JP2001055400A - Ｈｉｖ抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＩＶ−１により感染された少数の患者から
取られた血清の１００％を同定することに有用である一
連の新規ペプチド又はアミノ酸配列を提供し、そしてＨ
ＩＶ−１を検出するために有用な組成物もまた提供する
こと。 【解決手段】 下記の環状ペプチド： 【化１】 〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸
６０４から始まり、そしてアミノ酸５８６まで戻るアミ
ノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わし；そしてｙはカ
ルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸６１２か
ら始まり、そしてアミノ酸６２９まで延びるアミノ酸配
列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わす〕。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ抗体を検出
するための新規の環状合成ペプチド及び線状の合成ペプ
チドとその組合せに関する。

【０００２】

【従来の技術】後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、ＡＩ
ＤＳ関連複合体(ＡＲＣ)及び前ＡＩＤＳは、レトロウィ
ルス、すなわちヒト免疫欠損ウィルスタイプ１(ＨＩＶ
−１；またＨＴＬＶ−III、ＬＡＶ−１及びＡＲＶとし
ても知られている)により引き起こされると思われて来
た。最近、ＨＩＶ−２(正式にはＬＡＶ−２)と呼ばれる
もう１種の病原性ヒトレトロウィルスが、ＡＩＤＳを有
する西アフリカの患者から単離された(Ｍontagnierな
ど、国際公表番号 Ｗ０８７／０４４５９として１９８
７年、７月３０日に公表されたＰＣＴ／ＦＲ８７／００
０２５)。ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１及びＳimian免疫欠
損ウィルス(ＳＩＶ)と多くの配列を共有することが最近
示された(Ｇuyaderなど、Ｎature，３２６：６６２〜６
６９，１９８７)。

【０００３】たとえ他の番号システムが本発明に関する
従来技術に使用されても、本発明に使用されるアミノ酸
のための番号システムは、ＨＩＶ−１タンパク質のため
には、Ｒatnerなど、Ｎature，３１３：２７７〜２８
４，１９８５のシステム及びＨＩＶ−２タンパク質のた
めには、Ｇuyaderなど、Ｎature，３２６：６６２〜６
６９（１９８７）のシステムである。ペプチドにおける
本発明に使用されるアミノ酸は、次のような単一の文字
コードにより与えられる：ala＝Ａ，arg＝Ｒ，asn＝
Ｎ，asp＝Ｄ，cys＝Ｃ，gln＝Ｑ，glu＝Ｅ，gly＝Ｇ，h
is＝Ｈ，ile＝Ｉ，leu＝Ｌ．lys＝Ｋ，met＝Ｍ，phe＝
Ｆ，pro＝Ｐ，ser＝Ｓ，thr＝Ｔ，trp＝Ｗ，tyr＝Ｙ及
びval＝Ｖ。

【０００４】ＨＩＶ−１により感染された患者の血清中
の抗体の検出のための初期免疫診断試験は、抗原して完
全なウィルスを使用した。第２世代試験は、組換えＤＮ
Ａ方法により得られたポリペプチド配列を使用した。Ｃ
abradillaなど、Ｂio／Ｔechnology，３：１２８〜１３
３（１９８５）及びＣhangなど、Ｂio／Ｔechnology，
３：９０５〜９０９（１９８５）は、それぞれ８２個及
び１０２個のアミノ酸残基の細菌により合成されたウィ
ルスタンパク質を得ることに成功した。Ｅ.Ｐ.８６２０
２３１４号及び８６１１４２４３号は、単独で又は混合
して免疫反応性であるgp４１及びgp１２０の領域を包含
する組換えポリペプチドを記載する。Ｓhoemanなど、Ａ
nal. Ｂiochem．１６１：３７０〜３７９（１９８７）
はまた、ＨＩＶ−１により感染された患者からの血清中
に存在する抗体との免疫反応特性を有する、gp４１から
のいくつかのポリペプチドを記載する。上記アッセイ方
法は許容されない。それらの感度の欠乏は、それが検出
から漏れ、そして血液生成物受容体を感染せしめるウィ
ルスを含む血液を可能にする場合、重大である。これら
の抗原調製物中に存在する不純物は、健康な個人を苦悩
にする、許容できない高レベルの誤った陽性結果の原因
である。

【０００５】次に、従来技術においては、より短いエピ
トープの同定が行なわれたことが明らかになった。これ
は、それらが容易且つ低費用で調製され得るためであ
り、そしてより重要なことには、ＡＩＤＳに関係しない
ウィルスタンパク質との共有エピトープの存在による誤
った陽性の試験結果の危険性を減じるためである。これ
に関しては、Ｇallaher，Ｃell，５０：３２７〜３２
８，１９８７は、ＨＩＶ−１のgp４１の領域が、呼吸シ
ンシチウムウィルスとの５個の隣接するアミノ酸残基の
配列及びはしかウィルスＦ１糖タンパク質の４個の等し
く分配されたアミノ酸の配列を共有することを見出し
た。従って、この領域又は発見されるべきいづれか他の
共通領域を含むさらに高く精製された組換えポリペプチ
ドが、誤った陽性結果を潜在的に担当するであろう。

【０００６】卓越した特異性とは別に、ＨＩＶウィルス
のユニーク且つ高く保存されたエピトープに対応するよ
り短いペプチド配列の同定が、化学合成によるその産生
をより容易且つより安価にする。実験的な方法が記載さ
れて来た。これらの方法は、活性タンパク質の表面上に
暴露される予定である短いアミノ酸配列の選択に関与す
ることができる(Ｈopp and Ｗoods，Ｊ. Ｉmmunol. Ｍe
t．８８：１〜１８，１９８６を参照のこと)。いく分有
用であるけれども、これらの方法はほとんど表示的でな
い。それにもかかわらず、それらは、ＡＩＤＳの原因で
あるウィルスのタンパク質上に存在するエピトープの同
定のために多く適用されて来た。たとえば、アメリカ特
許第４,６２９,７８３号、国際特許出願番号 ＰＣＴ／
ＵＳ８６／００８３１及びＥ.Ｐ.出願第８６３０３２２
４号は、ＡＩＤＳの診断キットに有用である。ＨＩＶ−
１のp１８，p２５，gp４１及びgp１２０タンパク質から
の種々の合成ペプチドを開示する。

【０００７】しかしながら、より小さな抗原に対するこ
の傾向は、合成されたエピトープが、抗体により認識さ
れる厳密な立体配座を推定することができない危険性を
伴う。これらの場合のそれぞれにおいて試験される血清
サンプルの数はひじょうに制限されるけれども、小さな
合成ペプチドによる特異性は、ひじょうに高いことが見
出され(９５％〜１００％)たが、しかしながら、全体の
感度は８０〜１００％の間であった。１００％の感度が
達成される例のみにおいては、単に１０種のサンプルが
試験された。

【０００８】Ｓmithなど、Ｊ. Ｃlin. Ｍicrobiol．２
５：１４９８〜１５０４，１９８７は、高い免疫反応性
である２種のオーバラップペプチド、Ｅ３２及びＥ３４
を記載する。２４０種の血清陰性検体から誤った陽性結
果は得られなかったが、しかしその試験は３２２種のう
ち３種の血清陽性サンプルを見落とした(９９.１％の感
度)。Ｗangなど、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci．８３：
６１５９〜６１６３，１９８６は、１つの２１−マ−ペ
プチドが１００％の特異性及び９８％の感度を示す(Ａ
ＩＤＳの患者から取られた２２８種の血清陽性サンブル
のうち、２２４種がこのペプチドに対して陽性であるこ
とが見出された)一連のオーバーラップペプチド(たとえ
ばＳmithなど、によって発見されたＥ３２及びＥ３４ペ
プチドのアミノ酸残基)を記載する。

【０００９】１９８７年１１月１３日に出願されたアメ
リカ特許出願第１２０,０２７号においては、ＡＩＤＳ
ウィルスにより感染された患者の抗体と免疫反応する、
gp４１(ＨＩＶ−１)の残基６０６〜６２０(SGKLICTTAVP
WNAS)を包含する短い合成ペプチドが開示される。この
例においては、特異性がまた卓越している(６３／６３)
が、しかし５７種の確かな陽性のうち６種の血清陽性検
体が検出され得なかった(８９％の感度)。

【００１０】Ｇnannなど、Ｊ. Ｖirol．６１：２６３９
〜２６４１，１９８７及びＪ. Ｉnfec. Ｄis．１５６：
２６１〜２６７，１９８７はまた、gp４１(ＨＩＶ−１)
の免疫優性領域から一連のオーバーラップペプチドを報
告する。配列SGKLIC(６０６〜６１１)を有する１つのペ
プチドが試験される２２ ＨＩＶ−１陽性血清のいづれ
とも免疫反応しなかったそれらの発見が特に興味あるも
のであった。Ｎ−末端へのシステイン残基の付加はある
免疫反応性を回復した。すなわち４４種の血清のうち２
１種が７−マーのペプチドと反応した(４８％の感度)。
Ｇnannなどは、cys−６０５がgp４１−(ＨＩＶ−１)タ
ンパク質のセグメントの免疫反応性のために不可欠であ
ることの結論を下した。

【００１１】Ｇnannなどはまた、gp４１(ＨＩＶ−１)の
位置６０５及び６１１(Ｒatnerの番号システム)でのシ
ステイン残基が、ジスルフィド結合を通してのループの
形成によりたぶんタンパク質のこの領域の抗原立体配座
に臨界的な役割をはたすことができることを推定した。
しかし、ジスルフィド結合の形成を同定し、そして証明
するための著者による試みは失敗した。Ｇnannなどは、
それらが一部のアミノ酸配列６０５〜６１１(ここで２
個の末端のシステイン基はジスルフィド結合により結合
されている)を含む合成ペプチドを有することを決して
示さなかったので、そのようなジスルフィド結合を有す
るペプチドの性質は不明であり且つ推定できない。

【００１２】位置６０５〜６１１で２個のシステイン残
基を含む７−アミノ酸の一部の配列は、国際公開番号
ＷＯ８６／０６４１４として１９８６年１１月６日に発
表されたＰＣＴ／ＵＳ８６／００８３１のような他の記
録に開示されていて、ここで約bp７５１６〜７５９３の
領域によりコードされるペプチドＸ(３９)及び約bp７５
４３〜bp７５９３の領域によりコードされるペプチドVI
II(７９)の両者は、上記刊行物においてＧnannなど、に
より論じられた７−アミノ酸配列(アミノ酸６０５〜６
１１)を含む。そのペプチドは線状ペプチドとして報告
され、そしてその著者は、環状構造のいづれの形成をも
言及していない。

【００１３】国際公開番号 ＷＯ８７／０６００５とし
て１９８７年１０月８日に発表されたＰＣＴ／ＵＳ８７
／００５７７においてＲosenなどは、ＨＩＶ−１のエン
ベロープ糖タンパク質(gp４１)のＣys(６０５)−Ｃys
(６１１)を包含する一連の合成ペプチドが、中性又は塩
基性水性緩衝液中での溶解に基づいて一連の自発的な酸
化形質転換を受けることを報告している。その発明者
は、これらの条件下で、ＥＬＩＳＡに使用されるペプチ
ドが線状モノマー、環状モノマー、線状又は環状ダイマ
ー及び種々の長さの線状ポリマーのランダム混合物であ
ることを推定している。しかしながら、その発明者は、
環状成分の存在を証明していず、そして存在する他の種
々のダイマー及びポリマーを特徴づけていず、そして彼
らは、そのポリマー形がＥＬＩＳＡ試験における反応性
のために最っとも重要な成分であることを推定してい
る。

【００１４】Ｇnannなど、Ｓcience ２３７：１３４６
〜１３４９，１９８７は、gp４１(ＨＩＶ−１)上の１つ
に相同する領域に２つのシステイン、たとえばＣys(６
０５)及びＣys(６１１)を含むgp４２(ＨＩＶ−２)の残
基５９２〜６０３を包含する短い線状合成ペプチドを報
告する。このペプチドは、ＨＩＶ−２により感染された
患者から取られた５種の血清のうち５種と反応した。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】上記引用文献は、ＨＩ
Ｖ−１抗体を同定することにおいて有用であるペプチド
を提供するけれども、それらはまた、陽性の血清サンプ
ルを完全(１００％)に検出できないようなある欠点をも
示す。たとえば、Ｇnannなど、Ｊ. Ｖirol．６１：２６
３９〜２６４１（１９８７）は、６００〜６１１のアミ
ノ酸配列に関するそれらの試験において、２２種の陽性
血清のうち２２種すべてを検出し、そして彼らはまた、
Ｃenters for Ｄisease Ｃontrol, Ａtlanta. Ｇaでの
他の発明者に行なわれた、その同じ１２−アミノ酸配列
(６００〜６１１)に関する類似する試験が７９種の陽性
血清のうち７８種を検出したことを述べている。Ｊ. Ｉ
nfect．Ｄis.，１５６：２６１〜２６７，１９８７にお
いてその同じ著者は、gp４１−(ＨＩＶ−１)からの同じ
１２−アミノ酸配列が、アメリカ合衆国からの１３２人
のＨＩＶ−１感染患者のうち１３１人と反応することを
示した。

【００１６】同じ文献において、ＨＩＶ−１陽性血清が
５００倍以上に希釈される場合、これらの希釈された血
清のいくつかが、低感度を示す陰性であることが見出さ
れた。

【００１７】他の欠点は、被覆段階の間、システインを
含むペプチドの多くの酸化形の形成に起因する十分に定
義されていず且つ推定できない混合物のＥＬＩＳＡにお
ける使用である。

【００１８】ひじょうに低レベルの抗体が存在する場合
でさえ、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２抗体を含むす
べてのサンプルを正常な試験条件下で陽性として検出で
きる十分に定義された構造の最終生成物のみをＥＬＩＳ
Ａに使用するために、被覆段階の間、自発的な酸化に耐
性であるペプチド又はペプチド混合物を提供することが
ひじょうに所望されるように思われる。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ＨＩＶ
−１及びＨＩＶ−２抗体を１００％検出することに特に
適合され、そして血清がひじょうに希釈される場合でさ
え、すべてのＨＩＶ−１抗体を完全に検出できる新規の
一連のペプチド又はアミノ酸配列が提供される。

【００２０】より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、
５８６〜６２９のいづれかのアミノ酸配列(gp４１−Ｈ
ＩＶ−１)を含んで成り、ここでいづれか選択されたア
ミノ酸配列において、次の一部配列：

【００２１】

【化１】

【００２２】を提供するためにジスルフィド結合により
結合される、６０５〜６１１のアミノ酸配列のそれぞれ
の末端でシステイン残基を含むアミノ酸配列が常に存在
する。

【００２３】さらにより詳しくは、本発明の新規の環状
ペプチドは、その中に下記一般式：

【００２４】

【化２】

【００２５】〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸
又はアミノ酸６０４から始まり、そしてアミノ酸５８６
まで戻るアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わし；
そしてｙはカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミ
ノ酸６１２から始まり、そしてアミノ酸６２９まで延び
るアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わす〕で表わ
されるアミノ酸配列６０５〜６１１(gp４１−ＨＩＶ−
１)を含んで成る。

【００２６】より特定には、ｘは５８６から６０４まで
延びる次のアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)の１つを
表わし： G WG IWG GIWG LGIWG LLGIWG QLLGIWG QQLLGIWG DQQLLGIWG KDQQLLGIWG LKDQQLLGIWG YLKDQQLLGIWG RYLKDQQLLGIWG ERYLKDQQLLGIWG VERYLKDQQLLGIWG AVERYLKDQQLLGIWG LAVERYLKDQQLLGIWG ILAVERYLKDQQLLGIWG RILAVERYLKDQQLLGIWG そしてｙはカルボキシル基又は６１２から６２９まで延
びる次の１又は複数のアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−
１)を表わす： T TT TTA TTAV TTAVP TTAVPW TTAVPWN TTAVPWNA TTAVPWNAS TTAVPWNASW TTAVPWNASWS TTAVPWNASWSN TTAVPWNASWSNK TTAVPWNASWSNKS TTAVPWNASWSNKSL TTAVPWNASWSNKSLE TTAVPWNASWSNKSLEQ TTAVPWNASWSNKSLEQG TTAVPWNASWSNKSLEQGC TTAVPWNASWSNKSLEQI。

【００２７】下記の一般式（Ｉ）：

【００２８】

【化３】

【００２９】〔式中、ｘ及びｙは前記に定義された通り
である〕で表わされる少なくとも１つのペプチド及び−
４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列(gp１２０ Ｈ
ＩＶ−１)により特徴づけられるgp１２０のペプチド、
又は−４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列(gp１
２０ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるgp１２０のペプ
チド及び２４１から２６３まで延びるアミノ酸配列(p２
４ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるp２４のペプチ
ド、又は−４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列(g
p１２０ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるgp１２０の
ペプチド及び５８６から６２０まで延びるgp４１ ＨＩ
Ｖ−１のペプチドの組合せ又は混合物もまた本発明の範
囲内に存在する。

【００３０】本発明によれば、ＨＩＶ−２により感染さ
れた少数の患者から取られた血清の１００％を同定する
ことに有用である一連の新規ペプチド又はアミノ酸配列
もまた提供される。ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２の
両者を検出するために本発明に記載されたペプチド又は
ペプチドの混合物のいくらかを使用することが可能であ
る。

【００３１】より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、
５７８〜６１３のいづれかのアミノ酸配列(gp４２−Ｈ
ＩＶ−２として言及されるであろう推定上のgp４１.７)
を含んで成り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配列
において、次の一部配列：

【００３２】

【化４】

【００３３】を提供するためにジスルフィド結合により
結合される、５９７〜６０３(gp４２−ＨＩＶ−２)のア
ミノ酸配列のそれぞれの末端でシステイン残基を含むア
ミノ酸配列が常に存在する。

【００３４】さらにより詳しくは、本発明の新規の環状
ペプチドは、その中に下記一般式（II）：

【００３５】

【化５】

【００３６】〔式中、ｘ¹はアミノ末端、１つのアミノ
酸又はアミノ酸５９６から始まり、そしてアミノ酸５７
８まで戻るアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を表わ
し；そしてｙ¹はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又
はアミノ酸６０４から始まり、そしてアミノ酸６１３ま
で延びるアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を表わす〕
で表わされるアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を含ん
で成る。

【００３７】より特定には、ｘ¹は５７８から５９６ま
で延びる次のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)の１つ
を表わし： G WG SWG NSWG LNSWG RLNSWG ARLNSWG QARLNSWG DQARLNSWG QDQARLNSWG LQDQARLNSWG YLQDQARLNSWG KYLQDQARLNSWG EKYLQDQARLNSWG IEKYLQDQARLNSWG AIEKYLQDQARLNSWG TAIEKYLQDQARLNSWG VTAIEKYLQDQARLNSWG RVTAIEKYLQDQARLNSWG そしてｙ¹は６０４から６１３に延びる次のアミノ酸配
列(gp４２−ＨＩＶ−２)の１つを表す： H HT HTT HTTV HTTVP HTTVPW HTTVPWV HTTVPWVN HTTVPWVND HTTVPWVNDS。

【００３８】下記一般式（II）：

【００３９】

【化６】

【００４０】〔式中、ｘ¹及びｙ¹は前記に定義された通
りである〕で表わされる少なくとも１つの合成ペプチド
及び外部エンベロープ糖タンパク質(ＥＧＰ)の及び４８
６から５０８まで延びるアミノ酸配列により特徴づけら
れるペプチド２０３と呼ばれるペプチド、又はＥＧＰの
及び４８６から５０１まで延びるアミノ酸配列により特
徴づけられるペプチド204と呼ばれるペプチドの組合せ
または混合物もまた、本発明の範囲内にある。

【００４１】さらに、前記定義されたgp１２０及び／又
はp２４及び／又はＥＧＰアミノ酸配列の１又は複数の
線状ペプチドの不在又は存在中で、式Ｉの少なくとも１
つのペプチド及び式IIの１つのペプチド(ここで、ｘ，
ｙ，ｘ¹及びｙ¹は前記の通りである)を含んで成る合成
ペプチドの組合せを使用することもまた、本発明の範囲
内にある。

【００４２】本発明の新規混合物の１つの意外な利点
は、それらが、１３７８人のＨＩＶ−１陽性の被検者及
び５人のＨＩＶ−２陽性の被検者から成る大パネルの血
清に由来するＨＩＶ抗体の完全な検出を提供することが
できることである。もう１つの利点は、最少の誤った陽
性をもたらす本発明の混合物により保持される高レベル
の特異性である。

【００４３】

【発明の実施の形態】（合成のためのペプチドの選択）
ペプチドが、ＨＩＶ−１単離体の既知のアミノ酸配列及
び保存される領域の知識に基づく合成のために選択され
た。つい最近、ＨＩＶ−２(最近出願した新しいウィル
スである)は、ＨＩＶ−１との相当の相同性を共有する
ことが示された。従って、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ
−２の両者を検出するために本発明に記載されるペプチ
ド又はペプチドの混合物を使用することが可能である。

【００４４】既知のアミノ酸配列の他に、ポリペプチド
の一部が表面配向され、そして従って免疫原性であるこ
とを推定することを助ける種々の生理化学的原理を用い
ることによって、可能性あるエピトープが選択される。
これらは、Ｈopp and Ｗoods(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓc
i．７８，３８２４〜３８２８，１９８１)の親水性プロ
ット及びＫyte and Ｄoolittle(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．１５
７，１０５〜１３２，１９８２)による類似するアプロ
ーチを含む。また、タンパク質立体配座の実験的な推定
(Ｃhou and Ｆasman，Ａnn．Ｒev．Ｂiochem.，４７，
２５１〜２７６，１９７８)は、そのポリペプチドの一
部が免疫原性であることを推定することにおいて有用な
ガイドである。これらの理論的なアプローチは有用なガ
イドであるけれども、本発明の研究の間、発見された多
くの例外が存在する。

【００４５】多くの場合、免疫診断試薬としてより有用
なペプチドを製造するためには、その抗原特性を変えな
いで、天然に存在する配列を変性することが所望され
る。そのような変性とは、−へテロ二価性架橋試薬、た
とえばスルホスクシンイミジル−４−(p−マレイミドフ
ェニル)ブチレート(結合をもたらすための好ましい試
薬)によりキャリヤータンパク質へのペプチドの結合を
促進するためにアミノ又はカルボキシル末端でのシステ
イン残基の付加；支持ペプチド又は大きなペプチドヘの
結合のために又はペプチドの物理的又は化学的性質を変
性するために、ペプチドのお互いの結合を促進するため
のオリゴペプチドのＣＯＯＨ又はＮＨ₂末端でのあるア
ミノ酸の付加を含む。そのような変性は、エステル化反
応を通してリンカーとして使用され得るチロシン、グル
タミン酸又はアスパラギン酸の付加により、及びシッフ
塩基又はアミド形成、すなわち末端−ＮＨ₂アシル化、
チオグリコール酸アミド化、末端−ＣＯＯＨアミド化に
よる誘導体化、たとえばアンモニア、メチルアミン形成
により結合され得るリシンの付加によりもたらされる。
これらの修飾は、ペプチド上の実効電荷の変化をもたら
し、そしてまた、固体支持体、キャリヤー又は他のペプ
チドヘのそのペプチドの共有結合も促進することができ
る。これらの修飾は、ペプチドの免疫反応性の変化をも
たらさない。すなわち、自発的に酸化する傾向があるア
ミノ酸であるメチオニンが、抗原性を変えないでノルロ
イシンにより通常置換され得る。

【００４６】ペプチド配列は、種々の変化、たとえば挿
入、欠失及び置換(保存性又は非保存性のいづれか)にゆ
だねられ得、そしてそのような変化は、それらの使用に
おいてある利点を提供するであろう。これらの変化は、
たとえばgly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gl
n；ser，thr；lys，arg；phe，tyr；ala，ser；ala，th
r；ala，val；ala，pro；ala，glu；leu，gln；gly，ph
e；ile，ser；及びile，metの組合せを含む。

【００４７】ペプチドの受動的な吸収を促進するために
少数(１〜１０)の疎水性アミノ酸から成る“テール”を
固体支持体に付加することが便利である。この修飾は、
ＣＯＯＨ又はＮＨ₂末端のいづれかで行なわれ得る。好
ましい付加はphe−ala−phe−ala−pheである。

【００４８】本発明によれば、ＨＩＶ−１抗体の検出の
ために有用な選択された環状ペプチドは、５８６〜６２
９のアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を含んで成るペ
プチドであり、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配
列においては、式Ｉの環状ペプチドを提供するためにシ
ステイン残基がジスルフィド結合により、６０５〜６１
１のgp４１−(ＨＩＶ−１)アミノ酸配列のそれぞれの末
端で結合されているアミノ酸配列が常に存在する。好ま
しい環状ペプチドは、次の条件のペプチドである：ｘが
ＮＨ₂Ｇであり、そしてｙがTTAVPWNAS−ＣＯＯＨ(８０)
であり；ｘがＮＨ₂−RILAVERYLKDQQLLGIWG−であり、そ
してｙが−TTAVPWNAS−ＣＯＯＨであり(８７ｃ)；ｘが
ＮＨ₂−VERYLKDQQLLGIWG−であり、そしてｙが−TTAVPW
NAS−ＣＯＯＨであり(８８)；ｘがＮＨ₂−Ｇであり、そ
してｙが−TTAVPWNASWSNKSLEQGC−ＣＯＯＨであり(１０
３)、そしてｘがＮＨ₂−Ｇであり、そしてｙが−TTAVPW
NASWSNKSLEQI−ＣＯＯＨである(９６)。

【００４９】また、本発明によれば、ＨＩＶ−２抗体の
検出のために有用な選択された環状ペプチドは、５７８
〜６１３のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を含んで
成るペプチドであり、ここでいづれかの選択されたアミ
ノ酸配列においては、式IIの部分配列を提供するため
に、システイン残基がジスルフィド結合により５９７〜
６０３のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)のそれぞれ
の末端で結合されているアミノ酸配列が常に存在する。

【００５０】本発明の式（II）の好ましい環状ペプチド
は、次の条件のペプチドである：ｘ¹がＮＨ₂−RVTAIEKY
LQDQARLNSWG−であり、そしてｙ¹が−ＣＯＮＨ₂であり
(ペプチド１４６)；ｘ¹がＮＨ₂−QDQARLNSWG−であり、
そしてｙ¹が−HTTVPWVNDS−ＣＯＮＨ₂であり(ペプチド
１４７)；ｘ¹がＡc.QDQARLNSWG−であり、そしてｙ¹が
−ＣＯＮＨ₂であり(ペプチド２００)；ｘ¹がＮＨ₂Ｇ−
であり、そしてｙ¹が−HTTVPWVNDS−ＣＯＯＨであり(ペ
プチド２０１)；そしてｘ¹がＮＨ₂−RVTAIEKYLQDQARLNS
WG−であり、そしてｙ¹がHTTVPWVNDS−ＣＯＯＨである
(ペプチド２０２)。

【００５１】最っとも好ましい環状ペプチドは、ペプチ
ド８０，８７ｃ，１４６，１４７，２００，２０１及び
２０２である。

【００５２】表１は、本発明の好ましい環状ペプチドの
ために、Ｒatnerなど、Ｎature ３１３：２７７〜２８
４（１９８５）により公表された配列に基づいてのＨＩ
Ｖ−１のためのアミノ酸の位置番号及びＧuyaderなど、
Ｎature ３２６：６６２〜６６９（１９８７）により公
表された配列に基づいてのＨＩＶ−２のためのアミノ酸
の位置番号を提供する。

【００５３】

【表１】

【００５４】同定される領域は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ
−２に対する抗体を検出することにおいてひじょうに免
疫反応性であるので、いづれかＨＩＶ単離体のその対応
する領域がまた興味の対象であることは明らかである。
同様に、ＨＩＶの他の単離体又は他の血清タイプに見出
される配列もまた、本発明の範囲内にある。

【００５５】１又は２個のチオールを含有する残基、た
とえばシステインを線状ペプチド配列に付加し、それに
よって対応する環状ペプチドの調製のために残基を付与
することもまた、本発明の範囲内にある。

【００５６】一般的に言えば、脱アミノ−ジカルバ相同
体が、gp４１−(ＨＩＶ−１)の位置６１１又はgp４２−
(ＨＩＶ−２)の位置６０３でアミノスベリン酸(Ａsu)に
よるジスルフィド架橋に含まれる２個のシステインの置
換により合成され得る。

【００５７】複数のペプチド配列を共有結合し、又は複
数のペプチドから成るポリマーを形成することが所望さ
れる。そのような変性は、抗原性質を失わないで固体表
面上への抗原の受動的吸着を促進せしめることができ
る。

【００５８】（線状及び環状ペプチドの調製）樹脂支持
体は、ポリペプチドの固相調製のために当業界において
通常使用される適切な樹脂であり、好ましくはp−ベン
ジルオキシアルコールポリスチレン及びp−メチルベン
ジドリルアミン樹脂である。初めの保護されたアミノ酸
の樹脂支持体への結合に続いて、アミノ保護基が、当業
界で従来使用されている固相ペプチド合成の標準方法に
より除去される。アミノ保護基の除去の後、残る保護さ
れたα−アミノ基及び必要なら、側鎖を保護されたアミ
ノ酸が、所望する生成物を得るために引き続いて結合さ
れる。他方、多重アミノ酸基が、樹脂支持性アミノ酸配
列との結合の前、溶液方法を用いて結合され得る。

【００５９】適切な結合試薬の選択は、当業界で確立し
ている。たとえば、適切な結合試薬は、単独で又は好ま
しくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で
Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド又はＮ,Ｎ'−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)である。もう１
つの有用な結合方法は、保護されたアミノ酸の予備形成
された対称無水物を使用する。

【００６０】成長するポリペプチド鎖上に導入されるそ
れぞれのアミノ酸のために使用される必要なα−アミノ
保護基は、好ましくは９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル(Ｆmoc)である。しかしながら、保護基が結合
条件下で分解せず、そして成長分子にすでに存在するい
づれか他の保護基の存在下で選択的に容易に除去できる
かぎり、どんな保護基でも使用され得る。

【００６１】側鎖アミノ酸のための基を選択するための
基準は次の条件である：（ａ）合成のそれぞれの段階で
α−アミノ保護基の除去のための選択的な反応条件下で
の種々の試薬に対する保護基の安定性：（ｂ）保護基は
その戦略的特性を保持すべきであること(すなわち、結
合条件下で分離しないこと)及び（ｃ）保護基は、ポリ
ペプチド合成の終結後及びポリペプチド構造に影響を及
ぼさない条件下で容易に除去できるべきであること。

【００６２】完全に保護された樹脂支持性ペプチドは、
適切なスカベンジャー、たとえばアニソール、チオアニ
ソール、エチルメチルスルフィド、１，２−エタンジチ
オール及び関連する試薬の存在下で室温で１〜６時間、
塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸の５０〜６０％ 溶
液によりp−ベンゼルオキシアルコール樹脂から分離さ
れる。同時に、ほとんどの酸不安定側鎖保護基が除去さ
れる。より酸耐性の保護基は、ＨＦ処理により除去され
る。

【００６３】本発明の環状ペプチドは、当業界で一般的
に知られているペプチド合成の次の技法により、保護さ
れた又は保護されていないＳＨ−基のジスルフィド結合
への直接的な酸化転換により調製される。好ましい方法
とは、フェリシアン化カリウムによる遊離ＳＨ−基の直
接的な酸化を包含する。そのような環状ペプチドは、抗
体への結合を助けることができるより固定されたコンホ
メーションを取る。システイン−システインのジスルフ
ィド結合が天然のウィルスタンパク質に存在するかどう
かは知られていない。

【００６４】（ペプチド混合物）１３７８人のＨＩＶ−
１陽性被検者及び５人のＨＩＶ−２陽性被検者の血清に
由来するＨＩＶ抗体の完全な検出を提供することが見出
されている環状及び線状ペプチドの混合物もまた、本発
明の範囲内にある。また、本発明の新規混合物は、最少
数の誤った陽性をもたらす高レベルの特異性を提供する
ことが見出された。

【００６５】さらに、本発明の混合物は、下記一般式：

【００６６】

【化７】

【００６７】〔式中、ｘ及びｙは前記定義通りである〕
で表わされる少なくとも１種の環状ペプチド及び −gp１２０の線状ペプチド、又は −gp１２０の線状ペプチド、p２４の線状ペプチド及びg
p４１の線状ペプチド、又は −gp１２０の線状ペプチド及びgp４１の線状ペプチドを
含んで成る。

【００６８】本発明の他の混合物は、下記一般式：

【００６９】

【化８】

【００７０】〔式中、ｘ¹及びｙ¹は前記定義通りであ
る〕で表わされる少なくとも１種の環状ペプチド及びＨ
ＩＶ−２のＥＧＰの線状ペプチドの１つを含んで成る。

【００７１】gp４１−(ＨＩＶ−１)及びgp４２−(ＨＩ
Ｖ−２)に由来する環状ペプチドがひじょうに保存され
且つ免疫優性の領域をまねたとしても、gp４１の他のペ
プチド配列及びＨＩＶの他の２種の免疫原タンパク質か
らのいくらかを含むことは、より安全であることが見出
された。そのような感染された個人の血清中に含まれる
抗体がもはや環状ペプチドに結合できない程度に突然変
異がこのエピトープを変性する場合、この血清は、アッ
セイシステムに含まれる他のエピトープに対して向けら
れた他の抗体によりなお陽性であることが見出された。
しかしながら、混合物に使用され得るペプチドの数は限
定される。まず第１に、多過ぎる異なったペプチドは、
誤った陽性結果の割合を高めるであろう。特に、p２４
タンパク質の多くのペプチドは、しばしば許容できない
低い特異性を招くことが見出された。第２に、混合物中
における多過ぎるペプチドの付加は、免疫優性ペプチド
を希釈し、そして試験の感度を低めるであろう。

【００７２】より特定には、gp１２０の線状ペプチド
は、４９７〜５１８のアミノ酸配列を有し、そして次の
式：ＮＨ₂−CGKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR−ＣＯＯＲ(７
１)に相当する。

【００７３】p２４の線状ペプチドは、２４１〜２６３
のアミノ酸配列を有し、そして次の式：ＮＨ₂−CGSTLQE
QIGWNTNNPPIPVGEIYK−ＣＯＯＨ(６１)に相当する。

【００７４】ＥＧＰ(ＨＩＶ−２)の線状ペプチドは、４
８６〜５０１のアミノ酸配列(ペプチド２０４)又は４８
６〜５０８のアミノ酸配列(ペプチド２０３)を有し、そ
してそれぞれ次の式：ＮＨ₂LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR−
ＣＯＯＨ(２０３)又はＮＨ₂LVEITPIGFAPTKEKR−ＣＯＯ
Ｈ(２０４)に相当する。

【００７５】（ＨＩＶ抗体の検出）本発明のペプチド及
びペプチド混合物は、当業界において良く知られている
方法に従ってＡＩＤＳ関連抗体の検出のための診断試薬
として使用される。ＡＩＤＳに対する抗体の決定におけ
る本発明のペプチドの主な利点は、これまで使用されて
来た既知の抗原と比べてのそれらの特異性にある。

【００７６】ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のた
めの１つの方法に従えば、いわゆる“ウェスターンブロ
ット”分折が使用される(Ｔowbin，Ｈ.，Ｓtaehelin．
Ｔh．and Ｇordon，Ｊ.，Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．
ＵＳＡ ７６，４３５０〜４３５４（１９７９）)。この
方法によれば、本発明のペプチド又は複数のペプチドが
ニトロセルロース紙上に適用される。このニトロセルロ
ース紙は含浸され、そして次に試験されるべき血清によ
り処理される。洗浄の後、そのニトロセルロース紙は、
酵素によりラベルされた抗−ヒトＩgＧにより処理され
る。次に、その酵素活性が適切な基質により決定され
る。もちろん他の放射性ラベル又は螢光ラベルも使用さ
れ得る。

【００７７】本発明のペプチド又はペプチド混合物を用
いてのＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のための好
ましい便利且つ従来の方法は、酵素結合性免疫吸着アッ
セイ(ＥＬＩＳＡ)である。この試験によれば、本発明の
ペプチド又はペプチド混合物が、ミクロタイタープレー
トの壁上に吸着される。次に、その壁は、試験されるべ
き血清により処理される。洗浄の後、ペルオキシダーゼ
によりラベルされた抗−ヒトＩgＧがその壁に付加され
る。そのペルオキシダーゼの決定は、対応する基質、た
とえo−フェニレンジアミンにより行なわれる。また、
この方法において、ペルオキシダーゼは、他のラベル、
たとえば放射性又は螢光ラベルにより交換され得る。

【００７８】ＥＬＩＳＡ試験においては、個々のペプチ
ド又はその組合せを使用することが可能である。誤った
応答の原因となる抗体を同時に排除しながら、抗体を検
出するための最っとも効果的なペプチドを組合すことを
可能にするので、後者が好ましい。いくつかの血清サン
プルが、抗原として個々のペプチドとの不確かな応答を
示しながら、ペプチドの混合物との正しい陽性結果を示
すことが、これらの研究の間、発見された。従って、Ｈ
ＩＶ抗体のための信頼すべき試験は、ペプチド抗原の適
切な組合せによってのみ達成され得る。

【００７９】本発明のペプチド又はペプチド混合物によ
る、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のためのもう
１つの方法は、いわゆる“二抗原−サンドイッチ法”に
よる酵素免疫試験である。この方法は、Ｉmmunologocal
Ｍethods ２０：２５〜３４（１９７８）に記載される
Ｍaiolini，Ｒ. Ｉ.の研究に基づかれている。この方法
によれば、試験されるべき血清が、本発明のペプチド又
はペプチド混合物が被覆されている固相(捕獲層)及びペ
ルオキシダーゼによりラベルされている本発明のペプチ
ド又はペプチド混合物(プローブ層)と接触せしめられ
る。その免疫反応は、１又は２段階で行なわれ得る。そ
の免疫反応が２段階で行なわれる場合、洗浄段階が２回
のインキュベーションの間で行なわれる。免疫反応の
後、洗浄段階が行なわれる。その後、ペルオキシダーゼ
が、基質、たとえばo−フェニレンジアミンにより決定
される。

【００８０】適切な固相は、有機及び無機ポリマー〔ア
ミラーゼ、デキストラン、天然又は変性されたセルロー
ス、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミ
ド、アガロース、磁鉄鉱、多孔性ガラス粉末、ポリビニ
リデンフルオリド(Ｋynar)及びラテックス〕、試験容器
(試験管、タイタープレート又はガラス又は人工的な材
料のキュベット)の内壁及び固体物(ガラス及び人工的な
材料のロッド、末端が太くなったロッド、末端のローブ
又はラメラを有するロッド)の表面である。ガラス及び
人工的材料からの球体は、特に適切な固相キャリヤーで
ある。

【００８１】本発明のペプチド及びペプチド混合物は、
ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定において有用であ
るのみならず、またＡＩＤＳウィルス自体の決定のため
にも有用である。なぜならば、これらのペプチド(遊
離、重合されている又は適切なキャリヤーに接合されて
いる)は、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体、特にモノク
ローナル抗体を誘発することにおいて有用であるからで
ある。そのような抗体は、本発明のペプチド又はペプチ
ド混合物の十分な量を哺乳類又は鳥類に注射し、そして
前記動物の血清から前記抗体を回収することによって産
生され得る。

【００８２】抗体を誘発するための適切な宿主動物は、
哺乳類、たとえばウサギ、ウマ、ヤギ、テンジクネズ
ミ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、等を包含する。

【００８３】一般的に知られている種々の方法は、ＡＩ
ＤＳウィルス又はその一部の決定に使用され得る。

【００８４】１つのそのような方法においては、アッセ
イされるべき血清サンプルの既知量、本発明の放射性ラ
ベルされた環状ペプチド又はペプチド混合物及び本発明
のラベルされていないペプチド又はペプチド混合物が一
緒に混合され、そして静置される。抗体／抗原複合体
が、当業界において既知の方法により、すなわち硫酸ア
ンモニウム、ポリエチレングリコール、第二抗体(過剰
量か又は不溶性支持体に結合されている)、デキストラ
ン被覆性木炭及び同様のものによる処理により、結合さ
れていない試薬から分離される。本発明のラベルされた
ペプチド又はペプチド混合物の濃度は結合された又は結
合されていない相のいづれかにおいて決定され、そして
サンプルのＡＩＤＳ含有量は、それ自体既知の方法で標
準曲線と観察されるラベルされた成分のレベルとを比較
することによって決定され得る。

【００８５】もう１つの適切な方法は、“二抗体サンド
イッチアッセイ”である。このアッセイによれば、試験
されるべきサンプルが２種の異なった抗体により処理さ
れる。これらの抗体の１つはラベルされ、そして他は固
相上に被覆される。固相として、本明細書において前で
言及されたものが考慮される。適切なラベルは、酵素、
たとえばペルオキシダーゼ、放射性ラベル又は螢光ラベ
ルである。好ましい固相はプラスチックビーズであり、
そして好ましいラベルは、ホースラディシュペルオキシ
ダーゼである。種々の抗体が、種々の動物、たとえばヒ
ツジ及びウサギを免疫化することによって高められ得
る。

【００８６】もう１つの方法は、モノクローナル抗体を
産生するための良く知られたＫoehler and Ｍilstein技
法を用いることにある。同じ抗原に対して(但し異なっ
たエピトープに対してではない)向けられるモノクロー
ナル抗体を識別するために、Ｓtahliなど、Ｊ．Ｉmmuno
logical Ｍethods ３２：２９７〜３０４（１９８０）
の方法が使用され得る。

【００８７】もちろん、抗血清(ポリクローナル抗体)及
びモノクローナル抗体を使用することも可能である。

【００８８】“二抗体サンドイッチ法”によれば、サン
プルが、固相抗体及びラベルされた抗体と共にインキュ
ベートされる。まず、固相抗体によりサンプルを処理
し、そして洗浄の後、ラベルされた抗体によりサンプル
を処理することが可能である。しかし、まず固相抗体に
よりサンプルを処理し、そして一定の時間の後、ラベル
された抗体により処理することも可能である。さらに及
び好ましくは、固相抗体及びラベルされた抗体により一
緒にサンプルを処理することが可能である。

【００８９】免疫反応の後、洗浄段階が行なわれる。洗
浄の後、当業界で既知の方法に従って、ラベルが決定さ
れる。ラベルとしてペルオキシダーゼが使用される場
合、その決定は、基質、たとえばフェニレンジアミン又
はテトラメチルベンジジンにより行なわれる。ラベルさ
れた成分の量は、サンプル中に存在する抗原の量に比例
する。

【００９０】ＡＩＤＳウィルス又はＡＩＤＳウィルスに
対する抗体の決定のための上記のような方法は、容器中
に、本発明の環状ペプチド又はＡＩＤＳウィルスに対す
る抗体(本発明の環状ペプチド又は環状及び線状ペプチ
ドの混合物により誘発された)を含んで成る適切な試験
キットで行なわれ得る。

【００９１】さらに、本発明の環状ペプチド及び本発明
の環状及び線状ペプチドの混合物は、ＡＩＤＳウィルス
に対する保護免疫性を誘発できるワクチンとして使用さ
れる。投与のルート、抗原投与量、注入の回数及び頻度
は、個人ごとに異なり、そして他のウィルス感染におい
て免疫性を提供することに現在使用されている方法に匹
敵することができる。ワクチンは、既知の方法に従って
調製される。ワクチン組成物は、便利には、生理学的に
許容できるキャリヤー物質と共に組合されるであろう。
そのワクチン組成物は、アジュバント又は免疫応答のい
づれか他のエンハンサーを含むことができる。さらに、
そのワクチン組成物は、ＡＩＤＳの他に他の疾病に対す
る免疫性を提供するために他の抗原も含むことができ
る。

【００９２】（試験されたパネル血清）本発明の生成物
により試験されたパネル血清を、広範囲の種類の個人か
ら得、そしてそれは、ＨＩＶ−１に対して血清陰性であ
ることが知られている８４５個のサンプル及びそれに対
して血清陽性であることが確認されている１３７８個の
サンプル並びにＨＩＶ−２に対して血清陽性であること
が確認されている５個のサンプルを含む。

【００９３】表２は、血清サンプルが取られた被検体及
びそれらのＨＩＶ血清学的状態の説明を示す。

【００９４】

【表２】

【００９５】（結果）本発明の環状ペプチド及び１又は
複数の線状ペプチドとのそれらの混合物が、種々の血清
(このいくらかは陽性であり、そして他は陰性であるこ
とが確められている)に対して、前記ＥＬＩＳＡ試験に
従って試験された。

【００９６】表３は、既知のＨＩＶ−１陽性血清を同定
することにおいて個々に評価された単一のペプチドの結
果を提供する。

【００９７】表４に表３のペプチドのアミノ酸配列を示
す。

【００９８】表５は、既知のＨＩＶ−２陽性血清を同定
することにおいて個々に評価された単一のペプチドの結
果を提供する。

【００９９】表６は、種々の希釈度でのいくつかの血清
の結果を比較することによって、ＥＬＩＳＡ試験におけ
る環状ペプチド対非環状ペプチドの感度を例示するため
に提供される。それぞれの対内で、環状相同体がその線
状相同体よりもより活性であることが注目されるであろ
う。これらのデータは、抗体との反応において、一定の
ペプチドの環状性の重要性を明確に示す。

【０１００】最近、被覆のために使用されるいくつかの
条件(炭酸緩衝液、pＨ ９.６)において、それらの配列
中に２個のシステインを有する線状ペプチドが内部環状
化及び重合を受けることが見出された。表６に示される
結果がＨＩＶ−１抗体を検出することにおいて線状ペプ
チドよりも環状ペプチドの卓越性を明確に示したとして
も、その高められた感度は、炭酸緩衝液(pＨ ９.６)中
に溶解された後、線状ペプチドの可能性のある環状化及
び重合のために過小評価されて来た。その実験は、前記
のとおり炭酸緩衝液(pＨ ９.６)及びまた１０％ 酢酸(p
Ｈ ２.７)中に溶解される線状８７ペプチド及び環状８
７ｃペプチドによりくり返された。ペプチドのＨＰＬＣ
分析は、炭酸緩衝液中において、使用される線状ペプチ
ド８７が、室温でその溶液中に維持される場合、環状化
及び重合を受けることを確証した。プレートに結合され
る線状ペプチドに対する環状ペプチドの正確な割合はま
だ決定されていないけれども、環状化及び重合がマイク
ロタイタープレートのウエル中において生じたと思われ
る。

【０１０１】炭酸緩衝液中において見られるのとは反し
て、１０％ 酢酸中に溶解された線状ペプチド８７は、
ＨＰＬＣ及びエルマン試験によって指摘されるように線
状のまま残存した。

【０１０２】１０％ 酢酸中に溶解された環状ペプチド
８７ｃは、環状のまま残存した(ＨＰＬＣ分析及び負の
エルマン試験から)。

【０１０３】この実験に使用されるプレートは、１０μ
g／mlでのペプチドの溶液により被覆された(表６の実験
結果が０.５μg／mlでのペプチドにより被覆されたプレ
ートにより得られた)。４種の異なったＨＩＶ−１陽性
サンプルが連続的に希釈され、そしてそれらの力価が決
定された。その力価を、すでに記載されたＥＬＩＳＡ方
法の条件下で１.０の吸光度を示す血液希釈度として定
義した。

【０１０４】表６においてすでに示されたように、環状
ペプチド８７ｃは、その対応する線状ペプチド８７より
も高い感度で、ＨＩＶ−１に対して特異的な抗体を検出
することができることが表７において明確である。線状
ペプチド８７に対する環状ペプチドにより測定される感
度の割合は、１，３〜２，２の間であり、そして平均
１，８である。環状８７ｃペプチドを用いてのＥＬＩＳ
Ａ試験の感度が、線状ペプチド８７が線状で残存し、そ
して環状化又は重合されない条件(酸性pＨ)を用いて比
較される場合、これらの割合はさらに高く、３.０〜４.
５である。

【０１０５】十分に定義された環状ペプチド８７ｃによ
り被覆されたプレートの感度とペプチド８７の種々のポ
リマーのみを含むクロマトグラフィー画分のプールによ
り被覆された他のプレートの感度とを比較する類似実験
はまた、最大感度でのＨＩＶ−１抗体の検出において、
環状ペプチド８７ｃの卓越性を示す。これらの実験の
間、バックグラウンド読みが線状ペプチド８７により被
覆されたプレート上で有意に高く(０.１４４±０.０１
０対０.００６±０.００２)、そしてＡＩＤＳ試験にお
いて十分に酸化された環状ペプチド８７ｃを用いること
の１つの利点を示すことがまた突然見出された。

【０１０６】表８において、環状及び線状ペプチドの混
合物は、既知のＨＩＶ陽性血清を同定することにおいて
評価され、そして表９はＨＩＶ陰性血清に対するその同
じ混合物の結果を示す。

【０１０７】表８及び表９に使用される混合物は、次の
通りである： 混合物の番号 混合物中のペプチド １ 線状ペプチド４１，４２，５６及び７１ ２ 線状ペプチド２３，２９，４２，５６及び７１ ３ 環状ペプチド８０及び線状ペプチド６１，７１及び８７ ４ 環状ペプチド８０及び線状ペプチド７１及び８７ ５ 環状ペプチド８０及び８７ｃ及び線状ペプチド７１ ６ 環状ペプチド２００，２０１，２０２及び 線状ペプチド２０３及び２０４ ７ 環状ペプチド８０，８７ｃ，２０２及び 線状ペプチド７１，２０３及び２０４。

【０１０８】これらの混合物において、ペプチド２３，
２９，２０３及び２０４は、次の配列を有する： ＡcＮＨ−YGCSGKLIC−ＣＯＮＨ₂ (２３) ＮＨ₂−CGVKNWMTETLL−ＣＯＯＨ (２９) ＮＨ₂−LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR−ＣＯＯＨ (２０３) ＮＨ₂−LVEITPIGFAPTKEKR−ＣＯＯＨ (２０４)。

【０１０９】表１０は、１６７種のＨＩＶ−１陽性血清
及び５１種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおけ
る本発明の混合物４とウェスターンブロット試験との間
の試験の比較を示す。その結果は、ＥＬＩＳＡ試験にお
ける本発明の混合物４がウェスターンブロット試験より
も高い感度及び特異性を与えることを示す。

【０１１０】表１１は、８２２種のＨＩＶ−１陽性血清
及び１１４種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにお
ける免疫螢光アッセイを示す。その結果は、ＥＬＩＳＡ
試験における混合物４が免疫螢光アッセイよりも高い感
度及び特異性を与えることを示す。

【０１１１】表３から表１１まで以下にまとめて記載す
る。

【０１１２】

【表３】

【０１１３】

【表４】

【０１１４】

【表５】

【０１１５】

【表６】

【０１１６】

【表７】

【０１１７】

【表８】

【０１１８】

【表９】

【０１１９】

【表１０】

【０１２０】

【表１１】

【０１２１】結果は、既知のＨＩＶ−１陽性血清を正し
く同定することにおけるあるペプチド混合物、特に好ま
しい混合物４及び５の卓越性及び既知のＨＩＶ−２陽性
血清を正しく同定することにおける混合物６の卓越性並
びにＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２陽性血清サンプルの両者
を正しく同定することにおける最終混合物７の卓越性を
明確に示す。単一のペプチドよりもむしろ混合物の使用
が、抗体がひじょうに限定された数のエピトープに対し
て向けられている低い力価の異常な血清を同定する失敗
の可能性を最少にする。すべての血清陽性サンプルがＥ
ＬＩＳＡにより試験され、そしてウェスターンブロット
又は免疫螢光アッセイにより確認された。矛盾する場
合、サンプルは、最終の対照標準として取られるラジオ
イムノ沈殿アッセイによりアッセイされた。

【０１２２】次の実施例は、本発明のペプチドの合成の
ための一般的な方法及びそのペプチドの利用を例示す
る。

【０１２３】

【実施例】実施例１：Ｎα−Ｆmocにより保護されたア
ミノ酸残基を担持する樹脂の調製 塩化メチレン(ＣＨ₂Ｃl₂)及びジメチルホルムアミド(Ｄ
ＭＦ)の混合物(４：１)中、所望するＮα−Ｆmoc保護性
アミノ酸残基を、ＣＨ₂Ｃl₂：ＤＭＦ(４：１)中、p−ベ
ンジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に０℃で添加し
た。その混合物を数秒間、手で攪絆し、そして次にＮ,
Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)、次い
で４−(ジメチルアミノ)ピリジンの触媒量により処理し
た。その混合物を、０℃でさらに３０分間攪絆し、そし
て次に室温で一晩攪絆した。濾過された樹脂を、ＣＨ₂
Ｃl₂、ＤＭＦ及びイソプロパノール(それぞれ３回)及び
最後にＣＨ₂Ｃl₂により連続的に洗浄した。その樹脂を
ＣＨ₂Ｃl₂中に懸濁し、氷浴中に冷却し、そしてその攪
絆された懸濁液に、再蒸留されたピリジン、続いて塩化
ベンゾイルを添加した。攪絆を０℃で３０分間続け、そ
して次に室温で６０分間続けた。濾過の後、その樹脂
を、ＣＨ₂Ｃl₂、ＤＭＦ及びイソプロパノール(それぞれ
３回)及び最終的に石油エーテル(２度)により連続的に
洗浄し、その後、真空下で乾燥せしめ、一定の重量にし
た。Ｍeienhoferなど、(Ｉnt．Ｊ．Ｐeptide Ｐrotein
Ｒes.，１３，３５，１９７９)による置換の分光光度決
定は、樹脂上の置換の程度を示した。

【０１２４】実施例２：連続するアミノ酸の結合 Ｎα−Ｆmoc保護性第１アミノ酸残基を担持する樹脂
を、Ｌabortec ＳＰ６４０ Ｐeptide Ｓynthesizerの反
応容器中に添加し、そして次のようにして処理した： （１）ＤＭＦによる洗浄(それぞれ１分間、２度)、
（２）ＤＭＦ中、ピペリジンの２０％ 溶液による予備
洗浄(３分間)、（３）ＤＭＦ中、ピペリジンの２０％
溶液による保護解除(１０分間)、（４）ＤＭＦによる洗
浄(それぞれ１秒間、４度)、（５）イソプロパノールに
よる洗浄(それぞれ３０秒間、２度)、（６）ＤＭＦによ
る洗浄(それぞれ４５秒間、２度)、（７）遊離アミノ基
のためのチェック−Ｋaiser試験(陽性であるべきであ
る)、（８）そのペプチド樹脂を、所望するＦ−moc−保
護性アミノ酸３モル当量及び両蒸留された乾燥ＤＭＦ中
にすべて溶解された１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
３モル当量と共に２分間、軽く振盪すること、（９）次
に、固体ＤＣＣ(３.３モル当量)を、反応容器に添加す
ること、（10）その反応混合物の２時間の振盪、（11）
ＤＭＦによる洗浄(それぞれ４５秒間、２度)、（12）イ
ソプロパノールによる洗浄(それぞれ４５秒間、２度)。

【０１２５】１２段階の後、ニンヒドリン試験のために
アリコートを取る。その試験が陰性である場合、次のア
ミノ酸の結合のために段階１に戻す。その試験が陽性で
あり又はわずかに陽性である場合、段階６〜１２をくり
返す。

【０１２６】本発明に記載されるペプチドのアミノ酸の
それぞれの結合のために上記スキームを用いる。Ｆmoc
によるＮ−α保護を、合成を通して残るアミノ酸のそれ
ぞれにより使用する。

【０１２７】放射性ラベルされたペプチドを、上記結合
方法を用いて³Ｈ−グリシンの導入により得る。

【０１２８】最後のアミノ酸の付加の後、Ｎ−末端残基
のＮα−Ｆmocを、上記スキームの段階１〜７に戻すこ
とによって除去する。ペプチド樹脂をＣＨ₂Ｃl₂により
洗浄し、そして真空乾燥せしめ、保護された粗ペプチド
を得る。

【０１２９】実施例３：保護解除及び樹脂からペプチド
の切断 保護されたペプチド−樹脂を、２.５％ エタンジチオー
ル及び２.５％ アニソールを含む、ＣＨ₂Ｃl₂中、トリ
フルオロ酢酸(ＴＦＡ)の５５％ 溶液中に懸濁する。そ
の混合物をＮ₂によりフラッシュし、そして室温で１.５
時間攪絆する。その混合物を濾過し、そしてその樹脂を
ＣＨ₂Ｃl₂により洗浄する。その樹脂を、ＣＨ₂Ｃl₂中、
２０％ ＴＦＡにより室温で５分間再び処理する。その
混合物を濾過し、そして樹脂をＣＨ₂Ｃl₂中、２０％ Ｔ
ＦＡにより洗浄し、そして次にＣＨ ₂Ｃl₂により洗浄す
る。集められた濾液を３５℃以下で真空蒸発せしめ、そ
して残留物を、乾燥ジエチルエーテルにより数度こまか
くすり砕く。固形物を１０％水性酢酸中に溶解し、そし
て粗組成物を得るために凍結乾燥する。

【０１３０】arg及びcys残基を含むペプチドをさらに、
アニソール及びジメチルスルフィドの存在下で０℃で１
時間、ＨＦ処理により保護解除する。固形物を１０％
水性酢酸中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍結
乾燥せしめる。

【０１３１】実施例４：ペプチドの精製 粗ペプチドを、移動相のグラジエントを有するＣ₁₈又は
Ｃ₄逆相のＶydacカラム(２.５×２５mm)上で分離用ＨＰ
ＬＣにより精製する。流出液を２２０nmでモニターし、
そして続いて分析用ＨＰＬＣによりモニターする。

【０１３２】適切な画分をプールし、蒸発せしめ、そし
て凍結乾燥せしめる。合成ペプチドの同定を、分析用逆
相クロマトグラフィー及びアミノ酸分析により確証す
る。

【０１３３】実施例５：ペプチドの環状化 フェロシアン化カリウムの溶液(０.１Ｍ，pＨ ７.０)
を、線状ペプチドの希釈水溶液(０.５mＭ)にpＨ ７.０
でゆっくりと添加する。室温で２時間放置した後、その
pＨを５.０に下げ、そしてその溶液をイオン交換樹脂
(Ｂio−Ｒad Ａg−３−Ｘ４ａ，Ｃl−形）により３０分
間処理する。その懸濁液を濾過し、そしてその濾液を凍
結乾燥せしめ、粗環状ペプチドを得る。そのペプチド
を、分離用逆相ＨＰＬＣにより精製し、そしてアミノ酸
分析により特徴づける。環状化の証明を、環状ペプチド
のＨＰＬＣ移動性と出発の線状ペプチドとを比較するこ
とによって、線状ペプチドに戻る環状ペプチドのアリコ
ートを還元することによって及びまた、環状化の後、遊
離スルフヒドリル基の消失(エルマン試験)を観察するこ
とによって得る。

【０１３４】環状ペプチドとそれらの対応する線状ペプ
チドとの間の生理化学的相違を示すために、ＨＰＬＣに
おける保持時間の相違を示す表１２に言及する。

【０１３５】

【表１２】

【０１３６】実施例６：ウシ血清アルブミン又はキーホ
ールリムペット(アオガイ)へモシアニンヘのペプチドの
接合 ペプチドを、スルホスクシンイミジル−４−(p−マレイ
ミドフェニル)ブチレート(Ｓulfo−ＳＭＰＢ)により前
もって誘導体化されたＢＳＡ又はＫＬＨに接合せしめ
る。

【０１３７】スルホ−ＳＭＰＢ(Ｐierce Ｃhemicals)の
水溶液を、０.０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ
７.０)中、ＢＳＡ又はＫＬＨの溶液に添加する。その混
合物を、室温で４５分間振盪し、そして、活性化された
キャリヤーをすぐに、０.１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝
液(pＨ ６.０)により平衡化されたＳephadex Ｇ−２５
カラムに４℃で適用する。

【０１３８】活性化されたキャリヤーに対応する、最初
のピークの吸光度の画分を丸底フラスコに集め、それに
０.０５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ６.２)中、ペ
プチドの溶液を添加する。その混合物をＮ₂により十分
にフラッシュし、そして室温で一晩インキュベートす
る。その結合効力を、３Ｈによりラベルされたペプチド
を用いて及び接合体のアミノ酸分析によりモニターす
る。

【０１３９】実施例７：酵素結合性免疫吸着アッセイ
(ＥＬＩＳＡ)によるＨＩＶに対する抗体の検出 マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを、ペプ
チド又はペプチド混合物を含む溶液(５μg／ml)１００
μlにより飽和せしめ、そして一晩放置する。ウェルを
空にし、そして洗浄緩衝液(Ｔris，０.０４３Ｍ；ＮaＣ
l，０.５Ｍ；チメロザル、０.０１％ Ｗ／Ｖ；Ｔween
２０，０.０５％ Ｖ／Ｖ；pＨ ７.４)により２度洗浄す
る。次に、ウェルを、洗浄緩衝液０.３５mlにより３７
℃で１時間飽和せしめ、そして同じ緩衝液により１度洗
浄する。分析されるべき血清サンプルを、検体緩衝液
(洗浄緩衝液＋カゼイン、０.０５％ Ｗ／Ｖ)により希釈
する。ウェルを洗浄緩衝液によりすすぎ、その後希釈さ
れた血清サンプル(０.１ml)を添加する。これらを室温
で１時間インキュベートする。次にウェルを空にし、洗
浄緩衝液によりすぐに２度洗浄し、そして次に２分間１
度洗浄する。洗浄緩衝液中、１％ Ｗ／Ｖウシ血清アル
ブミンにより希釈された接合体溶液(ラベルされたヒト
ＩgＧペルオキシダーゼに対するアフィニティ精製され
たヤギ抗体、５０％グリセロール５ml中０.５mg)を、そ
れぞれのウェルに添加し(０.１ml)、そして室温で１時
間インキュベートする。次にウェルを空にし、そして急
速に洗浄緩衝液により２度洗浄し、そして次に５度洗浄
し、ここで緩衝液は洗浄当り２分間、ウェルを接触せし
める。基質溶液(３,３',５,５'−テトラメチルベンジジ
ン、ＤＭＳＯ １ml当り８mg)を、３０％ Ｈ₂Ｏ₂ ０.１
％ Ｖ／Ｖを含む０.１Ｍのクエン酸塩−酢酸塩緩衝液(p
Ｈ ５.６)１００体積により希釈し、そしてそれぞれの
ウェルに添加する(ウェル当り、０.１ml)。１０分後、
それぞれのウエルの内容物を、２ＮのＨ₂ＳＯ₄ ０.１ml
により処理し、そして対４５０nmで吸光度を読む。すべ
ての測定は２度行なわれる。

【０１４０】

【発明の効果】本発明によれば、ＨＩＶ−２により感染
された少数の患者から取られた血清の１００％を同定す
ることに有用である一連の新規ペプチド又はアミノ酸配
列もまた提供される。ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２
の両者を検出するために本発明に記載されたペプチド又
はペプチドの混合物のいくらかを使用することが可能で
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ (72)発明者 フランセスコ ベリーニ カナダ国，エイチ３アール １ジェイ８, ケベック，タウン オブ マウント−ロー ヤル，グラハム ブールバール，3045 (72)発明者 ジェルベ ドワンヌ カナダ国，エイチ４エル ３ダブリュ５, ケベック，サンローラン オブライエン ストリート，1735 (72)発明者 マーシャル ラクロワ カナダ国，ジェイ４ダブリュ ３エイチ ８，ケベック，ブロサール クロワッサン ツーランゴー，1925

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ保護基としての９−フルオレニル
   メチルオキシカルボニル(Ｆmoc)の使用により特徴付け
   られる固相ポリペプチド合成法と、それに続く、２個の
   システイン残基の特異的酸化および実質的に純粋な環状
   ペプチドをもたらす逆相ＨＰＬＣ精製方法を包含する、
   RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS、RILAVERYLKDQQ
   LLGIWGCSGKLICTTAVPWNASW、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI
   CTTAVPWNASWS、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASW
   SN、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNK、RILAV
   ERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKS、RILAVERYLKDQQ
   LLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSL、RILAVERYLKDQQLLGIWGC
   SGKLICTTAVPWNASWSNKSLE、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC
   TTAVPWNASSWNKSLEQ、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVP
   WNASSWNKSLEQG、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
   SWNKSLEQGC 及びRILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
   SWNKSLEQI（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLI
   Cの２個のシステイン残基の間で形成される。）よりな
   る群から選択されるペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】 ペプチドがRILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC
   TTAVPWNAS（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLI
   Cの２個のシステイン残基の間で形成される）である、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ９−フルオレニルメチルオキシカルボニ
   ル(Ｆmoc)をアミノ保護基として使用する固相ポリペプ
   チド合成法と、それに続く、２個のシステイン残基の特
   異的酸化および実質的に純粋な環状ペプチドをもたらす
   逆相ＨＰＬＣ精製方法を包含する製造方法により調製さ
   れる、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS、RILAVER
   YLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASW、RILAVERYLKDQQLLGIWG
   CSGKLICTTAVPWNASWS、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAV
   PWNASWSN、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN
   K、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKS、RILAV
   ERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSL、RILAVERYLKDQ
   QLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLE、RILAVERYLKDQQLLGIW
   GCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQ、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGK
   LICTTAVPWNASSWNKSLEQG、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICT
   TAVPWNASSWNKSLEQGC 及びRILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICT
   TAVPWNASSWNKSLEQI（ここで、環状ジスルフィドは、配
   列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成され
   る。）よりなる群から選択されるペプチド。
4. 【請求項４】 RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
   （ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個の
   システイン残基の間で形成される）である、請求項３に
   記載のペプチド。
5. 【請求項５】 ＨＩＶ−１に対する抗体の検出、並びに
   ＡＩＤＳ、ＡＲＣ及び前ＡＩＤＳ状態の診断のための組
   成物であって、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNA
   S、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASW、RILAVERYL
   KDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS、RILAVERYLKDQQLLGIWGC
   SGKLICTTAVPWNASWSN、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAV
   PWNASWSNK、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNK
   S、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSL、RILA
   VERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLE、RILAVERYLK
   DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQ、RILAVERYLKDQQLL
   GIWGCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQG、RILAVERYLKDQQLLGIWG
   CSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQGC 及びRILAVERYLKDQQLLGIWG
   CSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQI（ここで、環状ジスルフィ
   ドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成
   される。）よりなる群から選択されるペプチドを抗原と
   して含んでなる組成物。
6. 【請求項６】 ペプチドがRILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC
   TTAVPWNAS（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLI
   Cの２個のシステイン残基の間で形成される）である、
   請求項５に記載の組成物。
7. 【請求項７】 ＨＩＶ−１に対する抗体の検出方法であ
   って、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS、RILAVER
   YLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASW、RILAVERYLKDQQLLGIWG
   CSGKLICTTAVPWNASWS、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAV
   PWNASWSN、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN
   K、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKS、RILAV
   ERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSL、RILAVERYLKDQ
   QLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLE、RILAVERYLKDQQLLGIW
   GCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQ、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGK
   LICTTAVPWNASSWNKSLEQG、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICT
   TAVPWNASSWNKSLEQGC 及びRILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICT
   TAVPWNASSWNKSLEQI（ここで、環状ジスルフィドは、配
   列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成され
   る。）よりなる群から選択されるペプチドを使用するこ
   と含んでなる方法。
8. 【請求項８】 試験方法がＥＬＩＳＡ、血球凝集反応、
   単一ドットまたは複数ドットストリップアッセイ法を包
   含する、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 免疫化学試薬が、RILAVERYLKDQQLLGIWGC
   SGKLICTTAVPWNAS、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWN
   ASW、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS、RILAVE
   RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSN、RILAVERYLKDQQLLG
   IWGCSGKLICTTAVPWNASWSNK、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI
   CTTAVPWNASWSNKS、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWN
   ASWSNKSL、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKS
   LE、RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQ、R
   ILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQG、RILAV
   ERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQGC 及びRILAV
   ERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSWNKSLEQI（ここで、
   環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン
   残基の間で形成される。）よりなる群から選択されるペ
   プチドであることを特徴とする、ＨＩＶ−１に対する抗
   体の検出、並びにＡＩＤＳ、ＡＲＣ及び前ＡＩＤＳ状態
   の診断のための試験キット。