KR20150029678A - 백신 - Google Patents

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앙케르 룬데모스
마츠 외크비스트
아른트 오베 호브덴
마야 솜메르펠트 그뢴볼드
비다르 웬델 한센
비르게르 쇠렌센
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Abstract

본 발명은 HIV 감염들 및 AIDS를 포함하는 레트로바이러스 감염들의 치료를 위한 활성 제제들의 신규한 조합들 및 방법들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 펩타이드들; 및 면역조절성 화합물들 및/또는 히스톤 디아세틸라제 (HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제의 투여 및 조합의 신규한 용도에 관한 것이다.

Description

백신{VACCINE}
본 발명은 HIV 감염들 및 AIDS를 포함하는 레트로바이러스 감염들의 치료를 위한 활성 제제의 신규한 조합들 및 방법들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 펩타이드들; 및 면역조절성 화합물들 및/또는, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제들 같은 병원소 퍼징제들의 조합을 이용하는 신규한 치료 방법들에 관한 것이다.
최근에 AIDS가 만성 세포변성 바이러스 감염의 결과로서 단순히 CD4+ T-림프구의 손실에 의해 야기되는 것이 아니라 오히려 HIV-1에 의해 유도되는 면역학적 질환이라는 개념을 지지하는 많은 연구 증거가 축적되었다. 따라서 HIV-1에 의해 유도되는 만성 면역 자극을 타겟팅하는 중재법(interventions)을 개발하는 것도 중요하다(Sommerfelt 2011, Recent Translational Research in HIV/AIDS Ed. Dr. Yi-Wei Tang. ISBN 979-953-307-189-2. pp 493-510).
HIV-1 감염을 박멸시키기 위한 항레트로바이러스 치료법(ART)의 실패는 HIV-1이 잠복성 병원소들(reservoirs)에서 멈춰진 상태(quiescent)로 남아 있다는 관찰에서 알 수 있다. 잠복적으로 감염된 휴지 CD4+ 세포들(나이브 메모리 세포 또는 오래 살아있는 메모리 세포)은 전사적으로 침묵성 HIV-1을 가지고 HIV-1 감염의 우세한 병원소를 나타낸다. 대식세포, 수지상세포들 및 성상세포들 같은 다른 세포들도 (HIV-1 감염이 CD4-독립적 기작을 통해 발생한다면) 병원소들로서 기능할 수 있다(Reviewed in Alexaki et al., 2008, Curr. HIV Res. 6:388-400). HIV-1 감염의 박멸에 대한 주요 도전을 보여주는 것이 상술한 잠복성 병원소들이다. 박멸에 대한 접근방법들은 배출된 바이러스가 인근 세포들을 감염하여 복제할 수 없도록 ART의 존재 하에서 잠복적으로 감염된 세포들(예컨대 메모리 세포들)의 선택적인 활성화에 의해 병원소들을 제거하기 위한 시도들을 포함한다(Richman et al., 2009, Science 323:1304-1307). 제제들은 히스톤 디아세틸라제 억제제들, IL-2 및 IL-7 같은 사이토카인들 뿐 아니라 단백질 키나제 C 활성인자인 브리오스타틴을 포함한다(Kovochich et al., 2011, PLoS ONE 6 (4):e18270). 치료적 백신들은 바이러스 지속(persistence)을 위한 영역들을 나타내는 림프 조직(Pantaleo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9838-42; Fox et al., 1991, J. Infect. Dis. 164:1051-57) 및 중추 신경 시스템(Alexaki et al., 2008, Curr. HIV Res. 6:388-400) 같은 ART에 의해 다소 덜 접근되는 보호 위치들(sanctuary sites)을 투과할 수 있는 장점을 가진다. 이것은 바이러스 자체 뿐 아니라 HIV-연결된 면역 활성화 모두를 타겟팅하는 치료적 중재법에 관한 것이다.
TNF-α의 비정상적 생산과 연관된 질병들(diseases)을 안전하고 효과적으로 치료하는 데 이용될 수 있는 화합물들을 제공하고자 하는 목적으로 다수의 연구들이 행해져 왔다. 예를 들어, Marriott, J.B.,등, Expert Opin. Biol. Ther. (4): 1-8 (2001); G.W. Muller, 등, Journal of Medicinal Chemistry, 39(17): 3238-3240 (1996); 및 G.W. Muller, 등, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 2669-2674 (1998)을 참고하라. 일부 연구들은 LPS 자극된 PBMC에 의한 TNF-α 생산을 강력하게 억제하는 능력으로 선택되는 화합물 그룹들에 집중하였다. L.G. Corral, 등, Ann. Rheum. Dis., 58 (suppl I): 1107-1113 (1999). 종종 면역조절성 화합물들로 언급되는 상술한 화합물들은 TNF-α의 강력한 억제 뿐 아니라, LPS 유도된 단핵구 IL1B 및 IL12 생산의 현저한 억제를 나타낸다. 또한, LPS 유도된 IL6는 부분적일 지라도 면역조절성 화합물들에 의해 억제된다. 상술한 화합물들은 LPS 유도된 IL10의 강력한 자극인자들이다. 특이적 예들은, US 6281230 및 US 6316471에 기재된 대로 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)프탈이미드들 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단핵구/대식세포 기능은 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인으로 작용하는 선천성 면역 시스템의 일부이다. 숙주의 단핵구 및 대식세포를 조절함으로써, 면역조절성 화합물들은 인플루엔자 같은 바이러스 감염에 대한 반응의 동력학(dynamics)을 변화시킬 수 있다.
히스톤 디아세틸라제(HDAC)들은 히스톤 단백질의 N-아세틸화된 라이신 아미노산에서 아세틸 그룹들을 제거하는 효소들의 한 클래스이다. 현재까지 18개의 HDAC들이 포유동물들에서 동정되었다. 그들은 세포내 위치, 기능 및 서열 유사성에 기반하여 4개의 클래스들로 분류되었다. 클래스 I은 핵에서 주로 발견되는 HDAC 1, 2, 3 및 8을 포함한다. 클래스 II HDAC들 (HDACs 4, 5, 6, 7 9, 및 10)는 세포질에 주로 발견되지만 핵과 세포질 간에 왕복(shuttle)할 수 있다; 클래스 IIa는 4개의 HDAC들 (HDACs 4, 5, 7 및 9)를 포함하는 반면에 클래스 IIb는 오직 세포질에서만 발현되는 2개의 HDAC들 (HDACs 6 및 10)을 포함한다. 어디에서나 발현되는 HDAC11은 클래스 I 및 클래스 II HDAC들 모두와 서열 유사성을 공유하고 클래스 IV를 나타낸다. 클래스 III("시르투인 패밀리(sirtuin family)"로도 불림)은 히스톤에서 일차적으로 기능하지 않는 NAD+-의존적 단백질들을 이룬다.
이전 연구는 HIV-1 gp120의 카르복시말단 C5 도메인에 대한 항체들이 더 낮은 면역 활성화 및 더 지체되는 질병 진행과 연결되어 있었다는 것을 나타낸다(Loomis-Price et al. 1998 J. Inf Dis. 178 :1306-1316 ; Warren RQ wt al. 1991 J. Clin Immunol 11: 13-21; Lifson et al. 1991 J. Inf. Dis 163 :959-965). 실제로, 이러한 도메인에 대한 체액성(즉, 항체) 반응들이 없어지는 경우 질병 진행을 가속시키는 것으로 밝혀졌다(Wong et al. 1993 J. Inf. Dis 168: 1523-1527). 더 나아가 HIV-감염된 5%의 개인들이 보이는 LTNP (long term nonprogressors)가 HIV-1 gp120의 카르복시말단성 C5 도메인에 대해 체액성 반응들을 유지하였고 일정 정도의 바이러스 로딩을 가짐에도 불구하고 오랜 세월 동안 항레트로바이러스 치료법의 부재 하에서도 생존할 수 있다(Liegler et al. 1998 J. Infec. Dis. 178: 669-79; Gougeon et al. 1996 J.Immunol 156:3509-20; Muro-Cacho et al. 1995 J. Immunol 154 :5555-66 ; Easterbrook et al. 1999 J. Infect 28:71-73).
gp120의 C5 도메인은 13개의 아미노산 길이이다(gp120의 499-511 아미노산 잔기들, 및 레퍼런스 서열 B.FR 83.HXB2 - TKAKRRVVQREKR을 가진다).
HIV 감염 및 AIDS를 포함하는 레트로바이러스 감염들의 예방 및/또는 치료에서 이용될 수 있는 치료제의 효과적인 조합들 및 방법들을 제공하는 것이 본 발명의 구현예들의 목적이다.
HIV 감염 및 AIDS의 예방 및/또는 치료 및/또는 박멸에서 면역조절성 화합물들 및/또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제들 같은 병원소 퍼징제들(reservoir purging agents)을 사용하여 치료적 HIV 백신의 효과를 증대시키는 것이 본 발명의 구현예들의 목적이다.
대상자(subject)에서 체액성 면역반응 및/또는 세포-매개된 면역반응을 자극하는 화합물들을 포함하는 치료 백신들의 효과를 면역조절성 화합물들 및/또는 병원소 퍼징제들과 조합하는 것이 유리하다는 것이 본 발명자(들)에 의해 발견되었다.
따라서 첫 번째 양태에서 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 I(HIV)로 감염된 인간에서 HIV 같은 인간 레트로바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (1) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들; 및 (2) 면역조절성 화합물 및/또는 히스톤 디아셀틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제를 개별적으로, 어떠한 순서에서 연속적으로 또는 동시적으로 투여하는 단계를 포함한다.
두 번째 양태에서 본 발명은
a) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들; 및
b) 면역조절성 화합물 및/또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제
를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가적인 양태에서 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 I(HIV) 같은 그러한 바이러스로 감염된 인간에서 HIV 같은 인간 레트로바이러스 감염을 발병하는 위험 또는 이의 병리학적 효과들을 감소 및/또는 지연하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (1) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들; 및 (2) 면역조절성 화합물 및/또는 히스톤 디아셀틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제를 어떠한 순서에서 연속적으로 또는 동시적으로 투여하는 단계를 포함한다.
정의들
"하나(one)", "a" 또는 "an" 같은 용어들이 본 개시내용에 사용되는 경우 상기 용어들은 다르게 지시되지 않는 한 "최소 하나", 또는 "하나 또는 이상"을 의미한다. 또한, 상기 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"을 의미하고자 하여 명확하게 인용된 구성요소들, 특징들, 상태들, 또는 단계들보다 다른 구성요소들, 특징들, 상태들, 또는 단계들의 존재를 참작한다.
본 발명에 따른 조합들에 의해 치료될 수 있는 인간 레트로바이러스들은:
HTLV-1 (초기에 인간 T-세포 백혈병 바이러스로 불리움 - 현재는 인간 T-림프영양성 바이러스로 불리움);
HTLV-II (인간 T-세포 백혈병 바이러스도 현재는 인간 T-림프영양성 바이러스로 불리움);
HIV-1 (보다 초기에 LAV로 불리움 - 림프절증 바이러스, 또한 인간 T-림프영양성 바이러스 III, 즉 HTLV-III로 불리움);
HIV-2 (또한 HTLV-IV로 불리웠음); 상기 바이러스들 중 어떠한 것의 어떤 서브타입을 포함한다;
다르게 특별하게 기재하지 않는 한, "HIV"는 일반적으로 인간 면역결핍 바이러스 1을 표시한다.
"HIV 질병"은 여러 단계들로 구성되는데, 종종 감기-유사(flu-like) 증상들로 나타나는 급성 HIV 감염 및 피부 발진, 피로, 도한(night sweats), 경미한 체중 감소, 구강 궤양, 및 진균성 피부 및 손톱 감염 같은 여러 가지 비-특이적인 증상들을 가지는 중간 단계 증후성 질병을 포함한다. 대부분 HIV 감염된 사람들은 보다 심각한 병증들을 발병하기 전에 상술한 증상들 같은 가벼운 증상들을 경험할 것이다. 일반적으로 첫 번째 가벼운 증상들이 나타나기까지 5년 내지 7년이 걸리는 것으로 생각된다. HIV 질병이 진행됨에 따라, 아직 AIDS로 진단되지 않았을 지라도 일부 개인들은 중한 병증, HIV 질병의 말기 단계를 나타낼 수 있다(하기를 참조하라). 전형적인 문제들은 구강 또는 질 아구창(진균성 발진 또는 반점들), 구강의 재발성 헤르페스 수포(입 안의 발진) 또는 생식기의 재발성 헤르페스 수포, 진행성 열병, 지속성 설사, 및 유의한 체중 감소를 포함한다. "AIDS"는 말기 단계의 HIV 질병이고, 지속적으로 면역 시스템의 효율성을 감소시키고 개인들을 기회성 감염들 및 종양들에 민감하게 만드는 상태이다.
본 명세서에서 용어 "gp120"을 사용하는 경우, 상기 용어는 gp160의 효소적 절단 산물인
Figure pct00001
120 kDa N-말단 당단백질로, 결국 HIV env 유전자의 유일한 발현 산물이다. gp120은 감염성 HIV 비리온들 상에 "스파이크(spikes)"를 형성하고 gp41에 비-공유결합적으로 결합된다.
"gp41"은 gp160의 C-말단 효소적 절단 산물인
Figure pct00002
41 kDa 당단백질을 의미한다. gp41은 HIV 감염된 세포들 또는 비리온들의 막에 위치한다. gp41은 gp120에 비-공유결합적으로 결합하는 N-말단 트랜스막 도메인을 가진다. 이러한 트랜스막 도메인은 본 명세서에서 "gp41의 트랜스막 도메인" 또는 "tm-gp41"로 명명된다. 상기 용어는, 예를 들어 화학식 III으로 설명되는 서열의 돌연변이된 버전에서 천연적으로 발생하는 범위 안에서 포함된다.
"C5" 또는 "C5 도메인"은 gp120의 13개의 C-말단 아미노산 잔기들을 나타낸다.
"C2" 또는 "C2 도메인"은 gp120 내 보존성 영역을 나타낸다. C2 내 영역들은 gp120의 내부 중심부 도메인에 존재하는 C5와 역평행 β-시트(antiparallel β-sheet)를 형성한다.
본 발명의 문맥에서 "HIV의 병리학적 효과를 감소 및/또는 지연시키는 것"은 본 발명의 방법들의 용도가 본 발명에 따라 치료되는 HIV로 감염된 개인에서 보여지는 사망률(morbidity)에서 통계학적으로 유의한 감소 및/또는 지연을 제공한다는 것을 의미한다. 즉, AIDS로 특징화시키는 명확한 질병 증상들의 개시 시점이 비-처리된 대조군들과 비교하여 더 늦고/늦거나 다수의 병리학적 징후들(manifestations)이 본 발명의 치료를 받지 않은 대조군들과 비교하여 감소된다.
상기 표현 "gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결(association)"은 C5가 tm-g41 및 C2 모두 또는 하나와 비-공유결합적으로 상호작용할 수 있다는 것을 의미한다. tm-gp41과의 상호작용은 분자 간인 반면에, C2와의 상호작용은 분자 내이다.
gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 "안정화시킬 수 있는 제제(agent)"는 gp41과의 분자 간 결합 및/또는 C2에 대한 분자 내 결합으로부터 C5의 방출을 억제하거나 또는 통계학적으로 감소시키는 성분(matter)의 조성물이다. 일반적으로, 그러한 제제는 상기 효과를 나타낼 수 있는 실제적인 어떠한 물질이고, 중요한 예들은 항체들, 항체 단편들, 및 항체 유사체들이다. 하지만, 한쪽에 C5 및 다른 쪽에 tm-gp41 및/또는 C2 간의 복합체에 대한 적합한 결합 친화도를 가지는 다른 분자들도 본 발명에 따른 제제이다 - 정확한 분자적 포멧이 결합 특성보다 덜 중요하고, 그러한 제제가 수용체 또는 수용체 유사체일 수 있지만, 작은 분자 안정화제(stabilisers)가 본 발명의 아젠(agen)으로 기능할 수 있다는 것도 본 발명에 따라 가능하다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되며 구체적으로 소망되는 생물학적 활성 즉 상술한 제제로서 기능하는 한, 전-장(full-length) 단일클론 항체들, 다중클론 항체들, 다중특이적 항체들(예컨대, 이중특이적 항체들), 및 항체 단편들을 포함한다. 항체들의 생산과 관련된 다양한 기술들이, 예를 들어 Harlow, 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).)에 제공되어 있다.
"항체 단편 또는 항체 유사체(antibody fragment or antibody analogue)"는 전-장 항체, 좋게는 이의 항원-결합 또는 가변 영역들의 일부를 포함한다. 항체 단편/유사체의 예들은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (전형적으로 항체의 단일 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인), 단일-체인 Fv (scFv), dsFv, Fd 단편들 (전형적으로 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb (전형적으로 VH 도메인) 단편들; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인들; 미니바디들, 디아바디들(diabodies), 트리아바디들(triabodies), 테트라바디들, 및 카파 바디들 (예를 들어 Ill et al., Protein Eng 1997;10: 949-57을 참조하라); 카멜(camel) IgG; IgNAR; 및 항체 단편들로부터 형성되는 다중특이적 항체 단편들 및, 분리된 CDRs 또는 항원-결합 잔기들 또는 폴리펩타이드들이 함께 연결 또는 결합되어 기능성 항체 단편을 형성할 수 있다면 하나 이상의 분리된 CDRs 또는 기능성 파라토프(paratope)를 포함한다. 다양한 타입의 항체 단편들이, 예를 들어 Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23, 1126-1136; WO2005/040219에 기재 또는 검토되었고, 미국 특허출원 20050238646 및 20020161201에 공개되었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 유도체(antibody derivative)"는 전-장 항체 또는 항체의 단편, 좋게는 적어도 이의 항원-결합 또는 가변 영역들을 포함하는 항체의 단편을 포함하며, 하나 이상의 아미노산들이 화학적으로 변형, 예를 들어 알킬화, PEG화(PEGylation), 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 또는 이와 유사한 것들에 의해 변형되는데, 예컨대 두 번째 분자에 상기 항체의 결합을 위한 변형이다. 이것은 PEG화된 항체들, 시스테인-PEG화된 항체들, 및 이의 변이체들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 대로 "컨쥬게이트(conjugate)"는 세포독성 제제, 검출가능한 제제 등 같은 두 번째 제제와 연결되거나 또는 결합된 항체 유도체 같은 본 발명에 따라 이용되는 제제를 포함한다. 컨쥬게이트는 공유결합적으로 결합된 펩타이드들로 구성될 수 있지만(컨쥬게이트의 예는 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개의 펩타이드들을 포함하는 융합 펩타이드로, 그러한 경우의 컨쥬게이트는 핵산 단편으로부터 유래되는 발현 산물일 수 있음), 컨쥬게이트는 화학적 컨쥬게이션을 통해 공유결합으로 결합되는 펩타이드들의 조합일 수도 있다(전통적인 예는 글루타르알데하이드를 이용한 컨쥬게이션이다). 보다 복잡한 컨쥬게이션의 다른 예는 본 발명의 제제 또는 펩타이드 멀티머 또는 다른 화학적 물질이 담체 분자와 결합되는 예로, 결과적으로 본 발명의 제제 또는 펩타이드 멀티머 또는 다른 화학적 물질들과 커플링된다(예를 들어, 그러한 화학적 물질들이 폴리-라이신 담체(라이신 "트리(tree)")에 결합하는 경우).
"인간화된(humanized)" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 포함하는 인간/비-인간 키메릭(chimeric) 항체이다. 보통, 인간화된 항체는 수령체(recipient)의 과다가변 영역의 잔기들이 소망되는 특이성, 친화도, 및 능력을 가지는 비-인간 종들(공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트, 래빗, 또는 비-인간 영장류의 과다가변 영역의 잔기들로 대체되는 인간 면역글로불린들(수령체 항체)이다. 일부 예들에서, 상기 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기들이 상응하는 비-인간 잔기들로 대체된다. 더 나아가, 인간화된 항체들은 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 상술한 변형들은 항체 실행능(performance)을 추가적으로 개선하도록 실시된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 최소 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인들을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 상기 항체에서 과다가변성 루프들 모두 또는 실질적으로 모든 루프들은 비-인간 면역글로불린의 루프들에 해당하고 FR 잔기들 모두 또는 실질적으로 모든 잔기들이 인간 면역글로불린 서열의 FR 잔기들이다. 상기 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 최소 하나의 부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 수도 있다. 보다 상세하게는, 예를 들어 Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, US 특허출원 20060073137, 및 US 등록특허 6,750,325, 6,632,927, 6,639,055, 6,548,640, 6,407,213, 6,180,370, 6,054,297, 5,929,212, 5,895,205, 5,886,152, 5,877,293, 5,869,619, 5,821,337, 5,821,123, 5,770,196, 5,777,085, 5,766,886, 5,714,350, 5,693,762, 5,693,761, 5,530,101, 5,585,089, 및 5,225,539를 참조하라.
레퍼런스 항체의 "생물학적 특징(biological characteristic)"을 가지는 항체는 동일한 항원에 결합하는 다른 항체들과 구별되는 그러한 항체의 하나 이상의 생물학적 특징을 가지는 항체(one)이다.
본 발명의 문맥에서 용어 "펩타이드(peptide)"는 2개부터 10개까지의 아미노산 잔기들의 짧은 펩타이드들, 11개부터 100개까지의 아미노산 잔기들의 올리고펩타이드들, 및 100개 이상의 아미노산 잔기들의 폴리펩타이드들 모두를 의미하고자 한다. 펩타이드에서 아미노산들을 언급하는 경우, 상기 아미노산들은 다른 정보가 제공되지 않는 한 L-아미노산들이다. 아미노산들은 다르게 기재되지 않는 한 표준적인 3개의 문자 또는 하나의 문자 지정으로 언급된다. 본 명세서에서 언급되는 일부 이상한 아미노산들은 항상 Har로 약어된 호모아르기닌(homoarginine), 보통 Nle 또는 Nl로 축약된 노르루이신(norleucine), 보통 Lys(Me)로 축약된 N-ε-메틸화된 Lys, 항상 Cit로 축약되거나 또는 단일 문자 "B"로 표시된 시트룰린(Citrulline), 항상 Dpr로 축약된 디아미노프로피온산 및 항상 Dpr(Ser)로 축약된 세리닐 디아미노프로피온산을 포함한다.
"단백질"은 최소 하나의 펩타이드를 포함하는 기능성 이중분자를 나타내고자 한다; 최소 2개의 펩타이드들을 포함하는 경우, 상기 펩타이드들은 공유결합적으로 결합되거나 또는 비-공유결합적으로 결합되어 복합체를 형성할 수 있다. 단백질 내 폴리펩타이드는(들은) 당화 및/또는 지질화될 수 있고/있거나 보결분자단(prosthetic groups)을 포함한다.
"펩타이드 멀티머(peptide multimer)"는 서로에 대해 상대적으로 비-천연적 형태(configuration)에서 최소 2개의 펩타이드들로 구성된 분자를 의미한다. 예들은 천연에서 보여지지 않는 형태지만 단백질의 아미노산 잔기들 중 최소 하나의 측쇄를 통해 공유결합적으로 결합되거나, 또는 단백질들의 말단을 통해(예컨대, 펩타이드 결합을 통해) 결합되는 동일한 단백질 또는 다른 단백질로부터 유래되는 펩타이드들이다. 펩타이드 멀티머의 전형적인 예들은 하기에 상세하게 기재되어 있다.
펩타이드의 "변이체(variant)" 또는 "유사체(analogue)"는 레퍼런스와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드, 전형적으로는 천연 또는 "모(parent)" 폴리펩타이드를 의미한다. 펩타이드 변이체는 상기 천연 아미노산 서열 내 어떤 위치들에서 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는 삽입들을 가질 수 있다.
"보존성(conservative)" 아미노산 치환들은 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성들을 가지는 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 치환들이다. 유사한 측쇄들을 가지는 아미노산 잔기들의 패밀리들은 당업계에 알려져 있고, 염기성 측쇄들 (예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하된 극성 측쇄들 (예컨대, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄들 (예컨대, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-가지된 측쇄들 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족성 측쇄들 (예컨대, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가지는 아미노산들을 포함한다. 보존성 아미노산 치환들의 특정 형태는 유전 코드에 의해 인코딩되는 정상적인 20개의 아미노산들에 속하지 않는 아미노산들을 가지는 치환들을 포함한다. 본 발명의 선호되는 구현예들은 합성 펩타이들의 사용을 수반하기 때문에, 본 명세서에 개시된 펩타이드들에서 그러한 "비-천연(non-naturally occurring)" 아미노산 잔기들을 제공하는 것이 문제가 되지 않으며, 이에 따라 아미노산 잔기들의 측쇄들에 천연적인 포화된 탄소 체인들을 더 짧거나 또는 더 긴 포화된 탄소 체인들로 교체하는 것도 가능하다 - 예를 들어, 라이신은 n이 4와 상이한 측쇄 -(CH2)nNH3을 가지는 아미노산, 아르기닌은 n이 3과 상이한 측쇄 (CH2)nNHC(=NH2)NH2를 가지는 아미노산 등으로 치환될 수 있다. 유사하게도, 산성 아미노산들인 아스파르트산 및 글루탐산은 n>2인 측쇄 -(CH2)nCOOH를 가지는 아미노산 잔기들로 치환될 수 있다.
펩타이드의 "레트로 형태(retro form)"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 아미노산의 순서가 반대로 위치된 펩타이드의 형태이다. 예를 들어, ALDFR의 레트로 형태는 RFDLA 펩타이드이다.
"인버소(inverso)" 형태는 인 버소 형태 내 각 아미노산이 펩타이드 내 상응하는 아미노산과 비교하여 반대의 입체화학적 배치로(stereochemical confiurational) 존재한다는 사실에 의해 특징화된다. 그래서, 상기 펩타이드가 L-아미노산들로 구성된다면 상기 인버소 형태는 D-아미노산들로 구성된다.
펩타이드의 "레트로-인버소(retro-inverso)" 형태는 인버소 형태 및 레트로 형태 모두를 가지는 펩타이드의 형태이다. L-ala - L-Arg - L-Lys의 레트로-인버소 형태는 D-Lys - D-Arg - D-ala이다.
두 개의 아미노산 서열들의 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한(substantially identical)"은, 예컨대 디폴트 갭 가중(default gap weights)을 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 배열되는 경우 상기 서열들이 최소 약 50, 최소 약 60, 최소 약 70, 최소 약 80, 최소 약 90, 최소 약 95, 최소 약 98, 또는 최소 약 99 퍼센트 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존성 아미노산 치환들로 상이하다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환들을 포함하는 다양한 치환들, 결실들 및 다른 변형들에 대해 할당된 유사성의 측정치들을 이용하여 유사 서열들을 부합시킨다. 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 GCG 소프트웨어는, 생물체의 다른 종들로부터 유래되는 상동성 폴리펩타이드들 같은 밀접하게 관계된 폴리펩타이드들 또는 야생형 단백질과 이의 돌연변이 단백질(mutein) 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 파라미터들로 이용될 수 있는 "갭(Gap)" 및 "베스트피트(BestFit)" 같은 프로그램들을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조하라. 또한 폴리펩타이드 서열들은 디폴트 또는 추천되는 파라미터들을 적용하는 FASTA 또는 ClustalW를 이용하여 비교될 수 있다. GCG 버전 6.1. 내 프로그램인 FASTA (예컨대, FASTA2 및 FASTA3)는 문의 서열과 조사 서열 간의 가장 최적의 중첩 영역들의 배열 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219). 서열과 다양한 생물체로부터 유래되는 매우 많은 수의 서열들을 포함하는 데이터베이스를 비교하거나 또는 이를 유추하는 경우, 다른 선호되는 알고리즘은 디폴트 파라미터들을 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp이다. 예를 들어, Altschul 등, J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul 등, Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)을 참조하라; 각각 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 두 개의 실질적으로 동일한 아미노산 서열들 내 "상응하는(corresponding)" 아미노산 위치들은, 본 명세서에서 언급되는 전형적으로 디폴트 파라미터들을 이용한 단백질 분석 소프트웨어 중 어느 것에 의해 배열되는 위치들이다.
일반적으로 용어 "부분서열(subsequence)"은 관련되는 경우 각각 천연 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열로부터 직접적으로 유래되는 최소 3개의 아미노산들, 또는 최소 3개의 뉴클레오타이드들의 어떠한 연속적인 스트레치를 의미한다. 하지만, 본 발명의 펩타이드 멀티머들을 논의하는 경우 상기 부분서열은 1 또는 2개의 짧은 아미노산들일 수 있다. 이것은 아미노산들이 최소한 함께 항체를 위한 형태적 에피토프(conformational epitope)를 형성하는 경우 본 발명의 펩타이드 멀티머들이 다른 펩타이드 도메인들로부터 유래하는 아미노산들을 포함하기 때문이다. 그러므로, 그러한 형태적 에피토프는 C5로부터 유래하는 4개의 아미노산들로 구성될 수 있지만, tm-gp41로부터는 오직 1 또는 2개만으로 구성될 수 있다 - 2개의 도메인들로부터 이러한 조합된 에피토프가 안정화될 수 있다는 것이 여기에서 중요한 점인데, 다시 말하면 동일한 에피토프에 대한 인 비보 항체 결합이 C5 및 tm-gp41 및/또는 C2 간의 배열(configuration)을 안정화시킬 것이다.
핵산이 다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓여지는 경우 상기 핵산은 "작동적으로 결합된(operably linked)" 다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 전서열(presequence)용 DNA 또는 분비성 리더(secretory leader)는 폴리펩타이드용 DNA에 작동적으로 결합된다; 상기 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 프로모터 또는 인핸서(enhancer)가 코딩 서열에 작동적으로 결합된다; 또는 번역을 용이하게 하기 위해 위치되는 경우 리보좀-결합 위치는 코딩 서열에 작동적으로 결합된다. 일반적으로, "작동적으로 결합된"은 결합될 DNA 서열들이 근접한 상태이고, 분비성 리더의 경우에서 인접하고 판독 상(reading phase)에 있다는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서들은 인접해야만 할 필요는 없다. 결합(linking)은 간편한 제한 위치들에서의 라이게이션(ligation)에 의해 달성된다. 그러한 위치들이 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터들 또는 링커들이 종래의 관례에 따라 이용된다.
"분리된(isolated)" 분자는 상기 분자가 속하는 클래스의 분자들에 대해 조성물 내에서 우세한 종으로 존재하는 분자이다(즉, 상기 분자는 조성물에서 분자 타입 중 최소 약 50%를 구성하고 전형적으로는 상기 조성물에서 분자의 종들, 예컨대 펩타이드 중 최소 약 70%, 최소 약 80%, 최소 약 85%, 최소 약 90%, 최소 약 95%, 또는 그 이상을 구성할 것이다). 보통, 항체 분자의 조성물은 조성물 내 모든 본 발명의 펩타이드 종들의 맥락에서 항체 분자들에 대해 98% - 99% 균질성을 나타내거나 또는 최소한 제안된 용도의 맥락에서 실질적으로 활성 펩타이드 종들에 대해 98% - 99% 균질성을 나타낼 것이다.
본 발명의 맥락에서, "치료(treatment)" 또는 "치료하는 것(treating)"은 문맥에서 모순되지 않는 한 질병 또는 질환(disorder)의 하나 이상의 증상들 또는 임상적으로 관계된 징후들을 예방, 약화, 관리, 치유 또는 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 질병 또는 질환의 어떠한 증상들 또는 임상적으로 관계된 증후들이 확인되지 않았던 환자의 "치료"는 예방적(preventive or prophylactic) 치료법인 반면에, 일반적으로 질병 또는 질환의 증상들 또는 임상적으로 관계된 증후들이 확인되었던 환자의 "치료"는 예방적 치료법으로 구성되지 않는다.
상기 용어 항원은 면역 시스템의 특이적으로 인지하는 구성성분들(항체들, T-세포들)에 의해 인지되는 실질적 물질(substance of matter)을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "면역원(immunogen)"은 개체에서 적응적 면역반응을 유도할 수 있는 실질적 물질을 나타내고자 의도되며, 상기 적응적 면역반응은 면역원을 타겟팅한다. 본 발명과 관련하여, 면역원은 이와 반응하는 항체들을 유도할 것이다. 다시 말하면, 면역원은 면역을 유도할 수 있는 항원이다.
본 명세서에서 용어 "에피토프(epitope)", "항원성 결정인자(antigenic determinant)" 및 "항원성 위치(antigenic site)"는 상호교환적으로 이용될 수 있으며 항체들에 의해 인지되거나("B-세포 에피토프들"로도 알려진 항체 결합 에피토프들의 경우) 또는 상기 에피토프가 MHC 분자와 복합체를 형성하는 경우 T-세포 수용체들에 의해 인지되는(T-세포 수용체 결합 에피토프들, 즉 "T-세포 에피토프들"의 경우) 항원 또는 면역원 내 부위를 의미한다.
용어 "면역원적으로 효과적인 양(immunogenically effective amount)"은 당업계의 통상적인 의미를 가지는데, 즉 면역반응을 유도할 수 있는 면역원, 상기 면역원과 면역학적 특징들을 공유하는 병원성 제제들로 유의하게 기능하는 면역원의 양을 의미한다.
상기 용어 "백신"은 면역원을 포함하고 병리학적 상태를 발병시킬 위험성을 감소시킬 수 있거나 또는 병리학적 상태의 치유(또는 최소한 증상들의 약화)에 도움을 줄 수 있는 치료학적으로 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 면역반응을 유도할 수 있는 조성물을 위해 이용된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 당업계의 통상적인 의미를 가지는데, 즉 상기 용어는 문제의 질병을 치료하는 경우 인간 사용을 위한 의약품의 일부로서 허용될 수 있는 물질에 대해 이용되며 이에 따라 상기 용어는 치료될 대상자의 상태를 개선하는 것보다는 오히려 악화시킬 높은 독성의 물질들의 용도를 효과적으로 배제한다.
"T 헬퍼 림프구 에피토프(T helper lymphocyte epitope)"(TH 에피토프)는 MHC 클래스 II 분자와 결합하는 펩타이드이며, MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시세포(APC)의 표면에 제시될 수 있다. "면역학적 담체(immunological carrier)"는 일반적으로 하나 또는 많은 TH 에피토프들을 포함하는 실질적 물질로, T-헬퍼 림프구들이 활성화되어 증식하는 것을 보장하도록 커플링되는 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 실질적 물질이다. 알려진 면역학적 담체의 예들은 파상풍 및 디프테리아 톡소이드(toxoids) 및 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)이다.
용어 "보조제(adjuvant)"는 백신 기술의 당업계에서 통상적인 의미를 가지는데, 즉 1) 자체적으로 상기 백신의 면역원에 대해 특이적 면역반응을 마운팅할 수 없지만 2) 그럼에도 불구하고 상기 면역원에 대한 면역반응을 증진시킬 수 있는 실질적 물질 또는 조성물이다. 또는, 다시 말하면, 상기 보조제 단독의 백신화(vaccination)는 상기 면역원에 대한 면역반응을 제공하지 않고, 상기 면역원의 백신화는 상기 면역원에 대한 면역반응을 일으킬 수 있거나 또는 일으키지 않을 수 있지만, 면역원과 보조제의 조합된 백신화는 상기 면역원 단독에 의해 유도되는 면역반응보다 더 강력한 상기 면역원에 대한 면역반응을 유도한다.
세포- 매개된 면역( CMI )을 유발시키는 펩타이드들
백신화는 감염 전에 특이적 병원체에 대한 면역반응을 자극하는 것을 목표로 한다. 개체가 그러한 병원체에 노출되는 경우, 감염의 확립을 억제하는 메모리 반응이 촉발된다. 따라서 백신들은 선천성 면역이 아닌 오랫동안 유지되고 메모리를 가지는 적응적 면역반응을 자극한다. 적응적 면역 시스템에 대해 2개의 주요 무기들이 있다. 바이러스 입자들에 결합할 수 있는 항체들 및 감염을 중화시킬 수 있는 어떤 항체들의 발생을 포함하는 체액성 면역. 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I의 맥락에서, 바이러스 에피토프들을 노출하는 감염된 세포를 죽이는 세포독성 T-세포들의 발생을 유발하는 세포 매개된 면역으로 이러한 방식으로 감염된 세포들을 박멸시킨다.
본 명세서에서 사용되는 대로 세포-매개된 면역 반응을 유발시키는 펩타이드는 항원-특이적 세포독성 T-림프구들의 활성화를 유발시키는 어떠한 펩타이드를 의미한다. 상술한 펩타이드들은, 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I의 맥락에서 감염된 세포들을 박멸시키는 방식으로, 바이러스 에피토프들을 노출하는 감염된 세포를 죽이는 세포독성 T-세포들의 발생을 유도하는 세포독성 T-림프구 면역(CTL) 반응을 유발한다. 세포-매개된 면역(CMI)은 식세포, 자연살해세포(NK), 항원-특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 대한 반응으로 다양한 사이토카인들의 배출을 포함할 수도 있다.
상술한 펩타이드들은 헬퍼 T 림프구(HTL) 에피토프들을 포함하는 HTL 유도성 펩타이드일 수 있다. "HTL 유도성 펩타이드(HTL inducing peptide)"는 HTL 반응을 유도할 수 있는 HLA 클래스 II 결합 펩타이드이다. 또한 상기 펩타이드들은 다른 구현예들에서 HTL 유도성 펩타이드 외에 또는 택일적으로 CTL 에피토프들을 포함하는 CTL 유도성 펩타이드들일 수 있다. "CTL 유도성 펩타이드(CTL inducing peptide)"는 CTL 반응을 유도할 수 있는 HLA 클래스 I 결합 펩타이드이다.
본 발명에 따라 이용되는 대로 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 펩타이드는 국제특허출원 WO0052040, WO 2012/092934 또는 WO 2012/072088 중 어느 하나에 기재된 어떠한 펩타이드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 특허 출원들이 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
HIV -특이적 펩타이드들
일부 양태들에서, 본 발명에 따른 방법들 및 조성물들은 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들을 이용하거나 또는 포함한다. 일부 구현예들에서, 이러한 펩타이드는 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드이다.
세포-매개된 면역반응을 유발시키는 펩타이드들의 하나의 양태는 HIV gag p24의 보존된 부위들에 기반된 HIV-특이적 펩타이드들, 상기 펩타이드들 중 최소 하나를 포함하는 자유로운 형태 또는 담체-결합된 형태의 항원들에 관한 것이다.
본 발명에 따라 이용되는 HIV-특이적 펩타이드들은 HIV-1-에피토프의 독창성(민감성 및 특이성)을 유지하는 특성을 가지는 HIV-1 코어 단백질 p24의 보존된 영역들(areas)로부터 유래할 수 있다. 더욱이 본 발명에 따라 이용되는 신규한 펩타이드들은 어떠한 인지된 세포독성 T 림프구(CTL) 길항 효과를 가지지 않고 최소 하나의 잠재적인 CTL 에피토프를 가질 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되고 상술한 기준들에 합당한 HIV-특이적 펩타이드들은;
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa20 (서열번호 47);
상기 위치 1의 Xaa는 Lys 또는 Arg,
상기 위치 2의 Xaa는 Ala, Gly, Ser 또는 Arg,
상기 위치 3의 Xaa는 Leu 또는 Met,
상기 위치 4의 Xaa는 Gly 또는 Arg,
상기 위치 5의 Xaa는 Pro, Thr, Val, Ser, Gln 또는 Ala,
상기 위치 6의 Xaa는 Gly, Ala, Lys, Arg, Gln 또는 Glu,
상기 위치 8의 Xaa는 Thr 또는 Ser,
상기 위치 9의 Xaa는 Leu 또는 Ile,
상기 위치 14의 Xaa는 Thr, Ser 또는 Val,
상기 위치 15의 Xaa는 Ala 또는 Ser,
상기 위치 16의 Xaa는 Cys 또는 Ser,
상기 위치 17의 Xaa는 Gln 또는 Leu,
상기 위치 18의 Xaa는 Gly, Glu 또는 Arg, 및
상기 위치 20의 Xaa는 Gly 또는 Arg인 아미노산 서열;
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 Tyr Xaa15 Pro Xaa17 Xaa18 Ile Leu Xaa21 Xaa22 (서열번호 50);
상기 위치 1의 Xaa는 Arg, Lys, Asp 또는 없고,
상기 위치 2의 Xaa는 Trp, Gly, Lys 또는 Arg,
상기 위치 3의 Xaa는 Ile, Leu, Val 또는 Met,
상기 위치 4의 Xaa는 Ile, Val 또는 Leu,
상기 위치 5의 Xaa는 Leu, Met, Val 또는 Pro,
상기 위치 12의 Xaa는 Arg 또는 Lys,
상기 위치 13의 Xaa는 Met 또는 Leu,
상기 위치 15의 Xaa는 Ser, Cys 또는 Gln,
상기 위치 17의 Xaa는 Thr, Val, Ile, Ser 또는 Ala,
상기 위치 18의 Xaa는 Ser, Gly 또는 Thr,
상기 위치 21의 Xaa는 Asp, Glu, Cys 또는 Gly,
상기 위치 22의 Xaa는 Gly 또는 없으며, n = 0, 1, 2 또는 3인 아미노산 서열;
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Ile Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 (서열번호 55);
상기 위치 1의 Xaa는 Asn, Ser, Gly, His, Ala, Pro, Arg 또는 없고,
상기 위치 2의 Xaa는 Asn, Ala 또는 Lys,
상기 위치 3의 Xaa는 Pro, Gln, Gly, Ile 또는 Leu,
상기 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ala,
상기 위치 8의 Xaa는 Gly 또는 Lys,
상기 위치 9의 Xaa는 Glu, Asp, Lys, Phe 또는 Thr,
상기 위치 10의 Xaa는 Ile, Met, Val 또는 Leu,
상기 위치 11의 Xaa는 Tyr, Leu 또는 없으며,
상기 위치 12의 Xaa는 Ser 또는 없고,
상기 위치 13의 Xaa는 Arg 또는 없으며,
상기 위치 14의 Xaa는 Asp, Arg, Trp, Ala 또는 없고,
상기 위치 15의 Xaa는 Ile 또는 없으며,
상기 위치 16의 Xaa는 Tyr 또는 없고,
상기 위치 17의 Xaa는 Lys 또는 Arg,
상기 위치 18의 Xaa는 Arg, Lys 또는 Asp,
상기 위치 19의 Xaa는 Trp 또는 Gly,
상기 위치 20의 Xaa는 Ile, Met, Val, Gln 또는 Ala,
상기 위치 21의 Xaa는 Ile, Val 또는 Ala,
상기 위치 22의 Xaa는 Leu, Met 또는 Val,
상기 위치 23의 Xaa는 Gly 또는 Cys,
상기 위치 24의 Xaa는 Leu 또는 없으며,
n = 1,2 또는 3인 아미노산 서열, 및
Xaa1 Xaa2 Ile Ile Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 [Gly]n [Arg]m Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 (서열번호 61);
상기 위치 1의 Xaa는 Pro, Lys, Arg 또는 없으며,
상기 위치 2의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Lys,
상기 위치 5의 Xaa는 Pro 또는 Thr,
상기 위치 6의 Xaa는 Met, Thr 또는 Nleu,
상기 위치 7의 Xaa는 Phe 또는 Leu,
상기 위치 8의 Xaa는 Ser, Thr, Ala 또는 Met,
상기 위치 9의 Xaa는 Ala, Glu 또는 Leu,
상기 위치 11의 Xaa는 Ser 또는 없고,
상기 위치 12의 Xaa는 Ala, Arg 또는 없으며,
상기 위치 13의 Xaa는 Ile, Leu 또는 없고,
상기 위치 14의 Xaa는 Ser, Ala, Leu 또는 없으며,
상기 위치 15의 Xaa는 Tyr, Glu 또는 Asp,
상기 위치 16의 Xaa는 Gly 또는 Asp,
상기 위치 17의 Xaa는 Ala 또는 Leu,
상기 위치 18의 Xaa는 Thr, Ile, Val, Leu 또는 Asn,
상기 위치 19의 Xaa는 Pro, Thr 또는 Ser,
상기 위치 20의 Xaa는 Tyr, Phe, Nleu, His 또는 Gln,
상기 위치 21의 Xaa는 Asp, Asn, Leu 또는 Ala,
상기 위치 22의 Xaa는 Leu, Ile, Val 또는 Asn,
상기 위치 23의 Xaa는 Asn, Tyr, Cys 또는 Gly,
상기 위치 24의 Xaa는 Thr, Met, Ile, Ala, Val 또는 없고,
상기 위치 25의 Xaa는 Gly 또는 없으며,
서로에게 독립적인 n = 1, 2 또는 3 및 m= 0, 1, 2 또는 3인 아미노산 서열의 그룹들로부터 선택되고,
각 HIV 특이적 펩타이드의 말단들은 프리 카르복실- 또는 아미노-그룹, 아미드, 아실 또는 아세틸일 수 있거나,
또는 상기 HIV 특이적 펩타이드들 중 어느 하나의 염이다.
HIV-특이적 펩타이드 서열들은 특히 우수한 항원으로 기능할 잠재력을 가지며, 상기 항원은 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55 또는 서열번호 61의 서열들의 군으로부터 선택되는 최소 하나의 펩타이드를 포함한다. 항원성(antigenicity)은, 다른 펩타이드들의 비율 또는 농도를 조정하거나 또는 예를 들어 다이머화 또는 폴리머화 및/또는 고체 상(solid phase)에 고정화에 의해 펩타이드들의 크기를 조절하여 조정될 수 있다. 상기 항원은 본 발명에 따라 이용되는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열들을 포함하며, 이들은 브릿지 예를 들어 체인들의 Cys 잔기들 간의 이황화 브릿지에 의해 연결되거나 또는 가능하다면 O, S, 또는 N 같은 하나 이상의 헤테로원자들, 좋게는 상기 원자들은 결합되어 있는 헤테로원자들에 의해 개입되는 C1-C8 알킬렌 같은 브릿지들에 의해 연결되어 있다. 상기 체인들은 모노머, 다이머 또는 올리고머 형태로 고체 상에 고정화될 수 있다. 고정화를 용이하게 해주는 ≪암(arm)≫을 획득하기 위해 추가적인 아미노산들이 상기 말단들에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따라 이용되는 HIV-특이적 펩타이드들 내 모든 아미노산들은 천연의 L-형태가 선호될지라도 D- 또는 L-형태를 모두 가질 수 있다.
HIV-특이적 펩타이드 서열들의 C- 및 N-말단(terminal ends)은 말단 NH2-그룹 및/또는 COOH-그룹의 변형에 의해 천연 서열들과 다를 수 있고, 예를 들어 상기 말단은 아실화, 아세틸화, 아미드화 또는 변형되어 담체 또는 다른 분자를 위한 결합 위치를 제공할 수 있다. 펩타이드의 C-말단이 아미드인 경우, 적합한 아미드들은 화학식 -C(O)-NRxRy를 가지는 아미드들로, 상기 Rx 및 Ry는 수소 및 C1-6 알킬로부터 독립적으로 선택되며 상기 알킬 그룹은 하나 이상의 불소 원자로 치환될 수 있고, 예를 들어 -CH3, -CH2CH3 및 -CF3이며, 언급될 수 있는 특정 아미드 그룹은 -C(O)NH2이다. 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되는 경우, 적합하게 아세틸화된 N-말단들은 화학식 -NH-C(O)Rz의 아세틸화된 말단들을 포함하고, Rz는 수소, C1 -6 알킬이며, 상기 알킬 그룹은 하나 이상의 불소 원자로 치환될 수 있고, 예를 들어 -CH3, -CH2CH3 및 -CF3, 또는 페닐이다.
본 발명에 따라 이용되는 HIV-특이적 펩타이드들은 6 내지 50개의 아미노산들, 좋게는 10 내지 30개의 아미노산들로 구성된다. 상기 펩타이드들은 동정된 위치들에서 아미노산들의 모든 천연 변이들을 포괄하고 있다.
본 발명에 따라 이용되는 폴리펩타이드 항원은 프리 형태 또는 담체-결합된 형태 중 어느 하나이다. 상기 펩타이드가 선택적으로 결합되는 담체 또는 고체 상은 매우 다양한 알려진 담체들로부터 선택될 수 있다. 상기 담체 또는 고체 상은 백신에서 진단성 항원 또는 면역화시키는 성분으로서 고정화된 폴리펩타이드의 의도된 용도와 관련하여 선택될 것이다.
예를 들어, 진단성 목적들을 위해 이용될 수 있는 담체의 예들은 스티렌-디비닐 벤젠, 하이드록실화된 스티렌-디비닐 벤젠, 폴리스티렌, 카르복실화된 폴리스티렌, 카본 블랙의 비드들, 비-활성화된 또는 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드 활성화된 유리, 에폭시-활성화된 다공성 자성 글래스, 젤라틴 또는 폴리사카라이드 입자들 같은 코-폴리머들(co-polymers)의 자성 비드들 또는 라텍스 또는 다른 단백질 입자들, 적혈구 세포들, 단일- 또는 다중클론 항체들 또는 그러한 항체들의 fab 단편들이다.
본 발명에 따른 용도를 위한 백신의 하나의 구현예에서 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55 및 서열번호 61의 펩타이드들을 포함하는 항원을 포함하고, 보다 좋게는 상기 펩타이드들은 1:1:1:1 w/w의 비율로 존재한다.
추가적으로 선호되는 구현예에서 본 발명에 따른 용도를 위한 백신은 다음의 펩타이드들:
RALGPAATLQTPWTASLGVG(서열번호 49)
RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG (서열번호 52)
RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRTAILG (서열번호 57)
및
RFIIPNlFTALSGGRRALLYGATPYAIG (서열번호 64)(위치 6의 Nl은 노르루이신이다) 또는 이의 염들, 특히 아세테이트 염들을 포함한다.
일부 구현예들에서 본 발명에 따른 용도를 위한 펩타이드들은 다음과 같이:
RALGPAATLQTPWTASLGVG-NH2(서열번호 49)
RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG-NH2 (서열번호 52)
RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRTAILG-NH2(서열번호 57)
및
RFIIPNlFTALSGGRRALLYGATPYAIG-NH2 (서열번호 64) (위치 6의 Nl은 노르루이신이다)
또는 이의 염들, 특히 아세테이트 염들로 C-말단에서 변형된다.
상기 서열들 중 하나는 B-세포 에피토프를 포함하며 체액성 면역 시스템을 활성화시킬 것인 반면에 다른 서열들은 CTL-에피토프들을 제공하고 CTL-에피토프의 프레인 내에서 실시되는 상기 아미노산 변화들은 증가된 결합을 이루도록 고안된다. 상기 펩타이드의 합성을 용이하게 하고/하거나 상기 펩타이드의 용해성을 증가시키기 위해 다른 아미노산 변화들이 실시되었다.
C5 관계된 화합물들 같은 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물:
본 발명은 또한 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물들의 용도에 관한 것이다. 체액성 면역은 바이러스 입자들에 결합할 수 있는 항체들 및 감염을 중화시킬 수 있는 어떤 항체들의 발생을 포함한다.
본 발명에 따라 이용되는 대로 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 펩타이드는 국제특허출원 WO2011/000962, WO00/52040, WO 2012/092934 또는 WO 2012/072088 중 어느 하나에 기재된 어떠한 펩타이드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 출원들이 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
일부 구현예들에서 상술한 화합물들은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 제제들이다. 다른 구현예들에서 상술한 화합물들은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시키는 항체들을 유도하는 면역원들이다.
본 발명의 하나의 양태는 인간 면역결핍 바이러스 I(HIV) 같은 그러한 바이러스로 감염된 인간에서 HIV 같은 인간 레트로바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 제제의 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태는 매우 유사하지만 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)을 발생하는 위험을 감소시키는 조성물들 및 방법들에 관한 것으로, 상기 방법은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 제제의 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한다.
상술한 양태들은 본 발명에 따라 HIV 감염된 장기간 비-발병자들에 특징적인 항체들을 모방할 수 있는 제제들로 HIV 감염된 개체들 같이 레트로바이러스 감염들을 치료하는 것을 주요한 목표로 한다 - 이것은 본 발명의 기저를 이루는 발견들의 가장 간단한 치료적 이용이다. 상기 하나의 양태가 HIV 같은 레트로바이러스 감염들의 병리학적 효과들을 감소시키거나 또는 명확하게 AIDS를 발병시키는 시간을 연장하는 목적을 가진다면, 다른 양태는 전적으로 AIDS를 발생시킬 위험을 감소시키는 것을 목표로 하여 항레트로바이러스 치료법으로 현재 예방적으로 치료되는 개인들에 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 상술한 첫 번째 양태들에서 제제는 gp41의 트랜스막 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열 및 C2 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택되는 최소 하나의 아미노산 서열을 포함하는 분자이며, 상기 최소 하나의 아미노산 서열은 C5 도메인과 결합하고 선택적으로 최소 하나의 D-아미노산을 포함한다; 어떤 구현예들에서 상기 아미노산 서열 내 모든 아미노산들은 D-아미노산들이다. 상기 분자는 좋게는 펩타이드이며, 어떤 구현예들에서 이러한 펩타이드는 최소 하나의 아미노산 서열로 구성된다. 상기 아미노산 서열들은 전형적으로 최대 10개의 아미노산 잔기들, 예컨대 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 및 최대 5개의 아미노산 잔기들을 포함한다. 이에 따라 선호되는 분자들은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기들을 가지는 펩타이드들이다. 따라서 상기 최소 하나의 분자의 특이적 구현예들은 서열번호 34, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 43 및 45를 가지거나 또는 포함하는 펩타이드들로, 모두 일부 또는 전체적으로 D-아미노산들로 구성될 수 있다. 또한 화학식 III을 가지는 펩타이드들을 포함하는 분자들은 상기 최소 하나의 분자의 흥미로운 구현예들이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 상술한 첫 번째 양태들에서 제제는 항체, 항체 단편 또는 항체 유사체로부터 선택된다. 상기 항체는 완전한 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메릭 항체, 또는 이의 유도체일 수 있다. 전형적으로, 상기 항체는 IgA, IgD, IgG, IgE 또는 IgM이다 - 상기 항체는 단일클론 및 다중클론 모두일 수 있다. 상기 항체 단편은 전형적으로 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig(라마 또는 카멜 Ig), VHH 단편, 단일 체인 FV, 및 단일-체인 항체 단편으로부터 선택되고, 상기 항체 유사체는 전형적으로 scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR, tandAb, BiTE, 및 다중특이적 항체로부터 선택된다.
본 발명의 상술한 첫 번째 양태들의 하나의 구현예에서, 상기 제제는 Z1은 K, R 또는 E이고, Z2는 Q 또는 E인 아미노산 스트레치 TZ1AKRRVVZ2REKR 내 하나 이상의 아미노산 잔기들에 결합하고 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들과 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인 내 하나의 아미노산 스트레치에서 하나 이상의 아미노산 잔기들 간의 연결을 안정화시킨다. C5로부터 유래하는 이러한 아미노산 스트레치는 알려진 복수의 HIV 클레이드들 사이에 매우 보존되어 있어 상기 제제와 이러한 스트레치와의 효과적인 상호작용이 매우 유리할 것으로 믿어진다.
본 발명의 추가적인 양태는 HIV로 감염된 인간에서 인간 면역결핍 바이러스 I (HIV)의 위험을 감소시키거나 또는 이의 병리학적 효과들을 감소 및/또는 지연시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시키는 항체를 유도하는 면역원의 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는 반면에, 다른 양태들은 동일한 방법을 이용하는 예방적 방법에 관한 것이다. 다시 말하면, 하나의 양태는 치료적 활성 면역치료법에 관한 것인 반면에, 다른 양태는 AIDS를 포함하는 HIV 질병의 예방적 면역치료법에 관한 것이다. 또한 이것은 HIV 감염의 예방을 수반한다.
상술한 특이적 양태들은 HIV LTNP 개체들에서 발견되는 항체 레퍼토리처럼 평균적인 HIV 감염된 개체에서 동일한 타입의 항체 레퍼토리를 유도하는 것이 용이하다는 인식(realisation)에 기반된다. C5 및 tm-gp41 및/또는 C2 모두에서 펩타이드 부위들을 신중하게 선택함으로써 상술한 부위들로 구성되는 HIV에 존재하는 항체 결합 에피토프들을 모방하는 펩타이드 멀티머들을 제조하기 위해, 소망된 면역을 유도할 백신들을 제조하는 것이 가능하게 된다 - 흥미롭게도, 이러한 접근방법은 전통적인 의미에서 중화성 항체들을 얻기 위한 백신화시키는 것을 목표로 하지 않는다.
하나의 구현예에서 상기 면역원은 본 발명의 상술한 양태들을 논의하는 경우 하기에 상세하게 기재된 펩타이드 멀티머, 하기에 상세하게 기재된 조성물, 다른 양태들과 관련하여 논의되는 핵산 단편, 다른 곳에서 논의되는 바이러스 또는 플라스미드 벡터 조성물들로부터 선택된다.
공통적으로 상술한 양태들 모두는 C5 도메인 및 C2 및/또는 gp41의 트랜스막 도메인 간의 타겟팅된 연결이 Z1은 K, R 또는 E이고, Z2는 Q 또는 E인 아미노산 스트레치 TZ1AKRRVVZ2REKR 내 최소 하나의 아미노산 및 gp41의 트랜스막 도메인 내 최소 하나의 아미노산 또는 gp120의 불변 C2 도메인 내 최소 하나의 아미노산을 포함하는 것인 구현예들을 포함한다. 상기 설명한 대로, 이러한 특이적 서열은 알려진 HIV 클레이드들에서 매우 잘-보존되어 있어, 타겟팅하기 가장 쉬운 것이 이러한 서열과 tm-gp41 또는 C2 간의 상호작용이다.
본 발명에 따라 이용되는 면역원들은 (1) 펩타이드 멀티머를 포함할 수 있으며, 상기 멀티머는
- 0 내지 4개 사이의 아미노산 치환들을 포함하는 HIV gp120의 C5 도메인의 13개의 아미노산 잔기 아미노산 서열의 아미노산 서열, 이의 부분서열, 또는 상기 아미노산 서열 또는 부분서열의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 펩타이드, 및
- gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치 또는 서열번호 6 내지 서열번호 13 중 어느 하나에 존재하는 아미노산 스트레치 또는 gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 최소 하나의 두 번째 펩타이드를 포함하고,
상기 펩타이드 멀티머는 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결에 결합하고 안정화시킬 수 있는 항체를 유도할 수 있고, 상기 펩타이드 멀티머는 gp120 내 C5의 N-말단 아미노산들이 없다.
다시 말하면, 이러한 양태는 한쪽에 C5 및 다른 쪽에 tm-gp41 및/또는 C2에 상호작용하는 영역들로 특징화되는 에피토프들과 3차원적으로 유사함(resemblance)을 가지는 펩타이드 멀티머들에 관한 것이다. 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머들은 HIV LTNP 개체들에서 발견되는 항체들처럼 동일한 특징들을 가지는 항체들을 유도할 수 있는 유용한 면역원들이지만, 상기 펩타이드 멀티머들도 진단/예후 수단으로서 유망하다. 레트로-, 인버소-, 및 레트로-인버소 펩타이드들의 포함은 HIV 카운터파트와 비교하여 단백질 가수분해적으로 안정적인 펩타이드들의 생산을 가능하게 할 뿐 아니라 진정한 외래 펩타이드들의 생산을 가능하게 한다.
상기 펩타이드 멀티머의 하나의 구현예에서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (I)
을 가지는 아미노산 서열로, X1은 Thr이고, X2는 Lys, Arg, Har 및 Glu로부터 선택되며, X3은 Ala 및 Val로부터 선택되고, X4는 Arg, Har, Lys 및 Cit(시트룰린)로부터 선택되며, X5는 Arg, Har, Lys 및 Cit로부터 선택되고, X6은 Arg, Har, Lys 및 Cit로부터 선택되며, X7은 Val, Leu, Ile 및 Nle(노르루이신)로부터 선택되고, X8은 Val, Leu, Ile 및 Nle로부터 선택되며, X9는 Gln, Glu, Asn 및 Asp로부터 선택되고, X10은 Arg, Har 및 Cit로부터 선택되며, X11은 Glu 및 Asp로부터 선택되고, X12는 Lys이며, X13은 Arg, Har 및 Cit로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나,
또는 화학식 I의 아미노산 서열의 부분서열을 포함하거나, 또는 상기 아미노산 서열 또는 부분서열의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식 I을 가지는 아미노산 서열의 N-말단에 결합되는 디펩타이드 Ala-Pro를 추가적으로 포함하고/포함하거나 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식 I을 가지는 아미노산 서열의 C-말단에 결합되는 디펩타이드 X14-X15를 추가적으로 포함할 수 있으며, X14는 Ala 및 Val로부터 선택되며 X15는 Val, Leu 및 Nle로부터 선택된다.
C5로부터 유래되는 특히 흥미로운 펩타이드들은 실시예들의 서문에 설명되어 있고 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머들의 첫 번째 펩타이드의 구현예들을 구성한다.
gp41 및 gp120의 많은 천연 돌연변이체들이 관찰되었음에 따라 두 번째 펩타이드가 gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치를 포함한다고 기재하는 경우, 이것은 상기 아미노산 스트레치가 어떠한 그런 천연의 형태에서 존재한다는 것을 지시하고자 의도된다. 따라서, gp41로부터 유래되는 경우 어떤 구현예들에서 상기 최소 하나의 두 번째 펩타이드는 화학식:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17 (III)
을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로, Z1은 Asp이며, Z2는 Arg이고, Z3은 Pro이며, Z4는 Glu 또는 Gly이고, Z5는 Gly 또는 Arg이며, Z6은 Ile이고, Z7은 Glu이며, Z8은 Glu이고, Z9는 Glu이며, Z10은 Gly이고, Z11은 Gly이며, Z12는 Glu 또는 없고, Z13은 Arg 또는 Gln이며, Z14는 Asp 또는 Gly이고, Z15는 Arg 또는 Lys이며, Z16은 Asp 또는 Gly이고, Z17은 Arg인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이거나,
또는 화학식 (III)의 부분서열, 예컨대 최소 5개의 아미노산 잔기들(예컨대 최소 6개, 최소 7개, 최소 8개, 최소 9개, 최소 10개, 최소 11개, 최소 12개, 최소 13개, 최소 14개, 최소 15개, 및 최소 16개의 아미노산 잔기들)을 가지는 부분서열을 포함하는 펩타이드이다. 나아가, 상기 두 번째 펩타이드의 이러한 구현예는 gp41에서 발견되는 상응하는 아미노산 서열과 최소 80%의 서열 동일성을 초래하는 아미노산 치환들을 포함할 수 있다.
C2 및 gp41, 및 gp120으로부터 유래되는 특히 흥미로운 펩타이드들은 실시예들의 서문에 설명되어 있고 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머들의 두 번째 펩타이드의 구현예들을 구성한다.
상기 펩타이드 멀티머의 어떤 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드 및 최소 하나의 두 번째 펩타이드는 링커를 통해 연결된다; 상기 링커는 글라이신, 라이신 또는 아르기닌 링커, 폴리히스티디닐 택(tag), 단백질 G, 및 단백질 A 같은 어떠한 펩타이드 링커일 수 있지만, 비스-말레이미드 링커, 이황화 링커, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커를 이용하는 것도 가능하다. 실제적으로, 펩타이드 화학에서 유용한 것으로 알려진 어떠한 링커도 본 발명에 따른 링커로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 서로에게 컨쥬게이션되거나 또는 융합된 "단순(simple)" 선형 펩타이드의 사용을 고려하지만, 또한 C5 및 gp120 또는 gp41의 다른 부위들로부터 유래된 개별 펩타이드들이 비-펩타이드 링커들, 예를 들어 상보적 핵산들, 핵산 유도체들 또는 유사체들, 예컨대, PNA, LNA를 통해 결합되는 경우 펩타이드 멀티머들도 고려한다. 다수의 링커 타입들의 사용도 본 발명의 범위 내에 속하고, 예를 들어 체인간 이황화 링커들을 포함하는 선형 펩타이드들을 이용하는 것도 본 발명에 따라 이용될 수 있는 일부이다.
본 발명에 따라 이용되는 특히 흥미로운 펩타이드 멀티머들은 실시예들의 서문에 설명되어 있다.
어떤 구현예들에서, 상기 펩타이드 멀티머에서 상기 첫 번째 펩타이드 및 최소 하나의 두 번째 펩타이드 중 최소 하나는 아미드화, 아실화, 또는 아세틸화 같은 N- 또는 C-말단 변형을 포함한다. 펩타이드의 C-말단이 아미드인 경우, 적합한 아미드들은 화학식 -C(O)-NRxRy를 가지는 아미드들을 포함하고, 상기 Rx 및 Ry는 수소 및 C1 -6 알킬로부터 독립적으로 선택되며 상기 알킬 그룹은 하나 이상의 불소 원자로 치환될 수 있고, 예를 들어 -CH3, -CH2CH3 및 -CF3이며, 언급될 수 있는 특정 아미드 그룹은 -C(O)NH2이다. 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되는 경우, 적합하게 아세틸화된 N-말단들은 화학식 -NH-C(O)Rz의 아세틸화된 말단들을 포함하고, Rz는 수소, C1 -6 알킬이며, 상기 알킬 그룹은 하나 이상의 불소 원자로 치환될 수 있고, 예를 들어 -CH3, -CH2CH3 및 -CF3, 또는 페닐이다.
상기 펩타이드 멀티머들이 백신 제제들로서 고려되기 때문에, 어떤 구현예들에서 상기 펩타이드 멀티머들은 면역원성 담체 같은 담체 분자와 커플링된다. 따라서 상기 펩타이드 멀티머들의 펩타이드들은 재조합 융합(예컨대, CLIP 기술을 통한) 또는 방향성(예컨대, 헤테로이중기능성 교차-링커들) 또는 방향성 없는 방식의 화학적 결합 중 어느 하나를 통해 다른 분자들과 결합될 수 있다. 예를 들어, 디프테리아 독소, 라텍스 비드(진단 및 예후성 구현예들에 유용함), 및 자성 비드들(또한 진단 및 예후성 구현예들에 유용함), 폴리라이신 구축물들, 등 같은 담체 분자들과의 결합은 본 발명에 따라 이용되는 모든 가능한 담체 분자들이다.
상기 면역원성 담체는 당업계에서 전통적으로 이용되었던 담체 단백질들 (예컨대, 디프테리아 또는 테타누스 톡소이드, KLH, 등) 같은 담체 단백질들로부터 간편하게 선택되지만, 개체군의 더 큰 비율에서 T-세포 면역을 유도할 수 있는 더 짧은 펩타이드들(T-헬퍼 에피토프들)을 이용하는 것도 가능하다. 그러한 T-헬퍼 에피토프들에 대한 상세설명은, 예컨대 본 명세서에서 참조로서 삽입되는 WO 00/20027에서 발견될 수 있다 - 본 명세서에서 논의되는 모든 면역학적 담체들 및 "잡다한 요소로 이루어지는(promiscuous)" (즉, 총체적인) T-헬퍼 에피토프들은 본 발명에서 면역원성 담체들로서 유용하다.
어떤 구현예들에서, 상기 담체는 바이러스 유사 입자, 즉 감염성이 없는 비리온들과 특성들을 공유하는 입자이다. 그러한 바이러스-유사 입자들은 화학적으로 제공되거나(예컨대, Jennings and Bachmann Ann Rev Pharmacol. Toxicol. 2009. 49:303-26 Immunodrugs: Therapeutic VLP-based vaccines for chronic diseases) 또는 융합 단백질들을 발생시키기 위한 클로닝 기술들(예컨대, Peabody et al. J. Mol. Biol. 2008; 380: 252-63. Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2)을 이용하여 제공될 수 있다. 다른 예는 면역반응회사(Immune Response Corporation)에 의해 최초로 제조된 HIV 백신인 "레뮨(Remune)"으로, 상기 백신은 바이러스 게놈을 파괴하기 위해 방사선 조사되었던 포르말린 비활성화된 HIV로 구성된다. 상기 회사는 오늘날 널리 사용되고 있는 사멸된 폴리오 백신을 만들기 위해 동일한 기술을 이용했던 조나스 솔크(Jonas Salk)에 의해 시작되었다. 하지만, HIV의 고정에 있어서, gp120은 상기 비리온 표면 상에 일부 gp41만을 떨어뜨렸다. 이것은 본 명세서에 개시된 C5-유래된 펩타이드들과 레뮴 입자들을 직접적으로 혼합할 가능성을 열어두는데, 왜냐하면 C5와 레뮴 입자 상 gp41 간의 결합을 얻는 것이 여전히 가능할 것이기 때문이다.
펩타이드 멀티머들에 관계된 양태의 구현예들도 상기 첫 번째 펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5 또는 이의 단편, 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5 또는 이의 단편으로부터 선택되는 펩타이드의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 두 번째 펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 서열번호 46 또는 이의 단편 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 46 또는 이의 단편으로부터 선택되는 펩타이드의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 펩타이드 멀티머들을 포함한다. 상술한 대로, 그러한 경우에서 상기 펩타이드 멀티머가 C5와 gp41 및/또는 C2 간의 연결을 안정화시킬 항체들을 유도하는 능력을 제공하는 한 상기 단편은 매우 짧을 수 있다. 본 발명의 흥미로운 펩타이드 멀티머들 다수가 실시예들의 서문에 나열된다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 최대 70개의 아미노산들, 예컨대, 최대 69, 최대 68, 최대 67, 최대 66, 최대 65, 최대 64, 최대 63, 최대 62, 최대 61, 최대 60, 최대 59, 최대 58, 최대 57, 최대 56, 최대 55, 최대 54, 최대 53, 최대 52, 최대 51, 최대 50, 최대 49, 최대 48, 최대 47, 최대 46, 최대 45, 최대 44, 최대 43, 최대 42, 최대 41, 최대 40, 최대 39, 최대 38, 최대 37, 최대 36, 최대 35, 최대 34, 최대 33, 최대 32, 최대 31, 최대 30, 최대 29, 최대 28, 최대 27, 최대 26, 최대 25, 최대 24, 최대 23, 최대 22, 최대 21, 최대 20, 최대 19, 최대 18, 최대 17, 최대 16, 최대 15, 최대 14, 최대 13, 최대 12, 최대 11, 최대 10, 최대 9, 최대 8, 및 최대 7개의 아미노산들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 펩타이드 멀티머는 최소 6개의 아미노산 잔기들, 예컨대, 최소 7, 최소 8, 최소 9, 최소 10, 최소 11, 최소 12, 최소 13, 최소 14, 최소 15, 최소 16, 최소 17, 최소 18, 최소 19, 최소 20, 최소 21, 최소 22, 최소 23, 최소 24, 최소 25, 최소 26, 최소 27, 최소 28, 최소 29, 최소 30, 최소 31, 최소 32, 최소 33, 최소 34, 최소 35, 최소 36, 최소 37, 최소 38, 최소 39, 최소 40, 최소 41, 최소 42, 최소 43, 최소 44, 최소 45, 최소 46, 최소 47, 최소 48, 최소 49, 최소 50, 최소 51, 최소 52, 최소 53, 최소 54, 최소 55, 최소 56, 최소 57, 최소 58, 최소 59, 최소 60, 최소 61, 최소 62, 최소 63, 최소 64, 최소 65, 최소 66, 최소 67, 최소 68, 및 최소 69개의 아미노산 잔기들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 펩타이드 멀티머는 6개의 아미노산 잔기들 또는 7개의 아미노산 잔기들 또는 8개의 아미노산 잔기들 또는 9개의 아미노산 잔기들 또는 10개의 아미노산 잔기들 또는 11개의 아미노산 잔기들 또는 12개의 아미노산 잔기들 또는 13개의 아미노산 잔기들 또는 14개의 아미노산 잔기들 또는 15개의 아미노산 잔기들 또는 16개의 아미노산 잔기들 또는 17개의 아미노산 잔기들 또는 18개의 아미노산 잔기들 또는 19개의 아미노산 잔기들 또는 20개의 아미노산 잔기들 또는 21개의 아미노산 잔기들 또는 22개의 아미노산 잔기들 또는 23개의 아미노산 잔기들 또는 24개의 아미노산 잔기들 또는 25개의 아미노산 잔기들 또는 26개의 아미노산 잔기들 또는 27개의 아미노산 잔기들 또는 28개의 아미노산 잔기들 또는 29개의 아미노산 잔기들 또는 30개의 아미노산 잔기들 또는 31개의 아미노산 잔기들 또는 32개의 아미노산 잔기들 또는 33개의 아미노산 잔기들 또는 34개의 아미노산 잔기들 또는 35개의 아미노산 잔기들 또는 36개의 아미노산 잔기들 또는 37개의 아미노산 잔기들 또는 38개의 아미노산 잔기들 또는 39개의 아미노산 잔기들 또는 40개의 아미노산 잔기들 또는 41개의 아미노산 잔기들 또는 42개의 아미노산 잔기들 또는 43개의 아미노산 잔기들 또는 44개의 아미노산 잔기들 또는 45개의 아미노산 잔기들 또는 46개의 아미노산 잔기들 또는 47개의 아미노산 잔기들 또는 48개의 아미노산 잔기들 또는 49개의 아미노산 잔기들 또는 50개의 아미노산 잔기들 또는 51개의 아미노산 잔기들 또는 52개의 아미노산 잔기들 또는 53개의 아미노산 잔기들 또는 54개의 아미노산 잔기들 또는 55개의 아미노산 잔기들 또는 56개의 아미노산 잔기들 또는 57개의 아미노산 잔기들 또는 58개의 아미노산 잔기들 또는 59개의 아미노산 잔기들 또는 60개의 아미노산 잔기들 또는 61개의 아미노산 잔기들 또는 62개의 아미노산 잔기들 또는 63개의 아미노산 잔기들 또는 64개의 아미노산 잔기들 또는 65개의 아미노산 잔기들 또는 66개의 아미노산 잔기들 또는 67개의 아미노산 잔기들 또는 68개의 아미노산 잔기들 또는 69개의 아미노산 잔기들 또는 70개의 아미노산 잔기들로 구성된다.
상기 기재된 펩타이드들은 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 희석제들, 비히클(vehicle) 및/또는 하나 이상의 면역학적 보조제와 조합되어 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 면역원성 조성물(예컨대, 백신 조성물)로서 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
면역원성 조성물의 제조는 면역학적 보조제들 같은 최신 구성요소들의 사용을 포함한다. 하기에 상세하게 기재되는 상술한 보조제들 외에, 면역원성 조성물들은 일반적으로 당업계에 교시되는 대로 제조된다:
활성 성분들으로서 펩타이드 서열들을 포함하는 백신의 제조는 본 명세서에 참조로서 모두 삽입되는 미국 특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 및 4,578,770에 의해 예시된 바와 같이 일반적으로 당업계에서 잘 이해된다. 전형적으로, 그러한 백신들은 액체 용액 또는 현탁액 같이 주입가능하게 제조되고; 주입 시 용액 또는 현탁액을 위해 적합한 고형 형태들, 주입 전에 액체로도 제조될 수 있다. 상기 제조물은 유화될 수도 있다. 상기 면역원성 활성 성분은 약제학적으로 허용가능하고 상기 활성 성분과 양립가능한 부형제들과 종종 혼합된다. 적합한 부형제들은, 예를 들어 물, 염, 덱스트로오스, 글라이세롤, 에탄올, 또는 이와 유사한 것, 및 이의 조합물이다. 또한, 소망한다면, 상기 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 상기 백신의 효과를 증진시키는 보조제 같은 최소 양의 보조 물질들(auxiliary substances)을 포함할 수 있다; 아래의 보조제들의 상세한 논의사항과 비교하라.
백신들은 주입을 통해 비경구적으로, 예를 들어 피하내(subcutaneously), 피내(intracutaneously), 피내(intradermally), 피하내(subdermally), 또는 근육내 주입에 의해 간편하게 투여된다. 다른 모드의 투여에 적합한 추가적인 제형물들은 좌약들 및 일부 경우에서, 경구, 구강, 설하, 복강내, 질내, 항문, 경막외, 척수, 및 두개내 제형물들을 포함한다. 좌약을 위해, 전통적인 바인더들 및 담체들은, 예를 들어 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드들을 포함할 수 있다; 그러한 좌약들은 0.5% 내지 10% 범위, 좋게는 1-2% 범위의 활성 성분을 포함하는 혼합물들로부터 형성될 수 있다. 경구 제형물들은 그러한 정상적으로 이용되는 부형제들, 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 상술한 조성물들은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지속되는 방출 제형물 또는 파우더의 형태를 가지며 10-95%, 좋게는 25-70%의 활성 성분을 포함한다.
상기 펩타이드들 및 펩타이드 멀티머들은 중성 또는 염 형태의 백신으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염들은 산 부가 염들(펩타이드의 프리 아미노산 그룹들로 형성됨) 및 예컨대 염산 또는 인산 같은 무기산들, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 및 이와 유사한 것 같은 그러한 유기산들로 제형화된 염들을 포함한다. 프리 카르복실 그룹으로 형성된 염들은, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철 같은 무기 염기들, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 및 이와 유사한 것 같은 그러한 유기 염기들로부터 유래될 수도 있다.
백신들은 투여량 제형물과 양립할 수 있는 방식으로 투여되고 치료학적으로 효과적이고 면역원성을 가질 것인 그러한 양에서 투여된다. 투여될 양은 치료될 대상자에 의존하는데, 예를 들어 면역반응을 증가시키는 상기 개체의 면역 시스템의 능력, 및 소망된 면역의 정도에 의존한다. 적합한 투여량 범위들은 백신화 당 약 수백 마이크로그램의 활성성분으로 약 0.1 μg부터 2,000 μg의 선호되는 범위(1-10 mg 범위의 더 많은 양들이 고려될 지라도)를 가지며, 예컨대 약 0.5 μg부터 1,000 μg의 범위, 좋게는 약 1 μg부터 500 μg의 범위 및 특히 약 10 μg부터 100 μg의 범위이다. 초기 투여 및 두 번째 주사(booster shots)를 위해 적합한 치료 계획(regimens)도 다양하지만 초기 투여 후 이후의 접종 또는 다른 투여를 실시하는 것이 전형적이다.
상기 펩타이드들 및 펩타이드 멀티머들의 일부는 백신에서 충분하게 면역원성을 나타내지만, 상기 백신이 추가적으로 보조제 물질을 포함한다면 다른 것들 중 일부에 대한 면역반응이 증대될 것이다. 따라서 본 명세서에 기재된 면역원성 분자들은 보조제들과 함께 제형화될 수 있다:
보조제들 - 조합되는 것이 체액성 반응들을 유도하는 것으로 알려져 있고: i) 염 현탁액 (예컨대, 알루미늄 또는 칼슘 이온들을 포함하는 많은 염들), ii) 오일-인-물(oil-in-water) 에멀젼 (예컨대, 많은 스쿠알란-기반된 또는 스쿠알렌-기반된 에멀젼들), iii) 물-인-오일 에멀젼 (예컨대, 몬타니드(Montanide) ISA51 또는 ISA720), iv) 중성 리포좀, v) 양이온성 리포좀, vi) 마이크로스피어, vii) 면역자극성 복합체 (예컨대, ISCOMs 또는 ISCOMATRIX), viii) 패턴-인지 수용체 아고니스트 (예컨대, C-타입 렉틴 수용체들 (CLRs), NOD-유사 수용체들 (NLRs), RIG-유사 헬리카제들 (RLHs), 골수성 세포들에서 발현되는 촉발성 수용체 (TREMs) 및 톨-유사(Toll-like) 수용체들 (TLRs)에 대한 아고니스트), ix) 사포닌 (즉, 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 또는 플라티코돈 그란디플로룸(Platycodon grandiflorum)으로부터 유래되는 어떠한 사포닌), x) 비로좀/바이러스-유사 입자들(예컨대..), xi) 엔테로톡신 (즉, 콜레라 톡신, CTA1-DD 또는 대장균 열-불안정 엔테로톡신), 및 이의 조합들을 포함한다.
다른 적합한 보조제들은 Hung CY 등에 기재된 EP54 및 EP67 같은 반응-선택적 C5a 아고니스트들(agonists)을 포함한다. 인간 보체 단편 C5a의 아고니스트는 콕시디오이데스 감염에 대한 백신 면역을 증대시킨다. 백신 (2012) 및 Kollessery G 등. 형태적으로 편향되고 반응-선택적인 C5a 아고니스트들인 EP54 및 EP67을 포함하는 종양-특이적 펩타이드 기반된 백신들은 동계 쥐과 모델(syngeneic murine model)에서 공격적인 큰 B 세포 림프종에 대해 보호한다. 백신 (2011) 29: 5904-10.
이에 따라 백신에 대한 보조제 효과를 달성하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 일반적인 원리들 및 방법들이 "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, 및 "Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 상세하게 기재되어 있고, 이의 개시내용 모두가 본 명세서에 참조로서 삽입되지만, 이후의 많은 공개물들(publications)도 보조제들을 삽입하는 기술을 다룬다: Roestenberg M 등, PLoS One. 2008;3(12):e3960. Epub 2008 Dec 18; Relyveld E and Chermann JC, Biomed Pharmacother. 1994;48(2):79-83; Hsu FJ 등, Blood. 1997 May 1;89(9):3129-35; Galli G 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 12;106(19):7962-7. Epub 2009 Apr 27; Bojang KA 등, Lancet. 2001 Dec 8;358(9297):1927-34; Odunsi K 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31;104(31):12837-42. Epub 2007 Jul 25; Patel GB and Sprott GD; Crit Rev Biotechnol. 1999;19(4):317-57. Review; Agger EM 등, PLoS One. 2008 Sep 8;3(9):e3116; Kirby DJ 등 J Drug Target. 2008 May;16(4):282-93; Florindo HF 등, Vaccine. 2008 Aug 5;26(33):4168-77. Epub 2008 Jun 17; Sun HX 등, Vaccine. 2009 May 28; Guy B, Nat Rev Microbiol. 2007 Jul;5(7):505-17. Review.; Vandepapeliere P 등, Vaccine. 2008 Mar 4;26(10):1375-86. Epub 2008 Jan 14; Ghochikyan A 등 Vaccine. 2006 Mar 20;24(13):2275-82. Epub 2005 Dec 5; Xie Y 등, Vaccine. 2008 Jun 25;26(27-28):3452-60. Epub 2008 May 1; Chung YC 등, Vaccine. 2008 Mar 28;26(15):1855-62. Epub 2008 Feb 25; Maier M 등, Vaccine. 2005 Oct 25;23(44):5149-59; Sundling C 등, J Gen Virol. 2008 Dec;89(Pt 12):2954-64.
본 발명에 따라 이용되는 펩타이드들을 형질전환된 세포에 의해 재조합적으로 생산하는 경우, 본질적이지는 않을 지라도 상기 발현 산물이 간편하게 배양 배지 내로 전달되거나 또는 상기 형질전화된 세포의 표면으로 편리하게 운반된다.
효과적인 생산자 세포가 동정되었던 경우 이에 기반하여 본 발명에 따라 이용되는 벡터를 운반하고 본 발명에 따라 이용되는 핵산 단편을 발현하는 안정적인 세포주를 확립하는 것이 선호된다. 좋게는, 이러한 안정적인 세포주는 상기 펩타이드 발현 산물을 분비하거나 또는 운반하여 이의 정제를 용이하게 한다.
일반적으로, 숙주세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터들은 상기 숙주들과 관련되어 사용된다. 상기 벡터는 보통 복제 위치 뿐 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열들을 운반한다. 예를 들어, 대장균(E. coli)은 전형적으로 대장균 종으로부터 유래되는 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다(예컨대, Bolivar et al ., 1977을 참조하라). 상기 pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린 저항성 유전자들을 포함하여 형질전환된 세포들을 동정하기 위한 쉬운 방도를 제공한다. 또한 상기 pBR 플라스미드, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파지는 발현을 위한 원핵 미생물에 의해 이용될 수 있는 프로모터들을 포함하거나, 또는 포함하도록 변형되어야만 한다.
재조합 DNA 구축에서 가장 일반적으로 이용되는 그러한 프로모터들은 β-락타마제 (페니실리나제) 및 락토오스 프로모터 시스템들 (Chang et al ., 1978; Itakura et al ., 1977; Goeddel et al ., 1979) 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al ., 1979; EP-A-0 036 776)을 포함한다. 상술한 프로모터들이 가장 일반적으로 이용되지만, 다른 미생물성 프로모터들도 발견되고 이용되었으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 대한 상세내용들이 공개되었다.
원핵생물 외에도, 효모 배양물 같은 진핵 미생물들도 이용될 수 있고, 여기에 프로모터도 발현을 추진할 수 있을 것이다. 많은 다른 스트레인들이 흔히 이용가능할지라도, 사카로미세스 세레비지아세(Saccharomyces cerevisiase), 또는 보통 빵 효모(baker's yeast)가 진핵 미생물들 중에서 가장 일반적으로 이용된다. 사카로미세스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7이 보통 이용된다 (Stinchcomb et al ., 1979; Kingsman et al ., 1979; Tschemper et al., 1980).
효모 벡터들에서 적합한 프로모팅 서열들은 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzman et al ., 1980) 또는 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코오스 이소머라제, 및 글루코키나제 같은 다른 당분해효소들 (Hess et al ., 1968; Holland et al ., 1978)을 포함한다. 적합한 발현 플라스미드들을 구축하는 경우, 상술한 유전자들과 결합된 종결 서열들도 발현되기를 소망하는 서열의 발현 벡터 3' 내로 삽입되어 mRNA 및 종결의 폴리아데닐화(polyadenylation)를 제공한다.
성장 조건들에 의해 조절되는 전사의 추가적인 장점을 가지는 다른 프로모터들은 알코올 디하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소들, 및 상술한 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용을 책임지는 효소들에 대한 프로모터 부위이다. 효소-호환가능한 프로모터, 복제기원 및 종결 서열들을 포함하는 어떠한 플라스미드 벡터가 적합하다.
미생물들 외에도, 다세포 생물체들로부터 유래되는 세포의 배양물도 숙주로서 이용될 수 있다. 원칙적으로, 척추동물 또는 무척추동물 배양으로부터 유래하던 간에 어떠한 그런 세포 배양물이 작동가능하다. 그러한 유용한 숙주세포주의 예들은 VERO 및 HeLa 세포들, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주들, 및 W138, BHK, COS-7 293, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (SF) 세포들, 드로소필라 멜라노가스터 세포주들 (예컨대, 쉬나이더 2 (S2)), 및 MDCK 세포주들이다.
통상적으로 그런 세포들에 대한 발현 벡터들은 어떠한 필요한 리보좀 결합 위치들, RNA 스플라이싱 위치들, 폴리아데닐화 위치, 및 전사적 종결인자 서열들과 함께 (필요하다면) 복제기원, 발현될 유전자의 앞에 위치되는 프로모터를 포함한다.
포유동물 세포들에서 이용하는 경우, 발현 벡터들 상 조절 기능들은 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 이용되는 프로모터들은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 및 가장 빈번하게는 시미안 바이러스 40 (SV40)으로부터 유래된다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터들이 특히 유용한데, 이는 양 프로모터들이 SV40 바이러스 복제기원도 포함하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 얻어지기 때문이다(Fiers et al ., 1978). 상기 바이러스 복제기원에 위치되는 HindIII 위치로부터 BglI 위치로 연장하는 약 250 bp 서열이 포함되는 경우 더 작거나 또는 더 큰 SV40 단편들도 이용될 수 있다. 나아가, 조절 서열들이 숙주세포 시스템들과 양립가능하다면 소망되는 유전자 서열과 정상적으로 연관되는 프로모터 또는 조절 서열들을 이용하는 것도 가능하고 이는 종종 바람직하다.
복제기원은 SV40 또는 다른 바이러스(예컨대, 다른 폴리오마 바이러스들, 아데노, VSV, BPV)로부터 유래될 수 있는 외인성 기원을 포함하는 벡터의 구축 또는 숙주세포 염색체 복제 기작 중 어느 하나에 의해 제공될 수 있다. 상기 벡터가 숙주세포 염색체에 통합되는 경우, 후자는 보통 충분하다.
상기 상세하게 기재되었던 폴리펩타이드 기반 백신들의 투여 경로 및 투여 계획에 있어서, 상술한 투여 경로 및 투여 계획도 본 발명의 핵산 백신들에 적용가능하고 폴리펩타이드를 위한 상기 투여 경로 및 투여 계획과 관련되는 모든 상기 논의사항들이 필요한 부분만 약간 수정하여 핵산들에 적용한다. 이를 위해 핵산 백신들도 정맥내 및 동맥내로 투여될 수 있다는 것이 첨가될 것이다. 더 나아가, 핵산 백신들이 소위 유전자 총 및/또는 전기천공을 이용하여 투여될 수 있다는 것이 당업계에 잘-알려져 있고, 따라서 상술한 투여 경로 및 투여 계획 및 동등한 모드들이 본 발명의 일부로서 간주된다.
정상적인 환경 하에서, 상기 핵산 단편이 발현이 바이러스 프로모터의 조절 하에 있는 벡터의 형태로 도입된다. 본 발명에 따라 이용되는 벡터들의 보다 상세한 논의사항들에 대해, 상기 논의사항과 비교하라. 또한, 핵산 백신들의 제형물 및 사용과 관계된 상세한 개시내용들이 이용가능하고, Donnelly JJ 등, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 및 Donnelly JJ 등, 1997, Life Sciences 60: 163-172를 참조하라. 상술한 레퍼런스 모두가 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
펩타이드 면역원 또는 핵산 면역원을 이용하는 대안은 살아있는 면역원 기술의 이용이다. 이것은 본 발명의 핵산 단편 또는 벡터로 형질전환된 비-병원성 미생물을 투여하는 것을 수반한다. 상기 비-병원성 미생물은 어떠한 적합한 약화된 박테리아 스트레인(패시징 또는 재조합 DNA 기술에 의한 병원성 발현 산물들의 제거에 의해 약화됨), 예를 들어 미코박테리움 보비스 BCG., 비-병원성 스트렙토코커스 종, 대장균, 살모넬라 종, 비브리오 콜레래, 쉬겔라, 등일 수 있다. 최신 살아있는 백신들의 제조를 다루는 검토들은, 예를 들어 Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990에서 발견될 수 있으며, 양자가 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 그러한 살아있는 백신들에서 이용되는 핵산 단편들 및 벡터들에 대한 상세 내용들은 하기 논의사항을 참조하라.
박테리아 살아있는 면역원들에 대한 대안으로서, 본 발명에 따라 이용되는 핵산 단편이 백시니아 스트레인 또는 어떠한 다른 적합한 폭스바이러스 같은 비-독성 바이러스 백신에 삽입될 수 있다.
정상적으로는, 상기 비-병원성 미생물 또는 바이러스는 대상자에 오직 한번 투여되지만, 어떤 경우들에서 보호적 면역을 유지하기 위해 일생동안 상기 미생물/바이러스를 몇 번이고 투여하는 것이 필요할 수 있다. 심지어 폴리펩타이드 백신화를 위해 상기 상세하게 기재된 바와 같이 살아있는 또는 바이러스 백신들을 이용하는 경우 면역화 계획들이 유용할 것이라는 것이 고려된다.
택일적으로, 살아있는 또는 바이러스 면역화가 이전 또는 이후 폴리펩타이드 및/또는 핵산 면역화와 조합된다. 예를 들어, 살아있는 또는 바이러스 백신으로 일차 면역화를 초래한 후 상기 폴리펩타이드 또는 핵산 접근방법을 이용한 이후 부스터(booster) 면역화들을 실시하는 것이 가능하다.
실시예들의 서문
서열들 개요 및 약어들:
C5-서열들:
APTKAKRRVVQREKRAV (서열번호 1)
APTKAKRRVVEREKRAV (서열번호 2)
APTRAKRRVVQREKRAV (서열번호 3)
APTRAKRRVVEREKRAV (서열번호 4)
APTEAKRRVVEREKRAV (서열번호 5)
WWGCAKRRVCGGAKRRVVQREKRA (서열번호 44)
(서열번호 44 내 밑줄친 아미노산 잔기들은 이황화 링커를 통해 결합된다; N-말단 W는 좋게는 D-아미노산이고 C-말단 A는 아미드화될 수 있다; 상기 펩타이드는 상술한 2개의 변형들을 가지는 경우 BI450-AdjBT_1로 명명된다).
C5-복합체 형성 서열들:
DRPEGIEEEGGERDR (4번째 아미노산이 G일 수 있고/있거나 5번째 아미노산이 R일 수 있고/있거나 13번째 아미노산이 Q일 수 있고/있거나 14번째 아미노산이 G일 수 있고/있거나 15번째 아미노산이 K일 수 있다; 서열번호 6);
DRPEGIENNGGERDR (4번째 아미노산이 G일 수 있고/있거나 5번째 아미노산이 R일 수 있고/있거나 13번째 아미노산이 Q일 수 있고/있거나 14번째 아미노산이 G일 수 있고/있거나 15번째 아미노산이 K일 수 있는 서열번호 7);
DRPEGIENNGGERDRDR (4번째 아미노산이 G일 수 있고/있거나 5번째 아미노산이 R일 수 있고/있거나 13번째 아미노산이 Q일 수 있고/있거나 14번째 아미노산이 G일 수 있고/있거나 15번째 아미노산이 K일 수 있고/있거나 16번째 아미노산이 G일 수 있다); 서열번호 46);
VERYLKDQQLLG (서열번호 8);
VERYLKDEELLG (서열번호 9);
VERYLKDNNLLG (서열번호 10);
QLLLNGSLAEEEIVI (서열번호 11)
QLLLNGSLAEEEVVIV (서열번호 12)
QLLLNSLAEEEVVI (서열번호 13)
GGAIVNGSLADDDIVI (서열번호 37, 또한 본 명세서에서 204d로 명명됨)
WWGCIEEEGCGGIEEEGGERDR (서열번호 45: 밑줄친 아미노산 잔기들은 이황화 링커를 통해 결합된다; N-말단 W는 좋게는 D-아미노산이고 C-말단 A는 아미드화될 수 있다; 상기 펩타이드는 상술한 2개의 변형들을 가지는 경우 BI450-AdjBT_2로 명명된다).
폴리펩타이드들 I:
(Z-SEQc5-Z-SEQc5)n
n=1,2,3,4
폴리펩타이드들 II:
(Z-SEQcx-Z-SEQcx)n
n=1,2,3,4
펩타이드 복합체들:
(Z-SEQc5-Z-SEQc5)n
|
비스-말레이미드 링커
|
(Z-SEQcx-Z-SEQcx)n
n=1,2,3,4
(Z-SEQc5-Z-SEQc5)n
|
(Z - SEQcx-Z-SEQcx)n
n=1,2,3,4
폴리펩타이드 I의 예들은 다음의 서열들일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
APTKAKRGGGAPTRAKRGGGAPTEAKR (서열번호 14)
RVVEREKGGGAKRRVVGGGRVVQREK (서열번호 15)
GGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (서열번호 16)
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (서열번호 17)
GGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (서열번호 18)
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (서열번호 19)
GGAKRRVVGGAKRRVV (서열번호 20)
GCGAKRRVVGGAKRRVV (서열번호 21)
폴리펩타이드 II의 예들은 다음의 서열들일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
GGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (서열번호 22)
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (서열번호 23)
GGDQQLLGGAEEEIVGGGERDR (서열번호 24)
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG (서열번호 25)
GGAEEEVVGGDQQLL (서열번호 26)
CGGAEEEVVGGDQQLL (서열번호 27)
이황화 결합된 구축물의 예들은 다음의 결합된 펩타이드 서열들일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (서열번호 28)
|
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (서열번호 29)
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (서열번호 30)
|
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG (서열번호 31)
CGGAEEEVVGGDQQLL (서열번호 32)
|
GCGGAKRRVVGGAKRRVV (서열번호 33)
상기 이황화 결합된 구축물들은, 예를 들어 티올-보호되지 않은 펩타이드들과 2-피리딘술페닐(SPyr)-보호된 시스테인-함유 펩타이드들의 적정에 의해 합성될 수 있다. 이것은 호모다이머들의 형성을 억제하는 이황화-결합된 펩타이드 헤테로다이머들을 선택적으로 발생시키는 우수한 과정으로 증명되었다 (Schutz A et al., Tetrahedron, Volume 56, Issue 24, 9 June 2000, Pages 3889-3891). 서열번호 28이 서열번호 31 또는 서열번호 33과 이황화 결합되거나 또는 서열번호 30이 서열번호 29 또는 서열번호 33과 이황화 결합되거나, 또는 서열번호 32가 서열번호 29 또는 서열번호 31과 이황화 결합되는 유사한 구축물들도 본 발명의 범위 내에 있다.
다르게 결합된 구축물의 예들이 다음의 결합된 펩타이드 서열들일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 구축물들은 모두 바켐 사(Bachem (UK) Ltd:)로부터 얻어졌다:
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (서열번호 38)
|
GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR (서열번호 39)
(상기 펩타이드들은 밑줄친 Cys와 Lys 잔기들을 통해 결합된다; 전체 구축물은 본 명세서에서 BI400-B로 명명된다).
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (서열번호 38)
|
GKGGIEEEGGERDRDRGGQDRDR (서열번호 40)
(상기 펩타이드들은 밑줄친 Cys와 Lys 잔기들을 통해 결합된다; 전체 구축물은 본 명세서에서 BI400-Bu1로 명명된다).
GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (서열번호 41)
|
GKGGIEEEGGQDRDRGGRDRDR (서열번호 42)
(상기 펩타이드들은 밑줄친 Cys와 Lys 잔기들을 통해 결합된다; 전체 구축물은 본 명세서에서 BI400-Bu2로 명명된다).
GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (서열번호 41)
|
GKGGIEEEGGEQDRDRGGERDRD (서열번호 43)
(상기 펩타이드들은 밑줄친 Cys와 Lys 잔기들을 통해 결합된다; 전체 구축물은 본 명세서에서 BI400-Bu3로 명명된다).
상기 Cys-Lys 링커는 전형적으로 하나의 펩타이드 내 (2-옥소-에틸) 유도체화된 시스테인과 다른 펩타이드 내 라이신 간의 아미드 결합의 형태로 확립된다.
서열번호 38이 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 68과 Cys-Lys 결합되거나 또는 서열번호 41이 서열번호 39 또는 서열번호 40과 Cys-Lys 결합되는 경우 유사하게 형성되는 구축물들도 본 발명의 범위 내에 있다.
작은 분자 억제제들:
DQQLL (서열번호 34)
AKRRVV (서열번호 35)
AEEEVV (서열번호 36)
서열번호 34-36은 좋게는 D-아미노산들로 부분적으로 또는 완전하게 구성된다.
gp41 의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120 의 불변 C2 도메인과 HIV gp120 의 C5 도메인의 연결을 안정화시키는 항체들을 유도하는 하나의 선호되는 면역원은 다음의 구조를 가지는 화합물이다:
(H-글라이실-L-알라닐-L-라이실-L-아르기닐-L-아르기닐-L-발릴-L-발릴-글라이실-글라이실-L- 시스테이닐 (2-옥소-에틸)-글라이실-글라이실-L-알라닐-L-라이실-L-아르기닐-L-아르기닐-L-발릴-L-발릴-L-글루타미닐-L-아르기닐-L-글루타밀-L-라이실-L-아르기닐-L-알라닐-글라이실-L-글루타밀-L-아르기닐-L-글루타밀-L-라이실-L-아르기닐-L-알라닐-NH2) (H-글라이실-L-라이실-글라이실-글라이실-L-이소루이실-L-글루타밀-L-글루타밀-L-글루타밀-글라이실-글라이실-L-아르기닐-L-아스파르틸-L-아르기닐-L-아스파르틸-L-아르기닐-글라이실-글라이실-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-아르기닐-L-아스파르틸-L-아르기닐-NH2), 아세테이트 염 (Cys(2-옥소-에틸)10 (A-체인)과 Lys2 (B-체인) 간의 아미드 결합)
이러한 화합물은 또한:
(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-옥소- 에틸 )-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2) (H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2), 아세테이트 염 (Cys(2-옥소-에틸)10 (A-체인)과 Lys2 (B-체인) 간의 아미드 결합)으로도 언급될 수 있다.
이러한 선호되는 C5 화합물은 31개의 아미노산들(A-체인) 및 22개의 아미노산들(B-체인)의 2개의 선형 펩타이드 아미드 체인들로 구성된다. 각 체인은 N 말단에 프리 아미노산 그룹 및 C-말단에 아미드 그룹을 가진다. 상기 체인들은 A-체인의 Cys(2-옥소-에틸)10와 B-체인의 Lys2 간의 아미드 결합을 통해 공유결합적으로 결합된다. 아키랄 Gly을 제외한 모든 아미노산 잔기들이 L 배열(configuration)로 존재한다.
Figure pct00003

상기 선호되는 C5 화합물(또한 Vacc-C5로 실시예들에서 언급됨)은 아세테이트 염으로 제공될 수 있다. 카운터 이온 아세테이트는 상기 펩타이드 분자의 염기성 그룹들에 이온성 형태로 결합된다.
면역조절성 화합물들
다르게 지시되지 않는 한 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역조절성 화합물들(immunomodulatory compounds)"은 LPS 유도된 단핵구 TNF-a, IL-1B, IL-12, IL-6, MIP-la, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, 및/또는 COX-2 생산을 억제하는 어떤 작은 유기 분자들, COX-2 억제제들, 및 에토리콕시브(Etoricoxib)를 포괄한다. 다른 면역조절성 화합물들은 비리오스타틱스(Viriostatics) VS411 (디다노신 + 하이드록시우레아)을 포함한다. 특이적 면역조절성 화합물들은 본 명세서에서 다른 곳에서 논의된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 면역조절성 화합물들은 T 세포들의 공동-자극인자들이고 투여량 의존적으로 현저하게 세포 증식을 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 면역조절성 화합물들은 CD4+ T 세포 서브세트(subset)보다 CD8+ T 세포 서브세트에 더 큰 공동-자극성 효과를 나타낼 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 화합물들은 골수성 세포 반응들에 대한 항-염증성 특성들을 가지고, T 세포들을 더욱 효과적으로 공동-자극하여 더 많은 양의 IL-2, IFN-γ을 생산하며, T 세포 증식 및 CD8+ T 세포 세포독성 활성을 증대시킨다. 하나의 구현예에서, 특정 이론에 의해 제한됨이 없이, 본 명세서에서 제공되는 면역조절성 화합물들은 간접적으로 사이토카인 활성화시킬 수 있고 직접적으로 자연살해("NK") 세포 및 자연살해 T("NKT") 세포들에 기능할 수 있고 상기 NK 세포들의 활성을 증가시켜 IFN-γ를 포함하지만 이에 한정되지 않는 유익한 사이토카인들을 생산하고 NK 및 NKT 세포 세포독성 활성을 증가시킨다.
하나의 구현예에서, 면역조절성 화합물의 특이적 예들은 US 5929117에 개시된 치환된 스티렌들 같은 치환된 스티렌들의 시아노 및 카르복시 유도체들; US 5874448 및 US5955476에 기재된 이소인돌린 같은 l-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3일) 이소인돌린 및 l ,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일) 이소인돌린; US 5798368에 기재된 테트라 치환된 2-(2,6-디옥소피페르딘-3-일)-l-옥소이소인돌린들; US 5635517, US6281230, US6316471, US6403613, US6476052 및 US6555554에 개시된 유도체들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 1-옥소 및 l ,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 이소인돌린들 (예컨대, 탈리도마이드의 4-메틸 유도체들), 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 프탈이미드들 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-l-옥소이소인돌들; US 6380239에 기재된 인돌린 고리의 4- 또는 5-위치에서 치환된 1-옥소 및 1,3-디옥소이소인돌린들 (예컨대, 4-(4-아미노-l,3-디옥소이소인돌린-2-일)-4-카르바모일부탄산); US 6458810에 기재된 2,6-디옥소-3-하이드록시피페리딘-5-일의 2-위치에서 치환된 이소인돌린-1-원 및 이소인돌린-l,3-디온(예컨대, 2-(2,6-디옥소-3-하이드록시-5-플루오로피페리딘-5-일)-4-아미노이소인돌린-l-원); US 5698579 및 US 5877200에 개시된 비-폴리펩타이드 고리형 아미드들의 클래스; 및 2003년 3월 6일에 공개된 U.S. 특허공개번호 2003/0045552, 2003년 5월 22일에 공개된 U.S. 특허공개번호 2003/0096841, WO2007028047, WO2002094180 및 WO 02/059106)에 기재된 화합물들 같이 이소인돌-이미드 화합물들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 확인된 상기 특허들 및 특허 출원들 각각의 전문이 참조로서 본 명세서에 삽입된다. 하나의 구현예에서, 면역조절성 화합물들은 탈리도마이드를 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 면역조절성 화합물들은 본 명세서에서 참조로서 삽입된 US 5635517에 기재된 벤조 고리(benzo ring)에 아미노로 치환된 1-옥소-및 1,3 디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 이소인돌린들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 US 6281230; US 6316471; US 6335349; US 6476052, 및 WO 98/03502)에 기재된 화합물들 같이 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 프탈이미드들 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-l-옥소이소인돌들의 클래스에 속하고, 상기 문헌들 각각은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 U.S. 특허출원 공개번호 US 2003/0096841 및 US 2003/0045552, 및 WO 02/059106)에 개시된 이소인돌-이미드들의 클래스에 속하며, 상기 문헌들 각각은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 U.S. 특허출원 공개번호 US 2002/0045643, 및 WO 98/54170, 및 미국 특허번호 6,395,754에 개시된 이소인돌-이미드들의 클래스에 속하고, 상기 문헌들 각각은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 US 5874448 및 US 5955476에 개시된 화합물들 같은 l-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3일) 이소인돌린들 및 l,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일) 이소인돌린들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 문헌들 각각은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 US 5798368에 기재된 테트라 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-l-옥소이소인돌린들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 문헌은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 US 6403613에 개시된 1-옥소 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 이소인돌린들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 문헌은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 US 6380239 및 2004년 7월 28일에 출원된 미국 출원번호 10/900,270에 기재된 인돌린 고리의 4- 또는 5-위치에서 치환된 1-옥소 및 1,3-디옥소이소인돌린들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 문헌들 각각은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 다른 특이적 면역조절성 화합물들은 US 6458810에 기재된 2,6-디옥소-3-하이드록시피페리딘-5-일로 2-위치에서 치환된 이소인돌린-l-원 및 이소인돌린-l,3-디온을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 문헌은 본 명세서에서 참조로서 삽입된다.
히스톤 디아세틸라제 억제제들 및 다른 병원소 퍼징제들 .
본 명세서에서 사용되는 용어 "히스톤 디아세틸라제 억제제(histone deacetylase inhibitor)", "HDACi"는 히스톤 디아세틸라제를 억제하는 화합물을 의미한다.
이들의 화학적 구조에 기반하여, HDACi들은 4개의 다른 클래스들로 세분되었다 (검토를 위해 예를 들어 Dokmanovic & Marks, J. Cell. Biochem., 96, 293-304, 2005를 참조하라):
- 하이드록사믹산들 (트리코스타틴 A, 보리노스타트 = SAHA)
- 고리형 테트라펩타이드들 (뎁시펩타이드)
- 짧은-체인 지방족산들 (벨프로산, 페닐 부티레이트)
- 벤즈아미드들 (엔티노스타트).
상술한 화합물들은 일반적으로 클래스 I, II, 및 IV의 히스톤 디아세틸라제들에 대해 활성(상기 화합물에 의존하여 주어진 HDAC에 대해 대략 특이성을 가짐)을 가진다.
HDACi에 의한 히스톤 디아세틸라제의 억제는 과다아세틸화된 뉴클레오좀 코어 히스톤들의 축적을 유도한다. 이러한 크로마틴 리모델링은 세포주기 어레스트, 분화 및/또는 아팝토시스 같은 생물학적 과정들을 통해 암세포들의 증식을 억제할 수 있는 유전자 발현의 조절을 초래한다 (검토를 위해 예를 들어 Marks & Xu, J. Cell. Biochem., 107, 600-608, 2009; Federico & Bagella, J. Biomed. Biotechnol, 2011:475641을 참조하라).
히스톤 디아세틸라제 억제제들 같은 병원소 퍼징제들은, 예를 들어 톨-유사 수용체-9 (TLR9) 아고니스트들, 퀘르세틴, 트리코스타틴 A, 리포산, 하이드록사믹산, 벨프로산, 나트륨 부티레이트, 보리노스타트, 로미뎁신, TNF-α, PHA, Tat, 인터페론 감마 (IFN-γ), CD154, IL-1베타, IL-2, IL-6, IL-7 또는 IL-7R 아고니스트, IL-9 또는 IL-9R 아고니스트들, 5-하이드록시프탈렌-1,4-디온 (5HN), siRNA 또는 잠복성 HIV의 발현을 조절하는 miRNA에 대해 도출된 안타고미르들 (antagomirs) (항-miRNA 안티센스), 전사인자 YY1 및/또는 cMyc을 타겟팅하는 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs), 케토신(chaetocine) 같은 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 억제제들, 뉴클레오타이드 유사체 메틸화 억제제들인 5-아자시티딘, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 5-플루오로-2'-데옥시시티딘 및 제불라리딘(zebularidine)을 포함하는 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제들, 비-뉴클레오시드 DNA 메틸화 억제제들인 프로카인, 프로카인아미드, 하이드라라진(hydralazine) 및 RG108을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 적합한 히스톤 디아세틸라제 억제제들 (HDACi)은 M344 (4-(디메틸아미노)-N-[7-(하이드록시아미노)-7-옥소헵틸]벤즈아미드), 치다마이드(chidamide) (CS055/HBI-800), 4SC-202, (4SC), 레스미노스타트 (4SC), 보리노스타트 (SAHA), 벨리노스타트 (PXD101), LAQ824, 트리코스타틴 A 및 파노비노스타트 (LBH589) 같은 하이드록사믹산; 엔티노스타트 (MS-275), CI994, 및 모세티노스타트 (MGCD0103) 같은 벤즈아미드들, 고리형 테트라펩타이드들 (예컨대 트라폭신, 예컨대 트라폭신 B), 및 로미뎁신 (ISTODAX) 같은 뎁시펩타이드들, 친전자성 케톤들, 및 페닐부티레이트, 벨프로산, 옥삼플라틴, ITF2357 (기비노스타트 제네릭), 아피시딘, MC1293, CG05, 및 CG06 같은 지방족산 화합물들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 적합한 병원소 퍼징제들은: PMA, 프로스트라틴, 브리오스타틴 및 TNF-알파를 포함하는 군으로부터 선택되는 NF-카파-B-유도인자, 및/또는 b) TSA, SAHA, MS-275, 아미노수베로일 하이드록사믹산들, M-카르복시시나믹산 비스하이드록사메이트, LAQ-824, LBH-589, 벨리노스타트 (PXD-101 ), 파노비노스타트 (LBH-589), M-카르복시시나믹산 비스하이드록사메이트의 시나믹 하이드록사믹산(cinnamic hydroxamic acid) 유사체, IF2357, 아릴옥시알카노익산 하이드록사미드들, 뎁시펩타이드, 아피시딘, 고리형 하이드록사믹산-포함 펩타이드 그룹의 분자들, FK-228, 레드 FK, 지방족 체인에 의해 하이드록사믹산에 결합된 고리형 펩타이드 모방물, 부티레이트, 페닐부티레이트, 나트륨 부티레이트, 벨프로산, 피발로일옥시메틸 부티레이트, 5 NOX-275, 및 MGCD0103을 포함하는 다른 패밀리들 (하이드록사메이트들, 고리형 펩타이드들, 지방족산들, 및 벤즈아미드들)로부터 선택되는 히스톤 디아세틸라제 억제제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 WO2013050422, WO2012051492 A3 및 Barton 등, Clinical Pharmacology & Therapeutics (2013); 93 1, 46-56l 중 어느 하나에 개시된 퍼징제들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이러스 병원소 퍼징제들 중 어느 하나는 단독 또는 다른 클래스의 HIV 유도인자들 같은 어느 하나의 다른 적합한 바이러스 병원소 퍼징제와 조합하여 이용될 수 있다.
DNA 메틸화는, 아마도 억제성 히스톤 변형들과 함께, 프로바이러스의 침묵 상태(silent state)로의 "락(lock)"에 기여할 수도 있고 활성 상태로의 복귀를 어렵게 만들 수도 있다. 상술한 관찰들은 효율적인 cART와 함께 HDAC 또는 HMT 또는 DNA 메틸화 억제제가 숙주 면역 시스템에 의해 견딜 수 있는 수준으로 잠복성 병원소들의 풀을 감소/제거하고자 하는 우수한 항-잠복 약물 후보물질들을 구성한다는 것을 의미한다.
따라서 적합한 면역조절성 화합물들 또는 퍼징제들은:
5-아자시티딘(azacytidine) (아자시티딘(azacitidine)), 시네펀진(Sinefungin), 5-아자-2'-데옥시시티딘 (5-아자-CdR, 데시타빈), 1-3-다라비노푸라노실-5-아자시토신 (파자라빈) 및 디하이드로-5-아자시티딘 (DHAC), 5-플루오로데옥시시티딘 (FdC), 2-H 피리미디논을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오타이드 듀플렉스들, 제부라린(zebularine), 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드들 (ODNs), MG98, (-)-에피갈로카테신-3-갈레이트, 하이드라라진, 프로카인 및 프로카인아미드를 포함하는 2개의 클래스들(비-뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 탈메틸화 제제들)로부터 선택되는 DNA 메틸화 억제제들일 수 있다.
본 발명에 따라 이용되는 다른 적합한 면역조절성 화합물들 또는 퍼징제들은 TSA, SAHA, MS-275, 아미노수베로일 하이드록사믹산들, M-카르복시시나믹산 비스하이드록사메이트, LAQ-824, LBH-589, 벨리노스타트 (PXD-101 ), 파노비노스타트 (LBH-589), M-카르복시시나믹산 비스하이드록사메이트의 시나믹 하이드록사믹산 유사체, IF2357, 아릴옥시알카노익산 하이드록사미드들, 뎁시펩타이드, 아피시딘, 고리형 하이드록사믹산-포함 펩타이드 그룹의 분자들, FK-228, 레드 FK, 지방족 체인에 의해 하이드록사믹산에 결합된 고리형 펩타이드 모방물, 부티레이트, 페닐부티레이트, 나트륨 부티레이트, 벨프로산, 피발로일옥시메틸 부티레이트, 5 NOX-275, 및 MGCD0103을 포함하는 다른 패밀리들의 HDACI (하이드록사메이트들, 고리형 펩타이드들, 지방족산들, 및 벤즈아미드들)로부터 선택되는 히스톤 디아세틸라제 억제제를 포함한다.
본 발명에 따라 이용되는 다른 적합한 면역조절성 화합물들 또는 퍼징제들은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제들 (케토신 및 BIX-01294); Zeste 2 (EZH2)의 증강제(Enhances)의 억제제들를 포함한다 - 예컨대 단독 또는 다른 클래스의 면역조절성 화합물들 또는 퍼징제들와 조합하여 이용되는 3-데아자네플라노신(deazaneplanocin) A (DZNep).
본 발명의 방법들에서 (i) 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들 및/또는 (ii) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물; 및 (iii) 히스톤 디아셀틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제, 및/또는 (iv) 면역조절성 화합물을 포함하는 구성성분들 각각은 동시적으로, 어떠한 순서에서 연속적으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
따라서 본 발명은 구성성분 (i) 및 (ii) 중 최소 하나 및 구성성분 (iii) 및 (iv) 중 최소 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 보조제, 희석제 또는 담체와 조합된다.
유사하게도, 본 발명은 구성성분 (i) 및 (ii) 중 최소 하나 및 구성성분 (iii) 및 (iv) 중 최소 하나를 포함하는 조합 산물(combination product)도 제공하며, 각 구성성분은 선택적으로 약제학적으로-허용가능한 보조제, 희석제 또는 담체와 혼합(admixture)되어 제형화된다. 본 발명의 이러한 양태에서, 상기 조합 산물은 단일 (조합) 약제학적 제형물 또는 부품-키트(kit-of-parts) 중 어느 하나일 수 있다. 부품-키트에서 상기 구성성분들 중 일부 또는 모두가 개별적으로 제형화될 수 있고 각각 다른 성분(들)과 함께 투여에 적합한 형태로 제공될 수 있다.
상기 구성성분(들)은, 예를 들어 사용 설명서와 함께 상기 특정된 하나 이상의 추가적인 구성성분(들)과 조합하여 제공될 수도 있다.
본 발명에서 HDACi의 치료적인 양, 예를 들어 바이러스 백신의 면역학적 효과를 증진시키기에 충분한 양이 포유동물에 투여된다. 상기 HDACi는 어떠한 적합한 투여가능한 형태, 예를 들어 구강, 피하, 정맥내, 복강내, 비강내, 장내, 국소적, 설하내, 근육내, 동맥-내, 골수내, 척추강내, 흡입, 안내, 피부내, 질내 또는 직장내 방법을 이용하여 투여될 수 있다.
다른 적합한 병원소 퍼징제들은 NF-카파B를 포함하는 전사인자들, 프로스트라틴, 프로스트라틴, 아우라노핀, 브리오스타틴, 비발암성 포르볼 에스테르, DPP (12-데옥시포르볼-13-페닐아세테이트), PMA, 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA); P-TEF-b 키나제 및 헥사메틸비스아세트아미드(HMBA)를 포함하는 HIV mRNA 연장을 활성화시키는 화합물들; 항-CD3/CD28을 포함하는 T-세포 자극성 인자들 - T-세포 자극성 항체's; 티르포스틴(Tyrphostin) A, 티르포스틴 B, 및 티르포스틴 C를 포함하는 키나제 억제제들; TLR-7 아고니스트들; SF1670 (Echelon Bioscience)을 포함하는 PTEN (포스파타제 및 텐신 상동체) 유전자 억제제들, 디술피람 (DSF), 아세트알데하이드 디하이드로게나제의 억제제, bpV(HOpic), bpV(phen), 및 bpV(pic) (Calbiochem; EMD Millipore)를 포함하는 단백질 타이로신 포스파타제 억제제들을 활성화시키는 화합물들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
HIV 타겟팅 펩타이드들로 자극된 T-세포들에 의해 잠복적으로 HIV-1로 감염된 세포들의 활성화 및 제거는 Shan 등 (Immunity, 2012, Vol. 36, Issue 3, pp. 491-501)에 의해 기재된 방법에 의해 연구될 수 있다. 이러한 연구에서 저자들은 Yang 등 (J Clin Invest. 2009, 119 (11):3473-3486)에 의해 기재된 잠복성 HIV-1 감염에 대한 모델을 발생시키는 방법들을 이용한다. 바이러스 잠복성에 대한 다른 모델들이 존재하며 유사한 방식으로 이용될 수 있다 (Saleh et al. Blood 2007; 110:4161-4. Saleh et al. Retrovirology 2011; 8:80.). 더 나아가, Shan 등은 잠복적으로 감염된 세포들을 활성화시키기 위해 HDAC 억제제 SAHA를 이용하지만, 원칙적으로 상기 방법은 유사한 방식으로 잠복성 HIV-1의 다른 활성인자들을 연구하기 위해 이용되거나 또는 조정될 수 있다. 간략하게는: 일차 CD4+ 및 CD8+ T-세포들의 분리를 위해 말초 혈액이 HIV-1-감염된 공여체 및 건강한 성인 지원자들로부터 얻어졌고 Bcl-2 트랜스덕션 이후에 HIV-1 리포터 바이러스 (GFP 발현성) 감염에 이용되었다 (Yang et al., 2009, J Clin Invest., 119 (11):3473-3486). CD8+ T-세포들이 선택적으로 HIV-1 특이적 펩타이드들로 자극된 후 분리되었으며 인 비트로 감염된 자가 CD4+ T-세포들과 공동배양되었다. 잔여 GFP+ CD4+ T-세포들의 분획을 FACS로 측정하였다. 이러한 과정은 상기 활성화된 CD4+ T-세포들의 CD8+ CTL 매개된 사멸(killing)을 증명하였다.
본 발명의 특이적 구현예들
상기 기재된 대로 본 발명의 하나의 양태는
a) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드; 조합하여
b) 면역조절성 화합물 및/또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제
를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 조성물은 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 조성물은 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물을 포함한다. 일부 구현예들에서, 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 이러한 화합물은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 제제들이다. 일부 구현예들에서, 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 이러한 화합물은 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시키는 항체들을 유도하는 면역원이다. 일부 구현예들에서, 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 이러한 화합물은 국제특허출원 WO2011/000962, WO0052040, WO 2012/092934 또는 WO 2012/072088 중 어느 하나에 기재된 펩타이드이고, 상기 레퍼런스들이 본 명세서에 의해 참조로서 삽입된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 조성물은 면역조절성 화합물을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 조성물은 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 면역조절성 화합물들은 MDX-1106 (Merck) 같은 항-PD1 항체들, THALOMID® (탈리도마이드), 항-PD1 항체들, 사이클로포스파미드, 레바미솔, 레날리도마이드, CC-4047 (포말리도마이드), CC-11006 (셀진), 및 CC-10015 (셀진), 및 WO2007028047, WO2002059106, 및 WO2002094180 중 어느 하나에 기재되어 있는 면역조절성 화합물로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 면역조절성 화합물은 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-l ,3-디온 및 3-(4-아미노-l-옥소-l,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 면역조절성 화합물은 거울상 이성질체적으로(enantiomerically) 순수하다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제는 M344 (4-(디메틸아미노)-N-[7-(하이드록시아미노)-7-옥소헵틸]벤즈아미드), 치다마이드 (CS055/HBI-800), 4SC-202, (4SC), 레스미노스타트 (4SC), 보리노스타트 (SAHA), 벨리노스타트 (PXD101), LAQ824, 트리코스타틴 A 및 파노비노스타트 (LBH589) 같은 하이드록사믹산들; 엔티노스타트 (MS-275), CI994, 및 모세티노스타트 (MGCD0103) 같은 벤즈아미드들, 고리형 테트라펩타이드들 (예컨대 트라폭신, 예컨대 트라폭신 B), 및 로미뎁신 (ISTODAX) 같은 뎁시펩타이드들, 친전자성 케톤들, 및 페닐부티레이트, 벨프로산, 옥삼플라틴, ITF2357 (기비노스타트 제네릭), 아피시딘, MC1293, CG05, 및 CG06 같은 지방족산 화합물들; NF-카파B를 포함하는 전사인자들을 활성화시키는 화합물들, 프로스트라틴, 아우라노핀, 브리오스타틴, 비발암성 포르볼 에스테르, DPP (12-데옥시포르볼-13-페닐아세테이트), PMA, 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA); P-TEF-b 키나제 및 헥사메틸비스아세트아미드(HMBA)를 포함하는 HIV mRNA 연장을 활성화시키는 화합물들; 항-CD3/CD28을 포함하는 T-세포 자극성 인자들 - T-세포 자극성 항체's; 티르포스틴 A, 티르포스틴 B, 및 티르포스틴 C를 포함하는 키나제 억제제들; TLR-7 아고니스트들; SF1670 (Echelon Bioscience)을 포함하는 PTEN (포스파타제 및 텐신 상동체) 유전자 억제제들, 디술피람 (DSF), 아세트알데하이드 디하이드로게나제의 억제제, bpV(HOpic), bpV(phen), 및 bpV(pic) (Calbiochem; EMD Millipore)를 포함하는 단백질 타이로신 포스파타제 억제제들, 톨-유사 수용체-9 (TLR9) 및 톨-유사 수용체-7 (TLR9) 아고니스트를 포함하는 톨-유사 수용체들 아고니스트들, 퀘르세틴, 리포산, 나트륨 부티레이트, TNF-알파, PHA, Tat로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드는:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa20 (서열번호 47);
상기 위치 1의 Xaa는 Lys 또는 Arg,
상기 위치 2의 Xaa는 Ala, Gly, Ser 또는 Arg,
상기 위치 3의 Xaa는 Leu 또는 Met,
상기 위치 4의 Xaa는 Gly 또는 Arg,
상기 위치 5의 Xaa는 Pro, Thr, Val, Ser, Gln 또는 Ala,
상기 위치 6의 Xaa는 Gly, Ala, Lys, Arg, Gln 또는 Glu,
상기 위치 8의 Xaa는 Thr 또는 Ser,
상기 위치 9의 Xaa는 Leu 또는 Ile,
상기 위치 14의 Xaa는 Thr, Ser 또는 Val,
상기 위치 15의 Xaa는 Ala 또는 Ser,
상기 위치 16의 Xaa는 Cys 또는 Ser,
상기 위치 17의 Xaa는 Gln 또는 Leu,
상기 위치 18의 Xaa는 Gly, Glu 또는 Arg, 및
상기 위치 20의 Xaa는 Gly 또는 Arg인 아미노산 서열;
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 Tyr Xaa15 Pro Xaa17 Xaa18 Ile Leu Xaa21 Xaa22 (서열번호 50);
상기 위치 1의 Xaa는 Arg, Lys, Asp 또는 없고,
상기 위치 2의 Xaa는 Trp, Gly, Lys 또는 Arg,
상기 위치 3의 Xaa는 Ile, Leu, Val 또는 Met,
상기 위치 4의 Xaa는 Ile, Val 또는 Leu,
상기 위치 5의 Xaa는 Leu, Met, Val 또는 Pro,
상기 위치 12의 Xaa는 Arg, Lys,
상기 위치 13의 Xaa는 Met 또는 Leu,
상기 위치 15의 Xaa는 Ser, Cys 또는 Gln,
상기 위치 17의 Xaa는 Thr, Val, Ile, Ser 또는 Ala,
상기 위치 18의 Xaa는 Ser, Gly 또는 Thr,
상기 위치 21의 Xaa는 Asp, Glu, Cys 또는 Gly,
상기 위치 22의 Xaa는 Gly 또는 없으며,
n = 0,1,2 또는 3인 아미노산 서열;
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Ile Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 (서열번호 55);
상기 위치 1의 Xaa는 Asn, Ser, Gly, His, Ala, Pro, Arg 또는 없고,
상기 위치 2의 Xaa는 Asn, Ala 또는 Lys,
상기 위치 3의 Xaa는 Pro, Gln, Gly, Ile 또는 Leu,
상기 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ala,
상기 위치 8의 Xaa는 Gly 또는 Lys,
상기 위치 9의 Xaa는 Glu, Asp, Lys, Phe 또는 Thr,
상기 위치 10의 Xaa는 Ile, Met, Val 또는 Leu,
상기 위치 11의 Xaa는 Tyr, Leu 또는 없으며,
상기 위치 12의 Xaa는 Ser 또는 없고,
상기 위치 13의 Xaa는 Arg 또는 없으며,
상기 위치 14의 Xaa는 Asp, Arg, Trp, Ala 또는 없고,
상기 위치 15의 Xaa는 Ile 또는 없으며,
상기 위치 16의 Xaa는 Tyr 또는 없고,
상기 위치 17의 Xaa는 Lys 또는 Arg,
상기 위치 18의 Xaa는 Arg, Lys 또는 Asp,
상기 위치 19의 Xaa는 Trp 또는 Gly,
상기 위치 20의 Xaa는 Ile, Met, Val, Gln 또는 Ala,
상기 위치 21의 Xaa는 Ile, Val 또는 Ala,
상기 위치 22의 Xaa는 Leu, Met 또는 Val,
상기 위치 23의 Xaa는 Gly 또는 Cys,
상기 위치 24의 Xaa는 Leu 또는 없으며,
n = 1,2 또는 3인 아미노산 서열, 및
Xaa1 Xaa2 Ile Ile Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 [Gly]n [Arg]m Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 (서열번호 61);
상기 위치 1의 Xaa는 Pro, Lys, Arg 또는 없으며,
상기 위치 2의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Lys,
상기 위치 5의 Xaa는 Pro 또는 Thr,
상기 위치 6의 Xaa는 Met, Thr 또는 Nleu,
상기 위치 7의 Xaa는 Phe 또는 Leu,
상기 위치 8의 Xaa는 Ser, Thr, Ala 또는 Met,
상기 위치 9의 Xaa는 Ala, Glu 또는 Leu,
상기 위치 11의 Xaa는 Ser 또는 없고,
상기 위치 12의 Xaa는 Ala, Arg 또는 없으며,
상기 위치 13의 Xaa는 Ile, Leu 또는 없고,
상기 위치 14의 Xaa는 Ser, Ala, Leu 또는 없으며,
상기 위치 15의 Xaa는 Tyr, Glu 또는 Asp,
상기 위치 16의 Xaa는 Gly 또는 Asp,
상기 위치 17의 Xaa는 Ala 또는 Leu,
상기 위치 18의 Xaa는 Thr, Ile, Val, Leu 또는 Asn,
상기 위치 19의 Xaa는 Pro, Thr 또는 Ser,
상기 위치 20의 Xaa는 Tyr, Phe, Nleu, His 또는 Gln,
상기 위치 21의 Xaa는 Asp, Asn, Leu 또는 Ala,
상기 위치 22의 Xaa는 Leu, Ile, Val 또는 Asn,
상기 위치 23의 Xaa는 Asn, Tyr, Cys 또는 Gly,
상기 위치 24의 Xaa는 Thr, Met, Ile, Ala, Val 또는 없고,
상기 위치 25의 Xaa는 Gly 또는 없으며,
서로에게 독립적인 n = 1, 2 또는 3 및 m= 0, 1, 2 또는 3인 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드로,
각 HIV 특이적 펩타이드의 말단들은 프리 카르복실- 또는 아미노 그룹, 아미드들, 아실들, 아세틸들 또는 이의 염들일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 HIV-특이적 펩타이드의 2개 이상의 Cys 잔기들은 체인내- 또는 체인간 이황화 결합, -S-(CH2)p-S- 또는 -(CH2)p-브릿지의 일부를 형성할 수 있고, 선택적으로 O, N 및 S 같은 하나 이상의 헤테로원자들에 의해 선택적으로 중재되는 p = 1-8이고/이거나 상기 펩타이드 서열들은 고형 지지체에 고정된다. 일부 구현예들에서, 서열번호 47의 아미노산 서열은 서열번호 48 및 서열번호 49의 군들로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 서열번호 50의 아미노산 서열은 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54의 군들로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 서열번호 55의 아미노산 서열은 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60의 군들로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 서열번호 61의 아미노산 서열은 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66의 군들로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드는 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55 및 서열번호 61의 각 군들로부터 선택되는 최소 2개, 3개, 또는 4개의 펩타이드들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드는 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 57 및 서열번호 64의 펩타이드들로 구성되거나 또는 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 최소 하나의 제제는 gp41의 트랜스막 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열 및 C2 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택되는 최소 하나의 아미노산 서열을 포함하는 분자이고, 상기 최소 하나의 아미노산 서열은 선택적으로 최소 하나의 D-아미노산을 포함하는 C5 도메인과 결합한다. 일부 구현예들에서, 이러한 분자는 펩타이드이다. 일부 구현예들에서, 이러한 펩타이드는 최소 하나의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구현예들에서, gp41의 트랜스막 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열은 최대 10개의 아미노산 잔기들의 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 최소 하나의 제제는 항체, 항체 단편 또는 항체 유사체로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 이러한 항체는 완전한 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메릭 항체, 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 IgA, IgD, IgG, IgE 또는 IgM이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig (라마 또는 카멜 Ig), VHH 단편, 단일 체인 FV, 및 단일-체인 항체 단편으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 유사체는 scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR, tandAb, BiTE, 및 다중특이적 항체로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킬 수 있는 최소 하나의 제제는 Z1은 K, R 또는 E이고, Z2는 Q 또는 E인 아미노산 스트레치 TZ1AKRRVVZ2REKR 내 하나 이상의 아미노산 잔기들에 결합하고 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들과 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인 내 하나의 아미노산 스트레치 내 하나 이상의 아미노산 잔기들 간의 연결을 안정화시킨다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 상기에 언급된 면역원은:
- 0 내지 4개 사이의 아미노산 치환들을 포함하는 HIV gp120의 C5 도메인의 13개의 아미노산 잔기 아미노산 서열의 아미노산 서열, 이의 부분서열, 또는 상기 아미노산 서열 또는 부분서열의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 펩타이드, 및
- gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치 또는 서열번호 6 내지 서열번호 13 중 어느 하나에 존재하는 아미노산 스트레치 또는 gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 최소 하나의 두 번째 펩타이드를 포함하는 펩타이드 멀티머로, 상기 펩타이드 멀티머는 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결에 결합하고 안정화시킬 수 있는 항체를 유도할 수 있고, 상기 펩타이드 멀티머는 gp120 내 C5의 N-말단 아미노산들이 없다.
일부 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (I)
을 가지는 아미노산 서열로, X1은 Thr이고, X2는 Lys, Arg, Har 및 Glu로부터 선택되며, X3은 Ala 및 Val로부터 선택되고, X4는 Arg, Har, Lys 및 Cit(시트룰린)로부터 선택되며, X5는 Arg, Har, Lys 및 Cit로부터 선택되고, X6은 Arg, Har, Lys 및 Cit로부터 선택되며, X7은 Val, Leu, Ile 및 Nle(노르루이신)로부터 선택되고, X8은 Val, Leu, Ile 및 Nle로부터 선택되며, X9는 Gln, Glu, Asn 및 Asp로부터 선택되고, X10은 Arg, Har 및 Cit로부터 선택되며, X11은 Glu 및 Asp로부터 선택되고, X12는 Lys이며, X13은 Arg, Har 및 Cit로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나,
또는 화학식 I의 아미노산 서열의 부분서열을 포함하거나, 또는 상기 아미노산 서열 또는 부분서열의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식 I을 가지는 아미노산 서열의 N-말단에 결합되는 디펩타이드 Ala-Pro를 추가적으로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식 I을 가지는 아미노산 서열의 C-말단에 결합되는 디펩타이드 X14-X15를 추가적으로 포함하며, X14는 Ala 및 Val로부터 선택되며 X15는 Val, Leu 및 Nle로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 최소 두 번째 펩타이드는 화학식:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17 (III)
을 가지는 아미노산 서열로, Z1은 Asp이며, Z2는 Arg이고, Z3은 Pro이며, Z4는 Glu 또는 Gly이고, Z5는 Gly 또는 Arg이며, Z6은 Ile이고, Z7은 Glu이며, Z8은 Glu이고, Z9는 Glu이며, Z10은 Gly이고, Z11은 Gly이며, Z12는 Glu 또는 없고, Z13은 Arg 또는 Gln이며, Z14는 Asp 또는 Gly이고, Z15는 Arg 또는 Lys이며, Z16은 Asp 또는 Gly이고, Z17은 Arg인 아미노산 서열을 포함하거나,
또는 화학식 (III)의 부분서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 두 번째 펩타이드는 화학식 III으로부터 유래되는 최소 5개의 연속 아미노산 잔기들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드와 최소 하나의 두 번째 펩타이드는 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예들에서, 상기 링커는 비스-말레이미드 링커, 이황화 링커, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 글라이신 링커, 라이신 링커 및 아르기닌 링커로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드 및 최소 하나의 두 번째 펩타이드 중 최소 하나는 아미드화, 아실화, 또는 아세틸화 같은 N- 또는 C-말단 변형을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 면역원성 담체 같은 담체 분자와 커플링된다. 일부 구현예들에서, 상기 담체는 바이러스 유사 입자이다.
일부 구현예들에서, 상기 첫 번째 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44 또는 이의 단편, 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44 또는 이의 단편으로부터 선택되는 펩타이드의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 두 번째 펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 이의 단편, 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 이의 단편으로부터 선택되는 펩타이드의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태로 구성된 군으로부터 선택되고/선택되거나, 상기 펩타이드 멀티머는 서열번호 1 내지 서열번호 46을 가지는 펩타이드들로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 최대 70개의 아미노산들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 최소 6개의 아미노산 잔기들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 및 70개의 아미노산 잔기들로 구성된 군으로부터 선택되는 다수의 아미노산 잔기들로 구성된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 서열번호 28과 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화 결합된 펩타이드, 서열번호 30과 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화 결합된 펩타이드, 또는 서열번호 32와 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화 결합된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되거나;
또는 서열번호 38과 서열번호 39, 서열번호 40; 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 68 중 어느 하나 간의 시스테인-라이신 결합된 펩타이드, 또는 서열번호 41과 서열번호 39, 서열번호 40; 서열번호 42, 및 서열번호 43 중 어느 하나 간의 시스테인-라이신 결합된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는:
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (서열번호 28)
|
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (서열번호 29),
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (서열번호 30)
|
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG (서열번호 31),
CGGAEEEVVGGDQQLL (서열번호 32)
|
GCGGAKRRVVGGAKRRVV (서열번호 33),
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (서열번호 38)
|
GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR (서열번호 39),
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (서열번호 38)
|
GKGGIEEEGGERDRDRGGQDRDR (서열번호 40),
GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (서열번호 41)
|
GKGGIEEEGGQDRDRGGRDRDR (서열번호 42),
GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (서열번호 41)
|
GKGGIEEEGGEQDRDRGGERDRD (서열번호 43) 및
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(서열번호 38)
|
GKGGIEEEGGRDRDRGGQDRDR (SEQ ID NO:68)
로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 멀티머는 선택된 (H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-옥소-에틸)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2) (H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2), 아세테이트 염(Cys(2-옥소-에틸)10 (A-체인) 및 Lys2 (B-체인) 간의 아미드 결합)이다.
본 발명의 다른 양태는 인간 면역결핍 바이러스 I(HIV) 같은 그러한 바이러스로 감염된 인간에서 HIV 같은 인간 레트로바이러스 감염을 발병하는 위험 또는 이의 병리학적 효과들을 감소 및/또는 지연하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (1) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물 및/또는 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드; 및 (2) 면역조절성 화합물 및/또는 히스톤 디아셀틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제와 조합하여 어떠한 순서에서 연속적으로 또는 동시적으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 인간 레트로바이러스 감염은 HTLV-1 (인간 T-림프영양성 바이러스), HTLV-II (인간 T-림프영양성 바이러스), HIV-1 및 HIV-2를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스, 및 이의 어떠한 서브타입으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 면역조절성 화합물은 상기 특정된 대로이다. 일부 구현예들에서, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 상기 병원소 퍼징제는 상기 특정된 대로이다. 일부 구현예들에서, 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드는 상기 특정된 대로이다. 일부 구현예들에서, 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물은 상기 특정된 대로이다.
실시예 1
세포-매개된 면역(CMI)를 유발시키는 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드들 또는 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 펩타이드들이 국제특허출원 WO0052040, WO 2012/092934 또는 WO 2012/072088에 기재된 대로 선형 서열에 대한 종래의 기술들을 이용하여 합성하였다.
구체적으로는 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시키는 항체들을 유도함으로써 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물들은 WO2011/000962에 기재된 대로 제조하였다.
또한 p41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결을 안정화시킴으로써 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물들은 WO2011/000962에 기재된 대로 제조하였다.
본 발명에 따라 이용되는 면역조절성 화합물 및 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제는 당업자에게 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다.
선형 서열들을 위한 종래의 기술들을 이용하여 펩타이드들의 합성
APTKAKRRVVQREKR의 제조
상기 펩타이드는 F-moc 합성의 일반적인 기재(Atherton et al. 1978 J. Chem. Soc. Chem Commun 539)에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였으며, 하기에 "합성의 일반적인 기재(the general description of synthesis)로 명명된다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1822.2
실험적 분자량: 1823.0 ES+
APTKAKR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 769.6
실험적 분자량: 760.7 ES+
APTRAKR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 797.6
실험적 분자량: 797.6 ES+
APTEAKR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 770.9
실험적 분자량: 770.9 ES+
RVVEREK의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 914.1
실험적 분자량: 913.9 ES+
RVVQREK의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 913.1
실험적 분자량: 913.0 ES+
AKRRVV의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 726.9
실험적 분자량: 726.9 ES+
DRPEGIEEEGGERDR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1742.1
실험적 분자량: 1742.8
VERYLKDQQLLG의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1460.7
실험적 분자량: 1460.1
VERYLKDEELLG의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1462.6
실험적 분자량: 1463.0
VERYLKDNNLLG의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1432.6
QLLLNGSLAEEEIVI의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1639.9
QLLLNGSLAEEEVVI의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1625.9
QLLLNSLAEEEVVI의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1568.8
APTKAKRGGGAPTRAKRGGGAPTEAKR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2647.0
실험적 분자량: 2646.3 ES+
RVVEREKGGGAKRRVVGGGRVVQREK의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2862.3
실험적 분자량: 2863.3 ES+
GGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2590.1
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2693.2
GGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2476.9
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2580.0
GGAKRRVVGGAKRRVV의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1665.0
GCGAKRRVVGGAKRRVV의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1768.1
GGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도(HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 3127.2
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 3230.4
GGDQQLLGGAEEEIVGGGERDR의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2242.4
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 2402.5
GGAEEEVVGGDQQLL의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1499.6
CGGAEEEVVGGDQQLL의 제조
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다.
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 1602.7
본 발명에 따라 이용되는 복합체화된 C5 관계된 펩타이드들의 합성:
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV
|
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRD의 제조
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 5750.4
실험적 분자량:
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR
|
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG의 제조
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 4965.6
실험적 분자량:
CGGAEEEVVGGDQQLL
|
GCGGAKRRVVGGAKRRVV의 제조
순도 (HPLC): 90% 초과.
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량: 3410.9
실험적 분자량:
다음과 같이, C5-펩타이드의 합성 및 정제를 위한 과정들의 요약이 주어진다. 궁극적으로 이러한 산물의 제조 및 품질에서의 개선으로 이끌 수 있는 경험이 아직 제한된다.
SPPS 합성은 상기 레진의 15 mmoles (A-체인) 및 30 mmoles (B-체인)으로 시작하였다. 일부의 조 C5-펩타이드의 정제 후, 16.6 g의 최종 산물을 얻었다.
단계 1: 고체 상 펩타이드 합성
A-체인 (H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2) 및 B-체인 (H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)의 아미노산 서열들을 Fmoc-전략을 이용하는 표준 고체 상 펩타이드 합성(SPPS)으로 어셈블리한다. (W.C. Chan and P.D. White; Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach, Oxford University Press Inc., New York, 2000, ISBN 978-0-19-963724-9)
상기 고체 상을 SPPS 반응기로 옮기고 Fmoc 탈보호와 함께 합성 주기를 시작한다. 탈보호 단계 이후에, 상기 펩타이드 체인은 적합한 활성화성 제제들의 존재 하에서 아미노산 서열에 따른 다음의 N-α-보호된 AA 유도체 또는 디펩타이드에 의해 연장한다. 부산물들로서 긴 펩타이드 서열들의 형성을 피하기 위해, 반응되지 않은 펩타이드 체인들 (캡핑 과정)의 전체 아세틸화(systemic acetylation)를 매 커플링 단계 후 실시할 수 있다.
각 단일 단계에 있어서, 용매들 및/또는 시약들을 첨가하고, 반응 혼합물을 교반한 후 레진으로부터 용매들 및/또는 시약들을 제거하기 위해 여과시킨다. 반응이 불완전한 경우에 SPPS 사이클의 단일 단계들을 반복할 수 있다. 고체 상이 A-체인 또는 B-체인의 완전한 아미노산 서열을 담을 때까지 SPPS 사이클을 반복한다.
A-체인에 있어서, 최종 Fmoc-탈보호를 실시하고 감압 하에서 펩타이드 레진을 건조시킴으로써 SPPS를 완결한다.
B-체인은 Lys2에서 브로모아세틸 링커로 추가적으로 변형시킨다. 이러한 과정은 적합한 활성화 제제의 존재 하에서 Lys2의 측쇄 보호기(protecting group)를 선택적으로 절단하고 Lys2에 브로모아세트산을 커플링하는 것으로 구성된다. 상기 커플링 반응이 불완전하다면, 재커플링 과정들을 실시할 수 있다. 이후 감압 하에서 펩타이드 레진을 건조시킴으로써 SPPS를 완결한다.
단계 2: 산 불안정한 보호기의 절단을 포함하는 레진으로부터의 절단
상기 레진으로부터 펩타이드들을 절단하는 동시에 산 불안정한 보호기의 절단은 물의 존재 하에서 TFA 처리로 완수한다. 반응성 양이온들을 가두고 측-쇄 반응들의 알킬화를 피하기 위해 필요에 따라 스캐빈저(Scavengers)를 첨가한다. TFA로 상기 레진을 여과하고 세척한 후, 산물들을 IPE로 침전시킨다. 상기 침전물들을 여과하며 IPE로 세척하고 감압 하에서 건조시킨다.
단계 3: 제조성 HPLC (TFA 시스템)에 의해 중간산물들의 정제
이전 단계에서 얻어진 A-체인 및 B-체인을 ACN 농도구배 용출(TFA 시스템)을 이용한 역상 컬럼들 상의 제조성 HPLC 및 λ = 220 nm에서의 UV 검출에 의해 정제한다.
펩타이드 부분들을 물 또는 물 및 아세트산의 혼합물에서 녹이고 상기 컬럼에 로딩한다. 이후에, TFA 시스템의 ACN 농도구배를 시작한다. 분석적 HPLC를 이용하여 수집된 분획들을 점검하고 이에 따라 풀링한다.
부 분획물들(Side fractions)을 TFA 시스템으로 재정제할 수 있다. 마지막으로, 적절한 순도를 가지는 상기 풀링된 분획들을 동결건조한다.
단계 4: A-체인 및 B-체인의 커플링
TRIS 완충액 (염산의 첨가로 pH 8.5로 조정됨) 내 A-체인 (1 당량)의 용액에 수용성 TFA 내 B-체인 (1 당량)의 용액의 첨가를 통해 상기 두 개의 펩타이드 체인들의 커플링을 실시한다. 추가적인 TRIS 완충액을 첨가하여 상기 반응 혼합물을 pH > 8로 유지한다. 이후 상기 반응 혼합물을 교반하고 분석적 HPLC로 반응 진행을 모니터링한다. 완료 후, TFA의 첨가로 상기 반응 혼합물의 pH를 약 pH 3까지 낮춘다.
단계 5: 제조성 HPLC (TFA 시스템)에 의한 정제
이전 단계에서 얻어진 C5-펩타이드를 ACN 농도구배 용출(TFA 시스템)을 이용한 역상 컬럼들 상의 제조성 HPLC 및 λ = 220 nm에서의 UV 검출에 의해 정제한다.
C5-펩타이드 부분들을 상기 컬럼에 직접적으로 로딩한다. 이후에, TFA 시스템의 ACN 농도구배를 시작한다. 분석적 HPLC를 이용하여 수집된 분획들을 점검하고 이에 따라 풀링한다.
부 분획물들을 TFA 시스템으로 재정제할 수 있다. 마지막으로, 적절한 순도를 가지는 상기 풀링된 분획들을 동결건조한다.
단계 6: 이온 교환, 마이크로여과, 및 동결건조
C5-펩타이드의 제조의 마지막 단계는 이전 단계에서 얻어지는 TFA 염을 아세테이트 염으로의 이온 교환이다.
TFA 정제로부터 동결건조된 물질을 5% 아세트산에 녹이고 상기 용액을 이온 교환 레진(아세테이트 형태)에 로딩한다. 용출은 5% 아세트산으로 실시하고 TLC로 점검한다. 산물 용액을 0.2 μm 막 필터로 여과하고 동결건조하여 백색 내지 황백색 물질로서의 최종 산물을 생산한다.
본 발명에 따른 조성물들 및 방법들에서 이용되는 세포- 매개된 면역반응을 유발시키는 HIV -특이적 펩타이드들의 제조
본 발명에 따라 이용되는 펩타이드들은 재조합 DNA 기술들 같은 선형 아미노산 서열을 생산하는 어떠한 알려진 방법에 의해 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드 또는 상기 펩타이드들의 멀티머를 인코딩하는 핵산 서열을 발현 벡터 내로 도입한다. 적합한 발현 벡터들은, 예를 들어 복제 및 발현에 필요한 조절 영역들을 포함하는 플라스미드들, 코스미드들, 바이러스들 및 YAC (yeast artifical chromosome)이다. 숙주세포에서의 발현을 위해 상기 발현 벡터를 자극할 수 있다. 적합한 숙주세포들은, 예를 들어 박테리아, 효모세포들 및 포유동물 세포들이다. 그러한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있고 예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989에 기재되어 있다. 다른 잘-알려진 기술들은, 액체 상 또는 좋게는 예를 들어 소위 메리필드 합성에 의한 고체 상 (레진)에서 다음 아미노산과 하나의 아미노산 잔기의 커플링에 의한 분해 또는 합성이다. 예를 들어 Barany and Merrifield in the Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol.2, E. Gross and Meinhofer, Ed. (Acad.Press, N.Y., 1980), Kneib-Coronier and Mullen Int. J. Peptide Protein Res.,30, p.705-739 (1987) and Fields 및 Noble Int.J.Peptide Protein Res., 35, p.161-214 (1990)을 참조하라.
결합된 또는 고리형 펩타이드를 소망하는 경우, 아미노산 서열은 적절한 선형 아미노산 서열들이 합성된 후 화학적 산화 단계를 거쳐 하나의 펩타이드 서열 내 또는 두 개의 펩타이드 서열들 간의 2개의 시스테인 잔기들을 고리화 또는 연결시킨다. Akaji 등, Tetrahedron Letter, 33, 8, p.1073-1076, 1992를 참조하라.
하기에 주어지는 실시예들에서 제조되는 모든 펩타이드 유도체들은 표준 프로그램을 이용하는 Milligen 9050 펩타이드 합성기에서 합성하였다. 이용된 레진은 0,20 meq/g (RAPP POLYMERE GmbH, Tubingen)의 이론적 로딩을 가지는 Tenta Gel P RAM이었다. 상기 합성의 최종 산물은 하룻밤 동안 진공 하에서 건조시켰다. 이후 상기 펩타이드에 90% 트리플루오로아세트산을 스캐빈저들로서 에탄디티올(5%) 및 물(5%)의 존재 하에서 처리하여 레진으로부터 절단하였다 (상온에서 1,5시간). 이후 상기 레진을 여과하고 추가적인 트리플루오로아세트산 (100%) (2 x 20 ml)으로 필터 상에서 세척하였다. 상기 조합된 여과물들(filtrates)을 진공 하에서 증발시키며(상온의 수조) 잔류물을 에틸 에테르 (200 ml)로 분쇄하고 상기 침전된 산물을 여과하였다. 상기 고체를 빙초산 (100 ml)을 가지는 필터에 신속하게 녹였으며 메탄올에 녹여진 1,5 l의 20% 아세트산을 첨가하고 옅은 갈색이 나타낼 때까지 메탄올에 녹여진 0,1 M의 요오드 용액을 처리하였다. 이후 아세테이트 형태의 Dowex 1 x 8 이온 교환제 (15g) (Bio-Rad, Richmond, CA)를 첨가하고 상기 혼합물을 여과시켰다. 상기 여과물을 증발시키고 잔류물을 아세트산 하에서 동결-건조하였다. 이후 0,1% 트리플루오로아세트산 물 용액 내에 아세토니트릴을 포함하는 적합한 시스템에서 Kromasil® 100 - 5 C8 컬럼 (EKA Nobel, Surte, Sweden)으로 채워진 컬럼 상의 역상 액체 크로마토그래피로 산물을 정제하였다. 상기 컬럼으로부터 수집된 시료들을 Kromasil® 100 - 5 C8 컬럼 (EKA Nobel, Surte, Sweden)이 장착된 분석적 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) (Beckman System Gold, USA)로 분석하였다. 순수 물질을 포함하는 분획들을 풀링하여 용매를 증발시키고 산물을 아세트산 하에서 동결-건조시켰다. 최종 산물에 대해 최종적인 HPLC 분석을 실시하고 펩타이드의 구조를 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
합성 동안 이용된 모든 아미노산들은 L-아미노산들이었고 α-아미노 기능 상에 플루오레닐메톡시-카르보닐 그룹으로 보호하였다. 측쇄들(side chains)은 다음과 같이 보호하였다:
Cys (Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Thr(tBu).
괄호 내 약어들은:
Trt = 트리페닐메틸
t-Bu = 3차 부틸
OtBu = 3차 부틸에스테르
상기 아미노산 유도체들은 Bachem AG, Switzerland에서 공급되었다.
K A L G P G A T L Q T P W T A C Q G V G - NH2 (서열번호 48)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC): 87%
R A L G P A A T L Q T P W T A S L G V G (서열번호 49)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC): 95% 초과
분자량 (프리 염기): 1966
분자식 : C88H144O25N26
W I I P G L N P L V G G G K L Y S P T S I L C G - NH2 (서열번호 51)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 95%
질량 스펙트럼 분석: 이론적 분자량 : 2454.9
실험적 분자량 : 2454.8 ES+
R W L L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G (서열번호 52)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 95% 초과
분자량 (프리 염기) : 2552
분자식 : C119H195O29N33
K I L L G L N P L V G G G R L Y S P T S I L G (서열번호 53) , R L L L G L N P L V G G G R L Y S P T T I L G (서열번호 54) 및 N I P I P V G D I Y G G G D I Y K R W Q A L C L (서열번호 70)의 제조. 상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
R N I P I P V G D I Y G G G D I Y K R W Q A L C L (서열번호 56)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 85%
질량 스펙트럼 분석 : 이론적 분자량 : 2817.3
실험적 분자량 : 2813.7 ES+
R A I P I P A G T L L S G G G R A I Y K R W A I L G (서열번호 57)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 95% 초과
분자량 (프리 염기) : 2707
분자식 : C125H208O29N38
A L P I PA G F I Y G G G R I Y K R W Q A L G (서열번호 58), K I P I P V G F I G G G W I Y K R W A I L G (서열번호 59) 및 K I P I P V G T L L S G G G R I Y K R W A I L G (서열번호 60)의 제조. 상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
K F I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I (서열번호 62)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 서열 내 Nl은 노르루이신이다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 80% 초과
질량 스펙트럼 분석 : 이론적 분자량 : 2783.3
실험적 분자량 : 2783.3 ES+
K F I I P Nl F S A LS G G G A I S Y D L N T F L N C I G (서열번호 63)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 서열 내 Nl은 노르루이신이다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 80% 초과
질량 스펙트럼 분석 : 이론적 분자량 : 2932.4
실험적 분자량 : 2931.8 ES+
R F I I P Nl F T A L S G G R R A L L Y G A T P Y A I G (서열번호 64)의 제조.
상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 서열 내 Nl은 노르루이신이다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
순도 (HPLC) : 95% 초과
분자량 (프리 염기) : 2894
분자식 : C137H217O32N37
K I I P Nl F S A L G G G R L L Y G A T P Y A I G (서열번호 65), R I I P Nl F T A L S G G G R L L Y G A T P Y A I G (서열번호 66) 및 W I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I (서열번호 71). 상기 펩타이드는 합성의 일반적인 기재에 따라 상응하는 출발점으로부터 아미드 형태로 합성하였다. 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다.
이황화 브릿지를 통한 다이머화 .
상기 실시예들의 펩타이드 서열들을 산화 단계를 통해 결합시켜 디펩티이드(dipeptide)를 형성하고 시스테인 잔기들이 이황화 브릿지를 형성하였다. 상기 브릿지는 다음 중 어느 하나의 방식으로 형성하였다;
A) I2를 이용한 산화. 동량의 펩타이드들을 아세트산/메탄올 (1:4)에 녹였고 메탄올에 녹여진 0.1 M I2를 첨가하여 다이머 혼합물을 생산하였다.
또는
B) [Cys(Spy)16]-서열번호 48을 통한 산화. 2 M AcOH (수용성) 및 2-프로파놀 (1:1)에 녹여진 2,3 mM의 서열번호 48 펩타이드에 2,2 디티오디피리딘 (3 당량)을 처리하여 [Cys(Spy)16]-서열번호 48을 생산하였다. 동량의 [Cys(Spy)16]-서열번호 48 및 서열번호 51 펩타이드를 10 mM NH4Oac (수용성 pH = 6,5) 및 메탄올 (5:2)에 녹여 서열번호 67의 다이머를 생산하였다.
펩타이드의 순도는 HPLC 분석으로 결정하였으며 구조는 아미노산 분석 및 질량분석법 (LDI-MS)으로 확인하였다. 펩타이드 함량 (아미노산 프리 염기)은 80%였다.
순도 (HPLC): 92%.
실시예 2
서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 57 및 서열번호 64의 펩타이드들을 포함하는 백신을 제조하였다. 동결-건조된 펩타이드들을 4 mg/ml의 최종 농도로 멸균수에 녹였다. 최종 염 농도는 0,9%였다. 과립구-대식세포-콜로니 자극인자 (GM-CSF)의 제조물도 0.3 mg/ml의 최종 농도로 사용을 위한 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 두 개의 용액을 피내 투여한다. 전형적인 주사 투여량은 100 μl이다.
실시예 3
항원 용액 또는 현탁액을 동량부의 베링의 프로인트 보조제와 완전하게 또는 불완전하게 혼합하고, 이후에 주사바늘 또는 균질기로 뽑고 강하게 눌러서 미세하게 유화시켰다. 상기 에멀젼은 최소 30분 동안 안정하게 유지할 것이다. 상기 항원-보조제 에멀젼은 가장 좋게는 저장소(depot)로서 피하로 주입한다.
실시예 4
독성 데이터.
실시예의 디펩타이드들을 0,9% NaCl로 4 mg/ml의 테스트 용액 농도로 희석한다. 펩타이드를 kg 몸무게 당 100 μg의 투여량으로 NMFI 암컷 마우스에 주사로 투여한다. 어떠한 독성학적 효과들이 관찰되지 않았고 펩타이드는 정말로 독성을 가지지 않는다.
백신의 펩타이드 조성물에 대한 독성 연구들은 마우스 및 래트에서 실시한다. 두 번째로 흔하게 이용되는 설치류 종들로부터 비교적 데이터를 제공하기 위한 연구를 위해 마우스를 선택한다. 상기 테스트 물질은 생리학적 염과의 재구축을 위한 동결건조된 물질을 포함하는 하나의 바이얼로서 제공되는 4개의 펩타이드들의 혼합물이며, 투여량 레벨은 총 펩타이드 로드(load)의 측면에서 표현된다. 개별 펩타이드들은 1:1:1:1 비율로 존재하여 0.0075 mg/kg 몸무게, 0.075 mg/kg 몸무게 및 0.75 mg/kg 몸무게의 각 펩타이드의 투여량 레벨을 제공하며, 이는 의도되는 인간 투여량의 500배까지에 해당한다. 테스트 동물들은 4개의 그룹의 각 10마리의 동물들(다섯 마리의 수컷 및 다섯 마리의 암컷)로 분류된다; 염 대조군 그룹 및 낮은 투여량, 중간 투여량 및 높은 투여량을 위한 그룹들. 테스트 조성물은 3 ml/분의 투여 속도로 꼬리 정맥 내로 한번에 정맥내 주입으로 투여한다. 동물들을 15일 및 16일째에 나트륨 펜토바르비톤의 복강내 주사로 죽인다.
상술한 연구의 결과들은 마우스 및 래트에 투여된 투여량 레벨이 어떠한 해로운 반응들을 유발하지 않았고 어떠한 효과 레벨도 3 mg/kg을 초과하지 않았다는 것을 나타냈다.
실시예 5
HIV -1에 의해 유도된 항체들의 검출을 위한 면역어세이 .
자성입자 시약들이 제조자의 추천된 프로토콜에 따라 제조될 것이다. 이용되는 Dynal AS는 디나비드(Dynabeads)의 제조사이다. 리간드로 코팅된 자성입자들은 시약 1로 명명한다. 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드는 상기 자성입자들의 전-활성화된 표면에 공유결합적으로 커플링된다. 또한 상기 펩타이드를 상기 자성입자들의 표면에 물리적으로 흡착시키는 것도 가능하다. 시약 1 내 입자들의 농도는 1 mg/ml부터 15 mg/ml까지의 범위 내이다. 입자 크기는 0,2 μm 내지 15 μm로 다양하다. 펩타이드의 농도는 0,01 mg/mg 입자부터 1 mg/mg 입자까지의 범위 내이다.
항 인간 Ig 알카린 포스파타제 (AP) 컨쥬게이션된 항체 시약은 Dako AS의 추천된 프로토콜에 따라 제조한다. 이러한 프로토콜은 해당 분야에서 표준 과정이다. 이러한 시약은 시약 2로 명명한다.
기질 용액인 페놀프탈레인-모노포스페이트는 Fluka AG의 추천된 프로토콜에 따라 제조한다. 이러한 프로토콜은 해당 분야에서 표준 과정이다. 이러한 시약은 시약 3으로 명명한다.
이용되는 세척 및 반응 완충액은 다음의 추가적인 화합물을 포함하는 표준 0.05 M 트리스-염기 완충액이다; Tween 20 (0,01% 내지 0,1%), 글라이세롤 (0,1% 내지 10%) 및 나트륨 클로라이드 (0,2% 내지 0,1%).
어세이 과정은 각 웰에서 한 방울의 시약 1을 두 방울의 세척 완충액과 혼합하는 반응 단계를 포함한다. 혼합 후, 30 μl의 시료를 첨가하고 상기 용액을 5분 동안 반응시킨다. 상기 자성입자들을 자석으로 모을 수 있고 자석을 분리하기 전에 상기 액체를 제거하였다. 이후 시약 2와 반응시키기 전에 상기 웰들을 4방울의 세척 용액으로 두 번에 걸쳐서 세척한다. 한 방울의 시약 2를 2방울의 세척 완충액과 함께 첨가하며 상기 용액을 5분 동안 반응시킨다. 자성입자들을 자석으로 모을 수 있고 자석을 분리하기 전에 상기 액체를 제거하였다. 이후 시약 3과 반응시키기 전에 상기 세척 단계를 반복한다. 두 방울의 시약 3을 각 웰에 첨가하며 상기 용액을 3분 동안 반응시킨다. 백색 백그라운드 하에서 상기 결과들을 판독할 수 있다. 양성 결과들은 빨간색 (3+ = 강한 빨간색)인 반면에 음성 결과들은 음성 대조군에서 얻어지는 매우 엷은 노란색/갈색 용액들이다.
면역어세이 키트는 HIV 바이러스 또는 HIV-특이적 펩타이드들 또는 단백질들 중 어느 하나, 예를 들어 본 발명의 펩타이드들에 의해 유도되는 항체들의 검출에 이용될 수 있다.
상기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 예들일 뿐이다. 당업자가 청구항들에 설명된 대로 본 발명의 개념 및 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 기재되는 펩타이드들, 항원들 및 백신들을 변형할 수 있다는 것이 반드시 이해된다.
본 발명에 따라 이용되는 폴리펩타이드들은 항원을 형성하는 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55 및 서열번호 61 중 어느 하나 뿐 아니라 서열번호 28과 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화 결합된 펩타이드, 서열번호 30과 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화 결합된 펩타이드, 또는 서열번호 32와 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화 결합된 펩타이드; 또는 서열번호 38과 서열번호 39, 서열번호 40; 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 68 중 어느 하나 간의 시스테인-라이신 결합된 펩타이드, 또는 서열번호 41과 서열번호 39, 서열번호 40; 서열번호 42, 및 서열번호 43 중 어느 하나 간의 시스테인-라이신 결합된 펩타이드인 펩타이드 멀티머를 포함하지만 이에 한정되지 않게 선택되는 국제특허출원 WO2011/000962, WO0052040, WO 2012/092934 또는 WO 2012/072088 중 어느 하나에 구체적으로 개시된 최소 하나의 펩타이드를 포함하고 예방적 또는 치료적 백신의 유효성분(active principle)은 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 (HIV-1)에 대한 보호를 제공한다. 상기 백신은 숙주의 면역 시스템 (인간 또는 척추동물)을 보호하거나 또는 자극하는 유익한 효과들을 가지는 화합물들, 예를 들어 인터루킨들, 인터페론들, 과립구 대식세포 성장인자들, 조혈 성장인자들(haematopoietic growth factors) 또는 유사한 것들을 포함할 수 있다. 좋게는 상기 백신 조성물은 보조제 또는 비히클을 추가적으로 포함하고, 보다 좋게는 상기 보조제 또는 비히클은 아마 백반과 함께 모노포스포릴 지질 A (MPL®), 프로인트 보조제 (완전 또는 불완전한 형태) 또는 알루미늄 하이드록시디(aluminum hydroxyd)이다. 보조제/비히클의 최적 양은 선택되는 타입(들)에 따라 다를 것이다.
펩타이드 또는 백신 제형물은 저장 전에 동결-건조시킬 수 있다. 상기 백신은 좋게는 사용 전에 하나 이상의 투여량 단위들(dosage units)을 포함하는 앰플에 낮은 온도에서 저장할 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드의 전형적인 투여량 단위는: kg 체중 당 1 μg-1 mg, 좋게는 kg 체중 당 2 μg-0.15 mg의 농도 범위 내이다. 당업자들은 적합한 투여량이 환자의 몸무게, 질병의 타입, 상태의 심각성, 투여 경로 및 여러 가지 다른 인자들에 따라 다를 것이라는 것을 이해할 것이다. 상기 백신은 12번까지 투여할 수 있으며, 전형적으로 주사를 통해 약 3번 투여될 것이다. 주사액의 제조에서 상기 펩타이드들을 멸균 나트륨 클로라이드 용액에 펩타이드 당 1 mg/ml 및 0,9% 나트륨 클로라이드의 최종 농도로 녹인다. 전형적으로 주사 용량은 100 μl 내지 200 μl (2 x 100 μl)이다. 상기 펩타이드는 좋게는 적합한 보조제 및/또는 과립구-대식세포 성장인자, 예를 들어 류코맥스(Leucomax®)(Shering Plough)와 공동-투여한다. 적합한 투여는 피내(intracutane), 피하(subcutane), 정맥내, 경구(peroral), 근육내, 비강내, 점막내 또는 어떠한 다른 적합한 경로일 수 있다. 부스터(booster) 투여는 보호를 유지하기 위해 필요할 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물들은 감염의 예방 뿐 아니라, 감염의 치료에 유용하다는 것이 당업자에게 이해될 것이다.
실시예 6
기존의 임상적 데이터에 기반하여 실시예 8 및 Vacc-C5의 펩타이드 조성물의 조합을 테스팅하는 임상 연구를 구축할 수 있었다. Vacc-C5의 백신화 치료 계획은 피내로 300 μg Vacc-C5를 10분 동안 운반시킨 후 0.33x106 IU 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF)의 피내 주사일 수 있다. 상기 백신화 치료 계획은 1주, 2주, 4주, 12주, 13주, 22주 및 23주에 주당 한번씩 실시할 수 있다. 면역학적 성숙의 기간 후, 상기 펩타이드 조성물의 백신화 일정은 300 μg/10분 동안 피내로 주입한 후 0.33x106 IU GM-CSF의 피내 주사된 펩타이드이다. 상기 펩타이드 조성물은 27주, 28주, 29주, 30주, 42주, 44주째에 경구로 투여할 수 있으며, 프로토콜 전반에 걸쳐서 임상적 및 면역학적 파라미터들, 예컨대 지연된 과민성 반응 (DTH), Vacc-C5 항체 반응에 대한 ELISA 같은 혈청학적 파라미터들 및 상기 펩타이드 조성물 또는 상응하는 천연 항원에 대한 ELISPOT 또는 증식 같은 세포 파라미터들이 측정된다. 택일적으로, 상기 펩타이드 조성물 및 Vacc-C5 (예를 들어 상기 펩타이드 조성물의 펩타이드 당 300 μg 및 300 μg Vacc-C5)는 동일한 주사에 조합할 수 있으며 10분 동안 투여한 후 1주, 2주, 3주, 4주, 16주 및 18주에 1주일에 한번씩 GM-CSF의 피내 주사를 실시하고, 프로토콜 전반에 걸쳐서 임상적 및 면역학적 파라미터들, 예컨대 DTH, Vacc-C5 항체 반응에 대한 ELISA 같은 혈청학적 파라미터들 및 상기 펩타이드 조성물 또는 상응하는 천연 항원에 대한 ELISPOT 또는 증식 같은 세포 파라미터들이 측정된다. 또한, 상기 보조제는 양 임상 연구들에서 ISA51, ISA720, 프로박스(Provax) 또는 GM-CSF 대신에 허가된 또는 비-허가된 다른 보조제일 수 있다.
실시예 7
증가된 증식, 다중기능성( polyfunctionality ), IL -2 분비 및 IFN -γ 생산을 위한 IMiDs 와 함께 펩타이드들의 테스트
본 발명에 따라 이용되는 펩타이드들로 전-처리된 수지상세포들의 자극 하에서 다중기능성 HIV-특이적 T-세포들의 확장(expansion)은 Keersmaecker 등 (J. Virol., 2012 86:9351-9360) 및 본 명세서에 참조된 방법들, HIV 단백질들인 Gag 또는 Nef가 공동-배양으로 T-세포들을 자극하기 위해 사용되기 전에 상기 단백질들을 본 발명에 따라 이용되는 펩타이드들과 반응시킴으로써 연구할 수 있다.
Keersmaecker 등은 Gag- 또는 Nef-특이적 펩타이드들을 제시하는 수지상세포들과 인 비트로 T-세포 자극 동안 IMiDs (레날리도마이드 (IMiD3; CC-5013) 및 포말리도마이드 (IMiD1; CC-4047)의 존재가 T-세포들의 기능에 많은 개선들을 초래한다는 것을 발견하였다. 상술한 개선들은; 증대된 용해 능력을 가지는 다중기능성 HIV 특이적 CD8+ T 세포들, 인지되는 보다 많은 Gag 항원 에피토프들 및 더 낮은 항원 펩타이드 농도들, 증가된 수의 다중기능성 CD4+ T-세포들과 함께 CD4+ T 세포들의 감소된 증식, CD8 T-세포들에 의한 증가된 IL-2 생산, 항원 자극 후 CD8+ T-세포들 및 CD4 T-세포들에 의한 검출가능한 IFN-γ 생산을 포함한다.
" Expansion of Polyfunctional HIV - Specific T Cells upon Stimulation with mRNA Electroporated Dendritic Cells in the Presence of Immunomodulatory Drugs "
Brenda De Keersmaecker, Sabine D. Allard, Patrick Lacor, Rik Schots, Kris Thielemans, 및 Joeri L. Aerts
J. Virol. September 2012 86:9351-9360; published ahead of print 20 June 2012년 6월 20일에 인쇄 전에 공개됨, doi:10.1128/JVI.00472-12
실시예 8
레날리도마이드 및 HDAC 억제제와 조합한 4개의 펩타이드들을 포함하는 펩타이드 조성물의 테스트를 위해 제안된 임상 연구 프로토콜
1) 보조제로서 GM-CSF 및 레날리도마이드 (CC-5013)를 가지는 펩타이드 조성물, 또는
2) 보조제로서 GM-CSF 및 레날리도마이드 (CC-5013)에 대한 위약 (Placebo)을 가지는 펩타이드 조성물.
3) 위약
중 어느 하나에 의한 1주, 2주, 3주 및 4주째의 면역화들 및 12주 및 13주째의 부스터 면역화
제안된 투여량들:
펩타이드 조성물: 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5 mg (동량의 각 펩타이드)
레날리도마이드: 5, 10, 및 25 mg.
Vacc-C5: 100, 300 및 900 μg.
레날리도마이드 (CC-5013) 군(arm)으로 임의 추출된 대상자들은 상기 펩타이드 조성물로 면역화시키기 2일 전에 매일 레날리도마이드 (CC-5013)의 단일 구강 투여량을 섭취할 것이고 각 면역화 날짜에 레날리도마이드 (CC-5013)의 단일 구강 투여량을 섭취할 것이다.
이러한 임상 시험 설정(setup)에 따라 이용되는 펩타이드 조성물은 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 57, 및 서열번호 64로 구성된다.
20주에 모든 연구 군들의 대상자들은 백그라운드 ART를 유지하면서 매주 1일, 3일 및 5일(즉, 1주일에 3번)에 8주 동안 (28주까지) 구강으로 20 mg의 파노비노스타트 (LBH589)를 받을 것이다. 이것은 24주의 추적 기간 (52주까지) 진행될 것이다. 연구가 완료되면, 대상자들이 ART를 중단할 추가적인 관찰 연구에 참여하도록 요청하여 바이러스학적 조절에 대한 연구 치료의 효과를 평가할 수 있다. 이러한 부분의 연구 내로의 등록은 선택적이고 잠복성 HIV-1 병원소에 대한 연구 치료들의 효과에 의해 결정될 것이다. (치료 중단의 최대 지속: 16주).
요약하면:
연구 군(Study arm) 1: 펩타이드 조성물 + IMiD + HDAC (파노비노스타트)
연구 군 2: 펩타이드 조성물 + HDAC (파노비노스타트)
연구 군 3: HDAC (파노비노스타트)
본 발명에 따른 조합 치료들의 결과로서 바이러스 병원소의 삭제는, 예를 들어 Lehrman 등 (The Lancet (366), 2005, pp. 549-555) 및 본 명세서의 레퍼런스들에 설명된 과정들에 따라서 정량할 수 있다. 간략하게는, 이것은 치료 전, 동안 및 후에 얻어지는 환자 혈액의 시료들에서 측정하는 것을 포함한다; 자극된 잠복적으로 감염된 세포들로부터 얻어지는 p24 발현, 혈장 HIV RNA 농도 (바이러스 로드), 및 실시간 PCR 분석에 의한 통합된 HIV DNA.
실시예 9
DC/T-세포 증식 어세이
수지상세포 (DC)는 건강한 혈액 공여체들로부터 유래된 연막(buffy coat) 제조물들로부터 분리된 단핵구로부터 발생시켰다. 간략하게는, 말초혈액 단핵구 세포들을 밀도 구배 원심분리로 분리하고 이후에 제조자의 설명서에 따라 디나비드 본래의 인간 단핵구들 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 디나비드 단핵구들을 음성적으로 분리하였다. 단핵구들을 5-6일 동안 X-VIVO15 배지 (Lonza, Basel, Switerland)에서 IL-4 (20 ng/ml; Immunotools, Friesoythe; Germany) 및 GM-CSF (100 ng/ml; Immunotools)를 가지고 배양하여 미성숙한 DC를 발생시켰다. 사이토카인들을 2-3일 마다 보충하였다. 세포들의 성숙은 IFN-γ (1000 IU/ml), TNF-α (50 ng/ml), IL-1β (25 ng/ml) IFN-α (3000 IU/ml)을 가지고 24시간 동안 실시하였다. 성숙 후, 상기 DC는 광범위한 세척 및 형광성 염료 (VPD450, BD biosciences, Sam Jose, CA)로 표지된 말초 혈액 단핵구 세포들 (PBMC)의 공동-배양 전에 10 μg/ml의 펩타이드들과 37℃에서 2시간 동안 펄싱시켰다. DC:T 세포의 다양한 비율을 적절한 대조군들과 함께 테스트하였다. IMiDs를 가지거나 또는 없는 웰에 IL-2 (50 U/ml) 및 IL-7 (50 ng/mL) (Both, Immunotools)를 공동-배양의 시작에 첨가하였다. 6-10일째에, T 세포 증식의 레벨을 유세포 분석법으로 분석하였다. 상기 공동-배양 웰들로부터 상층액을 루미넥스(Luminex) 기술로 조사하여 어떠한 억제 활성을 규명하였다.
실시예 10
면역학적 연구들
래빗 면역화
뉴질랜드 백색 암컷 래빗들을 0주, 2주 및 6주에 50%V/V 프로인트 보조제에 포함되는 500 μg BI400-B로 구성된 1 ml의 BI400-B 백신으로 피내로 면역화시켰다 (즉, 완전 프로인트 보조제가 프라이밍을 위해 이용된 후 불완전한 프로인트 보조제로 부스팅됨). 선택적으로 동물들은, 예를 들어 면역화 2일 전에 매일 또는 각 면역화 날에 단일 투여량의 면역조절성 약물 (IMiD)을 받았다. 개별 혈청이 ELISA를 위해 분리되었다.
인간 혈청을 위한 직접적 ELISA
BI400-015 및 -201로 구성된 50-100 μl의 혼합물 (코팅 완충액 - 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에서 전-반응됨; CB로 표시됨 - 코팅 전 1-3일째에 각 펩타이드에 대해 16 μg/ml로 냉장 상태) 또는 단지 CB (백그라운드 대조군)가 4℃에서 하룻밤 동안 마이크로타이터 플레이트들 내 코팅 웰에 사용되었다. 이후, 상기 마이크로타이터 플레이트들을 세척 완충액 (PBS + 1%v/v Triton-X100; WB로 표시됨)으로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 웰 당 200 μl의 차단 완충액 (PBS + 1%w/v BSA)으로 상온 (RT)에서 2시간 동안 차단하였다. 이후 플레이트들을 WB로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 웰 당 50-70 μl의 첨가된 인간 (희석 완충액 (PBS + 1%v/v Triton-X100 + 1%w/v BSA; DB로 표시됨)으로 1:1 - 1:250의 범위로 연속적 희석됨)으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트들을 이후에 WB로 6번에 걸쳐서 세척시킨 후, 웰 당 70 μl의 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 단백질 G (DB에 녹여진 3 μg/ml; Calbiochem 539305)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 플레이트들을 WB로 6번에 걸쳐서 세척시킨 후, 웰 당 100 μl의 0.3%w/v 페노프탈레인 모노포스페이트 (Sigma P-5758)와 상온에서 10-60분 동안 반응시켰다. 최종적으로 플레이트들에 웰 당 100 μl의 퀀칭 용액 (0.1 M TRIS + 0.1 M EDTA + 0.5 M NaOH + 0.01%w/v NaN3; pH 14)을 첨가하여 퀀칭시킨 후, 550 nm에서 ELISA 판독기 (ASYS UVM 340)로 확인하였다.
BI400 -B로 면역화 후 래빗 혈청에 대한 경쟁적 ELISA
BI400-015 및 -201로 구성된 50-100 μl의 혼합물 (코팅 완충액 - 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에서 전-반응됨; CB로 표시됨 - 코팅 전 1-3일째에 각 펩타이드에 대해 16 μg/ml로 냉장 상태) 또는 단지 CB (백그라운드 대조군)가 4℃에서 하룻밤 동안 마이크로타이터 플레이트들 내 코팅 웰에 사용되었다. 이후, 플레이트들을 세척 완충액 (PBS + 1%v/v Triton-X100; WB로 표시됨)으로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 웰 당 200 μl의 차단 완충액 (PBS + 1%w/v BSA)으로 상온 (RT)에서 2시간 동안 차단하였다. 이후 플레이트들을 WB로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 웰 당 60-100 μl의 첨가된 래빗 혈청 시료들 (1:10 - 1:250의 최종 농도로 희석됨)으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고, 상기 래빗 혈청 시료들은 400-SEQ.B, BI400-015, BI400-201, BI400-204d, 재조합 gp41 (Shin-Won Scientific, SWO 102 gp41), BI301-23 (관련없는 단백질; 대조군), 펩타이드 무처리군 (즉, PBS; 대조군), LTNP-혈청 풀 (1:10의 최종 농도로 희석됨), 또는 혈액 공여체 혈청-풀 (1:10의 최종 농도로 희석됨; 대조군)의 연속적 희석들 (10-1000 μM의 최종 농도 범위)과 전반응시켰다. 플레이트들을 이후에 WB로 6번에 걸쳐서 세척시킨 후, 웰 당 70 μl의 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 염소-항-래빗-Ig (6 μg/ml; Dako D0487)과 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 플레이트들을 WB로 6번에 걸쳐서 세척시킨 후, 웰 당 100 μl의 0.3%w/v 페노프탈레인 모노포스페이트 (Sigma P-5758)와 상온에서 10-60분 동안 반응시켰다. 최종적으로 플레이트들에 웰 당 100 μl의 퀀칭 용액 (0.1 M TRIS + 0.1 M EDTA + 0.5 M NaOH + 0.01%w/v NaN3; pH 14)을 첨가하여 퀀칭시킨 후, 550 nm에서 ELISA 판독기 (ASYS UVM 340)로 확인하였다.
실시예 11
다음의 실시예들에서 이용되는 본 발명에 따른 펩타이드들은 Sheppard, (1978) J.Chem.Soc., Chem. Commun., 539의 Fmoc-전략을 이용한 c-말단 아미드들로서 Schafer-N에 의해 합성하였다.
세포 투과 어세이
바이오틴화된 펩타이드들을 위한 세포내 염색
인간 PBMCs의 염색을 위해 96-웰 U-바닥 폴리스티렌 플레이트들 (NUNC, cat no: 163320)을 사용하였다. 간략하게는, 8 μl의 본 발명에 따른 N- 또는 C-말단성 바이오틴화된 펩타이드들 (즉, 각 펩타이드에 대해 테스트된 5 mM, 2.5 mM 및 1.25 mM)을 혈액 공여체들로부터 유래된 40 μl의 PBMC (12.5 x 106 세포들/ml)와 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 세포들을 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3번에 걸쳐서 세척시킨 후, 각 세포 펠렛을 100 μl의 트립신-EDTA (Sigma, cat no: T4424)로 재현탁시키고 37℃에서 5분 동안 반응시켰다. 트립신 처리된 세포들을 이후에 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3번에 걸쳐서 세척시킨 후, BD Cytofix/Cytoperm™ 플러스 (BD, cat no: 554715)로 재현탁하고 제조자에 따라 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 세포들을 150 μl의 PermWash (BD, cat no: 554715)로 2번에 걸쳐서 세척하였다. 세포들을 이후에 제조자에 따라 스트렙타비딘-APC (BD, cat no: 554067) 및 항-hCD11c (eBioscience, cat no: 12-0116)로 4℃에서 30분 동안 염색하여 각각 바이오틴화된 펩타이드들 및 수지상세포들을 시각화하였다. 이후 세포들을 150 μl의 PermWash로 3번에 걸쳐서 세척시킨 후, 유세포 분석 전에 염색 완충액 (BD, cat no: 554656)에 재현탁하였다. 수지상세포들은 림프구 영역 바깥쪽의 CD11c+로서 게이팅되었다 (즉, 림프구들보다 더 높은 FSC & SSC 시그널). HTS 로더를 가지는 FACSCanto II 유세포 분석기에서 200 000개의 총 세포들을 얻었고, 펩타이드-형광 (즉, GeoMean)에 대한 총 세포들 및 수지상세포들 모두의 막대 그래프를 제조하였다.
바이오틴화된 펩타이드들에 대한 세포외 염색
인간 PBMCs의 염색을 위해 96-웰 U-바닥 폴리스티렌 플레이트들 (NUNC, cat no: 163320)을 사용하였다. 간략하게는, 표 1 또는 표 2에 따른 8 μl의 N- 또는 C-말단성 바이오틴화된 펩타이드들 (즉, 각 펩타이드에 대해 테스트된 5 mM, 2.5 mM 및 1.25 mM; 상업적인 공급체들을 통한 고체 상 합성에 의해 제조된 모든 펩타이드들)을 혈액 공여체들로부터 유래된 40 μl의 PBMC (12.5 x 106 세포들/ml)와 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 세포들을 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3번에 걸쳐서 세척시킨 후, 세포들을 이후에 제조자에 따라 스트렙타비딘-APC (BD, cat no: 554067) 및 항-hCD11c (eBioscience, cat no: 12-0116)로 4℃에서 30분 동안 염색하여 각각 바이오틴화된 펩타이드들 및 수지상세포들을 시각화하였다. 이후 세포들을 150 μl의 CellWash (BD, cat no: 349524)로 3번에 걸쳐서 세척시킨 후, 유세포 분석 전에 염색 완충액 (BD, cat no: 554656)에 재현탁하였다. 수지상세포들은 림프구 영역 바깥쪽의 CD11c+로서 게이팅되었다 (즉, 림프구들보다 더 높은 FSC & SSC 시그널). HTS 로더를 가지는 FACSCanto II 유세포 분석기에서 200 000개의 총 세포들을 얻었고, 펩타이드-형광 (즉, GeoMean)에 대한 총 세포들 및 수지상세포들 모두의 막대 그래프를 제조하였다.
본 발명에 따른 CMI 펩타이드들이 천연 카운터파트와 비교하여 세포로 진입하는 개선된 능력을 가졌다는 것을 명확하게 나타냈다.
FACS Duva 소프트웨어에 의해 계산되는 대로 상기 데이터는 각 테스팅된 펩타이드의 geomean-값이다. 트립신처리/Cytofix/Cytoperm에 의한 Geomean 값들.:
실시예 12
양성 CTL 반응은 택일적으로 ELISPOT 어세이에 의해 어세이될 수 있다.
ELISPOT 어세이에 의한 인간 IFN -감마 세포독성 T-세포 ( CTL ) 반응
간략하게는, 1일째에, HCV 환자들로부터 유래된 PBMC 시료들을 플라스크 (430 000 PBMCs/cm2)에서 L-글루타민 (MedProbe Cat. No. 13E17-605E), 10% FBS (Foetal Bovine serum) (Fisher Scientific Cat. No. A15-101) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Fisher Acientific Cat. No. P11-010)이 보충된 배양 배지 (RPMI 1640 Fisher Scientific; Cat No. PAAE15-039)의 포괄적 양으로 5% CO2, 37℃에서 2시간 동안 배양시켜 단핵구들을 부착하였다. 비-부착성 세포들을 분리하고 세척한 후 추가적인 이용까지 FBS 내 10%V/V DMSO에 동결시켰다. 부착 세포들을 배양 배치로 신중하게 세척한 후, 최종 농도 2 μg/ml의 hrGM-CSF (Xiamen amoytop biotech co, cat no: 3004.9090.90)의 및 1 μg/ml의 hrIL-4 (Invitrogen, Cat no: PHC0043) 및 선택적으로 면역조절성 제제 (IMiD)를 포함하는 배양 배지에서 3일까지 37℃에서 배양시켰고, 이러한 과정을 6일째에 반복하였다. 7일째에, 배양된 수지상세포들 (웰 당 5 000-10 000)을 해동된 자가 비-부착 세포들 (웰 당 200 000), 항원 시료들 (최종 농도 1-8 μg/ml의 펩타이드 항원들; 최종 농도 5 μg/ml의 콘카나발린 A (Sigma, Cat no: C7275) 또는 PHA (Sigma, Cat no: L2769)) 및 항-아네르기 항체들 (항-PD-1 (eBioscience, cat no: 16-9989-82) 및 항-PD-L1 (eBioscience, cat no: 16-5983-82) 모두의 최종 농도 0.03-0.05 μg/ml)과 함께 웰 당 0.5 μg의 항-인간 γ 인터페론으로 코팅된 ELISPOT (Millipore multiscreen HTS) 플레이트들에 첨가하였다.
실시예 13
ELISPOT 어세이에 의한 인플루엔자 특이적 M2e 반응
첫 번째 날에, 혈액 공여체들로부터 유래된 PBMC 시료들을 해동하고 따뜻한 배지로 세척한 후 플라스크 (250000 PBMCs/cm2)에서 배양 배지 (울트라-글루타민, Lonza, BE12-702F701; 10% FBS, Fisher Scientific Cat. No. A15-101; 페니실린/스트렙토마이신, Fisher Acientific Cat. No. P11-010이 보충된 RPMI 1640)의 포괄적 양으로 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양시켜 상기 세포들을 해동 후에 회복시켰다. 2일째에, 상기 세포들을 총 200 μl의 총 배지 용량으로 웰 당 500 000 세포들로 팔콘 마이크로테스트 조직 배양 플레이트인 96웰 평평한 바닥에 첨가하였다. 평행 웰들에 두 쌍으로 지정된 자극들 및 선택적으로 면역조절성 제제 (IMiD)을 첨가하거나, 또는 5% CO2, 37℃에서 6일 동안 대조군으로서 배지에 방치하였다. 배양 6일 후에, 100 μl의 세포 현탁액을 1 μg/ml의 천연 인플루엔자 M2e 단백질로 코팅된 ELISPOT (Millipore multiscreen HTS) 플레이트로 옮겼다. 24시간의 배양 후, 상기 플레이트를 웰 당 200 μl의 PBS + 0,05% Tween20으로 4번에 걸쳐서 세척하고 웰 당 200 μl의 PBS로 5번에 걸쳐서 세척하였다. 0.5% FBS를 포함하는 PBS에서 마우스 항-인간 IgG 또는 IgM 바이오틴 (Southern Biotech 9040-08 및 9020-08)을 희석하고 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 80 μl의 스트렙타비딘-알칼린-포스파타제 (Sigma Aldrich, S289)를 각 웰에 첨가하고 암 상태에서 상온에서 60분 동안 반응시키기 전에, 기재된 대로 세척을 반복하였다. 이후에 기질을 벡터 블루 알칼린 포스파타제 기질 키트 III(Vector Blue, SK-5300)에 첨가하고 상온에서 7분 동안 발생시키기 전에, 상기 웰들을 웰 당 200 μl의 PBS + 0.05% Tween20으로 2번 및 웰 당 200 μl의 PBS로 4번에 걸쳐서 세척하였다. 상기 반응을 흐르는 물로 중단하였으며 상기 플레이트를 건조시켰고 스포츠(sport)를 ELISPOT 판독기 (CTL-ImmunoSpot® S5 UV Analyzer)에 의해 나열시켰다.
ELISA에 의한 인플루엔자 특이적 M2e 반응
지시된 대로 100 μl의 항원 (코팅 완충액 - 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에서 전-반응됨; CB로 표시됨 - 코팅 전 1-3일째에 8 μg/ml로 냉장 상태) 또는 단지 CB (백그라운드 대조군)가 4℃에서 마이크로타이터 플레이트들 내 코팅 웰에 사용되었다. 이후, 상기 마이크로타이터 플레이트들을 세척 완충액 (PBS + 1%v/v Triton-X100; WB로 표시됨)으로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 웰 당 200 μl의 차단 완충액 (PBS + 1%w/v BSA)으로 상온 (RT)에서 2시간 동안 차단하였다. 이후 플레이트들을 WB로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 웰 당 50-70 μl의 첨가된 인간 (또는 래빗 또는 양) 혈청 (희석 완충액 (PBS + 1%v/v Triton-X100 + 1%w/v BSA; DB로 표시됨)에서 1:1 - 1:250의 범위의 연속적인 희석액들)으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트들을 이후에 WB로 6번에 걸쳐서 세척시킨 후, 웰 당 70 μl의 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 단백질 G (DB에 녹여진 3 μg/ml; Calbiochem 539305) 또는 염소 항-마우스 IgG 바이오틴 (1 μg/ml, Southern Biotech, 1030-08)으로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 염소 항-마우스 IgG 바이오틴의 경우, 100 μl의 스트렙타비딘-알칼린-포스파타제 (1 μg/ml, Sigma Aldrich, S289)의 첨가 전에, 상기 플레이트들을 기재된 대로 하나의 추가적인 단계로 세척하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 플레이트들을 WB로 6번에 걸쳐서 세척시킨 후, 웰 당 100 μl의 0.3%w/v 페노프탈레인 모노포스페이트 (Sigma P-5758)와 상온에서 10-60분 동안 반응시켰다. 최종적으로 플레이트들에 웰 당 100 μl의 퀀칭 용액 (0.1 M TRIS + 0.1 M EDTA + 0.5 M NaOH + 0.01%w/v NaN3; pH 14)을 첨가하여 퀀칭시킨 후, 550 nm에서 ELISA 판독기 (ASYS UVM 340)로 측정하였다. 이후에 기재된 광학 밀도 (OD) 값, 또는 지시된 희석의 혈청에서의 OD 값을 초래하는 혈청의 희석으로서 혈청의 강도, 즉 체액성 면역반응의 규모를 보고한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bionor Immuno AS <120> VACCINE <130> 19592PCT00 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> HIV <400> 1 Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala 1 5 10 15 Val <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> HIV <400> 2 Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala 1 5 10 15 Val <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> HIV <400> 3 Ala Pro Thr Arg Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala 1 5 10 15 Val <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> HIV <400> 4 Ala Pro Thr Arg Ala Lys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala 1 5 10 15 Val <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> HIV <400> 5 Ala Pro Thr Glu Ala Lys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala 1 5 10 15 Val <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> HIV <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Glu can be Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Gly can be Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Arg can be Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Asp can 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Arg 1 5 10 15 Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Lys may be linked to Cys in position 10 in SEQ ID NO: 38 or 41 <400> 39 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Glu Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 40 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys may be linked to Cys in position 10 in SEQ ID NO: 38 or 41 <400> 40 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg 1 5 10 15 Gly Gly Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Cys may be linked to Lys in position 2 in SEQ ID NO: 39 or 40 or 42 or 43 <400> 41 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala Gly Gln Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys may be linked to Cys in position 10 in SEQ ID NO: 38 or 41 <400> 42 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Gln Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Asp Arg Asp Arg 20 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys may be linked to Cys in position 10 in SEQ ID NO: 38 or 41 <400> 43 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Gln Asp Arg Asp Arg 1 5 10 15 Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp 20 <210> 44 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Trp may be D-Trp <220> <221> DISULFID <222> (4)..(10) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Carboxyterminal may be amidated <400> 44 Trp Trp Gly Cys Ala Lys Arg Arg Val Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala 20 <210> 45 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Trp may be D-Trp <220> <221> DISULFID <222> (4)..(10) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Carboxyterminus may be amidated <400> 45 Trp Trp Gly Cys Ile Glu Glu Glu Gly Cys Gly Gly Ile Glu Glu Glu 1 5 10 15 Gly Gly Glu Arg Asp Arg 20 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Glu can be Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Gly can be Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Arg can be Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Asp can be Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Arg can be Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Asp can be Gly <400> 46 Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Asn Asn Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp 1 5 10 15 Arg <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Ala, Gly, Ser or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa in position 3 is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in position 4 is Gly or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in position 5 is Pro, Thr, Val, Ser, Gln or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa in position 6 is Gly, Ala, Lys, Arg, Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa in position 8 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa in position 9 is Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Thr, Ser or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa in position 15 is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Gln or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa in position 18 is Gly, Glu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa in position 20 is Gly or Arg <400> 47 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Gln Thr Pro Trp Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Val Xaa 20 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 48 Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Gln Thr Pro Trp Thr Ala Cys 1 5 10 15 Gln Gly Val Gly 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 49 Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Gln Thr Pro Trp Thr Ala Ser 1 5 10 15 Leu Gly Val Gly 20 <210> 50 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is Arg, Lys, Asp or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Trp, Gly, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa in position 3 is Ile, Leu, Val or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in position 4 is Ile, Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in position 5 Leu, Met, Val or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is 0, 1, 2 or 3 Gly residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 13 is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Met or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Ser, Cys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa in position 18 is Thr, Val, Ile, Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Ser, Gly or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa in position 22 is Asp, Glu, Cys or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa in position 22 is Gly or none <400> 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Leu Asn Pro Leu Val Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa 1 5 10 15 Pro Xaa Xaa Ile Leu Xaa Xaa 20 <210> 51 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Trp Ile Ile Pro Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Lys Leu Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Thr Ser Ile Leu Cys Gly 20 <210> 52 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Arg Trp Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu 1 5 10 15 Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Gly 20 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Lys Ile Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Thr Ser Ile Leu Gly 20 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 54 Arg Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Thr Thr Ile Leu Gly 20 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is Asn, Ser, Gly, His, Ala, Pro, Arg or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Asn, Ala or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa in position 3 is Pro, Gln, Gly, Ile or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa in position 7 is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa in position 8 is Gly or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa in position 9 is Glu, Asp, Lys, Phe or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa in position 10 is Ile, Met, Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa in position 11 is Tyr, Leu or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is Ser or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 13 is 1, 2 or 3 Gly residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Arg or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa in position 15 is Asp, Arg, Trp, Ala or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Ile or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Tyr or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa in position 18 is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Arg, Lys or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa in position 20 is Trp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Ile, Met, Val, Gln or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa in position 22 is Ile, Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa in position 23 is Leu, Met or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa in position 24 is Gly or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa in position 25 is Leu or none <400> 55 Xaa Xaa Xaa Pro Ile Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 56 Arg Asn Ile Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Gly Gly Gly Asp Ile 1 5 10 15 Tyr Lys Arg Trp Gln Ala Leu Cys Leu 20 25 <210> 57 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 57 Arg Ala Ile Pro Ile Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Lys Arg Trp Ala Ile Leu Gly 20 25 <210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 58 Ala Leu Pro Ile Pro Ala Gly Phe Ile Tyr Gly Gly Gly Arg Ile Tyr 1 5 10 15 Lys Arg Trp Gln Ala Leu Gly 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 59 Lys Ile Pro Ile Pro Val Gly Phe Ile Gly Gly Gly Trp Ile Tyr Lys 1 5 10 15 Arg Trp Ala Ile Leu Gly 20 <210> 60 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 60 Lys Ile Pro Ile Pro Val Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Lys Arg Trp Ala Ile Leu Gly 20 <210> 61 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is Pro, Lys, Arg or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Glu, Arg, Phe or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in position 5 is Pro or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa in position 6 is Met, Thr or Nleu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa in position 7 is Phe or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa in position 8 is Ser, Thr, Ala or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa in position 9 is Ala, Glu or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa in position 11 is Ser or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is 1, 2 or 3 Gly residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 12 is 0, 1, 2 or 3 Arg residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Ala, Arg or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa in position 15 is Ile, Leu or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Ser, Ala, Leu or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Tyr, Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa in position 18 is Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Ala or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa in position 20 is Thr, Ile, Val, Leu or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Pro, Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa in position 22 is Tyr, Phe, Nleu, His or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa in position 23 is Asp, Asn, Leu or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa in position 24 is Leu, Ile, Val or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa in position 25 is Asn, Tyr, Cys or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa in position 26 is Thr, Met, Ile, Ala, Val or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in postion 27 is Gly or none <400> 61 Xaa Xaa Ile Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 62 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa in position 6 is Norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Norleucine <400> 62 Lys Phe Ile Ile Pro Xaa Phe Ser Ala Leu Gly Gly Ala Ile Ser Tyr 1 5 10 15 Asp Leu Asn Thr Xaa Leu Asn Cys Ile 20 25 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa in position 6 is Norleucine <400> 63 Lys Phe Ile Ile Pro Xaa Phe Ser Ala Leu Ser Gly Gly Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Asp Leu Asn Thr Phe Leu Asn Cys Ile Gly 20 25 <210> 64 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 64 Arg Phe Ile Ile Pro Asn Leu Phe Thr Ala Leu Ser Gly Gly Arg Arg 1 5 10 15 Ala Leu Leu Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr Ala Ile Gly 20 25 <210> 65 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in position 5 is Norleucine <400> 65 Lys Ile Ile Pro Xaa Phe Ser Ala Leu Gly Gly Gly Arg Leu Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Pro Tyr Ala Ile Gly 20 <210> 66 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in position 5 is Norleucine <400> 66 Arg Ile Ile Pro Xaa Phe Thr Ala Leu Ser Gly Gly Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr Ala Ile Gly 20 25 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 68 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 Asn Ile Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Gly Gly Gly Asp Ile Tyr 1 5 10 15 Lys Arg Trp Gln Ala Leu Cys Leu 20 <210> 71 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in position 5 is Norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa in position 20 is Norleucine <400> 71 Trp Ile Ile Pro Xaa Phe Ser Ala Leu Gly Gly Ala Ile Ser Tyr Asp 1 5 10 15 Leu Asn Thr Xaa Leu Asn Cys Ile 20

Claims (43)

  1. 인간 면역결핍 바이러스 I(HIV) 같은 그러한 바이러스로 감염된 인간에서 HIV 같은 인간 레트로바이러스 감염을 치료하는 방법으로, 상기 방법은 (1) 대상자(subject)에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들 및/또는 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물; 및 (2) 히스톤 디아셀틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제(reservoir purging agent), 및/또는 면역조절성 화합물을 개별적으로, 어떠한 순서에서 연속적으로 또는 동시적으로 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 대상자에 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들의 투여를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물의 투여를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 상기 화합물은 gp41의 트랜스막(transmembrane) 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인 간의 연결(association)을 안정화시키는 항체들을 유도하는 면역원인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 면역조절성 화합물의 투여를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제의 투여를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역조절성 화합물들은 MDX-1106 (Merck) 같은 항-PD1 항체들, THALOMID® (탈리도마이드), 항-PD1 항체들, 사이클로포스파미드, 레바미솔, 레날리도마이드, CC-4047 (포말리도마이드), CC-11006 (셀진), 및 CC-10015 (셀진), 및 WO2007028047, WO2002059106, 및 WO2002094180 중 어느 하나에 기재되어 있는 면역조절성 화합물로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역조절성 화합물은 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역조절성 화합물은 레날리도마이드인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 상기 병원소 퍼징제는 M344 (4-(디메틸아미노)-N-[7-(하이드록시아미노)-7-옥소헵틸]벤즈아미드), 치다마이드 (CS055/HBI-800), 4SC-202, (4SC), 레스미노스타트 (4SC), 보리노스타트 (SAHA), 벨리노스타트 (PXD101), LAQ824, 트리코스타틴 A 및 파노비노스타트 (LBH589) 같은 하이드록사믹산들; 엔티노스타트 (MS-275), CI994, 및 모세티노스타트(MGCD0103) 같은 벤즈아미드들, 환형 테트라펩타이드들(예컨대, 트라폭신 B 같은 트라폭신), 및 로미뎁신 (ISTODAX) 같은 뎁시펩타이드들, 친전자성 케톤들, 및 페닐부티레이트, 벨프로산, 옥삼플라틴, ITF2357 (기비노스타트 제네릭), 아피시딘, MC1293, CG05, 및 CG06 같은 지방족산 화합물들; NF-카파B를 포함하는 전사인자들을 활성화시키는 화합물들, 프로스트라틴, 아우라노핀, 브리오스타틴, 비발암성 포르볼 에스테르, DPP (12-데옥시포르볼-13-페닐아세테이트), PMA, 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA); P-TEF-b 키나제 및 헥사메틸비스아세트아미드(HMBA)를 포함하는 HIV mRNA 연장을 활성화시키는 화합물들; IL-7; 항-CD3/CD28을 포함하는 T-세포 자극성 인자들 - T-세포 자극성 항체들; 티르포스틴(Tyrphostin) A, 티르포스틴 B, 및 티르포스틴 C를 포함하는 키나제 억제제들; SF1670 (Echelon Bioscience), 디술피람 (DSF)을 포함하는 PTEN (포스파타제 및 텐신 상동체) 유전자 억제제들, 아세트알데하이드 디하이드로게나제의 억제제, bpV(HOpic), bpV(phen), 및 bpV(pic) (Calbiochem; EMD Millipore)을 포함하는 단백질 타이로신 포스파타제 억제제들, 톨-유사(Toll-like) 수용체-9 (TLR9) 및 톨-유사 수용체-7 (TLR9) 아고니스트들을 포함하는 톨-유사 수용체들 아고니스트들, 퀘르세틴, 리포산, 나트륨 부티레이트, TNF-알파, PHA 및 Tat로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 병원소 퍼징제는 로미뎁신인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 상기 하나 이상의 펩타이드는:
    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa20 (서열번호 47);
    상기 위치 1의 Xaa는 Lys 또는 Arg,
    상기 위치 2의 Xaa는 Ala, Gly, Ser 또는 Arg,
    상기 위치 3의 Xaa는 Leu 또는 Met,
    상기 위치 4의 Xaa는 Gly 또는 Arg,
    상기 위치 5의 Xaa는 Pro, Thr, Val, Ser, Gln 또는 Ala,
    상기 위치 6의 Xaa는 Gly, Ala, Lys, Arg, Gln 또는 Glu,
    상기 위치 8의 Xaa는 Thr 또는 Ser,
    상기 위치 9의 Xaa는 Leu 또는 Ile,
    상기 위치 14의 Xaa는 Thr, Ser 또는 Val,
    상기 위치 15의 Xaa는 Ala 또는 Ser,
    상기 위치 16의 Xaa는 Cys 또는 Ser,
    상기 위치 17의 Xaa는 Gln 또는 Leu,
    상기 위치 18의 Xaa는 Gly, Glu 또는 Arg, 및
    상기 위치 20의 Xaa는 Gly 또는 Arg인 아미노산 서열;

    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 Tyr Xaa15 Pro Xaa17 Xaa18 Ile Leu Xaa21 Xaa22 (서열번호 50);
    상기 위치 1의 Xaa는 Arg, Lys, Asp 또는 없고,
    상기 위치 2의 Xaa는 Trp, Gly, Lys 또는 Arg,
    상기 위치 3의 Xaa는 Ile, Leu, Val 또는 Met,
    상기 위치 4의 Xaa는 Ile, Val 또는 Leu,
    상기 위치 5의 Xaa는 Leu, Met, Val 또는 Pro,
    상기 위치 12의 Xaa는 Arg 또는 Lys,
    상기 위치 13의 Xaa는 Met 또는 Leu,
    상기 위치 15의 Xaa는 Ser, Cys 또는 Gln,
    상기 위치 17의 Xaa는 Thr, Val, Ile, Ser 또는 Ala,
    상기 위치 18의 Xaa는 Ser, Gly 또는 Thr,
    상기 위치 21의 Xaa는 Asp, Glu, Cys 또는 Gly,
    상기 위치 22의 Xaa는 Gly 또는 없으며, n = 0,1,2 또는 3인 아미노산 서열;

    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Ile Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 (서열번호 55);
    상기 위치 1의 Xaa는 Asn, Ser, Gly, His, Ala, Pro, Arg 또는 없고,
    상기 위치 2의 Xaa는 Asn, Ala 또는 Lys,
    상기 위치 3의 Xaa는 Pro, Gln, Gly, Ile 또는 Leu,
    상기 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ala,
    상기 위치 8의 Xaa는 Gly 또는 Lys,
    상기 위치 9의 Xaa는 Glu, Asp, Lys, Phe 또는 Thr,
    상기 위치 10의 Xaa는 Ile, Met, Val 또는 Leu,
    상기 위치 11의 Xaa는 Tyr, Leu 또는 없으며,
    상기 위치 12의 Xaa는 Ser 또는 없고,
    상기 위치 13의 Xaa는 Arg 또는 없으며,
    상기 위치 14의 Xaa는 Asp, Arg, Trp, Ala 또는 없고,
    상기 위치 15의 Xaa는 Ile 또는 없으며,
    상기 위치 16의 Xaa는 Tyr 또는 없고,
    상기 위치 17의 Xaa는 Lys 또는 Arg,
    상기 위치 18의 Xaa는 Arg, Lys 또는 Asp,
    상기 위치 19의 Xaa는 Trp 또는 Gly,
    상기 위치 20의 Xaa는 Ile, Met, Val, Gln 또는 Ala,
    상기 위치 21의 Xaa는 Ile, Val 또는 Ala,
    상기 위치 22의 Xaa는 Leu, Met 또는 Val,
    상기 위치 23의 Xaa는 Gly 또는 Cys,
    상기 위치 24의 Xaa는 Leu 또는 없으며,
    n = 1,2 또는 3인 아미노산 서열, 및

    Xaa1 Xaa2 Ile Ile Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 [Gly]n [Arg]m Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 (서열번호 61);
    상기 위치 1의 Xaa는 Pro, Lys, Arg 또는 없으며,
    상기 위치 2의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Lys,
    상기 위치 5의 Xaa는 Pro 또는 Thr,
    상기 위치 6의 Xaa는 Met, Thr 또는 Nleu,
    상기 위치 7의 Xaa는 Phe 또는 Leu,
    상기 위치 8의 Xaa는 Ser, Thr, Ala 또는 Met,
    상기 위치 9의 Xaa는 Ala, Glu 또는 Leu,
    상기 위치 11의 Xaa는 Ser 또는 없고,
    상기 위치 12의 Xaa는 Ala, Arg 또는 없으며,
    상기 위치 13의 Xaa는 Ile, Leu 또는 없고,
    상기 위치 14의 Xaa는 Ser, Ala, Leu 또는 없으며,
    상기 위치 15의 Xaa는 Tyr, Glu 또는 Asp,
    상기 위치 16의 Xaa는 Gly 또는 Asp,
    상기 위치 17의 Xaa는 Ala 또는 Leu,
    상기 위치 18의 Xaa는 Thr, Ile, Val, Leu 또는 Asn,
    상기 위치 19의 Xaa는 Pro, Thr 또는 Ser,
    상기 위치 20의 Xaa는 Tyr, Phe, Nleu, His 또는 Gln,
    상기 위치 21의 Xaa는 Asp, Asn, Leu 또는 Ala,
    상기 위치 22의 Xaa는 Leu, Ile, Val 또는 Asn,
    상기 위치 23의 Xaa는 Asn, Tyr, Cys 또는 Gly,
    상기 위치 24의 Xaa는 Thr, Met, Ile, Ala, Val 또는 없고,
    상기 위치 25의 Xaa는 Gly 또는 없으며,
    서로에게 독립적인 n = 1, 2 또는 3 및 m= 0, 1, 2 또는 3인 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드로, 각 HIV 특이적 펩타이드의 말단들은 프리 카르복실- 또는 아미노-그룹, 아미드, 아실 또는 아세틸일 수 있거나,
    또는 상기 HIV 특이적 펩타이드들 중 어느 하나의 염인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 HIV-특이적 펩타이드의 2개 이상의 Cys 잔기들은 체인내- 또는 체인간 이황화 결합(disulphide binding), -S-(CH2)p-S- 또는 -(CH2)p-브릿지(bridge)의 일부를 형성할 수 있고, 선택적으로 O, N 및 S 같은 하나 이상의 헤테로원자들에 의해 선택적으로 중재되는 p = 1-8이고/이거나 상기 펩타이드 서열들은 고형 지지체(solid support)에 고정되어 있는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열번호 47의 아미노산 서열은 서열번호 48 및 서열번호 49의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호 50의 아미노산 서열은 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호 55의 아미노산 서열은 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호 61의 아미노산 서열은 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드는 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55 및 서열번호 61의 각 군들로부터 선택되는 최소 2개, 3개 또는 4개의 펩타이드들을 포함하는 것인 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 최소 하나의 HIV-특이적 펩타이드는 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 57 및 서열번호 64의 펩타이드들, 또는 이의 염으로 구성되거나 또는 포함하는 것인 방법.
  20. 제4항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역원은:
    - 0 내지 4개 사이의 아미노산 치환들을 포함하는 HIV gp120의 C5 도메인의 13개의 아미노산 잔기 아미노산 서열의 아미노산 서열, 이의 부분서열, 또는 상기 아미노산 서열 또는 부분서열의 인버소(inverso)-, 레트로(retro)- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 첫 번째 펩타이드, 및
    - gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치(stretch) 또는 서열번호 6 내지 서열번호 13 중 어느 하나에 존재하는 아미노산 스트레치 또는 gp41의 트랜스막 도메인에 존재하거나 또는 gp120의 불변 C2 도메인에 존재하는 아미노산 스트레치의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 최소 하나의 두 번째 펩타이드를 포함하는 펩타이드 멀티머(multimer)로, 상기 펩타이드 멀티머는 gp41의 트랜스막 도메인 및/또는 gp120의 불변 C2 도메인과 HIV gp120의 C5 도메인의 연결에 결합하고 안정화시킬 수 있는 항체를 유도할 수 있고, 상기 펩타이드 멀티머는 gp120 내 C5의 N-말단 아미노산들이 부족한 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식:

    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (I)

    을 가지는 아미노산 서열로, X1은 Thr이고, X2는 Lys, Arg, Har 및 Glu로부터 선택되며, X3은 Ala 및 Val로부터 선택되고, X4는 Arg, Har, Lys 및 Cit(시트룰린)로부터 선택되며, X5는 Arg, Har, Lys 및 Cit로부터 선택되고, X6은 Arg, Har, Lys 및 Cit로부터 선택되며, X7은 Val, Leu, Ile 및 Nle(노르루이신)로부터 선택되고, X8은 Val, Leu, Ile 및 Nle로부터 선택되며, X9는 Gln, Glu, Asn 및 Asp로부터 선택되고, X10은 Arg, Har 및 Cit로부터 선택되며, X11은 Glu 및 Asp로부터 선택되고, X12는 Lys이며, X13은 Arg, Har 및 Cit로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나,
    또는 화학식 I의 아미노산 서열의 부분서열을 포함하거나, 또는 상기 아미노산 서열 또는 부분서열의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식 I을 가지는 아미노산 서열의 N-말단에 결합된 디펩타이드(dipeptide) Ala-Pro를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 첫 번째 펩타이드는 화학식 I을 가지는 아미노산 서열의 C-말단에 결합된 디펩타이드 X14-X15를 추가적으로 포함하고, X14는 Ala 및 Val로부터 선택되며 X15는 Val, Leu 및 Nle로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 최소 두 번째 펩타이드는 화학식:
    Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17 (III)
    을 가지는 아미노산 서열로, Z1은 Asp이며, Z2는 Arg이고, Z3은 Pro이며, Z4는 Glu 또는 Gly이고, Z5는 Gly 또는 Arg이며, Z6은 Ile이고, Z7은 Glu이며, Z8은 Glu이고, Z9는 Glu이며, Z10은 Gly이고, Z11은 Gly이며, Z12는 Glu 또는 없고, Z13은 Arg 또는 Gln이며, Z14는 Asp 또는 Gly이고, Z15는 Arg 또는 Lys이며, Z16은 Asp 또는 Gly이고, Z17은 Arg인 아미노산 서열을 포함하거나,
    또는 화학식 (III)의 부분서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 두 번째 펩타이드는 화학식 III으로부터 유래되는 최소 5개의 연속 아미노산 잔기들을 포함하는 것인 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 첫 번째 펩타이드와 최소 하나의 두 번째 펩타이드는 링커를 통해 연결되는 것인 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 링커는 비스-말레이미드 링커, 이황화(disulfide) 링커, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커, 글라이신 링커, 라이신 링커 및 아르기닌 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 첫 번째 펩타이드 및 최소 하나의 두 번째 펩타이드 중 최소 하나는 아미드화, 아실화, 또는 아세틸화 같은 N- 또는 C-말단 변형을 포함하는 것인 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는 면역원성 담체 같은 담체 분자와 커플링되어 있는 것인 방법.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 담체는 바이러스 유사 입자(virus like particle)인 것인 방법.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 첫 번째 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44 또는 이의 단편, 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44 또는 이의 단편으로부터 선택되는 펩타이드의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 두 번째 펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 이의 단편, 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 이의 단편으로부터 선택되는 펩타이드의 인버소-, 레트로- 또는 레트로-인버소 형태로 구성된 군으로부터 선택되고/선택되거나, 상기 펩타이드 멀티머는 서열번호 1 내지 서열번호 46을 가지는 펩타이드들로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는 최대 70개의 아미노산들을 포함하는 것인 방법.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는 최소 6개의 아미노산 잔기들을 포함하는 것인 방법.
  34. 제20항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 및 70개의 아미노산 잔기들로 구성된 군으로부터 선택되는 다수의 아미노산 잔기들로 구성되는 것인 방법.
  35. 제20항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는 서열번호 28과 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화-결합된 펩타이드, 서열번호 30과 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화-결합된 펩타이드, 또는 서열번호 32와 서열번호 29, 서열번호 31, 및 서열번호 33 중 어느 하나 간의 이황화-결합된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    또는 서열번호 38과 서열번호 39, 서열번호 40; 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 68 중 어느 하나 간의 시스테인-라이신 결합된 펩타이드, 또는 서열번호 41과 서열번호 39, 서열번호 40; 서열번호 42, 및 서열번호 43 중 어느 하나 간의 시스테인-라이신 결합된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는:
    CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (서열번호 28)
    |
    CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (서열번호 29),
    CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (서열번호 30)
    |
    CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG (서열번호 31),
    CGGAEEEVVGGDQQLL (서열번호 32)
    |
    GCGGAKRRVVGGAKRRVV (서열번호 33),

    GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (서열번호 38)
    |
    GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR (서열번호 39),
    GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (서열번호 38)
    |
    GKGGIEEEGGERDRDRGGQDRDR (서열번호 40),
    GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (서열번호 41)
    |
    GKGGIEEEGGQDRDRGGRDRDR (서열번호 42),
    GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (서열번호 41)
    |
    GKGGIEEEGGEQDRDRGGERDRD (서열번호 43) 및
    GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(서열번호 38)
    |
    GKGGIEEEGGRDRDRGGQDRDR (SEQ ID NO:68)
    또는 이들 중 어느 하나의 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제20항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 멀티머는 (H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-옥소-에틸)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2) (H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2), 아세테이트 염(Cys(2-옥소-에틸)10 (A-체인) 및 Lys2 (B-체인) 간의 아미드 결합)인 것인 방법.
  38. a) 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들 및/또는 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물; 및
    b) 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제, 및/또는 면역조절성 화합물
    을 포함하는 조성물.
  39. (i) 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들 및 (ii) 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물 중 최소 하나; 및 (iii) 히스톤 디아셀틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제, 및 (iv) 면역조절성 화합물 중 최소 하나를 포함하는 약제학적 조성물로; 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 보조제, 희석제 또는 담체와 조합되는 것인 약제학적 조성물.
  40. 구성성분 (i) 및 (ii) 중 최소 하나 및 구성성분 (iii) 및 (iv) 중 최소 하나를 포함하는 부품-키트(kit-of-parts)로, 상기 구성성분들 중 최소 2개는 서로에 대해 개별적으로 제형화되고, 각 구성성분은 선택적으로 하나의 약제학적으로-허용가능한 보조제, 희석제 또는 담체와 조합된 혼합물(admixture)로 제형화되는 것인 부품-키트.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물 또는 부품-키트는 제2항 내지 제37항 중 어느 하나에 특정된 대로 대상자에서 세포-매개된 면역반응을 유발시키는 하나 이상의 펩타이드들 및/또는 대상자에서 체액성 면역을 자극하는 화합물; 및 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제 같은 병원소 퍼징제, 및/또는 면역조절성 화합물을 포함하는 것인 조성물 또는 부품-키트.
  42. 제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 레트로바이러스 감염은 HTLV-1 (인간 T-림프영양성 바이러스), HTLV-II (인간 T-림프영양성 바이러스), HIV-1 및 HIV-2를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스, 및 이의 어떠한 서브타입으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 인간 레트로바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스-1 감염인 것인 방법.
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