JP2625118B2 - Htlv−▲iii▼gag/env遺伝子蛋白質の発現と精製 - Google Patents
Htlv−▲iii▼gag/env遺伝子蛋白質の発現と精製Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は後天性免疫不全症候群(AIDS)の病因物質で
あるHTLV−IIIウイルスの核蛋白質(gag)およびエンベ
ロープ蛋白質(env)から成るgag/envと命名した蛋白質
に関するものである。本蛋白質は有機合成法により、ま
たは必要な遺伝子配列を適当なDNAベクターを介して適
合した単細胞生物に挿入する組換えDNA技術を利用する
ことにより生成される。
あるHTLV−IIIウイルスの核蛋白質(gag)およびエンベ
ロープ蛋白質(env)から成るgag/envと命名した蛋白質
に関するものである。本蛋白質は有機合成法により、ま
たは必要な遺伝子配列を適当なDNAベクターを介して適
合した単細胞生物に挿入する組換えDNA技術を利用する
ことにより生成される。
本発明はさらにgag/env蛋白質の単離および精製そし
て本蛋白質を利用してヒト血清或いは他の生体試料中の
AIDS抗体またはウイルスの検出並びにAIDSに対して人類
を免疫予防防御する方法に関する。
て本蛋白質を利用してヒト血清或いは他の生体試料中の
AIDS抗体またはウイルスの検出並びにAIDSに対して人類
を免疫予防防御する方法に関する。
1985年にほとんど8,000人の人がAIDSを有すると診断
され、その数は着実に上昇している。1986年にはさらに
15,000人の人が新たにAIDSと診断されると考えられ、19
87年にはその数はさらに2倍となるであろう[New Yrok
Times Magazine,1986年3月2日,42頁]。AIDSは体の
免疫系に対する影響の二次作用として重度の日和見感染
が始まることが特色である[Gottliebら、New Eng.J.Me
d.305巻,1425頁(1981年)]。本疾患は男性同性愛者、
血液製品を注射した患者、薬物静注常用者およびハイチ
および中央アフリカ出身者などに見つかつている[Piot
ら,Lancet,11巻,65頁(1984年)]。
され、その数は着実に上昇している。1986年にはさらに
15,000人の人が新たにAIDSと診断されると考えられ、19
87年にはその数はさらに2倍となるであろう[New Yrok
Times Magazine,1986年3月2日,42頁]。AIDSは体の
免疫系に対する影響の二次作用として重度の日和見感染
が始まることが特色である[Gottliebら、New Eng.J.Me
d.305巻,1425頁(1981年)]。本疾患は男性同性愛者、
血液製品を注射した患者、薬物静注常用者およびハイチ
および中央アフリカ出身者などに見つかつている[Piot
ら,Lancet,11巻,65頁(1984年)]。
原因物質はAIDSの疫学パターンが伝染病のパターンと
一致することよりウイルス性であると考えられた。少な
くとも3種のレトロウイルスが何人からのAIDS患者の培
養T−細胞またはAIDSの危険性のある人の白血球細胞か
ら単離されている。リンパ腺症関連ウイルス(LAV)と
呼ばれる新しいヒトレトロウイルスが発見され、その性
状はAIDSの病因的役割と一致していた。このウイルスは
リンパ腺症患者から単離され、従つてそのように命名さ
れた[Montaguierら,Human T−cell Leukemia/Lymphoma
Virus,R.C.Galloら編集、Cold Spring Harbor Laborat
ory,363−370頁(1984年)]。
一致することよりウイルス性であると考えられた。少な
くとも3種のレトロウイルスが何人からのAIDS患者の培
養T−細胞またはAIDSの危険性のある人の白血球細胞か
ら単離されている。リンパ腺症関連ウイルス(LAV)と
呼ばれる新しいヒトレトロウイルスが発見され、その性
状はAIDSの病因的役割と一致していた。このウイルスは
リンパ腺症患者から単離され、従つてそのように命名さ
れた[Montaguierら,Human T−cell Leukemia/Lymphoma
Virus,R.C.Galloら編集、Cold Spring Harbor Laborat
ory,363−370頁(1984年)]。
他のヒトレトロウイルス、具体的にはヒトT−細胞白
血病/リンパ腫/リンパ趨向性ウイルスのI型[Poiesz
ら,Proc Natl Acad Sci,U.S.A.,77巻,7415頁(1980
年)]およびIII型[Poieszら,Science 224巻,497頁(1
984年)]の二つのサブグループ、も単離されている。
またもう一つのAIDS−関連レトロウイルス(ARV)と呼
ばれるウイルスも原因物質として提案されている[Levy
ら,Science 225巻,840頁(1984年)]。HTLV−IIIおよ
びARVレトロウイルスの両者共LAVと類似した生物学的お
よび血清疫学的性質を示す[Levyら,上述;Popovicら,
上述]。従つて少なくとも三種のレトロウイルスがAIDS
の病因物質として考えられてきた:LAV,ARVおよびHTLV−
IIIである。本明細書ではこれらのウイルスをまとめてA
IDSウイルスと呼ぶ。HTLV−IIIがこのグループの原型で
あるので、「HTVL−IIIウイルスの蛋白質の配列に対応
する抗原決定因子」という表現は実際には全のAIDSウイ
ルスの蛋白質の配列を意味することになる。
血病/リンパ腫/リンパ趨向性ウイルスのI型[Poiesz
ら,Proc Natl Acad Sci,U.S.A.,77巻,7415頁(1980
年)]およびIII型[Poieszら,Science 224巻,497頁(1
984年)]の二つのサブグループ、も単離されている。
またもう一つのAIDS−関連レトロウイルス(ARV)と呼
ばれるウイルスも原因物質として提案されている[Levy
ら,Science 225巻,840頁(1984年)]。HTLV−IIIおよ
びARVレトロウイルスの両者共LAVと類似した生物学的お
よび血清疫学的性質を示す[Levyら,上述;Popovicら,
上述]。従つて少なくとも三種のレトロウイルスがAIDS
の病因物質として考えられてきた:LAV,ARVおよびHTLV−
IIIである。本明細書ではこれらのウイルスをまとめてA
IDSウイルスと呼ぶ。HTLV−IIIがこのグループの原型で
あるので、「HTVL−IIIウイルスの蛋白質の配列に対応
する抗原決定因子」という表現は実際には全のAIDSウイ
ルスの蛋白質の配列を意味することになる。
AIDSの真の病因物質を決めるのが難しい一つの理由は
いろいろなレトロウイルス抗原がAIDS患者の血清試料と
交叉反応を示すためであつた。例えば、AIDS患者の血清
試料はHTLV−I[Essexら,Science 220巻,859頁(1983
年)]およびHTLV−III(Sarngadharanら,Science,224
巻,506頁(1984年)]の両者の抗原と反応することが示
されている。HTLVのエンベロープ遺伝子産物は成人T−
細胞白血病患者の血清の抗体と交叉反応する抗原性を示
した[Kiyokawaら、Proc Natl.Acad.Sci.USA,81巻,6202
頁(1984年)]。成人T−細胞白血病(ATL)と後天性
免疫不全症候群(AIDS)とはHTLV−IがT細胞の非制御
増殖を特徴とするT細胞悪性を起す点にある。AIDSでは
細胞増殖の代りに細胞死滅が起る。事実、このHTLV−II
Iの細胞変性特質はこの疾患特有のレトロウイルス起源
を最終的に決定するのに重要であつた。
いろいろなレトロウイルス抗原がAIDS患者の血清試料と
交叉反応を示すためであつた。例えば、AIDS患者の血清
試料はHTLV−I[Essexら,Science 220巻,859頁(1983
年)]およびHTLV−III(Sarngadharanら,Science,224
巻,506頁(1984年)]の両者の抗原と反応することが示
されている。HTLVのエンベロープ遺伝子産物は成人T−
細胞白血病患者の血清の抗体と交叉反応する抗原性を示
した[Kiyokawaら、Proc Natl.Acad.Sci.USA,81巻,6202
頁(1984年)]。成人T−細胞白血病(ATL)と後天性
免疫不全症候群(AIDS)とはHTLV−IがT細胞の非制御
増殖を特徴とするT細胞悪性を起す点にある。AIDSでは
細胞増殖の代りに細胞死滅が起る。事実、このHTLV−II
Iの細胞変性特質はこの疾患特有のレトロウイルス起源
を最終的に決定するのに重要であつた。
AIDSの病因物質はAIDSに悩む患者から単離されたAIDS
に特有な細胞変性レトロウイルスに感染した耐性ヒト腫
瘍T−細胞株(HT)を使用することにより単離された。
このウイルスを用いて血清疫学的測定するとAIDSとHTLV
−IIIウイルス抗原に対する抗体の存在との間に完全な
相関があることがわかつた[Montaguierら,上述;Sarng
adharanら,上述;Schupbachら,Science 224巻,503頁(1
984年)]。さらにリンパ腫症候群の患者のおよそ85%
およびAIDS流行地域の無症候性男性同性愛者のかなりの
割合がHTLV−IIIに対する抗体を血液中に有することも
わかつた。この事よりこれらのデータはHTLV−IIIがAID
Sの主要な病因物質であることを示す。
に特有な細胞変性レトロウイルスに感染した耐性ヒト腫
瘍T−細胞株(HT)を使用することにより単離された。
このウイルスを用いて血清疫学的測定するとAIDSとHTLV
−IIIウイルス抗原に対する抗体の存在との間に完全な
相関があることがわかつた[Montaguierら,上述;Sarng
adharanら,上述;Schupbachら,Science 224巻,503頁(1
984年)]。さらにリンパ腫症候群の患者のおよそ85%
およびAIDS流行地域の無症候性男性同性愛者のかなりの
割合がHTLV−IIIに対する抗体を血液中に有することも
わかつた。この事よりこれらのデータはHTLV−IIIがAID
Sの主要な病因物質であることを示す。
H−9細胞株を用いてAIDSウイルスの培養に成功する
までAIDSウイルスのenv AIDS蛋白質は単離され、特徴づ
けられ、或いは合成されてなかつた。これは主としてウ
イルスが細胞変性性で従つてウイルスを単離することが
可能でなかつたためである[Popovicら,上述]。しか
しこのウイルスの細胞変性効果に耐性なヒトT−細胞株
が発見されると、AIDSプロウイルスDNAの分子クローニ
ングも行なうことが出来た。
までAIDSウイルスのenv AIDS蛋白質は単離され、特徴づ
けられ、或いは合成されてなかつた。これは主としてウ
イルスが細胞変性性で従つてウイルスを単離することが
可能でなかつたためである[Popovicら,上述]。しか
しこのウイルスの細胞変性効果に耐性なヒトT−細胞株
が発見されると、AIDSプロウイルスDNAの分子クローニ
ングも行なうことが出来た。
ヒト血液および他の生体試料のAIDS診断のための迅速
かつ高感度な方法およびワクチンによる本疾患の予防法
の必要性は非常に大きい。実際には現在使用できるアツ
セイおよびテストは全て誤りが多い。事実Center for D
isease Control(CDC)は現在使用されているテストはH
TLV−IIIに対する抗体の存在の有無のための血液検索に
のみ使用すべきと言う。CDCはさらに現在使用できる酵
素結合免疫アツセイ(ELISA)テストは危険度の高い住
民の一般検索のためまたはAIDSの診断テストとして使用
すべきでないとまで言つている[Federal Register 50
巻(48);9909頁,1985年3月12日]。
かつ高感度な方法およびワクチンによる本疾患の予防法
の必要性は非常に大きい。実際には現在使用できるアツ
セイおよびテストは全て誤りが多い。事実Center for D
isease Control(CDC)は現在使用されているテストはH
TLV−IIIに対する抗体の存在の有無のための血液検索に
のみ使用すべきと言う。CDCはさらに現在使用できる酵
素結合免疫アツセイ(ELISA)テストは危険度の高い住
民の一般検索のためまたはAIDSの診断テストとして使用
すべきでないとまで言つている[Federal Register 50
巻(48);9909頁,1985年3月12日]。
今まで用いられてきたAIDSテストの誤りはAIDSの病因
物質の特異的抗原蛋白質を用いていないことに依る。従
来用いられた蛋白質はウイルス溶解物に起因した。溶解
物はウイルスに感染したヒト細胞、即ち、ウイルスを増
殖させるのに用いた細胞、から調製しているため、溶解
物はウイルス蛋白質と共にヒト蛋白質を含有している。
従つてウイルス蛋白質の純粋な抗原を調製するのは困難
であつた。今まで使用された抗原は偽陽性および偽陰性
の両方を誘導した[Budiansky,Nature,312巻,583頁(19
84年)]。このような溶解物蛋白質/ペプチドの使用に
起因する誤りはAIDS抗体結合のためにAIDS特異蛋白質以
外の蛋白質を実質含まない成分を使用することにより避
けられる。実質的に純粋なAIDSエンベロープおよびコア
蛋白質を抗原として使用できる。
物質の特異的抗原蛋白質を用いていないことに依る。従
来用いられた蛋白質はウイルス溶解物に起因した。溶解
物はウイルスに感染したヒト細胞、即ち、ウイルスを増
殖させるのに用いた細胞、から調製しているため、溶解
物はウイルス蛋白質と共にヒト蛋白質を含有している。
従つてウイルス蛋白質の純粋な抗原を調製するのは困難
であつた。今まで使用された抗原は偽陽性および偽陰性
の両方を誘導した[Budiansky,Nature,312巻,583頁(19
84年)]。このような溶解物蛋白質/ペプチドの使用に
起因する誤りはAIDS抗体結合のためにAIDS特異蛋白質以
外の蛋白質を実質含まない成分を使用することにより避
けられる。実質的に純粋なAIDSエンベロープおよびコア
蛋白質を抗原として使用できる。
HTLV−IIIのエンベロープおよびコア蛋白質の両方共
保存された抗原決定因子を有し、そのためAIDSウイルス
の検索、診断および/またはワクチンによる予防を可能
とする。そしてHTLV−IIIに接触し、従つてAIDSに感染
している危険性の高い人またはかかつている人をその血
液中のウイルス核(コア)蛋白質(gag)および/また
はエンベロープ蛋白質(env)に対する抗体の存在によ
り同定できる[Sarngadharanら,Science 224頁,506頁
(1984年)]。
保存された抗原決定因子を有し、そのためAIDSウイルス
の検索、診断および/またはワクチンによる予防を可能
とする。そしてHTLV−IIIに接触し、従つてAIDSに感染
している危険性の高い人またはかかつている人をその血
液中のウイルス核(コア)蛋白質(gag)および/また
はエンベロープ蛋白質(env)に対する抗体の存在によ
り同定できる[Sarngadharanら,Science 224頁,506頁
(1984年)]。
血液または他の生体試料中のAIDSウイルス自身または
その粒子の存在を検出する信頼できる敏感なテストが手
に入る事もまた重要である。Groopmanら[Blood,66巻,7
42頁(1985年)]はAIDSウイルスに対する抗体はAIDS患
者の血液中に必ず存在するとは限らないと報告してい
る。Groopmanらは一人のAIDS患者ともう一人の関連疾患
(ARC)を検査し、抗体陰性であるがHTLV−IIIが培養で
きた血液試料を得た。
その粒子の存在を検出する信頼できる敏感なテストが手
に入る事もまた重要である。Groopmanら[Blood,66巻,7
42頁(1985年)]はAIDSウイルスに対する抗体はAIDS患
者の血液中に必ず存在するとは限らないと報告してい
る。Groopmanらは一人のAIDS患者ともう一人の関連疾患
(ARC)を検査し、抗体陰性であるがHTLV−IIIが培養で
きた血液試料を得た。
最近、AIDS問題にも組換えDNA技術が応用されてき
た。HTLV−IIIからのenv遺伝子の分子クローニングおよ
び発現が報告されている[Crowlら,Cell,41巻,979頁(1
985年);Changら,Biotechnology,3巻,905頁(1985
年)]。Dowbenkoら[Proc Natl Acad sci U.S.A.82巻,
7748頁(1985年)]はHTLV−IIIのコア蛋白質をE.coli
中で発現した。
た。HTLV−IIIからのenv遺伝子の分子クローニングおよ
び発現が報告されている[Crowlら,Cell,41巻,979頁(1
985年);Changら,Biotechnology,3巻,905頁(1985
年)]。Dowbenkoら[Proc Natl Acad sci U.S.A.82巻,
7748頁(1985年)]はHTLV−IIIのコア蛋白質をE.coli
中で発現した。
そのような遺伝子操作実験により、安全で信頼性があ
り生産コストの低い精製ウイルス抗原が入手可能であ
る。しかし、さらに有利なことはenvおよびgagの両蛋白
質に存在する抗原決定因子を有するウイルス蛋白質を入
手できる点である。そのような蛋白質はAIDS抗体の検出
に非常に強力な道具であり、高感度の各種診断テストお
よびAIDSウイルスに対するワクチンの可能性の基礎とな
り得る。
り生産コストの低い精製ウイルス抗原が入手可能であ
る。しかし、さらに有利なことはenvおよびgagの両蛋白
質に存在する抗原決定因子を有するウイルス蛋白質を入
手できる点である。そのような蛋白質はAIDS抗体の検出
に非常に強力な道具であり、高感度の各種診断テストお
よびAIDSウイルスに対するワクチンの可能性の基礎とな
り得る。
そこでgag/envと命名し、HTLV−IIIのgag蛋白質およ
びHTLV−III env蛋白質の少なくとも夫々一つの抗原決
定因子を有する新規蛋白質を提供し、AIDSウイルスの検
索、診断および/またはAIDSウイルスに対するワクチン
による予防が可能となる。新規なgag/eng蛋白質は第2
図に示すアミノ酸配列の全てまたは一部分、或いは機能
的にそれと同等なもので示される。
びHTLV−III env蛋白質の少なくとも夫々一つの抗原決
定因子を有する新規蛋白質を提供し、AIDSウイルスの検
索、診断および/またはAIDSウイルスに対するワクチン
による予防が可能となる。新規なgag/eng蛋白質は第2
図に示すアミノ酸配列の全てまたは一部分、或いは機能
的にそれと同等なもので示される。
本発明はさらに本発明のgag/envポリペプチドをコー
ドする必須DNA、そのようなDNAを含む組換えベクターお
よび本発明のgag/env蛋白質を組換えDNA技術により生産
するのに有用な単細胞生物、さらにそのようなDNA配
列、組換えベクターおよび単細胞生物の調製方法をも提
供する。さらに、本発明のgag/env蛋白質の発現および
単離のための方法も記載している。このようにして生産
したgag/env蛋白質は本発明による方法により多くの重
な免疫手法に利用される。
ドする必須DNA、そのようなDNAを含む組換えベクターお
よび本発明のgag/env蛋白質を組換えDNA技術により生産
するのに有用な単細胞生物、さらにそのようなDNA配
列、組換えベクターおよび単細胞生物の調製方法をも提
供する。さらに、本発明のgag/env蛋白質の発現および
単離のための方法も記載している。このようにして生産
したgag/env蛋白質は本発明による方法により多くの重
な免疫手法に利用される。
診断薬としての使用により、gag/env蛋白質はヒト血
清または涙、精液、膣分泌液および唾液のような生体液
中のAIDSウイルスに対する抗体の存在を検出するのに利
用できる。本蛋白質は均質に得られるため過去における
比較的不純なHTLV−IIIウイルス蛋白質に基づく診断薬
を使用した時に悩む非特異的反応の問題は除去できる。
清または涙、精液、膣分泌液および唾液のような生体液
中のAIDSウイルスに対する抗体の存在を検出するのに利
用できる。本蛋白質は均質に得られるため過去における
比較的不純なHTLV−IIIウイルス蛋白質に基づく診断薬
を使用した時に悩む非特異的反応の問題は除去できる。
gag/env蛋白質を免疫原として用いるとそこに含まれ
る抗原性決定因子に対する抗体を動物中で生産する。そ
のような抗体は適当に標識したgag/env蛋白質と結合す
ることにより、ヒト血清中または涙、精液、膣分泌液お
よび唾液のような他の生体液中のHTLV−IIIウイルスの
存在を検出するための放射免疫アツセイ(RIA)または
酵素免疫アツセイ(ELISA)に使用される。これらの方
法により検出される粒子(または断片)はウイルスコア
またはエンベロープ蛋白質の断片である。
る抗原性決定因子に対する抗体を動物中で生産する。そ
のような抗体は適当に標識したgag/env蛋白質と結合す
ることにより、ヒト血清中または涙、精液、膣分泌液お
よび唾液のような他の生体液中のHTLV−IIIウイルスの
存在を検出するための放射免疫アツセイ(RIA)または
酵素免疫アツセイ(ELISA)に使用される。これらの方
法により検出される粒子(または断片)はウイルスコア
またはエンベロープ蛋白質の断片である。
適当なワクチン製剤への混合により、本発明のgag/en
v蛋白質は予防免疫処置によるAIDSの蔓延にうち勝つた
め使用される。
v蛋白質は予防免疫処置によるAIDSの蔓延にうち勝つた
め使用される。
gagおよびenv蛋白質を別々に使用するのと比較してga
g/env蛋白質を使用するのに重要な利点がある。env蛋白
質自体は非常に不溶性でそのため精製が困難である。二
つの蛋白質を組合せることによりより容易に可溶化さ
れ、従つて容易に精製できる蛋白質が得られる。勿論大
規模生産および精製も一つの化合物を単離するだけであ
るから簡単になる。その他、gag/env蛋白により別々のg
agおよびenv蛋白質の場合よりも良く働く抗原サンドウ
イツチアツセイの診断キツトの開発が可能になる。
g/env蛋白質を使用するのに重要な利点がある。env蛋白
質自体は非常に不溶性でそのため精製が困難である。二
つの蛋白質を組合せることによりより容易に可溶化さ
れ、従つて容易に精製できる蛋白質が得られる。勿論大
規模生産および精製も一つの化合物を単離するだけであ
るから簡単になる。その他、gag/env蛋白により別々のg
agおよびenv蛋白質の場合よりも良く働く抗原サンドウ
イツチアツセイの診断キツトの開発が可能になる。
gag/env蛋白質はHTLV−IIIに由来するが、本明細書に
記載する診断用および免疫予防法はリンパ腺症関連ウイ
ルス(LAV)およびAIDS関連レトロウイルス(ARV)のよ
うなAIDSに係わる或いは関連している他のどのウイルス
の検出にも応用できる。これはCrowlら[Cell 41巻,979
頁(1985年)]がこれらのウイルスは免疫学的にHTLV−
IIIウイルスと関連し、共通のアミノ酸配列を有するこ
とを示したからである。
記載する診断用および免疫予防法はリンパ腺症関連ウイ
ルス(LAV)およびAIDS関連レトロウイルス(ARV)のよ
うなAIDSに係わる或いは関連している他のどのウイルス
の検出にも応用できる。これはCrowlら[Cell 41巻,979
頁(1985年)]がこれらのウイルスは免疫学的にHTLV−
IIIウイルスと関連し、共通のアミノ酸配列を有するこ
とを示したからである。
本発明は以下に示す詳細な記載を基に次の図面と併せ
て考えるとより容易に理解される。
て考えるとより容易に理解される。
第1図はgag(上図)およびgag/env(下図)蛋白質の
合成を指示する発現ベクターの図示である。gagおよびe
nv遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示し、斜
線の部分はgag/env融合遺伝子のenv部分を表わす。両プ
ラスミド共転写はλPLプロモーターの制御下にあり、翻
訳開始シグナルはプラスミドpEV−vrf2からのものであ
る。
合成を指示する発現ベクターの図示である。gagおよびe
nv遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示し、斜
線の部分はgag/env融合遺伝子のenv部分を表わす。両プ
ラスミド共転写はλPLプロモーターの制御下にあり、翻
訳開始シグナルはプラスミドpEV−vrf2からのものであ
る。
第2図はgag/env融合遺伝子の核酸配列(位置番号お
よび制限エンドヌクレアーゼ部位を示す)およびそれか
ら予想されるgag/env蛋白質のアミノ酸配列を示す。
よび制限エンドヌクレアーゼ部位を示す)およびそれか
ら予想されるgag/env蛋白質のアミノ酸配列を示す。
第3図はE.coli中で生産されたgag/env蛋白質のSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す。写
真1はgag/env融合遺伝子を有する組換えプラスミドを
持つ細胞および対照細胞からの全蛋白のクマシーブルー
染色を示す。写真2および3は細胞全蛋白をenvペプチ
ド500−511に対するウサギ抗体(写真2)またはgag p
24に対する羊抗体(写真3)のウエスタンブロツトであ
る。写真2および写真3の免疫複合体は西洋ワサビのペ
ルオキシターゼで標識した第二の抗体で検出した。いず
れの写真でもg/eはgag/env蛋白質を表わし、cは特異性
を示すため用いた陰性対照試料を表わす。分子量マーカ
ーの移動度(KD)を示し、ゲル中でgag/env蛋白質バン
ドの位置を矢印で示した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す。写
真1はgag/env融合遺伝子を有する組換えプラスミドを
持つ細胞および対照細胞からの全蛋白のクマシーブルー
染色を示す。写真2および3は細胞全蛋白をenvペプチ
ド500−511に対するウサギ抗体(写真2)またはgag p
24に対する羊抗体(写真3)のウエスタンブロツトであ
る。写真2および写真3の免疫複合体は西洋ワサビのペ
ルオキシターゼで標識した第二の抗体で検出した。いず
れの写真でもg/eはgag/env蛋白質を表わし、cは特異性
を示すため用いた陰性対照試料を表わす。分子量マーカ
ーの移動度(KD)を示し、ゲル中でgag/env蛋白質バン
ドの位置を矢印で示した。
本発明の方法は数多くのステツプを伴ない、それは理
論的には、(1)gagおよびenv蛋白質をコードする遺伝
子またはその断片の同定と単離、(2)これらの遺伝子
または遺伝子断片を適当なクローニングベクターに挿入
してgag/env融合遺伝子を含む組換えベクターの構築、
(3)組換えクローニングベクターの適合性の単細胞宿
主生物への移動、(4)適当に修飾した複製可能で挿入
遺伝子配列を発現でき宿主の選択および培養、(5)遺
伝子産物の同定および精製、(6)遺伝子産物のHTLV−
IIIまたは関連ウイルスに対する抗体検出のため、或い
はヒト血清または他の生体液中のウイルス自体またはそ
の断片検出のため使用できる抗体産生のための免疫原と
しての使用、そして(7)AIDSに対する免疫予防防御の
ためのgag/env蛋白質の使用より成る。
論的には、(1)gagおよびenv蛋白質をコードする遺伝
子またはその断片の同定と単離、(2)これらの遺伝子
または遺伝子断片を適当なクローニングベクターに挿入
してgag/env融合遺伝子を含む組換えベクターの構築、
(3)組換えクローニングベクターの適合性の単細胞宿
主生物への移動、(4)適当に修飾した複製可能で挿入
遺伝子配列を発現でき宿主の選択および培養、(5)遺
伝子産物の同定および精製、(6)遺伝子産物のHTLV−
IIIまたは関連ウイルスに対する抗体検出のため、或い
はヒト血清または他の生体液中のウイルス自体またはそ
の断片検出のため使用できる抗体産生のための免疫原と
しての使用、そして(7)AIDSに対する免疫予防防御の
ためのgag/env蛋白質の使用より成る。
単離したHTLV−IIIウイルス粒子は本発明のgagおよび
env両遺伝子の源として使用できる。例えばDowbenkoら
[Proc.Natl Acad Sci.U.S.A.82巻,7748頁(1985年)]
はgag遺伝子の原料としてウイルス遺伝子の5′−領域
から2.2キロベース(kb)断片を用いた。他の方法とし
て、HTLV−IIIのプロウイルス遺伝子を組込んだ細胞か
らの遺伝子DNAを遺伝子の原料として使用することもで
きる[Shawら,Science 226巻,1165頁(1984年)]。Cro
wlら[Cell 41巻,979頁(1985年)]はenv遺伝子を得
るためにHTLV−IIIの感染したH9細胞からの遺伝子DNAを
使用した。
env両遺伝子の源として使用できる。例えばDowbenkoら
[Proc.Natl Acad Sci.U.S.A.82巻,7748頁(1985年)]
はgag遺伝子の原料としてウイルス遺伝子の5′−領域
から2.2キロベース(kb)断片を用いた。他の方法とし
て、HTLV−IIIのプロウイルス遺伝子を組込んだ細胞か
らの遺伝子DNAを遺伝子の原料として使用することもで
きる[Shawら,Science 226巻,1165頁(1984年)]。Cro
wlら[Cell 41巻,979頁(1985年)]はenv遺伝子を得
るためにHTLV−IIIの感染したH9細胞からの遺伝子DNAを
使用した。
gagおよびenv遺伝子の単離の他の方法として遺伝子配
列の化学合成および遺伝子から生産するメツセンジヤー
RNAに相補的なDNAの合成があるが、これらに限定される
ものではない。
列の化学合成および遺伝子から生産するメツセンジヤー
RNAに相補的なDNAの合成があるが、これらに限定される
ものではない。
原料には関係なく、gagおよびenv蛋白質をコードする
DNAはバクテリアにクローンでき、gagおよびenv遺伝子
を含有するクローンは本技術でよく知られる方法により
同定できる。例えば、遺伝子の相補DNA(cDNA)プロー
ブを調製し、ハイブリダイゼーシヨン技術を用いて本遺
伝子を有するクローンの検出に使用できる。
DNAはバクテリアにクローンでき、gagおよびenv遺伝子
を含有するクローンは本技術でよく知られる方法により
同定できる。例えば、遺伝子の相補DNA(cDNA)プロー
ブを調製し、ハイブリダイゼーシヨン技術を用いて本遺
伝子を有するクローンの検出に使用できる。
本発明の好ましい態様として、上述のHTLV−III−感
染H9細胞のDNAをXba I消化して構築した遺伝子ライブラ
リーをλフアージベクターを用いてクローニングし、HT
LV−IIIのプロウイルス遺伝子を有するクローンをTHLV
−III cDNAとハイブリダイゼーシヨンして同定する。そ
のようなクローンの一つをλHXB−3と命名し、このク
ローンのDNAをCla I/Hinc II消化してgag前駆体蛋白質
の大部分をコードする1700塩基対断片を単離した。
染H9細胞のDNAをXba I消化して構築した遺伝子ライブラ
リーをλフアージベクターを用いてクローニングし、HT
LV−IIIのプロウイルス遺伝子を有するクローンをTHLV
−III cDNAとハイブリダイゼーシヨンして同定する。そ
のようなクローンの一つをλHXB−3と命名し、このク
ローンのDNAをCla I/Hinc II消化してgag前駆体蛋白質
の大部分をコードする1700塩基対断片を単離した。
本発明の好ましい態様としてはenv遺伝子配列の直接
の原料はenv蛋白質の514−524残基に対応するenvコドン
を欠損するプラスミドpEV3/env44−640の誘導体であ
る。驚くべきことに、この欠損によりenv遺伝子の発現
が有意に増加する。プラスミドpEV3/env44−640のBgl I
I/Hind III切断によりコドン467から640を含むenv配列
を得た。
の原料はenv蛋白質の514−524残基に対応するenvコドン
を欠損するプラスミドpEV3/env44−640の誘導体であ
る。驚くべきことに、この欠損によりenv遺伝子の発現
が有意に増加する。プラスミドpEV3/env44−640のBgl I
I/Hind III切断によりコドン467から640を含むenv配列
を得た。
HTLV−IIIのenvおよびgag遺伝子を一たび同定して単
離したら、挿入遺伝子配列の転写および翻訳に必要な要
素を含む適当な発現ベクター中にそれを挿入する。有用
なクローニングベクターは種々の既知バクテリアプラス
ミド、フアージDNA、フアージDNAを利用するために改良
したプラスミドのようなプラスミドおよびフアージDNA
の組合せ、或いは酵母プラスミド等のクロモゾーム由
来、非クロモゾーム性および合成DNAの断片より成る。
使用できる特異的クローニングベクターとしては、pEV
−vrfプラスミド(pEV−vrf1,−2および−3)、SV4
0、アデノウイルス、酵母、ラムダgt−WES−ラムダB、
シヤーロン4Aおよび28、ラムダ−gt−1−ラムダB、pU
C8,9,18および19のようなM13−由来ベクター、pBR313,3
22および325、pAC105、pVA51、pACY177、pKH47、pACYC1
84、pUB110、pMB9、ColE1、pSC101、pm121、RSF2124、p
CR1またはRP4などがあるがこれらに限定されるものでは
ない。
離したら、挿入遺伝子配列の転写および翻訳に必要な要
素を含む適当な発現ベクター中にそれを挿入する。有用
なクローニングベクターは種々の既知バクテリアプラス
ミド、フアージDNA、フアージDNAを利用するために改良
したプラスミドのようなプラスミドおよびフアージDNA
の組合せ、或いは酵母プラスミド等のクロモゾーム由
来、非クロモゾーム性および合成DNAの断片より成る。
使用できる特異的クローニングベクターとしては、pEV
−vrfプラスミド(pEV−vrf1,−2および−3)、SV4
0、アデノウイルス、酵母、ラムダgt−WES−ラムダB、
シヤーロン4Aおよび28、ラムダ−gt−1−ラムダB、pU
C8,9,18および19のようなM13−由来ベクター、pBR313,3
22および325、pAC105、pVA51、pACY177、pKH47、pACYC1
84、pUB110、pMB9、ColE1、pSC101、pm121、RSF2124、p
CR1またはRP4などがあるがこれらに限定されるものでは
ない。
gagおよびenv遺伝子のクローニングベクターへの挿入
は、両遺伝子および目的のクローニングベクターを同じ
制限酵素で切断して相補末端を作成することにより容易
に行なうことができる。もしこれが出来ない時には消化
により生成した切断末端を一本鎖DNAを消化することに
より平滑末端を作り、或いは適当なDNAポリメラーゼに
より一本鎖DNAをうめることにより同じように平滑末端
を作つて改良する。こうすることによりT4DNAリガーゼ
のような酵素により平滑末端ライゲーシヨンを行なう。
また別の方法として、DNA末端にヌクレオチド配列(リ
ンカー)を連結することにより目的部位を作ることもで
きる。リンカーは制限部位認識配列をコードする特有の
オリゴヌクリオチド配列より成る。切断ベクターおよび
gagとenv遺伝子断片もMorrowにより記載される[Method
s in Enzymology 68巻,3頁(1979年)]ように同ヌクレ
オチドテイリングにより修飾する。
は、両遺伝子および目的のクローニングベクターを同じ
制限酵素で切断して相補末端を作成することにより容易
に行なうことができる。もしこれが出来ない時には消化
により生成した切断末端を一本鎖DNAを消化することに
より平滑末端を作り、或いは適当なDNAポリメラーゼに
より一本鎖DNAをうめることにより同じように平滑末端
を作つて改良する。こうすることによりT4DNAリガーゼ
のような酵素により平滑末端ライゲーシヨンを行なう。
また別の方法として、DNA末端にヌクレオチド配列(リ
ンカー)を連結することにより目的部位を作ることもで
きる。リンカーは制限部位認識配列をコードする特有の
オリゴヌクリオチド配列より成る。切断ベクターおよび
gagとenv遺伝子断片もMorrowにより記載される[Method
s in Enzymology 68巻,3頁(1979年)]ように同ヌクレ
オチドテイリングにより修飾する。
gagまたはenv遺伝子或いはその断片を適当なクローニ
ングベクターに挿入した後、もう一つの遺伝子または遺
伝子断片は正しい制限エンドヌクレアーゼ切断により最
初の遺伝子と並列に二番目の遺伝子または遺伝子断片を
挿入して融合遺伝子を創成する。勿論gagおよびenv遺伝
子を化学合成する場合には融合遺伝子を直接合成してク
ローニングベクターに一本のDNA断片として挿入でき
る。
ングベクターに挿入した後、もう一つの遺伝子または遺
伝子断片は正しい制限エンドヌクレアーゼ切断により最
初の遺伝子と並列に二番目の遺伝子または遺伝子断片を
挿入して融合遺伝子を創成する。勿論gagおよびenv遺伝
子を化学合成する場合には融合遺伝子を直接合成してク
ローニングベクターに一本のDNA断片として挿入でき
る。
本発明の好ましい態様として、上述のλHXB−3から
のgag遺伝子含有Cla I/Hinc II断片をCla IおよびPvu I
Iで切断したpEV−vrf2プラスミドに結合して、gag残基1
5−512より成る56Kd蛋白質の合成を指示する組換え発現
プラスミドpEV2/gag15−512(第1図、上図)を得る。
残基437に近いBgl II部位の下流のgag配列を上述のプラ
スミドpEV3/env44−640の誘導体(残基514−524欠損)
からのenv配列Bgl II/Hind III断片で置き換え、gag/en
v融合遺伝子を含むプラスミドpEV2/gag15−436/env467
−640Δ514−524(第1図、下図)を得る。
のgag遺伝子含有Cla I/Hinc II断片をCla IおよびPvu I
Iで切断したpEV−vrf2プラスミドに結合して、gag残基1
5−512より成る56Kd蛋白質の合成を指示する組換え発現
プラスミドpEV2/gag15−512(第1図、上図)を得る。
残基437に近いBgl II部位の下流のgag配列を上述のプラ
スミドpEV3/env44−640の誘導体(残基514−524欠損)
からのenv配列Bgl II/Hind III断片で置き換え、gag/en
v融合遺伝子を含むプラスミドpEV2/gag15−436/env467
−640Δ514−524(第1図、下図)を得る。
この構築の詳細は以下の実施例の段落中、特にBから
Eに示した。好ましい態様のgag/env遺伝子の核酸塩基
配列(Maxamの化学切断法、Methods in Enzymology 65
巻,499頁(1980年)、により決定]およびそれから推定
されるgag/env蛋白質のアミノ酸配列を第2図に示す。
Eに示した。好ましい態様のgag/env遺伝子の核酸塩基
配列(Maxamの化学切断法、Methods in Enzymology 65
巻,499頁(1980年)、により決定]およびそれから推定
されるgag/env蛋白質のアミノ酸配列を第2図に示す。
本発明で用いるクローニングベクターの多くは目的の
形質転換株を選択するのに用いる一つまたはそれ以上の
マーカー活性、例えばpBR322でのアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性、pUC8のアンピシリン耐性およびβ
−ガラクトシダーゼ活性およびpEV−rvf2のアンピシリ
ン耐性などを有する。そのようなベクターが挿入された
宿主の選択はベクターがない場合に有していない活性が
ベクターにより発現することで非常に簡単に行なうこと
が出来る。
形質転換株を選択するのに用いる一つまたはそれ以上の
マーカー活性、例えばpBR322でのアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性、pUC8のアンピシリン耐性およびβ
−ガラクトシダーゼ活性およびpEV−rvf2のアンピシリ
ン耐性などを有する。そのようなベクターが挿入された
宿主の選択はベクターがない場合に有していない活性が
ベクターにより発現することで非常に簡単に行なうこと
が出来る。
クローニングベクターの選択した部位に挿入するgag
およびenv遺伝子断片のヌクレオチド配列は真の構造遺
伝子部分でないヌクレオチドを含む場合があることは理
解すべきである。また逆に、遺伝子断片が完全遺伝子の
一部分のみを有することもできる。必要な点はクローニ
ングベクターに挿入した遺伝子断片が適当な宿主生物中
でgagおよびenv蛋白質の配列に対応する少なくとも一つ
の抗原決定因子を有するポリペプチドまたは蛋白質の生
産を指示することが出来ることである。
およびenv遺伝子断片のヌクレオチド配列は真の構造遺
伝子部分でないヌクレオチドを含む場合があることは理
解すべきである。また逆に、遺伝子断片が完全遺伝子の
一部分のみを有することもできる。必要な点はクローニ
ングベクターに挿入した遺伝子断片が適当な宿主生物中
でgagおよびenv蛋白質の配列に対応する少なくとも一つ
の抗原決定因子を有するポリペプチドまたは蛋白質の生
産を指示することが出来ることである。
適当な宿主生物の選択はこの技術で知られる多くの要
因により影響される。要因としては例えば、選んだベク
ターとの適合性、ハイブリツドプラスミドによりコード
される毒性、目的蛋白の回収の容易さ、発現特質、生物
安全性およびコストなどである。これらの要因のバラス
をとらねばならず、ある組換えDNA分子の発現に対して
必ずしも全ての宿主が同等に効果ある訳ではない事を理
解すべきである。
因により影響される。要因としては例えば、選んだベク
ターとの適合性、ハイブリツドプラスミドによりコード
される毒性、目的蛋白の回収の容易さ、発現特質、生物
安全性およびコストなどである。これらの要因のバラス
をとらねばならず、ある組換えDNA分子の発現に対して
必ずしも全ての宿主が同等に効果ある訳ではない事を理
解すべきである。
本発明で使用できる適した宿主単細胞生物としては植
物、動物または酵母細胞およびEscherichia coli,Bacil
lus subtilis,Bacillus stearothermophilusおよび放線
菌などがあるがこれらに限定されるものではない。Casa
dabanら[J.Mol.Biol,138巻,179頁(1980年)]により
報告されたEscherichia coli MC 1061株は他のpRK248cI
tsプラスミドを含むE.coli K−12株と同様使用でき
る。他のE.coli K−12株に使用するためのプラスミド
pRK248cItsはAmerican Type Culture Collection(ATC
C)から自由に入手でき、ATCC33766の番号がついてい
る。E.coli MC1061株もATCCに寄託され(ATCC−5333
8)依頼により自由に入手できる。
物、動物または酵母細胞およびEscherichia coli,Bacil
lus subtilis,Bacillus stearothermophilusおよび放線
菌などがあるがこれらに限定されるものではない。Casa
dabanら[J.Mol.Biol,138巻,179頁(1980年)]により
報告されたEscherichia coli MC 1061株は他のpRK248cI
tsプラスミドを含むE.coli K−12株と同様使用でき
る。他のE.coli K−12株に使用するためのプラスミド
pRK248cItsはAmerican Type Culture Collection(ATC
C)から自由に入手でき、ATCC33766の番号がついてい
る。E.coli MC1061株もATCCに寄託され(ATCC−5333
8)依頼により自由に入手できる。
組換えクローニングベクターの宿主細胞への移入はい
ろいろな方法で実行できる。選んだそのベクター/宿主
細胞系によつて形質転換、形質導入またはトランスフエ
クシヨンにより行なえる。そのような修飾宿主細胞が得
られると、細胞を培養して培養物より蛋白質発現産物を
単離する。
ろいろな方法で実行できる。選んだそのベクター/宿主
細胞系によつて形質転換、形質導入またはトランスフエ
クシヨンにより行なえる。そのような修飾宿主細胞が得
られると、細胞を培養して培養物より蛋白質発現産物を
単離する。
E.coli中で生産されるとgag/env蛋白質は大部分細胞
質のバクテリア封入体(不溶性蛋白凝集物)に閉じ込め
られ、この事は蛋白質の精製を非常に容易にする。本発
明のgag/env蛋白産物を単離するには、細菌細胞を好ま
しくは破砕または溶菌し、不溶性蛋白を遠心分離により
回収する。実質的精製は得られる沈でん物を徐々に高い
濃度の尿素で何回か洗い、続いて標準蛋白質精製法によ
り行なう。
質のバクテリア封入体(不溶性蛋白凝集物)に閉じ込め
られ、この事は蛋白質の精製を非常に容易にする。本発
明のgag/env蛋白産物を単離するには、細菌細胞を好ま
しくは破砕または溶菌し、不溶性蛋白を遠心分離により
回収する。実質的精製は得られる沈でん物を徐々に高い
濃度の尿素で何回か洗い、続いて標準蛋白質精製法によ
り行なう。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のための試料の
ように少量の蛋白質の時には、細胞はドデシル硫酸ナト
リウム(SDS)などの界面活性剤処理により破砕する。
多量の蛋白質は超音波処理或いはフレンチプレスのよう
な他の物理適破砕により回収するのがよい。
ように少量の蛋白質の時には、細胞はドデシル硫酸ナト
リウム(SDS)などの界面活性剤処理により破砕する。
多量の蛋白質は超音波処理或いはフレンチプレスのよう
な他の物理適破砕により回収するのがよい。
細胞破砕はまた化学的或いは酵素的方法によつては行
なう事ができる。細胞膜構成にはしばしば二価陽イオン
が必要であるため、EDTAまたはEGTAのような適当なキレ
ート剤による処理により細胞から蛋白質を漏出するのに
十分な破砕ができることができた。同様にリゾチームの
ような酵素も同じ結果を得た。この酵素は細胞壁のペプ
チドグリカン骨格を加水分解する。リゾチーム処理と合
わせて凍結と融解のくり返えし処理も採用できる。
なう事ができる。細胞膜構成にはしばしば二価陽イオン
が必要であるため、EDTAまたはEGTAのような適当なキレ
ート剤による処理により細胞から蛋白質を漏出するのに
十分な破砕ができることができた。同様にリゾチームの
ような酵素も同じ結果を得た。この酵素は細胞壁のペプ
チドグリカン骨格を加水分解する。リゾチーム処理と合
わせて凍結と融解のくり返えし処理も採用できる。
細胞から出したgag/env蛋白質はこの技術で知られる
方法によつて混合物から同定できる。例えば、本蛋白質
に対する抗体を用いた放射免疫アツセイまたは酵素免疫
アツセイが使用できる。好ましくは蛋白質はSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動と続くウエスタンブロツトま
たは類似の分析により同定する。
方法によつて混合物から同定できる。例えば、本蛋白質
に対する抗体を用いた放射免疫アツセイまたは酵素免疫
アツセイが使用できる。好ましくは蛋白質はSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動と続くウエスタンブロツトま
たは類似の分析により同定する。
本発明のgag/env蛋白質は硫酸ナトリウムまたは硫酸
アンモニウムのような塩による沈澱、または限外濾過、
或いはこの技術でよく知られる他の方法を用いて濃縮さ
れる。その後の精製はゲル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフイー、精製用デイスクゲルまたは、カーテン電気泳
動、等電点分画電気泳動、低温有機溶媒分画或いは向流
分配などの通常の蛋白精製技術により行なう。
アンモニウムのような塩による沈澱、または限外濾過、
或いはこの技術でよく知られる他の方法を用いて濃縮さ
れる。その後の精製はゲル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフイー、精製用デイスクゲルまたは、カーテン電気泳
動、等電点分画電気泳動、低温有機溶媒分画或いは向流
分配などの通常の蛋白精製技術により行なう。
gag/env蛋白質はHTLV−IIIウイルスの二つの主要成分
の抗原性決定因子を含み、このウイルスがAIDSの主たる
病因であつてAIDSまたはARCと掛わるまたは関連してい
るとされる他のウイルスと免疫学的に関連しているた
め、本蛋白質はヒト血清中のAIDSウイルスに対する抗体
の検出のための有力な診断の道具である。この目的のた
めにこの技術で知られる多くの方法により融合蛋白質を
使用できる。
の抗原性決定因子を含み、このウイルスがAIDSの主たる
病因であつてAIDSまたはARCと掛わるまたは関連してい
るとされる他のウイルスと免疫学的に関連しているた
め、本蛋白質はヒト血清中のAIDSウイルスに対する抗体
の検出のための有力な診断の道具である。この目的のた
めにこの技術で知られる多くの方法により融合蛋白質を
使用できる。
例えば、gag/env蛋白質を多くの方法のいずれかで標
識し、標識蛋白質をAIDSウイルスに対する抗体を含むと
疑われるヒト血清試料に添加して標識融合蛋白−抗体複
合体を形成させ、生成した複合体を適当な方法により検
出する。他の例として、本蛋白質を固体担体に固定して
ヒト血清試料と接触させることもできる。試料中のAIDS
ウイルスに対する抗体は固定化蛋白質と結合し、生成す
る複合体は未反応の蛋白質や抗体を洗滌除去した後Stap
hylococcus aureusプロテンA(例えば沃素125で標識)
または第二の抗ヒトIgG抗体(例えば放射同位元素また
は西洋ワサビやラクトペルオキシダーゼで標識)などの
試薬を用いて検出できる。これらの問題に関しては本技
術熟練者には明白な多くの異なる方法があり、そのいく
つかは以下に暗示している。
識し、標識蛋白質をAIDSウイルスに対する抗体を含むと
疑われるヒト血清試料に添加して標識融合蛋白−抗体複
合体を形成させ、生成した複合体を適当な方法により検
出する。他の例として、本蛋白質を固体担体に固定して
ヒト血清試料と接触させることもできる。試料中のAIDS
ウイルスに対する抗体は固定化蛋白質と結合し、生成す
る複合体は未反応の蛋白質や抗体を洗滌除去した後Stap
hylococcus aureusプロテンA(例えば沃素125で標識)
または第二の抗ヒトIgG抗体(例えば放射同位元素また
は西洋ワサビやラクトペルオキシダーゼで標識)などの
試薬を用いて検出できる。これらの問題に関しては本技
術熟練者には明白な多くの異なる方法があり、そのいく
つかは以下に暗示している。
gag/env蛋白質に対する抗体の利用によりヒト血清ま
たは他の生体試料中のAIDSウイルス或いはそれ由来の粒
子の存在のための多種の診断テストを開発できる。その
ための抗体は本蛋白質とそれに対する抗体産生を誘導す
る適合した医薬担体より成るワクチン製剤のT分量を哺
乳造物やニワトリに注射して生産できる。必要な適当な
蛋白量はこの技術の熟練者は知つているが、決まつた実
験により決定できる。本発明の関連で使用する際には、
「医薬担体」という用語はヒトへの投与に適した標準組
成物または動物の種痘に使用される典型的なアジユバン
トを意味する。
たは他の生体試料中のAIDSウイルス或いはそれ由来の粒
子の存在のための多種の診断テストを開発できる。その
ための抗体は本蛋白質とそれに対する抗体産生を誘導す
る適合した医薬担体より成るワクチン製剤のT分量を哺
乳造物やニワトリに注射して生産できる。必要な適当な
蛋白量はこの技術の熟練者は知つているが、決まつた実
験により決定できる。本発明の関連で使用する際には、
「医薬担体」という用語はヒトへの投与に適した標準組
成物または動物の種痘に使用される典型的なアジユバン
トを意味する。
動物の種痘に適したアジユバントとしてはフロインド
完全または不完全アジユバント(ヒトまたは家畜には適
さない)、アジユバント65(落花生油、マンニド−オレ
イン酸および−ステアリン酸アルミニウムを含有)およ
び水酸化アルミニウム、りん酸アルミニウムおよびミヨ
ウバンのような金属ゲル;ヘキサデシルアミン、オクタ
デシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシル
臭化アンモニウム、N1−N−ジオタデシルグリセロール
およびプルロニツク多価アルコールなどのような界面活
性剤;ピラン、硫酸デキストラン、ポリエC、ポリアク
リル酸、カルボポールなどの多価陰イオン;ムラミルジ
ペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどペプチド
類;および油性エマルジヨンなどがあるがこれらに限定
されるものではない。gag/env蛋白質はリポソームや他
のマイクロキヤリア中に封入して投与し、或いは多糖
類、他の蛋白質または他のポリマーと結合してから投与
することもできる。典型的には最初の接種の何週間か後
に一回かそれ以上の追加免疫接種をし、これらの総合効
果によりgag/env蛋白質に対する抗体の高力価産生がで
き、通常の方法により回収できる。
完全または不完全アジユバント(ヒトまたは家畜には適
さない)、アジユバント65(落花生油、マンニド−オレ
イン酸および−ステアリン酸アルミニウムを含有)およ
び水酸化アルミニウム、りん酸アルミニウムおよびミヨ
ウバンのような金属ゲル;ヘキサデシルアミン、オクタ
デシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシル
臭化アンモニウム、N1−N−ジオタデシルグリセロール
およびプルロニツク多価アルコールなどのような界面活
性剤;ピラン、硫酸デキストラン、ポリエC、ポリアク
リル酸、カルボポールなどの多価陰イオン;ムラミルジ
ペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどペプチド
類;および油性エマルジヨンなどがあるがこれらに限定
されるものではない。gag/env蛋白質はリポソームや他
のマイクロキヤリア中に封入して投与し、或いは多糖
類、他の蛋白質または他のポリマーと結合してから投与
することもできる。典型的には最初の接種の何週間か後
に一回かそれ以上の追加免疫接種をし、これらの総合効
果によりgag/env蛋白質に対する抗体の高力価産生がで
き、通常の方法により回収できる。
勿論本蛋白質に対するモノクローナル抗体も現在知ら
れる技術により産生でき、同じ結果が得られる。B細胞
のように抗体産生能を有する体細胞を骨髄腫細胞株と融
合してハイブリドーマ細胞を得る。これらの細胞を試験
管内で、或いは腹水癌として培養して特異抗体を多量に
生産させる。ハイブリドーマ細胞は容易にクローン化で
きるので多数の細胞を早く生産することが可能であり、
それらは全て共通の抗原性決定因子に指示される同じ特
異抗体分子を生産する。この例外的に統一された抗体産
生は抗体を特異診断テストに使用する際有利である。
れる技術により産生でき、同じ結果が得られる。B細胞
のように抗体産生能を有する体細胞を骨髄腫細胞株と融
合してハイブリドーマ細胞を得る。これらの細胞を試験
管内で、或いは腹水癌として培養して特異抗体を多量に
生産させる。ハイブリドーマ細胞は容易にクローン化で
きるので多数の細胞を早く生産することが可能であり、
それらは全て共通の抗原性決定因子に指示される同じ特
異抗体分子を生産する。この例外的に統一された抗体産
生は抗体を特異診断テストに使用する際有利である。
抗原の注射により初回抗原刺激を受けた動物のリンパ
腺および脾臓はB細胞の便利な材料であるが、これら細
胞を初回免疫していない動物より単離してから試験管内
で初回抗原刺激を行なうのも同様に効果ある。
腺および脾臓はB細胞の便利な材料であるが、これら細
胞を初回免疫していない動物より単離してから試験管内
で初回抗原刺激を行なうのも同様に効果ある。
マウスおよびラツテBリンパ球が最も頻繁にハイブリ
ドーマ生産に用いられているが、その代りにウサギ、人
間、蛙または他の動物からの細胞も使用できる。
ドーマ生産に用いられているが、その代りにウサギ、人
間、蛙または他の動物からの細胞も使用できる。
ハイブリドーマ生産のため使用する多くの特有の骨髄
腫細胞株がリンパ球性腫瘍から開発されている[Kohler
およびMilstein,European J.Immunol.6巻,511頁(1976
年);Shulmanら、Nature,276巻,269頁(1978年)]。開
発された多くの細胞株の中でp3/X63−Ag8,p3/NSI/1−Ag
4−1,Sp2/O−Ag14およびS194/5.XXO.BU.1が頻繁に利用
されている。
腫細胞株がリンパ球性腫瘍から開発されている[Kohler
およびMilstein,European J.Immunol.6巻,511頁(1976
年);Shulmanら、Nature,276巻,269頁(1978年)]。開
発された多くの細胞株の中でp3/X63−Ag8,p3/NSI/1−Ag
4−1,Sp2/O−Ag14およびS194/5.XXO.BU.1が頻繁に利用
されている。
ハイブリドーマ生産のための抗体産生脾臓細胞または
リンパ腺細胞と骨髄腫細胞との融合は骨髄腫細胞に対す
る脾細胞またはリンパ球細胞の割合を過剰とし、その比
は20:1ともなり得るが、通常はもつと低い比率が用いら
れる。融合はUV−不活センダイウイルスまたはポリエチ
レングリコール(PEG)のような融合促進剤を用いて行
なう。Gefterら[Somatic Cell Genet3巻;231頁(1977
年)]はジメチルスルホキシドとPEGを組合せるとさら
に細胞融合を高めると報告している。極度に高い効率で
細胞を融合することの出来る電気的装置も開発されてい
る。
リンパ腺細胞と骨髄腫細胞との融合は骨髄腫細胞に対す
る脾細胞またはリンパ球細胞の割合を過剰とし、その比
は20:1ともなり得るが、通常はもつと低い比率が用いら
れる。融合はUV−不活センダイウイルスまたはポリエチ
レングリコール(PEG)のような融合促進剤を用いて行
なう。Gefterら[Somatic Cell Genet3巻;231頁(1977
年)]はジメチルスルホキシドとPEGを組合せるとさら
に細胞融合を高めると報告している。極度に高い効率で
細胞を融合することの出来る電気的装置も開発されてい
る。
融合が起ると未融合の親細胞からハイブリドーマ細胞
を選択する必要がある。この選択はハイブリドーマ細胞
は増殖できるが親細胞は生育できない培地中で細胞を培
養することにより容易に達成できる。融合に使用される
B体細胞は培養寿命が限られていてそのため培養中に失
なわれるが、骨髄腫細胞は培養中で無限の寿命を有する
ので特別の技術により除去しなければならない。
を選択する必要がある。この選択はハイブリドーマ細胞
は増殖できるが親細胞は生育できない培地中で細胞を培
養することにより容易に達成できる。融合に使用される
B体細胞は培養寿命が限られていてそのため培養中に失
なわれるが、骨髄腫細胞は培養中で無限の寿命を有する
ので特別の技術により除去しなければならない。
通常用いる方法では、ヒポキサンチン、フオスフオリ
ボシルトランスフエラーゼ欠損(HPRT~)の骨髄腫細胞
を使用する。これらの細胞はヒポキサンチンの遊離塩基
を再利用する除去経路を欠くためアミノプテリンのよう
な阻害剤を用いてプリンの初めからの合成経路をブロツ
クすると生存できない。親骨髄腫細胞は融合混合物をヒ
ポキサンチン/アミノプテリン/チミジン(HAT)培地
で培養することにより選択的に除去され、ハイブリドー
マ細胞は抗体産生融合細胞によるHPRTの作用のため生存
する。
ボシルトランスフエラーゼ欠損(HPRT~)の骨髄腫細胞
を使用する。これらの細胞はヒポキサンチンの遊離塩基
を再利用する除去経路を欠くためアミノプテリンのよう
な阻害剤を用いてプリンの初めからの合成経路をブロツ
クすると生存できない。親骨髄腫細胞は融合混合物をヒ
ポキサンチン/アミノプテリン/チミジン(HAT)培地
で培養することにより選択的に除去され、ハイブリドー
マ細胞は抗体産生融合細胞によるHPRTの作用のため生存
する。
選択培養の後、生存するハイブリドーマ細胞をクロー
ン化し、種細胞を通常の標準細胞培養法により培養し、
目的の特異免疫グロビンを生産するクローンを酵素免疫
アツセイ(ELISA)また他のテストを用い、抗体を誘導
した抗原の使用に基づいて検出する。
ン化し、種細胞を通常の標準細胞培養法により培養し、
目的の特異免疫グロビンを生産するクローンを酵素免疫
アツセイ(ELISA)また他のテストを用い、抗体を誘導
した抗原の使用に基づいて検出する。
本発明の使用法に基づいて得られる抗−gag/env蛋白
質抗体はさらにAIDSウイルスまたはそれ由来の粒子の各
種診断試験の調製に利用できる。診断システムとしては
遊離溶液または固体での放射免疫アツセイの形態であ
る。その他、酵素免疫アツセイおよび免疫ブロツトに基
づくアツセイがある。これらのアツセイは直接法或いは
抗gag/env蛋白抗体に対する第二抗体を応用した間接法
である。数多くの酵素活性を抗体に結合でき、ペルオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼおよびアルカリフオスフアターゼはそのほんの一例
である。
質抗体はさらにAIDSウイルスまたはそれ由来の粒子の各
種診断試験の調製に利用できる。診断システムとしては
遊離溶液または固体での放射免疫アツセイの形態であ
る。その他、酵素免疫アツセイおよび免疫ブロツトに基
づくアツセイがある。これらのアツセイは直接法或いは
抗gag/env蛋白抗体に対する第二抗体を応用した間接法
である。数多くの酵素活性を抗体に結合でき、ペルオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼおよびアルカリフオスフアターゼはそのほんの一例
である。
これらの試験法の多くにある基本的な原理は、AIDSウ
イルスまたはその断片を含む疑いのあるヒト血清或いは
他の生体試料をgag/env蛋白質に対する抗体の既知力価
量と反応させて抗原−抗体複合体を形成する。このよう
にして形成した複合体を適当な方法によつて検出するも
のである。
イルスまたはその断片を含む疑いのあるヒト血清或いは
他の生体試料をgag/env蛋白質に対する抗体の既知力価
量と反応させて抗原−抗体複合体を形成する。このよう
にして形成した複合体を適当な方法によつて検出するも
のである。
本技術の熟練者は抗−gag/env蛋白質高血清は他にも
いろいろな方法で診断に利用でき、例えば凝集反応試験
などが例であることがわかる。凝集反応アツセイでは、
抗体とAIDSウイルスまたはウイルス断片との相互反応を
粒子を抗−gag/env蛋白質抗体でコートした系を用いて
検出できる。粒子としてはラテツクスビーズ、リポソー
ム、赤血球、ポリアクリルアミドゲルまたは適当なポリ
マー類などがある。
いろいろな方法で診断に利用でき、例えば凝集反応試験
などが例であることがわかる。凝集反応アツセイでは、
抗体とAIDSウイルスまたはウイルス断片との相互反応を
粒子を抗−gag/env蛋白質抗体でコートした系を用いて
検出できる。粒子としてはラテツクスビーズ、リポソー
ム、赤血球、ポリアクリルアミドゲルまたは適当なポリ
マー類などがある。
上に述べたAIDSウイルスまたはAIDSウイルスに対する
抗体の測定方法は容器中に本発明のgag/env蛋白質或い
は本発明のgag/env蛋白質で誘導したAIDSウイルスに対
する抗体を含有した適当なテストキツトで実施できる。
抗体の測定方法は容器中に本発明のgag/env蛋白質或い
は本発明のgag/env蛋白質で誘導したAIDSウイルスに対
する抗体を含有した適当なテストキツトで実施できる。
Crowlらは[Cell 41巻,979−986頁(1985年)]50人
のAIDS患者の血清を遺伝子操作で生産したenv蛋白質と
試験した結果、全てがこの蛋白質と反応性を示したと報
告している。これらの患者の半分は合衆国西海岸出身、
半分は東海岸出身者であつたにも拘らず真実であつた。
試験した全ての血清がenv蛋白質に反応したという事実
は、地理的に離れていて遺伝的にも疑いなくいくらか異
なる、このように反応した抗体を産生するウイルスがそ
のエンベロープ蛋白質中に少なくとも一つの共通の或い
は保存された抗原決定因子を有していた事を示す。
のAIDS患者の血清を遺伝子操作で生産したenv蛋白質と
試験した結果、全てがこの蛋白質と反応性を示したと報
告している。これらの患者の半分は合衆国西海岸出身、
半分は東海岸出身者であつたにも拘らず真実であつた。
試験した全ての血清がenv蛋白質に反応したという事実
は、地理的に離れていて遺伝的にも疑いなくいくらか異
なる、このように反応した抗体を産生するウイルスがそ
のエンベロープ蛋白質中に少なくとも一つの共通の或い
は保存された抗原決定因子を有していた事を示す。
AIDSレトロウイルスのgagコア蛋白質は以前にこのウ
イルスに感染したことのある人の多くに抗体産生を誘導
することが見つかつている[Montagnierら,上述;Schup
bachら、上述;Sarngadharanら,上述]。
イルスに感染したことのある人の多くに抗体産生を誘導
することが見つかつている[Montagnierら,上述;Schup
bachら、上述;Sarngadharanら,上述]。
以上の事を考え合わせると、構成成分であるgagおよ
びenv蛋白質の配列に対応する少なくとも一つの抗原決
定因子を有する本発明のgag/env蛋白質は人類に対して
免疫原性を有し、AIDSワクチンとして有用である。
びenv蛋白質の配列に対応する少なくとも一つの抗原決
定因子を有する本発明のgag/env蛋白質は人類に対して
免疫原性を有し、AIDSワクチンとして有用である。
従つて、gag/env蛋白質(本明細書の記載により、ま
たは化学合成により生産)は本蛋白質および適合する医
薬担体より成るワクチン製剤として使用できる。そのよ
うな製剤には精製蛋白質として使用できるが、またこの
技術で知られる改良によつてさらに免疫原性を高めるこ
ともできる。例えば、本蛋白質を1,3−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミドのような架橋剤との反応により高免疫
原性マトリツクスへと変換することができる。また、本
蛋白質を直接または適当なリンカー分子を介して高免疫
原性蛋白担体分子と共有結合で連結できる。使用できる
担体分子としては、例えばスカシガイヘモシアニンおよ
びジフテリア毒素のような種々の細菌毒素(不活化毒
素)がある。gag/env蛋白質を細菌毒素と結合する場合
には、AIDSとその毒素の起源細菌との両方の予防が出来
る二価性ワクチン製剤を調製できる。
たは化学合成により生産)は本蛋白質および適合する医
薬担体より成るワクチン製剤として使用できる。そのよ
うな製剤には精製蛋白質として使用できるが、またこの
技術で知られる改良によつてさらに免疫原性を高めるこ
ともできる。例えば、本蛋白質を1,3−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミドのような架橋剤との反応により高免疫
原性マトリツクスへと変換することができる。また、本
蛋白質を直接または適当なリンカー分子を介して高免疫
原性蛋白担体分子と共有結合で連結できる。使用できる
担体分子としては、例えばスカシガイヘモシアニンおよ
びジフテリア毒素のような種々の細菌毒素(不活化毒
素)がある。gag/env蛋白質を細菌毒素と結合する場合
には、AIDSとその毒素の起源細菌との両方の予防が出来
る二価性ワクチン製剤を調製できる。
投与経路、抗原量、注射の頻度などは全てこの技術で
の通常の熟練範囲のものである。
の通常の熟練範囲のものである。
<実施例> 以下の実施例でHTLV−IIIウイルスのgag/env蛋白質を
コードする組換えベクターの構築法を示すが、これに限
定されるものではない。本実施例では次のステツプを行
なうが、各ステツプはさらに詳細に後に述べる。
コードする組換えベクターの構築法を示すが、これに限
定されるものではない。本実施例では次のステツプを行
なうが、各ステツプはさらに詳細に後に述べる。
(1) 組換えフアージクローンλHXB−3よりgag遺伝
子のアミノ酸残基15−512(最初の14残基以外の全て)
をコードするDNA配列を切り出し、E.coli発現プラスミ
ドpEV−vrf2に連結してプラスミドpEV2/gag15−512を
得; (2) 発現プラスミドpEV3/env44−640よりenvアミノ
酸残基319−331に対応するDNA配列をプライマー指示変
異により削除し、プラスミドpEV3/env44−640Δ319−33
1を得、 (3) pEV3/env44−640Δ319−339についてプライマ
ー指示変異を行ない、アミノ酸残基514−524をコードす
るヌクレオチドの削除をしてプラスミドpEV3/env44−64
0Δ319−331Δ514−524を得、 (4) プラスミドpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−
524からのenv残基467−640Δ514−524をコードするenv
遺伝子の制限酵素断片を切断したプラスミドpEV2/gag15
−512に連結し、gag残基15−436およびenv残基467−640
Δ514−524をコードする融合遺伝子を作成してプラスミ
ドpEV2/gag15−436/env467−640Δ514−524を得る。
子のアミノ酸残基15−512(最初の14残基以外の全て)
をコードするDNA配列を切り出し、E.coli発現プラスミ
ドpEV−vrf2に連結してプラスミドpEV2/gag15−512を
得; (2) 発現プラスミドpEV3/env44−640よりenvアミノ
酸残基319−331に対応するDNA配列をプライマー指示変
異により削除し、プラスミドpEV3/env44−640Δ319−33
1を得、 (3) pEV3/env44−640Δ319−339についてプライマ
ー指示変異を行ない、アミノ酸残基514−524をコードす
るヌクレオチドの削除をしてプラスミドpEV3/env44−64
0Δ319−331Δ514−524を得、 (4) プラスミドpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−
524からのenv残基467−640Δ514−524をコードするenv
遺伝子の制限酵素断片を切断したプラスミドpEV2/gag15
−512に連結し、gag残基15−436およびenv残基467−640
Δ514−524をコードする融合遺伝子を作成してプラスミ
ドpEV2/gag15−436/env467−640Δ514−524を得る。
構築の各段階でプラスミドはE.coli MC1061株(pRK2
48cIts)に形質転換して再生した。
48cIts)に形質転換して再生した。
A.組換えベクター調製の一般手順 <DNA調製> 1mlの一晩培養物からのプラスミドDNAの小規模単離は
Birnboimらの手法[Nucleic Acids Research 7巻,1513
頁(1979年)]によつて行なつた。本法は分析を目的に
バクテリアのコロニーより少量のDNAを単離できる。多
量のプラスミドDNAは1リツトルの培養物を用い、塩化
セシウムでの遠心分離による標準法で調製できる。
Birnboimらの手法[Nucleic Acids Research 7巻,1513
頁(1979年)]によつて行なつた。本法は分析を目的に
バクテリアのコロニーより少量のDNAを単離できる。多
量のプラスミドDNAは1リツトルの培養物を用い、塩化
セシウムでの遠心分離による標準法で調製できる。
<酵素反応の条件> 使用した全ての制限酵素およびT4DNAリガーゼはマサ
チユセツツ州バーバリーのニユーイングランドバイオラ
ボス(New England Bio Labs)の製品である。これらの
酵素の使用法および使用条件は製造元による指示どおり
である。
チユセツツ州バーバリーのニユーイングランドバイオラ
ボス(New England Bio Labs)の製品である。これらの
酵素の使用法および使用条件は製造元による指示どおり
である。
制限エンドヌクレアーゼの1単位の活性は、反応液量
0.05ml、37℃、60分の消化で1.0μgのDNAを完全消化す
るのに必要な酵素量と定義する。消化反応液は分解する
DNAの他、100μg/mlのウシ血清アルブミンおよび以下に
示す緩衝液成分を含む: Bgl II:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH7.4)、10m
M MgCl2および10mMメルカプトエタノール(2−ME) Cla I:50mM NaCl、6mMトリス−塩酸(pH7.9)および6m
M MgCl2 Hinc II:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH7.4)、7m
M MgCl2および1mMジチオスライトール(DTT) Hind III:50mM NaCl、50mMトリス−塩酸(pH8.0)およ
び10mM MgCl2 Hpa I:6mM KCl、10mMトリス−塩酸(7.4)、10mM MgC
l2および1mM DTT Pst I:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH7.5)および
10mM MgCl2 Pvu II:60mM NaCl、6mMトリス−塩酸(pH7.5)、6mM
MgCl2および6mM2−ME Stu I:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH8.0)、10mM
MgCl2および6mM 2−ME T4DNAライゲーシヨンはDNAおよび50mMトリス−塩酸
(pH7.8)、10mM MgCl2、20mM DTT、1.0mM ATPおよ
び50μg/mlのウシ血清アルブミンを含む反応液中で16℃
にて行なう。1単位のT4 DNAリガーゼ活性は20μの
反応液中でDNAの5′末端濃度として0.12μM(300μg/
ml)のラムダDNAのHind III断片を50%ライゲーシヨン
するのに必要な量と定義する。
0.05ml、37℃、60分の消化で1.0μgのDNAを完全消化す
るのに必要な酵素量と定義する。消化反応液は分解する
DNAの他、100μg/mlのウシ血清アルブミンおよび以下に
示す緩衝液成分を含む: Bgl II:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH7.4)、10m
M MgCl2および10mMメルカプトエタノール(2−ME) Cla I:50mM NaCl、6mMトリス−塩酸(pH7.9)および6m
M MgCl2 Hinc II:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH7.4)、7m
M MgCl2および1mMジチオスライトール(DTT) Hind III:50mM NaCl、50mMトリス−塩酸(pH8.0)およ
び10mM MgCl2 Hpa I:6mM KCl、10mMトリス−塩酸(7.4)、10mM MgC
l2および1mM DTT Pst I:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH7.5)および
10mM MgCl2 Pvu II:60mM NaCl、6mMトリス−塩酸(pH7.5)、6mM
MgCl2および6mM2−ME Stu I:100mM NaCl、10mMトリス−塩酸(pH8.0)、10mM
MgCl2および6mM 2−ME T4DNAライゲーシヨンはDNAおよび50mMトリス−塩酸
(pH7.8)、10mM MgCl2、20mM DTT、1.0mM ATPおよ
び50μg/mlのウシ血清アルブミンを含む反応液中で16℃
にて行なう。1単位のT4 DNAリガーゼ活性は20μの
反応液中でDNAの5′末端濃度として0.12μM(300μg/
ml)のラムダDNAのHind III断片を50%ライゲーシヨン
するのに必要な量と定義する。
<DNA断片のアガロースによる精製> 制限酵素切断の後、クローニング用のDNA断片を1%
アガロース電気泳動により単離する。1μg/mlの臭化エ
チジウムにより検出した後、目的のDNA断片を含むゲル
切片を21ゲージの針で10mMトリス−塩酸(pH7.4)、1mM
EDTAおよび300mM NaClを含有する溶液中に押し出
す。これを−80℃、3時間凍結し、37℃、30分間融解し
て10,000×gで30分間遠心分離する。上澄液を0.45μの
マイレツクスフイルターで濾過し、sec−ブタノールで
0.25mlに濃縮した後E.coli tRNA(転位RNA)10μgを
担体としてエタノール沈でんを3回行なう。
アガロース電気泳動により単離する。1μg/mlの臭化エ
チジウムにより検出した後、目的のDNA断片を含むゲル
切片を21ゲージの針で10mMトリス−塩酸(pH7.4)、1mM
EDTAおよび300mM NaClを含有する溶液中に押し出
す。これを−80℃、3時間凍結し、37℃、30分間融解し
て10,000×gで30分間遠心分離する。上澄液を0.45μの
マイレツクスフイルターで濾過し、sec−ブタノールで
0.25mlに濃縮した後E.coli tRNA(転位RNA)10μgを
担体としてエタノール沈でんを3回行なう。
<培養培地> M9CA培地は1リツトル当り10gのNa2HPO4、3gのKH2P
O4、0.5gのNaClおよび1gのNH4Clを含有し、1mM MgS
O4、0.5%グルコースおよび0.5%カザミノ酸を添加して
pH7.4に調整する。
O4、0.5gのNaClおよび1gのNH4Clを含有し、1mM MgS
O4、0.5%グルコースおよび0.5%カザミノ酸を添加して
pH7.4に調整する。
ルリアブロス(LB)は1リツトル当り5gバクト−酵母
エキス、10gバクト−トリプトンおよび10gNaClを含有
し、pH7.5に調整する。
エキス、10gバクト−トリプトンおよび10gNaClを含有
し、pH7.5に調整する。
指示してある場合にはテトラサイクリンおよびアンピ
シリンをそれぞれ15および50μg/mlの終濃度で添加す
る。
シリンをそれぞれ15および50μg/mlの終濃度で添加す
る。
<形質転換および組換え体の単離> E.coli MC1061株(pRK248cIts)の形質転換はKushne
rのプロトコール[Boyerら編集、Genetic Engineering,
Elsevier/North−Holland,Amsterdam,17頁(1978年)]
の改良法を用い、本質的には以下のとおり行なつた。
rのプロトコール[Boyerら編集、Genetic Engineering,
Elsevier/North−Holland,Amsterdam,17頁(1978年)]
の改良法を用い、本質的には以下のとおり行なつた。
細菌細胞を200mlのLB中30℃でO.D.600が0.5から1.0の
間まで増殖させた後、細胞を6,000×g4℃で5分間遠心
分離して集め、10mMモルホリノプロパンスルホン酸(MO
PS;pH7.0)および10mM RbCl含有の溶液50mlに再けん濁
する。細胞を再び遠心分離で集め、10ml MOPS(pH6.
5)、50mM CaCl2および10mM RbCl含有の溶液30mlに再
びけん濁する。0℃で30分間インキユベートした後細胞
を集め、50mM CaCl2、10m MRbClおよび15%グリセロー
ル含有10mM MOPS(pH6.5)6mlに再けん濁し、40本のエ
ツペンドルフ管に分注して−80℃で凍結する。
間まで増殖させた後、細胞を6,000×g4℃で5分間遠心
分離して集め、10mMモルホリノプロパンスルホン酸(MO
PS;pH7.0)および10mM RbCl含有の溶液50mlに再けん濁
する。細胞を再び遠心分離で集め、10ml MOPS(pH6.
5)、50mM CaCl2および10mM RbCl含有の溶液30mlに再
びけん濁する。0℃で30分間インキユベートした後細胞
を集め、50mM CaCl2、10m MRbClおよび15%グリセロー
ル含有10mM MOPS(pH6.5)6mlに再けん濁し、40本のエ
ツペンドルフ管に分注して−80℃で凍結する。
形質転換には100μの細胞を溶解し、0゜、37゜お
よび0℃でそれぞれ30分、2分および2分間およそ100n
gのDNAを含有するライゲーシヨン反応液サンプル10μ
存在下、各管に0.1〜0.5mlのLBを添加してインキユベー
トする。続いて22℃60分間各管をインキユベートした
後、200mlの細胞けん濁液をアンピシリン含有LB平板上
にまいて30℃20時間インキユベートする。
よび0℃でそれぞれ30分、2分および2分間およそ100n
gのDNAを含有するライゲーシヨン反応液サンプル10μ
存在下、各管に0.1〜0.5mlのLBを添加してインキユベー
トする。続いて22℃60分間各管をインキユベートした
後、200mlの細胞けん濁液をアンピシリン含有LB平板上
にまいて30℃20時間インキユベートする。
<細胞増殖および遺伝子発現の誘導> プラスミドpRK248cItsを保有するE.coli MC1061株の
細胞と発現プラスミドをM9CA培地中30℃で中期対数増殖
まで培養してからλPLリプレツサーを失活させるために
42℃にシフトする。42℃で2時間インキユベート後、誘
導培養物1mlからの細胞を遠心分離で集め、分析のため1
0mMトリス−塩酸(pH7.4)および10%グリセロール含有
のTG緩衝液に再けん濁する。
細胞と発現プラスミドをM9CA培地中30℃で中期対数増殖
まで培養してからλPLリプレツサーを失活させるために
42℃にシフトする。42℃で2時間インキユベート後、誘
導培養物1mlからの細胞を遠心分離で集め、分析のため1
0mMトリス−塩酸(pH7.4)および10%グリセロール含有
のTG緩衝液に再けん濁する。
<SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタ
ンブロツト分析> トリス−グリシン(TG)緩衝液にけん濁した誘導細胞
を等量の2倍濃度試料緩衝液[Laemmli,Nature 227巻、
680頁(1970年)]と混合し、9℃で5分間インキユベ
ート後Laemmliにより記載されるように12.5%ゲルのSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。電気泳動の
後、ゲルの蛋白質を20%メタノールおよび0.01SDS含有1
2.5mMトリスおよび96mMグリシン中pH7.5、95ボルトで6
時間0.1ミクロンのニトロセルロースメンブレン上に電
気ブロツトする。ウエスタンブロツト分析はTowbinら
[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76巻,4350頁(1979年)]
により記載されている通り行なつた。
ンブロツト分析> トリス−グリシン(TG)緩衝液にけん濁した誘導細胞
を等量の2倍濃度試料緩衝液[Laemmli,Nature 227巻、
680頁(1970年)]と混合し、9℃で5分間インキユベ
ート後Laemmliにより記載されるように12.5%ゲルのSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。電気泳動の
後、ゲルの蛋白質を20%メタノールおよび0.01SDS含有1
2.5mMトリスおよび96mMグリシン中pH7.5、95ボルトで6
時間0.1ミクロンのニトロセルロースメンブレン上に電
気ブロツトする。ウエスタンブロツト分析はTowbinら
[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76巻,4350頁(1979年)]
により記載されている通り行なつた。
<プライマー指示部位特異変異処理> プライマー指示の部位特異変異処理はMorinagaら[Bi
otechnology 2巻,636頁(1984年)]により記載された
方法によつて行なつた。変異処理を行なうために使用す
る合成オリゴヌクレオチドは亜りん酸法[Beaucegeら,T
etrahydron Lett.22巻,1859頁(1981年);Matteucciら,
J.Am.Chem.Soc.103巻,3185頁(1981年)]により自動合
成装置を用いて調製し、Maxamら[Methods in Enzymolo
gy 65巻,499頁(1980年)]の方法によるポリアクリル
アミドゲル電気泳動により精製する。
otechnology 2巻,636頁(1984年)]により記載された
方法によつて行なつた。変異処理を行なうために使用す
る合成オリゴヌクレオチドは亜りん酸法[Beaucegeら,T
etrahydron Lett.22巻,1859頁(1981年);Matteucciら,
J.Am.Chem.Soc.103巻,3185頁(1981年)]により自動合
成装置を用いて調製し、Maxamら[Methods in Enzymolo
gy 65巻,499頁(1980年)]の方法によるポリアクリル
アミドゲル電気泳動により精製する。
<コロニーハイブリダイゼーシヨン> コロニーハイブリダイゼーシヨンはGrunsteinら[pro
c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.72巻,3961頁(1975年)]の方
法により行なつた。プライマー指示部位特異変異処理に
用いたと同じオリゴヌクレオチドをManiatisら[Cell
15巻,687頁(1978年)]の記載するポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて5′末端を32P−ATPで標識してハイブリ
ダイゼーシヨンのプローブとした。
c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.72巻,3961頁(1975年)]の方
法により行なつた。プライマー指示部位特異変異処理に
用いたと同じオリゴヌクレオチドをManiatisら[Cell
15巻,687頁(1978年)]の記載するポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて5′末端を32P−ATPで標識してハイブリ
ダイゼーシヨンのプローブとした。
B.プラスミドpEV2/gag15−512の構築 上に示したように、gag/env融合蛋白質を発現する最
後の発現プラスミドの構築は先ず最初の14個のアミノ末
端残基以外の全てをコードするヌクレオチドを含むプラ
スミド(pEV2/gag15−512)の構築に始まる。次にgagの
カルボキシ末端の残基をコードするヌクレオチドのいく
つかをenv配列で置換して最後の融合産物を得る。
後の発現プラスミドの構築は先ず最初の14個のアミノ末
端残基以外の全てをコードするヌクレオチドを含むプラ
スミド(pEV2/gag15−512)の構築に始まる。次にgagの
カルボキシ末端の残基をコードするヌクレオチドのいく
つかをenv配列で置換して最後の融合産物を得る。
プラスミドpEV2/gag15−512を作成するためgag蛋白質
の15−512残基をコードするDNA配列をHTLV−IIIプロウ
イルスを含む組換えフアージラムダクローンλHXB−3
の50μgより50単位のCla Iおよび50単位のHinc IIを用
いて37℃120分間消化して1700bp断片を得る。このDNA断
片を分離用アガロースゲル電気泳動により単離し、0.1
倍濃度のTE緩衝液[1mMトリス−塩酸(pH7.4)および0.
1mM EDTA]に再けん濁して終濃度を0.03pmole/μと
する。
の15−512残基をコードするDNA配列をHTLV−IIIプロウ
イルスを含む組換えフアージラムダクローンλHXB−3
の50μgより50単位のCla Iおよび50単位のHinc IIを用
いて37℃120分間消化して1700bp断片を得る。このDNA断
片を分離用アガロースゲル電気泳動により単離し、0.1
倍濃度のTE緩衝液[1mMトリス−塩酸(pH7.4)および0.
1mM EDTA]に再けん濁して終濃度を0.03pmole/μと
する。
gagDNA断片を挿入するためにE.coliの発現プラスミド
pEV−vrf2を5単位のCla Iおよび5単位のPvu IIで37℃
60分間消化し、λPLプロモーターを含む1700bp断片を1
%アガロースゲルの電気泳動で単離してエタノール沈で
ん後再けん濁して終濃度0.03pmole/μとする。
pEV−vrf2を5単位のCla Iおよび5単位のPvu IIで37℃
60分間消化し、λPLプロモーターを含む1700bp断片を1
%アガロースゲルの電気泳動で単離してエタノール沈で
ん後再けん濁して終濃度0.03pmole/μとする。
この構築に用いるプラスミドpEV−vrf2は容易に入手
できるプラスミドpBR322[ATCC31344]の誘導体であ
る。プラスミドpEV−vrf2の構築はCrowlら[Gene 38巻,
31頁(1985年)]により詳細に記載されている。本構築
に用いる組換えフアージラムダクローンλHXB−3はSha
wら[Science 226巻,1165頁(1984年)]により記載さ
れている。本クローンは上述のとおりHTLV−IIIに感染
したH−9細胞株より標準の組換えDNA技術を用いて得
られる。本発明の使用に適したH9/HTLV−III Bと命名し
たHTLV−III感染ヒト細胞はAmerican Type Culture Col
lectionに寄託番号CRL8543として寄託されている。Shaw
らはHTLV−III遺伝子の配列を報告しているので、それ
らのデータを用いてDNAプローブを容易に合成でき、そ
のプローブを用いてH−9またはウイルスを増殖できる
他の細胞株の遺伝子を単離することができる。
できるプラスミドpBR322[ATCC31344]の誘導体であ
る。プラスミドpEV−vrf2の構築はCrowlら[Gene 38巻,
31頁(1985年)]により詳細に記載されている。本構築
に用いる組換えフアージラムダクローンλHXB−3はSha
wら[Science 226巻,1165頁(1984年)]により記載さ
れている。本クローンは上述のとおりHTLV−IIIに感染
したH−9細胞株より標準の組換えDNA技術を用いて得
られる。本発明の使用に適したH9/HTLV−III Bと命名し
たHTLV−III感染ヒト細胞はAmerican Type Culture Col
lectionに寄託番号CRL8543として寄託されている。Shaw
らはHTLV−III遺伝子の配列を報告しているので、それ
らのデータを用いてDNAプローブを容易に合成でき、そ
のプローブを用いてH−9またはウイルスを増殖できる
他の細胞株の遺伝子を単離することができる。
300pmoleのgag/Cla I−Hinc II断片を0.03pmoleのpEV
−vrf2/Cla I−Pvu II断片と混ぜ、200単位のT4DNAリガ
ーゼを用いて反応液10μ中で15℃18時間ライゲーシヨ
ンを行なう。その生成物をE.coli MC1061株(pRK248cI
ts)に形質転換し、転換株をアンピシリン含有LB寒天平
板で30℃18時間インキユベーシヨンして選択した。組換
えプラスミドDNAはBgl II、Pst IまたはHind IIIで切断
後、制限断片の大きさを分析して確認した。DNAの大き
さの分析で正しかつたものについてgag前駆ポリペプチ
ドの合成をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動および
ウエタンブロツト分析で評価した。
−vrf2/Cla I−Pvu II断片と混ぜ、200単位のT4DNAリガ
ーゼを用いて反応液10μ中で15℃18時間ライゲーシヨ
ンを行なう。その生成物をE.coli MC1061株(pRK248cI
ts)に形質転換し、転換株をアンピシリン含有LB寒天平
板で30℃18時間インキユベーシヨンして選択した。組換
えプラスミドDNAはBgl II、Pst IまたはHind IIIで切断
後、制限断片の大きさを分析して確認した。DNAの大き
さの分析で正しかつたものについてgag前駆ポリペプチ
ドの合成をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動および
ウエタンブロツト分析で評価した。
プラスミドpEV2/gag15−512を保有する細菌を40℃で
誘導し、その試料を二連でSDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析の調製をした。電気泳動後ゲルを分
けて半分をクマシーブリリアントブルーで染色し、ゲル
の残りの半分を電気ブロツト及び抗−gag抗体を用いて
ウエスタンブロツト分析にかけた。
誘導し、その試料を二連でSDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析の調製をした。電気泳動後ゲルを分
けて半分をクマシーブリリアントブルーで染色し、ゲル
の残りの半分を電気ブロツト及び抗−gag抗体を用いて
ウエスタンブロツト分析にかけた。
分析の結果、誘導細胞はゲル中で見かけの分子量がお
よそ56および53Kdの二つの主要バンドで移動する蛋白質
を生産することがわかつた。完全なgag15−512蛋白質の
大きさは約56Kdである。両方の主要蛋白質とも抗−gag
抗体と反応した。抗体と反応性のある多くの低分子蛋白
質も観察された。
よそ56および53Kdの二つの主要バンドで移動する蛋白質
を生産することがわかつた。完全なgag15−512蛋白質の
大きさは約56Kdである。両方の主要蛋白質とも抗−gag
抗体と反応した。抗体と反応性のある多くの低分子蛋白
質も観察された。
C.プラスミドpEV3/env44−640Δ319−331の構築 本発明の最終典型的プラスミドに存在するenv配列は
二つのステツプ(このセクシヨンおよび次のセクシヨン
Dに記載)で導入され、各ステツプともプライマー指示
部位特異変異による特異短鎖ヌクレオチド配列の欠損を
包含する。これらのはじめの欠損(このセクシヨンに記
載)はプラスミドpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−52
4を生成するのに(セクシヨンD)必要である。
二つのステツプ(このセクシヨンおよび次のセクシヨン
Dに記載)で導入され、各ステツプともプライマー指示
部位特異変異による特異短鎖ヌクレオチド配列の欠損を
包含する。これらのはじめの欠損(このセクシヨンに記
載)はプラスミドpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−52
4を生成するのに(セクシヨンD)必要である。
λHXB−3およびpEV−vrfプラスミドからの発現プラ
スミドpEV3/env44−640の構築はCrowlら[Cell 41巻,97
9頁(1985年)]により記載されており、それはE.coli
中で68Kd HTLV−III env特異蛋白質の合成を指示す
る。envアミノ酸残基319−331に対応するDNA配列をプラ
イマー指示変異により、18マー合成オリゴヌクレオチド
3′GCA TTT GTT AAC ATT AGT 3′を用いて削除した。
このオリゴヌクレオチドはenv配列を補足して第318残基
をコードするヌクレオチドと第332残基をコードするヌ
クレオチドとを結合するように設計されている。これら
の配列を合わせた結果、プラスミドDNA中に新たに独特
なHpa I部位が導入され、39bpが削除される。プラスミ
ドpEV3/env44−640中のStu IおよびHind III部位はヘテ
ロ二重鎖分子のギヤツプをつくるのに利用する。
スミドpEV3/env44−640の構築はCrowlら[Cell 41巻,97
9頁(1985年)]により記載されており、それはE.coli
中で68Kd HTLV−III env特異蛋白質の合成を指示す
る。envアミノ酸残基319−331に対応するDNA配列をプラ
イマー指示変異により、18マー合成オリゴヌクレオチド
3′GCA TTT GTT AAC ATT AGT 3′を用いて削除した。
このオリゴヌクレオチドはenv配列を補足して第318残基
をコードするヌクレオチドと第332残基をコードするヌ
クレオチドとを結合するように設計されている。これら
の配列を合わせた結果、プラスミドDNA中に新たに独特
なHpa I部位が導入され、39bpが削除される。プラスミ
ドpEV3/env44−640中のStu IおよびHind III部位はヘテ
ロ二重鎖分子のギヤツプをつくるのに利用する。
コロニー検索で32P−標識合成オリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーシヨン陽性であつたコロニーから単
離したDNAでMC1061(pRK248cIts)を形質転換し、新し
い独特のHpa I部位の存在を分析する。
のハイブリダイゼーシヨン陽性であつたコロニーから単
離したDNAでMC1061(pRK248cIts)を形質転換し、新し
い独特のHpa I部位の存在を分析する。
D.プラスミドpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−524の
構築 envをコードする配列内の第二番目の欠損は配列5′A
GA GCA GTG GCA GCA GGA 3′を有する合成オリゴヌクレ
オチドを用いてプライマー指示変異により実施した。こ
のオリゴヌクレオチドはenv蛋白質の第513残基をコード
する配列を第525番目の残基をコードする配列に隣接し
て配置し、従つて514−524残基をコードするヌクレオチ
ドの欠損が達成できる。この欠損はプラスミド中でHpa
IおよびHind III制限部位を用いてenv領域内に一重鎖の
ギヤツプを形成する。
構築 envをコードする配列内の第二番目の欠損は配列5′A
GA GCA GTG GCA GCA GGA 3′を有する合成オリゴヌクレ
オチドを用いてプライマー指示変異により実施した。こ
のオリゴヌクレオチドはenv蛋白質の第513残基をコード
する配列を第525番目の残基をコードする配列に隣接し
て配置し、従つて514−524残基をコードするヌクレオチ
ドの欠損が達成できる。この欠損はプラスミド中でHpa
IおよびHind III制限部位を用いてenv領域内に一重鎖の
ギヤツプを形成する。
再び形質転換した後、32P−標識オリゴヌクレオチド
プローブにより陽性と同定されたもののDNAにつき、Hpa
IおよびHind IIIにより制限切断および続く1%アガロ
ースでの電気泳動により33bpの欠損を分析する。この欠
損はまたMaxamおよびGilbert[Methods in Enzymology
65巻,499頁(1980年)]の方法による化学切断でのDNA
配列決定によつても確認された。
プローブにより陽性と同定されたもののDNAにつき、Hpa
IおよびHind IIIにより制限切断および続く1%アガロ
ースでの電気泳動により33bpの欠損を分析する。この欠
損はまたMaxamおよびGilbert[Methods in Enzymology
65巻,499頁(1980年)]の方法による化学切断でのDNA
配列決定によつても確認された。
前述のとおり、Δ514−524欠損はenvの発現を有意に
増加させた。
増加させた。
E.プラスミドpEV2/gag15−436/env467−640Δ514−524
の構築 2μgのpEV2/gag15−512を5単位のCla Iおよび4単
位のBgl IIで二重消化してgag残基15−436をコードする
1300bp断片、または10単位のPst Iおよび5単位のCla I
でλPLプロモーターを含むおよそ1Kb断片を得る。0.3μ
gのpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−524を10単位のP
st Iおよび4単位のBgl IIで切断してenv残基467−640
Δ514−524をコードするおよそ4Kbの断片を得る。この
ようにして調製した種々のDNA断片を前述のとおり1%
アガロースで分離し、回収する。
の構築 2μgのpEV2/gag15−512を5単位のCla Iおよび4単
位のBgl IIで二重消化してgag残基15−436をコードする
1300bp断片、または10単位のPst Iおよび5単位のCla I
でλPLプロモーターを含むおよそ1Kb断片を得る。0.3μ
gのpEV3/env44−640Δ319−331Δ514−524を10単位のP
st Iおよび4単位のBgl IIで切断してenv残基467−640
Δ514−524をコードするおよそ4Kbの断片を得る。この
ようにして調製した種々のDNA断片を前述のとおり1%
アガロースで分離し、回収する。
単離した夫々のDNA断片を0.03pmoleずつ混合し、200
単位のT4リガーゼの存在下で15℃、18時間ライゲーシヨ
ンする。次に結合反応生成物でMC1061(pRK248 CIts)
を形質転換し、形質転換株をアンピシリン含有LB寒天平
板上で選択する。特有のコロニーからプラスミドDNAを
調製し、PVu II消化後の制限断片サイズの分析により確
認した。
単位のT4リガーゼの存在下で15℃、18時間ライゲーシヨ
ンする。次に結合反応生成物でMC1061(pRK248 CIts)
を形質転換し、形質転換株をアンピシリン含有LB寒天平
板上で選択する。特有のコロニーからプラスミドDNAを
調製し、PVu II消化後の制限断片サイズの分析により確
認した。
単離株12個のうち11株が予想通り3505および2882bpの
Pvu II断片を有する正しいDNA分析結果を示した。陽性
株のうちの2株につきgag/env融合蛋白質の合成を評価
した。これらの株を誘導し、細胞試料をとつてSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、電気ブロツトおよびウエ
スタンブロツトによる分析を行ない、その結果を第3図
に示す。
Pvu II断片を有する正しいDNA分析結果を示した。陽性
株のうちの2株につきgag/env融合蛋白質の合成を評価
した。これらの株を誘導し、細胞試料をとつてSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、電気ブロツトおよびウエ
スタンブロツトによる分析を行ない、その結果を第3図
に示す。
第3図の写真1はgag/env融合遺伝子を含む組換えプ
ラスミド保有細胞から(g/e)および対照細胞から
(c)の細胞全蛋白質のクマシーブルー染色である。写
真2および3は同じ試料のウエスタンブロツト分析で、
env残基500−511に相当する合成ペプチドに対するウサ
ギポリクローナル抗体を用いた場合(写真2)および市
販されているgag蛋白質p24に対する羊ポリクローナル抗
体[写真3、p24蛋白質についてはDowbenkoら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.82巻,7748頁(1985年)参照のこ
と]を用いた場合を示してある。第3図で写真2および
3の免疫複合体は西洋ワサビペルオキシダーゼで標識し
た第二の抗体により検出し、分子量マーカーの移動度も
示してある(Kdで表示)。ゲル中でのgag/env蛋白質の
バンドは矢印で示した。
ラスミド保有細胞から(g/e)および対照細胞から
(c)の細胞全蛋白質のクマシーブルー染色である。写
真2および3は同じ試料のウエスタンブロツト分析で、
env残基500−511に相当する合成ペプチドに対するウサ
ギポリクローナル抗体を用いた場合(写真2)および市
販されているgag蛋白質p24に対する羊ポリクローナル抗
体[写真3、p24蛋白質についてはDowbenkoら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.82巻,7748頁(1985年)参照のこ
と]を用いた場合を示してある。第3図で写真2および
3の免疫複合体は西洋ワサビペルオキシダーゼで標識し
た第二の抗体により検出し、分子量マーカーの移動度も
示してある(Kdで表示)。ゲル中でのgag/env蛋白質の
バンドは矢印で示した。
本発明の精神およびその範囲から逸脱することなく数
多くの変更および変形を行なうことが出来ることは当業
者にとつて明らかなことである。例えば、本発明のgag/
env蛋白質をコードする遺伝子に塩基置換を行ない(本
明細書に参考資料として挙げた配列データを用いて)、
それからいくらか異なる融合蛋白質(しかし機能的に同
等)を生成できる。そのような改良蛋白質も、HTLV−II
Iウイルスのgagおよびenv蛋白質の配列に対応する少な
くとも一つの抗原性決定因子を有する限り、本発明に包
含される。同様に、本発明の蛋白質のアミノ配列自体も
直接変化させることができ、同じ結果である。本明細書
に記載される具体的な態様は例示としてのみであり、本
発明は特許請求の範囲の項によつてのみ制限されるもの
である。
多くの変更および変形を行なうことが出来ることは当業
者にとつて明らかなことである。例えば、本発明のgag/
env蛋白質をコードする遺伝子に塩基置換を行ない(本
明細書に参考資料として挙げた配列データを用いて)、
それからいくらか異なる融合蛋白質(しかし機能的に同
等)を生成できる。そのような改良蛋白質も、HTLV−II
Iウイルスのgagおよびenv蛋白質の配列に対応する少な
くとも一つの抗原性決定因子を有する限り、本発明に包
含される。同様に、本発明の蛋白質のアミノ配列自体も
直接変化させることができ、同じ結果である。本明細書
に記載される具体的な態様は例示としてのみであり、本
発明は特許請求の範囲の項によつてのみ制限されるもの
である。
第1図はgag蛋白質およびgag/env蛋白質の合成のための
発現プラスミドの模式図である。第2図はgag/env融合
遺伝子の塩基配列およびそれより予想されるgag/env蛋
白質のアミノ酸配列を示す構造図である。第3図はE.co
li中で生成されるgag/env蛋白質のSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分析の結果を示す電気泳動図である。
発現プラスミドの模式図である。第2図はgag/env融合
遺伝子の塩基配列およびそれより予想されるgag/env蛋
白質のアミノ酸配列を示す構造図である。第3図はE.co
li中で生成されるgag/env蛋白質のSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分析の結果を示す電気泳動図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/569 G01N 33/577 B 33/577 9282−4B C12N 15/00 A //(C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 ダル ヤング アメリカ合衆国カリフォルニア州オーク ランド,アパートメント 104,カルデ コット レーン 196 (56)参考文献 特開 昭60−67859(JP,A) Cell,Vol.40,(Janua ry 1985)P.9−17 Science,Vol.228,(5 April 1985),P.93−96
Claims (9)
- 【請求項1】HTLV−III gag蛋白質の少なくとも一つの
抗原性決定因子およびHTLV−III env蛋白質の少なくと
も一つの抗原性決定因子に対応するアミノ酸配列を有す
る蛋白質。 - 【請求項2】以下に示すアミノ酸配列またはその機能的
な部分もしくは同等物である特許請求の範囲第1項の蛋
白質。 - 【請求項3】本質的に純粋な形の特許請求の範囲第
(1)項または第(2)項のいずれか一つに記載の蛋白
質。 - 【請求項4】HTLV−III gag蛋白質の少なくとも一つの
抗原性決定因子およびHTLV−III env蛋白質の少なくと
も一つの抗原性決定因子に対応するアミノ酸配列を有す
る蛋白質の製造方法であって、 (a) この蛋白質をコードするDNA配列からなる組換
え発現ベクターを含む単細胞生物を該蛋白質が発現する
ような適当な成育条件下で培養し、そして、 (b) この培養物より該蛋白質を単離し、必要によ
り、それを精製することからなる方法。 - 【請求項5】単細胞生物がE.coli細胞である特許請求の
範囲第(4)項記載の方法。 - 【請求項6】組換えベクターがプラスミドpEV2/gag15−
436/env467−640Δ514−524である特許請求の範囲
(5)項記載の方法。 - 【請求項7】ヒト血清中のAIDSウイルスに対する抗体の
存在を検出する方法であって、 (a) HTLV−III gag蛋白質の少なくとも一つの抗原
性決定因子およびHTLV−III env蛋白質の少なくとも一
つの抗原性決定因子に対応するアミノ酸配列を有する蛋
白質を標識し、 (b) ステップ(a)の標識蛋白質をヒト血清試料と
反応させ、反応液中で標識蛋白質−抗体複合体を形成さ
せ、そして、 (c) ステップ(b)の標識蛋白質−抗体複合体を測
定することからなる方法。 - 【請求項8】ヒト血清中のAIDSウイルスに対する抗体の
存在を検出する方法であって、 (a) HTLV−III gag蛋白質の少なくとも一つの抗原
性決定因子およびHTLV−III env蛋白質の少なくとも一
つの抗原性決定因子に対応するアミノ酸配列を有する蛋
白質を固体担体に固定化し、 (b) ヒト血清試料をステップ(a)の固定蛋白質と
接触させて固定化蛋白質−抗体複合体を形成させ、 (c) 未結合の蛋白質および抗体をステップ(b)の
複合体から洗い除き、そして、 (d) その複合体を標識したスタフイロコツカス・ア
ウレウスのプロティンAおよび標識した第二の抗ヒトIg
G抗体から成る群から選択される試薬を添加することに
より測定することからなる方法。 - 【請求項9】容器中にHTLV−III gag蛋白質の少なくと
も一つの抗原性決定因子およびHTLV−III env蛋白質の
少なくとも一つの抗原性決定因子に対応するアミノ酸配
列を有する蛋白質を含むAIDSウイルスに対する抗体を測
定するための試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US848671 | 1986-04-04 | ||
US06/848,671 US4925784A (en) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62244393A JPS62244393A (ja) | 1987-10-24 |
JP2625118B2 true JP2625118B2 (ja) | 1997-07-02 |
Family
ID=25303966
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62082197A Expired - Lifetime JP2625118B2 (ja) | 1986-04-04 | 1987-04-02 | Htlv−▲iii▼gag/env遺伝子蛋白質の発現と精製 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4925784A (ja) |
JP (1) | JP2625118B2 (ja) |
KR (1) | KR930001118B1 (ja) |
AT (1) | AT400442B (ja) |
AU (1) | AU599091B2 (ja) |
BE (1) | BE1001973A5 (ja) |
BR (1) | BR8701528A (ja) |
CA (1) | CA1341249C (ja) |
CH (1) | CH676004A5 (ja) |
DE (3) | DE3711016A1 (ja) |
DK (1) | DK172274B1 (ja) |
ES (3) | ES2004133A6 (ja) |
FR (1) | FR2606422B1 (ja) |
GB (1) | GB2188639B (ja) |
IL (1) | IL82088A (ja) |
IT (1) | IT1203851B (ja) |
NL (1) | NL192275C (ja) |
NO (1) | NO871409L (ja) |
NZ (1) | NZ219837A (ja) |
SE (1) | SE8701413L (ja) |
SG (1) | SG102792G (ja) |
SU (1) | SU1644720A3 (ja) |
ZA (1) | ZA871724B (ja) |
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US9309574B1 (en) | 1984-08-22 | 2016-04-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Molecular cloning of HIV-1 from immortalized cell lines |
ATE87103T1 (de) * | 1985-12-17 | 1993-04-15 | Akzo Nv | Immunochemisches reagenz. |
AU590382B2 (en) * | 1985-12-24 | 1989-11-02 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Plasmid and phage clones of human t-cell lymphotropic virus type iii |
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NO881501L (no) * | 1987-10-09 | 1989-04-10 | Repligen Corp | Rekombinante htlv-111-proteiner og anvendelser av disse. |
EP0311228A3 (en) * | 1987-10-09 | 1990-05-02 | Repligen Corporation | Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus |
DE3879881D1 (de) * | 1987-11-16 | 1993-05-06 | Hoffmann La Roche | Rekombinante hiv-2 polypeptide. |
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JP2559482B2 (ja) * | 1988-01-12 | 1996-12-04 | ジーンラブズ テクノロジーズ,インコーポレイテッド | Htlvーiペプチド抗原および分析法 |
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