta Tween 20.

Sitten kuhunkin koloon sekoitettiin 200 μΐ piparjuuren peroksi-daasilla merkittyä hiiren monoklonaalista anti-ihmisen IgG-vasta-ainetta (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ) laimennettuna suhteessa 1:35000 PBS—1iuoksel1a, joka sisältää 50 7. si ki öasteisen vasikan seerumia, 1 7. hevosen seerumia ja ·.·.· 0,5 7. tuotetta Tween 20. Tuloksena olevaa merkittyä reaktio- seosta pidettiin 30 minuuttia 37 *C:ssa polypeptidiä sisältä— i:: vien merkittyjen kompleksien muodostamiseksi. Sitten kolot huuhdottiin viiteen kertaan seoksella PBS - 0,05 7. Tween 20 • · reagoimatta jääneen merkityn vasta—aineen poistamiseksi.

Sitten kuhunkin koloon sekoitettiin 200 μΐ 0PD—substraattia ... kehittyvän reaktioseoksen muodostamiseksi. Tätä kehittyvää • · « * « · ‘ . reaktioseosta pidettiin 30 minuuttia noin 20 *C:n lämpötilassa, • · · minkä jälkeen kuhunkin koloon sekoitettiin 50 μΐ 4N rikkihappoa HaSO* kehittyvän reaktion pysäyttämiseksi, ja tuloksena olevien liuosten absorbanssit määritettiin aallonpituudella 490 nm käyttäen mikrotiitterilevyjen mittauslaitetta.

69 1C 1797 Näistä tutkimuksista saadut tulokset osoittavat, että sekä p80 ja p81 kykenevät immuunireagoimaan HIV-2:n indusoimien vasta-aineiden kanssa. Polypeptidi p80 tuotti kummallakin seerumilla absorbanssiarvoja, jotka ovat suurempia kuin 1,1, kun taas p81 tuotti noin arvoja 0,4. Kun ELISA toteutettiin peptidien p80 ja p81 seoksella, niin tällöin saadut absorbanssiarvot olivat verrattavissa pelkällä peptidillä p81 saatuihin arvoihin.

Esimerkki 12 HIV-1- ja STLV-III-polypeptidien spesifisyyteen liittyvät tutkimukset HIV-1- ja STLV-III-polypeptidien kyky erottaa toisistaan HIV-l-ja HIV-2-infektioiden indusoimat vasta-aineet arvioitiin kolmella seerumiryhmällä. Ensimmäinen ryhmä koostui 20 seerumista, jotka oli otettu talteen HIV-2-eristeen vasta-aineen suhteen positiivisista länsiafrikkalaisista potilaista heidän käydessään avohoitoklinikassa Bissaussa, Guinea-Bissau, epäiltyyn tuberkuloosiin liittyvien tutkimusten vuoksi. Nämä kaikki seerumit immuunireagoivat HIV-2:n kanssa ELISA-määrityksessä käytettäessä antigeeninä rikottuja vironeita (viruslysaattia).

Nämä seerumit sisälsivät myöskin vasta-aineita, jotka reagoivat HIV-2:n TMP-proteiinin (gp36) kanssa Western:in täpliin perus- ,tuvassa määritysmenetelmässä, mutta niillä ei todettu reaktii-« * visuutta HIV-l:n TMP-proteiinin (gp41) kanssa.

p Toiseen ryhmään kuului seerumeita, jotka oli saatu 20 HIV-l- • · * ί·: : vasta-aineen suhteen positiivisesta, oireettomasta ruotsalai- • · · *.·.* sesta (homoseksuaalisista miehistä, huumausaineita suonen si- • · *.V säisesti väärinkäyttävistä henkilöistä tai verenvuototaudista kärsivistä henkilöistä), ja jotka reagoivat Western:in täpliin ;Y; perustuvassa määrityksessä HIV-l:n TMP-proteiinin (gp4l) ja sen :*·*: muiden antigeenien kanssa, muttei HIV-2 TMP-proteiinin (gp36) *. kanssa.

4 · « I · 4 4« '·;·* Kolmas ryhmä koostui 20 seerumista, jotka oli saatu kaupalli- sesti saatavilla diagnoosi järjestelmillä (saatu yhtiöistä Orga- • · 101797 70 non, Teknika, N.V., Tunhout, Belgia, sekä Wellcome Reagents, Ltd., Lontoo, UK.) sekä HTLV-IV—virushajotteeseen perustuvalla ELISA-menetelmällä määritettäessä HIV-1- ja HIV-2-vasta-ainei-den suhteen negatiivisista ruotsalaisista veren luovuttajista.

Kiinteät kantajat, jotka käsittivät HIV-1-polypeptidien (III) ja (IV) yhdistelmää kiinnitettynä mikrotiitterilevyn koloihin, valmistettiin esimerkissä 11 esitetyllä tavalla käyttäen 200 Ml 0,1 M NaHCDs-liuosta, pH 9,6, joka sisältää 5 pg/ml kumpaakin polypeptidiä kolojen pinnoittamiseksi. Samoin esimerkin 11 mukaisesti valmistettiin erilaisia kiinteitä kantajia, jotka käsittivät STLV—III—polypeptidiä p80 kiinnitettynä mikrotiit— terilevyn koloihin. Sitten edellä kuvattujen seerumien kaikki kolme ryhmää määritettiin käyttäen sekä polypeptidien (III) ja (IV) yhdistelmää sisältävää (HIV-1-spesifistä) kiinteätä kantajaa että peptidiä p80 sisältävää (HIV—2-spesifistä) kiinteätä kantajaa esimerkissä 11 kuvatussa ELISA-menetelmässä.

Näiden kaikkien seerumiryhmien ELISA—tulokset on esitetty kuviossa 3. Ne 20 seerumia, jotka sisälsivät HIV—2—viruksen indu-soimia vasta-aineita, mutta jotka eivät sisältäneet vasta-ai-. neita HIV-1 TMP-proteiinille gp41, tuottivat voimakkaita reak- tioita STLV-111—kai tai sen polypeptidin pBO kanssa, mutta eivät tuottaneet, yhtä seerumia lukuunottamatta, olennaista immuuni-reaktiota HI V-l-kai tai sten polypeptidien (III) ja (IV) yhdis— • telmän kanssa.

• · · • ·

Sitä vastoin ne 20 seerumia, jotka sisälsivät HIV-1-virusta • · torjuvia vasta-aineita, reagoivat polypeptidejä (III) ja (IV) sisältävien kiinteiden kantajien kanssa, mutta eivät tuottaneet, nytkin yhtä poikkeusta lukuunottamatta, olennaista im— ... muunireaktiota vain peptidiä p80 sisältävien kiinteiden kanta- • · « • · » * jien kanssa. Negatiiviset vertai 1useerumit eivät tuottaneet • · · ’1·’ lainkaan olennaista immuunireaktiota HIV-1- eikä STLV-III-spe- ; sifisten kiinteiden kantajien kanssa.

• « Näiden kahden seerumin, jotka tuottavat immuunireaktion sekä ·· HIV-1- että STLV-III—spesifisten kiinteiden kantajien kanssa, • · · > i • · 71 myöhemmän analyysin perusteella uskotaan, että ne henkilöt, joista nämä seerumit oli saatu, olivat altistuneet sekä HIV-1-että HIV-2—virukselle.

Koska polypeptidit (III) ja (IV) todettiin eri tavoin reaktiivisiksi (esimerkki 7), niin polypeptidejä p80 ja p81 verrattiin samalla tavalla. Kullakin 24 seerumilla peptidiin p80 perustuvassa ELISA-määrityksessä saadut absorbanssiarvot jaettiin niillä arvoilla, jotka saatiin peptidiin p81 perustuvassa ELISA-määri tyksessä. Tuloksena olevat absorbanssiarvojen suhteet esitetään suuruusjärjestyksessä taulukossa 14.

Taulukosta 14 voidaan nähdä, että tutkitusta 24 seerumista 19:n immuunireaktiivisuus oli suurempi peptidin p80 tapauksessa kuin peptidin p81 tapauksessa.

Näin ollen oheisessa keksinnössä saadaan aikaan määritysjärjestelmä ja -menetelmä, joilla altistuminen HIV—1—virukselle ja altistuminen HIV-2-virukselle voidaan erottaa toisistaan sekä todeta.

« · « • · · • « · • i t i i • 4 • · · • · • · • · · • · · • · • · · • · · • · · 1 · • · · • · · • a • a a a • a a • · a a » < a • » • a

Claims (25)

10179/ Taulukko 14 Peptidien p80 Ja p81 vertaaminen Seerumi n Suhde numero d80 _o81 o80:p81 6602 0,516 0,001 516^000 6698 2,000 - 0,022 90,910 5740 2,000 0,043 - 46,510 6877 0,248 0,008 31,000 6650 " 0,700 0,034 20,590 3616 0,686 0,047 14,600 3942' 0,588 0,051 11,530 6674 2,000 0,258 7,752 3541 0,181 0,025 7,240 3743 0,257 0,040 6,425 6665 0,254 0,053 4,792 6604 1,808 0,400 4,520 6661 0,647 0,160 4,044 6603 1,152 0,421 2<736 3923 0,180 0,067 2,687 6601 0,353 0,138 2,558 5182 0,162 0,102 1,588 6600 0,359 0,306 1,173 5160 0,251 0,236 1,064 5727 0,504 0,563 0,895 6599 0,206 0,232 0,888 6683 - 0,387 0,489 0,791 6631 0,153 0,285 0,537 Vi’ 6598 0,072 0,205 0.,351 • · · I · i • · • · · • · · • · « • · • · · Edellä olevan kuvauksen, erityiset suoritusmuodot Ja esimerkit • · mukaan lukien, tarkoitus on havainnollistaa oheista keksintöä .··. sitä millään tavalla rajoittamatta. Lukuisat muut muunnokset • * Ml • · Ja muutokset ovat mahdollisia oheisen keksinnön todellisesta » * · ···? hengestä Ja tavoitteista kuitenkaan poikkeamatta. • · 101797

1 I « II innehäller högst 33 aminosyrarester och väri sekvensen av ’·*·* aminosyrarester hos nämnda polypeptid är homolog med den sek vens som visas i figur l. • · * · « te

1. Polypeptid, väsentligen bestäende av högst cirka 50 aminosyrarester och innefattande en sekvens av aminosyrarester av fontein -CAFRQVC-, varvid sekvensen av polypeptiden härstammar frän TMP-proteinet och polypeptiden kan immunoreagera med antikroppar som induce-rats av HIV-2.

1. Polypeptidi, joka koostuu korkeintaan noin 50 aminohappo jäännöksestä ja joka sisältää kaavan -CAFRQVC- mukaisen aminohappojäännösten ketjun, mainitun polypeptidin sekvenssin ollessa peräisin TMP-proteiinista ja kyetessä immuu-nireagoimaan HIV-2-viruksen indusoimien vasta-aineiden kanssa.

2. Polypeptid enligt patentkrav l, kannetecknad av att I I » ,···. nämnda polypeptid icke väsentligt immunoreagerar med antikrop- • « /·'/·, par inducerade av HIV-1-virus. I i · I I

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi ei immuunireagoi olennaisesti HIV-l-viruksen indusoimien vasta-aineiden kanssa.

3. Polypeptid enligt patentkrav 1, kannetecknad av att den

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää korkeintaan 33 aminohappojäännöstä ja että mainitussa polypeptidissä aminohappojäännösten ketju on homologinen kuviossa 1 esitetyn ketjun kanssa.

4. Polypeptid enligt patentkrav 3, kännetecknad av att nämnda polypeptid har en sekvens av aminosyrarester som rep- * · · il! resenteras av en formel, vald bland följande grupp: S · tr t AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC, AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, 101797 AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, AWGCAFRQVCHITVPWPNAS, och CAFRQVC.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen polypeptidi, tunnettu :.·* siitä, että mainitussa polypeptidissä aminohappo j äännös ten ket- 4 ► ',,,ί ju on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: « « | t » t : AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, . V. AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, . /. AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC, • « i AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, ,. AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, t ’ SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, ‘ AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, ; AWGCAFRQVCHITVPWPNAS ja CAFRQVC. • f · i * i · '‘*t 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, joka koostuu • t ’· korkeintaan noin 50 aminohappojäännöksestä ja joka sisältää kaavan -AWGCAFRQVC- 101797 mukaisen aminohappojäännösten ketjun, mainitun polypeptidin sekvenssin ollessa peräisin TMP-proteiinista ja kyetessä immuu-nireagoimaan HIV-2-viruksen indusoimien vasta-aineiden kanssa.

5. Polypeptid enligt patentkrav l, väsentligen bestäende av högst cirka 50 aminosyrarester och innefattande en sekvens av aminosyrarester som representeras av formeln: -AWGCAFRQVC- varvid sekvensen av polypeptiden härstammar frän TMP-proteinet och nämnda polypeptid kan iinmuno reage ra med antikroppar induce-rade av HIV-2.

6. Polypeptid enligt patentkrav 1, bestäende väsentligen av högst cirka 50 aminosyrarester härstammande frän ΊΜΡ-proteinet och innefattande en sekvens av aminosyrarester som representeras av en formel, vald ur gruppen: -AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC- , -AWCAFRQVCHTTVPWPNAS- , . -AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC- , . . -AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC- , . V. -AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC- , 4 · < , ‘., -SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT- , • t ',.' -AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS- , -AWGCAFRQVCHITVPWPNAS-, och • · ♦ *-v -CAFRQVC- . • · I **· 7. Förfarande för analys med avseende pä närvaro av anti- V · HIV-2-antikroppar i ett prov av kroppsvätska, kännetecknat av . .·. att det innefattar stegen, att: • · « ···, a) en immunoreaktionsblandning framställes genom blandning I · *’* av ett prov av kroppsvätska med en polypeptid som väsentligen bestär av högst cirka 50 aminosyrarester och innefattar en sek- vens av aminosyrarester som representeras av formeln: -CAFRQVC- „ 101797 varvid nämnda polypeptid kan immunoreagera med antikroppar in-ducerade av HIV-2-virus; b) immunoreaktionsblandningen hdlles under biologiska ana-lysbetingelser under en tidsrymd, tillräcklig för att eventuel-la anti-HIV-2-antikroppar som föreligger i provet skall immunoreagera med nämnda polypeptid och bilda en polypeptidhaltig immunoreaktionsprodukt; och c) analys genomföres med avseende pä närvaro av polypeptidhaltig immunoreaktionsprodukt som bildats, och därigenom pä närvaron av eventuella anti-HIV-2-antikroppar i provet.

6. Patenttivaatimuksen l mukainen polypeptidi, joka koostuu korkeintaan noin 50 TMP-proteiinista peräisin olevasta aminohappo jäännöksestä ja joka sisältää aminohappojäännösten ketjun, joka on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: -AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC-, -AWCAFRQVCHTTVPWPNAS-, -AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC-, -AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC-, -AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC-, -SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT-, -AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS-, -AWGCAFRQVCHITVPWPNAS- ja -CAFRQVC-.

7. Menetelmä anti-HIV-2-vasta-aineiden läsnäolon määrittämiseksi ruumiinnesteen näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmän käsittämissä vaiheissa: « · '.··* (a) muodostetaan immuunireaktion seos sekoittamalla ruumiinnes- 4 1· :teestä saatuun näytteeseen polypeptidiä, joka koostuu korkein- I · v,: taan noin 50 aminohappojäännöksestä ja joka sisältää kaavan < 4 · t t I 4 -CAFRQVC- • · • · • · * • · · • · mukaisen aminohappojäännösten ketjun, mainitun polypeptidin ;·, kyetessä immuunireagoimaan HIV-2-viruksen indusoimien vasta- • · · *... aineiden kanssa; • · « • · · *. (b) mainittua immuunireaktion seosta pidetään biologiselle mää- ritykselle sopivissa olosuhteissa sellaisen ajanjakson ajan, :* : että näytteessä mahdollisesti läsnäolevat anti-HIV-2-vasta-ai neet ehtivät immuunireagoida mainitun polypeptidin kanssa sekä muodostaa polypeptidiä sisältävän immuunireaktion tuotteen; ja ♦ · * 4 4 4 * * (c) täten muodostuneen, polypeptidiä sisältävän immuunireaktion tuotteen mahdollinen läsnäolo ja näin ollen mahdollisten anti-HIV-2 -vasta-aineiden läsnäolo mainitussa näytteessä määritetään. 101797

8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att po- lypeptiden har en sekvens av aminosyrarester som representeras av en formel, vald bland gruppen: AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, AIE KYLEDQAQLNAWGCAFRQV C, AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, . AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, • I 1 AWGCAFRQVCHITVPWPNAS, och CAFRQVC. • i · « · • t I · f < I .V 9. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att ' t * ‘ ; nämnda polypeptidhaltiga immunoreaktionsprodukt vidare beredes | · · för analys enligt steg (c) genom att: (i) en märkningsreaktionsblandning framställes genom att den • : *·' polypeptidhaltiga immunoreaktionsprodukten blandas med märkt, 9 · *·.· * specifikt bindingsmedel som kan bindas till varje human im- . munoglobulinprodukt, och • · · ·**. (ii) den sälunda framställda märkningsreaktionsblandningen ’** upprätthälles under biologiska analysbetingelser under en till- . räcklig tidsrymd för att de märkta antikropparna skall im- ;/·· munoreagera med närvarande anti-HIV-2-antikroppar som polypeptidhaltig immunoreaktionsprodukt under bildning av ett märkt kömpiex. 101797

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun polypeptidin aminohappojäännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC, AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, AWGCAFRQVCHITVPWPNAS ja CAFRQVC.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua, polypeptidiä sisältävää immuunireaktion tuotetta käsitellään edelleen kohdan (c) mukaista määritystä varten siten, että: (i) muodostetaan merkitsevä reaktioseos sekoittamalla mainittuun, polypeptidiä sisältävään immuunireaktion tuotteeseen merkittyä, spesifisesti sitovaa ainetta, joka kykenee sitoutumaan . mihin tahansa ihmisen immunoglobuliinituotteeseen, ja « · (ii) mainittua, täten muodostettua, merkitsevää reaktioseosta pidetään biologiselle määritykselle sopivissa olosuhteissa sei- « · :,v laisen ajanjakson ajan, että mainitut merkityt vasta-aineet ehtivät immuunireagoida mahdollisten, polypeptidiä sisältävänä :Y: immuunireaktion tuotteena läsnäolevien anti-HIV-2-vasta-ainei- • · den kanssa merkityn kompleksin muodostaen. • · ;·. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · * *···. tä, että ennen mainittua, kohdan (a) mukaista sekoittamista • · · mainittu polypeptidi kiinnitetään kiinteään matriisiin. • · · • · · • · · • · ·

10. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att po-lypeptiden fore blandningen enligt steg (a) fixeras vid en fast matris.

11. Diagnostiskt system i satsfom for analys med avseende pä närvaro av anti-HIV-2-antikroppar i ett prov av kroppsväts-ka, kännetecknat av att det innefattar förpackning som innehäl-ler en polypeptid, väsentligen bestäende av högst cirka 50 aminosyrarester och innefattande en sekvens av aminosyrarester som representeras av formeln -CAFRQVC-, varvid nämnda polypeptid kan immunoreagera med antikroppar in-ducerade av HIV-2-virus.

11. Reagenssipakkauksena oleva diagnoosijärjestelmä anti- « HIV-2-vasta-aineiden läsnäolon määrittämiseksi ruumiinnesteestä Y‘: saadusta näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää pakkauk- • · · sen, joka sisältää korkeintaan noin 50 aminohappojäännöksestä koostuvaa polypeptidiä, joka polypeptidi sisältää kaavan -CAFRQVC- 101797 mukaisen aminohappojäännösten ketjun, ja joka polypeptidi kykenee immuunireagoimaan HIV-2-viruksen indusoimien vasta-aineiden kanssa.

12. Diagnostiskt system enligt patentkrav li, kännetecknat av att nämnda polypeptid har en sekvens av aminosyrarester som representeras av en formel, vald bland gruppen: AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC, t \ « : ;' s AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, . ^ # AWGCAFRQV CHTTVPWPNAS, **’* AWGCAFRQVCHITVPWPNAS, och CAFRQVC. • * ♦ ·· * »tl

12. Patenttivaatimuksen li mukainen diagnoosijärjestelmä, tunnettu siitä, että mainitun polypeptidin aminohappojäännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC, AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, AIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, AWGCAFRQVCHITVPWPNAS ja CAFRQVC.

13. Diagnostiskt system enligt patentkrav li, kännetecknat • av att det ytterligare innef attar en HIV-l-besläktad di-cys- ,"*» polypeptid som väsentligen bestär av högst 50 aminosyrarester e«» och innefattar en sekvens av aminosyrarester som representeras '· av formeln: '7·; -CSGKLIC-, varvid nämnda HIV-1-besläktade polypeptid kan immunoreagera med antikroppar inducerade av HIV-1-virus. 101797

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnoosijärjestelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi korkeintaan 50 gp41-proteiinista peräisin olevasta aminohappojäännöksestä koostu- , vaa, HIV-l-kaltaista di-cys-polypeptidiä, joka polypeptidi si- sältää kaavan • · · • · • · • · · V.: -CSGKLIC- < i · «Il « · « < mukaisen aminohappo jäännösten ketjun, mainitun, HIV-1-kai täisen :Y: polypeptidin kyetessä immuunireagoimaan HIV-1-viruksen indusoi- • · mien vasta-aineiden kanssa. • « • · • · ·

14. Dignostlskt system enllgt patentkrav 13, kännetecknat av att den HIV-1-besläktade di-cys-polypeptiden har en sekvens av aminosyrarester som representeras av en formel, vald bland gruppen: CSGKLIC IWGCSGKLICTTAVP, IWGCSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, LLGIWGCSGKLIC, QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, IWGCSGKLICTTAVPWN, CSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC, och GCSGKLICTTAVPWN.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen diagnoosijärjestelmä, • · · tunnettu siitä, että mainitun, HIV-1-kaitäisen di-cys-polypep-tidin aminohappo jäännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen ««« mukaisista ketjuista: « CSGKLIC, ' '* IWGCSGKLICTTAVP, IWGCSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, LLGIWGCSGKLIC, 101797 QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, IWGCSGKLICTTAVPWN, CSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC ja GCSGKLICTTAVPWN.

15. Diagnostiskt system enligt patentkrav 11, kännetecknat av att ytterligare innefattar en HIV-1-besläktad di-leu-poly-peptid, väsentligen bestäende av hogst 50 aminosyrarester och innefattande en sekvens av aminosyrarester som representeras av formeln: -ZLLG(X)WZ'- , väri X betecknar I, L, M eller F; • · ’;··* Z är den sekvens av aminosyrarester hos HIV-l-virusproteinet *·'·* gp41 som är belägen omedelbart intill aminosidan hos L-leucin- :.: : rester i positionen 599 hos proteinet gp41; \v Z' är den sekvens av aminosyrarester hos HIV-l-virusproteinet • · gp4l som är belägen omedelbart intill karboxisidan av L-trypto-fanresten i positionen 603 hos proteinet gp41, och ·*«., väri en av Z eller Z' kan ha en längd av noli rester, och vari Z och Z' tillsammans innef attar minst 10 rester. • 99 • · · ’···’ 16. Diagnostiskt system enligt patentkrav 15, kännetecknat • · · av att den HIV-1-besläktade di-leu-polypeptiden har en sekvens • j· av aminosyrarester som representeras av en formel, vald bland • t f I . ·. : gruppen: 101797 IWGCSGKLICTTAVPWNAS, LKDQQLLGIWGCSGLKI, LKDQQLLGIWGCSGK, RILAVERYLKDQQLLGIWGCS, OCh AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI.

15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnoosijärjestelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi korkeintaan 50 aminohappo jäännöksestä koostuvaa, HIV-1-kaltaista di-leu-polypepti-diä, joka sisältää kaavan -ZLLG(X) WZ'- mukaisen aminohappojäännösten ketjun, jossa X on aminohappojäännös I, L, M tai F; Z on aminohappojäännösten ketju, joka sijaitsee HIV-1-viruksen gp41-proteiinissa välittömästi L-leusiinijäännöksen, joka sijaitsee gp41-proteiinin asemassa 599, vieressä, aminopäätteen puolella; Z' on aminohappojäännösten ketju, joka sijaitsee HIV-1-viruksen gp41-proteiinissa välittömästi L-tryptofaanijäännöksen, joka ;;; sijaitsee gp41-proteiinin asemassa 603, vieressä, karboksipäät- teen puolella; ja 1 ’·* jossa jommankumman ketjuista Z tai Z' pituus voi olla nolla : jäännöstä ja jossa Z ja Z' yhdessä käsittävät vähintään 10 \V jäännöstä. • · • · · • · · • ·

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen diagnoosijärjestelmä, ·*·.. tunnettu siitä, että mainitun, HIV-1-kaltaisen di-leu-polypep- tidin aminohappo jäännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen \ mukaisista ketjuista: • ♦ · • · · • · · ··· :..IWGCSGKLICTTAVPWNAS, • i* LKDQQLLGIWGCSGLKI, : LKDQQLLGIWGCSGK, RILAVERYLKDQQLLGIWGCS ja AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI. 101797

17. Diagnostiskt system enligt patentkrav 13, kännetecknat av att det vidare innefattar en HIV-1-besläktad di-leu-polypep-tid, väsentligen bestäende av högst 50 aminosyrarester och in-nefattande en sekvens av aminosyrarester som representeras av formeln: -ZLLG(X) WZ'-, väri X betecknar I, L, M eller F; Z är den sekvens av aminosyrarester i HIV-l-virusproteinet gp41 som är belägen omedelbart intill aminosidan av L-leucinrester i positionen 599 hos proteinet gp4l; Z' är den sekvens av aminosyrarester hos HIV-l-virusproteinet gp41 som är belägen omedelbart intill karboxisidan av L-trypto-fanresten i positionen 603 hos proteinet gp41, och väri en av Z eller Z' kan ha mängden noli rester, och väri Z och Z' tillsammans innefattar minst 10 rester.

17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen diagnoosijärjestelmä, joka käsittää lisäksi korkeintaan 50 aminohappojäännöksestä koostuvaa, HIV-l-kaltaista di-leu-polypeptidiä, joka sisältää kaavan -ZLLG(X)WZ'- mukaisen aminohappojäännösten ketjun, jossa X on aminohappojäännös I, L, M tai F; Z on aminohappojäännösten ketju, joka sijaitsee HIV-1-viruksen gp4l-proteiinissa välittömästi L-leusiinijäännöksen, joka sijaitsee gp41-proteiinin asemassa 599, vieressä, aminopäätteen puolella; Z' on aminohappojäännösten ketju, joka sijaitsee HIV-1-viruksen gp41-proteiinissa välittömästi L-tryptofaanijäännöksen, joka sijaitsee gp41-proteiinin asemassa 603, vieressä, karboksipäät-teen puolella; ja jossa jommankumman ketjuista Z tai Z' pituus voi olla nolla jäännöstä ja jossa Z ja Z' yhdessä käsittävät vähintään 10 jäännöstä. !’.! 1Θ. Patenttivaatimuksen 17 mukainen diagnoosijärjestelmä, • ♦ */* tunnettu siitä, että mainitut, HIV-1-kaltaiset di-cys-ja di- leu-polypeptidit ovat läsnä seoksena. l.v 19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen diagnoosijärjestelmä, • · \V tunnettu siitä, että mainitut, HIV-2-kaitäiset ja HIV-1-kal- taiset polypeptidit ovat läsnä seoksena. • · • · • «♦ ·'♦*; 20. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnoosijärjestelmä, *. tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi erillisessä pak- • · · kauksessa merkittyä, spesifisesti sitovaa vasta-ainetta poly- • · peptidiä sisältävän immuunireaktion tuotteen läsnäolon ilmaise-·· miseksi. < t *

18. Diagnostiskt system enligt patentkrav 17, kännetecknat av att de Ηΐν-1-besläktade di-cys- och di-leu-polypeptiderna finnes närvarande som en blandning. • · • · :.V

19. Diagnostiskt system enligt patentkrav 17, kännetecknat av att de HIV-2-besläktade och HIV-1-besläktade polypeptiderna jfinnes närvarande som en blandning. « « < • · · • · ·

20. Diagnostiskt system enligt patentkrav 11, kännetecknat • · · III av att det ytterligare innefattar i en separat förpackning, ett • · * ; * märkt, specifikt bindingsmedel för att angiva närvaro av en po- lypeptidhaltig immunoreaktionsprodukt. I I

21. Diagnostiskt system enligt patentkrav li, kännetecknat av att polypeptiden är fixerad till en fast matris. 101797

21. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnoosijärjestelmä, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi on kiinnitetty kiinteään matriisiin. 101797

22. Diagnostiset system enligt patentkrav 11, kaxmetecknat av att det ytterligare innefattar en HIV-1-besläktad polypeptid som har en sekvens av aminosyrarester som representeras av en formel, vald ur gruppen: CSGKLIC, IWGCSGKLICTTAVP, IWGCSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, LKDQQLLGIWGCSGKLI, LLGIWGCSGKLIC, QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, IWGCGS KLICTTAVPWN, CSGKLICTTAVPWNAS, SGKLICTTAVPWNAS, AVERYKLDQQLLGIWGCSGKLIC, GCSGKLICTTAVPWN, LKDQQLLGIWGCSGK, och RILAVERYLKDQQLLGIWGCS. .·. 23. Diagnostiskt system enligt patentkrav 21 i satsform, ·· kaxmetecknat av att det innefattar: • · */! (a) en första, fast bärare, innefattande en fast matris, * ; till vilken operativt fixerats en HIV-2-besläktad polypeptid ·;'· ' som har en sekvens av aminosyrarester som representeras av en ‘.V formel, vald ur gruppen: • · • · · • · · • · AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, :*·, AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, :7: AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC, AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, • · · *: * AVEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVC, ! : SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, AWGCAFRQVCHITVPWPNAS, OCh CAFRQVC, (b) en andra, fast bärare, innefattande en fast matris, till vilken operativt fixerats en HIV-1-besläktad di-cys-polypeptid 00 101797 som har en sekvens av aminosyrarester som representeras av en formel, vald ur gruppen: CS6KLIC, IWGCSGKLICTTAVP, IWGCSGKLICTTAVPWPNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, LLGIWGCSGKLIC, QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, IWGCGSKLICTTAVPWN, CSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC, och GCSGKLICTTAVPWN, och en HIV-Ι-besläktad di-leu-polypeptid som har en sekvens av aminosyror som representeras av en formel, vald ur gruppen: IWGCGSKLICTTAVPWNAS, LKDQQLLGIWGCSGLKI, LKDQQLLGIWGCSGK, och RILAVERYLKDQQLLGIWGCS. 4. t

22. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnoosijärjestelmä, joka käsittää lisäksi HIV-1-kaltaista polypeptidiä, jonka aminohappojäännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: CSGKLIC, IWGCSGKLICCTTAVP, IWGCSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, LKDQQLLGIWGCSGKLI, LLGIWGCSGKLIC, QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, IWGCSGKLICTTAVPWN, CSGKLICTTAVPWNAS, S GKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC, GCSGKLICTTAVPWN, LKDQQLLGIWGCSGK ja RILAVERYLKDQQLLGIWGCS.

23. Patenttivaatimuksen 21 mukainen diagnoosijärjestelmä • · · ·-*·. reagenssipakkauksena, tunnettu siitä, että se käsittää: **! a) kiinteästä matriisista muodostuvan ensimmäisen kiinteän kan- ‘ ; tajan, johon on kiinnitetty toimivasti HIV-2-kaitäistä polypep- ·;· · tidiä, jonka aminohappo jäännösten ketju on jokin seuraavien l·*·* kaavojen mukaisista ketjuista: • · • · · • · · • · AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC, ]*·.. AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, AI EK YLEDQAQLNAWGCAFRQVC, AVEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC, • · · aiekylkdqaqlnswgcafrqvc, : * SWGCAFRQVCHTSVPWVNDT, ; iI * AWGCAFRQVCHTTVPWPNAS, AWGCAFRQVCHITVPWPNAS j a CAFRQVC, b) kiinteästä matriisista muodostuvan toisen kiinteän kantajan, johon on kiinnitetty toimivasti HIV-l-kaltaista di-cys-polypep- βο 101797 tidiä, jonka aminohappo]äännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: CSGKLIC, IWGCSGKLICTTAVP, IWGCSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, LLGIWGCSGKLIC, QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS, IWGCSGKLICTTAVPWN, CSGKLICTTAVPWNAS, AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC ja GCSGKLICTTAVPWN, sekä HIV-1-kaltaista di-leu-polypeptidiä, jonka aminohappojäännösten ketju on jokin seuraavien kaavojen mukaisista ketjuista: IWGCSGKLICTTAVPWNAS, LKDQQLLGIWGCSGLKI, LKDQQLLGIWGCSGK ja RILAVERYLKDQQLLGIWGCS.

24. Diagnostiskt system enligt patentkrav 21 i satsform, kännetecknat av att det innefattar: (a) en första, fast bärare, innefattande en mikrotiterplat- •·' ta, till vilken operativt fixerats en polypeptid som har en v.: sekvens av aminosyrarester som representeras av formeln Γ\ AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC OCh f f E • · · • · · (b) en andra, fast bärare, innefattande en mikrotiterplatta, till vilken operativt fixerats i blandning en första och en J · ·;·’ andra HIV-Ι-besläktad polypeptid som har sekvenser av <t'|· aminosyrarester som representeras av formeln: I I I 4 « 4 4 • « IWGCSGKLICTTAVPWNAS, respektive AVERYLKDQQLLGIWGCSGCKLI. 101797

24. Patenttivaatimuksen 21 mukainen diagnoosijärjestelmä reagenssipakkauksena, tunnettu siitä, että se käsittää: a) mikrotiitterilevystä muodostuvan ensimmäisen kiinteän kanta-l· ·' jän, johon on kiinnitetty toimivasti polypeptidi, jolla on kaa- van j*’.· AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC (( « • · · • · · mukainen aminohappojäännösten ketju, sekä • · · “I b) mikrotiitterilevystä muodostuvan toisen kiinteän kantajan, • · *”* johon on kiinnitetty toimivasti ensimmäisen ja toisen HIV-1-: kaltaisen polypeptidin seosta, joiden polypeptidien aminohappo-jäännösten ketjulla on vastaavasti kaava: IWGCSGKLICTTAVPWNAS ja AVERYLKDQQLLGIWGCSGCKLI. I · 101797

25. Patenttivaatimuksen 21 mukainen diagnoosijärjestelmä reagenssipakkauksena, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteästä matriisista muodostuvan kiinteän kantajan, johon on kiinnitetty toimivasti ensimmäisen, toisen ja kolmannen polypepti-din seos, joiden polypeptidien aminohappojäännösten ketjulla on vastaavasti kaava: AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC IWGCSGKLICTTAVPWNAS ja AVERYLKDQQLLGIWGCSGCKLI.

25. Diagnostiskt system enligt patentkrav 21 i satsform, kännetecknat av att innefattar en fast bärare, innefattande en fast matris, till vilken är operativt fixerade i blandning första, andra och tredje polypeptider, vilka har sekvenser av aminosyrarester som representeras av formlerna: AIEKYLEDQAQLNAWGCAFRQVC respekt ive IWGCSGKLICTTAVPWNAS och AVERYLKDQQLLGIWGCSGCKLI. « • I I • · · « · « I · « ♦ ♦ ♦ · • · · • ♦ ♦ • · • t • · • t • t ( • ♦ * • · · -* · · • · · • · · t : * ·