JPH08245693A - Ｈｉｖ抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 HIV−２により感染された少数の患者から取
られた血清の100％を同定することに有用である一連の
新規ペプチド又はアミノ酸配列を提供し、そしてHIV−
１及び／又はHIV−２の両者を検出するために有用な組
成物もまた提供すること。 【解決手段】 下記の一般式： 【化１】 〔式中、ｘ¹はアミノ末端、１つのアミノ酸またはアミ
ノ酸596から始まり、そしてアミノ酸578まで戻るアミノ
酸配列（gp-42−HIV−２）を表わし；そしてｙ¹はカル
ボキシル末端、１つのアミノ酸またはアミノ酸604から
始まり、そしてアミノ酸613まで延びるアミノ酸配列（g
p42−HIV−２）を表わす〕で表わされる環状合成ペプチ
ド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ抗体を検出
するための新規の環状合成ペプチド及び線状の合成ペプ
チドとその組合せに関する。

【０００２】

【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、Ａ
ＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）及び前−ＡＩＤＳは、レト
ロウィルス、すなわちヒト免疫欠損ウィルスタイプ１
（HIV−１；またHTLV−III、LAV−１及びARVとしても知
られている）により引き起こされると思われて来た。最
近、HIV−２（正式にはLAV−２）と呼ばれるもう１種の
病原性ヒトレトロウィルスが、ＡＩＤＳを有する西アフ
リカの患者から単離された（Montagnierなど、国際公表
番号W087/04459として1987年、７月30日に公表されたPC
T/FR87/00025）。HIV−２は、HIV−１及びSimian免疫欠
損ウィルス（ＳＩＶ）と多くの配列を共有することが最
近示された（Guyaderなど、Nature，326：662〜669，19
87）。

【０００３】たとえ他の番号システムが本発明に関する
従来技術に使用されても、本発明に使用されるアミノ酸
のための番号システムは、HIV−１タンパク質のために
は、Ratnerなど、Nature，313：277〜284，1985のシス
テム及びＨＩＶ−２タンパク質のためには、Guyaderな
ど、Nature，326：662〜669（1987）のシステムであ
る。ペプチドにおける本発明に使用されるアミノ酸は、
次のような単一の文字コードにより与えられる：ala＝
A，arg＝R，asn＝N，asp＝D，cys＝C，gln＝Q，glu＝
E，gly＝G，his＝H，ile＝I，leu＝L．lys＝K，met＝
M，phe＝F，pro＝P，ser＝S，thr＝T，trp＝W，tyr＝Y
及びval＝V。

【０００４】HIV−１により感染された患者の血清中の
抗体の検出のための初期免疫診断試験は、抗原して完全
なウィルスを使用した。第２世代試験は、組換えＤＮＡ
方法により得られたポリペプチド配列を使用した。Cabr
adillaなど、Bio/Technology，３：128〜133（1985）及
びChangなど、Bio/Technology，３：905〜909（1985）
は、それぞれ82個及び102個のアミノ酸残基の細菌によ
り合成されたウィルスタンパク質を得ることに成功し
た。E.P.86202314号及び86114243号は、単独で又は混合
して免疫反応性であるgp41及びgp120の領域を包含する
組換えポリペプチドを記載する。Shoemanなど、Anal. B
iochem．161：370〜379（1987）はまた、HIV−１により
感染された患者からの血清中に存在する抗体との免疫反
応特性を有する、ｇｐ４１からのいくつかのポリペプチ
ドを記載する。上記アッセイ方法は許容されない。それ
らの感度の欠乏は、それが検出から漏れ、そして血液生
成物受容体を感染せしめるウィルスを含む血液を可能に
する場合、重大である。これらの抗原調製物中に存在す
る不純物は、健康な個人を苦悩にする、許容できない高
レベルの誤った陽性結果の原因である。

【０００５】次に、従来技術においては、より短いエピ
トープの同定が行なわれたことが明らかになった。これ
は、それらが容易且つ低費用で調製され得るためであ
り、そしてより重要なことには、ＡＩＤＳに関係しない
ウィルスタンパク質との共有エピトープの存在による誤
った陽性の試験結果の危険性を減じるためである。これ
に関しては、Gallaher，Cell，50：327〜328，1987は、
HIV−１のgp41の領域が、呼吸シンシチウムウィルスと
の５個の隣接するアミノ酸残基の配列及びはしかウィル
スＦ１糖タンパク質の４個の等しく分配されたアミノ酸
の配列を共有することを見出した。従って、この領域又
は発見されるべきいづれか他の共通領域を含むさらに高
く精製された組換えポリペプチドが、誤った陽性結果を
潜在的に担当するであろう。

【０００６】卓越した特異性とは別に、ＨＩＶウィルス
のユニーク且つ高く保存されたエピトープに対応するよ
り短いペプチド配列の同定が、化学合成によるその産生
をより容易且つより安価にする。実験的な方法が記載さ
れて来た。これらの方法は、活性タンパク質の表面上に
暴露される予定である短いアミノ酸配列の選択に関与す
ることができる（Hopp and Woods，J. Immunol. Met．8
8：１〜18，1986を参照のこと）。いく分有用であるけ
れども、これらの方法はほとんど表示的でない。それに
もかかわらず、それらは、ＡＩＤＳの原因であるウィル
スのタンパク質上に存在するエピトープの同定のために
多く適用されて来た。たとえば、アメリカ特許第4,629,
783号、国際特許出願番号PCT/US86/00831及びE.P.出願
第86303224号は、ＡＩＤＳの診断キットに有用である。
HIV−１のp18，p25，gp41及びgp120タンパク質からの種
々の合成ペプチドを開示する。

【０００７】しかしながら、より小さな抗原に対するこ
の傾向は、合成されたエピトープが、抗体により認識さ
れる厳密な立体配座を推定することができない危険性を
伴う。これらの場合のそれぞれにおいて試験される血清
サンプルの数はひじょうに制限されるけれども、小さな
合成ペプチドによる特異性は、ひじょうに高いことが見
出され（95％〜100％）たが、しかしながら、全体の感
度は80〜100％の間であった。100％の感度が達成される
例のみにおいては、単に10種のサンプルが試験された。

【０００８】Smithなど、J. Clin. Microbiol．25：149
8〜1504，1987は、高い免疫反応性である２種のオーバ
ラップペプチド、Ｅ32及びＥ34を記載する。240種の血
清陰性検体から誤った陽性結果は得られなかったが、し
かしその試験は322種のうち３種の血清陽性サンプルを
見落とした（99.1％の感度）。Wangなど、Proc.Natl.Ac
ad.Sci．83：6159〜6163，1986は、１つの21−マ−ペプ
チドが100％の特異性及び98％の感度を示す（ＡＩＤＳ
の患者から取られた228種の血清陽性サンブルのうち、2
24種がこのペプチドに対して陽性であることが見出され
た）一連のオーバーラップペプチド（たとえばSmithな
ど、によって発見されたＥ32及びＥ34ペプチドのアミノ
酸残基）を記載する。

【０００９】1987年11月13日に出願されたアメリカ特許
出願第120,027号においては、ＡＩＤＳウィルスにより
感染された患者の抗体と免疫反応する、gp41（HIV−
１）の残基606〜620（SGKLICTTAVPWNAS）を包含する短
い合成ペプチドが開示される。この例においては、特異
性がまた卓越している（63/63）が、しかし57種の確か
な陽性のうち６種の血清陽性検体が検出され得なかった
（89％の感度）。

【００１０】Gnannなど、J. Virol．61：2639〜2641，1
987及びJ. Infec. Dis．156：261〜267，1987はまた、g
p41（HIV−１）の免疫優性領域から一連のオーバーラッ
プペプチドを報告する。配列SGKLIC（606〜611）を有す
る１つペプチドが試験される22 HIV−１陽性血清のいづ
れとも免疫反応しなかったそれらの発見が特に興味ある
ものであった。Ｎ−末端へのシステイン残基の付加はあ
る免疫反応性を回復した。すなわち44種の血清のうち21
種が７−マ−のペプチドと反応した（48％の感度）。Gn
annなどは、cys−605がgp41−（HIV−１）タンパク質の
セグメントの免疫反応性のために不可欠であることの結
論を下した。

【００１１】Gnannなどはまた、gp41（HIV−１）の位置
605及び611（Ratnerの番号システム）でのシステイン残
基が、ジスルフィド結合を通してのループの形成により
たぶんタンパク質のこの領域の抗原立体配座に臨界的な
役割をはたすことができることを推定した。しかし、ジ
スルフィド結合の形成を同定し、そして証明するための
著者による試みは失敗した。Gnannなどは、それらが一
部のアミノ酸配列605〜611（ここで２個の末端のシステ
イン基はジスルフィド結合により結合されている）を含
む合成ペプチドを有することを決して示さなかったの
で、そのようなジスルフィド結合を有するペプチドの性
質は不明であり且つ推定できない。

【００１２】位置605〜611で２個のシステイン残基を含
む７−アミノ酸の一部の配列は、国際公開番号W086/064
14として1986年11月６日に発表されたPCT/US86/00831の
ような他の記録に開示されていて、ここで約bp7516〜75
93の領域によりコードされるペプチドＸ（39）及び約bp
7543〜bp7593の領域によりコードされるペプチドVIII
（79）の両者は、上記刊行物においてGnannなど、によ
り論じられた７−アミノ酸配列（アミノ酸605〜611）を
含む。そのペプチドは線状ペプチドとして報告され、そ
してその著者は、環状構造のいづれの形成をも言及して
いない。

【００１３】国際公開番号W087/06005として1987年10月
８日に発表されたPCT/US87/00577においてRosenなど
は、HIV−１のエンベロープ糖タンパク質（gp41）のCys
（605）−Cys（611）を包含する一連の合成ペプチド
が、中性又は塩基性水性緩衝液中での溶解に基づいて一
連の自発的な酸化形質転換を受けることを報告してい
る。その発明者は、これらの条件下で、ELISAに使用さ
れるペプチドが線状モノマー、環状モノマー、線状又は
環状ダイマー及び種々の長さの線状ポリマーのランダム
混合物であることを推定している。しかしながら、その
発明者は、環状成分の存在を証明していず、そして存在
する他の種々のダイマー及びポリマーを特徴づけてい
ず、そして彼らは、そのポリマー形がELISA試験におけ
る反応性のために最っとも重要な成分であることを推定
している。

【００１４】Gnannなど、Science 237：1346〜1349，19
87は、gp41（HIV−１）上の１つに相同する領域に２つ
のシステイン、たとえばCys（605）及びCys（611）を含
むgp42（HIV−２）の残基592〜603を包含する短い線状
合成ペプチドを報告する。このペプチドは、HIV−２に
より感染された患者から取られた５種の血清のうち５種
と反応した。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】上記引用文献は、HIV
−１抗体を同定することにおいて有用であるペプチドを
提供するけれども、それらはまた、陽性の血清サンプル
を完全（100％）に検出できないようなある欠点をも示
す。たとえば、Gnannなど、J.Virol．61：2639〜2641
（1987）は、600〜611のアミノ酸配列に関するそれらの
試験において、22種の陽性血清のうち２２種すべてを検
出し、そして彼らはまた、Centers for Disease Contro
l, Atlanta. Gaでの他の発明者に行なわれた、その同じ
12−アミノ酸配列（600〜611）に関する類似する試験が
79種の陽性血清のうち78種を検出したことを述べてい
る。J．Infect．Dis.，156：261〜267，1987においてそ
の同じ著者は、gp41−（HIV−１）からの同じ12−アミ
ノ酸配列が、アメリカ合衆国からの132人のHIV−１感染
患者のうち131人と反応することを示した。

【００１６】同じ文献において、HIV−１陽性血清が500
倍以上に希釈される場合、これらの希釈された血清のい
くつかが、低感度を示す陰性であることが見出された。

【００１７】他の欠点は、被覆段階の間、システインを
含むペプチドの多くの酸化形の形成に起因する十分に定
義されていず且つ推定できない混合物のELISAにおける
使用である。

【００１８】ひじょうに低レベルの抗体が存在する場合
でさえ、HIV−１及び／又はHIV−２抗体を含むすべての
サンプルを正常な試験条件下で陽性として検出できる十
分に定義された構造の最終生成物のみをELISAに使用す
るために、被覆段階の間、自発的な酸化に耐性であるペ
プチド又はペプチド混合物を提供することがひじょうに
所望されるように思われる。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、HIV−
１及びHIV−２抗体を100％検出することに特に適合さ
れ、そして血清がひじょうに希釈される場合でさえ、す
べてのＨＩＶ−１抗体を完全に検出できる新規の一連の
ペプチド又はアミノ酸配列が提供される。

【００２０】より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、
586〜629のいづれかのアミノ酸配列（gp41−HIV−１）
を含んで成り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配列
において、次の一部配列：

【００２１】

【化４】

【００２２】を提供するためにジスルフィド結合により
結合される、605〜611のアミノ酸配列のそれぞれの末端
でシステイン残基を含むアミノ酸配列が常に存在する。

【００２３】さらにより詳しくは、本発明の新規の環状
ペプチドは、その中に下記一般式：

【００２４】

【化５】

【００２５】〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸
又はアミノ酸604から始まり、そしてアミノ酸586まで戻
るアミノ酸配列（gp41−HIV−１）を表わし；そしてｙ
はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸612
から始まり、そしてアミノ酸629まで延びるアミノ酸配
列（gp41−HIV−１）を表わす〕で表わされるアミノ酸
配列605〜611（gp41−HIV−１）を含んで成る。

【００２６】より特定には、ｘは586から604まで延びる
次のアミノ酸配列（gp41−HIV−１）の１つを表わし： G WG IWG GIWG LGIWG LLGIWG QLLGIWG QQLLGIWG DQQLLGIWG KDQQLLGIWG LKDQQLLGIWG YLKDQQLLGIWG RYLKDQQLLGIWG ERYLKDQQLLGIWG VERYLKDQQLLGIWG AVERYLKDQQLLGIWG LAVERYLKDQQLLGIWG ILAVERYLKDQQLLGIWG RILAVERYLKDQQLLGIWG そしてｙはカルボキシル基又は612から629まで延びる次
の１又は複数のアミノ酸配列（gp41−HIV−１）を表わ
す： T TT TTA TTAV TTAVP TTAVPW TTAVPWN TTAVPWNA TTAVPWNAS TTAVPWNASW TTAVPWNASWS TTAVPWNASWSN TTAVPWNASWSNK TTAVPWNASWSNKS TTAVPWNASWSNKSL TTAVPWNASWSNKSLE TTAVPWNASWSNKSLEQ TTAVPWNASWSNKSLEQG TTAVPWNASWSNKSLEQGC TTAVPWNASWSNKSLEQI。

【００２７】下記の一般式（Ｉ）：

【００２８】

【化６】

【００２９】〔式中、ｘ及びｙは前記に定義された通り
である〕で表わされる少なくとも１つのペプチド及び −497から518まで延びるアミノ酸配列（gp120 HIV−
１）により特徴づけられるgp120のペプチド、又は −497から518まで延びるアミノ酸配列（gp120 HIV−
１）により特徴づけられるgp120のペプチド及び241から
263まで延びるアミノ酸配列（p24 HIV−１）により特徴
づけられるp24のペプチド、又は −497から518まで延びるアミノ酸配列（gp120 HIV−
１）により特徴づけられるgp120のペプチド及び586から
620まで延びるgp41 HIV−１のペプチドの組合せ又は混
合物もまた本発明の範囲内に存在する。

【００３０】本発明によれば、HIV−２により感染され
た少数の患者から取られた血清の100％を同定すること
に有用である一連の新規ペプチド又はアミノ酸配列もま
た提供される。HIV−１及び／又はHIV−２の両者を検出
するために本発明に記載されたペプチド又はペプチドの
混合物のいくらかを使用することが可能である。

【００３１】より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、
578〜613のいづれかのアミノ酸配列（gp42−HIV−２と
して言及されるであろう推定上のgp41.7）を含んで成
り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配列において、
次の一部配列：

【００３２】

【化７】

【００３３】を提供するためにジスルフィド結合により
結合される、597〜603（gp42−HIV−２）のアミノ酸配
列のそれぞれの末端でシステイン残基を含むアミノ酸配
列が常に存在する。

【００３４】さらにより詳しくは、本発明の新規の環状
ペプチドは、その中に下記一般式（II）：

【００３５】

【化８】

【００３６】〔式中、ｘ¹はアミノ末端、１つのアミノ
酸又はアミノ酸596から始まり、そしてアミノ酸578まで
戻るアミノ酸配列（gp42−HIV−２）を表わし；そして
ｙ¹はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸6
04から始まり、そしてアミノ酸613まで延びるアミノ酸
配列（gp42−HIV−２）を表わす〕で表わされるアミノ
酸配列（gp42−HIV−２）を含んで成る。

【００３７】より特定には、ｘ¹は578から596まで延び
る次のアミノ酸配列（gp42−HIV−２）の１つを表わ
し： G WG SWG NSWG LNSWG RLNSWG ARLNSWG QARLNSWG DQARLNSWG QDQARLNSWG LQDQARLNSWG YLQDQARLNSWG KYLQDQARLNSWG EKYLQDQARLNSWG IEKYLQDQARLNSWG AIEKYLQDQARLNSWG TAIEKYLQDQARLNSWG VTAIEKYLQDQARLNSWG RVTAIEKYLQDQARLNSWG そしてｙ¹は604から613に延びる次のアミノ酸配列（gp4
2−HIV−２）の１つを表す： H HT HTT HTTV HTTVP HTTVPW HTTVPWV HTTVPWVN HTTVPWVND HTTVPWVNDS。

【００３８】下記一般式（II）：

【００３９】

【化９】

【００４０】〔式中、ｘ¹及びｙ¹は前記に定義された通
りである〕で表わされる少なくとも１つの合成ペプチド
および外部エンベロープ糖タンパク質（ＥＧＰ）の及び
486から508まで延びるアミノ酸配列により特徴づけられ
るペプチド203と呼ばれるペプチド、又はＥＧＰの及び4
86から501まで延びるアミノ酸配列により特徴づけられ
るペプチド204と呼ばれるペプチドの組合せまたは混合
物もまた、本発明の範囲内にある。

【００４１】さらに、前記定義されたgp120及び／又はp
24及び／又はＥＧＰアミノ酸配列の１又は複数の線状ペ
プチドの不在又は存在中で、式Ｉの少なくとも１つのペ
プチド及び式IIの１つのペプチド（ここで、ｘ，ｙ，ｘ
¹及びｙ¹は前記の通りである）を含んで成る合成ペプチ
ドの組合せを使用することもまた、本発明の範囲内にあ
る。

【００４２】本発明の新規混合物の１つの意外な利点
は、それらが、1378人のＨＩＶ−１陽性の被検者及び５
人のHIV−２陽性の被検者から成る大パネルの血清に由
来するＨＩＶ抗体の完全な検出を提供することができる
ことである。もう１つの利点は、最少の誤った陽性をも
たらす本発明の混合物により保持される高レベルの特異
性である。

【００４３】

【発明の実施の形態】

（合成のためのペプチドの選択）ペプチドが、HIV−１
単離体の既知のアミノ酸配列及び保存される領域の知識
に基づく合成のために選択された。つい最近、HIV−２
（最近出願した新しいウィルスである）は、HIV−１と
の相当の相同性を共有することが示された。従って、HI
V−１及び／又はHIV−２の両者を検出するために本発明
に記載されるペプチド又はペプチドの混合物を使用する
ことが可能である。

【００４４】既知のアミノ酸配列の他に、ポリペプチド
の一部が表面配向され、そして従って免疫原性であるこ
とを推定することを助ける種々の生理化学的原理を用い
ることによって、可能性あるエピトープが選択される。
これらは、Hopp and Woods（Proc．Nat．Acad．Sci．7
8，3824〜3828，1981）の親水性プロット及びKyte andD
oolittle（J．Mol．Biol．157，105〜132，1982）によ
る類似するアプローチを含む。また、タンパク質立体配
座の実験的な推定（Chou and Fasman，Ann．Rev．Bioch
em.，47，251〜276，1978）は、そのポリペプチドの一
部が免疫原性であることを推定することにおいて有用な
ガイドである。これらの理論的なアプローチは有用なガ
イドであるけれども、本発明の研究の間、発見された多
くの例外が存在する。

【００４５】多くの場合、免疫診断試薬としてより有用
なペプチドを製造するためには、その抗原特性を変えな
いで、天然に存在する配列を変性することが所望され
る。そのような変性とは、 −へテロ二価性架橋試薬、たとえばスルホスクシンイミ
ジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（結
合をもたらすための好ましい試薬）によりキャリヤータ
ンパク質へのペプチドの結合を促進するためにアミノ又
はカルボキシル末端でのシステイン残基の付加；支持ペ
プチド又は大きなペプチドヘの結合のために又はペプチ
ドの物理的又は化学的性質を変性するために、ペプチド
のお互いの結合を促進するためのオリゴペプチドのCOOH
又はNH₂末端でのあるアミノ酸の付加を含む。そのよう
な変性は、エステル化反応を通してリンカーとして使用
され得るチロシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸の
付加により、及びシッフ塩基又はアミド形成、すなわち
末端−NH₂アシル化、チオグリコール酸アミド化、末端
−COOHアミド化による誘導体化、たとえばアンモニア、
メチルアミン形成により結合され得るリシンの付加によ
りもたらされる。これらの修飾は、ペプチド上の実効電
荷の変化をもたらし、そしてまた、固体支持体、キャリ
ヤー又は他のペプチドヘのそのペプチドの共有結合も促
進することができる。これらの修飾は、ペプチドの免疫
反応性の変化をもたらさない。すなわち、自発的に酸化
する傾向があるアミノ酸であるメチオニンが、抗原性を
変えないでノルロイシンにより通常置換され得る。

【００４６】ペプチド配列は、種々の変化、たとえば挿
入、欠失及び置換（保存性又は非保存性のいづれか）に
ゆだねられ得、そしてそのような変化は、それらの使用
においてある利点を提供するであろう。これらの変化
は、たとえばgly，ala；val，ile，leu；asp，glu；as
n，gln；ser，thr；lys，arg；phe，tyr；ala，ser；al
a，thr；ala，val；ala，pro；ala，glu；leu，gln；gl
y，phe；ile，ser；及びile，metの組合せを含む。

【００４７】ペプチドの受動的な吸収を促進するために
少数（１〜10）の疎水性アミノ酸から成る“テール”を
固体支持体に付加することが便利である。この修飾は、
COOH又はNH₂末端のいづれかで行なわれ得る。好ましい
付加はphe−ala−phe−ala−pheである。

【００４８】本発明によれば、HIV−１抗体の検出のた
めに有用な選択された環状ペプチドは、586〜629のアミ
ノ酸配列（gp41−HIV−１）を含んで成るペプチドであ
り、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配列において
は、式Ｉの環状ペプチドを提供するためにシステイン残
基がジスルフィド結合により、605〜611のgp41−（HIV
−１）アミノ酸配列のそれぞれの末端で結合されている
アミノ酸配列が常に存在する。好ましい環状ペプチド
は、次の条件のペプチドである：ｘがNH₂Gであり、そし
てｙがTTAVPWNAS−COOH(80)であり；ｘがNH₂−RILAVERY
LKDQQLLGIWG−であり、そしてｙが−TTAVPWNAS−COOHで
あり(87c)；ｘがNH₂−VERYLKDQQLLGIWG−であり、そし
てｙが−TTAVPWNAS−COOHであり(88)；ｘがNH₂−Gであ
り、そしてｙが−TTAVPWNASWSNKSLEQGC−COOHであり(10
3)、そしてｘがNH₂−Gであり、そしてｙが−TTAVPWNASW
SNKSLEQI−COOHである(96)。

【００４９】また、本発明によれば、HIV−２抗体の検
出のために有用な選択された環状ペプチドは、578〜613
のアミノ酸配列（gp42−HIV−２）を含んで成るペプチ
ドであり、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配列に
おいては、式IIの部分配列を提供するために、システイ
ン残基がジスルフィド結合により597〜603のアミノ酸配
列（gp42−HIV−２）のそれぞれの末端で結合されてい
るアミノ酸配列が常に存在する。

【００５０】本発明の式（II）の好ましい環状ペプチド
は、次の条件のペプチドである：ｘ¹がNH₂−RVTAIEKYLQ
DQARLNSWG−であり、そしてｙ¹が−CONH₂であり（ペプ
チド146）；ｘ¹がNH₂−QDQARLNSWG−であり、そしてｙ¹
が−HTTVPWVNDS−CONH₂であり（ペプチド147）；ｘ¹がA
c.QDQARLNSWG−であり、そしてｙ¹が−CONH₂であり（ペ
プチド200)；ｘ¹がNH₂G−であり、そしてｙ¹が−HTTVPW
VNDS−COOHであり（ペプチド201）；そしてｘ¹がNH₂−R
VTAIEKYLQDQARLNSWG−であり、そしてｙ¹がHTTVPWVNDS
−COOHである（ペプチド202）。

【００５１】最っとも好ましい環状ペプチドは、ペプチ
ド80，87c，146，147，200，201及び202である。

【００５２】表１は、本発明の好ましい環状ペプチドの
ために、Ratnerなど、Nature 313：277〜284（1985）に
より公表された配列に基づいてのＨＩＶ−１のためのア
ミノ酸の位置番号及びGuyaderなど、Nature 326：662〜
669（1987）により公表された配列に基づいてのHIV−２
のためのアミノ酸の位置番号を提供する。

【００５３】

【表１】

【００５４】同定される領域は、HIV−１及びHIV−２に
対する抗体を検出することにおいてひじょうに免疫反応
性であるので、いづれかＨＩＶ単離体のその対応する領
域がまた興味の対象であることは明らかである。同様
に、ＨＩＶの他の単離体又は他の血清タイプに見出され
る配列もまた、本発明の範囲内にある。

【００５５】１又は２個のチオールを含有する残基、た
とえばシステインを線状ペプチド配列に付加し、それに
よって対応する環状ペプチドの調製のために残基を付与
することもまた、本発明の範囲内にある。

【００５６】一般的に言えば、脱アミノ−ジカルバ相同
体が、gp41−（HIV−１）の位置611又はgp42−（HIV−
２）の位置603でアミノスベリン酸（Ａｓｕ）によるジ
スルフィド架橋に含まれる２個のシステインの置換によ
り合成され得る。

【００５７】複数のペプチド配列を共有結合し、又は複
数のペプチドから成るポリマーを形成することが所望さ
れる。そのような変性は、抗原性質を失わないで固体表
面上への抗原の受動的吸着を促進せしめることができ
る。

【００５８】（線状及び環状ペプチドの調製）樹脂支持
体は、ポリペプチドの固相調製のために当業界において
通常使用される適切な樹脂であり、好ましくはｐ−ベン
ジルオキシアルコールポリスチレン及びｐ−メチルベン
ジドリルアミン樹脂である。初めの保護されたアミノ酸
の樹脂支持体への結合に続いて、アミノ保護基が、当業
界で従来使用されている固相ペプチド合成の標準方法に
より除去される。アミノ保護基の除去の後、残る保護さ
れたα−アミノ基及び必要なら、側鎖を保護されたアミ
ノ酸が、所望する生成物を得るために引き続いて結合さ
れる。他方、多重アミノ酸基が、樹脂支持性アミノ酸配
列との結合の前、溶液方法を用いて結合され得る。

【００５９】適切な結合試薬の選択は、当業界で確立し
ている。たとえば、適切な結合試薬は、単独で又は好ま
しくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で
Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド又はＮ，Ｎ’
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。
もう１つの有用な結合方法は、保護されたアミノ酸の予
備形成された対称無水物を使用する。

【００６０】成長するポリペプチド鎖上に導入されるそ
れぞれのアミノ酸のために使用される必要なα−アミノ
保護基は、好ましくは９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル（Fmoc）である。しかしながら、保護基が結合
条件下で分解せず、そして成長分子にすでに存在するい
づれか他の保護基の存在下で選択的に容易に除去できる
かぎり、どんな保護基でも使用され得る。

【００６１】側鎖アミノ酸のための基を選択するための
基準は次の条件である：（ａ）合成のそれぞれの段階で
α−アミノ保護基の除去のための選択的な反応条件下で
の種々の試薬に対する保護基の安定性：（ｂ）保護基は
その戦略的特性を保持すべきであること（すなわち、結
合条件下で分離しないこと）及び（ｃ）保護基は、ポリ
ペプチド合成の終結後及びポリペプチド構造に影響を及
ぼさない条件下で容易に除去できるべきであること。

【００６２】完全に保護された樹脂支持性ペプチドは、
適切なスカベンジャー、たとえばアニソール、チオアニ
ソール、エチルメチルスルフィド、１，２−エタンジチ
オール及び関連する試薬の存在下で室温で１〜６時間、
塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸の50〜60％溶液によ
りｐ−ベンゼルオキシアルコール樹脂から分離される。
同時に、ほとんどの酸不安定側鎖保護基が除去される。
より酸耐性の保護基は、ＨＦ処理により除去される。

【００６３】本発明の環状ペプチドは、当業界で一般的
に知られているペプチド合成の次の技法により、保護さ
れた又は保護されていないＳＨ−基のジスルフィド結合
への直接的な酸化転換により調製される。好ましい方法
とは、フェリシアン化カリウムによる遊離ＳＨ−基の直
接的な酸化を包含する。そのような環状ペプチドは、抗
体への結合を助けることができるより固定されたコンホ
メーションを取る。システイン−システインのジスルフ
ィド結合が天然のウィルスタンパク質に存在するかどう
かは知られていない。

【００６４】（ペプチド混合物）1378人のHIV−１陽性
被検者及び５人のHIV−２陽性被検者の血清に由来する
ＨＩＶ抗体の完全な検出を提供することが見出されてい
る環状及び線状ペプチドの混合物もまた、本発明の範囲
内にある。また、本発明の新規混合物は、最少数の誤っ
た陽性をもたらす高レベルの特異性を提供することが見
出された。

【００６５】さらに、本発明の混合物は、下記一般式：

【００６６】

【化１０】

【００６７】〔式中、ｘ及びｙは前記定義通りである〕
で表わされる少なくとも１種の環状ペプチド及び −gp120の線状ペプチド、又は −gp120の線状ペプチド、p24の線状ペプチド及びgp41の
線状ペプチド、又は −gp120の線状ペプチド及びgp41の線状ペプチドを含ん
で成る。

【００６８】本発明の他の混合物は、下記一般式：

【００６９】

【化１１】

【００７０】〔式中、ｘ¹及びｙ¹は前記定義通りであ
る〕で表わされる少なくとも１種の環状ペプチド及びHI
V−２のＥＧＰの線状ペプチドの１つを含んで成る。

【００７１】gp41−（HIV−１）及びgp42−（HIV−２）
に由来する環状ペプチドがひじょうに保存され且つ免疫
優性の領域をまねたとしても、gp41の他のペプチド配列
及びＨＩＶの他の２種の免疫原タンパク質からのいくら
かを含むことは、より安全であることが見出された。そ
のような感染された個人の血清中に含まれる抗体がもは
や環状ペプチドに結合できない程度に突然変異がこのエ
ピトープを変性する場合、この血清は、アッセイシステ
ムに含まれる他のエピトープに対して向けられた他の抗
体によりなお陽性であることが見出された。しかしなが
ら、混合物に使用され得るペプチドの数は限定される。
まず第１に、多過ぎる異なったペプチドは、誤った陽性
結果の割合を高めるであろう。特に、p24タンパク質の
多くのペプチドは、しばしば許容できない低い特異性を
招くことが見出された。第２に、混合物中における多過
ぎるペプチドの付加は、免疫優性ペプチドを希釈し、そ
して試験の感度を低めるであろう。

【００７２】より特定には、gp120の線状ペプチドは、4
97〜518のアミノ酸配列を有し、そして次の式：NH₂−CG
KIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR−COOR（71）に相当する。

【００７３】p24の線状ペプチドは、241〜263のアミノ
酸配列を有し、そして次の式：NH₂−CGSTLQEQIGWNTNNPP
IPVGEIYK−COOH（61）に相当する。

【００７４】ＥＧＰ（HIV−２）の線状ペプチドは、486
〜501のアミノ酸配列（ペプチド204）又は486〜508のア
ミノ酸配列（ペプチド203）を有し、そしてそれぞれ次
の式： NH₂LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR−COOH（203）又
はNH₂LVEITPIGFAPTKEKR−COOH（204）に相当する。

【００７５】（ＨＩＶ抗体の検出）本発明のペプチド及
びペプチド混合物は、当業界において良く知られている
方法に従ってＡＩＤＳ関連抗体の検出のための診断試薬
として使用される。ＡＩＤＳに対する抗体の決定におけ
る本発明のペプチドの主な利点は、これまで使用されて
来た既知の抗原と比べてのそれらの特異性にある。

【００７６】ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のた
めの１つの方法に従えば、いわゆる“ウェスターンブロ
ット”分折が使用される（Towbin，H.，Staehelin．T
h．andGordon，J.，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 76，43
50〜4354（1979））。この方法によれば、本発明のペプ
チド又は複数のペプチドがニトロセルロース紙上に適用
される。このニトロセルロース紙は含浸され、そして次
に試験されるべき血清により処理される。洗浄の後、そ
のニトロセルロース紙は、酵素によりラベルされた抗−
ヒトＩｇＧにより処理される。次に、その酵素活性が適
切な基質により決定される。もちろん他の放射性ラベル
又は螢光ラベルも使用され得る。

【００７７】本発明のペプチド又はペプチド混合物を用
いてのＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のための好
ましい便利且つ従来の方法は、酵素結合性免疫吸着アッ
セイ（ELISA）である。この試験によれば、本発明のペ
プチド又はペプチド混合物が、ミクロタイタープレート
の壁上に吸着される。次に、その壁は、試験されるべき
血清により処理される。洗浄の後、ペルオキシダーゼに
よりラベルされた抗−ヒトＩｇＧがその壁に付加され
る。そのペルオキシダーゼの決定は、対応する基質、た
とえばｏ−フェニレンジアミンにより行なわれる。ま
た、この方法において、ペルオキシダーゼは、他のラベ
ル、たとえば放射性又は螢光ラベルにより交換され得
る。

【００７８】ELISA試験においては、個々のペプチド又
はその組合せを使用することが可能である。誤った応答
の原因となる抗体を同時に排除しながら、抗体を検出す
るための最っとも効果的なペプチドを組合すことを可能
にするので、後者が好ましい。いくつかの血清サンプル
が、抗原として個々のペプチドとの不確かな応答を示し
ながら、ペプチドの混合物との正しい陽性結果を示すこ
とが、これらの研究の間、発見された。従って、ＨＩＶ
抗体のための信頼すべき試験は、ペプチド抗原の適切な
組合せによってのみ達成され得る。

【００７９】本発明のペプチド又はペプチド混合物によ
る、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のためのもう
１つの方法は、いわゆる“二抗原−サンドイッチ法”に
よる酵素免疫試験である。この方法は、Immunologocal
Methods 20：25〜34（1978）に記載されるMaiolini，
R．I．の研究に基づかれている。この方法によれば、試
験されるべき血清が、本発明のペプチド又はペプチド混
合物が被覆されている固相（捕獲層）及びペルオキシダ
ーゼによりラベルされている本発明のペプチド又はペプ
チド混合物（プローブ層）と接触せしめられる。その免
疫反応は、１又は２段階で行なわれ得る。その免疫反応
が２段階で行なわれる場合、洗浄段階が２回のインキュ
ベーションの間で行なわれる。免疫反応の後、洗浄段階
が行なわれる。その後、ペルオキシダーゼが、基質、た
とえばｏ−フェニレンジアミンにより決定される。

【００８０】適切な固相は、有機及び無機ポリマー〔ア
ミラーゼ、デキストラン、天然又は変性されたセルロー
ス、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミ
ド、アガロース、磁鉄鉱、多孔性ガラス粉末、ポリビニ
リデンフルオリド（Kynar）及びラテックス〕、試験容
器（試験管、タイタープレート又はガラス又は人工的な
材料のキュベット）の内壁及び固体物（ガラス及び人工
的な材料のロッド、末端が太くなったロッド、末端のロ
ーブ又はラメラを有するロッド）の表面である。ガラス
及び人工的材料からの球体は、特に適切な固相キャリヤ
ーである。

【００８１】本発明のペプチド及びペプチド混合物は、
ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定において有用であ
るのみならず、またＡＩＤＳウィルス自体の決定のため
にも有用である。なぜならば、これらのペプチド（遊
離、重合されている又は適切なキャリヤーに接合されて
いる）は、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体、特にモノク
ローナル抗体を誘発することにおいて有用であるからで
ある。そのような抗体は、本発明のペプチド又はペプチ
ド混合物の十分な量を哺乳類又は鳥類に注射し、そして
前記動物の血清から前記抗体を回収することによって産
生され得る。

【００８２】抗体を誘発するための適切な宿主動物は、
哺乳類、たとえばウサギ、ウマ、ヤギ、テンジクネズ
ミ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、等を包含する。

【００８３】一般的に知られている種々の方法は、ＡＩ
ＤＳウィルス又はその一部の決定に使用され得る。

【００８４】１つのそのような方法においては、アッセ
イされるべき血清サンプルの既知量、本発明の放射性ラ
ベルされた環状ペプチド又はペプチド混合物及び本発明
のラベルされていないペプチド又はペプチド混合物が一
緒に混合され、そして静置される。抗体／抗原複合体
が、当業界において既知の方法により、すなわち硫酸ア
ンモニウム、ポリエチレングリコール、第二抗体（過剰
量か又は不溶性支持体に結合されている）、デキストラ
ン被覆性木炭及び同様のものによる処理により、結合さ
れていない試薬から分離される。本発明のラベルされた
ペプチド又はペプチド混合物の濃度は結合された又は結
合されていない相のいづれかにおいて決定され、そして
サンプルのＡＩＤＳ含有量は、それ自体既知の方法で標
準曲線と観察されるラベルされた成分のレベルとを比較
することによって決定され得る。

【００８５】もう１つの適切な方法は、“二抗体サンド
イッチアッセイ”である。このアッセイによれば、試験
されるべきサンプルが２種の異なった抗体により処理さ
れる。これらの抗体の１つはラベルされ、そして他は固
相上に被覆される。固相として、本明細書において前で
言及されたものが考慮される。適切なラベルは、酵素、
たとえばペルオキシダーゼ、放射性ラベル又は螢光ラベ
ルである。好ましい固相はプラスチックビーズであり、
そして好ましいラベルは、ホースラディシュペルオキシ
ダーゼである。種々の抗体が、種々の動物、たとえばヒ
ツジ及びウサギを免疫化することによって高められ得
る。

【００８６】もう１つの方法は、モノクローナル抗体を
産生するための良く知られたKoehler and Milstein技法
を用いることにある。同じ抗原に対して（但し異なった
エピトープに対してではない）向けられるモノクローナ
ル抗体を識別するために、Stahliなど、J．Immunologic
al Methods 32：297〜304（1980）の方法が使用され得
る。

【００８７】もちろん、抗血清（ポリクローナル抗体）
及びモノクローナル抗体を使用することも可能である。

【００８８】“二抗体サンドイッチ法”によれば、サン
プルが、固相抗体及びラベルされた抗体と共にインキュ
ベートされる。まず、固相抗体によりサンプルを処理
し、そして洗浄の後、ラベルされた抗体によりサンプル
を処理することが可能である。しかし、まず固相抗体に
よりサンプルを処理し、そして一定の時間の後、ラベル
された抗体により処理することも可能である。さらに及
び好ましくは、固相抗体及びラベルされた抗体により一
緒にサンプルを処理することが可能である。

【００８９】免疫反応の後、洗浄段階が行なわれる。洗
浄の後、当業界で既知の方法に従って、ラベルが決定さ
れる。ラベルとしてペルオキシダーゼが使用される場
合、その決定は、基質、たとえばフェニレンジアミン又
はテトラメチルベンジジンにより行なわれる。ラベルさ
れた成分の量は、サンプル中に存在する抗原の量に比例
する。

【００９０】ＡＩＤＳウィルス又はＡＩＤＳウィルスに
対する抗体の決定のための上記のような方法は、容器中
に、本発明の環状ペプチド又はＡＩＤＳウィルスに対す
る抗体（本発明の環状ペプチド又は環状及び線状ペプチ
ドの混合物により誘発された）を含んで成る適切な試験
キットで行なわれ得る。

【００９１】さらに、本発明の環状ペプチド及び本発明
の環状及び線状ペプチドの混合物は、ＡＩＤＳウィルス
に対する保護免疫性を誘発できるワクチンとして使用さ
れる。投与のルート、抗原投与量、注入の回数及び頻度
は、個人ごとに異なり、そして他のウィルス感染におい
て免疫性を提供することに現在使用されている方法に匹
敵することができる。ワクチンは、既知の方法に従って
調製される。ワクチン組成物は、便利には、生理学的に
許容できるキャリヤー物質と共に組合されるであろう。
そのワクチン組成物は、アジュバント又は免疫応答のい
づれか他のエンハンサーを含むことができる。さらに、
そのワクチン組成物は、ＡＩＤＳの他に他の疾病に対す
る免疫性を提供するために他の抗原も含むことができ
る。

【００９２】（試験されたパネル血清）本発明の生成物
により試験されたパネル血清を、広範囲の種類の個人か
ら得、そしてそれは、ＨＩＶ−１に対して血清陰性であ
ることが知られている８４５個のサンプル及びそれに対
して血清陽性であることが確認されている１３７８個の
サンプル並びにＨＩＶ−２に対して血清陽性であること
が確認されている５個のサンプルを含む。

【００９３】表２は、血清サンプルが取られた被検体及
びそれらのＨＩＶ血清学的状態の説明を示す。

【００９４】

【表２】

【００９５】（結果）本発明の環状ペプチド及び１又は
複数の線状ペプチドとのそれらの混合物が、種々の血清
（このいくらかは陽性であり、そして他は陰性であるこ
とが確められている）に対して、前記ELISA試験に従っ
て試験された。

【００９６】表３は、既知のHIV−１陽性血清を同定す
ることにおいて個々に評価された単一のペプチドの結果
を提供する。

【００９７】表４に表３のペプチドのアミノ酸配列を示
す。

【００９８】表５は、既知のHIV−２陽性血清を同定す
ることにおいて個々に評価された単一のペプチドの結果
を提供する。

【００９９】表６は、種々の希釈度でのいくつかの血清
の結果を比較することによって、ELISA試験における環
状ペプチド対非環状ペプチドの感度を例示するために提
供される。それぞれの対内で、環状相同体がその線状相
同体よりもより活性であることが注目されるであろう。
これらのデータは、抗体との反応において、一定のペプ
チドの環状性の重要性を明確に示す。

【０１００】最近、被覆のために使用されるいくつかの
条件（炭酸緩衝液、pH9.6）において、それらの配列中
に２個のシステインを有する線状ペプチドが内部環状化
及び重合を受けることが見出された。表６に示される結
果がHIV−１抗体を検出することにおいて線状ペプチド
よりも環状ペプチドの卓越性を明確に示したとしても、
その高められた感度は、炭酸緩衝液（pH9.6）中に溶解
された後、線状ペプチドの可能性のある環状化及び重合
のために過小評価されて来た。その実験は、前記のとお
り炭酸緩衝液（pH9.6）及びまた10％酢酸（pH2.7）中に
溶解される線状８７ペプチド及び環状８７ｃペプチドに
よりくり返された。ペプチドのHPLC分析は、炭酸緩衝液
中において、使用される線状ペプチド８７が、室温でそ
の溶液中に維持される場合、環状化及び重合を受けるこ
とを確証した。プレートに結合される線状ペプチドに対
する環状ペプチドの正確な割合はまだ決定されていない
けれども、環状化及び重合がマイクロタイタープレート
のウエル中において生じたと思われる。

【０１０１】炭酸緩衝液中において見られるのとは反し
て、10％酢酸中に溶解された線状ペプチド８７は、HPLC
及びエルマン試験によって指摘されるように線状のまま
残存した。

【０１０２】10％酢酸中に溶解された環状ペプチド８７
ｃは、環状のまま残存した（HPLC分析及び負のエルマン
試験から）。

【０１０３】この実験に使用されるプレートは、10μｇ
/mlでのペプチドの溶液により被覆された（表６の実験
結果が0.5μg/mlでのペプチドにより被覆されたプレー
トにより得られた）。４種の異なったHIV−１陽性サン
プルが連続的に希釈され、そしてそれらの力価が決定さ
れた。その力価を、すでに記載されたELISA方法の条件
下で1.0の吸光度を示す血液希釈度として定義した。

【０１０４】表６においてすでに示されたように、環状
ペプチド８７ｃは、その対応する線状ペプチド８７より
も高い感度で、HIV−１に対して特異的な抗体を検出す
ることができることが表７において明確である。線状ペ
プチド８７に対する環状ペプチドにより測定される感度
の割合は、１，３〜２，２の間であり、そして平均１，
８である。環状８７ｃペプチドを用いてのELISA試験の
感度が、線状ペプチド８７が線状で残存し、そして環状
化又は重合されない条件（酸性pH）を用いて比較される
場合、これらの割合はさらに高く、3.0〜4.5である。

【０１０５】十分に定義された環状ペプチド８７ｃによ
り被覆されたプレートの感度とペプチド８７の種々のポ
リマーのみを含むクロマトグラフィー画分のプールによ
り被覆された他のプレートの感度とを比較する類似実験
はまた、最大感度でのHIV−１抗体の検出において、環
状ペプチド８７ｃの卓越性を示す。これらの実験の間、
バックグラウンド読みが線状ペプチド８７により被覆さ
れたプレート上で有意に高く（0.144±0.010対0.006±
0.002）、そしてＡＩＤＳ試験において十分に酸化され
た環状ペプチド８７ｃを用いることの１つの利点を示す
ことがまた突然見出された。

【０１０６】表８において、環状及び線状ペプチドの混
合物は、既知のＨＩＶ陽性血清を同定することにおいて
評価され、そして表９はＨＩＶ陰性血清に対するその同
じ混合物の結果を示す。

【０１０７】表８及び表９に使用される混合物は、次の
通りである： 混合物の番号 混合物中のペプチド １ 線状ペプチド41,42,56及び71 ２ 線状ペプチド23,29,42,56及び71 ３ 環状ペプチド80及び線状ペプチド61,71及び87 ４ 環状ペプチド80及び線状ペプチド71及び87 ５ 環状ペプチド80及び87c及び線状ペプチド71 ６ 環状ペプチド200,201,202及び線状ペプチド203及び204 ７ 環状ペプチド80,87c,202及び線状ペプチド71,203及び204。

【０１０８】これらの混合物において、ペプチド23，2
9，203及び204は、次の配列を有する： AcNH−YGCSGKLIC−CONH₂ (23) NH₂−CGVKNWMTETLL−COOH (29) NH₂−LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR−COOH (203) NH₂−LVEITPIGFAPTKEKR−COOH (204)。

【０１０９】表１０は、167種のHIV−１陽性血清及び５
１種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおける本発
明の混合物４とウェスターンブロット試験との間の試験
の比較を示す。その結果は、ELISA試験における本発明
の混合物４がウェスターンブロット試験よりも高い感度
及び特異性を与えることを示す。

【０１１０】表１１は、822種のHIV−１陽性血清及び11
4種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおける免疫
螢光アッセイを示す。その結果は、ELISA試験における
混合物４が免疫螢光アッセイよりも高い感度及び特異性
を与えることを示す。

【０１１１】表３から表１１まで以下にまとめて記載す
る。

【０１１２】

【表３】

【０１１３】

【表４】

【０１１４】

【表５】

【０１１５】

【表６】

【０１１６】

【表７】

【０１１７】

【表８】

【０１１８】

【表９】

【０１１９】

【表１０】

【０１２０】

【表１１】

【０１２１】結果は、既知のHIV−１陽性血清を正しく
同定することにおけるあるペプチド混合物、特に好まし
い混合物４及び５の卓越性及び既知のHIV−２陽性血清
を正しく同定することにおける混合物６の卓越性並びに
HIV−１及びHIV−２陽性血清サンプルの両者を正しく同
定することにおける最終混合物７の卓越性を明確に示
す。単一のペプチドよりもむしろ混合物の使用が、抗体
がひじょうに限定された数のエピトープに対して向けら
れている低い力価の異常な血清を同定する失敗の可能性
を最少にする。すべての血清陽性サンプルがELISAによ
り試験され、そしてウェスターンブロット又は免疫螢光
アッセイにより確認された。矛盾する場合、サンプル
は、最終の対照標準として取られるラジオイムノ沈殿ア
ッセイによりアッセイされた。

【０１２２】次の実施例は、本発明のペプチドの合成の
ための一般的な方法及びそのペプチドの利用を例示す
る。

【０１２３】

【実施例】

実施例１：Ｎα−Fmocにより保護されたアミノ酸残基を
担持する樹脂の調製 塩化メチレン（CH₂Cl₂）及びジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）の混合物（４：１）中、所望するＮα−Fmoc保護
性アミノ酸残基を、CH₂Cl₂：ＤＭＦ（４：１）中、ｐ−
ベンジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に０℃で添加し
た。その混合物を数秒間、手で攪絆し、そして次にＮ，
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、次
いで４−（ジメチルアミノ）ピリジンの触媒量により処
理した。その混合物を、０℃でさらに30分間攪絆し、そ
して次に室温で一晩攪絆した。濾過された樹脂を、CH₂C
l₂、ＤＭＦ及びイソプロパノール（それぞれ３回）及び
最後にCH₂Cl₂により連続的に洗浄した。その樹脂をCH₂C
l₂中に懸濁し、氷浴中に冷却し、そしてその攪絆された
懸濁液に、再蒸留されたピリジン、続いて塩化ベンゾイ
ルを添加した。攪絆を０℃で３０分間続け、そして次に
室温で６０分間続けた。濾過の後、その樹脂を、CH₂C
l₂、ＤＭＦ及びイソプロパノール（それぞれ３回）及び
最終的に石油エーテル（２度）により連続的に洗浄し、
その後、真空下で乾燥せしめ、一定の重量にした。Meie
nhoferなど、（Int．J．Peptide Protein Res.，13，3
5，1979）による置換の分光光度決定は、樹脂上の置換
の程度を示した。

【０１２４】実施例２：連続するアミノ酸の結合 Ｎα−Fmoc保護性第１アミノ酸残基を担持する樹脂を、
Labortec SP640 Peptide Synthesizerの反応容器中に添
加し、そして次のようにして処理した： （１）ＤＭＦによる洗浄（それぞれ１分間、２度）、
（２）ＤＭＦ中、ピペリジンの20％溶液による予備洗浄
（３分間）、（３）ＤＭＦ中、ピペリジンの20％溶液に
よる保護解除（10分間）、（４）ＤＭＦによる洗浄（そ
れぞれ１秒間、４度）、（５）イソプロパノールによる
洗浄（それぞれ30秒間、２度）、（６）ＤＭＦによる洗
浄（それぞれ45秒間、２度）、（７）遊離アミノ基のた
めのチェック−Kaiser試験（陽性であるべきである）、
（８）そのペプチド樹脂を、所望するＦ−moc−保護性
アミノ酸３モル当量及び両蒸留された乾燥ＤＭＦ中にす
べて溶解された１−ヒドロキシベンゾトリアゾール３モ
ル当量と共に２分間、軽く振盪すること、（９）次に、
固体ＤＣＣ（3.3モル当量）を、反応容器に添加するこ
と、（10）その反応混合物の２時間の振盪、（11）ＤＭ
Ｆによる洗浄（それぞれ45秒間、２度）、（12）イソプ
ロパノールによる洗浄（それぞれ45秒間、２度）。

【０１２５】12段階の後、ニンヒドリン試験のためにア
リコートを取る。その試験が陰性である場合、次のアミ
ノ酸の結合のために段階１に戻す。その試験が陽性であ
り又はわずかに陽性である場合、段階６〜12をくり返
す。

【０１２６】本発明に記載されるペプチドのアミノ酸の
それぞれの結合のために上記スキームを用いる。Fmocに
よるＮ−α保護を、合成を通して残るアミノ酸のそれぞ
れにより使用する。

【０１２７】放射性ラベルされたペプチドを、上記結合
方法を用いて³Ｈ−グリシンの導入により得る。

【０１２８】最後のアミノ酸の付加の後、Ｎ−末端残基
のＮα−Fmocを、上記スキームの段階１〜７に戻すこと
によって除去する。ペプチド樹脂をCH₂Cl₂により洗浄
し、そして真空乾燥せしめ、保護された粗ペプチドを得
る。

【０１２９】実施例３：保護解除及び樹脂からペプチド
の切断 保護されたペプチド−樹脂を、2.5％エタンジチオール
及び2.5％アニソールを含む、CH₂Cl₂中、トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）の55％溶液中に懸濁する。その混合物を
Ｎ₂によりフラッシュし、そして室温で1.5時間攪絆す
る。その混合物を濾過し、そしてその樹脂をCH₂Cl₂によ
り洗浄する。その樹脂を、CH₂Cl₂中、20％ＴＦＡにより
室温で５分間再び処理する。その混合物を濾過し、そし
て樹脂をCH₂Cl₂中、20％ＴＦＡにより洗浄し、そして次
にCH₂Cl₂により洗浄する。集められた濾液を35℃以下で
真空蒸発せしめ、そして残留物を、乾燥ジエチルエーテ
ルにより数度こまかくすり砕く。固形物を10％水性酢酸
中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍結乾燥す
る。

【０１３０】ａｒｇ及びｃｙｓ残基を含むペプチドをさ
らに、アニソール及びジメチルスルフィドの存在下で０
℃で１時間、ＨＦ処理により保護解除する。固形物を10
％水性酢酸中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍
結乾燥せしめる。

【０１３１】実施例４：ペプチドの精製 粗ペプチドを、移動相のグラジエントを有するＣ₁₈又は
Ｃ₄逆相のVydacカラム（2.5×25mm）上で分離用HPLCに
より精製する。流出液を220nmでモニターし、そして続
いて分析用HPLCによりモニターする。

【０１３２】適切な画分をプールし、蒸発せしめ、そし
て凍結乾燥せしめる。合成ペプチドの同定を、分析用逆
相クロマトグラフィー及びアミノ酸分析により確証す
る。

【０１３３】実施例５：ペプチドの環状化 フェロシアン化カリウムの溶液（0.1Ｍ，pH7.0）を、線
状ペプチドの希釈水溶液（0.5mM）にpH7.0でゆっくりと
添加する。室温で２時間放置した後、そのpHを5.0に下
げ、そしてその溶液をイオン交換樹脂（Bio−Rad Ag−
３−X4a，Cl−形）により30分間処理する。その懸濁液
を濾過し、そしてその濾液を凍結乾燥せしめ、粗環状ペ
プチドを得る。そのペプチドを、分離用逆相HPLCにより
精製し、そしてアミノ酸分析により特徴づける。環状化
の証明を、環状ペプチドのHPLC移動性と出発の線状ペプ
チドとを比較することによって、線状ペプチドに戻る環
状ペプチドのアリコートを還元することによって及びま
た、環状化の後、遊離スルフヒドリル基の消失（エルマ
ン試験）を観察することによって得る。

【０１３４】環状ペプチドとそれらの対応する線状ペプ
チドとの間の生理化学的相違を示すために、HPLCにおけ
る保持時間の相違を示す表１２に言及する。

【０１３５】

【表１２】

【０１３６】実施例６：ウシ血清アルブミン又はキーホ
ールリムペット（アオガイ）へモシアニンヘのペプチド
の接合 ペプチドを、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（Sulfo−SMPB）により前
もって誘導体化されたＢＳＡ又はＫＬＨに接合せしめ
る。

【０１３７】スルホ−SMPB（Pierce Chemicals）の水溶
液を、0.02Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中、
ＢＳＡ又はＫＬＨの溶液に添加する。その混合物を、室
温で45分間振盪し、そして、活性化されたキャリヤーを
すぐに、0.1Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）によ
り平衡化されたSephadex Ｇ−25カラムに４℃で適用す
る。

【０１３８】活性化されたキャリヤーに対応する、最初
のピークの吸光度の画分を丸底フラスコに集め、それに
0.05Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.2）中、ペプチド
の溶液を添加する。その混合物をＮ₂により十分にフラ
ッシュし、そして室温で一晩インキュベートする。その
結合効力を、³Ｈによりラベルされたペプチドを用いて
及び接合体のアミノ酸分析によりモニターする。

【０１３９】実施例７：酵素結合性免疫吸着アッセイ
（ELISA）によるＨＩＶに対する抗体の検出 マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを、ペプ
チド又はペプチド混合物を含む溶液（５μg/ml）100μl
により飽和せしめ、そして一晩放置する。ウェルを空に
し、そして洗浄緩衝液（Tris，0.043Ｍ；NaCl，0.5Ｍ；
チメロザル、0.01％ W/V；Tween 20，0.05％ V/V；pH7.
4）により２度洗浄する。次に、ウェルを、洗浄緩衝液
0.35mlにより37℃で１時間飽和せしめ、そして同じ緩衝
液により１度洗浄する。分析されるべき血清サンプル
を、検体緩衝液（洗浄緩衝液＋カゼイン、0.05％ W/
V）により希釈する。ウェルを洗浄緩衝液によりすす
ぎ、その後希釈された血清サンプル（0.1ml）を添加す
る。これらを室温で１時間インキュベートする。次にウ
ェルを空にし、洗浄緩衝液によりすぐに２度洗浄し、そ
して次に２分間１度洗浄する。洗浄緩衝液中、１％ W/V
ウシ血清アルブミンにより希釈された接合体溶液（ラベ
ルされたヒトＩｇＧペルオキシダーゼに対するアフィニ
ティ精製されたヤギ抗体、50％グリセロール５ml中0.5m
g）を、それぞれのウェルに添加し（0.1ml）、そして室
温で１時間インキュベートする。次にウェルを空にし、
そして急速に洗浄緩衝液により２度洗浄し、そして次に
５度洗浄し、ここで緩衝液は洗浄当り２分間、ウェルを
接触せしめる。基質溶液（３，３’，５，５’−テトラ
メチルベンジジン、DMSO 1ml当り８mg）を、30％ H₂O₂
0.1％ V/Vを含む0.1Ｍのクエン酸塩−酢酸塩緩衝液（pH
5.6）100体積により希釈し、そしてそれぞれのウェルに
添加する（ウェル当り、0.1ml）。10分後、それぞれの
ウエルの内容物を、２ＮのH₂SO₄ 0.1mlにより処理し、
そして対450nmで吸光度を読む。すべての測定は２度行
なわれる。

【０１４０】

【発明の効果】本発明によれば、HIV−２により感染さ
れた少数の患者から取られた血清の100％を同定するこ
とに有用である一連の新規ペプチド又はアミノ酸配列も
また提供される。HIV−１及び／又はHIV−２の両者を検
出するために本発明に記載されたペプチド又はペプチド
の混合物のいくらかを使用することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/155 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｈ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (72)発明者 ジェルベ ドワンヌ カナダ国，エイチ４エル ３ダブリュ５, ケベック，サンローラン オブライエン ストリート，1735 (72)発明者 マーシャル ラクロワ カナダ国，ジェイ４ダブリュ ３エイチ ８，ケベック，ブロサール クロワッサン ツーランゴー，1925

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の一般式で表される環状合成ペプチ
   ド： 【化１】 ここで式中、ｘ¹はアミノ末端、１つのアミノ酸又は578
   から596まで延びる次のアミノ酸配列（gp42−HIV−２）
   を表す； Ｇ ＷＧ ＳＷＧ ＮＳＷＧ ＬＮＳＷＧ ＲＬＮＳＷＧ ＡＲＬＮＳＷＧ ＱＡＲＬＮＳＷＧ ＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ ＲＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ そしてｙ^１はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又は60
   4から613まで延びる次のアミノ酸配列（gp42−HIV−
   ２）を表す； H HT HTT HTTV HTTVP HTTVPW HTTVPWV HTTVPWVN HTTVPWVND HTTVPWVNDS 但し、以下のｘ¹およびｙ¹の組み合わせを除く：ｘ¹がN
   SWGであり、そしてｙ¹がHTTVPWVNDSである。
2. 【請求項２】 前記ｘ¹がNH₂−RVTAIEKYLQDQARLNSWGで
   あり、そして前記ｙ¹が−CONH₂である請求項１記載の環
   状合成ペプチド。
3. 【請求項３】 前記ｘ¹がNH₂−QDQARLNSWGであり、そし
   て前記ｙ¹が−HTTVPWVNDS−CONH₂である請求項１記載の
   環状合成ペプチド。
4. 【請求項４】 前記ｘ¹がAc−QDQARLNSWGであり、そし
   て前記ｙ¹が−CONH₂である請求項１記載の環状合成ペプ
   チド。
5. 【請求項５】 前記ｘ¹がNH₂であり、前記ｙ¹がHTTVPWV
   NDS−COOHである請求項１記載の環状合成ペプチド。
6. 【請求項６】 前記ｘ¹がNH₂−RVTAIEKYLQDQARLNSWGで
   あり、そして前記ｙ¹がHTTVPWVNDS−COOHである請求項
   １記載の環状合成ペプチド。
7. 【請求項７】 HIV−１及び／又はHIV−２に対する抗体
   の検出およびＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＡＲ
   Ｃ（ＡＩＤＳ関連複合体）及び前−ＡＩＤＳ状態の診断
   のための組成物であって、該組成物は、少なくとも１つ
   の請求項１記載の合成環状ペプチドを含有する、組成
   物。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組成物であって、さら
   に以下を含有する組成物： −486から501まで延びるアミノ酸配列により特徴づけら
   れるＥＧＰ（HIV−２）のペプチド、又は −486から508まで延びるアミノ酸配列により特徴づけら
   れるＥＧＰ（HIV−２）のペプチド。
9. 【請求項９】 少なくとも１つの請求項１記載のペプチ
   ドを用いることを含んで成るHIV−１及び／又はHIV−２
   に対する抗体の検出方法。
10. 【請求項１０】 前記イムノアッセイ方法がELISA、血
    球凝集反応、単一ドット又は多数ドットストリップアッ
    セイ方法である請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 免疫化学試薬が、少なくとも１つの請
    求項１記載のペプチドであることを特徴とする、HIV−
    １及び／又はHIV−２に対する抗体の検出及びＡＩＤＳ
    （後天性免疫不全症候群）、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連複合
    体）及び前−ＡＩＤＳ状態の診断のための試験キット。
12. 【請求項１２】 請求項１記載のペプチド（該ペプチド
    はいづれか適切なキャリヤーに結合されている）を用い
    ることによって哺乳類中においてHIV−１及び／又はHIV
    −２に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を
    産生するための免疫原。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の免疫原に由来する抗
    体を用いてHIV−１及び／又はHIV−２を検出し、そして
    前記ウィルスの存在を検出するための方法。
14. 【請求項１４】 請求項１記載のペプチド（該ペプチド
    は生理学的に許容できるキャリヤーに結合されている）
    を用いて哺乳類中においてHIV−１及び／又はHIV−２に
    対する抗体の産生を誘発するためのワクチン。
15. 【請求項１５】 HIV−１及び／又はHIV−２に対する抗
    体の検出およびＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、Ａ
    ＲＣ（ＡＩＤＳ関連複合体）及び前−ＡＩＤＳ状態の診
    断のための組成物であって、該組成物は、少なくとも１
    つの下記の一般式で表される合成環状ペプチド： 【化２】 〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸
    604から始まり、そしてアミノ酸586まで戻るアミノ酸配
    列（gp41−HIV−１）を表し；そしてｙはカルボキシル
    末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸612から始まり、そ
    してアミノ酸629まで延びるアミノ酸配列（gp41−HIV−
    １）を表す〕；および少なくとも１つの下記の一般式で
    表される合成環状ペプチド： 【化３】 〔式中、ｘ¹はアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ
    酸596から始まり、そしてアミノ酸578まで戻るアミノ酸
    配列（gp42−HIV−２）を表し；そして前記ｙ¹はカルボ
    キシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸604から始ま
    り、そしてアミノ酸613まで延びるアミノ酸配列（gp42
    −HIV−２）を表す〕；を含有する、組成物。