JPS6299398A - 新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の誘発および
／またはＡＩＤＳ抗体との反応が可能な新規ポリペプチ
ド、これらのポリペプチドをコードＪる発現ベクター、
これらの発現ベクターで形質転換された宿主細胞、上記
発現ベクターと形質−転換体を用いてｌｘ記ポリペプチ
ドを製造する方法、ならびにヒト血液中のＡＩＤＳ抗体
の存在を検知する方法に関する。本発明はまた、上記ポ
リペプチドを］−ドする合成遺伝子およびこのような遺
伝子の製造方法を包含する。

し１−口・ウィルスは、哺乳類や鳥類の動物に、広範囲
の口和児感染ににり免疫系の崩壊や死を招く多様な疾患
、たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を生じる
。さらに、異常な型の癌がこの症候群に伴うことも知ら
れている。ＡＩＤＳの病原体としてはこれまでに、少な
くとも３種のし１〜ロウイルスが同定されている。これ
らのウィルスは、リンパ腺症関連ウィルス（Ｌ　Ａ　Ｖ
　）［Ｈｏｎｔａｏｎｉｅｒ、　Ｌ、ほか：　ｌｌｕｍ
ａｎ　Ｔ−Ｃａｌｌ　ＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓｅｓ
　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）刊、３６３〜３
７９頁、１９８４年］、ヒ１−Ｔ細１１を向リンパウィ
ルス（トＩＴＬＶ−ｍ　）　［Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｈ，
ほか：　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４　：　／Ｉ　９７〜
５００　（１９８４）ｌｔ’ｊよびＡＩＤＳ関連レト１
コウイルス（ＡＲＶ）　　［Ｌｅｖｙ、　Ｊ、Ａ、ほか
：５ｃｉｅｎｃｅ、２２５　：　８４０〜８４２　（１
９４８）　］である。

ｔ、ＡＶ、　１ＩｒＬ、Ｖ−ＩＩＩおよびＡＲＶのゲノ
ムは分子的にクローン化されている［５ｈａｌｌｌ、　
Ｃ，Ｈ，ほか：５ｃｉｅｎｃｅ、２２６：１１６５〜１
１７１　（１９８４）　、　Ｌｅｖｙ、Ｊ、Ａ、はか：
　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２　：　７６０〜７６３　（１
９８４）、　Ａ１１ｚｏｎ、　Ｈ，ほか：Ｎａｔｕｒｅ
、　３１２　：　７５７〜７６０　（１９８４）　］。

Ｌ　Ａ　Ｖ、■Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ｍ　オ、ｋ　（ｊ　Ａ　
ＲＶ　−ＩＩ　ハフ　Ｄ　”）イルスのゲノムの全ヌク
レオチド配列が決定されティる［　Ｗａｉｎ−１１ｏｂ
ｓｏｎ、　Ｓ、ほか：　Ｃｅ１ｌ、　４０　：　９〜１
７　（１９８５）、　Ｒａｔｎｅｒ、　Ｌ、ほか：　Ｎ
ａｔｌｌｒｆ３．３１３：２７７〜２８４　（１９８５
）、５ａｎｃｈｃｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、　Ｒ，ほか：
５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２７　：　４８４〜４９２　（
１９８５）］。

配列データｔま、ＬＡＶ、１−ＩＴＬＶ−１１１および
ＡＲＶ−ＩＩゲノムは他のレトロウィルスと同様に組織
化されていて、少なくとも（ｉ）内部構造（ウィルス粒
子または核）蛋白質を］−ドするＱａＣＪ遺伝子、１ｉ
ｉｌ逆転写酵素をコードするＩ）Ｏｆｍ仏子１および（
２）ウィルス粒子のエンベロープ糖蛋白質をコードする
ｅｎｖ遺伝子を含有する。

レトロウィルスのｅｎｖ遺伝子によってコードされる糖
蛋白質は、ウィルス粒子の表面に露出されていて［Ｋｅ
ｍｅｌ、　Ｓ、Ｊ、ほか：　ｖｉｒｏｌｏｏｙ、　５５
　：４６４〜４７５（１９７３）］、ウィルス感染の初
期には、標的細胞の表面上の受容体との相互作用のため
に必須であることが知られている［　Ｄｅｌａｒｃｏ、
　Ｊ、　＆　Ｔｏｄａｒｏ、　Ｇ、　Ｊ、：Ｃｅ１ｌ、
　８　：　３６５〜３７１　（１９７６）］。さらに、
これらの糖蛋白質は、レトロウィルス感染患者の血清と
免疫学的に反応性を有し、゛レトロウィルス感染の診断
に有用なことが示されている［にｉｙｏｋａｗａ、　Ｔ
、ほか：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ｔｌｓＡ、　８１　：　６２０２〜６２０６　（１９
８４）］。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩのｅｎｖｉ伝子は分子量１６０
゜０００のグリコジル化ポリペプチド（ｏｌｅｏ）を特
定し、これはｇｐ１２０とｑｐ４１に処１１さｔ１６　
［ＲｏＬ＋ｃｙ、　Ｗ、Ｇ、　Ｌ＋か：　５ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２２８　：　５９３〜５９５　（１９８５）］。

大腸菌内で合成されたｌ−Ｉ　ＲＬ　Ｖ　−ｍ　　ｃ　
ｎ　ｖ遺伝子生成物は、ＡＩＤＳ患者の血清中に存在す
る抗体によって確認される［Ｃｒｏｗｌ、　Ｉｔ、ほか
：Ｃｅ１ｌ、４１　：９７９〜９８６　（１９８５）。

Ｃｈａｎｇ、　Ｎ、Ｔ、ほか：　５ｃｉｅｎｃｅ、２２
８　：　９３〜９６（１９８５）］。これは、これらの
ｅｎｖ生成物がｌ−Ｉ　ＲＬ　Ｖ−ＩＩＩ感染の診断に
有用であり、Ａ　［Ｄ　Ｓに対するワクチンとしての可
能性をもつことを示唆するものである。しかしながら、
様々のＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１［［単離体のｅｎｖ遺伝子の
制限酵素地図作成および配列解析の結果、重要な分岐が
とくにこの蛋白質の外部に存在することが明らかにされ
ている［　１ｌａｈｎ、　Ｂ、　Ｉｌ、ほか：　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＬＩＳ八、　　８２　　：
　　４８１３〜４８　１　７’（１９８５）　；　Ｃｒ
ａｗｌ、１１．ほか：前出］。コレらの所見により、個
々の患者からのｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ［［単離体が
そのエンベロープ抗原に重要な生物学的差異をもつ可能
性が生じ、ＡＩＤＳに対するワクチンおよびその診断の
ための鋭敏な方法を開発するために進行中の試みに適切
な考え方を提供することになった。

したがって、ＡＩＤＳウィルスのスクリーニングによる
診断および／またはＡＩＤＳウィルスに対する予防接種
による防御を可能にする本発明のポリペプチドが合成さ
れたものである。ＡＩＤＳウィルスの語には、たとえば
ＬＡＶ、ＡＲＶおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩ等、ＡＩＤＳの
病原と考えられているすべての変異株を包含する。

本発明は、ざらに詳しくは、次式 ％式％ で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよびそ
のフラグメントならびにＡＩＤＳウィルスに対する抗体
の誘発（抗原性ポリペプチド）および／またはＡＩＤＳ
抗体との反応（免疫原性ポリペプチド）が可能なその融
合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、上述の
ポリペプチドがアミノ酸置換された抗原性および／また
は免疫原性ポリペプチドを提供する。本発明はまた、上
述の免疫原性および／または抗原性ポリペプチドのたと
えば２〜１０回双頭反復体を包含する。本発明はさらに
、上述の免疫原性および／または抗原性ポリペプチドの
ＷＩＪ造方払を提供する。

本発明のポリペプチドは、その製造方法にＪ：リアミノ
末端の最初のアミノ酸としてメチオニン（ＡＴＧがコー
ドする）を含有する場合がある。

一方、微生物宿主は翻訳生成物を完全またｔま部分処理
して、アミン末端メチオニンを欠失さＶる場合がある。

本発明にお【」るフラグメントは、全ポリペプチドの選
ばれた領域と定義される。適当なフラグメント番またと
えば全ポリペプチドのカルボキシ末端またはアミン末端
から選ばれる。使用できるフラグメントは、例２に訂）
ホするそれぞれ勺ブクローンｐΔ１およびＩ）Ａ４のＤ
ＮＡ挿入体によってコードされるフラグメントである。

もつとも好ましいフラグメントは、次式 ＥＡＱＱＨＬＬＱ［、ＴＶＷＧＩＫＱ（、ＱＡＲＩＬＡ
ＶＥＲＹＬＫＤＱＱ乙ＬＧＩＷＧＣ５ＧＫｒ、ＺＣＴＴ
Ａｖｐ鼎ＡＳＷＳＮＫＬＬＥＱＩ裔聞耐避鴎ＲＥＩ關Ｙ
Ｔ　　　　　　　　　Ｈで表されるポリペプチドである
。

ポリペプチドの生物学的活性を本質的に変えないポリペ
プチドのアミノ酸置換は本技術分野においてよく知られ
ていて、たとえば、Ｈ，Ｎｅｕｒａｔｈ　＆Ｒ１し、旧
１１により、“Ｔｈｅ　Ｐｒ０ｔｅｉｎＳ”八ｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ　（Ｈｅｗ　Ｙｏｒｋ）刊（１９７９
年）のとくに第１４頁の第６図に記載されている。もつ
とも頻繁にみられるアミノ酸置換は、Ａ！ａ／Ｓｅｒ。

Ｖａ１／Ｉｆｅ、Ａｓｐ／ＧＪｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａ
Ｊａ／Ｇｊ！ｙ、ＡＪａ／Ｔｈｒ。

Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｊ！ａ／ＶａＪ！、Ｓｅｒ／Ｇｊ！
ｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｊ！ａ／Ｐｒｏ。

Ｌｙｓ／Ａｒ（ＩＪ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＩＪ！
ｅ、Ｌｅｕ／Ｖａ１．Ａｊ！ａ／Ｇｊｕ。

Ａｓｐ／Ｇｊ！ｙおよびそれらの逆である。

本発明の融合ポリペプチドは、上に定義した免疫［；（
性Ｊ３よび／または抗原性ポリペプチドと、このポリペ
プチドのたとえばアフィニティークロマトグラフィーに
よる精製に有利に使用できる担体蛋白質から構成される
。本発明に使用できる好ましい担体蛋白質は大腸菌りＤ
ラムフェニコールアセチル！−ランスフエラーピ（ＣＡ
Ｔ）およびジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）　、
とくにマウスＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒである。

本発明はざらに、本発明のポリペプチドをコードする合
成遺伝子、このような遺伝子を含有する発現ベクター、
および本発明のポリペプチドの組換えＤＮＡ技術による
製造に有用な形質転換体、ならびに上述の合成遺伝子、
発現ベクターおよび形質転換体の製造方法を提供する。

本発明の他の目的は、生成したポリペプチドの単離およ
び使用にある。

本発明はさらに、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の存在
についてヒト血液を試験する診断方法およびこの方法に
使用できるキットを提供する。この診断方法によれば、
以前に用いられたＡＩＤＳの血液試験すべてにおける非
特異性の問題点が解決する。

しかしながら、本発明のポリペプチドは診断材料として
使用できるばかりでなく、治療剤としてし応用できる。

したがって、本発明のさらに他の目的は、これらのポリ
ペプチドの、（２）ワクチンに導入した場合はＡＩＤＳ
ウィルスに対する防御免疫付与のため、および（ハ）Ａ
ＩＤＳポリペプチドに対するポリおよび／またはモノク
ロナール抗体の産生のための使用ならびにこのようなワ
クチンおよび抗体自体にある。

本発明のポリペプチドは公知の慣用方法によって製造で
きる。新規な蛋白質を製造する方法は、３種類に分類す
ることができる。すなわら、（１）化学的合成、好まし
くは固相合成、■化学合成によって’ＩＪ造された相当
する遺伝子の宿主への挿入およびその蛋白質の宿主によ
る発現、および（３）ウィルスから得られた相当する遺
伝子の宿主への挿入Ｊ３よびその蛋白質の宿主による発
現、である。

以下に、本発明の好ましい態様について）ホベる。

オリゴヌクレオチドフラグメントを合成し、これを正し
く組立てると上に定義したポリペプチドを］−ド１６合
成遺伝子が形成する。フラグメントは、予め決められた
段階でハイブリダイズし、リゲー］〜して合成遺伝子を
構築することができる。

合成遺伝子には適当な制限ｗ１素部位を設け、合成遺伝
子の発現が最になるように特別に設計されたベクター中
にクローン化する。このようにして、ＡＩＤＳウィルス
に対して免疫活性を有するポリペプチドが発現する。

オリゴヌクレオチドフラグメントは、オリゴヌクレオチ
ド配列の全化学合成、たとえばヌクレオチドシンｊ２ｆ
イザー中での合成を含むＤＮＡ化学の領域でよく知られ
た方法に従って製造できる。

所望のポリペプチドをコードする上記合成遺伝子の構築
には、いくつかの基準が守られなければならない。第一
に、トリヌクレオチドコドンは、細胞とくに大腸菌に受
入れられ、好んで使用されるらのを用いな４Ｊればなら
ない。第二に、プラスミドまたはファージ起源のベクタ
ー中への挿入が可能なように、分子の末端にａ、ｌＩ限
酵素認識部位をもつことが望ましい。しかも、ｉ、ＩＩ
　ｖＡ部位は、よく理解されているり〔１−ニングおＪ
、び発現ベクター、たとえばｐＤｓ群のプラスミドの使
用が可能になるように選択されねばならない。第三に、
分子に沿って計画的に配置された一連の制限エンドヌク
レアーゼ制限部位は、遺伝子の部分をきわめて容易に交
換および改変し、またそのある一部を発現さぼることが
できるように、導入する必要がある。

第四に、遺伝子の組立てを容易にするため、合成は不必
要に複雑にせず、不適当な交差ハイブリダイぜ−ション
は最少にするように注意しなければならない。

上述の注意点に留意しＣ１第１図に示したｅｎＶ　（８
０）と命名された合成遺伝子を合成した。この遺伝子は
２２個の合成Ａリボヌクレオチドフラグメント（１９ｖ
−から２９７−まで）から組立てられ、−重鎖重複によ
り完全な二重鎖ヌクレオチド配列を得る。オリゴヌクレ
オチドフラグメント合成および合成遺伝子の組立てのさ
らに詳細は例１および２に記述する。

本発明の合成遺伝子ｔよ、それ自体公知の方法により、
プラスミドまたはファージ起源の（■Ｈの右利な発現ベ
クター中に導入できる。プラスミドまたはファージ起源
の便利な発現ベクターについては、たどえばＨａｎｉａ
ｔｉｓほか著の実験便覧“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（１９８２年）に記載されて
いる。

ｐ　ｏ　ｓ　ｒ、ｙのプラスミドは、木立１！Ｉ］のプ
ラスミド発現ベクターの特異的な例である。これらのプ
ラスミドはｐ　ＩＩ　Ｒ３２２の誘導体で、たとえばｐ
Ｄｓ５／ＲＢＳＩ１．３△＋５Ａ　；　ＤＤＳ６／ＩＨ
ＩＳＩ１．３Ａ＋５Ａ等、コリファージＴ５ブ［１モ一
ター／１ａＣオペレーター発現制御配列に発効的に結合
した合成遺伝子を含む、ＤＥＮＶ　（８０）　、ｐＥＮ
Ｖ　（８０）／ＣＡＴおよＵＤＥＮＶ（８０）／ＤＨＦ
Ｒのようなプラスミド構成を有するプラスミドである。

このような構成に有用なプラスミドを含む大腸菌株（ｐ
Ｄｓ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａ：ｐＤｓ（３／ＲＢＳ
ＩＩ、３Ａ＋５Ａ　；　　ｐＤＳ８／ｒ＋Ｂｓｎで形質
転換された大腸菌Ｍ１５）はＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍ
ｍｌｕｎｏ　ｗｏｎ　Ｈｉｋｒｏｏｒａａｎｉｓｍｅｎ
（Ｄ　Ｓ　Ｍ　、　Ｇ６Ｌｔｉｎｇｅｎ　）　ニ、それ
−１’ｔＬＷ託Ｉ号ＤＳＭ３５１７．ＤＳＭ３５１８．
０３Ｍ３５１９として１９８５年１０月３日に寄託され
ている。

発現ベクターの選択された部位に挿入された合成遺伝子
は、ＥＮＶ　（８０）をコードしないＤＮＡ配列または
ＥＮＶ　（８０）のフラグメントのみを］−ドするＩ）
　Ｎ　Ａ配列に融合させてもよいのはもらろんである。

挿入されたＤＮＡ配列（合成遺伝子）が、形質転換宿主
内で、ＡＩＤＳウィルスに対して免疫原性活性を有する
ポリペプチド［ＥＮＶ　（８０）　、そのフラグメント
もしくはその融合ポリペプチド、またはアミノ酸置換に
よって得られるその類縁体〕を産生ずることのみが必要
である。

合成遺伝子に融合させることができるＤＮＡ配列は、広
く、原核生物または真核生物ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列から選択できる。本発明にＪｊいて合成遺伝
子との融合に使用される好ましいＤＮＡ配列は、ジヒド
ロ葉酸リダクターゼ（Ｄ　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒ）　、とくに
マウスＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ、Ｌｌ−３よび大腸菌クロラ
ムフェニコールアセチル１−ランスフ１ラーピ（ＣＡＴ
）をコード覆るＤＮＡ配列である。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現さ
せる方法は、たとえば、前出のＨａｎｉａｔｉＳほかの
著占によりよく知られている。その方法には、たとえば
、上記ＤＮＡ配列がベクターの発現制御配列と有効的に
結合している発現ベクターで適当な細菌宿主を形質転換
し、この宿主を適当な生育条件下に培養し、この培養液
から所望のポリペプチドを抽出、単１ｌｌｌｉ′する方
法がある。本技術分野の熟練賃であれば、本発明の範囲
から逸脱することなく、特定の遺伝子の発現にもつとも
有効４１方法を、公知の方法の中から選択することは容
易である。

本発明に使用する特定の宿主の選択は、本技術分野にお
いて認められている多くの因子に依存するものである。

たとえば選ばれた発現ベクターとの適合性、ハイブリッ
ドプラスミドににリコードされる蛋白質のｍ性、所望の
蛋白質の回収の容易性、発現特性、安全性および経済性
等である。これらの一般的な指針の中で、有用な細菌宿
主の例としては、ダラム陰性菌およびグラム陽性菌、と
くに大腸菌Ｊ３よび枯草菌を挙げることができる。

しつとし好ましい本発明の宿主ｌｌＩ胞は、大腸菌Ｍ　
１５　［Ｖｉｌｌａｒｅｊｏほか：β−Ｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄａｓｅｆｒｏｍ　　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　　
ａｎｄ　　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　　ａ＋ｕｔａｎｔ　　５
ｔｒａｉｎｓ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２０　：　４６６〜４
７４　（１９７４）にｌ）　Ｚ　２９１として記載され
ている］である。

しかしながら、他の大腸菌株、たとえば、大腸菌２９４
（△ＴＣＣ順３１４４６）および大腸菌ＲＲ１（ΔＴＣ
ＣＮｏ、３１３４３）も同様に使用′Ｃ″さる。

本発明のポリペプチドは、ｌ／ＩＩアンモニウムによる
沈殿、塩を除去するための透析（常圧または減圧上）、
ゲル濾過、クロマトグラフィー、プレバラテイブ平床等
電点電気泳ＵＪ、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラ
フィー（以下ＨＰＬＣという。イオン交換、ゲル濾過お
よび逆相クロマトグラフィーを包含する）、ａ３よびた
とえば色素結合担体または上記ポリペプチドに対するモ
ノクロナール抗体と結合させたセファロース上でのアフ
ィニティークロマトグラフィー等のような公知方法にに
って精製できる。本発明の好ましい態様においては、本
発明の融合ポリペプチドは、クロラムフェニコール−カ
ラム（ＣＡＴ−融合蛋白質）またはメトトレキセート−
カラム（ＤＨＦＲ−融合蛋白質）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーにＪ：って精製される。

本発明のポリペプチドは、ＡＩＤＳウィルスに対する感
染防御免疫を誘発可能なワクチンとして使用することが
できる。投与経路、抗原出社、注射の回数および間隔は
各個人によって相違し、現在、他のウィルス感染に対す
る感染防御免疫を付与するために用いられている使用法
と同様である。

このワクチン組成物は、生理学的に許容される担体材料
と合するのが便利である。ワクチン組成物には、アジュ
バントまたは他の任意の免疫応答エンハンサ−−を含有
させることができる。さらに、ワクチン組成物には、Ａ
ＩＤＳ以外の他の疾患に対する免疫を付与するＩこめに
他の抗原を加えることもできる。

さらに、本発明のポリペプチドは、本技術分野にＪ３い
てよく知られた方法に従い、ＡＩＤＳ関連抗体の検出用
の診断試薬として使用覆ることもで・きる。ＡＩＤＳに
対する抗体の測定に際しての本ざｔ明のポリペプチドの
主たる利点は、従来使用されている公知の抗原に比べて
特異性の高い点である。

Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓウィルスに対ツる抗体の定■の一方法と
しては、いわゆるウェスタンブロッティング解析が使用
できる［Ｔｏｂｉｎ、　Ｉｆ、　５ｔａａｈｃｌｉｎ、
　Ｔｈ、　＆Ｇｏｒｄｏｎ、　　Ｊ、　　　：　　Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　
ＵＳ＾、　　７６：４３５０〜４３５／ｌ　（１９７９
）］。この方法によれば、本発明のポリペプチドを５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルから電気泳動的に、ニトロ
セルロース濾紙上に移り。ついで、このニトロセル［−
１−ス濾紙を試験づべぎ血清で処理する。洗浄後、ニド
［］　ｊ？ルロース濾紙をパーオキシダーゼで標識した
抗ヒ］〜ＩＱＧで処理する。次にパーオキシダーゼを、
適当な基質、たとえば０−フェニレンジアミンで定量す
る。もちろん、放（ト）能または蛍光標識のにうな他の
標識も使用できる。

本発明のポリペプチドを用い、△ＩＤｓウィルスに対す
る抗体をもつと簡便な方法で定量するには、酵素結合免
疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が使用できる。この試験法によ
れば、本発明のポリペプチドをマイクロ滴定板のウェル
に吸着させる。次にこのウェルを試験すべき血清で処理
する。洗浄後、パーオキシダーゼで標識した抗ヒト［Ｑ
Ｇをウェルに加える。バーＡキシダーゼの定量は、相当
するｇｌたとえばＯ−フェニレンジアミンにより実施す
る。この操作でし、パーオキシダーゼを他の標識、たと
えば放用能または蛍光８Ｒ識に交換することができる。

本発明のポリペプチドによるＡＩＤＳウィルスに対する
抗体の他の定尾法には、いわゆる二重抗原４ノンドウイ
ツヂ法での酵素免疫試験法がある。

この方法は、Ｈａｉｏｌｉｎｉ、Ｒ，１，：　ｌｉｕｇ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ、　２０　：　２５
〜３４　（１９７８）の記載に基づくものである。この
方法によれば、試験すべき血清を、本発明のポリペプチ
ドでコーティングした固相と、パーオキシダーゼで標識
した本発明のポリペプチドと接触させる。免疫学的反応
は１工程または２工程で実施できる。免疫学的反応を２
工程で実施する場合は、２回のインキュベーションの間
に洗浄工程を実施する。１回または２回の免疫学的反応
ののちに、洗浄工程を行う。ついで、パーオキシダーゼ
を、基質たとえば０−フェニレンジアミンによって測定
する。

適当な固相は、有機および無機ポリマー［アミラーゼ、
デキストラン、天然または改良セルロース、ポリアクリ
ルアミド、アガロース、マグネタイト、多孔性ガラス粉
末、ポリビニリデンフルオライド（にｙｎａｒ　）およ
びラテックス１、試験容器（ガラスまたは合成材料の試
験管、滴定板または４：ユベット）の内壁、ならびに固
体（ガラスまたは合成材料の棒状体、末端を太くした棒
状体、末端に突出部または薄片を設覧プた棒状体）の表
面である。ガラスや合成材料の球状体はとくに固相担体
として適当である。

本発明のポリペプチドは、ＡＩＤＳウィルスに対りる抗
体の定■に有用なばかりでなく、これらのポリペプチド
はＡＩＤＳウィルスに対する抗体とくにモノクロナール
抗体を誘発するのに有用であるので、ＡＩＤＳウィルス
それ自体の定量にも使用できる。このような抗体は、哺
乳類または鳥類動物に十分な品の本発明ポリペプチドを
ｕ：　ｏ−＋　Ｌ、、その動物の血清から抗体を回収す
ることによって製造できる。

抗体のｖｋ発に適当な宿主動物には、つ勺ギ、ウマ、ヤ
ギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ等のｌ
ｌ１１１乳類動物が包含される。

ＡＩＤＳウィルスの定量には、一般によく知られている
各種の方法を使用できる。

一方法によれば、定吊寸べき血清サンプルの既知間に、
本発明の放射標識ポリペプチドおよび本発明の非標識ポ
リペプチドを混合し、放置する。

本技術分野にＪ３いて公知の操作、すなわち硫酸アンモ
ニウム、ポリエチレングリコール、不溶性支持体に接近
もしくは結合させた第二の抗体、デキストラン被覆活性
炭等で処理して、抗体／抗原複合体を非結合試薬から分
離する。本発明の標識ポリペプチドのａ度は、結合また
は非結合相のいずれかで定量し、サンプルのＡＩＤＳ含
社をついでそれ自体公知の方法で標準曲線に対して観察
された標識成分のレベルと比較することにより決定でき
る。

他の適当な方法は二重抗体１ノンドウイツチ定聞法であ
る。この方法によれば、試験すべきサンプルを２ｆＩＪ
の異なる抗体で処理する。これらの抗体の一方は標識し
、他方は同相上に被覆する。固相としては、本明細店申
に前述したものを使用できる。適当な標識は、酵素たと
えばパーオキシダーゼ、ｔｌｉ射標識または蛍光［１で
ある。

好ましい固相はプラスチックビーズであり、好ましい標
識はワザビパーオキシダーゼである。

異なる抗体はたとえば、異なる動物たとえばヒツジとウ
サギを免疫処置することによって得ることができる。

他の方法には、七ツク［１ナ一ル抗体の産生法としでよ
く知られたにｏｅｈｌｅｒ−１４１ｓｔｅｒｎ法を用い
る方法がある。同じ抗原であるが異なるエピトープに向
Ｕられる異なるモノクロナール抗体を見出すためには、
５Ｌｊｈｌｉはか［Ｊ、　ｏｆ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、　３２　：　２９７〜３０４　
（１９８０）］の方法を使用できる。

もらろｌυ、抗血清（ポリクロプール抗体）ＪｊＪ、び
モノクロナール抗体を使用することら可能である。

二重抗体リーンドウイツヂ法によれば、リンプルを固相
抗体および標識抗体とインキュベ−１へする。

ナンプルを最初、固相抗体と処理し、洗浄後に１ノ゛ン
ブルを標識抗体で処理することも可能である。

しかしながら、リーンプルを最初に固相抗体で処理し、
ある時間経過したのち標識抗体で処理することもでさる
。さらに、サンプルを固相および標識固体と一緒に処理
することも可能で、これが好ましい。

免疫学的反応ののらに、洗浄工程を実施する。

洗浄後に、標識を本伎術分野で公知の操作に従って定量
づる。標識としてパーオキシダーゼを使用した場合は、
定量は基質たとえば０−フェニレンジアミンまたはベン
ジジンを用いて行われる。標識された成分の但はサンプ
ル中に存在する抗原の品に比例する。

以上述べたようなＡＩＤＳウィルスまたはＡＩＤＳウィ
ルスに対する抗体の定ａ方法は、容ｚ中に本発明のポリ
ペプチドまたは本発明のポリペプチドによって誘発され
るＡＩＤＳウィルスに対する抗体を含有する適当な試験
４ツト内でも実施できる。

以下の実施例および図面を参照すれば、本発明をより明
確に理解することが可能であろう。以下の実施例には、
本発明の合成遺伝子ｅｎｖ　（８０）の構築および発現
について詳細に記述する。

例１ 合成遺伝子を構成する合成オリゴヌクレオヂドフラグメ
ン１〜の合成 合成Ａリゴヌクレオヂドフラグメントは第１図に承り。

Ａリボヌクレオチドフラグメント自体は、支持体として
制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）を用いて同時に製造した［
５ｐｒｏａｔ、Ｂ、　Ｓ、　＆　Ｂａｎｎｗａｒｔｈ。

Ｗ、：　Ｔｃｔｒａｈｃｄｒ、　Ｌｅｔｔ、、　２４　
：　５７７１〜５７７４（１９８３）、＾ｄａｍｓ、　
Ｓ、　１．ほか：Ｊ、八ｍ、　Ｃｈｃｍ。

Ｓｏｃ、、　１０５　：　６６１〜６６３　（１９８３
）］。

この目的に製作された装置を第１０図に示す。これは、
原即的には、中心シャフトを支社に各ディスクが個々に
回転するように積載された多数のディスクから構成され
る。中心シ用フト川の孔部とは別に、各ディスクにはた
がいに７２″の角度で配置された４個の小孔部と１個の
大孔部をｈする。

大孔部は反応室で、反応室の底部および頂部にはフリッ
トを設置ノる。ディスク１および１４は、スプリングを
装填したナツトから加わる対称の圧力を確保する金属根
である。ディスク２および１３は反応室をもたず、溶媒
および試薬の取入口およびＩＪＦ出口出口用子ユープの
取付部として働く。

並行合成の開始前に、合成すべきＤＮＡフラグメン１〜
の相当する３′−ヌクレオチドをもつ機能化支持体の適
当量を各室に充Ｌｒｉする。ついで、すべてのディスク
を官能化支持体上に接続すべき延長中位に相当１−るそ
れぞれの位置に回転させる。

す／ｒわち、次の１３ｉ　Ｗとして八を必要とする反応
室は位置△に（第１０ａ図のディスク３．４．７および
１０）、Ｃを必要とする反応室は位置Ｃに（第１０ａ図
のディスク８）に、以下同様に回転させる。停止可能な
すべての位置には小孔部が設けてあり、反応室とともに
ディスクの堆積を通して１セットのカラム様の系を形成
する。したがって４種の延長単位に相当する４個の位置
のそれぞれに、適当量のＡ、Ｔ、ＧまたはＣを注入すれ
ば、づべての配列が同時に延長される。１延長サイクル
時の全反応および洗浄は、同様に同時に実施される。漏
出はディスクの各孔部の下に設（）られたゴム環によっ
て回避される（第１０ｃ図参照）。

次の延１％　”ｆイクルを行うには、ディスクを新しい
位置に回転しなければならない。これはスプリング菰頃
ノーット（第１０ａ図）をゆるめて行い、ディスクの位
置を変えたのちに再びしめる。ひとつのディスクでの合
成が完了した場合には、その反応室は空の位置に回転さ
せ、伯のディスクでの合成を継続する。実際に背圧はな
いので、ディスクの数には制限はない。

１）　Ｎ△フラグメントの合成に用いられるＣＰＧ支持
体は、メジデルスルホニル−ニトロトリアゾール（ＭＳ
ＮＴ）または−クロリド（ＭＳＣＬ）およびＮ−メヂル
ーイミダゾールを用いて３′　−スクシニル化ヌクレオ
シドを直接支持体にカップリングさＶることにより官能
化した。この機能化操作はきわめて迅速、効率的で、Ｃ
ＰＧ支持体１Ｕあたり２５〜３３μｍｏｌｅの負荷が行
われる。未反応アミノ基はアシル化によって不活性化し
た。

長鎖アルキルアミン官能基をもつＰｉｅｒｃｅ製の制御
された多孔性ガラス材料５ｇとスクシニル化ヌクレオシ
ド２　、５　ｎ＋ｍｏｌｅを無水ピリジン５０　ｍｆｌ
　ａ３よびトリエチルアミン２ｉｄ中にとり、ついで溶
媒を蒸発させた。この操作をくり返し、残留物を無水ピ
リジン３（７にとり、ＭＳＮＴ１２．０ｍｍｏｌｅ　　
（３、６！Ｊ　）およびＮ−メチルイミダゾール１．４
１１Ｉｉ！を加えた。この懸濁液をときどき振盪して、
１時間゛至温で反応さＵた。ついで混合物をガラス濾斗
を通して濾過し、支持体をピリジン、１３よびエーテル
で洗浄し、真空下に乾燥した。支持体を他のフラスコに
移し、ジメチルアミノピリジン（１）　Ｍ　Ａ　Ｒ）の
６．５％（ｗ／ｖ　）　ＴＨＦ溶液１５−と無水酢Ｍ／
ルヂジン（１／１　：　　ｖ／ｖ　）１５ｄを加えて、
未反応アミノ基を封鎖した。１■、１間反応さけたのち
、Ｕ合物を再び総過し、支持体をピリジンおよびエーテ
ルで洗浄し、真空下に乾燥した。負他聞は放出されたジ
メトキシトリデル陽イオンのＵｖ定楢によって評価し、
通常は支持体１Ｕあたり２５〜３３μｍｏｌｅの範囲で
あった。

ＭＳＮＴの代わりにＭ　Ｓ　ＣＬを用いても同程度の官
能基化ができる。

ＤＮＡフラグメントの各合成は、官能基化したＣ　ｌ）
　Ｇ支１・”１体ｉｍｏｌで開始した。延長中位のデ第
１シヌクレＡシトー３′−β−シアノエチル−Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノアミダイト［Ｓｔ＋１ｎｂａ
。

Ｎ、Ｄほか：　Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄ、　Ｒｃｓ、、　１
２　：　４５３９〜４５５７　（１９８４）］を用い、
縮含過稈にはデトラゾールで活性化した。１１ｔｉ位付
加のための延長リイクルを次表に示Ｊ０ １）　　ジクロロエタン中３％　脱トリデル　５ジク【
］０口酢酸　　　　化 ２）　　アセトニトリル　　　　洗浄　　　　４３）　
　活性化アミダイト　　　延長　　　　５４）　　アセ
；−二ｌ・リル　　　　洗ｒｆｉ　　　　Ｏ，５５）　
　　Ａｃｔ、、／ルブジン　　封鎖　　　　３Ｄ　Ｍ　
Ａ　Ｐ　／　Ｔ　Ｉ−Ｉ　Ｆ ６）　　アセトニトリル　　　　洗ｆ１１０．５７）　
　１２溶液　　　　　　　酸化　　　　３脱］〜リチル
化工稈はジクロロ酢酸ににり実施し／ｊ　（八ｄａｍｓ
、　Ｓ、Ｚ、ほか：　＋Ｙｉ出）。これ４．ｔ　ｌｌＧ
２プリン化に関する限りまったく安全で、切断剤として
はＺｎＢｒ２の場合のように切断時間が鎖長によらない
。洗浄工程はずべてアセ１−二トリルで行う。

配列の各延長には（１個のディスク内で）、アミダイＩ
−２０１１９とテ１〜ラゾール７Ｉｔｇを無水アセトニ
トリル中に含有する溶液２００ｕｌｌを使用した。

反応を確実に完結させるため、延長サイクルの各反応時
間は必及と思われるＪ：りわずかに長くした。

づべての溶媒および試薬はわずかに過圧のアルゴン（０
，０２ｂａｒ　）で運搬し、この系は連続的なフｌ］一
様式で作動する。活性化延長中位は、並行合成の聞９ｆ
１０ηに調製した保存溶液から取り出した。

これは、４種の塩基に相当する４個の溝に、無水アセト
ニトリルを置換してシリンジで注入した。

各延長後の封鎖工程は、無水耐酸／ルブジン／Ｔ’ｌｌ
Ｆ　（１／１／８　：　　ｖ／ｖ　）および丁ＨＦ中６
．５％ジメヂルアミノビリジン（１）　Ｍ　Ａ　Ｐ　）
を１／２　　（ｖ／ｖ　）の割合に混合した混合物によ
り実／／Ｉ！ｌする。酸化工程は、各延長後にＴ］１Ｆ
中０．２ＭＥつ水溶液／ルヂジン／水（７８／２０／２
：ｖ／ｖ）を用いて行う。

Ｂ、後処理、精製Ｊ３よび単離 各ディスク中で全配列の合成が終了したの１５、支持体
を除去し、各配列を同１侍に後処理した。ねじ栓イ・ｊ
の１．５　ｍｆｔ　　［ｐｐｅｎｄｏｒｆ’管中ぐ、支
１＝’ｉ　ｆＡ　’；ｉ澗アン上ニアで処理して、リン
保護！、４ならびにＩ？ｕ’＋ｉＪ保護基を切断し、支
持体からそれを除去した。

この場合、管は密閉し、Ｅ　１１１１ｅ　ｎ　ｄ　ｏ　
ｒ　（加熱ブ［１ツク中、５６℃に一丙保１ｙづ−る。

冷［１２５）各［旧＋ｃｎｄｏｒｆ管の底に小さな孔を
あけ、管を再びＩ！ｌじ、生じた過圧により、支持体月
利を含ま４Ｚいアンモニア溶液を伯の［：ｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ管に移した。高速真空濃縮器で蒸発さけたのら、Ｄ
　Ｍ　Ｔ　１１１を除去するために８０％ｍ酸で処理し
た。もう−瓜真空濶縮器で蒸発ざＵ、各残留物の一部を
プレバク１フフ２０ バンドをＵ　Ｖ　！ｌ；’．（　１＞Ｉによって１■視
化し、抽出し、小逆相（ＲＰ）カラム（Ｊ丁．　Ｂａｋ
ｅｒ　Ｃｈｃｍ．　Ｃｏｒｐ．。

Ｐｌ＋ｉ　ｌ　ｌ　ｉｐｓｂｕｒｇ、　Ｎ、　Ｊ、　）
上で一緒に脱塩した。各ＤＮＡフラグメントの実際の品
を測定したのり、分析用ポリアクリルアミドゲル上３２
１〕で標識したのらイの純度を調べた。

相当Ｊる保護オリゴヌクレオブトフラグメン１〜を右Ｊ
る各合成のＣＰＧの総ωの１／１０をねじ栓つき１　、
５　ｄＥｐｐｅｎｄｏｒｒ管にとった。アンモニア（ｎ
＋ｉｎ、２５％）７００μＪを加え、管をねし栓で密閉
し、１６６時間−夜）　［ｐｐｃｎｄｏｒｆ加熱ブロッ
ク中加熱ブロック積５た。ついで管を冷却し、管の底部
に小孔をあけた。孔をふさぎ、生じた過圧を用いてアン
モニア溶液を他の管に写し、それに集めた。支持体を２
００μｌのアンモニアで洗浄し、アンモニア溶液を合し
、５分間ドライアイスで冷却したのら＾速真空濃縮器で
蒸発さけた。残留物を８０％吊酸３００μｌにとり、室
温に９０分間保持した。エーテル約９００μ夕を加え、
生じた沈殿を室温で遠心分離して集めた。上澄液を除き
、ベレツ１へを水に溶解し、この溶液の一部を、尿素染
料を添加し、９５℃に短時間加熱したのち、ポリアクリ
ルアミドゲル（４０Ｘ　２０　Ｘ　０　、２　ｃｔｎ　
）に適用した。

電気泳動後、バンドをＵ■照則によって可視化し、ゲル
から切り取り、ＤＮＡフラグメン１−を水で溶出（）、
小ＲＰ−カラム（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｂｅｍ。

Ｃｏｒｐ、　）を用いて同時に脱塩した。各オリゴヌク
レＡブトフラグメントの生成品をＵＶ吸収で測定し、３
２Ｐで標識したのち、そのＭＡ度を分析用ポリアミドゲ
ル上で確認した。

例２ ｐ△−ＥＮＶ−２０の構築 Ａ、原理 合成オリゴヌクレオブトを、両端に唯一の制限部位を５
つ４つの遺伝子ブロックに再分割した。

これらのブロックはＬ）ＵＣ−プラスミド中にサブクロ
ーニングできる。このサブクローンは、ナブクローン間
のバイブリドプラスミドの構築ができるプラスミド中、
唯一のへａｔｌｉ制限部位を用いて比較的筒中に配列さ
せることができる。この計画を第２図に図式的に示す。

Ｂ、合成オリゴヌクレオブトの各遺伝子ブ目ツク凍結乾
燥したオリゴヌクレオブトを室温で１時間を要し−Ｃ水
に溶解し、ＤＮＡ濃度１０　ｎｍｏｌｅ　／ｒｎＲどし
た。各オリゴヌクレオブト１００　ｐｍｏｌｅを１μｍ
のＴ［３２ＰＩ−Δ−ｒＰ　（２ｐｍｏｌｃ　：　５．
００ＱＣｉ　／［１１８０１）　、５０ｕｌの５０ｍ１
４　　Ｔｒｉｓ−１１ＣＪ！、Ｄｌ１８．０ＩＩ−１０
，５Ｕの１−　ＩＩ−ポリヌクレＡヂドキノ−−ぜ、１
０ｍＨＭＱＣｊ！２によりご３７℃で５分間活性化した
。各遺伝子ブロックの末端フラグメントの場合を除き、
各反応にはＱ、５ｆｆｉＨ△ｒ　Ｐ　６μｌを追加した
。反応は、リーンプルを６５°Ｃ′ｃ５分間加熱して件
止させた。各反応混合物を遺伝子ブロックに相当Ｊる４
個の［’ｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分取した。ＩＭ　　ＴＲ
ｌＳ−１−１（、Ｊ！５μＪ（ｐＨ７，８）　、１Ｍ　
　ＭｑＣ＊２１μｌ、５ＭＮ　ａ　Ｃ１２ＩＩ　ｆｔお
よび水３２μｆを加えたのち、リンプルを５分間煮沸し
た。ついで管を、沸騰水２１を含有−づるビーカー中に
とった。ビー力を冷至に約４時間放置して、リンプルを
徐々に４℃まで冷却した。リゲーシ］ンは、ＩＭ　　Ｄ
ＴＴ（ジチＡ−スレイ１〜−ル）１０μｊ！、１００ｎ
＋ＨＡ−ｒＰ１μｍおよびＴ　ＩＩ　−Ｄ　Ｎ　Ａリガ
ーゼ（５Ｗｃ１ｓｓ−ｕｎｉｔｓ、　Ｐｌ＋ａｒｍａｃ
ｉａ、　ｌ１ｐｐｓａｌａ　）　５　μｍを加えで、１
２℃で２４時間行った。次に５ＭＭＩＭリブウム１２μ
！とイソプロパツール２６０μ（を加えて１０分間ドラ
イアイス上に置いて沈殿させた。管をマイクロッエージ
中１２．０ＯＯｒＩＩＩＩｌ　ｒｌ　Ｏ分間遠心分離し
た。上澄液をパスツールピペットで捨て、ベレツ１−を
８０％エタノール１ｄで洗浄したのち、真空中で乾燥し
た。ＤＮＡベレットをゲルリーンプル緩衝液［０，０５
％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアツ
ール、１０ｍＨＥ　ｌ）　ＴＡ（エチレンジアミン四酢
酸）、ｐＨ８，ｏ］１０１１　ｆｔ中に溶解した。リン
プルをついで１×Ｔｌ３Ｌ＜０．０８９Ｍ　　ｒＲＩｓ
−ボレート、０．０８９Ｍホウ酸、０．００２Ｍ　　Ｅ
ｌ）ＴＡ、１、　Ｈａｎｉａｔｉｓ　！よか：　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄＳｐｒｉｎ
（］　（１９８２）　］を含む１０％ポリアクリルアミ
ドゲル上、Ｂｉｒａｄｍｉｎｉ−ｓｔａｂゲルシステム
を用い４００ｖで２０分間電気泳動に（＝Ｊ　した。電
気法１７１４１、ゲルをエチジウムプロミド（１０Ｕｇ
／Ｉｄ）中で５分間染色した。ＤＮＡバンドを３００　
ｎｎｎ性外光下可視化した。適当な９イズのバンドをメ
スを使って切り出した。マーカーＤＮＡは１（Ａ［ＥＩ
［Ｉ　（ＢＲＬ、［３ａｓｅｊ！　）ｔｉｉ化り、　タ
フ　７−ジφＸとした。ゲル片を０．７％アガロースゲ
ルを合む４Ｘ４履のつ１ルに移し、ウェルを１×丁Ｂ［
中液体０．７％アガロースでシールし、均一な電場を設
（プた。各サンプルの前にＮＡ４５模片（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ　＞
を挿入し、その膜上３００Ｖで５分間、ＤＮＡを電気泳
動した。ＤＮＡを６つストリップを次に蒸留水で洗浄し
、２５０　μｍ　］１　、５　Ｍ　Ｍ　Ｆｌａ　ＩＪ　
チウム、５０１ＨＩＲＩ　Ｓ−１１ｃｊ！　（ｒ＋ｌＩ
８．Ｏ＞および１０ｍ）ｌ［Ｅ　Ｉ）　Ｔ　Ａを含有す
るＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移シタ。

ＤＮＡをときどき攪拌しながら６５℃で２０分間溶出し
た。管から膜ストリップを除去し、サンプルを、ＩＭ　
　ＴＲｌ５（ｐＨ１８，０）で飽和したフェノール２０
０μｌで１回抽出した。サンプルをマイクＬ］フコーー
ジ中１２．０００ｒｐｍ　ｒｌ　０分間回転させ、上澄
液を捨てた。２０μｌの５Ｍ酢酢酸リブ−ハム４４０μ
！のイソプロパツールを加えたのら、ドライアイス上で
１０分間ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡをマイクロフユー
ジ中１２，００Ｑ　ｒｐｍで１０分間回転させてベレッ
ト化した。ベレットを８０％エタノールで洗浄し、真空
中で乾燥させた。ベレットを水１０μｍに溶解した。

ＤＮＡ濃度０．４μｇ／μｌのプラスミドｏＵｃ１８お
よびｐＵｃ１９はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｉｌｐｐｓａｌ
ａ　）から入手した。プラスミドＤＮＡ２μｌを１ＸＴ
４ボリメラーピ緩衝液（Ｔ。

Ｈａ、ｎ１ａｔｉＳほか：前出）中、総容ｆｆ１５０μ
ｌ、３７℃で１時間、１０Ｕの適当な酵素で消化した。

ｐ　Ｕ　Ｃ１８は、１ナブクローン■についてはＢａｍ
ＲＩとＥＣ０ＲＩで、サブクローン４については３μｍ
ＲＩとＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　ＴＲ’ｌ化り、り。

ｐＵＣｌ　９はサブクローン３については１三ｃｏＲＩ
とＰｓｔＩで、會１ブクローン３についてはＰｓｔＩと
Ｈｉｎｄｌｎで消化したく第２図参照）。消化後ＤＮＡ
を１回フェノールで抽出し、沈殿させ、前述のように乾
燥した。ベレットを１０ｕｊ！のゲル負荷緩衝液中に溶
解し、１ＸＴＢＥおよび１μ９／ｌｄのエチジウムプロ
ミドを含有寸６０．７％アガロースゲル上で電気泳動に
付した。

ベクターのバンドを３０ＯｎＩｌ′ｊ８外光下に可視化
した。各バンドの曲部でスリットを切り、ＮＡ４５膜片
を挿入した。股上ＤＮＡを３００Ｖで１０分間電気泳動
を行った。上述のようにして、ＤＮＮ１３溶出し、精製
した。最後のベレットを水３０μｌに溶解し、最終ＤＮ
Ａ濃度を０．１μ９／ｒｄとした。１μ！のベクターＤ
ＮＡを、１μｌの１０Ｘリガーぜ緩衝液（０，５Ｍ　　
丁ＲＩＳ−１−ＩＣ１、ｐＨ７，８，１０ｍＨＭｑＣｌ
　、１００ｎ＋ＨＤ丁Ｔ、５０ｍ）４ＮａＣｊ！、５０
０μＭΔＴＰ）および１μｊ！　　ＤＮＡ−リガーゼ（
１１４ｅｉｓｓ−ｕｎｉｔ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　
１Ｊｐｐｓａｌａ）を加えたのら、総容恐１０μｌとし
て、２μｌの挿入ＤＮＡとりゲートした。リゲーション
は２０℃で１時間行った。１１１１人ＤＮＡを用いない
対照リゲーションを平行して行った。

大腸菌に１２株ＴＢ−１はＢ　ＲＬ　（Ｍｅｓｓｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎ　ａｒｔ）から得られた。コンビ−テント
細胞の調製には、ＴＢ−１の単一コロニーをＬ［３−メ
ジウム（１０９［３ａｃｔｏ−トリプトン、５ｇ（３ａ
ｃ　ｔｏ−酵母エキス、１０ｇＮａＣｊ！／１、ｒ、　
Ｈａｎｉａｔｉｓほか：前出）中、ロータＩＪ　−シェ
ーカー中３７℃で一夜生育させた。−夜培養液５００μ
ｌをＬ　Ｂ−メジウム１００ｄで希釈し、ざらに２時間
３７℃で生育さけた。細胞を９．００Ｏｒｐｍ　、４℃
で１０分間遠心分離して集めた。ベレットを注意深＜５
０ｍＨＣａＣｊ！２２０ａｆ中に懸濁し、ドライアイス
上に３０分間放置した。細胞を再び遠心分離し、ベレッ
トを２０％グリセロール（ｖ／ｖ）含有５０ｍＨＣａＣ
ｊ！２１０ｄ中に溶解した。細胞を３００μｌずつ分取
して衝撃凍結ざぜ一８０℃に保存した。形質転換効率に
みるべき低下がなく、少なくとも３力月間保存できる。

形質転換には、０．５Ｍ　　ＭｑＣＪ２と０．　ＩＭ　
　ＣａＣｊ２２１０μＡ、３０％ポリエチレングリコー
ル１０μｌ　ＤＮＡおよび水を混合し、総合ｆｉｔ　１
００　ｕ　１とした。１００μｍの解凍コンビ−テント
細胞を加え、サンプルを氷上に２０分間置き、ついで室
温で１０分間インキュベートシた。

Ｌ１２−メジウム１−を加えたのち、サンプルを１時間
、３７℃の水浴中でインキュベートした。サンプルを次
にマイクロフユージ中１２．００Ｏｒｐｍで３分間遠心
分離した。上澄液を捨て、ベレツ１〜をＬＢ〜メジウム
１００μｍに懸濁し、８０μ９／ｌｄアンピシリンを含
むＬＢ−アガール板上で平板１８！した。プレートは３
７℃で一夜インキュベー１〜した。

ナブクローン１〜４リゲーション混合物の形質転換後、
１リゲーシヨンあたり約２００個の形質転換体が得られ
た。対照リゲーションは形質転換体を与えなかった。１
個のコロニーをようじで取り出し、８０μ９／ｍｅアン
ピシリン含有ＬＢ−メジウムを含む管に移し、激しく攪
拌しながら３７℃で６時間牛ｒ１さけた。細胞を８．Ｏ
ＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離した。ベレッｌ−を５０
０μｌの５０ｍＨＴＲｌ５−ＨＣｊ！　（１１１１８，
０）および１０ｍＨ［［）１−八に再懸濁した。リゾデ
ームを最柊濶度１１Ｉｔｇ／μｌに（２るように加えた
のら、サンプルを′！１！温で５分間インキュベート〜
した。２５μｍの１０％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸す１ヘ
リウム）および５０μｍの５Ｍ酢酸カリウムを加えたの
ち、リンプルを氷上に１５分間放置した。ついで染色体
１）　Ｎ　Ａをマイクしｌフユージ中１２．ＯＯＯｒＤ
ｍで１５分間遠心分離してベレッ１〜化した。上澄液を
新しい試験管に移し、１μｌのｆｌＮａｓｅ　　ｐ。

（１０Ｒｇ／Ｉｄ＞を加え、ついで３７℃で１０分間イ
ンキュベートシた。ＤＮＡを等容の１ＭＴＲＩ　５−Ｈ
Ｃｊ！　、ｐＨ８，Ｏ飽和フェノールを加えて抽出した
。１２．０００ｒｐｍで５分間遠心分離して相を分離し
た。上澄液を新しい試験管に移し、等容のりｒ＋　ｏホ
ルムを加えた。遠心分離して相を分離し、上澄液を新し
い管に移した。０．６容のイソブ０パノールと０．１容
の５ｔＶＩＭＭリヂウムを加えて室温に１０分間置きＤ
ＮＡを沈殿さけた。サンプルをマイクロフユージ中１２
．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した。ベレットを８
０％エタノールで洗浄し、真空中で乾燥した。ベレット
を水５０μｌに溶解した。、１０μｌを総容量１００μ
！中、ｊ８当な１Ｉ１１１限Ｍ木（１０単位）で消化し
、上述のように挿入体を放出さＵる。ついでＤＮＡを沈
殿させ、８０％エタノールで洗浄し、真空中で乾燥した
。ベレットを１０μｍのゲルサンプルｖＡｍ液に溶解し
、上述のように６％ポリアクリルアミドゲル ージφＸ　　ＤＮＡを用いて解析した。４種のり“ブク
［１−ンの１１１１人体はすべて開時されたサイズ、そ
れぞれ６４．５５．５８および６９塩基対を有していた
。サブクローンはｐΔ１，［）Δ２．ｐＡ３およびｐＡ
４と命名された。

Ｄ．ｐ△２−３の構築 ＩＩΔ２　４３よびｐＡ３０．２μＵを総容量１００１
１１中、Ａａ　ｔ　ＩＩ／Ｐｓ　ｔ　Ｉで各Ｍ５　Ｍ　
５　１１１位を用い、３７℃でＩ　１１，を間消化した
。リンプルは前述のように、沈殿さけ、８０％］ニタノ
ールで洗浄し、乾燥した。ベレッ１〜を１０μｌのゲル
負る１緩衝液（前述）に溶解し、Ｉ　Ｘ　Ｔ　Ｂ　Ｅお
にび１μ’Ｊ　／　ｔａ丁ヂジウムブロミド含有０．８
％アガロースゲル］−電気泳動に付した。ＤＡ２の５０
０ｂＤフラグメン１−およびＤＡ３の２ｋｂフラグメン
トをＮＡ４　５膜を用いて甲離し、上述のにうにしてさ
らに精製した．最終ペレツ１−は５μｌの水に溶解した
。各フラグメント２μｌに、１μｍ１０×リガーピ緩衝
液（０．５Ｍ　　ＴＲ　ＩＳ−１−１ｃＩ　ｐＨ７、８
。

０、１Ｍ　　ＭｑＣＪ　　、０．２Ｍ　　Ｉ）Ｔ−ｌ’
．１０ｍＨ　　△−１’ｒ’）、１μＡの一ｒ　４　−
　１）　Ｎ　Ａリガーピ（　１　ｗｃｉｓｓ−ｕｎｉｔ
，　ＰｈａｒｍａＣｌａ，　Ｕｐｐｓａｌａ）おにび１
μｌの水を補給した。リゲーション（ま室温でＩ　Ｉｌ
．？間行った。ついで量ナンＩルを前述したようにＴＢ
−１に形質転換した。形７１転換体をさらに上述のにう
に微小分解で解析した。組換えプラスミドの挿入体をＥ
　Ｃ　Ｏ　ＲＩ　Ｊｊよびト１ｉｎｃｉｍｔ’放出すセ
、８％ポリアクリルアミドゲル１−ゲル電気泳動によっ
て評価すると、期待されたりイズ１１４塩基対を示した
。ｃ　ｎ　ｖ　遺伝子フラグメンｉ−のブロック２６３
Ｊ：び３を含む新しい組換えプラスミドは［）Δ２−３
と命名した。

ｔ、ｐＡｌ−２−３の構築 ｐＡｌおよびｐＡ２−３の０．２μ９を総容量ｉ　ｏｏ
ｕｐ、中、Ａ　ａ　ｔ　ＩＩ　／　［ｃ　ｏ　ＲＩ　ニ
Ｊ：す、８酵１ｆｉ５　ｔｔｉ位を用いて３７℃で１時
間間化した。以下のＤＮＡの操伯はｐＡ２−３の構築の
場合も同じぐある（第２図ら参照）。新しい組換えプラ
スミドの挿入体は、Ｉ’）　ｔＪ　Ｃ１８のポリリンカ
ー内にざらに１個のｔ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位があるの
で、１１ｉｎｄｌで放出させた。挿入体は約２００塩１
．Ｌχ・１の期待された奎ナイズを示した。遺伝子ブロ
ック１．２お」；び３を含む新しいプラスミドはｐＡ１
−２−３と命名した。

１’　、　ＯＡ　−Ｅ　Ｎ　Ｖ−２０（７）　ｔＭ　２
　ｔＪ　ヨＵ　配＆ｌ　解析２　ｔｔ　７のｐＡｌ−２
−３を総合１ｆｌ　３００μｍ中２０　！ｌｉ位のＨｉ
ｎｄＩ［により、３７℃で１時間消化した。上述のよう
にＤＮＡを沈殿させ、１％アガロースゲル上電気泳動に
付した。ＮＡ４５膜を用いて２００　塩１対フラグメン
１〜をｔｌ離し、さらに−１−述のようにして精製した
。最終ペレツ１へを水１０　ｕ　１中に懸濁した。プラ
スミドｐ△４（０，５μｇ）を１００μ！中＋＋　ｒ　
ｎｄ　ｌｌ　１０＋ｐ位により、３７℃で１時間消化し
た。ついで細菌アルカリホスファターぜ、４０μｌの１
ＭＴ１でＩ　Ｓ−１−ＩＣｊ！　、　ｐＨ８，ＯおＪ：
び１６０μｌの水を加えて、６５℃で２１、）閤、末端
を脱リン酸化した。サンプルをＩ　Ｍ　　Ｔ　ＲＩ　Ｓ
　−１−Ｉ　ＣＪ　、　ｒｏｌ＋８．０飽和フ１ノ一ル
４００μｍで３回抽出した。

上述のように遠心分離して相を分離した。３回目ライア
イス上に５分装置いてＤＮＡを沈殿させた。

サンプルをマイクロフユージ中１２，０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離した。上澄液を捨て、ベレツ１−を８０
％Ｌクノールで３回洗浄し、最後に高速貞空遠心分離を
１５分間行って乾燥させた。ベレツｌ−を水５μｌに溶
解した。Ｈｉｎｄｍで消化し、脱リン酸化したｐＡ−４
ＤＮＡ２μｌを、１ｔｌｐのＴ４−ＤＮＡリガービ（１
Ｗｃ１ｓｓ−ｕｎｉｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ｔｌｐ
ｐｓａｌａ　）　、１　μｍの１０×リガーＵ緩衝液お
よび５μｌの水を加え、１μｍのｐＡ１−２−３　１１
ｉｎｄＩ［フラグメン１−と室温で１１１．’ｉ間リす
−１〜した。平行して、ＤＡｌ−２−３からの挿入ＤＮ
Ａを用いないで対照リゲーシ」ンを（１つだ。次にリグ
−シコン混合物をＴＢ−１中で形質転換した。１Ｉｉｎ
ｄＩ［ｌ−挿入体を含むり一ンブルは約５００の絹換え
］［に−をＬ）え、ｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｌｌｌ−挿入体
をもたないバックグラウンドは２０コロニーであった。

上述の微小分解操作で１２個の組換えプラスミドを単離
した。

１３　ａ　ｍ　ＨＩで切断したのち、２４６塩基対を右
する挿入体が、１２個のプラスミド中の１０個から、Ｅ
３％ゲル上ポリアクリルアミド電気泳仙後に放出された
。Ｎ　ｉ　ｎｄｌｎ、　Ｐｓ　ｔ　ＩおよびＥ　ＣＯＲ
ＩにＪ、る試験開化で、最終プラスミドＤＡ−ＥＮＶ−
２０中にこれらの１１１１限部位の存在が確認された。

ｐＡ−ＥＮＶ−２０で形質転換された大腸菌Ｔｒ３−１
は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＨｉ
ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｎ＋ｅｎ　　　（Ｄ　　ＳＭ、　
　Ｇ６ｔｔｉｎｇｃｎ　　）　　に　、　１９８５年１
０　Ｊ］３日、寄託番号ＤＳＭ３１５６で寄託された。

′ｃＪ度０．１μ！Ｊ／ｄのＭ　１３　ｒｎ　ｐ　１８
　ＲＦ　ｌＤＮＡは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　（Ｕｐｐ
ｓａｌａ　）から購入した。

１０μｍ（１μＪ）を１００１１１中、ＩＯＵの１３　
ａ　ｍ　Ｈｆにより、３７℃で１時間間化した。１０Ｕ
の却１菌アルカリボスファタービ、４０μｌの１Ｍ　　
ＴＲ［５−Ｈ（、ｉ、ｐＨ１８，０および２４０μｍの
水を加え、６５℃で２１１？ｉ間ＤＮＡを脱リン酸化し
た。サンプルを上述のようにフェノール抽出し、沈殿さ
けた。ペレットを水’２０μｌに溶解した。ｐ　Ａ　−
Ｅ　Ｎ　Ｖ−２０Ｄ　Ｎ　Ａ　２　ｕ　ｑを反応容量２
００μｊ！で、１３８ｎｔ−Ｉ　Ｉ　（２０１１ｉ位）
ににり消化した。挿入体を−［；ホのようにして１％ア
ガ【コースグルから単離した。最終ベレットを水１０１
１１に溶解した。Ｍ　１３　ｒｎ　ｏ　１８　Ｆ　ｒ＜
　Ｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａ１μｍをＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切断し
、脱リン酸化し、３μｌのｐＡ−ＥＮＶ−２０１３ａ　
ｍ　ｌ−Ｉ　Ｉ挿入（４を、水５μｊ！、Ｔ４−ＤＮＡ
−リガーｙ　（１ｗｅｉｓｓ−ｕｎ目、　Ｐｈａｒｉａ
ｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ）　１　ｕ　１および１μｌ
の１０×リガーゼ緩衝液添加後に、室温で１「４間リグ
−１〜した。ついでサンプルを、ｌ述のブ［１ト］−ル
に従って、大腸菌株ＪＭＩ　０５　（ＢＲＬ。

１１　ａ　Ｓ　ｅ　ｌ　、株二（ット）に形質転換した
。形質転１堕後の１時間のインキュベーションは省略し
、細胞を直接、インディケータ−細胞、ＩＰＴＧ（イソ
プロピル−β−Ｄ−チオ゛ガラク１−ピラノシド）Ｊメ
Ｊ、びＸ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクｌ−シト）含有軟質アガール中
ＬＢ−プレート上で、［３Ｒｌ−］’３ａｓｅ　ｌ　）
の配列決定キットのＭ１３指針に記載されているように
、平板培養した。挿入Ｄ　ＮＡを加えない対照リゲーシ
ョンを平行して行７）　／：＝　、、−一夜３７℃でイ
ンキュベーション後、対照プレー１−には２０個の青色
プラークが認められた。

挿入体を加えたプレートには２３個の古色プラークに加
えて、挿入体をもつ約１８０個の白色ブラーりを生じた
。３ｆｌ！Ｊの白色プラークをようじで取り、新たに−
ｆｆｌ　Ｉｎ養したインディケータ−細胞（ＪＭｌ　０
５，１３Ｒ１−、Ｂａ５ｅ　ｌ　、株キ”／　ｌ−）含
イｉ　Ｌ　［３−メジウム３−中で激しく振出しながら
、３７℃で５時間生台させた。一本鎖ＤＮＡ鋳型をＢＲ
Ｌ−Ｍ１３の指１１に記載のようにしてファージ上澄液
から調製した。鋳型は、１７マーのユニバータルブライ
ｖ　−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ）を用
いリンガ−のジデオキシ法で配列決定した。反応、また
０、４ＩｍＪ’７ゲル士ゲル電気泳動はＦ３　ＲＬのＭ
１３指２１に記載のように実施した。ガラスプレー］−
を分離したのら、ゲルは１０％メタノール、１０％酢酸
Ｊ＞よび８０％水で１５分間固定した。

ついでゲルをＷｈａｔｍａｎ　３配線紙に移し、ゲルド
ライア−上で乾燥した。増感スクリーンを用いないでゲ
ルをにｏｄａｋ−Ｘ　Ａ　Ｒフィルムに、室温にＪ３い
て一夜露出した。配列を調べた鋳型はすべて、正しく、
合成遺伝子ｅｎｖ　（８０）の予想された配列を示した
。

例３ ＣＡＴ、ＤＩＩＦＲ，ＥＮＶ　　（８０）−ＣＡＴ。

八、原理 ρＤ　Ｓ　５　／　ＲＢ　Ｓ　Ｉｆ　、　３　Ａ　４−
５△（第３図）、ｐＤ５６／ＲＢＳＩ１．３Ａ＋５Ａ　
（第４図）およびｐＤｓ８／ｌざＢＳｌ［（第５図）は
、クロラムフに］−ルアセチル１〜ランスフェラーゼ（
ＣＡＴ”　）おＪ：びジヒドロ葉酸リダクタ−ぜ（［〕
ＨＦＲ”）の誘導体の発現のみでなく、ｅｎｖ　（８０
）−ポリペプチド［ＥＮＶ　（８０）］およびその融合
蛋白質ＥＮＶ　（８０＞−ＣＡＴとＥＮＶ　（８０）−
Ｄｌ−ＩＦｒ＜の発現にも選択された。

効′キ１的な発現のために、上記ベクターは調節可能な
プロモーター／オペレーター要素ＰＨ２５本／。

［０，５ｔｉｂｅｒはか：　Ｔｂｅ　［ＨＢＯＪ、、３
　：　３１４３〜３１４８　（１９８４）］およびリポ
ソーム結合部位１又［３ＳＩＩまたはＲＢＳＩＩ、３Δ
←５Ａを合０する。これらのリポソーム結合部位は、大
腸菌ファージＴ５１０〔−ターＰ　　　［Ｒ，Ｇｃｎｔ
ｚ：ハイデルベルグ大学（ＦＲＧ）学位論文（１９８／
Ｉ）コの制御下のリポソーム結合部位に相当するＤＮＡ
合成を介して誘導された。これらの高効率の発現ジグ１
ルにＪ：す、上記ベクターは、プロモーター／Ａベレー
ター要素が１８ＣリブレツリーのＰ　　本　オペレータ
ー実体への結合を介して抑制されるならば、大腸内に安
定に紺ト“１されｊ！ノる。

Ｐ　　＊　は十分量のりプレーリー−分子が存在す８２
５　　／。

る場合にみ効率的に抑制されるので、１　ａ　ＣＩ　”
対立遺伝子を突然変異プロモーターと使用し、その結果
、遺伝子の転写が増加し、十分なりブレラ（ナー分子が
与えられた。λａｃ　１ｑ対立遺伝子はプラスミドｐＤ
Ｍ１．１　（第６図）の部分で、上述のプラスミドと適
合性を有し、ざらに選択マーカーとしてカシマイシンに
対する１氏抗性を（＝Ｊ　！−５するｎ　ｃ　ｏ　Ｍ　
ｌ云ｒをしつＣいる。しｌこがって、Ｆ）　Ｉ）　Ｓ　
５　／　Ｒ１３Ｓ　Ｉ［、３△＋５△、ｐＤＳ６／Ｒ１
３Ｓ　ＩＩ　、　３　Ａ　−１−５へ、　ｐ　Ｄ　Ｓ　
８　／　Ｒｆ３　Ｓ　ＩＩまたはＥＮＶ　（８０）−ｍ
包子を含むこれらのプラミスドの誘導体で形質転換する
大腸菌細胞は、これ゛らのベクターの安定な維）３を確
実にするためにｐＤＭｌ、１を含／υでいな（）ればな
らない。この系での発現の誘導は、所望細胞濃度で、メ
ジウムにｌ　ＰＴＧを添加することにより、容易に達成
される。

Ｂ、プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ１１．３Ａ＋５ＡＤＮ
Δ複製とプラスミドの１ｌＩＩＩｌ内１１１Ｍおよびア
ンピシリンに対する抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ
の全遺伝子を含む、ｖ１限エンドヌクレアーぜ）（ｂａ
ＩとＸｈｏＩの部位の間のｐＤＳ５／ｆｌＢｓＩ［，３
△」５Δ（第３図）の部分はｐ　Ｂ　Ｒ３２２から誘導
される［ｒ、　Ｂｏｌｉｖｅｒほか：　ａｅｎｅ。

２：９５〜１１３　（１９７７）、Ｊ、Ｇ。

’５ｕｔｃｌｉＨｃ　：前出］。このプラスミドの残り
の部分には、ｖＡ節可能なプロモーター／オペレーター
要素Ｐ　　本　　［Ｓｔ；ｂａｒ、　Ｄ、ほか：前出］
、ついＮ２５　　　／。

でＥｃｏＲＩ／［３ａｍＨＩフラグメントの一部である
リポソーム結合部位ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａ、制限エン
ドヌクレアーゼ５ａＡ１．ＰＳｔ■およびＨｉ　ｎｄ■
部位、クロラムフェニコールアセチル１−ランスフェラ
ーゼのプロモーターを含まない遺伝子［Ｈａｒｃｏｌｉ
、　Ｉｔ、ほか：ＦＥＢＳ　　Ｌｃｔｔ、、ｉｌｏ：１
１〜１４　（１９８０）］、ついで大腸菌ｒ　ｒ　ｎ　
［３Ａぺに１ンのターミネータ−Ｔ１［Ｂｒｏｓｉｕｓ
、　Ｊ、ほか：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１４
８　：　１０７〜１２７　（１９８１）］がある。

Ｃ，プラスミドｐＤｓ６／Ｒ１３ＳＩＩ、３△＋５Ａプ
ラスミドｐＤＳ６／ＲＢＳＩ１．３Ａ＋５Ａ（第４図）
は、Ｄ　Ｄ　Ｓ　５　／　ＲＢ　Ｓ　Ｉｆ　、　３△−
）　５　Ａ（第３図）に相当するが、さらにｃａｔｌ伝
子の前に、大腸菌ファージラムダのターミネータ−ｔ　
を含有する［　Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ｅ、ほか：　Ｎ、１
ｌｔＬｌｒ０．２７２：４１０〜４１／Ｉ　（１９７８
）］。

Ｄ、プラスミドｐｆ）８８／ＲＢＳＩＩプラスミドＤＤ
Ｓ８／Ｒ８Ｓｎ　（第５図）は、ＤＤＳ５／ＲＢＳＩ１
．３Ａ＋５Ａ　（第３図）に相当するが、Ｐ−とｃａｔ
遺伝子の間に、すＮ２５　　／。

ボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ、ついでマウスΔＴ−３０
００細胞系のジヒド［１葉酸リダクターゼのコード領域
［Ｃｈａｎｇ、　Ａ、　Ｃ，Ｙ、ほか：　Ｎａｔｕｒｅ
、　２７５　　：　　６１　７〜６２４　　（１９７８
）、Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｊ。

Ｎ、　　＆　　八ｔｔａｒｄｉ、　　Ｇ、：Ｇｃｎｅ、
　　２１　　：５９〜６３　　（１９８３）１および大
腸菌ファージラムダのターミネーターｔ　　［［、Ｓｃ
ｂｗａｒｚほか：前出］を含有寸る。

［、プラスミドｐＤＭ１．１ プラスミドｐＤＭ１．１　（第６図）は、Ｉｆ　ｉ　ｎ
ｄｍ／ＳａＩ　Ｉフラグメン１〜上に、カナマイシン抵
抗性をイＰ冒るトランスボゾンＴ「１５からのネオフィ
シホスホ１−ランスフェラーゼの遺伝子［Ｂｅｃｋ、　
Ｅ、ほか：Ｇｃｎｃ、　１９：３２７〜３３６（１９８
２）］、ついＴ：１　ａ　ｃ　Ｉ　遺伝子［１ａｒａｂ
ａｕｇｂ、　Ｐ、　Ｊ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７４　
：　７６５〜７６９　（１９７８）］と］ＸａＣ−リブ
レツ号をニ−ドするプロモーター突然素置１　ｑ［Ｃａ
１ｏｓ。

Ｈ，Ｐ、：Ｎａｔｕｒｃ、　　２７／ｌ　　：　　７６
２〜７６５　　（１９７８）１をイーする。ざらに、ｌ
）ＤＭｌ、１は大腸菌内での複製と安定な組積に必要な
情報をもつプラスミドｐＡｃＹｃ１８４領域［Ｃｈａｎ
ｇ、　Ａ、　Ｃ。

Ｙ、　＆　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、　：　Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３４　：　１１４１〜１１５６
　（１９７８）］を含石づる。

ｙ４４ 少 Ａ、ｌ皇理 プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＣＡＴ１ｐＥＮＶ　（
８０）　およびｐＥＮＶ　（８０）−１）　１１１”　
Ｒは、それぞれプラスミドｌ）　ｌ）　Ｓ　５　／Ｒ［
３ＳＩＩ、３Ａ＋５Ａ、ｐＤｓ６／ＲＢＳＩＩ。

３Δ１５ΔおＪ二びｐＤｓ８／ＲＢＳ１［のＢ　ａ　ｍ
　Ｌ（Ｉ部位に、ＥＮＶ　（８０）遺伝子を含有するｐ
Ａ−ＥＮＶ−２０の３　ａ　ｍ　ＨＩ−フラグメン１−
を挿入することにＪ：って構築された（第７図）。

トの単離 ＥＮＶ　（８０）遺伝子を含有ＪるｐＡ・−ＥＮＶ（８
０）−２０のＢ　ａ　ｍ　＋−４Ｉ−フラグメント１　
゛ｐｍｏ　ｌ　ｅを上述のようにして単離し、１０μｌ
のＴＥ−ｖｉＩ液＜１０ｍＨ１−ＲＩ　Ｓ−１−（ＣＩ
、　ａｌ１７．６およＵ　１　ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）
に再懸濁した。

３つの別の実験で、プラスミドｔ）ＤＳ５／ＲＢＳＩＩ
、３Ａ＋５Ａ、ｐＤｓ６／ＲＢＳＩＩ。

３Ａ＋５ΔおよびｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩの３９１０１Ｑ
を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで完全に消化した
。６５℃で７分間インギニ１ベートして酵素を不活性化
したのら、フェノール抽出ついでニーデル処理して蛋白
質を除去した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。ＤＮ
Ａを、５０ｍｔ４Ｔｒｉｓ／　ＨＣ１および１単位のウ
シ小腸ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ　、　Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ、　Ｈａｎｎｈｅｉｎ）を含むｐ］１８の緩衝液
４２μｌに再懸濁し、３７℃で１時開インＶユベートシ
た。酵素を熱不活性化したのち（上記参照）、蛋白質を
除去しく上記参照）　、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ
た。ＤＮＡを再懸濁したのＩう、線状化したプラスミド
ＤＮＡを１％アガロースゲル中電気泳仙、ＮΔ４５股上
電気伝達、ついで溶出、エタノール沈殿、ＴＥ−緩！Ｉ
ｉｊ液（上記参照）　ｒｔ＋　ｉＱ懸濁にＪ、り単離し
た。プラスミドｐｉ）８５／Ｒ１３ＳＩ１．３Ａ＋−５
Ａ、　ｐＤＳ６／＋＜　１３Ｓ　ｎ　　３Δ４−５　Ａ
およびｐＤｓ８／ＲＢＳＩＩの線状、脱リン酸化１）Ｎ
Ａｏ、５〜１．５ｐｍｏｌｅ　／ｆｉ得られた。

３つの別の実験でプラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳＩ１．３
Ａ＋５Ａ、ｐＤｓ６／ＲＢＳＩＩ。

３　Ａ　＋　５八およびｐ　Ｄ　Ｓ　８　／　ｌ’＜　
Ｂ　Ｓ　ＩＩの単離されたＤＮＡ０．０２５μｇｌｏｌ
ｅを、リゲーシＢ　ン緩ｍ液中２４μｌ容ωで、単離ｅ
ｎｖ　（８０）遺伝子０　、０５　ＤＩＯＩＯおよびＴ
４−ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｃｒ、　Ｈａｎ
ｎｈｅｉｍ）　１　、８単位と２０℃で６１１５間イン
４ニュベー卜し、ついで６５℃で７分間インキュベート
して酵素を不活性化した。

ＤＤＭｌ、１を含む大腸菌Ｍ　１５　（Ｃａ　Ｃ１２コ
ンビ−テント）を適当な条件下に、リゲー１へされたｔ
）　Ｎ　Ａで形質転換した。１００μ「／ｄのアンピシ
リンおよび２５μ９／ｍｌｌのカッ−マイシンを含むｌ
　Ｂ−プレート上、３７℃で形質転換体を選択したのら
、１００μｇ／ｄのアンピシリンおよび２５μ９／ｍｌ
！のカナマイシンを含むＬＢ−メジウム中で培養物を生
育させた。これらの培養液からのＤＮＡを４ａ準操作を
用イテ１１１　！１１し、ｅ　ｎ　Ｖ（８０）　遺伝子
の存在およびこの遺伝子の方向性を制限酊索エンドヌク
レアーピＸ　ｈ　ｏ　Ｉ　Ｊ３よび１１ｉｎｄｌｌｌを
用いる制限解析ににって解析した。

ｃｎｖ　（８０）遺伝子を正しい方向で含有するプラス
ミドｐＤＳ５／ＲＢＳＩ１．３Δモ５Ａ。

ｐＤＳ６／ＲＢＳＩＩ、３Δ＋５ΔおよびｐＤＳ８／Ｒ
ＢＳＩＩをぞＩｔ−ＰｔＬ、ｐＥＮＶ　（８０）−ＣＡ
Ｔ、ｐＥＮＶ　（８０）おにびｐＥＮＶ　（８０）−Ｄ
　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒと命名した（第７図）。

例５ 缶白？’［ＦＮＶ（８０）−ＣＡＴ、ＥＮＶ　（８０）
−Ｄ　ＨＦ　ＲＪ５　Ｊ：びＥＮＶ　（８０）のＡＩＤ
Ｓ患者八、原へ！ｐ ｅｎｖ（８０）遺伝子がＡＩＤＳ患者の抗体ににって特
異的に認識されるエピト−プを］−ドすることを示すた
めに、蛋白質ＣＡ’ｒ”。

１）ＩＩＦＲ”　、　ＥＮＶ　（８０）　−ＣＡＴ、　
ＥＮＶ（８０）−ＤｔｌＦＲ，ｊＬに（Ｊ’ＥＮＶ　（
８０）’ｉ：人腸人肉菌内生させ、ナイＯン膜に移し、
適当な血清と反応させた。

プラスミドｐＤＭｒ、１を含有する大腸菌Ｍ１５細胞を
ρ１〕Ｓ５／ＲＢＳ■、３Ａト５Δ。

Ｄ　Ｄ　Ｓ　６　／　Ｒｔ３　Ｓ　ＩＩ　、　３　Ａ　
＋　５　Ａ　、　ＯＤ　Ｓ　８　／Ｒ［３ＳＩ１．ｐＥ
ＮＶ　（８０）−ＣＡＴ、ｏＥＮＶ（８０）　−Ｄ　Ｉ
−Ｉ　Ｆ　ＲまたはｐＥＮＶ　（８０）のいずれかで形
質転換し、ついで１００μｇ／ｄのアンピシリンと２５
μ９／ｒｒｄｌのカナマイシンを含有するＩＢ−メジウ
ム中て゛１介させた。６００　ｎｍでの光学密度が約０
．７の時点′ｃ１ｇ谷液を分割し、−ｆＪはそのままイ
ン：１コベートしく非誘導リンプル）、他７５’　＋よ
最終ｉ１ａｌｆｆ２ｍＭになろＪ−うにＩ　ＰＴＧを加
えた１１リンプル）。さらに６時間インキュベー１−シ
たのら、遠心分離によって細胞を収穫し　Ｉこ　。

Ｃ大腸菌内でＨ４１した蛋白質の可視化Ｊ８Ｍ　Ｗｔ　
ｂ　Ｏｕ　１容１ｄ　／Ｊ’　ラ（７）細胞を、３％Ｓ
ＤＳ。

３％β−メルカプ］−エタノール、２０％グリヒロール
ＪｊＪ、び１２５＋ａＨ−１−１でＩ　Ｓ　−１−Ｉ　
ＯＡ　、　Ｄ１１６．８を含有するリンプル緩衝液に懸
濁した。リンプルを５分間煮沸し、氷−１−で冷７Ｊｌ
　ｕ、１２，０００Ｘ！Ｆで３０秒問遠心分離し、Ｕ、
　ＬａｅｍｍｌｉＩＮａｔｕｒｃ、２７７　：　６８０
”□６８２　（１９７０）］記載のｈ−法に従ってＳＤ
Ｓ含有ポリアクリルアミドゲル（１２，５％アクリルア
ミド、アクリルアミド／ビスアクリルアミド比３０１０
．８）中電気泳動にイ・１した。蛋白質をラーマシーブ
リリアン１−プルＲ−２５０で染色後、結合しなかった
染料をグルから除去した。非誘導Ｊ３Ｊ、び誘導条件下
の蛋白質産生を比較すると（第９ａ図参照）、調節可能
プロ［−ター／オペレーター要素ＰＮ２５ｘ１０のコン
１−ロール下に合成された蛋白質量はＩ　Ｐ　’ｌ−Ｇ
の（ｒ扛下に著しく増大づることが明らか−（゛ある。

Ｄ抗体と産生蛋白質との反応 誘導リンプル（Ｂ参照）をＣに記載のようにして電気ｖ
ｋ動に付した。非染色ゲルをナイロン膜（Ｐ△し、Ｆ１
ａ５ｃｌ＞で覆った。この→ノンドゥイツチをついで２
枚の濾紙で覆い、移送緩衝液（２５ｍＨＴＲｌ５　−　
Ｆ１ｃｊ！、　　　ｐ１１８．０　　、　１９０１１Ｈ
グリシン、２０％メタノール）を満たした移送’１　（
Ｂｉｏｒａｄ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ）に置き、ついで
蛋白質を股上電気泳動に付した（２５Ｖ／ｃｍ、４℃で
１２時間）。移送後、膜を２０％胎仔ウシつ清含右含有
Ｓ−緩衝液（１２５ｍＨＮａＣ１！。

１７．５ｍＨＮａ　　ｔｌＰｏ　　、２．５ｍＭに１１
２ＰＯ４）中、３７℃で２ｂ間ブロックした。

ついで、０．３％Ｔｗｅｃｎ　−８０、１０％正常Ａ７
キ血ｉ／＋　＋Ｊｊ　Ｊ、び２０％ウシ胎仔血Ｍｊ含右
Ｐ　１３　Ｓ−緩衝液中２０℃Ｃ１時間インＶユベー１
〜したのら、膜を３７℃で４５分間インキュベー１〜し
、ついで同じ緩衝液にさらに、Ｇ、　ｌｌｕｎｓｍａｎ
ｎ博士（Ｄｅｕｔｓｃｈｃｓ　　Ｐｒｉｍａｊｃｎｚｃ
ｎｔｒｕｍ　　Ｇｕ＋１１．　　Ｇ６ｔｔｉｎｇｃｎ　
　）から供りされた患名血清１３３０の１：２００希釈
液を加えて、４℃で１６１Ｌ’ｉ間インキコベートした
。膜を次に、０．３％ｒｗｃｃｎ−８０含有ＰＢＳ緩廟
液で、各洗浄工程ごとに緩衝液を変えながら、５、１０
　ｊ５よび１５分間、室温で洗浄した。次に、膜を、０
．３％Ｔｗｅｃｎ−８０、１０％ウシ胎仔血ｒｆｒＪ３
Ｊ：びビＡチンとカップリングざセｌこヤギ抗ヒ１−Ｉ
ｑＧ（＾ｍｃｒＳｔ＋ａｍ、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
Ｕ）　１　：　２００希釈液含右ｒ’　［３Ｓ−緩衝液
中、室温で２時間イン：コベートした。上述の３回の洗
浄をくり返したのら、膜を０．３％Ｔｗｃｃｎ−８０，
１０％ウシ胎仔血ｒ＋’１Ｊｊよびストレブタビジンー
ビブオンーパーオキシダーＬ’（八ｍｅｒｓｂａｍ、Ｂ
ｒａｕｎｓｃｈｗｃｉｏ）１　　二　３００希釈液含右
ＰＢＳ−緩挿ｉ液中、室温で１時間イン：コベート−シ
た。ついて・膜を０．３％Ｔｗｅｅｎ　−Ｂ０含右Ｐ　
［３Ｓ−緩衝液中で５分間２回洗ｒｐシ、ざらにＰ［３
Ｓ−緩衝液中で５分間５回洗浄したのら、膜を５ＯＲ認
のＰ　１３３−緩衝液にとった。抗体と反応した蛋白質
バンドを、１０　ｎｒｆｔの４−り［１０−１−犬７１
・−ル（メタノール中３　ｍｇ／　ｍｌ）と５０μｍの
ご３０％過酸化水木を加えて可視化した。膜を水中にと
って反応を停止させ、ついでゲルドライア−（７ａｂｏ
ｎａ、　［３ａｓ　ｃ　Ｉ　）で乾燥した。１」べての
洗浄およびイン−１ユベーシ］ンはシェーカークブレッ
ｈ　（Ｇ　Ｆ　Ｌ　、　Ｂｕｒｇｗｅｄｅｌ　）上Ｆ　
ｆｉ　ツタ。

第９ｂ図は、［Ｅ　Ｎ　Ｖ　（８０）　遺伝−Ｔ　ｋ：
　に　７）　テコードされる８０個のアミノ酸を含む蛋
白質のみが、ＡＩＤＳ患者の抗体ににって認識されたこ
とを示している。。

【図面の簡単な説明】

図中の略シ〕は次のとＪ３っである。 Δ、　１３．　Ｅ、　Ｌｌ、　ｌ〕、　Ｓ、　ＸおＪ、
びｘｂはそれぞれ、エンドヌクレアーｔ４Ａａ　ｔＩｌ
、Ｂａｍ１−Ｉ　Ｉ。 ＥｃｏＲｌ、、１ＩｉｎｄｌＩ１．ＰｓｔＴ、５ａｆＩ
。 Ｘ　ｉｌ　ＯｉおよびＸａｂＩの制限部位を示し、口コ
は遺伝子ｂｚａ、　！ａｃＴおよびｎ　ｅ　Ｏのプロモ
ーターを、 巨巨目は遺伝子ｂ　ｌ　ａ　、　Ｃａ　ｔ　、　ｎ　Ｏ
Ｏおよび１ａｃＩのリポソーム結合部イＱを、 工■コはターミネータ−１゜ｊｊ　Ｊ、びＴ１を、［］
ｍは調節可能なプロモーター／オペレーター要素ＰＨ２
５”　１０を゛ 口＝コはＲＢ　Ｓ　Ｉ［およびｒ＜１３ｓＩ１．３△＋
５Ａリボソ−ｌ＼結合部位を、 −−＞はこれらのリポソーム結合部位の］ン１へ［１−
ル下の：１−ド領域を、 ニー→はＯＮΔ２Ｉｌ製（ｒｅａｌ、　）　Ｉ；必要な
領１ｘｌヲ、■静は、ジヒドロ葉酸リグククーピ （ｄＭｒ）、クロラムフ■二］−ル７セブルトランスフ
］ニラ−ぜ（ｃａｔ）、β−ラクタマーピ（ｂｌａ）　
、Ｉａｃリブレツ”ｊ−（Ｊ！ａｃＩ）およびネオマイ
シンホスホｌ−ランスフェラーゼ（ｎｅｏ）の］−ド領
域を、 区で２はｅｎｖ　（８０）−遺伝子を表す。 第１図は、合成遺伝子を構成Ｊる合成ＡリゴヌクレＡブ
トフラグメン１〜である。 第２図は、プラスミドｐＡ−ＥＮＶ−２０の構築の概略
を図式的に示した図である。ノ１１一部には合成Ａリボ
ヌクレオチドの４つの単位への配置とこれらの遺仏了ブ
ＤツクのｐＵＣ−プラスミド中へのサブクローニングを
承り。左下部および右上部は、ｅｎｖ　（８０）　−遺
伝子をＢ　ａ　ｒＴｌ　ｌ−Ｉ　Ｉフラグメントして含
有するプラスミドＤＡ−ＥＮＶ−２０の配置を承り。 ■］モーター／オペレーター要素Ｐ　　＊　、リボＮ２
５　　／。 ソーム結合部位ＲＢＳＩＩ、３△＋５Δ、ｃａＬ遺−第
３ｂ図中、第３ａ図に示した制 限酵素部位には上線を施し、２１個の付加アミノ酸をＮ
末端に有するクロラムフエニコールア廿デル１−ランス
フェラーゼ（ＣＡＩ”＊）をコードするＲＢＳＩｌ、３
△＋５Ａ制御下領域には下線を施す。 ざらに、ＤＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５へのｏ　（３
Ｒ３２２部分を図式的に示し、ｐＢＲ３２２リスクレオ
ヂド配列を示Ｖ番目を付記した［５ｕｔｃｌｉｒｒｃ、
　Ｊ、　Ｇ、　：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒ
ｂｏｒ　５ｙＩＩｉｐ。 Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、、４３　：　７７〜９０　（
１９７９）　］。 なプロモーター／オペレーター要素ＰＮ２５　”　／。 、リポソーム結合部位Ｒ［３ＳＩ１．３Ａ＋５Δ、ター
ミネータ−ｊ、ｃａｔ遺伝遺伝子上３ターミネー中、第
１′ｌａ図にし示した制限Ｊノドヌクレアーゼ８６位に
は上線を、ＲＩ３ＳＩ［，３Ａ＋５へのλｉ制御下にあ
る］−ド領域には下線を施した。ざらにｐＤＳ６／ＲＢ
ＳＩ［，３Ａ＋５ΔのｏＢＲ３２２部分を図式的に示し
、ｐＢＲ３２２のヌクレオヂド配列に付された番目をイ
・」記した［　５ｕｔｃｌｉｆｆｃ。 Ｊ、Ｇ、：前出〕。 第５ａ図はプラスミドｐ　Ｄ　Ｓ　Ｂ　／　ＲＢ　Ｓ　
Ｉを図／Δベレーター要素Ｐ　　本　、リポソーム結合
８２５　　／。 部位ＲＢ　Ｓ　ＩＩ、ｄｈｆ’ｒ−７伝子、ターミネ−
１−ｔ　　、ｃａｔ遺伝子およびターミネータ−Ｔ１２
１図に示した制限Ｔンドヌクレアーピ部位には下線を、
１１１３　Ｓ　ＩＩの制御下にありぞのＮ、に喘の６個
の付加アミノ酸とジヒドロ［ｆリダクタ−ぜ（［〕ＨＦ
Ｒ”）を＝］−卜する領域には下線をイ・１した。さら
に、ｐ　Ｄ　Ｓ　８　／　Ｒ１３Ｓ　ＩＩのｐ　Ｂ　Ｒ
３２２部５）を図式的に示し、ｐＢ　Ｒ３２２のヌクレ
Ａブト配列に付されに番目を付記した（Ｓｕｔｃｌｉｆ
ｆｅ。 Ｊ、Ｇ、：前出）。 した制限エンドヌクレアーピ部位には上線を、ネオマイ
シンポスホトランフエラー１４　（ｎ　ｅ　Ｏ）おＪ、
びｌａＣリプレッサー１ａＣＩ）をコードずる領域には
下線をイＮ１シた。 第７図は、プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ｃＡＴ、ｐ
ＥＮＶ　（８０）およびｐＥＮＶ　（８０）−Ｄ　Ｉ−
Ｉ　Ｆ　Ｒの構築の概略と図式的に示した図である。蛋
白質ＥＮＶ　（８０）−ＣＡＴ、ＥＮＶ　（８０）およ
びＥ　Ｎ　Ｖ　（８０）　−Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ｌ又をコ
ードする領域は矢印で示ず。 第８図は蛋白７ｆｔＥＮＶ（８０）の全アミノ酸配列を
示１図である。蛋白質ＥＮＶ　（８０）−ＣＡ　Ｔ　ｒ
３　、Ｊ：　Ｕ　Ｅ　Ｎ　Ｖ　（８０）　−Ｄ　ＨＦ　
ＲニツイＴは最初の１００個のアミノ酸のみを示したく
全配り１１については、第３図、第５図および第７図参
照）。 第９図は、ＡＩＤＳ患者の抗体によるＥＮＶ（８０）　
　　−ＣＡＴ、　　　ＥＮＶ　　（８０）　　−Ｄ　　
トＩＦＲおよびＥＮＶ　（８０）の認識を示す図である
。 第９ａ図は、ｐＤＭｌ、１を右する大腸菌Ｍ２Ｓ中での
蛋白質の合成およびさらにプラスミドｐＤｓ５／ＲＢＳ
Ｉ１．３Ａ＋５Ａ　（レーン１）、ｐＥＮＶ　（８０）
−ＣＡＴ　（Ｌ／−ン２）、ｐ　Ｄ　Ｓ　８　／　Ｒ［
３Ｓ　Ｕ　（レーン３）、ｐＥＮＶ（８０）−ＤＩ−Ｉ
ＦＩ’＜　（レーン４）、ｐＤＳ６／ＲＢＳＩＩ、３△
＋５△（レーン５）またはＤＥＮＶ　（８０）（レーン
６）の非誘導または誘導条件下（例５参照）での産１を
電気泳動によってモニタリングした結果である。第９ｂ
図は相当づる免疫ブ０ットを示−Ｊ　、　Ｍは蛋白質１
ナイズマーカーを示し、分子量を記した。 第１０図は平行オリゴヌクレオブト合成を行うための装
置である。

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の誘発および／ま
   たはＡＩＤＳ抗体との反応が可能な次式【アミノ酸配列
   があります】： I で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは
   そのフラグメントまたは上述のポリペプチドがアミノ酸
   置換された免疫原性および／もしくは抗原性ポリペプチ
   ド
2. （２）式 I のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド
3. （３）式 I のポリペプチドのフラグメントである特許
   請求の範囲第１項記載のポリペプチド
4. （４）次式 【アミノ酸配列があります】：II で表されるアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第３項
   記載のポリペプチド
5. （５）特許請求の範囲第２項から第４項までのいずれか
   に記載のポリペプチドがアミノ酸置換された特許請求の
   範囲第１項記載のポリペプチド
6. （６）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか
   に記載のポリペプチドが原核生物蛋白質または真核生物
   蛋白質に融合した融合ポリペプチド
7. （７）原核生物蛋白質または真核生物蛋白質は担体蛋白
   質である特許請求の範囲第６項記載の融合ポリペプチド
8. （８）担体蛋白質は容易に精製可能な蛋白質である特許
   請求の範囲第７項記載の融合ポリペプチド
9. （９）担体蛋白質は大腸菌クロラムフェニコールアセチ
   ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）である特許請求の範囲
   第８項記載の融合ポリペプチド
10. （１０）ＥＮＶ（８０）−ＣＡＴである特許請求の範囲
    第９項記載の融合ポリペプチド
11. （１１）担体蛋白質はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ
    ＦＲ）である特許請求の範囲第８項記載の融合ポリペプ
    チド
12. （１２）ＥＮＶ（８０）−ＤＨＦＲである特許請求の範
    囲第１１項記載の融合ポリペプチド
13. （１３）アミノ末端にさらにメチオニン残基を有する特
    許請求の範囲第１項から第１２項までのいずれかに記載
    のポリペプチド
14. （１４）細菌によつて産生される特許請求の範囲第１項
    から第１３項までのいずれかに記載のポリペプチド
15. （１５）大腸菌によつて産生される特許請求の範囲第１
    項から第１３項までのいずれかに記載のポリペプチド
16. （１６）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコ
    ードする合成遺伝子
17. （１７）発現ＤＮＡ配列に発効的に結合した特許請求の
    範囲第１６項記載の合成遺伝子からなる発現ベクター
18. （１８）グラム陰性および／またはグラム陽性細菌内で
    複製可能なプラスミドである特許請求の範囲第１７項記
    載の発現ベクター
19. （１９）大腸菌株内で複製可能である特許請求の範囲第
    １８項記載の発現ベクター
20. （２０）枯草菌株内で複製可能である特許請求の範囲第
    １８項記載の発現ベクター
21. （２１）プラスミドｐＥＮＶ群の１員である特許請求の
    範囲第１８項および第１９項のいずれかに記載の発現ベ
    クター
22. （２２）ｐＥＮＶ（８０）である特許請求の範囲第２１
    項記載の発現ベクター
23. （２３）ｐＥＮＶ（８０）−ＣＡＴである特許請求の範
    囲第２１項記載の発現ベクター
24. （２４）ｐＥＮＶ（８０）−ＤＨＦＲである特許請求の
    範囲第２１項記載の発現ベクター
25. （２５）特許請求の範囲第１８項から第２５項までのい
    ずれかに記載の発現ベクターを有する細菌形質転換体
26. （２６）大腸菌株である特許請求の範囲第２５項記載の
    形質転換体
27. （２７）大腸菌Ｍ１５株である特許請求の範囲第２６項
    記載の形質転換体
28. （２８）枯草菌株である特許請求の範囲第２５項記載の
    形質転換体
29. （２９）ワクチンの構成成分としての特許請求の範囲第
    １項から第１５項までのいずれかに記載のポリペプチド
30. （３０）抗原としての特許請求の範囲第１項から第１５
    項までのいずれかに記載のポリペプチド
31. （３１）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドを製造するにあたり、特許請
    求の範囲第１７項から第２４項までのいずれかに記載の
    発現ベクターで細菌宿主を形質転換し、その形質転換体
    を上記ポリペプチドの発現に適当な生育条件下に培養し
    、そのポリペプチドを単離することを特徴とする方法
32. （３２）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドを公知の様式で用いることを
    特徴とするＡＩＤＳウィルスに対する抗体の定量方法
33. （３３）ウェスタン・ブロッティング解析を用いること
    を特徴とする特許請求の範囲第３２項記載の方法
34. （３４）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドを固相上にコーティングし、
    サンプルと接触させ、洗浄後に酵素標識非ヒトＩｇＧと
    接触させるＥＬＩＳＡ法を用いることを特徴とする特許
    請求の範囲第３２項記載の方法
35. （３５）二重抗原法を用いることを特徴とする特許請求
    の範囲第３２項記載の方法
36. （３６）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載の蛋白質に対する抗体を用いることを特徴と
    するＡＩＤＳウィルスの定量方法
37. （３７）サンプル中の抗原と特許請求の範囲第１項から
    第１５項までのいずれかに記載のポリペプチドの標識型
    を、特許請求の範囲第１項から第１５項までのいずれか
    に記載のポリペプチドに対する抗体とコンピートさせる
    特許請求の範囲第３６項記載の方法
38. （３８）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    かに記載のポリペプチドに対する２種の抗体を用いてサ
    ンドウィッチ法を実施する特許請求の範囲第３６項記載
    の方法
39. （３９）一方の抗体は固相上に結合させ、他方の抗体は
    標識する特許請求の範囲第３８項記載の方法
40. （４０）２種の抗体は異なる動物種で産生される特許請
    求の範囲第３８項記載の方法
41. （４１）２種のモノクロナール抗体を使用する特許請求
    の範囲第３８項記載の方法
42. （４２）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドと生理学的に許容される担体
    とを含有するワクチン
43. （４３）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドに対して産生される抗体
44. （４４）モノクロナール抗体である特許請求の範囲第４
    ３項記載の抗体
45. （４５）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドの感染防御免疫感作ワクチン
    の製造のための使用
46. （４６）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドのＡＩＤＳウィルスに対する
    抗体の製造のための使用
47. （４７）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドの、ＡＩＤＳウィルスの存在
    に関するヒト血液試験のための使用
48. （４８）特許請求の範囲第３１項記載の方法によつて製
    造された特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチド
49. （４９）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドを容器中に含有するＡＩＤＳ
    ウィルスに対する抗体の測定用試験キノト
50. （５０）特許請求の範囲第１項から第１５項までのいず
    れかに記載のポリペプチドによつて誘発させるＡＩＤＳ
    ウィルスに対する抗体を容器中に含有するＡＩＤＳウィ
    ルス測定用の試験キット