NO177463B - STLV-III-beslektede polypeptider, diagnostiske prövesett og in vitro analysefremgangsmåte for påvisning av anti-HIV-2-antistoffer i kroppsvæskepröve - Google Patents
STLV-III-beslektede polypeptider, diagnostiske prövesett og in vitro analysefremgangsmåte for påvisning av anti-HIV-2-antistoffer i kroppsvæskepröve Download PDFInfo
- Publication number
- NO177463B NO177463B NO885586A NO885586A NO177463B NO 177463 B NO177463 B NO 177463B NO 885586 A NO885586 A NO 885586A NO 885586 A NO885586 A NO 885586A NO 177463 B NO177463 B NO 177463B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hiv
- polypeptide
- amino acid
- antibodies
- peptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 340
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 229
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 179
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 title claims description 125
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims description 24
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 title claims description 14
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 title claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 14
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 title description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 108
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 48
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 38
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 24
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 17
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 43
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 101710112672 Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 16
- 101710204224 Tape measure protein Proteins 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 16
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 16
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 16
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 13
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 12
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- -1 temperature Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 4
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N (2s)-3-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N (2s,3s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000009230 endogenous glucose production Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ATVFTGTXIUDKIZ-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O ATVFTGTXIUDKIZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WXYGVKADAIJGHB-ZDUSSCGKSA-N (2s)-3-(1h-indol-2-yl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC2=C1 WXYGVKADAIJGHB-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical class C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003974 3-carbamimidamidopropyl group Chemical group C(N)(=N)NCCC* 0.000 description 1
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004217 4-methoxybenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1OC([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108700000434 Cannabis sativa edestin Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000713310 Human T-cell lymphotropic virus type 4 Species 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101800001386 Peptide II Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 108010031071 cholera toxoid Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000002809 confirmatory assay Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011850 initial investigation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical group 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920000379 polypropylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 125000003698 tetramethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt polypeptid-antigen som er beslektet med apeviruset STLV-III, og diagnostiske prøvesett og ln vltro analysefremgangsmåte for påvisning av anti-HIV-2-antistoffer i kroppsvæskeprøve.
Oppfinnelsens bakgrunn
"The acquired immune deficiency syndrome" (AIDS) har
nå spredd seg over hele verden og synes å være et akutt folke-helseproblem, særlig i Afrika. Et retrovirus betegnet "human immunodeficiency virus type 1"'(HIV-1), men tidligere kjent som LAV, HTLV-III eller ARV, ble påvist å forårsake AIDS i de forskjellige områdene som er sterkt rammet av epidemien, deriblant Nord-Amerika, Vest-Europa og Sentral-Afrika.
Undersøkelser av HIV-1 på molekylnivå har avslørt noen forskjeller i nukleotidsekvensen mellom nord-amerikanske og afrikanske isolater. Denne sekvensvariasjon er også til stede, dog i mindre utstrekning, blant forskjellige isola-
ter fra USA. De nord-amerikanske, vest-europeiske og sentral-afrikanske isolater synes imidlertid å ha like biologiske egenskaper og antigent kryssreaktive proteiner med den samme relative molekylvekt.
Individer som er smittet HIV-1 utvikler antistoffer
mot de gag-gen-kodede viruskjerneproteiner betegnet pl9,
p24, og mot deres forløperprotein betegnet p55. I tillegg er det også observert antistoffer mot env-gen-kodede kappe-glycoproteiner gpl20 (det ekstracellulære glycoprotein eller EGP), gp41 (transmembranprotein eller TMP) og deres forløper-glycoprotein betegnet gpl6 0.
Et stort antall AIDS-pasienter har et bortfall av antistoffer mot HIV-l-kjerneproteinene på et fremskredet stadium av sykdommen, men bibeholder antistoffer som er immunologisk reaktive med kappe-antigenene. Kappe-produktene påvises vanligvis ved hjelp av antistoffer i sera fra pasienter på forskjellige stadier av HIV-l-infeksjon. Selv om få rap-porter er tilgjengelige vedrørende seraomdannelse til HIV-1, synes fremkomsten av antistoffer mot kappeproteinene å skje like forut for fremkomsten av antistoffer mot kjerneproteinene. Se Carlson et al., Lancet, i:361-362 (1987). Av disse grunner har anvendelsen av antigener som utgjør env-gen-produktene, betydelig viktighet i diagnose av eksponering mot AIDS-beslektede retrovirus.
Ettersom AIDS kan overføres ved blodprodukter, har det helt fra den første erkjennelse av sykdommen, vært et sterkt incitament til å utvikle diagnostiske tester for å undersøke blod med hensyn på antistoffer eller antigener som er spesifikke for smitteviruset. Anstrengelser på dette område har båret frukter, og ved slutten av 1985 hadde fem selskaper fått godkjennelse for å markedsføre tester for påvisning av antistoffer mot HIV-l-virus. Disse testene for påvisning av antistoffene er alle basert på bruken av virusproteiner erholdt fra dyrkede HIV-infiserte T-lymfocytter. Det erholdte virus fra de dyrkede celler brytes opp (f.eks. med vaske-middel) og en væske (kalt "viruslysat") erholdes. Dette lysåtet (inneholdende mange forskjellige fragmenter fra virus og celleprotein) anvendes så vanligvis som fastfasebestanddelen i en immunologisk analyse.
Selv om de foreliggende tester synes å ha redusert overføringen av HIV-1 via blodprodukter betydelig, har de viruslysatbaserte tester noen betydelige ulemper, deriblant resultater som indikerer en stor hyppighet av falske positive resultater. De falske positive resultatene antas å'skyldes delvis tilstedeværelsen av ikke-virus-proteiner i virus-lysatpreparatene som anvendes i fastfasebestanddelen av de nåværende analyser.
I et forsøk på å redusere hyppigheten av falske positive resultater, har det innen teknikken begynt å utvikles stedrettede serologiske analyser hvor det anvendes syntetiske polypeptider som etterligner naturlig forekommende antigendeterminanter på virusproteiner. F.eks. beskrives det i US patentskrift nr. 4 629 783 til Cosand, Wang et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:6159-6163 (1986), og Kennedy et al., Science, 231:1556-1559 (1986) flere polypeptider som hevdes
å være i stand til å etterligne antigendeterminanter dannet av forskjellige HIV-1-proteiner, deriblant TMP (gp41). I
US patentsøknader nr. 843 437, innlevert 24. mars'1986, og nr. 25.108, innlevert 30. mars 1987, som begge er overdratt til Johnsonn & Johnaon, Inc., New Brunswick, NJ, beskrives også HIV-l-TMP-beslektede polypeptider. Lignende beskrivel-ser som de som finnes i den første søknad identifisert ovenfor, ble gjort av Rosen et al. ved den andre internasjonale konferanse om AIDS i Paris, Frankrike i juni 1986.
En annen betydelig ulempe ved de nåværende metoder for diagnostisering av eksponering mot AIDS-beslektede virus, er at de er basert på bruken av HIV-l-utvundne antigener og følgelig gir falske negative resultater for individer som er eksponert mot de antigent forskjellige vest-afrikanske AIDS-beslektede retrovirus, her betegnet som HIV type 2 (HIV-2). Mer enn 20 HIV-2-isolater er blitt gjort fra pasienter med AIDS og beslektede tilstander, hovedsakelig fra vest-afrikanere, men også fra enkelte europeere. Det er følgelig be-hov for en analyse som er spesifikk for HIV-2, for å under-søke blod som er gitt, og for diagnostisering av HIV-2-infeksjon. Bruin-Vezinet, Lancet, i:128-132 (1987).
HIV-2 er strukturelt, biologisk og antigent beslektet med HIV-1, og ape-T-lymfotrof-virus type III isolert fra javaaper (STLV-III Hl cl C), et virus som forårsaker en AIDS-
J * mac ;lignende sykdom i sin apevert. Alle tre virus synes å inneholde EMP- og TMP-proteiner som dannes ved spalting av et forløperprotein. Den tilsynelatende molekylvekt til hvert av disse proteinene varierer imidlertid mellom HIV-1, HIV-2 og STLV-III, og er følgelig et trekk som kan anvendes til å skjelne mellom disse virus. F.eks. er den tilsynelatende molekylvekt, i kilodalton, for TMP-ene fra HIV-1, HIV-2 og STLV-III mac henholdsvis 41, 36 og ^ 32. ;Hver av HIV-1, HIV-2 og J STLV-III macutviser også cyto-patogenisitet og tropisme for celler som bærer CD4(T4)-antigenet (T4-lymfocytter). I tillegg har alle tre virus antigent kryssreaktive kjerneproteiner. Daniel et al., Science, 288:1201-04 (1985); Bruin-Vezinet et al., supra. Selv om kappeproteinene, deriblant TMP-ene, fra HIV-2 og STLV-IIImac er antigent kryssreaktive, synes imidlertid ingen å ha antigene determinanter til felles med HIV-1-TMP. Clavel et al., Science, 233:343-346 (1986). ;Selv om DNA-sekvensen i env-genet til STLV-III ^ ikke 3 mac ;er blitt rapportert, har Guyader et al., Nature, 326:662-669 ;(1987) rapportert både DNA-sekvensen og den utledede aminosyrerestsekvens i HIV-2-env-gen-proteinproduktene. Ved sammenligning av EGP-proteinene fra HIV-1 og HIV-2, fant Guyadér et al. den å være "svært fjernt beslektet" ettersom det bare var 44,8% homologi i deres aminosyrerestsekvenser. Likeledes var aminosyrerestsekvensene i HIV-1- og HIV-2-TMP-proteinene bare 44,8% homologe. For å oppnå selv disse homo-loginivåer, måtte imidlertid Guyader et al. putte store innføyelser inn i aminosyrerestsekvensene, særlig når EGP-ene hvor bare korte områder som ligger langt fra hverandre er bevart mellom HIV-1 og HIV-2, ble justert i forhold til hverandre . ;Guyader et al. rapporterte også 22 av 23 cysteinrester funnet i HIV-l-kappeproteinene kunne stilles opp mot cysteinrester funnet i de tilsvarende HIV-2-proteiner. HIV-2-proteinene ble imidlertid funnet å inneholde ytterligere syv cysteinrester som for det meste ble funnet i områdene-som utgjør innføyelser i forhold til HIV-1. Det ble således kon-kludert med at "foldingen av HIV-2-EGP kan være forskjellig fra HIV-1, og noen områder vil derfor kunne bli eksponert på en anderledes måte". Det ble ikke gitt noen grunn som indikerer at en lignende konklusjon ikke var anvendbar for TMP-proteinene i HIV-1 og HIV-2- ;Hirsch et al., Cell., 49:307-319 (1987) rapporterer nukleotidsekvensen i genomet i et STLV-III-virus isolert ;fra afrikanske grønnaper (STLV-III ). Ifølge Hirsch et al. ;clylu ;er STLV-III agm -TMP 140 aminosy Jrer kortere enn det fra HIV-1 og synes å inneholde færre potensielle glycosyleringssteder. Samtidig 3 beskriver Hirsch et al. STLV-III agm - og J HIV-l-TMP-ene som forholdsvis godt bevarte, idet 49% av aminosyrene er de samme og 32% utgjør konservative substitusjoner. ;Endelig var, ifølge Hirsch et al., STLV-III^^-isola-tet som de undersøkte, praktisk talt identisk, fastslått ved hjelp av DNA-hybridisering, med et STLV-IIIagm-isolat, men lett skjelnbar, fastslått ved hjelp av kartlegging av restriksJ jonssted, fra et andre STLV-III mac-isolat. Slekt-skapet mellom STLV-III- , og STLV-III m og HIV-1, er ;følgelig ikke godt definert for tiden. ;Kort oppsummering av oppfinnelsen ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer polypeptider som stedrettede, serologiske reagenser, en in vltro analysefremgangsmåte og diagnostiske prøvesett som kan anvendes for diagnostisering av eksponering mot AIDS-beslektede, vest-afrikanske retrovirus (HIV-2- og STLV-III-retrovirus). Det vil si at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et STLV-III-beslektet polypeptid som kryssreagerer immunologisk med antistoffer indusert av HIV-2-infeksjoner i mennesker. ;Foreliggende oppfinnelse vedrører således et STLV-III-beslektet polypeptid som er kjennetegnet ved at det har en aminosyresekvens med formel: eller ;Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for ln vltro analysering med hensyn på tilstedeværelsen av anti-HIV-2-antistoffer i en kroppsvæskeprøve. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved følgende trinn: (a) dannelse av en immunoreaksjonsblanding ved å blande en kroppsvæske med et polypeptid med en aminosyresekvens som har formelen:
eller (b) opprettholdelse av immunoreaksjonsblandingen under biologiske analysebetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig til at eventuelle anti-HIV-2-antistoffer som er til stede i prøven, kan reagere immunologisk med polypeptidet og danne et polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, og (c) analysering med hensyn på tilstedeværelse av eventuelt, polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, som ble dannet, og derved tilstedeværelse av eventuelle anti-HIV-2-antistoffer i prøven. ;Videre vedrører foreliggende oppfinnelse et diagnostisk prøvesett for analysering med hensyn på tilstedeværelse av anti-HIV-2-antistoffer i en kroppsvæskeprøve. Prøvesettet er kjennetegnet ved at det omfatter en pakning som inneholder et polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har formelen: eller ;Det diagnostiske prøvesett omfatter videre fortrinnsvis enten et HIV-l-beslektet di-cys-polypeptid eller et HIV-1-beslektet di-leu-polypeptid, eller begge i en tilstrekkelig mengde til å utføre minst én analyse med hensyn på tilstedeværelse av antistoffer mot HIV-1. Helst er både HIV-l-beslektet di-cys- og di-leu-polypeptid inkludert i settet i blanding med hverandre. Ved en annen foretrukket utførelses-form er STLV-III-beslektet, HIV-l-beslektet di-cys- og HIV-l-beslektet di-leu-polypeptid inkludert i settet i blanding med hverandre. Mest foretrukket er sett hvor inkluderte STLV-III-beslektede og HIV-l-beslektede polypeptider er operativt festet, enten hver for seg eller i blanding, til en fast matriks, slik at det dannes en fast bærer. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således flere goder og fordeler. Et gode tilveiebragt ved hjelp av de diagnostiske prøvesett og fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er muligheten for å undersøke kroppsvæske, slik som et blod-produkt, med hensyn på eksponering mot begge de for tiden kjente typer av AIDS-beslektede virus. Ettersom foreliggende oppfinnelse tilveiebringer immunologisk stedspesifikke diagnostiske reagenser, kan det i tillegg på fordelaktig måte skjelnes mellom eksponering mot HIV-1 i forhold til HIV-2. ;En ytterligere fordel tilveiebragt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er at fremstilling og anvendelse av prøvesettene og fremgangsmåten for diagnostisering av eksponering mot både de HIV-1- og HIV-2-AIDS-forårsakende virus, som foreliggende oppfinnelse vedrører, nå kan utføres uten nødvendigheten av eller vanskeligheten ved å fremstille potensielt smittefarlig genetisk materiale, som er tilfellet når et viruslysat anvendes som antigen. ;Kort beskrivelse av tegningene ;I figurene som utgjør en del av beskrivelsen av denne oppfinnelse: Figur 1 viser en del av aminosyrerestsekvensen til STLV-III mac -TMP. Sekvensen er vist fra venstre til høy 2 re, og^ i retning fra aminoenden til carboxylenden, i en énbokstav^-kode. Restposisjonene er blitt nummerert som vist fra 1 til 33. ;Figur 2 viser på en lignende måte som i figur 1, en ;del av aminosyrerestsekvensen i HIV-1-TMP, og utgjør gp41-aminosyrerestene 589-610 som beskrevet i Råtner et al., Nature, 313:277-283 (1985). For å lette omtalen er imidlertid disse restposisjonene blitt omnummerert som vist fra 1 til 32. ;Figur 3 inneholder 2 paneler som viser antistoffbestem-melser under anvendelse av et diagnostisk system ifølge oppfinnelsen for analyse av (a) 20 sera fra individer i Guinea-Bissau som det tidligere var blitt bestemt hadde antistoffer mot HIV-beslektede virus (vest-afrikanere), (b) 20 sera fra HIV-l-smittede individer og (c) 20 sera fra blodgivere uten antistoffer mot HIV-1 eller HIV-2. Sera ble ansett som positive (lukkede symboler) når de ga verdier for optisk tetthet (O.D.) som var over 0,150 (den gjennomsnittlige O.D. i negative prøver pluss 6 standardavvik). Negative sera er angitt ved hjelp av åpne symboler. ;Panel A viser resultatene som ble oppnådd ved å bruke en fast bærer bestående hovedsakelig av bare STLV-III-beslektet polypeptid p80 som målantigen. ;Panel B viser resultatene som ble oppnådd ved å bruke en fast bærer bestående hovedsakelig av en kombinasjon av de HIV-l-beslektede polypeptider (III) og (IV) som målantigen. ;Nærmere beskrivelse av oppfinnelse ;A. Definisjoner ;Aminosyre: Alle aminosyrerester som her er identifisert, er i den naturlige L-konfigurasjon. Idet man holder seg til standard polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243: 3557-59, (1969), er forkortelser for aminosyrerester som vist i den følgende samsvarstabell: ;SAMSVARSTABELL ;;Det bør legges merke til at alle aminosyrerestsekvenser her er angitt ved hjelp av formler hvis orientering fra venstre til høyre er i den vanlige retning fra aminoende til carboxylende. ;Polypeptid og peptid: Polypeptid og peptid er uttrykk som her brukes vekselvis for å betegne en lineær serie av ikke mer enn ca. 50 aminosyrerester som er bundet en til den neste ved hjelp av peptidbindinger mellom a-amino- og carboxylgruppene i tilgrensende rester. ;Protein: Protein er et uttrykk som her brukes til å betegne en lineær serie av mer enn 50 aminosyrerester hvor en er bundet til den neste som i et polypeptid. ;B. Polypeptider ;De to polypeptidene som her er beskrevet, er kjennetegnet ved at de omfatter en bestemt aminosyrerestsekvens fordi denne bestemte sekvens i hvert tilfelle er blitt opp-daget å være i stand til å etterligne en lineær eller sammenhengende antigen determinant immunologisk. ;Peptidene ifølge oppfinnelsen inneholder minst to cysteinrester. De foreliggende peptider kan følgelig foreligge i forskjellige oxydasjonsformer. I tillegg til den monomere form som sulfhydrylgruppen i cysteinresten(e) reduseres i, kan det også foreligge dimere eller polymere former hvor sulfhydryl-grupper på 20 eller flere peptidmolekyler blir oxydert og dan-ner inter- og intrapeptiddisulfidbindinger. Mens foreliggende peptider som har bare en cysteinrest kan danne bare lineære dimerer, kan de som har to cysteinrester danne cykliske monomerer eller linære eller cykliske dimerer og lineære polymerer av forskjellige lengder. Disse forskjellige oxydasjonsformer ansees som en del av foreliggende oppfinnelse og er inkludert i uttrykkene "polypeptider" og "peptider". ;Et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan syn-tetiseres ved hjelp av hvilken som helst av teknikkene som er kjent for fagfolk innen polypeptidteknikken, inkludert rekombinant DNA-teknikker. Teknikker med syntetisk kjemi, slik som fastfase-syntese av Merrifield-type, er foretrukket på grunn av renhet, antigenspesifisitet, fravær av uønskede biprodukter, lettvint produksjon og lignende. En utmerket oppsummering av de mange teknikkene som er tilgjengelige, ;kan finnes i J.M. Steward og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; ;M. Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, andre utgave, 1976 og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983 for fastfase-peptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 for klassiske oppløsningssynteser. Passende beskyttelsesgrupper som kan anvendes i slike synteser, er beskrevet i de ovenfor nevnte litteratursteder og i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973. ;Generelt omfatter disse fremgangsmåtene den sekvensvise addisjon av én eller flere aminosyrerester eller passende beskyttede aminosyrerester til en voksende peptidkjede. Normalt er enten amino- eller carboxylgruppen i den første aminosyrerest beskyttet ved hjelp av en egnet, selektivt fjernbar beskyttelses gruppe. En forskjellig, selektivt fjernbar beskyttelsesgruppe benyttes for aminosyrer som inneholder en reaktiv syregruppe, slik som lysin. ;Hvis man bruker fastfasesyntese som et eksempel, så festes det beskyttede eller derivatiserte aminosyren til en inert fast bærer gjennom sin ubeskyttede carboxyl- eller aminogruppe. Beskyttelsesgruppen på amino- eller carboxylgruppen fjernes så selektivtog den neste aminosyre i sekvensen med den komplementære (amino- eller carboxyl-) gruppe passende beskyttet tilblandes, og omsettes under betingelser som er egnet for å danne amidbindingen med resten som allerede er festet til den faste bærer. Beskyttelsesgruppen på amino- eller carboxylgruppen fjernes så fra denne sist adderte aminosyrerest, og den neste aminosyre (passende beskyttet) adderes så, osv. Etter at alle de ønskede aminosyrer er blitt bundet i den korrekte rekkefølge, fjernes eventuelle gjenværende ende- og sidegruppebeskyttelsesgrupper (og fast bærer) sekvensvis eller samtidig, hvorved slutt-polypeptidet fåes. ;1. STLV- III- beslektede polypeptider ;Et STLV-III-beslektet polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse har en av de to nedenunder i tabell 1 angitte aminosyrerestsekvenser. Et STLV-III-beslektet polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse har videre evne til å reagere immunologisk med antistoffer indusert ved hjelp av et HIV-2-TMP, fortrinnsvis indusere antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med naturlig forekommende HIV-2-virus. ;Det skal forståes at et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse ikke behøver å være identisk med aminosyrerestsekvensen i STLV-III-TMP (gp32), så lenge som de angjeldende polypeptider omfatter den nødvendige sekvens og er i stand til å reagere immunologisk med antistoffer indusert ved hjelp av HIV-2-TMP. Et foreliggende STLV-III-beslektet polypeptid er således gjenstand for endringer, nærmere bestemt fjern-elser. Således er glycinresten i posisjon 16 i figur 1 ;blitt fjernet fra polypeptidene p80 og p81. ;2. HIV- 2- beslektede polypeptider ;Ved en utførelsesform inneholder et diagnostisk prøve-sett ifølge oppfinnelsen et HIV-l-beslektet di-cys-polypeptid med minst 7, fortrinnsvis minst 12, aminosyrerester og omfatter en aminosyrerestsekvens som har formelen: ;I tillegg har disse polypeptidene evne til å etterligne de immunologiske egenskaper til HIV-l-TMP-proteinet, inkludert evnen til 1) å reagere immunologisk med antistoffer indusert ved hjelp av naturlig forekommende HIV-1, og 2) å indusere antistoffer som reagerer immunologisk med naturlig forekommende HIV-1. ;Foretrukne HIV-l-beslektede di-cys-polypeptider inneholder ikke mer enn 32 aminosyrerester, har som en del av sekvensen sin, sekvensen -CSGKLIC-, og er homologe, fortrinnsvis uten innføyelse eller fjernelse, med en del av sekvensen vist i figur 2. Dvs. at et foretrukket HIV-l-beslektet di-cys-polypeptid er et som svarer i sekvens til sekvensen vist i figur 2 fra posisjon 17 til posisjon 23, og som omfatter i sin aminoende en lineær, sammenhengende sekvens av 1-16 aminosyrerester hvor sekvensen er vist i figur 12 fra og med posisjon 1 til og med posisjon 16. I tillegg omfatter polypeptidet også i sin carboxylende en lineær, sammenhengende sekvens av 1 - 9 aminosyrerester som er vist i figur 1 fra og med posisjon 24 til og med posisjon 32. ;De HIV-1-beslektede di-cys-polypeptider som kan være til stede i prøvesettene ifølge oppfinnelsen, omfatter de hvis aminosyrerestsekvenser er vist i tabell 2. ;Foreliggende oppfinnelse vedrører videre den oppdag-else at gjenkjennelse av antistoffer mot HIV-1 i immunologiske analyser bedres betydelig dersom de ovenfor beskrevne HIV-1-beslektede di-cys-polypeptider anvendes i kombinasjon med et andre HIV-l-beslektet polypeptid, betegnet et di-leu-polypeptid. ;HIV-l-beslektede di-leu-polypeptider består hovedsakelig av de hvis aminosyrerestsekvenser er vist i tabell 3. ;Foretrukne kombinasjoner av HIV-l-beslektede di-cys-og di-leu-polypeptider omfatter (IV.) eller (XII) med (III) , (XII) eller (X). Kombinasjonene av (III) med (IV) og (XIII) med (IV) er særlig foretrukne blant kombinasjonene. ;Ved en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse et HIV-l-beslektet polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har formelen, betegnet formel (XI): ;SGKLICTTAVPWNAS. ;På bakgrunn av resultatene som er omtalt i eksemplene er det klart at en betydningsfull antigen determinant i HIV-1-viruset som reagerer med HIV-l-induserte antistoffer, er definert ved (inneholdt i) 7-aminosyrerestsekvensen med formel (I) beskrevet tidligere. Selv om hver av de HIV-l-beslektede polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse reagerer med de fleste HIV-l-positive sera, er videre enkeltstående pasientsera blitt observert å reagere spesifikt med ett av de HIV-l-beslektede polypeptider, men ikke med andre. Denne observasjon indikerer at ytterligere antigene determinanter foreligger i lengre peptider som inneholder sekvensen med formel (I), slik som de peptider som er vist i tabell 2. Det ligger godt innenfor ferdigheten til en vanlig arbeider innen peptidsynteseteknikken å fremstille fragmenter fra de HIV-l-beslektede peptider for å bestemme antigene og immunogene fragmenter innenfor den. Slike antigene og immunogene fragmenter kan følgelig anvendes i de diagnostiske systemer og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse. Fagfolk vil dessuten erkjenne at lengre peptider svarende til en del av HIV-l-TMP-proteinet og som er i overensstemmelse med det som her er åpenbaret, ville virke i analysefremgangsmåtene og systemene ifølge foreliggende oppfinnelse. ;C. Inokula ;Ved en annen utførelsesform anvendes et STLV-III-beslektet polypeptid ifølge denne oppfinnelse eller en antigent beslektet variant derav i et farmasøytisk akseptabelt preparat med vandig fortynningsmiddel til å danne et inokulum som, når det administreres i en virksom mengde, er i stand til å indusere antistoffer som reagerer immunologisk med STLV-III og HIV-2. ;Ordet "inokulum" i sine forskjellige grammatikalske former brukes her til å beskrive et preparat som inneholder et polypeptid ifølge oppfinnelsen som en aktiv bestanddel brukt til fremstillingen av antistoffer mot HIV-2. Når et polypeptid anvendes til å indusere antistoffer, skal det forståes at polypeptidet kan anvendes alene, eller bundet til en bærer som et konjugat, eller som en polypeptidpolymer, men for å lette angivelsen, refereres de forskjellige ut-førelsesf ormer av polypeptidene ifølge oppfinnelsen her samlet til ved hjelp av uttrykket "polypeptid" og dets forskjellige grammatikalske former. ;For et polypeptid som inneholder færre enn ca. 35 aminosyrerester, er det foretrukket å anvende polypeptidet bundet til en bærer for det formål å indusere fremstillingen av antistoffer slik som allerede angitt. ;Som også allerede angitt, kan én eller flere ytterligere aminosyrerester adderes til amino- eller carboxylendene i polypeptidet for å hjelpe til ved binding av polypeptidet til en bærer. Cysteinrester addert i amino- eller carboxylendene i polypeptidet er funnet å være særlig anvendbare for å danne konjugater via disulfidbindinger. Andre fremgangsmåter som er godt kjent innen teknikken for fremstilling av 30 konjugater, kan imidlertid også anvendes. Eksempelvise ytterligere bindingsfremgangsmåter omfatter bruken av Michael addisjonsreaksjonsprodukter, dialdehyder, som glutar-aldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318-326 ;(1983) og lignende, og anvendelsen av "35 carbodiimid"-teknikk, slik som ved bruken av et vannoppløselig carbodiimid for å danne amidbindinger til bæreren. For en oversikt over proteinkonjugering eller -kobling gjennom aktiverte funksjon-elle grupper, se Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. ;8,, Supp-1, 7, 7-23, (1978). ;Anvendbare bærere er godt kjent innen teknikken og er vanligvis selv proteiner. Eksempler på slike bærere er Key-hole limpet hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albu-miner, slik som bovint serum albumin (BSA) eller humant serumalbumin (HSA), røde blodlegemer, slik som saueerythrocytter (SRBC), tetanustoksoid, koleratoksoid samt polyaminosyrer, slik som poly (D-lysin: D-glutaminsyre), og lignende. ;Valget av bærer er mer avhengig av sluttbruken for inokulumet og er basert på kriterier som ikke er spesielt involvert i foreliggende oppfinnelse. F.eks. bør det velges en bærer som ikke genererer en uheldig reaksjon i det bestemte dyr som skal inokuleres. ;Foreliggende inokulum inneholder en effektiv immunogen mengde av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, vanligvis som et konjugat bundet til en bærer. Den effektive mengde av polypeptid pr. enhetsdose avhenger, blant andre ting, av dyrearten som skal inokuleres, kroppsvekten til dyret og den valgte inokulasjonsplan, noe som er godt kjent innefor teknikken. Ino ula inneholder vanligvis polypeptidkonsen-trasjoner på ca. 10 ug til ca. 500 mg pr. inokulasjon (pr. dose), fortrinnsvis ca. 50 yg til ca. 50 mg pr. dose. Uttrykket "enhetsdose" slik det vedrører onculaene, henviser til fysisk adskilte enheter egnet som enhets-doseringer for dyr, idet hver enhet inneholder en forutbestemt mengde aktivt materiale beregnet til å gi den ønskede immunogene virkning sammen med det påkrevde fortynningsmiddel, dvs. bærer eller hjelpemiddel. Spesifika-sjonene for den nye enhetsdose av et inokulum er diktert og er direkte avhengig av (a) de unike egenskaper til det aktive materiale og den spesielle immunologiske virkning som skal oppnåes, og (b) begrensningene som er iboende i teknikken med å blande slikt aktivt materiale for immunologisk anvendelse i dyr, slik det her er nærmere beskrevet. ;Inokula fremstilles vanligvis fra det tørkede faste polypeptidkonjugat ved å dispergere polypeptidkonjugatet i et fysiologisk tolererbart (godtagbart) fortynningsmiddel, slik som vann, saltoppløsning eller fosfatbufret saltoppløs-ning, slik at det dannes en vandig blanding. ;Inokula kan også omfatte et adjuvans som del av for-tynningsmidlet. Adjuvanser, slik som fullstendig Freund's adjuvans (CFA), ufullstendig Freund's adjuvans (IFA) og alun, er materialer som er godt kjent innen teknikken, og er kommersielt tilgjengelige fra flere kilder. ;D. Antistoffer og antistoffpreparater ;Uttrykket "antistoff" i sine forskjellige grammatikalske former brukes her til å henvise til immunoglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoffbind-ingssete eller en paratop. Eksempelvise antistoffmolekyler er intakte immunoglobulinmolekyler, i det vesentlige intakte immunoglobulinmolekyler og de deler av et immunoglobulin-molekyl som inneholder paratopen, inkludert de deler som er kjent innen teknikken som Fab, Fab', F(ab')2°9 F(v). ;Et antistoffpreparat er kjennetegnet som inneholdende antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med HIV-2-TMP ;og et STLV-III-beslektet polypeptid ifølge oppfinnelsen, men som er i det vesentlige fri for antistoffer som reagerer immunologisk med ethvert annet HIV-2-beslektet protein. ;Et antistoffpreparat fremstilles vanligvis ved å immun-isere et laboratoriepattedyr med et inokulum, og derved å indusere i pattedyret antistoffmolekyler med den passende polypeptid-immunospesifisitet. Antistoffmolekylene hentes så fra pattedyret og isoleres i den ønskede utstrekning ved hjelp av godt kjente teknikker, slik som f.eks. ved immunoaffinitets-kromatografi. Det således fremstilte antistoffpreparat kan anvendes blant annet i den diagnostiske fremgangsmåte og prøvesett ifølge foreliggende oppfinnelse til å påvise HIV-2 i en kroppsprøve. ;Antistoffpreparatene indusert ved hjelp av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, kan beskrives som oligoklonale i forhold til naturlig forekommende polyklonale antistoffer ettersom de frembringes mot et immunogen (det forholdsvis lille polypeptid) som har forholdsvis få epitoper i forhold til epitopene etterlignet ved hjelp av et intakt HIV-2-TMP-molekyl. Følgelig binder reseptorer seg til epitoper i polypeptidet, mens naturlig forekommende antistoffer frembragt mot hele TMP-molekylet, binder seg til epitoper gjennom hele TMP-molekylet og henvises til som polyklonale. ;Egnede antistoffer i monoklonal form, vanligvis hele antistoffer, kan også fremstilles ved å bruke hybridomtek-nikk beskrevet av Niman et al., Proe. Nati. Sei, USA, 80: 4949-4953 (1983). For å danne hybridomet hvorfra det monoklonale antistoffpreparat fremstilles, fusjoneres i korte trekk et rayelom eller en annen selv-forevigende cellelinje med lymfocytter erholdt fra milten til et pattedyr hyper-immunisert med et polypeptid ifølge oppfinnelsen. ;Det er foretrukket at myelomcellelinjen er av den samme art som lymfocyttene. Vanligvis er en mus av stammen 129 ;G1X<+> det foretrukne pattedyr. Egnede musmyelomer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter de hypoxanthin-amino terin-thymidin-sensitive (HAT) cellelinjer P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4 som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, under de respektive betegnelser CRL 1580 og CRL 1581. ;Splenocytter fusjoneres vanligvis med myelomceller under anvendelse av polyethylenglycol (PEG) 1500. Fusjonerte hybri-der velges ut ved hjelp av deres sensitivitet til HAT. Hybri-domer som utskiller reseptormolekylene ifølge oppfinnelsen, identifiseres ved å bruke den enzymbundne immunosorbentanalyse (ELISA) beskrevet i eksempel 11. ;Et monoklonalt antistoffpreparat kan fremstilles ved ;å initiere en monoklonal hybridomkultur som omfatter et nær-ingsmedium inneholdende et hybridom som utskiller antistoffmolekyler med den korrekte polypeptidspesifisitet. Kulturen holdes under betingelser, og i et tidsrom, som er tilstrekkelig til at hybridomet utskiller antistoffmolekylene i mediet. Det antistoffholdige medium samles så opp. Antistoffmolekylene kan så isoleres ytterligere ved hjelp av godt kjente teknikker. ;Medier som kan anvendes for fremstilling av disse pre-paratene, er både godt kjente innen teknikken og kommersielt tilgjengelige, og omfatter syntetiske kulturmedier, innavlet mus og lignende. Et eksempel på syntetisk medium er Dulbecco<1>s minimal essential medium (DMEM, Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)) supplert med 4,5 g/liter glucose, 2 mm glutamin og 20% kalvefosterserum. Et eksempel på en innavlet musstamme er Balb/c. ;De monoklonale antistoffpreparater fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor kan f.eks. anvendes i diagnostiske og terapeutiske fremgangsmåter hvor dannelse av et HIV-2-TMP-holdig immunoreaksjonsprodukt er ønsket. ;E: Diagnostiske prøvesett ;Et diagnostisk prøvesett ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, i en tilstrekkelig mengde til minst én analyse, et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, som et emballert reagens. Instruksjoner for bruk av det emballerte reagens er også vanligvis inkludert. ;Slik det her er brukt, henviser uttrykket "pakning" til en slik fast matriks eller materiale som glass, plast, papir, folie og lignende som er i stand til å holde et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse innenfor fastsatte grenser. En pakning kan således f.eks. være en glassampulle brukt til å inneholde milligrammengder av et polypeptid som kommer i be-traktning, eller den kan være en mikrotiterplatebrønn hvortil mikrogrammengder av et polypeptid som kommer i betrakt-ning, er blitt operativt festet, dvs. bundet slik at det er i stand til å bli immunologisk bundet av et antistoff. ;"Bruksanvisninger" omfatter vanligvis en konkret fremstilling som beskriver reagenskonsentrasjonen eller i det minste én analysefremgangsmåteparameter, slik som de relative mengder av reagens og prøve som skal blandes, tidsrom for oppbevaring av reagens/prøve-blandinger, temperatur, buffer-betingelser og lignende. ;Ved foretrukne utførelsesformer omfatter et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse videre en markør eller et indikasjonsmiddel som er i stand til å signalisere dannelsen av et kompleks som inneholder et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse. ;Ordet "kompleks" henviser slik det her er brukt, til produktet av en spesifikk bindingsreaksjon, slik som en antistoff-antigen- eller reseptor-ligand-reaksjon. Eksempler på komplekser er immunoreaksjonsprodukter. ;Slik det her er brukt, henviser uttrykkene "markør" og "indikasjonsmiddel" i sine forskjellige grammatikalske former til enkeltstående atomer og molekyler som enten er direkte eller indirekte involvert i fremstillingen av et påvisbart signal for å indikere tilstedeværelsen av et kompleks. En-hver markør eller ethvert indikasjonsmiddel kan bindes til eller inkorporeres i et uttrykt protein, polypeptid eller antistoffmolekyl som er en del av et antistoff, eller monoklonalt antistoffpreparat, eller anvendes separat, og disse atomene eller molekylene kan anvendes alene eller sammen med tilleggsreagenser. Slike markører er selv godt kjent innen klinisk diagnostisk kjemi og utgjør en del av denne oppfinnelse bare i den utstrekning de benyttes sammen med ellers nye proteiner, fremgangsmåter og/eller systemer. ;Markørmidlet kan være et fluorescerende markørmiddel som bindes kjemisk til antistoffer eller antigener uten å denaturere dem, slik at det dannes et fluorokrom (fargestoff) som er et anvendbart immunofluoerescens-sporstoff. Egnede fluorescerende markørmidler er fluorokromer, slik som fluore-sceinisocyanat (FIC), fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-dimethylamin-l-nafthalensulfonylklorid (DANSC), tetramethyl-rhoadminisothiocyanat (TRITC), lissamin, rhoadmin 8200 sul-fonylklorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse av immunofluorescens-analyseteknikker finnes i DeLuca, "Immuno-fluorescence Analysis", i Antibody as a Tool, Marchalonis et al., utg. John Wiley & Sons, Ltd., s..189-231 (1982). ;Ved foretrukne utførelsesformer er indikasjonsgruppene et enzym, slik som pepperrotperoxydase (HRP), glucoseoxydase eller lignende. ;I slike tilfeller hvor hovedindikasjonsgruppen er et enzym, slik som HRP eller glucoseoxydase, er det påkrevet med ytterligere reagenser for å visualisere det faktum at et reseptor-ligand-kompleks (immunoreaktant) er dannet. Slike tilleggsreagenser for HRP omfatter hydrogenperoxyd og en oxydasjons-fargestoff-forløper som f.eks. diaminobenzidin. Et ytterligere reagens som kan anvendes sammen med glucoseoxydase er 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-G-sulfonsyre) ;(ABTS). ;Radioaktive grunnstoffer er også anvendbare markør-midler og brukes her som illustrasjon. Et eksempel på et radioaktivt markørmiddel er et radioaktivt grunnstoff som gir gammastråleemisjoner. Grunnstoffer som i seg selv sender 4. o, , ., som 124T 125T 128T <1>32T 51„ ;ut gammastråler, slik som I, I, I, I og Cr, representerer en klasse gammastråleemisjon-produserende radioaktivt grunnstoff som indikasjonsgrupper. Særlig fore-125 ;trukket er I. En annen gruppe anvendbare markørmidler er ;11 18 15 13 ;slike grunnstoffer som C, F, 0 og N som selv sender ut positroner. De utsendte positroner gir gammastråler etter å ha støtt på elektroner som er til stede i dyrets kropp. En beta-emitter er også anvendbar, slik som 111 indium eller <3>H. ;Bindingen av markører, dvs. merking av polypeptider og proteiner, er godt kjent innen teknikken. F.eks. kan antistoffmolekyler produsert av et hybridom merkes ved hjelp av metabolsk inkorporering av radioisotopholdige aminosyrer tilveiebragt som bestanddel i dyrkningsmediet. Se f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Teknikkene for proteinkonjugering eller -kobling gjennom aktiverte funksjon-elle grupper er særlig anvendbar. Se f.eks. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) og US.patentskrift ;nr. 4 493 795. ;De diagnostiske systemer kan også omfatte, fortrinnsvis som en separat pakning, et spesifikt bindingsmiddel. Et "spesifikt bindingsmiddel" er en molekylenhet som er i stand til selektivt å binde et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse eller et kompleks som inneholder et slikt, men er ikke selv en polypeptidmolekylblanding ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på spesifikke bindingsmidler er antistoffmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter derav, S. aureus protein A og lignende. Det spesifikke bindingsmiddel binder fortrinnsvis polypeptidet når det er til stede som del av et kompleks. ;I foretrukne utførelsesformer er det spesifikke bindingsmiddel merket. Når det diagnostiske system omfatter et spesifikt bindingsmiddel som ikke er merket, anvendes midlet imidlertid vanligvis som et forsterkningsmiddel eller -reagens. I disse utførelsesformene er det merkede spesifikke bindingsmiddel i stand til spesifikt å binde forsterkningsmidlet når forsterkningsmidlet er bundet til et kompleks som inneholder reagensarten. ;De diagnostiske sett ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i et "ELISA"-format for å påvise tilstedeværelsen eller mengden av minst anti-HIV-2-antistoffer i en kropps-væskeprøve, slik som serum, plasma eller urin. "ELISA" henviser til en enzymbundet immunosorbentanalyse hvor det anvendes et antistoff eller et antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen- eller enzym-antistoff-konjugat for å påvise og kvantifisere mengden av et antigen eller antistoff som er til stede i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken finnes i kapittel 2 i 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av P.D. Sites et al., utgitt av Lange Medical Publications of Los Altos, CA i 1982, og i US patentskrifter nr. 3 654 090, 3 850 752 og 4 016 043. ;Ved foretrukne utførelsesformer kan således et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse festes til en fast matriks slik at det dannes en fast bærer som omfatter en pakning i de angjeldende diagnostiske systemer. ;Reagenset festes vanligvis til den faste matriks ved adsorpsjon fra et vandig medium selv om andre fstemåter som er godt kjent for fagfolk innen teknikken, kan anvendes. ;Anvendbare faste matrikser er også godt kjent innen teknikken. Slike materialer er vannuoppløselige og omfatter det kryssbundne dextran som er tilgjengelig under vare-merket Sephadex<®>, agarose, polystyrenkuler med diameter ca. 1 ym - ca. 5 mm, polyvinylklorid, polystyren, kryssbundet polyacrylamid, nitrocellulose- eller nylonbaserte vevninger, slik som ark, strimler eller pinner, eller rør, plater eller brønnene i en mikrotiterplate, slik som de som er laget av polystyren eller polyvinylklorid. ;Reagensarten, det merkede spesifikke bindingsmiddel eller forsterkningsreagenset ifølge hvilket som helst diagnostisk system som her er beskrevet, kan tilveiebringes i oppløsning, som en flytende dispersjon eller som et i det vesentlige tørt pulver, f.eks. i lyofilisert form. Når indi-kas jonsmidlet er et enzym, kan enzymets substrat også tilveiebringes i en adskilt pakning i systemet. En fast bærer, slik som den tidligere beskrevne mikrotiterplate, og én eller flere buffere kan også være tatt med som separat emballerte elementer i dette diagnostiske analysesystem. ;Pakningsmaterialene som her er omtalt i sammenheng med diagnostiske systemer, er de som vanligvis benyttes i diagnostiske systemer, slike materialer omfatter glass- og plast-flasker (f.eks. polyethylen, polypropylen og polycarbonat), ampuller, plast- og plastfolielaminerte konvolutter og lignende . ;Ved en utførelsesform er et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbart til analysering med hensyn på tilstedeværelse av antistoffer indusert ved hjelp av HIV-2. Et slikt system omfatter i settform en pakning som inneholder et STLV-III-beslektet polypeptid ifølge oppfinnelsen. ;Når det er ønsket å tilveiebringe et diagnostisk system som kan anvendes til påvisning av og skjelning mellom eksponering mot HIV-1 og HIV-2, er det inkludert et HIV-l-beslektet di-cys- eller di-leu-polypeptid som her beskrevet, sammen med et STLV-III-beslektet polypeptid i settet. HIV-l-beslektede di-cys-polypeptider omfattet i settet, er de som har en sekvens valgt fra gruppen vist i tabell 2. ;Ved en annen utførelsesform av et diagnostisk system som kan anvendes til å påvise og skjelne mellom anti-HIV-1-og anti-HIV-2-antistoffer, er et HIV-l-beslektet di-leu-polypeptid ifølge oppfinnelsen inkludert i settet, i tillegg til det STLV-III-beslektede polypeptid. Foretrukne HIV-l-beslektede di-leu-polypeptider omfattet i settet, er de som har en sekvens valgt fra gruppen vist i tabell 3. ;På bakgrunn av det funn at en kombinasjon, i blanding, av HIV-l-di-cys- og di-leu-polypeptider uventet gir en forøkt evne til å påvise eksponering mot HIV-1, er et diagnostisk system som omfatter en pakning som inneholder et STVL-III-beslektet polypeptid ifølge oppfinnelsen og en kombinasjon, ;i blanding, av et HIV-l-di-cys- og et HIV-l-di-leu-polypeptid, også omfattet. ;Ved en utførelsesform er kombinasjonen av STLV-III-beslektet polypeptid og HIV-l-beslektet polypeptid fysisk adskilt i settet slik at det er mulig å skjelne mellom tilstedeværelsen av anti-HIV-1- og anti-HIV-2-antistoffene. Et eksempelvis sett av denne type omfatter en første fast bærer bestående avmikrotiterplatebrønner belagt med, dvs. hvortil det operativt er festet, et STLV-III-beslektet polypeptid, fortrinnsvis p82 og/eller p86, og en andre fast bærer bestående av mikrotiterplatebrønner belagt med, dvs. hvortil det er operativt festet, en blanding av HIV-l-beslektede polypeptider (III) og (IV). Selvfølgelig kan brønnene som er belagt med STLV-III-polypeptid og brønnene som er belagt med HIV-l-polypeptid være på den samme plate eller på forskjellige plater. ;I en annen utførelsesform er de STLV-III-beslektede, HIV-l-beslektede, di-cys- og HIV-l-beslektede di-leu-polypeptider inkludert i settet som en blanding av alle tre, hvorved det skapes en mulighet for å undersøke med hensyn på eksponering mot et større spekter av AIDS-beslektede virus under anvendelse av en fast bærer. Et sett av denne type omfatter vanligvis en fast bærer, slik som en mikrotiterplate hvortil det operativt er festet i en enkelstående brønn, en blanding av STLV-III-beslektet polypeptid, fortrinnsvis p82 og/eller p86, HIV-l-beslektet di-cys-polypeptid (III) og HIV-l-beslektet di-leu-polypeptid (IV). ;F. Analvsefremgangsmåter ;Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ;for in vltro påvisning av tilstedeværelsen av ;antistoffer mot HIV-2 (AIDS-beslektede vest-afrikanske retrovirus) i en kroppsvæskeprøve ved å fremstille et kompleks som inneholder et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse og slike antistoffer. Fagfolk innen teknikken vil forstå at det er et stort antall godt kjente fremgangsmåter innen klinisk diagnostisk kjemi som kan utnyttes til å danne disse kompleksene. Selv om eksempelvise analysefremgangsmåter her er beskrevet, er følgelig oppfinnelsen ikke be-grenset slik. ;Forskjellige heterogene og homogene analysefremgangsmåter kan anvendes, enten kompetitive eller ikke-kompetitive for påvisning av tilstedeværelse av antistoffer mot HIV-2-TMP i en kroppsvæskeprøve ved å bruke de STLV-III-beslektede polypeptider ifølge oppfinnelsen. F.eks. omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for analysering av en kroppsprøve med hensyn på tilstedeværelse av anti-HIV-2-antistoffer som omfatter følgende trinn: (a) Blanding av en kroppsvæskeprøve med et STLV-III-beslektet polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis p82 og/eller p86, slik at det dannes en immunoreaksjonsblanding. Fortrinnsvis tilveiebringes kroppsvæske-prøven som en kjent mengde blod eller et produkt utvunnet fra blod, slik som serum eller plasma, selv om urin, spytt, sæd, vaginalsekret eller cerebral-spinal-væske (CSF) også ;kan anvendes. Det HIV-2-beslektede polypeptid er fortrinnsvis til stede som del av en fast bærer, f.eks. et HIV-2-beslektet polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse festet til inner-veggene til mikrotiterbrønn, slik at den dannede immunoreaksjonsblanding har en fast og en flytende fase. ;(b) Oppbevaring av blandingen under biologiske analysebetingelser i et forutbestemt tidsrom, slik som ca. 10 minutter til ca. 16-20 timer, ved en temperatur på ca. 4°C til ca. 45°C som er tilstrekkelig for at eventuelle anti-HIV-2-antistoffer som er til stede i prøven, kan immunorea- ;gere med (bindes immunologisk) polypeptidet slik at det dannes et polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt. ;Biologiske analysebetingelser er de som opprettholder den biologiske aktivitet til polypeptidmolekylene ifølge oppfinnelsen og anti-HIV-2-antistoffene som er søkt analysert, og omfatter et temperaturområde fra ca. 4°C til ca. 45°C, en pH-verdiområde på ca. 5 til ca. 9 og en ionestyrke som varierer fra ionestyrken til destillert vann og til ionestyrken til ca. en molar natriumklorid. Metoder for optimali-sering av slike betingelser er godt kjent innen teknikken. (c) Analysering med hensyn på tilstedeværelse av eventuelt polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt som ble dannet, og derved bestemmes også tilstedeværelse av eventuelle anti-HIV-2-antistoffer i immunoreaksjonsblandingen. Fortrinnsvis bestemmes mengden av eventuelt dannet polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, og derved mengden av anti-HIV-2-antistoffer som er til stede i prøven. ;Analysering med hensyn på tilstedeværelse av eventuelt polypeptidholdig (anti-HIV-2-antistoff-holdig) immunoreaksjonsprodukt, enten direkte eller indirekte, kan utføres ved hjelp av analyseteknikker som er godt kjent innen fagområdet. I foretrukne utførelsesformer prepareres f.eks. det polypeptidholdige immunoreaksjonsprodukt fra trinn (b) ytterligere for analysering i henhold til trinn (c) ved hjelp av de følgende trinn: (i) Blanding av et biologisk aktivt, merket spesifikt bindingsmiddel med det polypeptidholdige immunoreaksjonsprodukt slik at det dannes en blanding for merkingsreaksjon. ;Det merkede spesifikke bindingsmiddel er i stand til å ;binde seg til ethvert immunoglobulin som er til stede i det polypeptidholdige immunoreaksjonsprodukt slik at det dannes et merket kompleks. Det merkede spesifikke bindingsmiddel består fortrinnsvis av andre antistoffmolekyler, slik som xenogene anti-human Fc-antistoffer. Mer foretrukket er det at det merkede spesifikke bindingsreagens er immunoglobulin-klassespesifikt. ;(ii) Den derved dannede blanding for merkingsreaksjon holdes under biologiske analysebetingelser i et forutbestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at det merkede spesifikke bindingsmiddel bindes til eventuelle anti-HIV-2-anti- ;stoffer som er til stede som polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, hvorved det dannes et merket kompleks. ;Analysering med hensyn på tilstedeværelse av det merkede kompleks gir en analyse med hensyn på tilstedeværelse av anti-HIV-2-antistoffer i prøven. ;Alternativt kan homogene analysefremgangsmåter, slik som de som er beskrevet i US patentskrifter 4 536 479, 4 233 401, 4 233 402 og 3 996 345, anvendes til å påvise det polypeptidholdige immunoreaksjonsprodukt ifølge trinn (c). ;Eksempler ;De følgende eksempler er ment å illustrere foreliggende oppfinnelse. ;1. Syntetisering av HTLV- III- peptid ( II) ;A. Syntese av Boc- prolin- harpiks: ;Klormethylert styren-divinylbenzen-polymer inneholdende 1,3 mol ekvivalenter (meq) klorid/gram harpiks ble forestret med Boc-prolin i vannfritt N,N-dimethylformamid (DMF) under anvendelse av kaliumjodid (Kl) som det katalytiske middel. Omsetningen ble utført ved 55°C i 24 timer som beskrevet av Steward & Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. utgave ;(1984), Pierce Chemical Co. Substitusjonen med Boc-prolin ;var 0,92 mmol/gram, slik det ble bestemt ved å anvende en pricrinsyreanalyse på en del av frigitt harpiks. ;B. Syntese og karakterisering av peptid ( II) ;Syntese av peptid med formel (II) ble utført ved å bruke teknikken til Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-54 ;(1963). Peptidsekvensen IWGCSGKLICTTAVP ble syntetisert på ;et Vega 250C automatisert peptidsynteseapparat ved å bruke et program for dobbelkobling. Boc-prolin-harpiks (1,8326 g) ;ble sekvensvis dobbelkoblet itied de følgende Boc-L-aminosyrer erholdt fra Bachem. Inc., Torrence, CA, i et overskudd på ;12 meq: ;Oppløsnings- ;Aminosyre middel ;Boc-Val CH2C12;Boc-Ala CH2C12 • ;Boc-(O-Bzl)-Thr CH2C12;Boe-(O-Bzl)-Thr CH2C12;Boc-(MeOBzl)-Cys CH2C12;Boc-Ile CH2C12;Boc-Leu 10% DMF/CH2C12;Box-(Cl-Z)-Lys CH2C12;Boc-Gly CH2C12;Boc-(O-Bxl)-Ser CH2C12;Boc-(MeOBzl)-Cys CH2C12;Boc-Gly CH2C12;Boc-Trp 10% DMF/CH2C12;Boc-Ile CH2C12;I den ovenfor angitte sekvensvise addisjonsfremgangs-måte er "Boe" brukt som en kjemisk forkortelse for tert-butyloxycarbonyl-a-amino-beskyttelsesgruppen. Den funksjon-elle gruppe fjernes ved hydrolyse i 50% trifluoreddiksyre (TFA)/50% diklormethan (CH2C12) etter at aminosyren er blitt koblet til den voksende peptidkjede. Denne virkningen ekspo-nerer aminoenden til kjeden slik at den neste aminosyre tilkobles effektivt. ;I tillegg til B>oc-beskyttelsesgruppen på hver aminosyre, er sidekjedene på noen aminosyrer videre beskyttet mot reaksjon ved peptidsyntesekjemien. Disse beskyttelsesgrupper, angitt i paranteser i sekvensaddisjonslisten ovenfor, er alle stabile overfor betingelsene ved peptidsyntese, men fjernes likevel lett fra aminosyren under spalting i fluorsyre. Anisol (methylfenylether) virker som en nukleofil "renovatør" under HF-spaltingstrinnet slik at alkylering av peptidet ved hjelp av de frigjorte carboniumioner fra beskyttelsesgruppen forhindres. Beskyttelsesgruppene for de oppførte aminosyrer er definert nedenunder: ;0- Benzyl: Benzylester, festet til hydroxylsidekjeden ;i både serin og threonin for å forhindre acylering eller for-grening av peptidkjeden. ;MeObzl: 4-Methoxybenzyl, festet til sulfhydrylgruppen ;i cystein for å forhindre dens oxydasjon under peptidsyntese. ;Cl- Z: 2-Klorbenzyloxycarbonyl, festet til a-aminogruppen i lysin for å forhindre dannelsen av sidekjedevekst fra dette sted på peptidet. ;Peptidet ble spaltet fra harpiksen med 10% anisol i fluorsyre og ekstrahert med 20% vandig eddiksyre. Denne opp-løsning ble filtrert for å fjerne fast harpiks og sendt gjennom en Frac.togel TSK HW-40F avsaltingskolonne under anvendelse av et elueringsmiddel av 2 0% vandig eddiksyre. Fraksjoner ble samlet opp i 10 ml aliquoter og kolonneefflu-enten ble overvåket ved 280 nanometer (nm) Fraksjoner som oppviste positiv absorbans ved 280 nm ble fortynnet med 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i vann og analysert ved hjelp av "high performance liquid chromatography" (HPLC) under anvendelse av følgende analytiske HPLC-betingelser: ;Buffer A: 0,1% TFA/destillert avionisert vann, ;Buffer B: 0,1% TFA/HPLC-finhetsgrad acetonitril, Gradientbetingelser: 10% buffer "B" til 50% buffer "B" ;i buffer "A" i løpet av 20 minutter, ;Bølgelengde: 214 nm, ;Strømning: 1,0 ml/minutt (min), ;Kolonne: Vydac 214TP54 C-4 proteinkolonne, 250 x 4,5 mm. Hovedabsorbanstoppen ved 214 nm ble bestemt til å ha en retensjonstid på 12,42 minutter. Fractogel-fraksjonene som inneholdt mer enn 70% av denne toppen, ble slått sammen og merket Fr:l. Fractogel-fraksjonene som inneholdt mindre enn 7 0%, men mer enn 50%, av denne toppen ble slått sammen og merket Fr:2. ;Analytisk HPLC på Fr:l viste at toppen ved 12,42 minutter utgjorde 87% av det totale areal. Fr:l ble videre kjennetegnet ved hjelp av aminosyreanalyse under anvendelse av en modell 4150 Alpha Amino Acid Analyzer, aminosyrerestsekvens-bestemmelse under anvendelse av en modell 470 A Protein-sekvenseringsmaskin og bestemmelse av prosent peptidinnhold slik det bestemmes ut fra utvinningen ved aminosyreanalyse av en kjent peptidmengde. Peptidsekvensanalyse ble også ut-ført på peptidharpiksen for å bekrefte den forventede peptidsekvens. C. Polymerisering av peptidet med formel ( II) : ;Peptidetinneholdt i Fr:1-forrådet som er beskrevet i ;del B, ble lyofilisert for å fjerne eddiksyre, og oppløselig-gjort ved 200 yg/ml i 0,1 M natriumbicarbonatbuffer, pH 9,0. Aliquoter av dette peptidet fortynnet til 20 ug pr. ml (ug/ ml) i natriumbicarbonatbuffer ble brukt til å belegge mikro-titerbrønner for ELISA-er vist i tabell 4. For analyser ;vist nedenunder i tabellene 4-6, ble peptidet oppløselig-gjort i vann ved 10 mg pr. ml (yg/ml) og fortynnet i fosfat-buffer, pH 7,3, til 5 yg/ml for belegning av mikrotiter-brønner. ;Peptidet i Fr:l foreligger primært i en enkel form som antas å være ikke-oxydert monomer. Ettersom peptidet med formel (II) inneholder to cysteiner, polymeriserer det imidlertid i nærvær av luft etter oppløseliggjøring i nøytral eller basisk vandig buffer. ;Peptidet anvendt i ELISA-er beskrevet nedenunder er en blanding av svært små mengder rettkjedet monomer, og større mengder cyklisk monomer (dannet ved hjelp av intrapolypeptid-disulfidbinding) og enda større mengder polymerer (dannet ved hjelp av interpolypeptid-disulfidbinding) av forskjellige størrelser. Uten at man ønsker å være bundet av det, antar søkerne at polymerformene er viktige for de her beskrevne reaktiviteter. Selv om den cykliske monomerform be-holder en del av antigenisiteten til polymerformen, antas den å være mindre virkningsfull når det gjelder å binde til mikrotiterbrønnene og er mindre egnet som fastfasebestanddelen i ELISA. Den antatte cykliske monomer avsløres som en skarp topp ved ca. 12,7 minutters retensjonstid i HPLC-analyse, mens polymeren er kjennetegnet som en bred topp ved omtrent 15,9 minutter retensjonstid. ;Oxydasjonsbetingelser kan endres når det gjelder temperatur, pH, peptidkonsentrasjon og lignende, slik det er kjent for fagfolk innen teknikken å endre mengden av monomer, cyklisk monomer og polymer som er tilbake i produktet, eller størrelsen på dannede polymerer. Små mengder av såkalte "deletion"-peptider (som mangler én eller flere aminosyrer) og deres oxydasjonsformer kan også finnes i peptidpreparatene som brukes i ELISA, men disse mindre urenheter påvirker ikke bruken av peptidet. 2. Syntese og karakterisering av HIV- l- polypeptider ( III) gjennom ( XI) : Syntese av disse peptidene ble utført ved å bruke i det vesentlige den samme klassiske Merrifield-teknikk som beskrevet tidligere for peptid (II). For peptid (III) ble det brukt Boc-serin-harpiks med substitusjon av 0,92 mmol/g. ;For peptid (IV) ble det brukt B -isoleucin-harpiks med substitusjon på 0,8 ml/g. Syntese av B<p>c-serin- og Boc-isoleucin-harpiksene ble utført ved hjelp av Gisin-metoden, slik den er beskrevet av Stewart & Young, supra. ;A. For peptid (III) ble aminosyrerestsekvensen i IWGCSGKLICTTAVPWNAS syntetisert ved å bruke de følgende Boc~ L-aminosyrer i 12 mekv. overskudd: ;B. For peptid (IV) ble peptidsekvens AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLT syntetisert ved å bruke de følgende Boc-L-aminosyrer i 12 mekv. overskudd: ;I tillegg til Boc-beskyttelsesgruppen på hver aminosyre er, på samme måte som med peptid (II), sidekjedene på noen aminosyrer ytterligere beskyttet mot reaksjon ved kjemien i forbindelse med peptidsyntese. I tillegg til de beskyttelsesgruppene som er beskrevet for aminosyrene i syntesen av peptid (II), ble de følgende beskyttelsesgrupper for aminosyrene som bare forekommer i peptidene (III) og (IV), brukt: Hobt: 1-hydroxybenzotriazol, anvendt i ekvimolare mengder i forhold til glutamin og asparagin under kobling for å forhindre dehydrering til nitrilformene. ;Tosyl: p-toluensulfonyl, anvendt til å acylere guanidin-gruppen i argininsidekjeden. ;Bzl: beta-benzylester, blokkerer carboxylgruppene i sidekjeden i asparaginsyre og glutaminsyre. ;Brz: 2-brombenzyloxycarbonyl, blokkerer hydroxylgruppen i tyrosinsidekjeden. ;Peptider ble spaltet fra harpiksen, filtrert, ekstrahert med eddiksyre og kjørt gjennom en Fractogel avsaltingskolonne som i eksempel 1. For peptid (IV) ble Fractogel fraksjonene analysert ved hjelp av analytisk HPLC, og fraksjoner inneholdende minst 30% av den samlede absorpsjon ved 214 nm som hovedtoppen som migrerer ved omtrent 14 minutters retensjonstid, ble slått sammen. De sammenslåtte fraksjoner ble kromatografert på carboxymethylcellulose ekvilibrert med 0,01 M ammoniumacetat, pH 4,4. Kolonnen ble eluert med en trinngrådient av ammoniumacetat og fraksjonen som eluerte ved 0,2 M ammoniumacetat ble samlet opp, lyofilisert og analysert ved hjelp av analytisk HPLC. Hovedtoppen som migrerte ved 15 minutters retensjonstid, omfattet mellom 30 og 40% ;av den samlede absorpsjon ved 214 nm, og materialet hadde et akseptabelt aminosyreinnhold. Dette materiale ble på ;nytt oppløseliggjort og brukt i ELISA som beskrevet for peptid (II) . ;For peptid (III), ble Fractogel-fraksjoner på samme måte analysert ved hjelp av analytisk HPLC. Fraksjoner som inneholdt minst 70% av den samelde absorpsjon ved 214 nm som hovedtoppen som migrerte ved omtrent 12,99 minutters retensjonstid, ble slått sammen, lyofilisert og analysert ved hjelp av HPLC og med hensyn på aminosyreinnhold. Dette materiale ble på nytt oppløseliggjort og brukt i ELISA som beskrevet for peptid (II). ;Når de ble brukt i blanding som fastfasebestanddelen ;i en ELISA, ble 1 ug av peptid (III) og 0,5 ug av peptid (IV) anvendt pr. mikrotiterbrønn. Peptidet ble enten tørket på brønnen ved 37°C eller "våt-pakket" på platen ved inkubasjon over natten ved 4°C. C. For peptid (V) ble Boc-serin-harpiks brukt som beskrevet for syntese av peptid (III). Syntese av (V) fort-satte som beskrevet for syntese av (III) gjennom tilsetningen av C-ende-isoleucinet til peptid (III). For fullførelse av (V)-sekvensen ble, fra dette punktet av, fremgangsmåten for tilsetning av aminosyrene i sekvensen AVERYLKDQQLLG i peptid (IV) fulgt. ;Peptid (V) ble spaltet fra harpiksen, filtrert, ekstrahert med eddiksyre og kjørt gjennom en Fractogel, fraksjoner inneholdende hovedtoppen for absorpsjon ved 280 nm ble slått sammen og merket Fr:l. Fr:l ble analysert med hensyn på aminosyreinnhold og funnet å være akseptabel. Denne fraksjon ble lyofilisert og brukt i ELISA som beskrevet for peptid (II) . D. Ved å følge lignende fremgangsmåter for peptidene med formlene (I), ble (IV) - (XV) fremstilt. ;E. Peptidene (I) - (III) , (V) og (VII) - (X) inneholder to cysteiner. Følgelig kan disse peptidene polymerisere og cyklisere gjennom oxydativ disulfidbinding under anvendelse av atmosfæreoxygen som oxydasjonsmiddel. Tilsetningen av de fire aminosyrerestene i den C-terminale ende av (III) hjelper tilsynelatende den cykliske form av peptidet når det gjelder å binde seg til plasten i ELISA-analysen. Som et resultat av dette, er den cykliske form av (III) mer effektiv i fastfase-ELISA enn (II) i cyklisk er. Formene av (II) , (III) - og (V)-peptidene som har vært brukt hittil i ELISA for å analysere med hensyn på HIV-l-antistoff-gjenkjenning, har vanligvis vært en blanding av rettkjedet monomer, cyklisk monomer, dimer og polymer. ;Peptidene (IV), (VI) og (XI) inneholder bare en cystein. Disse peptidene kan danne en dimerstruktur gjennom disulfidbinding. ;Under betingelser for oppløseliggjøring av peptider ved fremstilling av ELISA (f.eks. 0,1 M natriumbicarbonat-buf f er ved pH 9,0, i nærvær av luft og dens oxygen) å ha mesteparten av sulfhydrylgruppene i peptidene (II), (III), (IV) og (V) blitt omdannet til disulfidformer. ;3. Fremstilling av sammenlignings- HTLV- III- peptider ;Ved å følge lignende fremgangsmåter som de i eksemplene ;2 og 3, ble peptider med følgende formler syntetisert for sammenligningsformål: ;Disse peptidene har hver sekvenser som svarer til sekvensen i HIV-l-kappen, men er hverken di-cys- eller di-leu-polypeptidene som tidligere er blitt beskrevet. Nærmere bestemt er peptider med formelen (C-I) og (C-II) sekvenser oppstrøms for aminoenden i sekvensen med formel (I), dvs. CSGLKIC. Peptider med formelen (C-III) inneholder bare amino-endedelen av sekvensen med formel (I). Peptider med formelen (C-IV) inneholder hele sekvensen med formel (I), bortsett fra L-cys-resten i carboxylenden. Som det her vil bli beskrevet, utviser ingen av disse peptidene de ønskelige immunoreaktive egenskaper. 4. Fremstilling av HIV- 1 ELISA analysesett og fremgangsmåte for anvendelse; ;A. Fremgangsmåte nr. 1 for HIV- 1- ELISA ;(1) belegg ELISA-plate med peptid, 1 ug/50 ul/brønn .i 0,1 M ;NaHC03, pH 9, ;(2) la plater tørke over natten utildekket ved 37 C, vask så med PBS, (3) blokker plater med 300 yl/brønn blokkeringsbuffer (5% ;NCS-PBS) i 2 timer ved 37°C, ;(4) ryst ut blokkeringsbuffer og drener brønnen, ;(5) tilsett 50 yl/brønn testantiserum (første antistoff) i 30 - 120 minutter ved 37°C. (Dersom antiserumet må fortynnes, bruk T-vask). Fortynninger på 1:2 - 1:100 har ;vært brukt, ;(6) ryst ut testantisera og vask plate seks ganger med PBS-Tween<®>20, (7) tilsett 100 yl/brønn med merket spesifikt bindingsmiddel i form av et enzymmerket andre antistoff fortynnet 1:4000 med T-vask. Holdes 30 - 120 minutter ved 37°C, (8) ryst ut eventuelt ureagerte andre antistoff og vask platen seks ganger med PBS-Tween<®>20, (9) tilsette 100 yl/brønn OPD-substrat (eller 5 yl ABTS-oppløsning) i 20 minutter ved værelsetemperatur, (10) tilsett 50 yl/brønn 4N H2S04 for å stanse OPD-reaksjon (eller 100 yl/brønn 1% SDS for ABTS-reaksjon), (11) avles platen på en MR 500 mikroplate ELISA plateavleser. (490 nm for OPD eller 405 nm for ABTS). ;Reagenser: ;(1) 0,1 M NaHC03, pH 9. ;(2) NCS-PBS: fosfatbufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 5% normalt kalveserum. (3) T-vask: (780 ml TBS + 20 ml NCS + 1,6 g bovint serumalbumin (BSA) + 0,4 ml polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat (Tween<®>20), ;TBS: 12,11 g Tris-base, ;17,5 g NaCl, ;1800 ml H20, ;pH til 7,6 med HC1 (ca. 3N), ;sluttvolum 2000 ml. ;(4) Vaskebuffer PBS-Tween<®>20: 0,5 ml Tween<®>20 pr. liter ;PBS. ;(5) OPD-substrat: en o-fenylendiamin (OPD) tablett/3 ml ;H20/l,24 yl 30% H202. (6) 4N H2S04. (7) ABTS: H202 i 1:1 volumforhold i innkjøpte oppløs-ninger, ;ABTS = 2,2<1->azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-sulfo-nat) . ;(8) 1% SDS: 1% natriumdodecylsulfat. ;Materialet som ble anvendt i trinn 1 for belegning av ELISA-platen, er et peptid med formel (II), (III), (IV), (V) eller en blanding derav som beskrevet ovenfor. Det andre antistoff er enten et kommersielt tilgjengelig peroxydasemerket, polyklonalt anti-human-immunoglobulin-antistoff (katalog fra Cappel Laboratories, nr. 3201-0231, peroxydase-konjugert IgG-fraksjon av geit-anti-human-immunoglobuliner), eller et peroxydasemerket monoklonalt anti-human IgG-antistoff fra mus, eller en blanding av peroxydasemerkede monoklonale anti-human IgG-, IgA- og IgM-antistoffer fra mus. ;B. Fremgangsmåte nr. 2 for HIV- 1- ELISA ;( Tabellene 10 og 13): ;(1) En ELISA-plate belegges med peptider; 1,0 yg peptid IV, 0,5 yg peptid III, 200 yl/brønn i 0,1 M carbonatbuffer, pH 9,6. ;(2) Platene inkuberes over natten ved 4°C. ;(3) Platene blokkeres med 300 yl/brønn 1,0% BSA-PBS pluss additiver i 1,5 timer ved 37°C. ;(4) Blokkeringsbuffer rystes ut. ;(5) Platene tørkes i 1,0 time ved 37°C. ;(6) 200 yl/brønn 1% bovint gammaglobulin, 5% BSA, 0,5% ;Tween<®>20, PBS, pH 7,2, tilsettes. ;(7) 20 yl/brønn testsera tilsettes, det inkuberes i 30 minutter ved 37°C. (8) Testsera rystes ut, platen vaskes 5 ganger med PBS, 0,5% Tween<®>20. (9) 20 0 yl/brønn pepperrotperoxydase-merket monoklonalt anti-human-IgG fortynnes 1:3500 med 50% kalvefosterserum, 1% hesteserum, 0,05% Tween<®>, PBS tilsettes, ;(10) Det inkuberes i 3 0 minutter ved 37°C. ;(11) Merket monoklonalt anti-human-IgG rystes ut, platen vaskes 5 ganger med PBS, 0,05% Tween<®>20. (12) 200 yl/brønn OPD-substrat tilsettes og det inkuberes i 30 minutter ved væreIsetemperatur. (13) 50 yl/brønn 4 N H2S04 tilsettes for å stanse reaksjonen. (14) Platen avleses ved 490 nm i MR 500 mikroplateavleser. ;Reagenser: ;(1) Fosfatbufret saltoppløsning (PBS), pH 7,3. ;8,0 g natriumklorid, ;0,2 g kaliumfosfat, énbasisk, ;1,16 g natriumfosfat, tobasisk, ;0,2 g kaliumklorid, ;0,2 g thimerosal, ;vann opp til 800 ml og blandes, pH reguleres om nødvendig, ;vann tilsettes inntil 1 liter. ;(2) Belegningsbuffer: pH 9,6, 0,01 M carbonatbuffer. ;(3) Blokkeringsbuffer er PBS inneholdende følgende additiver: ;1% bovint serumalbumin (Sigma nr. A7030), ;10 Ku/ml aprotinin, ;10 yg/ml trypsininhibitor, ;10 mM EACA (E-aminocapronsyre), ;0,5 mM PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid), ;2,0 mM EDTA, ;10% glycerol. ;(4) Prøvefortynner: ;10,0 g bovint gammaglobulin, fraksjon II, lyofilisert, ;50,0 g bovint albumin, fraksjon V, ;0,5 ml "Polysorbate 20" (Tween<®>20), ;Vann tilsettes inntil 1 liter og det blandes, ;det filtreres gjennom 0,2 mikrometerfilter. ;(5) Konjugatfortynner: ;490 ml PBS, ;500 ml varmeinaktivert bovint fosterserum, ;10 ml varmeinaktivert hesteserum, ;0,1 g thimerosal, ;0,329 g kaliumferricyanid, ;vann tilsettes inntil 1 liter blanding, ;det filtreres gjennom 0,2 um filter. ;5. Evaluering av ELISA basert på HIV- 1 peptid II ;ELISA-settene beskrevet i eksemplene 4A fremstilt med peptid (II) ble evaulert mot et panel av sera omfattende sera fra normale individer, pasienter med forstyrrelser eller sykdommer som ikke har forbindelse med AIDS, kjente AIDS-pasienter, kjente ARC-pasienter og pasienter hvis diagnose er ukjent, men som er antistoff-positive med hensyn på HIV-2-antistoffer ved kommersielle tester eller ved hjelp av "Western blot"-analyse. Resultatene er oppsummert i tabellene 4-7. For sammenligning ble disse samme seraprøve analysert med kommersielt tilgjengelige sett hvor det benyttes et viruslysat som antigen, og ved hjelp av "Western blot"-analyse. ;De kommersielle sett .' valgt ut til disse undersøkelsene, var fra Abbot Laboratories, North Chicago, 111. og Electro-Nucleonics, Inc. (ENL), Columbia, MD, og retningslinjene ;som ble levert sammen med hvert kommersielt sett, ble fulgt ved utførelsen av hver analyse som er oppført i tabellene 4-7. Analysen hvor det anvendes polypeptid (II) som fastfaseantigen og fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4A, er hen-vist til som "E8"-analysen i tabellene. Sera som utviste lignende resultater i de utførte analyser, er gruppert sammen i tabellene nedenunder for å gjøre presentasjonen av dataene klarere. ;A. Tabell 4 viser resultater med normale sera. ;Gjennomsnittlig absorbans for normale = 0,016 for E8-analyse ;-Standardavvik (S.D.) fra gjennomsnittet er 0,017 ;Absorbans "cutoff"-verdi ved gjennomsnitt + S.D. = 0,104 Falsk positiv prosent i 200 prøver ved 0,104 "cutoff" = 0,5% ;(1/200) ;NT = ikke testet ;Prøve-ID = serumprøvenummer. ;Som vist i tabell 4, reagerer foreliggende sera som ikke inneholder antistoffer mot HIV-1, generelt ikke med peptid (II) i en standard ELISA. Dette muliggjør beregning av en "cutoff"-verdi for absorpsjon for å skjelne mellom anti-stof f-negative og antistoff-positive sera. I analysen ovenfor av 200 normale sera ble en "cutoff"-verdi på 0,104 valgt. Ved denne "cutoff"-verdi er den falske positive prosentdel forventet å være mindre enn eller lik med 0,5%. ;B. For å vise den bedre effektivitet når det gjelder ;å eliminere falske positive resultater ved anvendelse av peptidet med formel (II) i forhold til de kommersielt tilgjengelige sett hvor det anvendes viruslysat som målantigen, ble et antall sera fra pasienter med to forstyrrelser som ikke er relatert til AIDS, nemlig nasofaryngealt karsinom og rheumatoid artritt (RA), testet ved hjelp av E8-analysen og kommersielle tester. Resultatene er oppsummert i tabell 5 nedenunder og viser den forøkte spesifisitet ved E8-ana- ;lysen. Mange prøver som ga falske positive resultater med kommersielle tester, ble korrekt identifisert som negative ved hjelp av E8-analysen. ;(+) = falske positive resultater ;NT = ikke testet ;NPC = nasofaryngealt karsinom ;RA = rheumatoid artritt ;C. For å vise effektiviteten av E8-analysen ved påvisning av HIV-l-antistoffer i AIDS/ARC-pasientsera sammenlignet med kommersielle sett, ble ELISA-settet beskrevet i eksempel 4, fremgangsmåte A, evaluert mot et panel av sera utvunnet fra diagnostiserte AIDS- og ARC-pasienter. Resultatene er oppsummert i tabell 6 og viser at analysen er ekvivalent med kommersielle sett når det gjelder dens evne til å identi-fisere sera som inneholder antistoff mot HIV-1. D. Den høye prosentdel av falske positive resultater som er karakteristisk for de for tiden tilgjengelige sett hvor det anvendes viruslysat som antigen, skyldes delvis tilstedeværelsen av cellulære antigener i lysatet som reagerer med antistoffer som er til stede i både AIDS- og ikke-AIDS-pasientsera. I tillegg inneholder slike kompleksantigener som de som er utvunnet fra et virus, slik som HIV-1, mange epitoper og vil mer sannsynlig reagere ikke-spesifikt med antistoffer som er til stede i humansera. ;Peptidet (II) reduserer kompleksiteten til antigenet som brukes til å reagere med pasientsera, ned til en eller kanskje bare noen få epitoper. Sjansen for ikke-spesifikk reaksjon med ikke-HIV-l-antistoffer er derfor veldig redusert. Ikke-spesifikke reaksjoner kan imidlertid fortsatt oppstå ettersom noen antistoffer er "klebrige" og kan bindes til plastbæreren som brukes i analysen, eller til andre proteiner, slik som bovint serumalbumin eller geitsera som brukes til å blokkere platen etter tilsetning av peptidet. ;I tabell 7 nedenunder er det fremlagt data vedrørende analysen av forskjellige pasientsera. I tillegg til den vanlige analyse med peptid (II) som beskrevet i eksempel 4, fremgangsmåte A, ble hvert serum analysert mot peptid (II) etter blanding av seruinprøven med en effektiv blokkerende mengde av peptidet (II). I tabellen er også resultatene fra analysering av hver prøve med kommersielt tilgjengelige sett tatt med. Det er åpenbart ut fra resultatene av ikke-AIDS-seraprøver som feilaktig ble identifisert som positive ved enten den ene eller begge de kommersielt tilgjengelige sett, identifiseres korrekt som negative ved å bruke den kompetitive analyse med E8-peptid. Videre identifiseres til og med prøver som feilaktig er identifiserte som positive ved hjelp av E8-analysen, korrekt som negative ved den kompetitive analyse med E8-peptid. Betydningsfullt er det blokkerings- eller den kompetitive analyse som også tjener som en bekreftende analyse ved analysering av serumprøver som ikke inneholder antistoffer mot HIV-1. De siste syv prøver analysert som vist i tabell 7 er positive med hensyn på antistoff både ved E8-analysen og kommersielt tilgjengelige analyser (med unntak av de to falske negative resultatene ved bruk av Abbott-settet), og ved den mer trettende og tidkrevende "Western blot"-analyse. Reaktiviteten til disse sera med peptid (II) som fastfaseantigen blokkeres effektivt ved å blande hvert serum med peptid (II), noe som indikerer at reaktiviteten av antistoff til peptid er peptidspesifikk, og at disse siste syv prøvene er sanne positive prøver. ;6. Sammenligning av HIV- l- peptider ( I) - ( XV) med ( C- I) - ;( C- III) ved hjelp av ELISA ;ELISA-*sett som beskrevet eksempel 4, fremgangsmåte A, ble laget med peptider (I) - (XV) samt (C-I) - (C-VIII). ELISA-settene ble evaluert mot et 10-prøvers panel av sera som omfattet klinisk positive prøver, dvs. prøver som viste seg å
ha tilstedeværelse av HIV-l-infeksjon, slik det ble bestemt ved hjelp av kommersielle analyser og "Western blot"-analyse. Resultatene av disse analysene er vist i tabell 8 nedenunder.
En peptidanalyse betraktes som positiv dersom nivået
av absorbans (optisk tetthet) i ELISA-analysen var mer enn to ganger bakgrunnsnivået bestemt ved å beregnet gjennomsnittet av absorbansen til to normale sera. Den rapporterte gjennomsnittsverdi utgjør den gjennomsnittlige verdi for optisk tetthet i ELISA, beregnet etter at bakgrunnsverdien var trukket i fra. Den angitte indeks er en veiet aktivitet av et bestemt peptid i forhold til aktiviteten av peptidet med formel (II). Indeksen er veiet i favør av en bestemt pep-tidanalyses evne til korrekt å angi en positiv verdi til forskjell fra nivået av den normale bakgrunnsrespons. Formelen for utledning av indeksen er som følger:
hvor: % positive er % positive for den bestemte peptidanalyse,
gjennomsnitt er gjennomsnitt for den bestemte peptidanalyse ,
% positive.^ er % positive for peptidanalyse med formelen (II), og
(gjennomsnitt^) er gjennomsnitt for peptidanalysen med formelen (II).
Som det kan sees av tabell 8, ga analyser som ble gjort under anvendelse av peptider med formlene (I) - (V) alle positive resultater på minst 50% eller mer, og fastsatte i hvert tilfelle en indeks på minst 0,1. På den annen side utviste hver av de komparative segmenter, selv om de represen-terte nært tilgrensende eller overlappende eller delvis overlappende segmenter fra HIV-l-kappen, ikke slike positive resultater eller slik høy indeks. Disse data viser også at bruken av en blanding av polypeptider (III) og (IV) gir et forbedret resultat med hensyn til gjennomsnitt og indeks-verdier enn polypeptid (V), hvis sekvens inneholder kombinasjonen av sekvensene til (III) og (IV), gjør.
7. Sammenligning av ELISA- er under anvendelse av HIV- 1- peptider ( III) og ( IV)
Ytterligere AIDS/ARC-pasientsera ble analysert med ELISA-analyser under anvendelse av de høyreaktive peptider med formlene (III) og (IV) (eksempel 4, fremgangsmåte 1). Reaktiviteten, uttrykt som absorbansverdier, til noen av disse sera er vist i tabell 9.
De fleste sera som ble analysert, reagerte svært godt med begge peptidene, mye som det sees av prøvene i tabell 9, gruppe C. Av og til var imidlertid noen prøver langt mer reaktive med et peptid enn med det andre, som vist i tabell 9, gruppe A og B. Disse data indikerer at det kan være mer enn én epitop (f.eks. en lineær og en konformasjonell epitop eller to lineære epitoper) i dette 32-aminosyre-området som vanligvis gjenkjennes hos pasienter som er blitt eksponert mot H.iv-1. "High performance liquid chromatography" (HPLC) analyse av peptider med formlene (III) og (IV) i oppløsning indikerer at peptider med formel (III) foreligger stort sett som cykliske monomerer, mens peptider med formel (IV) for det meste er i dimerform. Strukturkjennetegnene som tilføres disse to peptidene ved disulfidbinding, kan være relatert til både antigenfremvisning og dannelsen av en konformasjons-epitop.
Den differensielle reaktivitet av polypeptidene (III) og (IV) ble videre undersøkt ved å sammenligne absorbansverdiene som ble oppnådd for hvert peptid i ELISA-er utført i henhold til eksempel 4B under anvendelse av peptid (III), peptid (IV) eller en blanding av (III) og (IV) som fastfaseantigen. De oppnådde absorbansverdier for hver av 37 sera i ELISA basert på peptid (III) ble dividert med de som ble oppnådd i ELISA basert på peptid (IV). De resulterende absorbansverdiforhold er vist i rangert rekkefølge i tabell 10.
Fra tabell 10 kan det sees at 30 av de 77 sera som ble undersøkt, oppviste en større immunoreaktivitet for peptid (III) enn for peptid (IV).
8. Undersøkelser av HIV- l- peptid kompetitiv inhiberinq
Ytterligere bevis for at mer enn én epitop er til stede i peptider med formel (III) og formel (IV) kan utledes fra absorbansverdier erholdt fra kompetitive undersøkelser, hvorav resultatene fra ett eksempel er vist i tabell 11. Méd denne undersøkelse ble sammenblandede peptider med formel (III) og (IV) anbragt på en mikrotiterplate som det immobili-serte, fastfaseantigen, og en ELISA-analyse (eksempel 4A) ble utført under fem forskjellige betingelser: uten konkurranse, eller konkurranse med overskudd av peptid med formel (III), peptid med formel (IV), en blanding av begge peptidene [(III) + (IV)], eller med et heterologt peptid. Konkurransen ble utført ved å tilsette det eller de korrekte peptid (gjær) til det fortynnede serum like før tilsetning av serumprøven til mikrotiterbrønnen.
Under disse betingelser er det svært klart at noen prøver reagerer svært godt med hvert av eller begge peptidene (III) og (IV). F.eks. reagerte prøve 3416 godt med en blanding av begge peptidene, ettersom konkurranse med peptidet med formel (III) alene ga en optisk tetthet (OD) på mer enn 1,8, konkurranse med peptidet med formel (IV) ga en OD på 1,055 og, i nærvær av begge konkurrerende peptider, gikk OD ned praktisk talt til bakgrunnsnivåer. Andre serumprøver, slik som 3412, reagerte mye sterkere med et peptid enn med det andre; i dette tilfelle ble OD redusert fra mer enn 1,4 ned til 0,113 når den var blokkert med peptid med formel (III), og forble større enn 1 når det ble konkurrert med peptid med formel (IV). Det er imidlertid tydeligvis noe reaktivitet med peptid med formel (IV) fordi, i nærvær av begge peptidene, oppheves immunoreaktiviteten fullstendig (0,059). Tilblanding av peptidene (III) og (IV) som konkurrerende peptider ga alltid et bedre resultat enn bruken av ett av peptidene alene gjorde.
En annen kompetitiv undersøkelse med peptid med formel (I) på platen som fastfaseantigen, og under anvendelse av fremgangsmåten ifølge eksempel 4A, viste at peptidene med formel (IV) ikke konkurrerte effektivt med peptid med formel (I) selv om peptid med formel (III) konkurrerte svært effektivt. Se tabell 12 nedenunder.
Ut fra disse analysene synes det således som om en epitop som er til stede i peptid med formel (III) , også er til stede i peptid med formel (I), og at denne epitop er vesentlig forskjellig fra de som er til stede i peptid med formel (IV). Basert på denne samme prøve, reagerte praktisk sera dessuten med epitopene som er til stede på peptidene med formel (III) og (IV), selv om de reagerte sterkere med ett peptid enn med det andre i mange tilfeller.
9. ELISA under anvendelse av en kombinasjon av HIV- 1- peptidene ( III) og ( IV)
Ved å bruke en blanding av 1 ug av peptid med formel (III) og 0,5 ug av peptid med formel (IV) pr. brønn som fastfaseantigen i en ELISA-analyse (eksempel 4B), var spesifisi-teten og sensitiviteten til denne analyse lik med eller bedre enn ethvert av de kommersielt tilgjengelige viruslysat-antistoff-påvisningssett som ble testet.
Tabell 13 viser ELISA-resultater erholdt ved å bruke pasientsera, normale sera og sera fra forskjellige sykdoms-grupper som omfatter rheumatoid artritt, nasofaryngealt karsinom, Epstein-Barr-virusinfeksjon, cytomegalovirusinfek-sjon, gram-negativ sepsis, toxoplasmagondii, systemisk lupus-erythematosus og herpesvirusinfeksjoner.
Når bona fide normalsera ble analysert med hensyn på reaktivitet i analysen med (III) pluss (IV) og i analysen markedsført av Electronucleonic, Incorporated (ENI), hadde analysen med peptidene (III) pluss (IV) en betydelig lavere prosentdel av falske positive resultater. Som dataene i tabell 13 viser, var prosentdelen falske positive resultater for ENI 1,65% (12/728), mens (III) pluss (IV) peptidanalysen hadde en falsk positiv prosentdel på bare 0,55% (4/ 728). Når den falske positive prosentdel i gruppen med forskjellige sykdommer undersøkes, hadde peptidanalysen en svakt lavere prosentdel med falske positive resultater enn
ENI-analysen, 1,81% vs. 2,58% (7/387 vs. 10/387).
10. Syntese av STLV- III- beslektede polypeptider
Syntese av polypeptidene p80 og p81 ble utført ved å bruke i det vesentlige den samme klassiske Merrifield-teknikk som beskrevet tidligere. For peptid p80 ble det brukt Boc-cystein-harpiks med substitusjon på 0,71 mmol/g fremstilt som i eksempel 2. For peptid p81 ble det brukt Boc-serin-harpiks med substitusjon på 0,67 mmol/g, fremstilt som i eksempel 2.
A. For polypeptid p8 0 ble aminosyrerestsekvensen AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC syntetisert ved å bruke følgende Boc-L-aminosyrer i overskudd på 12 molekvivalenter (mekv.):
B. For polypeptid p81 ble aminosyrerestsekvensen AWCAFRQVCHTTVPWPNAS syntetisert ved å bruke følgende Boc-L-aminosyrer i overskudd på 12 mekv.:
Polypeptidene ble hver for seg avspaltet fra de respektive harpikser, ekstrahert med eddiksyre, sendt gjennom en Fractogel avsaltingskolonne og ble analysert som i eksempel 1.
11. Evaluering av STLV- III- polypeptidene p80 og p81, alene og i kombinasjon, ved hjelp av ELISA
Innledende undersøkelser under anvendelse av to sera inneholdende høye titere av antistoffer mot HIV-2, ble utført ved hjelp av ELISA under anvendelse av hver av p80 og p81 alene og i kombinasjon. 100 mikroliter (ul) 0,01 M NaHCO^,
pH 9,6, inneholdende 1 mikrogram (yg) av enten p80 eller p81, eller en kombinasjon (blanding) av 1 yg p80 og 1 yg p81, ble blandet i brønnene i Immunolon II mikrotiterplater. Platene ble så holdt i ca. 16 timer ved 4°C for å la polypeptidene adsorbere på (belegge) veggene i brønnene. Etter fjerning
av polypeptidbelegningsoppløsningen ved rysting, ble 300 yl PBS inneholdende 1% bovint serumalbimun (BSA), 5 nm benzami-din, 10 kiloenheter aprotinin, 10 yg/ml trypsininhibitor, 10 mM EA.CA, 0,5 mM PMFS, 2 mM EDTA og 10% glycerol tilblandet i hver brønn for å blokkere overskytende proteinbindings-steder.
Brønnene ble holdt i 90 minutter ved 37°C, blokkerings-oppløsningen ble fjernet ved rysting og brønnene ble tørket ved å holde dem i 1 time ved 37°C, hvorved det ble dannet et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse, dvs. en STLV-III-beslektet polypeptid-holdig fast bærer (polypeptidbelagt brønn).
200 yl av hvert serum fortynnet 1:10 i TBS ble tilblandet i en polypeptidbelagt brønn. Den resulterende fast/ flytende-fase immunoreaksjonsblanding ble holdt ved 37°C i 30 minutter for å muliggjøre dannelse av polypeptidholdige immunologiske reaksjonsprodukter. Brønnene ble så skylt fem ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween<®>20.
200 yl av et pepperrotperoxydase-merket monoklonalt anti '-human-IgG-antistoff fra mus, fortynnet 1:3500 i PBS inneholdende 50% kalvefosterserum, 1% hesteserum og 0,5% Tween<®>20, ble så tilblandet i hver brønn. Den resulterende merkereaksjonsblanding ble holdt i 30 minutter ved 37°C for å la dannelse av polypeptidholdige merkede komplekser skje. Brønnene ble så skyllet fem ganger med PBS, 0,05% Tween<®>20 for å fjerne ikke-omsatt merket antistoff.
200 yl OPD-substrat ble så tilblandet i hver brønn slik at det ble dannet en fremkallings-reaksjonsblanding. Etter å ha holdt fremkallingsreaksjonsblandingen i 30 minutter ved ca. 20°C, ble 50 yl 4 N H2S04 tilblandet i hver brønn for å stanse fremkallingsreaksjonen, og de resulterende oppløsninger ble analysert med hensyn på absorbans ved 49 0 nm under anvendelse av en mikrotiterplateavleser. Se tabell 14.
Resultatene av disse undersøkelser indikerte at både p80 og p81 er i stand til å reagere immunologisk med antistoffer indusert ved hjelp av HIV-2. Polypeptid p80 ga absorbansverdier på mer enn 1,1 med begge sera, mens p81 ga verdier på ca. 0,4. Når ELISA-ene ble utført under anvendelse av en blanding av p80 og p81, så man absorbansverdier som var sammenlignbare med de som ble oppnådd med p81 alene.
12. Spesifisitetsundersøkelser av KIV- 1- og STLV- III- polypeptid
Tre grupper sera ble brukt til å eluere HIV-1- og STLV-III-polypeptidenes evne til å skjelne mellom antistoffer indusert ved HIV-1- og HIV-2-infeksjoner. Den første gruppe besto av 20 sera erholdt fra HIV-2-isolat-antistoff-positive vest-afrikanske pasienter, innsamlet mens de møtte frem på
en uteklinikk i Bissau, Guinea Bissau, for undersøkelser i forbindelse med mistanke om tuberkulose. Alle disse sera reagerte immunologisk med HIV-2 ved ELISA under anvendelse av oppbrudte vironer (viruslysat) som antigen. Disse sera inneholdt også antistoffer som reagerte med TMP (gp36) fra HIV-2 i en "Western blot"-analyse, men utviste ingen reaktivitet med TMP (gp41) fra HIV-1.
Den andre gruppe omfattet sera fra 20 HIV-1-antistoff-positive asymptomatiske svenske individer (homoseksuelle menn, intravenøse stoffmisbrukere eller blødere) som reagerte i "Western blot"-analysen med TMP (gp41) og andre antigener fra HIV-1, men ikke med TMP (gp36) fra HIV-2.
Den tredje gruppe besto av 20 sera fra svenske blodgivere som var negative med hensyn på HIV-1- og HIV-2-antistoffer når de ble analysert under anvendelse av kommersielt tilgjengelige diagnostiske systemer erholdt fra Organon, Teknika, N.V., Tunhout, Belgia og Wellcome Reagents, Ltd., London, U.K., og HTLV-IV-viruslysat-ELISA.
Faste bærer omfattende en kombinasjon av HIV-1-polypeptider (III) og (IV) festet til mikrotiterplaterbrønner ble fremstilt som beskrevet i eksempel 11 under anvendelse av 200 yl 1,0 M NaHC03, pH 9,6, inneholdende 5 yg/ml av hvert polypeptid til å belegge brønnene. Også fremstilt ifølge eksempel 11 ble et annet sett av faste bærere omfattende STLV-III-polypeptid p80 festet til mikrotiterplatebrønner. Alle tre gruppene av de ovenfor beskrevne sera ble så analysert ved å bruke både den (III) + (IV) polypeptidkombina-sjons-holdige (HIV-l-spesifikke) og den p80-holdige (HIV-2-spesifikke) faste bærerne ifølge ELISA-fremgangsmåten i eksempel 11.
ELISA-resultatene for alle tre grupper av sera er vist i figur 3. 20 sera som inneholdt antistoffer mot HIV-2 men ikke mot HIV-1 TMP gp41, ga uttalte reaksjoner med STLV-III-beslektet polypeptid p80, men ga, bortsett fra for ett serum, ingen vesentlig immunoreaksjon med kombinasjonen av HIV-l-beslektede polypeptider (III) og (IV).
I motsetning til dette reagerte de 20 sera med antistoffer mot HIV-1 med de faste bærerne inneholdende polypeptidene (III) og (IV), men ga, igjen med ett unntak, ingen vesentlige immunoreaksjon med de faste bærerne inneholdende bare p80. De negative kontrollsera ga ingen vesentlig immunoreaksjon med hverken de HIV-1- eller STLV-III-spesifikke faste bærerne.
Fra etterfølgende analyse av de to sera som ga immuno-reaks jon med både HIV-1- og STLV-III-spesifikke faste bærere, antas det at individene som disse sera. var erholdt fra, var blitt eksponert mot både HIV-1- og HIV-2-viruset.
Fordi polypeptidene (III) og (IV) ble funnet å være forskjellig reaktive (eksempel 7), ble polypeptidene p80 og p81 sammenlignet på samme måte. Absorbansverdiene som ble erholdt for hver av de 24 sera i en ELISA basert på peptid p80 ble dividert med verdiene som ble erholdt i en ELISA basert på peptid p81. De resulterende absorbansverdiforhold er vist i rangert rekkefølge i tabell 14.
Fra tabell 14 kan det sees at 19 av de 24 undersøkte sera utviste en større immunologisk reaktivitet for p80 enn for p81.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et analysesystem og en fremgangsmåte for å skjelne mellom eksponering mot HIV-1 i forhold til eksponering mot HIV-2, samt eksponering mot begge.
Beskrivelsen ovenfor, inkludert de bestemte utførelses-former og eksempler, er ment å være illustrerende for foreliggende oppfinnelse.
Claims (16)
1. Polypeptid,
karakterisert ved at det har en aminosyresekvens med formel:
eller
2. Fremgangsmåte for in vitro analysering med hensyn på tilstedeværelse av anti-HIV-2-antistoffer i en kroppsvæske-prøve ,
karakterisert ved følgende trinn: (a) dannelse av en immunoreaksjonsblanding ved å blande en kroppsvæske med et polypeptid med en aminosyresekvens som har formelen:
eller (b) opprettholdelse av immunoréaksjonsblandingen under biologiske analysebetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig til at eventuelle anti-HIV-2-antistoffer som er til stede i prøven, kan reagere immunologisk med polypeptidet og danne et polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, og (c) analysering med hensyn på tilstedeværelse av eventuelt, polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, som ble dannet, og derved tilstedeværelse av eventuelle anti-HIV-2-antistoffer i prøven.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det polypeptidholdige immunoreaksjonsprodukt videre fremstilles for analysering i henhold til trinn (c) ved: (i) dannelse av en merkereaksjonsblanding ved. å blande merket spesifikt bindingsmiddel som er i stand til å binde til ethvert humant immunoglobulinprodukt, med det polypeptidholdige immunoreaksjonsprodukt, og (ii) opprettholdelse av den således dannede merkereaksjonsblanding under biologiske analysebetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig til at de merkede antistoffer kan reagere immunologisk med eventuelle anti-HIV-2-antistoffer som er til stede som polypeptidholdig immunoreaksjonsprodukt, slik at det dannes et merket kompleks.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at polypeptidet festes til en fast matriks før tilblandingen i trinn (a).
5. Diagnostisk prøvesett for analysering med hensyn på tilstedeværelse av anti-HIV-2-antistoffer i en kropps-væskeprøve ,
karakterisert ved at det omfatter en pakning som inneholder et polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har formelen:
eller
6. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det videre omfatter et HIV-l-beslektet di-cys-polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har en formel valgt fra gruppen bestående av:
idet det HIV-l-beslektede polypeptid er i stand til å reagere immunologisk med antistoffer indusert av HIV-1.
7. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det videre omfatter et HIV-l-beslektet di-leu-polypeptid med en aminosyrerestsekvens med en formel valgt fra gruppen bestående av:
8. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 6, karakterisert ved at det videre omfatter et HIV-l-beslektet di-leu-polypeptid med en aminosyrerestsekvens med en formel valgt fra gruppen bestående av:
9. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 8, karakterisert ved at de HIV-l-beslektede di-cys- og di-leu-polypeptider er til stede som en blanding.
10. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 8, karakterisert ved at de HIV-2-beslektede og HIV-l-beslektede polypeptider er til stede som en blanding.
11. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det videre omfatter i en separat pakning, et merket spesifikt bindingsmiddel for sig-nalisering av tilstedeværelsen av et polypeptidholdig immuno-reaks jonsprodukt.
12. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at polypeptidet er festet til en fast matriks.
13. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det videre omfatter et HIV-l-beslektet polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har en formel valgt fra gruppen bestående av:
14. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det omfatter: (a) en første fast bærer bestående av en fast matriks hvortil det er operativt festet HIV-2-beslektet polypeptid med en aminosyresekvens som har formelen: AIEKYLEDQAQLNAWCAFRQVC eller AWCAFRQVCHTTVPWPNAS, (b) en andre fast bærer bestående av en fast matriks hvortil det er operativt festet et HIV-l-beslektet di-cys-polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har en formel valgt fra gruppen bestående av:
et HIV-l-beslektet di-leu-polypeptid ned en aminosyrerestsekvens som har en formel valgt fra gruppen bestående av:
15. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 14, karakterisert ved at det omfatter: a) en første fast bærer bestående av en mikrotiterplate hvortil det er operativt festet et polypeptid med en aminosyrerestsekvens som har formelen: b) en andre fast bærer bestående av en mikrotiterplate hvortil det er operativt festet i blanding et første og et andre HIV-l-beslektet polypeptid med aminosyrerestsekvenser som har de respektive formler:
16. Diagnostisk prøvesett ifølge krav 15, karakterisert ved at det omfatter en fast
bærer bestående av en fast matriks hvortil det er operativt festet i blanding første, andre og tredje polypeptider med aminosyrerestsekvenser som har de respektive formler:
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8701628A SE8701628D0 (sv) | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Medel for analys mm |
US8368287A | 1987-08-07 | 1987-08-07 | |
PCT/US1988/001140 WO1988008005A1 (en) | 1987-04-16 | 1988-04-08 | Stlv-iii-related polypeptides, diagnostic systems and assay methods |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO885586D0 NO885586D0 (no) | 1988-12-15 |
NO885586L NO885586L (no) | 1988-12-15 |
NO177463B true NO177463B (no) | 1995-06-12 |
NO177463C NO177463C (no) | 1995-09-20 |
Family
ID=26659777
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO885586A NO177463C (no) | 1987-04-16 | 1988-12-15 | STLV-III-beslektede polypeptider, diagnostiske prövesett og in vitro analysefremgangsmåte for påvisning av anti-HIV-2-antistoffer i kroppsvæskepröve |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0309566B1 (no) |
JP (1) | JP2777160B2 (no) |
AU (1) | AU614521B2 (no) |
DE (2) | DE3887053D1 (no) |
FI (1) | FI101797B (no) |
NO (1) | NO177463C (no) |
WO (1) | WO1988008005A1 (no) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5310651A (en) * | 1986-01-22 | 1994-05-10 | Institut Pasteur | DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2 |
AU614543B2 (en) * | 1987-08-21 | 1991-09-05 | Scripps Clinic And Research Foundation | Hiv-1-related polypeptides, diagnostic systems and assay methods |
AU623097B2 (en) * | 1987-10-09 | 1992-05-07 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Oligopeptides and their use for diagnostic and vaccination purposes for aids and arc |
AU629528B2 (en) * | 1988-01-27 | 1992-10-08 | Biochem Pharma Inc. | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies |
DE3901857A1 (de) * | 1989-01-23 | 1990-07-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von hiv 2 antikoerpern |
US5459060A (en) * | 1989-08-24 | 1995-10-17 | Bioclonetics Incorporated | Human monoclonal antibodies directed against the transmembrane glycoprotein (gp41) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
US6248574B1 (en) * | 1989-12-13 | 2001-06-19 | Avigdor Shaffermann | Polypeptides selectively reactive with antibodies against human immunodeficiency virus and vaccines comprising the polypeptides |
EP0438332B1 (fr) * | 1990-01-16 | 1998-04-08 | Orgenics Ltd. | Peptides dérivant de la glycoprotéine d'enveloppe de virus HIV, leurs applications à la détection d'une infection due à ces virus et à la vaccination contre le SIDA |
FR2657017B1 (fr) * | 1990-01-16 | 1995-08-18 | Clonatec Sa | Peptides derivant de la glycoproteine d'enveloppe du virus-hiv-1, leurs applications a la detection d'une infection due a ce virus et a la vaccination contre le sida. |
DE59309207D1 (de) * | 1992-10-06 | 1999-01-21 | Dade Behring Marburg Gmbh | Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung |
DE4318186C2 (de) * | 1993-06-01 | 2002-07-25 | Dade Behring Marburg Gmbh | Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung |
CN118515734A (zh) * | 2023-02-20 | 2024-08-20 | 菲鹏生物股份有限公司 | 稳定的hiv蛋白 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4629783A (en) * | 1985-04-29 | 1986-12-16 | Genetic Systems Corporation | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease |
US4735896A (en) * | 1986-03-04 | 1988-04-05 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide and process of using same for the detection and diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions |
WO1987002892A1 (en) * | 1985-11-14 | 1987-05-21 | President And Fellows Of Harvard College | T-lymphotrophic virus |
US4879212A (en) * | 1986-04-02 | 1989-11-07 | United Biomedical Inc. | Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III |
JPH01163198A (ja) * | 1987-12-28 | 1989-06-27 | Birobaaru Sa | Hiv−2感染検出用合成ペプチド抗原、その組成物およびその使用方法 |
-
1988
- 1988-04-08 AU AU17022/88A patent/AU614521B2/en not_active Ceased
- 1988-04-08 WO PCT/US1988/001140 patent/WO1988008005A1/en not_active Application Discontinuation
- 1988-04-08 DE DE19883887053 patent/DE3887053D1/de not_active Revoked
- 1988-04-08 JP JP63503630A patent/JP2777160B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-08 DE DE3887053T patent/DE3887053T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-08 EP EP88904066A patent/EP0309566B1/en not_active Revoked
- 1988-12-15 FI FI885806A patent/FI101797B/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-12-15 NO NO885586A patent/NO177463C/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0309566A1 (en) | 1989-04-05 |
EP0309566B1 (en) | 1994-01-12 |
AU614521B2 (en) | 1991-09-05 |
FI885806A (fi) | 1988-12-15 |
NO885586D0 (no) | 1988-12-15 |
JP2777160B2 (ja) | 1998-07-16 |
WO1988008005A1 (en) | 1988-10-20 |
FI885806A0 (fi) | 1988-12-15 |
AU1702288A (en) | 1988-11-04 |
NO885586L (no) | 1988-12-15 |
DE3887053D1 (de) | 1994-02-24 |
FI101797B1 (fi) | 1998-08-31 |
DE3887053T2 (de) | 1994-05-11 |
NO177463C (no) | 1995-09-20 |
JPH01503462A (ja) | 1989-11-22 |
FI101797B (fi) | 1998-08-31 |
EP0309566A4 (en) | 1989-06-26 |
DE3887053T4 (de) | 1994-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0261224B1 (en) | Synthetic htlv-iii peptides, compositions and uses thereof | |
US6485900B1 (en) | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease | |
US4772547A (en) | HTLV-III envelope peptides | |
NO300462B1 (no) | Monoklonale antistoffer og peptider som kan anvendes til diagnose av HIV-infeksjoner | |
Hinkula et al. | Epitope mapping of the HIV-1 gag region with monoclonal antibodies | |
EP0309566B1 (en) | Stlv-iii-related polypeptides, diagnostic systems and assay methods | |
US5670309A (en) | Methods and diagnostic kits for the detections of HIV-2-specific antibodies employing polypeptides obtained from the simian immunodeficiency virus | |
US6042831A (en) | Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) GP160 epitopes that are immunologically homologous to epitopes located in the class I major histocompatibility complex (MHC) heavy chain α-1 domain | |
EP0317804B1 (en) | HIV peptides and methods for detection of HIV | |
JP3851761B2 (ja) | Hiv抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物 | |
EP0538283B2 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies | |
EP0284383B1 (en) | Synthetic antigens for the detection of aids-related disease caused by LAV-2 | |
US7144697B1 (en) | Synthetic antigen for the detection of antibodies immunoreactive with HIV virus | |
EP0329761B1 (en) | Hiv-1-related polypeptides, diagnostic systems and assay methods | |
JPH07119235B2 (ja) | ヒト免疫不全ウイルスエンドヌクレアーゼ蛋白質由来ポリペプチド | |
CA1341594C (en) | Synthetic peptides and mixtures therof for detecting hiv antibodies | |
Cogniaux et al. | Characterization of monoclonal antibodies against the p17 core protein of the human immunodeficiency virus 1 | |
US6130314A (en) | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease | |
AU4087693A (en) | HIV protein epitopes immunologically homologous to HLA | |
WO1992022579A1 (en) | MIMIC PEPTIDES OF gp120 |