JPS62244393A - Ｈｔｌｖ−３ｇａｇ／ｅｎｖ遺伝子蛋白質の発現と精製 - Google Patents

Ｈｔｌｖ−３ｇａｇ／ｅｎｖ遺伝子蛋白質の発現と精製

Info

Publication number
JPS62244393A
JPS62244393A JP62082197A JP8219787A JPS62244393A JP S62244393 A JPS62244393 A JP S62244393A JP 62082197 A JP62082197 A JP 62082197A JP 8219787 A JP8219787 A JP 8219787A JP S62244393 A JPS62244393 A JP S62244393A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
antibody
dna
env
recombinant vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP62082197A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2625118B2 (ja
Inventor
ロバート　ミッチェル　クロウル
ダル　ヤング
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPS62244393A publication Critical patent/JPS62244393A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2625118B2 publication Critical patent/JP2625118B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
    • C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/974—Aids related test
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は後人性免疫不全症候群＜ＡＩＤＳ＞の病因物７
＋ｊである）１丁＋、−Ｖ　−［Ｉ［ウィルスの核蛋白
質（〔１ａ　ＣＪ　）　Ｊ３　ｃｌ：びエンベロープ蛋
白質（ｅｎｖ）から成るｇａｇ／ｅｎｖと命名した蛋白
質に関するものである。本蛋白質は有機合成法により、
または必要な遺伝子配列を適当なりＮＡベクターを介し
て適合した単細胞生物に挿入する紺ｊりえ１）　Ｎ　Ａ
技術を利用することにより生成される。
本発明はさらにｇａｇ／ｅ「）ｖ蛋白質の単離Ｊ３よび
精製そして本蛋白質を利用してヒト面清或いは他の生体
試料中のＡＩＤＳ抗体またはウィルスの検出−１及びに
ＡＩＤＳに対して人類を免疫予防防り１１する方法に関
する。
１９８５年にほとんど８．０００人の人がＡＩＤＳを有
すると診断され、その数は４実に１狩している。１９８
６年にはさらに１５．０００人の人が新たにＡ　Ｉ　Ｄ
　Ｓと診断されると考えられ、１９８７年にはその数は
さらに２倍となるであろう［Ｎｅｗ　Ｙｒｏｋ　Ｔｉｍ
ｅｓ　Ｍａｇａｚｉｎｅ　、　１９８６年３月２日、４
２頁］。ＡＩ　Ｄ　Ｓは体の免疫系にス・１ｉｌる影響
の二次作用として重度の日和見感染が始まることが特色
である［Ｇｏｔｔｌｉｅｂう、Ｎｅｗ　［ｎｇ、　Ｊ。
Ｈｅｄ、　３０５巻、１４２５頁（１９８１年）本疾患
は男性同性愛者、血液製品を注射した患者、薬物静注常
用各およびハイチおよび中央アノリカ出身となどに兇つ
かっている［　Ｐｉｏｔら、　Ｌａ１ｌＣＯｊ。
１１巻、６５頁（１９８／１年）」。
原因物質はＡＩＤＳの疫学パターンが伝染病のパターン
と一致することよりウィルス性であるととえられた。少
＜Ｅ　くとも３種のレトロウィルスが何人からのＡＩＤ
Ｓ患者の培養Ｔ−細胞またはへ１１〕Ｓの危険性のある
人の白血球細胞がら単離されている。リンパ腺症関連ウ
ィルス（ＬΔＶ）と呼ばれる新しいヒトし［・ロウィル
スが発売され、そのｆ’ｌ状はＡｌｒ）Ｓの病因的役割
と一致していた。
このウィルス１よりンパ腺症患者がら単離され、従って
そのように命名されたｉ　Ｈｏｎｔａｇｕｉｅｒら。
１１１Ｊｍａｌｌ　ｌ’−ｃｅｌｌ　ＬＱｔｌｋＯＩＩ
Ｉｌａ　／　１．ｙｍｐｈｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ、　Ｒ。
Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　ら＆、ｆｆｉ　、　（二ｏｌｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　１ｌａｒｌ）ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
、　３６３−３７０ｕ、Ｃ（１９８４年）他のヒトレト
ロウィルス、具体的にはヒトＴ−細胞白血病／リンパ腫
／リンパ趨向性ウィルスの丁型Ｉ　Ｐｏ１ｅｓｚら、　
　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　　＾ｃａｄ　Ｓｃｉ、　　１１
．ｓ、八、。
７７さ、７４１５貞（１９８０年）］および■型［Ｐｆ
ｌｉＯ３Ｚら、　　５ｃｉｅｎｃｅ　　２２４巻、４９
７頁　（１９８４年）］の二つの１ノ゛ブグループ、も
単離されている。またもう一つのＡＩＤＳ−関連レトロ
ウィルス（△ＲＶ）と呼ばれるウィルスも原因物質とし
て提案されでいる（＋−ｃｖｙら、　５ｃｉｅｎｃｅ　
２２５巻。
８４０頁（１９８４年）］。ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｆｆ［お
よびΔＲＶレトロウィルスの両者共１−　Ａ　Ｖと類似
した生物学的および血清疫学的性質を示す［Ｌ（！ｖｙ
ら。
上述ＨＰｏｐｏｖｉｃら、ト述］。従って少なくとも三
種のレトロウィルスがＡＩＤＳの病因物質として考えら
れてきた：ｌＡＶ、ＡＲＶおよびｌ−１−ｒ　Ｉ−Ｖ−
ＩＩＩ　’ｒ−ある。本明細用ではこれらのウィルスを
まとめ−（Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓウィルスと呼ぶ。トＩ　Ｔ　
ｌ−Ｖ−１ががこのグループの原型であるので、ｒ　Ｉ
」Ｔ　Ｌ　Ｖ　−］ウィルスの蛋白質の配列に対応する
穴原決定囚子」という表現は実際には全のＡＩＤＳウィ
ルスの蛋白質の配列を意味することになる。
ＡＩＤＳの真の病因物質を決めるのが難しい一つの理由
はいろいろなし１−ロウィルス抗原がＡｌＯ３患者の血
清試料と交叉反応を示すためであった。例えば、ＡＩＤ
Ｓ患者の血清試料は１−１　’ｌ’　ｌ　Ｖ　−１［：
　Ｆｓｓｅｘら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２０巻、８ミ５
９貞（１９８３年）］Ｊ３よびｌ−１−１’　ｌ−Ｖ−
ＩＩＩ（５ａｒｎＣＩａｄｌｌａｒａｎら、　　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　　、　　２２４ｉ、　　５０６ｊ’＋　（１
’：）　Ｆ３　／１年）Ｊの両名の抗原と反応すること
が示されＣいる。Ｉ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖの１ンベローブ遺
伝子産物は成人ニー細胞白血病患者の血γ＾の抗体と交
叉反応する抗原性を示した［　Ｋｉｙｏｋａｗａら、Ｐ
ｒｏｃＭａｌｌ　　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ｌＩ　　
Ｓ　　Ａ　　、　　８　１　　巻、　　６２０２　　負
（’＋　９８４年）］。成人「−細胞白血病（△１−Ｌ
）と後人性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）とはＨｒ　Ｌ　
Ｖ−Ｉが「細胞の非制御増殖を特徴とするＴ細胞悪性を
起ｊ点にある。　Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓでは細胞増殖の代りに
細胞死滅が起る。事実、このＩ−１’ｒ　Ｌ　Ｖ−■の
細胞変性特質はこの疾患特有のし１−〇ウィルス起源を
最終的に決定りるのに重要であった。
ＡＩＤＳの病因物質はΔ１［）Ｓに悩む患者からＩｎ　
１ＩｉＩｌされたＡＩＤＳに特有イ５細胞変性し］・ロ
ウイルスに感染した耐性ヒト肝瘍Ｔ−・細胞株（Ｈｌ）
を使用することにより単離された。このウィルスを用い
て血清疫学的測定づるとＡｉｒ）Ｓと１−１１１−　ｖ
−ｍウィルス抗原に対する抗体の存在との間に完全な相
関があることがわかった［　Ｈ（Ｉｎｔａ（Ｊ（Ｉｉ（
！ｒら、上述：　Ｓａｒｎｇａｄｔｌａｒｉｌｎら、上
述；５ｃｈｕｐｂａｃｈら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４
　％、　５０３　’＋：１（１９８４４：）］。さらに
リンパ腺症候群の患者のおよそ８５％およびＡ　Ｉ　Ｄ
　Ｓ流行地域の無症候性男性同性愛者のかなりの割合が
ＨＴ　Ｉ　Ｖ−Ｉ［Ｉに対する抗体を血液中にｎ１るこ
とｂわかった。この事よりこれらのデータは１１　Ｔ　
Ｌ　Ｖ　−■がＡＩＤＳの主要／Ｚ病囚物′ａであるこ
とを示ず。
）−１−９ＩＩＩ胞株を用いてＡＩＤＳウィルスの１８
養に成功するまでＡＩＤＳウィルスの０１１　ＶＡＩＤ
Ｓ蛋白質は甲離され、特徴づけられ、或いは合成されて
なかった。これは主としてウィルスが細胞変性性で従っ
てウィルスを単１ＩｉｌＩすることが可能でなかったた
めであるｉ　Ｐｏｐｏｖｉｃら、上述］。
しかしこのウィルスの細胞変性効果に耐性なヒトＴ−細
胞株が発見されると、ＡＩＤＳプロウィルスＤＮＡの分
子クローニングも行なうことが出来た。
ヒト血ａおよび伯の生体試料のＡＩＤＳ診断のための迅
速かつ高感度な方法およびワクチンによる本疾患の予防
法の必要性は非常に大さい。実際には現６−使用できる
アッセイおよびテストは全て誤りが多い。事実Ｃｅｎｔ
ｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＩ
）　Ｃ）は現在使用されているテストはＨＴ　Ｉ−Ｖ　
−ＩＩＩに対する抗体の存在の有無のための血液検索に
のみ使用すべぎと古う。ＣＤＣはざらに現在使用できる
酵素結合免疫アッセイ（ＬＬＩＳＡ）７−スｉ〜は危険
度の高い住民の一般検索のためまたはＡＩＤＳの診断テ
ストとして使１１１１べさ・でないとまで古っている［
ＦｅｃｌｅｒａｌＲａｇｉｓｔｃｒ５０巻（４Ｂ）：９
９０９頁、１９８５年３月１２日 今：Ｌで用いられてきたＡＩＤＳテストの誤りはへ１１
〕Ｓの病因物質の特異的抗原蛋白質を用いてい４ｊいこ
とに依る。従来用いられた蛋白質はウィルス溶解物に起
因した。溶解物はウィルスに感染したヒト劃り即ち、ウ
ィルスを増殖させるのに用いた細胞、から調製している
ため、溶解物はウィルス蛋白質と共にヒト蛋白質を含有
している。
従ってウィルス蛋白質の純粋な抗原を調製するのは困難
であった。今まで使用された抗原はＶＡ陽性および偽隙
性の両方を誘導した［　Ｂｕｄ　１ａｎｓｋｙ。
Ｎａｔｕｒｅ、　３１２巻、５８３頁（１９８４年）］
。
このような溶解物蛋白質／ペプチドの使用に起因する誤
りはΔ１１つＳ抗体結合のためにＡＩＤＳ特異蛋白質以
外の蛋白質を実１１含まない成分を使用することにより
避けられる。実質的に純粋なＡＩＤＳエンベロープおよ
びコア蛋白質を抗原としＣ使用できる。
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１［１のエンベＩ］−ブおよびコア蛋
白質の両方共保存された抗原決定因子を有し、そのため
ＡＩＤＳウィルスの検索、診断および／またはワクチン
による予防を可能とする。そしてトＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−Ｉ
ＩＩに接触し、従ってＡＩＤＳに感染している危険性の
高い人またはかかつている人をその血液中のウィルス核
（コア）蛋白Ｓ１　（ａ　ａ　ｇ）および／またはエン
ベロープ蛋白質（ｅｎｖ）に対り゛る抗体の（ｊ−ｒ上
により１１）１定できる［　Ｓａｒｎｇａｄｌ＋ａｒ、
ｉｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２　／Ｉ巻、５０６頁（
１９Ｂ／１年） 血液また１、１他の生体試料中のＡｉｒ）Ｓウィルス自
身３またはその粒子の存在を検出する信頼できる敏感な
デス１〜が手に入る事〜ｂまた重要である。
Ｇ　ｒＯＯＪｌ　ｍ　ｉｌ　ｎら［Ｂｆｏｏｄ、６６巻
、７４２頁（１９８５汀）ＪはＡＩＤＳウィルスに対す
る抗体はＡ１１）Ｓ患者の血液中に必ず存在するとは限
らないと報告している。Ｇｒｏｏｐｍａｎらは一人のＡ
ＩＤＳｌ、１．！　Ｍとｂう一人の関連疾患（△１７Ｃ
）を検査し、抗（Ａ　Ｋ２　性テｊＪ６　ルカｌ−ｌ　
−ｒ　ｌ−Ｖ−Ｉｎ　カｔｒｓ　ｒ１テｅ　ｔｃ面液試
斜をｉ！ｆ　／、：。
最近、ＡＩＤＳ問題にも紺換えＤＮＡ技術が応用されて
きた。ト１　’ｌ’　Ｌ　Ｖ−ＩＩＩからのｅｎｖ逍伝
子の分子り自−ニングおＪ：び発現が報告されているｌ
Ｃｒｏｗｌ　ら、　Ｃｅ１ｌ、　４１巻、９７９１　（
１９８５年）　；　ＣＣ１１ａｎら、　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　、　３巻、９０５＋：ｒ　＜　１９ａ　
５年）　　］　。Ｄｏｗｂｅｎｋｏら［Ｐｒｏｃ　Ｎａ
ｔｌＡｃａｄ　ｓｃｉ　Ｉｌ、Ｓ、Ａ、　８２巻、７７
４８頁（１９８５年）］　は１−ＩＴＩ　ｖ−ｍの］ア
蛋白質（！−ｒ’　。
Ｃ０１１中で発現した。
そのような瑣伝子操作実験により、安全で信頼性があり
生産コストの低い精製ウィルス抗原が入手可能である。
しかし、ざらにイｊ利なことはｅｎｖおよびｇａＱの両
（Ｊｉ白′ビ丁に存在す°る抗原決定因子を右するウィ
ルス蛋白質を入手できる点である。そのようへ蛋白質は
△ｌＯ８抗体の検出に非常に強力な道具であり、高感度
の各種診断テストおよびＡＩＤＳウィルスに対するワク
チンの可能性の基礎となり桿る。
そこｒｑａＱ／ｃｎｖと命名し、ＨＴ　ｌ−Ｖ　−１［
［のｑａｃｉ蛋白質およびｌ−１−ｒ　Ｉ−Ｖ　−Ｉｆ
ｆ　ｅ　ｎ　ｖ蛋白質の少なくとｂ夫々一つの抗原決定
因子を有する新規蛋白質を提供し、ＡＩＤＳウィルスの
検索、診断および／またはＡＩＤＳウィルスに対するワ
クチンによる予防が可能となる。新規なＱａＧ／ｅｎｖ
蛋白質は第２図に示すアミノ酸配列の全てまたは一部分
、或いは機能的にそれと同等なもので示される。
本発明はさらに本発明の（ＪａｃＪ／ｅｎｖボリベブブ
ドをコードづ゛る必須Ｉ）ＮＡ、そのようなりＮＡを含
む紺換えベクターおよび本発明のＱａＱ／ｅｎｖ蛋白質
を組換えＤＮＡ技術にＪ：り生産するのに有用な単細胞
生物、さらにそのようなりＮＡ配列、紺換えベクターお
よび１１１綱胞生物の調製方法をも提供１”る。さらに
、本発明のりａＱ　／　ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質の発現および
単離のための方法も記載している。このようにして生産
した（Ｊ　Ｑ　Ｃ’）　／　ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質は本発明
による方法により多くの・ｐな免疫手法に利用される。
診ｐ７ｉ桑としての使用により、ｇａｇ／ｅｎｖ蛋白質
はヒ］・血清または涙、精液、膣分泌液および唾液のよ
うな４体液中のＡＩＤＳウィルスに対する抗体の存在を
検出するのに利用できる。本漬白負は均ｒ：１に得られ
るため過去における比較的不純なＮ　’ｌ’　ｌ　Ｖ−
１［［ウィルス蛋白質に基づく診断藁を使用した時に悩
む非特異的反応の問題は除去できる。
（Ｊ　ｆ−１（Ｊｌｏ　ｎ　Ｖ蛋白質を免疫原として用
いるとそこに含まれる抗原性決定因子に対する抗体を初
物中で生産する。そのにうな抗体は適当に標識したｇ　
ａ　ｇ７ｅ　ｎ　ｖ蛋白質と結合り−ることにより、ヒ
ト血清中または涙、精液、膣分泌液および唾液のような
他の生体液中の）Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｌｌウィルスの
存在を検出するための放射免疫アツセーｒ（ＲＩＡ＞ま
たは酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用される。こ
れらの方法により検出される粒子（または断片）はウィ
ルスコアまたはエンベ［］−ブ蛋白質の断片である。
適当なワクチン製剤への混合により、本発明のＱ　ａ　
Ｑ　／　ｅ　ｎ　ｖ蛋白質は予防免疫処置によるＡＩＤ
Ｓの蔓延にうち勝つため使用される。
ｇ　ａ　ｇ　ｔｊ３よびｅｎｖ蛋白質を別々に使用する
のと比較してＧａｐ／ｅｎｖ蛋白質を使用するのに！Ｏ
要な利点がある。ｅｎｖ蛋白′ｄ自体は非常に不溶性で
そのため精製が困難である。二つの蛋白質を組合せるこ
とによりより容易に可溶化され、従って容易に精製でき
る蛋白質が得られる。勿論大規模生産および精製も一つ
の化合物を単離するだ【ノであるから簡単になる。その
他、ＱａＵ／Ｃｎ　ｖ蛋白に」；り別々のｇａＯおよび
ｅｎｖ蛋白質の場合より５良く動く抗原サンドウイップ
ーアツセイの診断キラ１〜の開発が可能になる。
すａＱ　／　Ｑ　ｎ　Ｖ　蛋白′ζ１はＨ１−１−Ｖ　
、−［１ｉ、：由来するが、不明ｔ＃書に記載する診断
用および免疫予防法はリンパ腺症関連ウィルス（ＬＡＶ
）およびＡＩＤＳ関連レトロウィルス（△ＲＶ）のよう
なΔ１１）Ｓに係わる或いは関連している他のどのウィ
ルスの検出にも応用できる。これはＣｒ０ＷＩら［Ｃｃ
ｌ１４１巻、９７９頁（１９８５年）１がこれらのウィ
ルスは免疫学的にＨＴＬＶ−Ｉｌｌウィルスと関連し、
共通のアミノ酸配列を右することを示したからである。
木ブを明は以下に示づ詳細な記載を基に次の図面と０１
μ（とえるとより容易に理解される。
４１１図はＱＥＩＱ　（上図）およびＱＦ３Ｑ／ｅｎＶ
（下図）蛋白質の合成を指示する発現ベクターの図示で
ある。ｇａｑおよびｅｎｖｌ伝子のｆｌ、ＩＪ限エンド
ヌクレアーげ切断部位を示し、斜線の部分はＱ　ａ　Ｑ
　／　ｅ　ｎ　Ｖ　ｌ４ｉｊ合遺伝子のｅｎｖ部分を表
わす。
両プラスミド共転写はλＰ１プロモーターの制御下にあ
り、翻訳ｔＲＩ始シグナルはプラスミド［）［Ｖ−ｖｒ
ｆ２からのものである。
第２図はｇａにＪ／ｅｎｖ融合遺伝子の核酸配列（位置
番号および制限エンドヌクレアーピ部位を示す）および
それから予想されるＱａＱ／ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配
列を示１．。
第３図はＥ、ｃｏｌｉ中で生産されたｑｄ（）／ｅｎｖ
蛋白質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
の結果を示す。写真１はＱａ（Ｊ／ｅｎｖ融合遺伝子を
有する組換えプラスミドを侍つ［ｌ胞および対照ｌＩｌ
胞からの全蛋白のクマシーブルー染色を示す。写真２お
よび３は細胞全蛋白をｅｎｖペプチド５００−５１１に
対するつ４ツギ抗体（写真２）または（Ｊａ（Ｊ　　ｐ
２／Ｉに対す゛る羊抗体（写真３）のウェスタンプロッ
トである。７ｆ貞２および写真３の免疫複合体は西洋ワ
ザビのベル第４；シダーゼで標識した第二の抗体で検出
した。
いずれの写真でもｇ／ｅはＱ　ａ　ｇ／ｅ　ｎ　Ｖ蛋白
′ζ１を表わし、Ｃは特異性を示すため用いた陰性対照
試料を表わす。分子量マーカーの移動度（ＫＤ）を示し
、ゲル中で（ｌ　ａ　Ｑ／ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質バンドの位
置を矢印で示した。
本発明の方法は数多くのステップを伴ない、それは理論
的には、１１）　ｒｒ　ａ　ｏおよびｅｎｖ蛋白質をコ
ードする遺伝子またはその断片の同定と単離、（２）こ
れらの遺伝子または遺伝子断片を適当なりローニングベ
クターに挿入してＧａｐ／ｅｎｖ融合遺伝子を含む組換
えベクターの構築、（３）組換えクローニングベクター
の適合性の単細胞宿主生物への移動、（４）適当に修飾
した複製可能で挿入遺伝子配列を発現でき宿主の選）Ｒ
および培養、（５）遺伝子産物の同定および精製、（６
）遺伝子産物のＨＴ　Ｌ　Ｖ−■または関連ウィルスに
対する抗体検出のため、或いはと１〜血清または他の生
体液中のウィルス自体またはその断片検出のため使用で
きる抗体産生のための免疫原としての使用、そして（７
）ＡＩＤＳに対する免疫予防防御のための（Ｊ　ａ　ｇ
／　ｅ　ｎ　ｖ蛋白質の使用より成る。
ｌＩＩ！！ｌｉシた）ｌ　Ｔ　Ｌ、　Ｖ　−ＩＩＩウィ
ルス粒子は本発明のｇａＱおよびｅｎｖＩｉＩ４遺伝子
の源として使用できる。例えばＤｏｗｂｅｎｋｏら［Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、＾、８２巻、７７４８１（１９８５年）］　は
ｇａｇ遺伝子の原料としてウィルス遺伝子の５′−領域
から２．２キロベース（ｋｂ）断片を用いた。他の方法
として、ＨＴＬＶ−１［１のプロウィルス遺伝子を組込
んだｉＢ胞からの遺伝子ＯＮ△を遺伝子の原料として使
用することもできる［　Ｓｈａｗら。
５ｃｉｅｎｃｅ　２２６巻、１１６５頁（１９８４年）
］。
Ｃｒｏｗｌら［Ｃｅ１１４１巻、９７９頁（１９８５年
）１はｅｎｖ遺伝子を得るために１−（Ｔ　Ｌ　Ｖ　−
ＩＩ［の感染したＨ９細胞からの遺伝子ＤＮＡを使用し
た。
ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の単離の他の方法として遺伝
子配列の化学合成および遺伝子から生産するメツセンジ
ャーＲＮＡに相補的なりＮＡの合成があるが、これらに
限定されるものではない。
原料には関係なく、ｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコード
するＤＮＡはバクテリアにりＬ］−ンでき、リａりおよ
びｅ　ｒ）ｖ　’１４伝子を含有するり［１−ンは木技
術でＪ：＜知られる方法により同定できる。例えば、遺
伝子の相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）プローブを調製し、ハ
イブリダイゼーション技術を用いて本遺伝子を右するク
ローンの検出に使用できる。
本発明の好ましい態様として、上述のＨＴＬＶ−■−感
染Ｈ９細胞のＤＮＡをＸｂａＩ消化してｍＲした遺伝子
ライブラリーをλフアージベクターを用いてクローニン
グし、Ｉ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩのプロウィルス遺
伝子を有するクローンをＨＴＬＶ−ＩＩＩＣｌ）　ＮＡ
とハイブリダイゼーションして同定する。
そのようなりローンの一つをλトＩＸＢ−３と命名し、
このり１コーンのＤＮＡをＣ１ａＩ／ｌ−１ｉｎｃ■消
化してｇａｇ前駆体蛋白質の大部分をコードする１７０
０塩基対断片を単離した。
本発明の好ましい態様としてはｅｎｖ遺伝子配列の１内
接の原料はｅｎｖ蛋白質の５１４−５２４残りに対応す
るｅｎｖコドンを欠損するプラスミドｐＥＶ３／ｅｎｖ
４４−６４（ｂ）のｖｒｌ体である。
驚くべきことに、この欠損によりｅｎｖ３ｇ伝子の発現
が有意に増加する。プラスミドｐＥＶ３／ｅｎｖ４４−
６４（ｂ）のＢＱｊ２１１／ｌ−１ｉ　ｎｄＩ［Ｉｆ；
７Ｊ所によりコドン４６７から６４０を含むｅｎｖ配列
を得た。
１−１１’　Ｌ　Ｖ−ＩＩＩのｅｎｖおよびｇａｌｌ子
を−・たび同定して単離したら、挿入遺伝子配タリの転
写Ｊ３よび翻訳に必要な要素を含む適当な発現ベクター
中にそれを挿入する。有用なりローニングベクターは種
々の既知バクテリアプラスミド、ファージＤＮＡ、ファ
ージＤＮＡを利用するために改良したプラスミドのよう
なプラスミドおよびファージＤＮＡの組合せ、或いは酵
母プラスミド等のクロモシーム由来、非クロモシーム性
および合成りＮＡの断片より成る。使用できる特異的ク
ローニングベクターとしては、ｐＥＶ−ｖｒｌ“プラス
ミド（ｐＥＶ−ｖｒ　ｆ’　１、−２オＪ＝ヒ−３）、
ＳＶ４０、アデノウィルス、酵母、ラムダｇｔ−ＷＥＳ
−ラムダＢ１シャーロン４Ａおよび２８、ラムダ−Ｑｔ
−１−ラムダＢ１ｐＵＣ８，９，１８および１９のよう
なＭ１３−由来ベクター、ｐ１３Ｒ３１３，３２２およ
び３２５、ｐＡｃ１０５　、　　Ｆ）ＶＡ５　１　　、
　　ｐ　ＡＣＹ　　１　７　７　　、　　ｐ　Ｋ　　）
Ｉ　　４　７　　、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢｌｌｏ、
ｌ）ＭＢ９、ＣＯＩ　Ｅ　１　、ｐＳＣＩ　０１、Ｄｍ
ｌ　２１、Ｒ８Ｆ２１２４、ρＣＲ７またはＲρ４など
があるがこれらに限定されるものではない。
Ｑ　ａ　ｇおよびｅｎｖｌ伝子のクローニングベクター
への挿入は、両遺伝子および目的のクローニングベクタ
ーを同じυ１限酵素で切断して相補末端を作成すること
により容易に行なうことができる。
らしこれが出来ない時には消化により生成した切筋末端
を一木１ｔＪＤＮ△を消化することにより平滑末端を作
り、或いは適当なりＮＡポリメラーぜにより一本鎖ＤＮ
Ａをうめることにより同じように甲８゛１末端を作って
改良する。こうすることによりＴ４　ＤＮへりガーゼの
ような酵素により平滑末端ライゲーションを行なう。ま
た別の方法として、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リ
ンカ−）を連結することにより目的部位を作ることもで
きる。
リンカ−はυ１服部位認識配列をコードする特有のオリ
ゴヌクリオチド配列より成る。切断ベクターおよびｑａ
ｑとｅｎｖ遺伝子断片もＨｏｒｒｏｗにより記載される
［Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８
巻、３頁（１９７９年）］ように同ヌクレＡチドテイリ
ングにより修飾する。
ＱａＱまたはｅｎｖｉ伝子或いはその断片を適当なりロ
ーニングベクターに挿入した侵、もう一つの遺伝子また
は逍１云子断片は正しい制限エンドヌクレアーゼ切断に
より最初の遺伝子と並列に二番目の遺伝子または遺伝子
断片を挿入して融合遺伝子を創成する。勿論Ｏａ９およ
びｅｎｖ３ｒｉ伝子を化学合成する場合には融合遺伝子
を直接合成してクローニングベクターに一木のＤＮＡ断
片として挿入できる。
本発明の好ましい態様として、上述のλＨＸＢ−３から
のｑａｑ遺伝子含有Ｃ１ａＩ／ｌ−１ｉ　ｎ　ｃ　Ｍ断
片をＣ１ａ工およびＰｖｕＩＴで切断したｐＥＶ−ｖｒ
ｆ２プラスミドに結合して、ｇａｇ残基１５−５１２よ
り成る５６にｄ蛋白４ノ合成を指示する組換え発現プラ
スミド１）ＥＶ２／（コａ　ｇｌ　５−５１２　（第１
図、１−図）を得る。残基４３７に近いＰ、ＱＩＴ１部
位の下流のａａｃｈ配列をト述のプラスミドル１三Ｖ３
／ｅｎｖ４４−６４（ｂ）の誘導体（残基５１４−５２
／Ｉ欠損）からのｃｎｖ配列Ｂ（’ＪＩ　Ｉ／ＩＩ　！
　ｎｄ　［１ＩＦ７ｉ片Ｃ置き換え、Ｑ　ａ　Ｑ／ｅ　
ｎ　Ｖ融合遺伝子を含むプラスミドｐＥＶ２／ＱａＱ１
５−４３６／ｅｎｖ４６７−６４０Δ５１４−５２４　
（第１図、下図）を１【する。
この構築の詳細は以下の実施例の段落中、特にＢからＦ
に示した。好ましい態様のＱａＯ／ｅｎｖ遺伝子の核酸
塩基配列（Ｈａｘａｍの化学切断法、Ｈｅｔｂｏｄｓ　
　ｉｎ　　ＥＩＩＺｙｌｏｌｏ（１６５巻、　４９９頁
（１９８０年）、により決定］　Ｊ３よびそれから推定
される（Ｊ　ａ　ｇ／　ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質のアミノ酸配
列を第２図に示ザ。
本発明で用いるり［１−ニングベクターの多くは目的の
形質転換株を選択するのに用いる一つまたはそれ以］−
のマーカー活性、例えばｐＢＲ３２２でのアンピシリン
およびテ１−ラザイクリン耐性、Ｄ　（Ｊ　Ｃ８のアン
ピシリン耐性およびβ−ガラクトシダーゼ活性およびＩ
）ＥＶ−ｖｒｊ２のアンピシリン耐性などを右する。そ
のにうなベクターがｈＩｉ人された宿主の選択はベクタ
ーがない場合に右しでいない活性がベクターにより発現
することで非常に簡単に行なうことが出来る。
クローニングベクターの選択した部位に１．ｌｊ人する
ｇａｇおよびｅｎｖ３１１伝子断片のヌクレオブト配列
は真の構造遺伝子部分でないヌクレオチドを含む場合が
あることは即解すべさ゛である。また逆に、遺伝子断片
が完全遺伝子の一部分のみを有することもできる。必要
な点はり１コーニングベクターに挿入した遺伝子断片が
適当な宿主生物中でＧ　ａ　ｇｌ３よびｅｎｖ蛋白質の
配列に対応する少なくと５一つの抗原決定囚ｒをイＩＪ
−るポリペプチドまたは蛋白質の生産を指示することが
出来ることである。
適当な宿主生物の選択はこの技術で知られる多くの要囚
により影響される。要因としては例えば、選んだベクタ
ーとの適合性、ハイブリッドプラスミドによりコードさ
れるｍ性、目的蛋白の回収の容易さ、発現特質、生物安
全性およびコストなどである。これらの要囚のバランス
をとらねばならず、ある組換えＤＮＡ分子の発現に対し
て必ずしも令での宿主が同等に効果ある訳ではない事を
理解すべきである。
本発明で使用できる適した宿主単細胞生物どしては植物
、動物または酵母ｍ胞および ［ｓｃｔ＋ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓおよび放線菌などがあるがこれらに限定されるもの
ではない。
Ｃａ５ａｄａｂａｎら［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
１３８巻、１７９頁（１９８０４ｆ）］にＪ：り報告さ
れたＥｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｈｅ　１０６
１株は伯のｐＲＫ２４８　ｃ　Ｉ　１：　ｓプラスミド
を含むＦ、ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２株と同様使用できる。
他のｌ：、ｃｏｌｉＫ−１２株に使用するためのプラス
ミドｐＲＫ２４８ｃ　　Ｉ　　Ｌｓ　　は八ｎ＋ｅｒｉ
ｃａｎ　　丁ｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｃｃ目
ｏｎ（Ａｌ−ＣＣ）から自由に入手でき、Ａ　ｒｃｃ３
３７６６（７）番号／ｆｉ　ライＴ　イル。Ｅ。
ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１株もＡＴＣＣｋ：寄託され（
ＡＴＣＣ−５３３３８）依頼により自由に人手できる。
組換えクローニングベクターの宿主細胞への移入はいろ
いろな方法で実行できる。選んだそのベクター／宿主細
胞系によって形質転換、形質導入または］・ランスフエ
クションにより行なえる。そのような修籐宿主細胞が得
られると、細胞を培養して培養物より蛋白質発現産物を
単離する。
Ｅ、ｃｏｌｉ中で生産されるとＣＪ　ａ　Ｑ　／　ｅ　
ｎ　ｖ蛋白質は大部分相Ｋｉ質のバクテリア封入体（不
溶性蛋白凝集物）に閏じ込められ、この事は蛋白質の精
製を非常に容易にする。本発明のｇａす／ｅｎｖ蛋白産
物を単離するには、細菌細胞を好ましくは破砕または溶
菌し、不溶性蛋白を遠心分離により回収する。実質的精
製はヤノられる沈でん物を徐々に高い濃度の尿素で何口
か洗い、続いて標準蛋白質１／ｒｉ製法により行なう。
ポリアクリルアミドゲル゛心気泳動分析のための試料の
ように少量の蛋白質の時には、細胞はドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＯ８＞などの界面活性剤処理により破砕する
。多ｉｄの蛋白質は超呂波処理或いはフレンチプレスの
ような他の物理的破砕にＪ：り回収η゛るのがＪ：い。
細胞破砕はまた化学的或いは酵木的方法によっでｂ　ｔ
ｊなう巾かできる。細胞膜構成にはしばしば二価陽イオ
ンが必要であるため、ＥＤＴＡまたはＥＧＩ−Ａのよう
な適当なキレート剤による処理により細胞から蛋白質を
漏出するのに十分な破砕がでさ゛ることかできた。同様
にリゾチームのようなＭ素す同じ結果を得た。この酵素
はＩＩＩ胞檗のペプチドグリカン骨格を加水分解する。
リゾチーム処理と合わせて凍結と融解のくり返えし処理
も採用′Ｃきる。
１１１４から出したＱ　ａ　ｇ／ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質【よ
この技術ぐ知られる方法によってｕ合物から同定できる
。
例えば、本蛋白質に対する抗体を用いた放射免疫アッセ
イまたは酵素免疫アッセイが使用できる。
好ましくは蛋白質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
電気上動くウェスタンプロットまたは類似の分析により
同定する。
本発明のＱａｇ／ｃｎｖ蛋白質は硫酸す１〜す′クムま
たは硫酸アン上ニウムのような塩による沈澱、または限
外濾過、或いはこの技術でよく知られる他の方法を用い
てａ縮される。その後の精製はゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、精製用ディスクゲルまたは、カーテ
ン・４気泳動、等電点分画電気泳動、低温有機溶媒分画
成いは向流分配などの通常の蛋白精製技術により行なう
。
（Ｊａ（Ｊ／ｅｎＶ蛋白質はＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｉｌｌウ
ィルスの二つの主要成分の抗原性決定因子を含み°、こ
のウィルスがＡＩＤＳの主たる病因であってＡＩＤＳま
たはＡＲＣと掛わるまたは関連しているとされる他のウ
ィルスと免疫学的に関連しているため、本蛋白質はヒト
血清中のＡ　ｌ　ｌ）　Ｓウィルスに対する抗体の検出
のための有力な診断の道具である。この目的のためにこ
の技術で知られる多くの方法により融合蛋白質を使用で
きる。
例えば、Ｑ　ａ　ｇ、”ｃ　ｎ　Ｖ蛋白質を多くの方法
のいずれかで標識し、標識蛋白質をＡＩＤＳウィルスに
対する抗体を含むと疑われるヒト血清試料に添加して標
識用台蛋白−抗体複合体を形成させ、生成した複合体を
適当な方法により検出する。他の例としで、本蛋白質を
固体担体に固定してヒト血ｉ１試料と接触さけることも
できる。試料中のＡ　Ｉ　ｌ）　Ｓウィルスに対する抗
体は固定化蛋白質と結合し、生成する複合体は未反応の
蛋白質や抗体を洗′ａ除去した後５ｔａｐｈｙ＋ｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｃｕｓプロチンＡ（例えば沃素１２５
で標識）または第二の抗に１・１００抗体（例えば放射
同位元素または西洋ワナビやラクトペルオキシダーゼで
標識）などの試薬を用いて検出できる。これらの問題に
関しては本技術熟練者には明白な多くの異なる方法があ
り、そのいくつかは以下に明示しである。
ＱａＱ／ｅｎｖ蛋白質に対する抗体の利用によりヒト血
清または他の生体試料中のＡ　ｌ　ｌ）　Ｓウィルス或
いはそれ由来の粒子の存在のための多種の診断テストを
開発できる。そのための抗体は本蛋白質とそれに対する
抗体産生を誘導する適合した医薬担体より成るワクチン
製剤のＴ分宿を哺乳動物やニワトリに注割して１産でき
る。必要な適当な蛋白量はこの技術の熟練者は知ってい
るが、決まった実験により決定できる。本発明の関連で
使用する際には、「医薬担体」という用語はヒトへの投
与に適した標準組成物または動物の種痘に使用される典
型的なアジュバントを意味する。
動物の種痘に適したアジュバントとしてはフロイント完
全または不完全アジュバント（ヒ１−または家畜には適
さない）、アジュバント６５（落花生油、マンニド−オ
レインＦｌｌｔｔ（よび−ステアリン酸アルミニウムを
含有）および水酸化アルミニウム、りん酸アルミニ１ク
ムおよびミョウバンのような金属ゲル；へキナデシルア
ミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジ
オクタデシル臭化アンモニウム、Ｎ１−Ｎ−ジオタデシ
ルグリセロールＪ３よびプルロニック多価アルコールな
どのような界面活性剤；ビラン、硫酸デキストラン、ボ
リエＣ１ポリアクリル酸、カルボボール多価陰イオン：
ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンな
どペプチド類：および油性エマルジョンなどがあるがこ
れらに限定されるものではない。ｇａｐ／（３ｎＶ蛋白
質はリポソームや他のマイクロキャリア中に封入して投
与し、或いは寥糖類、他の蛋白質または他のポリマーと
結合してから投与することもできる。典型的には最初の
接種の何週間か後に一回かそれ以上の追加免疫接種をし
、これらの総合効果にＪ：すＱａｑ／ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質
に対する抗体の高力価産生ができ、通常の方法により回
収できる。
勿論本蛋白質に対するモノクローナル抗体も現（ｆ知ら
れる技術により産生でき、同じ結果が得られる。ＲＩＩ
　Ｉｌａのように抗体産生能を有する体細胞を骨髄腫細
胞株と融合してハイブリドーマ細胞を得る１、これらの
細胞を試験管内で、或いは腹水癌として培養して特異抗
体を多植に生産させる。ハイブリドーマ細胞は容易にク
ローン化できるので多数の細胞を♀く生産づ゛ることが
可能であり、それらは全て共通の抗原性決定因子に指示
される同じ特異抗体分子を生産する。この例外的に統一
された抗体産生は抗体を特異診断テストに使用する際（
ｊ利である。
抗原の注射により初回抗原刺激を受けた動物のリンパ腺
およびｉ’ｓｍはＢ細胞の便利な材料であるが、これら
細胞を初回免疫していない動物より単離してから試験管
内で初回抗原刺激を行なうのも同様に効果ある。
マウスおよびラップＢリンパ球が最も頻繁にハイブリド
ーマ生産に用いられているが、その代りにウサギ、人間
、虹または他の動物からの細胞も使用できる。
ハイブリドーマ生産のため使用する多くの特有のｆｌ　
ＩＩＩＩＩＩ：　１ｌ胞株がリンパ球性腫瘍から開発さ
れている［に０ｔｌｌＯｒ　　およびＨｉｌｓｔｃｉｎ
、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ。
ｌｍ５ｕｎｏ１．６　＠、　５１１１ｉ　（１９７６年
）；Ｓｈｕｌｇｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　２７６巻、
２６９頁（１９７８年）］。開発された多くの細胞株の
中でｐ３／Ｘ６３−Ａｕ８．ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｕ４
−１．５ｌ）２１０−八Ｑ１４および５１９４１５゜Ｘ
Ｘ０．８ＬＪ、１が頻繁に利用されている。
ハイブリドーマ生産のための抗体産生融合細胞またはリ
ンパ腺細砲と骨髄腫細胞との融合は骨髄肝ａ胞に対する
牌細胞またはリンパ球細胞の割合を過剰とし、その比は
２０：１と６なり得るが、通常はもつと低い比率が用い
られる。融合はＵ■−不活センダイウィルスまたはポリ
エヂレングリ］−ル（ＰＥＧ）のような融合促進剤を用
いて行なう。ＧＣｒｔｅｒら［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１
ｌ　Ｇｅｎｅｔ３巻；２３１頁（１９７７年）］はジメ
チルスルホキシドとＰＥＧを組合せるとさらに細胞融合
を高めると報告し゛【いる。極度に高い効率で細胞を融
合することの出来る電気的装置ら開発されている。
融合が起ると未融合の親細胞からハイブリドーマ細胞を
選択する必要がある。この選択はハイブリドーマ細胞は
増殖できるがｔａ細胞は生育できない培地中で細胞を培
養することにより容易に達成でさる。融合に使用される
８体細胞は培養寿命が限られＣいてそのため培養中に失
なわれるが、骨ｒ＆ｆ１Ｍ重＃細胞は培養中で無限の寿
命を有するので特別の技術により除去しなければならな
い。
通常用いる方法では、ヒボキサンチン、フオスフオリボ
シルトランスフエラーゼ欠損 （ＨＰＲＴ−）の骨髄ｎａ胞を使用する。これらの細胞
はヒポキサンチンの遊離塩基を再利用する除去経路を欠
くためアミノプテリンのような阻害剤を用いてプリンの
初めからの合成経路をブロックすると生存できない、、
親骨髄腫［ｌ砲は融合混合物をヒボキサンチン／アミノ
プテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地で培養することによ
り選択的に除去され、ハイブリドーマ細胞は抗体産生融
合細胞によるＨＰＲＴの作用のため生存する。
選択培養の後、生存するハイブリドーマ細胞をクローン
化し、種細胞を通常の標準細胞培養法により培養し、目
的の特異免疫グロビンを生産するりＯ−ンを酵素免疫ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）また他のテストを用い、抗体を誘
導した抗原の使用に基づいて検出する。
本発明の使用法に基づいて得られる抗−ｇａｇ／ｅｎＶ
蛋白質抗体はさらにＡＩＤＳウィルスまたはそれ由来の
粒子の各種診断試験の調製に利用できる。診断システム
としては遊離溶液または固体での放射免疫アッセイの形
態である。その他、Ｍ；＋１免疫アツレイＪ３よび免疫
プロットに基づくアッセイがある。これらのアッセイは
直接法或いは抗ｇａ　Ｑ　／　ｅ　ｎ　Ｖ蛋白抗体に対
する第二抗体を応用した間接法である。数多くのＭ索活
性を抗体に結合でき、ペルオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーげ、β−ガラク］・シダーげおよびアルカリフ
Ａスファターゼはそのほんの一例である。
これらの試験法の多くにある基本的な原理は、Δ１１〕
Ｓウィルスまたはその断片を含む疑いのあるヒト血清或
いは他の生体試料をＱａＱ／ｅｎｖ蛋白質に対する抗体
の既知力価間と反応させて抗原−抗体複合体を形成する
。このようにして形成した複合体を適当な方法によって
検出するものである。
本技術の熟練者は抗−（ＪａＱ／ｅｎＶ蛋白質高而清は
他にム面ろいろな方法で診斯に利用でき、例えば凝集反
応試験などが例であることがわかる。
凝集反応アッセイでは、抗体とＡＩＤＳウィルスまたは
ウィルス断片との相互反応を粒子を抗−Ｑ　ａ　＜Ｊ　
／　ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質抗体でコートした系を用いて検出
できる。粒子としてはラテックスビーズ、リポソーム、
赤血球、ポリアクリルアミドゲルまたは適当なポリマー
類などがある。
上に述べたＡＩＤＳウィルスまたはＡＩＤＳウィルスに
対する抗体の測定方法は容器中に本発明のｇａｇ／ｃｎ
ｖ蛋白質或いは本発明のＣ１８ｇ／ｅｎｖ蛋白質で誘導
したＡＩＤＳウィルスに対する抗体を含有した適当なデ
ス１−キットで実施できる。
Ｃｒ０ＷＩらは［Ｃｅ１ｆ４１巻、９７９−９８６頁（
１９８５年）１５０人のＡＩＤＳ＠者の血清を遺伝子操
作で生産したｅｎｖ蛋白質と試験した結果、全てがこの
蛋白質と反応性を示したと報告している。これらの患者
の半分は合衆国西海岸出身、半分は東海岸出身前であっ
たにも拘らず真実であった。試験した全ての血清がｅｎ
ｖ蛋白質に反応したという事実は、地理的に離れていて
遺伝的にも疑いなくいくらか異なる、このように反応し
た抗体を産生するウィルスがそのエンベロープ蛋白質中
に少なくとも一つの共通の或いは保存された抗原決定因
子を右していた事を示す。
Δ１１）ＳレトロウィルスのＱａｇコア蛋白質は以前に
このウィルスに感染したことのある人の多くに抗体産生
を誘導することが見つかっている［　Ｈｏｎｔａｇｎｉ
ｅｒら、上述：　５ＣｈＵｐｂａＣｈら、上述：５ａｒ
ｎ（Ｊａｄｈａｒａｎら、上述］。
以十の事を考え合わせると、構成成分であるりａりおよ
びｅｎｖ蛋白質の配列に対応する少なくとも一つの抗原
決定因子を有する本発明のＱ　ａ　Ｑ　／　ｅ　ｎ　ｖ
蛋白質は人類に対して免疫原性を有し、ＡＩＤＳワクチ
ンとして有用である。
従って、ｇａｇ／ｅｎｖ蛋白質（水用ｍ害の記載により
、または化学合成により生産）は本蛋白質および適合す
る医薬担体より成るワクチン製剤どし−Ｃ使用できる。
そのような製剤には精製蛋白質として使用できるが、ま
たこの技術で知られる改良によってさらに免疫原性を高
めることもできる。例えば、本蛋白′ｄを１，３−ジシ
クロへキシルカルボジイミドのような架橋剤との反応に
より高免疫原性マｌ〜リツクスへと変換することができ
る。また、本蛋白質を直接または適当なリンカ−分子を
介して高免疫原性蛋白担体分子と共有結合で連結できる
。使用できる担体分子としては、例えばスカシガイヘモ
シアニンおよびジフテリア毒素のような種々のｗＪＶ４
毒素（不活化毒素）がある。
にＪ　ａ　（ｊ／ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質を細菌毒素と結合す
る場合には、ＡｌＤｓとその毒素の起源細菌との両方の
予防が出来る二価性ワクチン製剤を調製できる。
投与経路、抗原間、注射の頻度などは全てこの技術での
通常の熟練範囲のものである。
〈実施例〉 以下の実施例で１−１　ｒ’　Ｌ　Ｖ　−１１［ウィル
スのｇａｇ／ｅｎＶ蛋白質をコードする組換えベクター
の構築法を示すが、これに限定されるものではない。
本実施例では次のステップを行なうが、各ステップはさ
らに詳細に後に述べる。
（１）組換えファージクローンλＨＸＢ−３より０８ｇ
遺伝子のアミノ酸残括１５−５１２（最初の１４残基以
外の全て）をコードするＤＮＡ配列を切り出し、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ発現プラスミドＤＥＶ−ｖｒｆ２に連結してプラ
スミドｐ　＋＝　ｖ２／ＱａＱ　１５−５１２を１０； （２）　　発現プラスミドｐＥＶ３／ｅｎｖ４４−６４
０Ｊ：すｅｎｖアミノ酸残基３１９−３３１に対応する
ＤＮＡ配列をブライマー指示変異により削除し、プラス
ミド１）ＥＶ３／ｅｎｖ４４−６４０Δ３１９−３３１
を１！１１ ｆ３１　　ｐＥ　Ｖ　３　／　ｅ　ｎ　ｖ　４４−６４
０Δ３１９−３３９についてブライマー指示変異を行な
い、アミノ耐外１！５１４−５２４をコードするヌクレ
オチドの削除をしてプラスミドｐＥＶ３／ｅ　ｎ　ｖ　
４４−６４０Δ３１９−３３１Δ５１４−５２４を得、 （４）　　プラスミドｐＥＶ３／ｅｎｖ４４−６４０Δ
３１９−３３１Δ５１４−５２４からのｅｎｖ残基／１
６７−６４０Δ５１４−５２４をコードするｅｎｖ遺伝
子の制限酵素断片を切断したプラスミドｐＥＶ２／ｇａ
（Ｊｌ　５−５１２に連結し、すａｇ残１１５−４３６
およびｅｎｖ残基４６７−６４０Δ５１４−５２４を］
−ドする融合遺伝子を作成してプラスミドＥ）ＥＶ２／
ｇａＱ１５−４３６／ｅｎｖ４６７−６４０Δ５１４−
５２／１を得る。
構築の各段階でプラスミドは［、ＣＯ１ｉＭＣＣ０１ｉ
株（１）ＲＫ２４８ｃｌｔｓ）に形質転換して再生した
。
△１組換えベクターｖＡ製の一般手順 ＜ＯＮ八へＩ〉 １１１の一晩培養物からのプラスミドＤＮＡの小規模単
離はＢｉｒｎｂｏｉｍらの手法［Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　７巻、１５１３貞（１９７９
年）〕によって行なった。水沫は分析を目的にバクテリ
アのコロニーより少量のＤＮＡを単離できる。多聞のプ
ラスミドＤＮＡは１リツ［・ルの培養物を用い、塩化セ
シウムでの遠心分離による標準法で調製できる。
く酵素反応の条件〉 使用した全ての制限酵素および１４ＤＮＡリガーゼはマ
サチュセツツ州バーバリーのニューイングランドバイオ
ラボズ（Ｎｅｗ　［ｎｏｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ）
の製品である。これらの酵素の使用法および使用条件は
製造元による指示どおりである。
制限エンドヌクレアーゼの１単位の活性は、反応液Ｆａ
０．０５ｍ、３７℃、６０分の消化で１．０μびのＤＮ
Ａを完全消化するのに必要な酵素１１（と定捏する。消
化反応液は分解するＤＮＡの他、１００μｇ／Ｉ１１の
ウシ血清アルブミンおよび以下に示す緩衝液成分を含む
： １３ＱＪＩｆ：１００１８　　ＮａＣｊ！、１０１Ｈト
リス−塩Ｍ　（Ｄｔ１７．４　）　、１０ｓＭＭｏＣ！
、、およびｌ□ｎ＋ＨメルカプトＴタノール（２−ＭＥ
） Ｃ１ａＴ：５０ｓＨＮａＣｊ！、６１Ｍトリス−塩酸（
ｐ１１７　、９　）　Ｊ３よび６　ｍＨＭ　Ｑ　Ｃ１２
Ｈｉ　ｎｃＴＩ　：　１００Ｉｌ１８　　ＮａＣｊ！、
１０ｓＨ１−リスー塩酎　（ＤＩＩ７　、　４　）　　
、７１８ＭｇＣ１２およびｉ　ｍＨジヂオスライトール
（ＤＴＴ） Ｈｉ　　ｎｄＤＩ　：　５０１ＨＮａＧ１．５０ａ＋Ｈ
ｔ−リス−塩酸（ｐＨ８，０）および１０ａＨ ｑＣ１２ ＨＤａＩ：６ｍＭ　　ＫＣｊ！、１０１Ｈトリス−塩酸
（７，４）、１０ｓＨＭｇＣｌ２およ び１＋１１）ＨＴＬＶＤ’１−Ｔ ＰｓｔＩ　：　１００＋ＨＮａＣ１，１０ｍＭトリス−
Ｊ！！酸（ｔ＋ｌ１７．５）およびｌ０ＩＩＨ９Ｃ１２ ＰｖｕＩ［：６０ｍ？４　　ＮａＣｊ！、５ｍＨトリス
ーｔＢＨ（Ｅ１１１７　、５　＞　、６ｍＭ　　Ｍ　（
Ｊ　Ｃ１２および６ｍＮ２−ＭＥ ＳｔｕＴ：１００＋ｅＨＮａＣ１，１０Ｉｌｌリス−塩
Ｍ　（＋）１１８．０＞　、１０ｏ＋ＨＭｑＣ１２およ
び６ｍＭ　　２−ＭＥ Ｔ４ＤＮＡライゲーションはＤＮＡおよび５０ＩＩＨト
リス−塩酸（ｐＨ７，８）、１０ｍＭＭｇＣｊ！　　、
２０ｓＨＤＴＴ、１．ＯｅＨＡＴＰおよび５０μび／ｄ
の「ウシ血清アルブミンを含む反応液中で１６℃にて行
なう。１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ活性は２０μｌの反
応液中でＤＮＡの５′末端濃度として０．１２μＭ（３
００１１９／ｍ１．＞のラムダＤＮＡのｌ−１ｉ　ｎ　
ｄ　［１断片を５０％ライゲーションするのに必要な量
と定義する。
＜ＤＮＡ断片のアガロースによるｌｉ’ｊ　製＞制限酵
素切断の後、クローニング用のＤＮＡ断片を１％アガｌ
ｌｌ−ス電気泳動により単離する。１μ！Ｊ　／　ｍｌ
ｌの臭化エチジウムにＪ：り検出した後、目的のＤＮＡ
断片を含むゲル切片を２１ゲージの針で１０ｍ１４トリ
ス−ｍＦａ　（ｐＨ７、４）　、１　ｍＨＥ　ｌ）　Ｔ
　Ａ　イ１３よび３００ｍＨＮａ（１！を含有する溶液
中に押し出す。これを−８０℃、３時間凍結し、３７℃
、３０分間融解して１０．ＯＯＯＸｇで３０分間遠心分
離する。上澄液を０８４５μのマイレックスフィルター
で濾過し、５ｅｃ−７タノールで０．２５ｍに濃縮した
後Ｅ、ｃｏｌｉｔ　ＲＮＡ（転位１でＮＡ）１０μびを
担体としてエタノール沈でんを３回行なう。
く培養培地〉 Ｍ９ＣＡ培地は１リットル当り１０びのＮａ　　１−Ｉ
Ｐｏ　　、３ｇのＫＨＰＯ，０，５ｇのＮａＣ１および
１ｑのＮ＋−１，Ｃｊ２を含有し、１ｍＨＭＱＳＯ，０
，５％グルコースおよび０．５％カザミノ酸を添加して
ｐＨ７，４に調整する。
ルリアブロス＜　Ｌ　Ｂ　＞は１リットル当り５Ｊバク
トー７１８８エキス、１０ｇバクトートリプトンＪ：び
１　０ｇＮａ（１！を合有し、ｐＨ７、５に：調整する
。
指示しである場合にはテトラザイクリン（６よびアンピ
シリンをそれぞれ１５および５０μｇ／ｃｄの終１１度
で添加する。
く形１　　および組換え体の単離〉 （Ｈ，ＣＯｌｉ　　ＭＣ１０６１株（　ｐ　Ｒ　Ｋ　２
　４　８ｃｌｔｓ＞の形質転換はＫＵＳｌＩｎＯｒのプ
ロトコール［　ａｏｙａｒら編集、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。
Ｅ　ｌｓｃｖｉｅｒ／　Ｎｏｒｔｈ−１１ｏ１　ｌａｎ
ｄ，　　八ｍｓｔｃｒｄａ＋ｎ，　　１　　７　頁（１
９７８年）］の改良法を用い、木質的には以下のとおり
行なった。
細菌細胞を２００ｍ！のＬＢ中３０℃で０．０．６ｏ。
が０．５から１．（ｂ）の間まで増殖させた後、細胞を
６，ＯＯＯＸｇ４℃で５分間遠心分離して集め、１０＋
ｆ４モルｉｔーリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ　：
ｐＨ７．０）および１０ｍＨ　　ＲｂＣＪ！含有の溶液
５０　ｔｎｌｌに再けん濁する。細胞を再び遠心分離で
集め、１　０ｍｆｌ　　ＭＯＰＳ　（ｐＨ１６．　５）
　、５０ｍＭＣ　ａ　Ｃ　ｊ！　２　Ｊ）　Ｊ：び１０
＋＋＋Ｈ　　Ｒｂ（１！含有の溶液３０ｄに再びけん濁
する。０℃で３０分間インキュベー１・した後細胞を集
め、５　０　ｍＨ　　Ｃ　ａ　Ｃ　１　２７）１　０ｍ
ｉｔ＜　ｂ　Ｃ　１および１５％グリセロール含有１０
ｍＨＭＯＰＳ　（ｐＨ６、　５　）　６ｄに再けん濁し
、４０本のエツペンドルフ管に分注して一８０℃で凍結
する。
形質転換には１００μオのＩｇＩ胞を融解し、０°、３
７°および０℃でそれぞれ３０分、２分【１５よび２分
間およそ１　０　０　ｎ　ｇのＤＮＡを含有するライグ
ー２８１２反応液サンプル１０μｌ存在Ｆ、６管に０．
１〜０．５ｍｇのｌ−　８を添加してインキュベ−１−
する。続いて２２℃６０分間各管をインヤニベートした
後、２００ｄの細胞けん濁液をアンピシリン含有ＬＢ平
板上にまいて３０℃２０時間インキュベートする。
く細胞増殖および　伝子発現の・　、〉プラスミドｐＲ
Ｋ２／１８ＣＩｔｓを保有するＥ．ｃｏｌｉ　　ＭＣ１
０６１株の細胞と発現プラスミドをＭ９ＣＡ培地中３０
℃で中期対数増殖まで培養してからλＰ　ｔリプレッサ
ーを失活させるために４２℃にシフトする。４２℃で２
時間インキュベート後、誘導培養物１Ｍｉからの細胞を
遠心分離で集め、分析のため１０１１１Ｎトリス−塩酸
（ｐ１１７、４）および１０％グリセロール含有のＴＧ
！衝液に再けん濁する。
トリス−グリシン（ＴＧ）緩衝液に【ノん濁した誘導細
胞を等橙の２倍濃度試料緩衝液［　１．ａｅｍｍ　Ｉ　
Ｉ　。
Ｎａｔｕｒｅ２　２　７巻、６８０頁（１９７０年）］
と混合し、９℃で５分間インキュベート後Ｌａｃｍｍ　
ｌ　ｉにより記載されるＪ：うに１２．５％ゲルのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳リノすか（プる。電気
泳動の優、ゲルの蛋白質を２０％メタノールおよび０．
０１ＳＤＳ含イｊ１２．５ｍＨｔ−リスおよび９６ｍＭ
グリシン中ｐ１１７，５．９５ポル１〜で６時間０．１
ミク［１ンのニトロヒルロースメンブレン上に電気１０
ツ１〜する。ウェスタンプロット分析はｆｏｗｂｉｎら
　［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　１１．ｓ、八、　７６巻、４３５０頁（１９７
９年）］により記載されている通り行なった。
〈プライマー指示部位特異変異処理〉 ブライマー指示の部位特ｌＪ′４変異処理はＨｏｒｉｎ
ａｇａらＬ　Ｂｉｏｔｃｃｈｎｏｌｏｕ　２巻、６３６
頁（１９８４年）１により記載された方法によって行な
った。
変Ｗｅ処Ｊｌｌを行なうために使用する合成オリゴヌク
レオチドは仙り／υ耐酸法　ａｏａｕｃａｏｅら。
Ｉｅｔｒａｌ＋ｙｄｒｏｎ　Ｌａｔｔ、　　２２巻、１
８５９貞（１９８１年）　　：　Ｈａｊｔｅｕｃｃｉ　
ら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｃｍ、　Ｓａｃ、　　１０３
巻、３１８５頁（１９８１年）］により自動合成装ＵＪ
を用いて調製し、ｕａｘａｍら［８ｅｔｔｌＯｄＳ　ｉ
ｎｃｎｚｙｍｏ＋ｏｇｙ６５巻、４９９頁（１９８０年
）］の方法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製する。
〈コロニーハイブリダイピージョン〉 コロニーハイブリダイゼーションはＧｒｕｎｓｔｅｉｎ
ら　［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、、Ｉｌ、Ｓ、＾、　　７２　巻、　３９６１　、
ｆｊ　（１９７５年）］の方法により行なった。
プライマー指示部位特異変異処理に用いたと同じオリゴ
ヌクレオチドをＭａｎｉａｔｉｓら［Ｃｅ１ｌ　　１５
’５゜６８７頁（１９７８年）コの記４Ｘするポリヌク
レオヂドキナーゼを用いて５′末端を３２Ｐ−ＡＴＰで
標識してハイブリダイゼーションのプローブとした。
Ｂ、プラスミドｐＥＶ２１０ａｇ１５−５１２（７）構
築 上に示したように、ｇａｇ／ｅｎＶＦＩＡ合蛋白質を発
現する最後の発現プラスミドの構築は先ず最初の１４個
のアミン末端残塁以外の全てをコードするヌクレオチド
を含むプラスミド（ｐＥＶ２／ｇａｇ１５−５１２＞の
構築に始まる。次にｇａｇのカルボキシ末端の残塁をコ
ードするヌクレオチドのいくつかをｅｎｖ配列で置換し
て最後の融合産物を得る。
プラスミドＩ）ＥＶ２／Ｃ１ａＱ１５−５１２を作成す
るため９ａｇ蛋白質の１５−５１２残基をコードするＤ
ＮＡ配列をＨ丁Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩプロウィルスを含む組
換えファージラムダクローンλＨＸ　Ｂ　−３の５０μ
りより５０中位のＣｊ！ａＩおよび５０中位のＨｉ　ｎ
　ｃ　Ｉｆを用いて３７℃１２０分間消化して１７００
ｂｐ断片を得る。このＤＮＡｆｆ１片を分離用アガロー
スゲル電気泳動により単離し、０．１４８＋１！度のＴ
　Ｅ　Ｉｌ　ｋＷ液［１ａ＋１４トリス−塩酸（Ｄ１１
７．４）および０．１ｍＨＥＤ−ｒＡ］に再けん濁しで
終濃度を０．０３μｍｏｌｅ　／Ｉｌｌとする。
！Ｊ　ａ　ｇＩ）　ＮΔ断片を挿入するためにＥ。
ｃｏｌｉの発現プラスミドＤＥＶ−ｖｒｆ’２を５単イ
ＱのＣ１ａ　Ｉおよび５単位のＰ　Ｖ　ＬＪ　ＩＦで３
７℃６０分間消化し、λＰ、プロモーターを含む１７０
０１１所片を１％７ガロースゲルの電気泳動で単離して
エタノール沈でん後回けん濁して終濃度０、０３ＤＩｌ
＋０１０　／μｌとする。
この構築に用いるプラスミドｐＥＶ−ｖｒｆ２は容易に
入手できるプラスミドｏ　ｆ３　Ｒ３２２［ＡＴＣＣ３
１３４４］の誘導体である。１ラスミドＯＥ　Ｖ　−Ｖ
　ｒ　ｆ　２の構築はＣｒａｗｌらしＧｃｎｃ３８巻、
３１頁（１９８５年）］により詳細に記載されている。
本構築に用いる組換えファージラムダクローンλＩ−Ｉ
　Ｘ　Ｂ　−３はＳｈａｗらし５ｃｉｅｎｃｅ　２２６
巻、１１６５頁（１９８４年）１により記載されている
。本クローンは上述のとおり１４王ＬＶ−■に感染した
ｌ−１−９Ｉ１１１１１株より標準の組換えＤＮＡ技術
を用いて得られる。本発明の使用に適したＨ　９　／　
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ　Ｂ　、！：命名り、　タＨ−
ｒ　Ｌ　Ｖ　−１［１％染ヒトｍ胞はΔｍｃｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに
寄託番号Ｃ１で１８５４３として寄託されている。
ｓｈａｗらはＨＴＬＶ−［［［１伝子の配列を報告して
いるので、それらのデータを用いてＯＮへプローブを容
易に合成でき、そのプローブを用いて１」−９またはウ
ィルスを増殖できる他の細胞株の遺伝子を単離すること
ができる。
３００　ｐａｒｏｌｅのｇａ（Ｊ／Ｃ１ａＴ−Ｈｉ　ｎ
ｃＩ［断片を０．０３　ｐｍｏｌｅのｐＥＶ−ｖｒｔ’
２／Ｃ１ａＩ−ＰｖｕＵ断片と混ぜ、２００単位の１’
　４　Ｄ　Ｎ△リガーゼを用いて反応液１０μβ中で１
５℃１８時間ライゲージコンを行なう。その生成物をＥ
、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１株（ｐＲＫ２４８　ｃ　［
ｔ　ｓ　）に形′ｄ転換し、転換株をアンピシリン白石
ＬＢ寒天平板で３０℃１８時間インキコベーションして
選択した。組換えプラスミドＤＮＡはＢＱＪＩ、ｐｓｔ
Ｔまたはｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｍで切断後、制限断片の大
きさを分析し−Ｃ確認した。
ＤＮＡの大ぎさの分析で正しかったものについて＜）　
ａ　ｇｉ前駆ポリペプチドの合成をＳＯＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動おＪ：びウニタンプロット分析でｊ
’Ｆ　Ｉｄｌｉ　シた。
プラスミドＤＥＶ２／（Ｊａｇｌ　５−５１２を保心す
る細菌を４０℃で誘々し、その試料を二連でＳＯＳポリ
アクリルアミドゲル雷気泳動による分析の調製をした。
電気波ｆａＪ後ゲルを分けて半分をウマシーブリリアン
１−ブルーで染色し、ゲルの残りの半分を電気プロット
及び抗−〇ａＱ抗体を用いてウェスタンプロット分析に
かけた。
分析の結果、誘導細胞はゲル中で見かけの分子量がおよ
そ５６および５３にｄの二つの主要バンドで移ｖ）する
蛋白質を生産することがわかった。完全なｇａｇ１５−
５１２蛋白質の大きさは約５６Ｋｄである。両方の主要
蛋白質とも抗−９ａｇ抗体と反応した。抗体と反応性の
ある多くの低分子蛋白質も観察された。
本発明の最終典型的プラスミドに存在するｅｎｖ配列は
二つのステップ（このセクションおよび次のセクション
Ｄに記載）で導入され、各ステップともプライマー指示
部位特異変りマによる特異短鎖ヌクレオチド配列の欠員
を包含する。これらのはじめの欠損（このセクションに
記載）はプラスミド０ＥＶ３／ｅｎｖ４４−６４０Δ３
１９−３３１Δ５１４−５２４を生成するのに（セクシ
ョンＤ）必要である。
λＨＸＢ−３およびｐＥｖ−ｖｒｆプラスミドからの発
現プラスミドｐＥＶ３／ｅｎｖ４４−６４（ｂ）の構築
はｃｒｏｗｔら［Ｃｅ１１４１巻、９７９頁（１９８５
年）Ｊにより記載されており、それは［：、ｃｏｌｉ中
で６８にｄ　　ＨＴＬＶ−［［［ｅｎｖ特異蛋白質の合
成を指示する。ｅｎｖアミノ酸残基３１９−３３１に対
応するＤＮＡ配列をブライマー指示変異により、１８７
−合成オリゴヌクレオチド３　’　ＧＣＡ　ＴＴＴ　Ｇ
ＴＴ　ＡＡＣＡＴＴ　ＡＧＴ　３　’　を用いて削除し
た。このオリゴヌクレオチドはｅｎｖ配列を補足して第
３１８残基をコードするヌクレオチドと第３３２残基を
コードするヌクレオチドとを結合するように設計されて
いる。これらの配列を合わせた結果、プラスミドＤＮＡ
中に新たに独特なＩ−１ｐａ　１：部位が導入され、３
９ｂｐが削除される。
プラスミドｐＥＶ３／ｅｎｖ４４．−６４０中の３　ｔ
　ＬＪ　ＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位はヘテ１」二重
鎖分子のギＶツブをつくるのに利用する。
コ自ニー検索で３２ｐ−標識合成オリゴヌクレオチドと
のハイブリダイぜ−シコン陽性であったコ［に−から単
１ｌＩＩ　したＤＮＡでＭＣ１０６１（ｌ（Ｋ２４８ｃ
　Ｉ　ｔｓ）を形質転換し、新しい独特のＨｐａＩ部位
の存在を分析する。
Ｄ、プラスミ゛ＤＥＶ３／ｅｎｖ４４−６４０△ｅｎｖ
をコードする配列内の第二番目の欠１日は配列５’　Ａ
ＧＡ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　３’
　ヲｔｉＴ　ル合成オリゴヌクレオチドを用いてブライ
マー指示変異により実施した。このオリゴヌクレオチド
はｅｎｖ蛋白質の第５１３残基をコードする配列を第５
２５番目の残塁をコードする配列に隣接して配趙し、従
って５１４−５２４残基をコードするヌクレオチドの欠
損が達成できる。この欠損はプラスミド中でト１ｐａＩ
および）ｌ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ制限部位を用いてｅｎｖ領
域内に一重鎖のギャップを形成する。
再び形質転換した後、３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチド
プローブにより陽性と同定されたもののＤＮＡにつき、
ｌ−１ｐ　ａ　Ｉおよび１ｌｉｎｄｌｌｌにより制限部
ω１および続く１％アガロースでの雷気泳初により３３
ｂｐの欠損を分析する。この欠間はまたＨａＸａｌｌお
よびＧ１１ｂｅｒｔ　　［Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｆｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ６５巻、４９９頁（１９８０年）］の
方法による化学切断でのｌ）　Ｎ　Ａ配列決定によって
も確認された。
前述のとＪメリ、Δ５１４−５２４欠１０はｅｎｖの発
現を０意に増加させた。
築 ２μりのｐＥＶ２／ｇａｏｌ　５−５１２を５単位の（
、”；　１　ａ　、［および４単位の１３ｑｌＩ［で二
重消化してｇａｇ残基１５−４３６をコードする１３０
０ｈ断片、または１０１５．１ｆｆ、のＰｓｔＩおよび
５単４（ｂ）のＣ１ａ■でλＰ１プロモーターを含むお
よそ１　Ｋｌ）ｆ９ｉ　Ｐ’＋を得る。０．３μｙのｐ
ＥＶ３／ｅｎｖ’ｌ　　４−−６４０Δ３１　９−３３
　１　Δ５１４−５２４を゛１０１００ＰｓｔＩおよび
４単位のＢＱｊ！ｎでＩＪ）断しｒｅｎｖ残ｔ；＜　４
６７−６４０Δ５１１−５２４を＝１−ドするおよそ／
ｌＫｂの断片を得る。
このようにしＣ調製した種々のＤＮＡ断片を前述のとお
り１％アガロースで分離し、回収する。
単離した夫々のＤＮＡ断片を０．０３１）１０１０ずつ
混合し、２００　Ｃ１ｉ位のＴ４リガーピの存在下で１
５°Ｃ１１８時間ライゲーションする。次に結合反応生
成物でＭＣ，１０６１（ｐＲＫ２４８ＣＩｔＳ）を形質
転換し、形質転換株をアンピシリン含有Ｌ　Ｂ寒天平板
上で選択する。特有のコロニーからプラスミドＤＮＡを
調製し、ＰｖｕＩＩ消化後の制限断片ナイスの分析によ
りＪＪｖ認した。
甲離株１２個のうち１１株が予想通り３５０５および２
８８２ｂｐ１７）ＰｖｕｌＩＩＦｉ片を杓する正シイＤ
ＮＡ分析結果を示した６陽性株のうらの２株につきｇａ
Ｑ／ｅｎＶＦｉ＆合蛋白質の合成を評価した。
これらの株を誘導し、細胞試料をとってＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動、電気ブロワ１−およびウェス
タンプロットによる分析を行ない、その結果を第３図に
示す。
第３図の写真１はＣＪａＣＪ／ｅｎＶ＠合遺伝子を含む
組換えプラスミド保有細胞から（’Ｊ　／　ｅ　）　ｊ
３よび対照細胞から（Ｃ）の細胞全蛋白質のクマシーブ
ルー染色である。写真２および３は同じ試料のウェスタ
ンプロット分析で、ｅｎｖ残基５００＝５１１に相当す
る合成ペプチドに対するウリ“ギボリクローナル抗体を
用いた場合（写Ｌ’＆　２　）　Ｊ３よび市販されてい
るｇａｇ蛋白質ｐ２４に対する羊ポリクローナル抗体［
写真３、ｐ２４蛋白質についてはＤｏｗｂｃｎｋｏら、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、８２巻、７７４８頁（１９８５年）参照の
こと」を用いた場合を示しである。第３図で写真２　お
よび３の免疫複合体は西洋ワサビベル第１ニジダーゼで
標識した第二の抗体により検出し、分子ｉ１マーカーの
移動度ら示しである（にｄで表示）。
ゲル中でのＯＦ３　ＣＪ　／　ｅ　ｒｌ　Ｖ　蛋白質の
バンドは矢印で示した。
本発明の精神およびその範囲から逸脱することイ１く教
多くの変更および変形を行なうことが出来ることは当業
者にとって明らかなことである。例えば、本発明のｇ　
ａ　Ｃ：Ｊ７ｅ　ｎ　ｖ蛋白質をコードする迫仏子に塩
Ｍ置換を行ない（本明細山に参８資料として慣げた配列
データを用いて）、それからいくらか異なる融合蛋白質
（しかし機能的に同等）を生成で・きる。そのような改
良蛋白質も、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ［１ウイルスのｇａｇ
およびｅｎｖ蛋白質の配列に対応する少なくとも一つの
抗原性決定因子を有する限り、本発明に包含される。同
様に、本発明の蛋白質のアミノ配列自体も直接変化させ
ることができ、同じ結果である。木明１１［１ｉＪに記
載される具体的な態様は例示としてのみであり、本発明
は特許請求の範囲の項によってのみ制限されるものであ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図はｇａＯ蛋白質および（ＪａＱ／ｅｎｖ蛋白質の
合成のための発現プラスミドの模式図である。第２図は
（Ｊ　ａ　ｇ／　ｅ　ｎ　ｖ融合遺伝子の塩基配列およ
びそれより予想される（］　ａ　ｇ／（３ｎ　ｖ／３白
質のアミノ酸配列を示す構造図である。第３図は１：、
ｃｏｌｉ中で生成されるＱ　ａ　Ｑ／ｅ　ｎ　Ｖ蛋白質
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を
示ヂ電気泳動図である。

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ＨＴＬＶ−IIIｇａｇ蛋白質またはＨＴＬＶ−II
    Iｅｎｖ蛋白質の少なくとも一つの抗原性決定因子に対
    応するアミノ酸配列を有する蛋白質。
  2. （２）以下に示すアミノ酸配列またはそれに同等な機能
    的な部分。 【アミノ酸配列があります】
  3. （３）本質的に純粋な形の特許請求の範囲第（１）項ま
    たは第（２）項のいずれか一つに記載の蛋白質。
  4. （４）特許請求の範囲第（１）項から（３）項のいずれ
    か一つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
  5. （５）次式で示す核酸配列の全てまたは一部よりなるＤ
    ＮＡ配列である特許請求の範囲第（４）項記載のＤＮＡ
    配列または機能的にそれと同等なもの。 【ＤＮＡ配列があります】
  6. （６）特許請求の範囲第（４）項または（５）項のいず
    れか一つに記載のＤＮＡを含み、適合性単細胞宿主中で
    該ＤＮＡの発現を行なうことのできる組換えベクター。
  7. （７）プラスミドｐＥＶ２／ｇａｇ１５−４３６／ｅｎ
    ｖ４６７−６４０Δ５１４−５２４である特許請求の範
    囲第（６）項記載の組換えベクター。
  8. （８）特許請求の範囲第（６）項または（７）項のいず
    れか一つに記載の組換えベクターを含む単細胞生物。
  9. （９）原核細胞である特許請求の範囲第（８）項記載の
    単細胞生物。
  10. （１０）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞である
    特許請求の範囲第（９）項記載の単細胞生物。
  11. （１１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０
    ６１細胞である特許請求の範囲第（１０）項記載の単細
    胞生物。
  12. （１２）真核細胞である特許請求の範囲第（８）項記載
    の単細胞生物。
  13. （１３）ワクチンの成分としての特許請求の範囲第（１
    ）項から（３）項のいずれか一つに記載の蛋白質。
  14. （１４）抗原としての特許請求の範囲第（１）項から（
    ３）項のいずれか一つに記載の蛋白質。
  15. （１５）次のステップより成る特許請求の範囲第（１）
    項から（３）項のいずれか一つに記載の蛋白質を生産す
    る方法。 （ａ）特許請求の範囲第（６）項または（７）項のいず
    れか一つに記載の組換えベクターを含む単細胞生物を該
    蛋白質が発現するような適当な生育条件下で培養し、 （ｂ）培養物より該蛋白質を単離し、必要ならそれを精
    製する。
  16. （１６）単細胞生物がＥ．ｃｏｌｉ細胞である特許請求
    の範囲第（１５）項記載の方法。
  17. （１７）組換えベクターがプラスミドｐＥＶ２／ｇａｇ
    １５−４３６／ｅｎｖ４６７−６４０Δ５１４−５２４
    である特許請求の範囲第（１６）項記載の方法。
  18. （１８）特許請求の範囲第（６）項または（７）項のい
    ずれか一つに記載の組換えベクターを単細胞生物に導入
    することを特徴とする特許請求の範囲第（８）項から（
    １２）項のいずれか一つに記載の単細胞生物を調製する
    方法。
  19. （１９）組換えベクターを形質転換により単細胞生物に
    導入する特許請求の範囲第（１８）項記載の方法。
  20. （２０）組換えベクターを形質導入により単細胞生物に
    導入する特許請求の範囲第（１８）項記載の方法。
  21. （２１）組換えベクターをトランスフエクシヨンにより
    単細胞生物に導入する特許請求の範囲第（１８）項記載
    の方法。
  22. （２２）ヒト血清中のＡＩＤＳウィルスに対する抗体の
    存在を検出する次のステップより成る方法。 （ａ）特許請求の範囲第（１）項から（３）項のいずれ
    か一つに記載の蛋白質を標識し、 （ｂ）ステップ（ａ）の標識蛋白質をヒト血清試料と反
    応させ、反応液中で標識蛋白質−抗体複合体を形成させ
    、 （ｃ）ステップ（ｂ）の標識蛋白質−抗体複合体を測定
    する。
  23. （２３）ヒト血清中のＡＩＤＳウィルスに対する抗体の
    存在を検出する以下のステップより成る方法。 （ａ）特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれか
    一つに記載の蛋白質を固体担体に固定化し、（ｂ）ヒト
    血清試料をステップ（ａ）の固定蛋白質と接触して固定
    化蛋白質−抗体複合体を形成させ、（ｃ）未反応の蛋白
    質および抗体をステップ（ｂ）の複合体から洗い除き、 （ｄ）その複合体を標識したスタフイロコツカス・アウ
    レウスのプロテインおよび標識した第二の抗ヒトＩｇＧ
    抗体から成るグループから選択される試薬を添加するこ
    とにより測定する。
  24. （２４）ヒト血清または他の生体試料中のＡＩＤＳウィ
    ルスまたはその断片の存在を検出する以下のステップよ
    り成る方法。 （ａ）ヒト血清または生体試料を特許請求の範囲第（１
    ）項から（３）項のいずれか一つに記載の蛋白質に対し
    て生成した抗体の既知力価と反応させ、 （ｂ）抗体と試料を反応させて反応液中で抗原−抗体複
    合体を形成させ、 （ｃ）ステップ（ｂ）の抗原−抗体複合体を検出する。
  25. （２５）抗体を酵素標識し、反応液中に形成した抗原−
    抗体複合体を酵素結合免疫吸着アツセイにより検出する
    特許請求の範囲第（２４）項記載の方法。
  26. （２６）放射活性標識した特許請求の範囲第（１）項か
    ら第（３）項のいずれか一つに記載の蛋白質の既知量を
    血清または他の生体試料に添加し、反応液中に形成する
    抗原−抗体複合体を放射免疫アツセイにより検出する特
    許請求の範囲第（２４）項記載の方法。
  27. （２７）特許請求の範囲第（１）項から第（３）項のい
    ずれか一つに記載の蛋白質を生理的に使用できる担体と
    混合して成るワクチンの調製方法。
  28. （２８）哺乳動物またはニワトリに十分量の特許請求の
    範囲第（１）項から（３）項のいずれか一つに記載の蛋
    白質を注射して該蛋白質に対する抗体生産を誘導し、該
    動物の血清から該抗体を回収することより成るＡＩＤＳ
    ウィルスに対する抗体の調製方法。
  29. （２９）特許請求の範囲第（１）項から（３）項のいず
    れか一つに記載の蛋白質および適合した医薬担体から成
    るワクチン製剤。
  30. （３０）特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    か一つに記載の蛋白質に対して生成した抗体。
  31. （３１）モノクローナル抗体である特許請求の範囲第（
    ３０）項記載の抗体。
  32. （３２）特許請求の範囲第（１）項から第（３）項のい
    ずれか一つに記載の蛋白質の予防免疫ワクチンとしての
    使用。
  33. （３３）特許請求の範囲第（１）項から第（３）項のい
    ずれか一つに記載の蛋白質のＡＩＤＳウィルスに対する
    抗体調製への使用。
  34. （３４）特許請求の範囲第（１）項から第（３）項のい
    ずれか一つに記載の蛋白質のヒト血清中におけるＡＩＤ
    Ｓウィルスに対する抗体の存在検出への使用。
  35. （３５）特許請求の範囲第（１５）項記載の方法により
    調製した特許請求の範囲第（１）項から（３）項のいず
    れか一つに記載の蛋白質。
  36. （３６）特許請求の範囲第（１８）項から（２１）項の
    いずれか一つに記載の方法により調製した特許請求の範
    囲第（８）項から（１２）項のいずれか一つに記載の単
    細胞生物。
  37. （３７）特許請求の範囲第（２８）項記載の方法により
    調製した特許請求の範囲第（３０）項または（３１）項
    のいずれか一つに記載の抗体。
  38. （３８）特許請求の範囲第（２７）項記載の方法により
    調製した特許請求の範囲第（２９）項記載のワクチン。
  39. （３９）容器中に特許請求の範囲第（１）項−（３）項
    のいずれか一つに記載の蛋白質を含むＡＩＤＳウィルス
    に対する抗体測定のためのテストキット。
  40. （４０）特許請求の範囲第（１）項−（３）項のいずれ
    か一つに記載の蛋白質により誘導されたＡＩＤＳウィル
    スに対する抗体を容器中に含むＡＩＤＳウィルス測定の
    ためのテストキット。
JP62082197A 1986-04-04 1987-04-02 Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼ｇａｇ／ｅｎｖ遺伝子蛋白質の発現と精製 Expired - Lifetime JP2625118B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/848,671 US4925784A (en) 1986-04-04 1986-04-04 Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein
US848671 1986-04-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62244393A true JPS62244393A (ja) 1987-10-24
JP2625118B2 JP2625118B2 (ja) 1997-07-02

Family

ID=25303966

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62082197A Expired - Lifetime JP2625118B2 (ja) 1986-04-04 1987-04-02 Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼ｇａｇ／ｅｎｖ遺伝子蛋白質の発現と精製

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4925784A (ja)
JP (1) JP2625118B2 (ja)
KR (1) KR930001118B1 (ja)
AT (1) AT400442B (ja)
AU (1) AU599091B2 (ja)
BE (1) BE1001973A5 (ja)
BR (1) BR8701528A (ja)
CA (1) CA1341249C (ja)
CH (1) CH676004A5 (ja)
DE (3) DE3711016A1 (ja)
DK (1) DK172274B1 (ja)
ES (3) ES2004133A6 (ja)
FR (1) FR2606422B1 (ja)
GB (1) GB2188639B (ja)
IL (1) IL82088A (ja)
IT (1) IT1203851B (ja)
NL (1) NL192275C (ja)
NO (1) NO871409L (ja)
NZ (1) NZ219837A (ja)
SE (1) SE8701413L (ja)
SG (1) SG102792G (ja)
SU (1) SU1644720A3 (ja)
ZA (1) ZA871724B (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01160998A (ja) * 1987-11-16 1989-06-23 F Hoffmann La Roche Ag ポリペプチド
JPH01163665A (ja) * 1987-09-04 1989-06-27 Wellcome Found Ltd:The イムノアツセイおよびそれに使用される生物学的構築体
JPH01179687A (ja) * 1987-12-30 1989-07-17 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｈｉｖ融合蛋白質
JPH03501722A (ja) * 1988-01-12 1991-04-18 ジーンラブズ　テクノロジーズ，インコーポレイテッド Ｈｔｌｖ‐ｉペプチド抗原および分析法
JPH04506301A (ja) * 1989-10-13 1992-11-05 コノート　ラボラトリーズ　リミテッド エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9309574B1 (en) 1984-08-22 2016-04-12 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Molecular cloning of HIV-1 from immortalized cell lines
ES2054616T3 (es) * 1985-12-17 1994-08-16 Akzo Nv Reactivo inmunoquimico.
JPS62502868A (ja) * 1985-12-24 1987-11-19 アメリカ合衆国 ヒトｔリンパ球指向性ウイルスタイプ３のプラスミド及びファ−ジクロ−ン
US4925784A (en) * 1986-04-04 1990-05-15 Hoffmann-La Roche Inc. Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein
US4983387A (en) * 1986-05-19 1991-01-08 Viral Technologies Inc. HIV related peptides, immunogenic antigens, and use therefor as subunit vaccine for AIDS virus
US5142025A (en) * 1986-08-01 1992-08-25 Repligen Corporation Recombinant HTLV-III proteins and uses thereof
NZ221440A (en) * 1986-08-20 1991-11-26 Genetic Systems Corp Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections
US5166050A (en) * 1986-08-20 1992-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies and peptides useful in treating and diagnosing HIV infections
US5041385A (en) * 1986-11-01 1991-08-20 Oxford Gene Systems Limited Vector expressing fusion proteins and particles
EP0287226A1 (en) * 1987-03-23 1988-10-19 Hiver Limited Novel vaccines
EP0311228A3 (en) * 1987-10-09 1990-05-02 Repligen Corporation Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus
NO881501L (no) * 1987-10-09 1989-04-10 Repligen Corp Rekombinante htlv-111-proteiner og anvendelser av disse.
US5780038A (en) * 1987-11-16 1998-07-14 Roche Diagnostic Systems, Inc. HIV-2 envelope polypeptides
US5204259A (en) * 1988-05-06 1993-04-20 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. Methods and systems for producing HIV antigens
ATE110112T1 (de) * 1988-05-06 1994-09-15 Ferropas Ag Verfahren und systeme zur herstellung von hiv- antigenen.
FR2632310B1 (fr) * 1988-06-06 1992-04-10 Pasteur Institut Peptides ayant des proprietes protectrices d'un virus pathogene du type hiv dans des cellules sensibles
US6197496B1 (en) * 1988-06-09 2001-03-06 Institut Pasteur Immunological reagents and diagnostic methods for the detection of human immunodeficiency virus type 2 utilizing multimeric forms of the envelope proteins gp300, p200, and p90/80
CA2003383A1 (en) 1988-11-23 1990-05-23 Sushil G. Devare Synthetic dna derived recombinant hiv antigens
US5817318A (en) * 1989-05-03 1998-10-06 Connaught Laboratories Limited Synthetic peptides for an HIV-1 vaccine
ES2140380T5 (es) * 1990-03-21 2005-03-16 Geneart Gmbh Secuencias de adn que codifican polipeptidos gag retroviricos modificados y vacunas que las contienen o agregados de las mismas.
US6228608B1 (en) 1991-02-28 2001-05-08 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Recombinant FIV glycoprotein 160 and P24 gag protein
ES2160580T3 (es) * 1991-08-21 2001-11-16 Abbott Lab Ensayo de la hepatitis c que utiliza antigenos recombinantes dirigidos contra la region c-100.
GB9208218D0 (en) * 1992-04-14 1992-05-27 British Bio Technology Hybrid particles
EP0572737B1 (en) * 1992-06-04 2001-02-28 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University HIV Gag-env fusion antigen
KR0172970B1 (ko) * 1992-06-17 1999-02-01 김영길 Aids백신에 유용한 키메릭 단백 및 그의 제조방법
US5580773A (en) * 1992-06-17 1996-12-03 Korea Green Cross Corporation Chimeric immunogenic gag-V3 virus-like particles of the human immunodeficiency virus (HIV)
DK0586076T3 (da) * 1992-08-07 2003-10-20 Wyeth Corp Rekombinant adenovirus-vacciner
JPH08511007A (ja) * 1993-06-09 1996-11-19 コノート ラボラトリーズ リミテッド タンデム合成ｈｉｖ−１ペプチド
DK0638316T3 (da) * 1993-08-11 2003-09-22 Wyeth Corp Rekombinante adenovirusvacciner
US6025141A (en) * 1993-12-10 2000-02-15 The Canadian Red Cross Society Immunofluorescence assay for the detection of antibodies using recombinant antigens in insoluble form
DE4405810A1 (de) 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung
WO1995032000A1 (en) * 1994-05-20 1995-11-30 Microgenesys, Inc. Hiv polyprotein immunogens
FR2726576B1 (fr) * 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante
US6846905B2 (en) * 1997-08-15 2005-01-25 Abbott Laboratories Antigen constructs useful in the detection and differentiation of antibodies to HIV
NO311807B1 (no) 1999-03-04 2002-01-28 Bionor Immuno As HIV-peptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay- testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkalt av HIV
DE10106295C1 (de) * 2001-02-02 2002-08-22 Gaifar German American Inst Fo Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen, welches immobilisiert ist
CA2874936A1 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Bionor Immuno As Vaccine
JP2017523166A (ja) 2014-07-11 2017-08-17 ビオノール イミュノ エーエスＢｉｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ ヒト免疫不全ウイルスｉ（ｈｉｖ）の病理学的影響を減少及び／若しくは遅延させるか又は後天性免疫不全症候群（ａｉｄｓ）を発症するリスクを低減させる方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6067859A (ja) * 1983-09-15 1985-04-18 インスティチュート・パスツール リンパ節疾患及び後天性免疫不全症候群の診断用抗原組成物、検出方法及び診断キット

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
DE2814039C3 (de) * 1978-03-31 1981-02-19 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien
GB8423659D0 (en) * 1984-09-19 1984-10-24 Pasteur Institut Cloned dna sequences
IE58321B1 (en) * 1984-04-23 1993-09-08 Us Health Isolation of proteins of HTLV-III, serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with aids and pre-aids conditions, and detection of HTLV-III infection bi/immuno-assays using HTLV-III infection by immuno-assays using HTLV-III and its proteins
WO1986000930A1 (en) * 1984-07-20 1986-02-13 Worcester Foundation For Experimental Biology Retroviral vaccines and vectors and methods for their construction
IL76082A (en) * 1984-08-22 1991-07-18 Us Health Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof
NZ213823A (en) * 1984-10-26 1988-05-30 Us Health Producing human t-cell leukemia retrovirus envelope protein fragments in bacteria
CA1341423C (en) * 1984-10-31 2003-03-04 Paul A. Luciw Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome
EP0187041B1 (en) * 1984-12-24 1996-05-15 Genentech, Inc. Fusions of AIDS-related polypeptides
US4774175A (en) * 1985-03-01 1988-09-27 Centocor, Inc. Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3650011T2 (de) * 1985-04-08 1994-11-17 Genetic Systems Corp EXPRESSION UND DIAGNOSE MIT gag-KODIERTEN PEPTIDEN, DIE MIT ANTIKÖRPERN GEGEN LAV IMMUNOLOGISCH REAKTIV SIND.
DK171119B1 (da) * 1985-04-19 1996-06-17 Hoffmann La Roche AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin
ATE116006T1 (de) * 1985-04-29 1995-01-15 Genetic Systems Corp Synthetische antigene zum nachweis von aids.
EP0213894A3 (en) * 1985-08-23 1987-10-21 Advanced Genetics Research Institute Defective viral particle vaccines and methods for their use
JP2564268B2 (ja) * 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
JP2702911B2 (ja) * 1985-09-11 1998-01-26 ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法
GR862412B (en) * 1985-09-25 1987-01-23 Oncogen Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome
GB8525615D0 (en) * 1985-10-17 1985-11-20 Hoffmann La Roche Polypeptides
WO1987002775A1 (en) * 1985-10-24 1987-05-07 Southwest Foundation For Biomedical Research Synthetic peptides and use for diagnosis and vaccination for aids and arc
EP0230222A1 (en) * 1986-01-06 1987-07-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Expression of HTLV-III gag-Gene
US4734362A (en) * 1986-02-03 1988-03-29 Cambridge Bioscience Corporation Process for purifying recombinant proteins, and products thereof
US4753873A (en) * 1986-02-03 1988-06-28 Cambridge Bioscience Corporation Peptides for the diagnosis of HTLV-III antibodies, their preparation and use
US4808536A (en) * 1986-02-27 1989-02-28 Centocor, Inc. Immunochemical method for detection of antibody against HTLV-III core protein based upon recombinant HTLV-III gag gene encoded protein
US4925784A (en) * 1986-04-04 1990-05-15 Hoffmann-La Roche Inc. Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein
GB8629116D0 (en) * 1986-12-05 1987-01-14 Hoffmann La Roche Env/gag polypeptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6067859A (ja) * 1983-09-15 1985-04-18 インスティチュート・パスツール リンパ節疾患及び後天性免疫不全症候群の診断用抗原組成物、検出方法及び診断キット

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01163665A (ja) * 1987-09-04 1989-06-27 Wellcome Found Ltd:The イムノアツセイおよびそれに使用される生物学的構築体
JPH01160998A (ja) * 1987-11-16 1989-06-23 F Hoffmann La Roche Ag ポリペプチド
JPH01179687A (ja) * 1987-12-30 1989-07-17 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｈｉｖ融合蛋白質
JPH03501722A (ja) * 1988-01-12 1991-04-18 ジーンラブズ　テクノロジーズ，インコーポレイテッド Ｈｔｌｖ‐ｉペプチド抗原および分析法
JPH04506301A (ja) * 1989-10-13 1992-11-05 コノート　ラボラトリーズ　リミテッド エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造

Also Published As

Publication number Publication date
DK166087A (da) 1987-10-05
SG102792G (en) 1993-01-29
US4925784A (en) 1990-05-15
ATA82487A (de) 1995-05-15
AT400442B (de) 1995-12-27
ZA871724B (en) 1987-11-25
SE8701413L (sv) 1987-10-05
AU599091B2 (en) 1990-07-12
CH676004A5 (ja) 1990-11-30
NL192275B (nl) 1996-12-02
FR2606422A1 (fr) 1988-05-13
DK166087D0 (da) 1987-04-01
AU7103287A (en) 1987-10-08
ES2009350A6 (es) 1989-09-16
NZ219837A (en) 1990-09-26
FR2606422B1 (fr) 1991-01-04
CA1341249C (en) 2001-06-12
DE3711016A1 (de) 1987-10-08
BR8701528A (pt) 1988-01-19
KR870010189A (ko) 1987-11-30
NL192275C (nl) 1997-04-03
BE1001973A5 (fr) 1990-05-02
GB2188639A (en) 1987-10-07
GB8707971D0 (en) 1987-05-07
KR930001118B1 (ko) 1993-02-18
DK172274B1 (da) 1998-02-16
GB2188639B (en) 1990-09-26
IL82088A (en) 1991-11-21
DE3711016C2 (ja) 1990-08-02
DE3744825C2 (ja) 1990-10-25
IL82088A0 (en) 1987-10-30
IT1203851B (it) 1989-02-23
SE8701413D0 (sv) 1987-04-03
ES2004133A6 (es) 1988-12-01
DE3744827C2 (ja) 1990-08-09
JP2625118B2 (ja) 1997-07-02
NO871409L (no) 1987-10-05
SU1644720A3 (ru) 1991-04-23
IT8719973A0 (it) 1987-04-03
ES2016426A6 (es) 1990-11-01
NL8700795A (nl) 1987-11-02
NO871409D0 (no) 1987-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS62244393A (ja) Ｈｔｌｖ−３ｇａｇ／ｅｎｖ遺伝子蛋白質の発現と精製
KR870000702B1 (ko) 합성 항원 펩티드의 제조방법
JP4456671B2 (ja) Ｊｃ−ウイルスのｖｐ−抗原
CA1341439C (en) Feline t-lymphotropic lentivirus
US5565319A (en) Assay and apparatus for detecting feline immunodeficiency virus
Bruck et al. Biologically active epitopes of bovine leukemia virus glycoprotein gp51: their dependence on protein glycosylation and genetic variability
US5470720A (en) HIV antibody assays comprising p24-gp41 chimeric antigens
PT91881A (pt) Processo para a preparacao de novas proteinas e peptideos de hiv uteis no diagnostico, profilaxia ou terapia da sida
JPH0659221B2 (ja) Ｄｎａ運搬仲介物
KR920008744B1 (ko) Hiv 감염의 치료 및 진단용 모노클로날항체 및 펩티드
JPH07143888A (ja) 型特異的乳頭腫ウイルスｄｎａ配列およびペプチド
JP2004224798A (ja) Ｈｔｌｖ−ｉｉｉｄｎａのクローニングおよび発現
JPS63503513A (ja) Ｌａｖウィルス変異株、これらのｄｎａおよびタンパク成分ならびに、特に診断目的および免疫原性組成物製造用のそれらの用途
JPS6299398A (ja) 新規ポリペプチド
JP4463877B2 (ja) 合成ペプチドとそれを含むワクチン
JPH02238884A (ja) ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主
JPS63258575A (ja) 昆虫細胞中でつくられる組換えｈｉｖエンベロープタンパク
JPH0195773A (ja) エイズの診断、予防、又は治療に有用な新規なｈｉｖ蛋白質及びペプチド類
KR960005181B1 (ko) 재조합 htlv-ⅲ 단백질 및 이의 용도
JP2887238B2 (ja) ポリペプチド
JPH02503916A (ja) Ｈｉｖエンベロープ蛋白質に関連する合成ペプチド
JP3213313B2 (ja) 組み換えハイブリッドポーリンエピトープ
JPH04506077A (ja) Ｈｔｌｖ―１感染の診断、治療及び予防接種のためのペプチドとその誘導抗体
JPH02211881A (ja) ＨＩＶに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認識され得る免疫原配列を含むＨＢｓＡｇ抗原の形態学的特徴を有する組換えハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子、かかる粒子をコードするヌクレオチド配列及び核粒子を含むワクチン
EP0378929A2 (en) Membrane proteins and peptides of haemophilus influenzae type b

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term