KR20190136048A - 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
렌티바이러스 입자를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시된다. 렌티바이러스 벡터 시스템은 치료적 벡터를 포함한다. 치료적 벡터는 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, 여기서 PAH 서열은 절두된다.
Description
관련
출원에 대한 교차
-참조
본 출원은 그 개시물이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 가출원 번호 62/480,962 (2017 년 4 월 3 일 출원, 명칭 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PHENYLKETONURIA") 및 U.S. 가출원 번호 62/491,118 (2017 년 4 월 27 일 출원, 명칭 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PHENYLKETONURIA") 에 대해 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명의 양태는 페닐케톤뇨증 (PKU) 을 치료하기 위한 유전적 약물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 양태는 PKU 를 치료하기 위해 PAH-함유 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 것에 관한 것이다.
페닐케톤뇨증 (PKU) 은 혈액 내 페닐알라닌 농도 증가, 또는 고페닐알라닌혈증을 유발할 수 있는 장애의 이종 군을 나타낸다. 고페닐알라닌혈증은 치료받지 않은 채로 있다면 영향을 받는 어린이에서의 지적 장애, 발작, 행동 문제 및 손상된 성장 및 발달을 일으킬 수 있다. 고페닐알라닌 혈증이 지적 장애를 초래하는 메커니즘은 고용량 페닐알라닌의 놀라운 독성을 반영하며 신경계 조직의 저수초화 또는 탈수초화를 포함한다. PKU는 북미에서 12,000 건 중 1 건의 평균 보고 발생률을 가지며, 남성과 여성에게 동일하게 영향을 준다. 이 장애는 유럽인 또는 아메리카 원주민 조상에서 가장 흔하며 동부 지중해 지역에서 훨씬 높은 수준에 이른다.
PKU 환자의 신경학적 변화는 생후 1 개월 이내에 입증되었으며, 성인 PKU 환자의 자기 공명 영상 (MRI) 은 뇌에서의 백질 병변을 보여주었다. 이러한 병변의 크기와 수는 혈액 페닐알라닌 농도와 직접적으로 관련된다. 대조군 대상과 비교하여 PKU 를 갖는 청소년 및 성인의 인지 프로파일은 현저하게 감소된 IQ, 처리 속도, 운동 제어 및 억제 능력, 및 주의력 시험에서의 수행 감소를 포함할 수 있다.
PKU 의 대부분은 간 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 의 결핍으로 인해 야기된다. PAH 는 분자 산소 및 촉매량의 테트라히드로바이오프테린 (BH4), 그의 비단백질 보조인자의 존재 하에 페닐알라닌 (Phe) 의 티로신 (Tyr) 으로의 히드록실화를 촉매화하는 다량체성 간 효소이다. PAH 의 충분한 발현의 부재 하에, 혈액 내 페닐알라닌 수치 증가는 PKU 환자에서 고페닐알라닌혈증 및 유해한 부작용을 일으킨다. PAH 활성의 감소 또는 부재는 티로신, 및 멜라닌, l-티록신 및 카테콜아민 신경전달물질 (도파민을 포함) 을 포함하는 그의 다운스트림 생성물의 결핍을 유발할 수 있다.
PKU 는 PAH 에서의 돌연변이 및/또는 PAH 보조인자 (즉, BH4) 의 합성 또는 재생 결함에 의해 유발될 수 있다. 특히, 몇몇 PAH 돌연변이는 소포체에서의 단백질 폴딩에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 효소 촉매 활성을 약화시키거나 크게 철폐시키는 단백질 구조에서의 미스센스 돌연변이 (63%) 및 작은 결실 (13%) 로 인한 가속화된 분해 및/또는 응집을 초래한다.
일반적으로, 혈장 Phe 수준, Phe 에 대한 식이 내성 및 치료요법에 대한 잠재적 반응성을 기반으로 하여 PKU 를 분류하기 위해 3 개의 주요 표현형 군이 사용된다. 이들 군은 고전적 PKU (Phe > 1200 μM), 비정형 또는 경증 PKU (Phe 가 600 - 1200 μM 임) 및 영구적인 경증 고페닐알라닌혈증 (HPA, Phe 120 - 600 μM) 을 포함한다.
PKU 의 검출은 보편적 신생아 스크리닝 (NBS) 에 의존한다. 힐 스틱 (heel stick) 으로부터 채취한 혈액 1 점적을 미국의 모든 50 개 주에서 필수인 스크린에서 페닐알라닌 수치에 대해 검사한다.
현재, Phe 및 BH4 보충의 평생 식이 제한은 PKU 에 대해 유일하게 이용가능한 두 가지 치료 옵션이며, 영향받은 영아에서 최적의 임상 결과를 보장하기 위해 조기 치료 개입이 중요하다. 그러나, 고가의 약물 치료와 특수 저-단백 식품은, 특히 이들 제품이 민감 의료 보험에 의해 완전히 커버되지 않는 경우, 영양결핍, 심리사회적 또는 신경인지적 합병증으로 이어질 수 있는 환자에 대한 큰 부담을 부과한다. 또한, BH4 치료요법은 BH4 생합성에서의 결함과 관련된 바에 따라 경증 고페닐알라닌혈증의 치료에 주로 효과적인 반면, 경증 또는 고전적 PKU 를 갖는 환자의 오직 20-30% 만이 반응성이다. 따라서, 과도한 Phe-제한 식단에 대한 대안으로서 PKU 를 위한 새로운 치료 방식이 절실히 필요하다. 따라서, 페닐케톤뇨증의 치료를 위한 대안적 방법을 개발하는 것이 바람직할 것이다. 유전적 약물은 PKU 를 효과적으로 치료하는 가능성을 갖는다.
발명의 개요
한 양태에서, 바이러스 벡터가 개시된다. 바이러스 벡터는 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, 여기서 PAH 서열은 절두된다. 구현예에서, PAH 서열은 서열의 3' 미번역 부위 (UTR) 에서 절두된다. 구현예에서, PAH 서열은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4 중 적어도 하나와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성 중 적어도 하나를 포함한다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 추가로 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열은 전장 3' 미번역 부위 (UTR) 를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열은 PAH mRNA 서열이다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 shRNA 를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6 중 적어도 하나와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성 중 적어도 하나를 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 제 1 프로모터의 제어 하에 있으며, PAH 서열은 제 2 프로모터의 제어 하에 있다. 구현예에서, 제 1 프로모터는 H1 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 제 2 프로모터는 간-특이적 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함한다.
또 다른 양태에서, 바이러스 벡터가 개시된다. 바이러스 벡터는 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체, 및 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 포함한다. 구현예에서, PAH 서열은 SEQ ID NO: 1 과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성 중 적어도 하나를 포함한다.
또 다른 양태에서, 패키징 세포에 의해 생성되며 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자가 개시된다. 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 외피 단백질을 포함하고, 바이러스 벡터는 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체, 및 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 포함한다. 구현예에서, 표적 세포는 간 세포, 근육 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 신경내분비 세포, 내분비 세포, 림프구, 골수 세포, 고형 기관 내에 존재하는 세포, 또는 조혈 계통의 세포, 조혈모세포, 또는 전구체 조혈모세포 중 적어도 하나이다.
또 다른 양태에서, 대상에서의 페닐케톤뇨증 (PKU) 의 치료 방법이 개시된다. 방법은 패키징 세포에 의해 생성되며 표적 세포를 감염시킬 수 있는 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 외피 단백질, 및 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체, 및 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
구현예에서, 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자는 복수의 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다. 구현예에서, 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자는 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다. 구현예에서, 대상은 자궁내 (in utero) 에 있다. 구현예에서, 방법은 PKU 표현형과 상호연관되는 대상에서의 PKU 유전자형을 진단하는 것을 추가로 포함한다. 구현예에서, 진단하는 것은 대상에서의 태아기 스크리닝 동안 발생한다. 구현예에서, 진단하는 것은 투여하기 전에 발생한다.
또 다른 양태에서, 대상에서의 페닐케톤뇨증 (PKU) 치료를 위한 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자의 용도가 개시된다. 렌티바이러스 입자는 패키징 세포에 의해 생성되고, 표적 세포를 감염시킬 수 있으며, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 외피 단백질, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, 여기서 PAH 서열은 절두된다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체, 및 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 다른 양태 및 이점은 예로서 본 발명의 양태를 설명하는 수반되는 도면과 함께 취해져, 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1 은 원형화된 형태의 예시적 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 2 는 원형화된 형태의 예시적 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 3 은 원형화된 형태의 예시적 3-벡터 아데노-관련 바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 4 는: (A) PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 선형 맵; 및 (B) PAH shRNA 서열 및 PAH 서열을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 선형 맵을 도시한다.
도 5 는 완전한 5' 및 3' UTR 을 포함하는 페닐알라닌 히드록실라아제 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) 을 도시한다.
도 6 은 완전한 5' UTR 및 절두된 3' UTR 을 포함하는 페닐알라닌 히드록실라아제 오픈 리딩 프레임을 도시한다.
도 7 은 인간 및 마우스 PAH 유전자에 대한 발현 수준을 비교하는 면역블롯 데이터를 도시한다.
도 8 은 Hepa1-6 세포에서 3' UTR 부위를 갖거나 갖지 않는 hPAH 의 렌티바이러스-전달된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 9 는 Hepa1-6 세포에서 절두된 3' UTR 을 갖는 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 결과를 도시한다.
도 10 은 마우스 Hepa1-6 세포에서 WPRE 를 갖거나 갖지 않는 코돈-최적화된 hPAH 의 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 11 은 shPAH-1 및 shPAH-2 가 인간 Hep3B 세포에서 hPAH 발현을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 12 는 Hep3B 세포에서 내인성 hPAH 및 hAAT-hPAH-3'UTR289 의 shPAH-1 억제를 입증하는 데이터를 도시한다.
도 13 은 shPAH-2 가 HepG2 세포에서 내인성 hPAH 를 억제하나 hAAT-hPAH-3'UTR289 는 억제하지 않는다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 14 는 hAAT-PAH-UTR 을 갖는 Pah(enu2) 마우스 치료의 결과를 입증하는 데이터를 도시한다. 도 14A 는 그에 도시된 군에 대한 8 주에 걸친 체중 변화를 도시한다. 도 14B 는 그에 도시된 군에 대한 8 주에 걸친 체중 변화를 도시한다. 도 14C 는 그에 도시된 군에 대한 8 주에 걸친 체중 변화를 도시한다. 도 14D 는 처리 후 1 개월에 걸친 페닐알라닌의 수준을 도시한다.
도 15 는 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (hepatoma cell) 에서 hAAT 및 CMV 프로모터를 사용하는 인간 PAH 유전자의 렌티바이러스-전달된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 16 은 마우스 Hepa1-6 세포에서 hAAT 프로모터 및 간-특이적 인핸서 요소 ApoE (1), ApoE (2), 또는 프로트롬빈을 갖는 발현 구축물을 사용하는 hPAH 의 렌티바이러스-전달된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 2 는 원형화된 형태의 예시적 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 3 은 원형화된 형태의 예시적 3-벡터 아데노-관련 바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 4 는: (A) PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 선형 맵; 및 (B) PAH shRNA 서열 및 PAH 서열을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 선형 맵을 도시한다.
도 5 는 완전한 5' 및 3' UTR 을 포함하는 페닐알라닌 히드록실라아제 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) 을 도시한다.
도 6 은 완전한 5' UTR 및 절두된 3' UTR 을 포함하는 페닐알라닌 히드록실라아제 오픈 리딩 프레임을 도시한다.
도 7 은 인간 및 마우스 PAH 유전자에 대한 발현 수준을 비교하는 면역블롯 데이터를 도시한다.
도 8 은 Hepa1-6 세포에서 3' UTR 부위를 갖거나 갖지 않는 hPAH 의 렌티바이러스-전달된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 9 는 Hepa1-6 세포에서 절두된 3' UTR 을 갖는 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 결과를 도시한다.
도 10 은 마우스 Hepa1-6 세포에서 WPRE 를 갖거나 갖지 않는 코돈-최적화된 hPAH 의 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 11 은 shPAH-1 및 shPAH-2 가 인간 Hep3B 세포에서 hPAH 발현을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 12 는 Hep3B 세포에서 내인성 hPAH 및 hAAT-hPAH-3'UTR289 의 shPAH-1 억제를 입증하는 데이터를 도시한다.
도 13 은 shPAH-2 가 HepG2 세포에서 내인성 hPAH 를 억제하나 hAAT-hPAH-3'UTR289 는 억제하지 않는다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 14 는 hAAT-PAH-UTR 을 갖는 Pah(enu2) 마우스 치료의 결과를 입증하는 데이터를 도시한다. 도 14A 는 그에 도시된 군에 대한 8 주에 걸친 체중 변화를 도시한다. 도 14B 는 그에 도시된 군에 대한 8 주에 걸친 체중 변화를 도시한다. 도 14C 는 그에 도시된 군에 대한 8 주에 걸친 체중 변화를 도시한다. 도 14D 는 처리 후 1 개월에 걸친 페닐알라닌의 수준을 도시한다.
도 15 는 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (hepatoma cell) 에서 hAAT 및 CMV 프로모터를 사용하는 인간 PAH 유전자의 렌티바이러스-전달된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 16 은 마우스 Hepa1-6 세포에서 hAAT 프로모터 및 간-특이적 인핸서 요소 ApoE (1), ApoE (2), 또는 프로트롬빈을 갖는 발현 구축물을 사용하는 hPAH 의 렌티바이러스-전달된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.
상세한 설명
개시물의
개괄
본 개시물은 치료적 벡터 및 이의 세포에 대한 전달에 관한 것이다. 구현예에서, 치료적 벡터는 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 구현예에서, 치료적 벡터는 또한 숙주 (내인성) PAH 발현을 표적으로 하는 작은 RNA 를 포함한다.
정의 및 해석
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시물과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 개시물의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 공지된 종래의 방법에 따라, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 다음을 참조한다: Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 임의의 효소 반응 또는 정제 기법은 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조사의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기법은 당업계에 잘 공지되며 통상적으로 사용되는 것들이다.
상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형 형태는 문맥에서 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수형 형태와 상호교환가능하게 사용되며 복수형 형태를 포함하는 것 뿐만 아니라 각각의 의미 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "및/또는" 은 하나 이상의 열거된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라 대안으로 해석될 때의 조합 부족 ("또는") 을 나타내며 포함한다.
모든 숫자 지정, 예를 들어 범위를 포함하는, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 0.1 씩 증가하여 (+) 또는 (-) 로 변동되는 근사치이다. 항상 명확하게 언급되지 않더라도, 모든 수치 지정은 용어 "약" 이 선행된다는 것이 이해된다. 항상 명확하게 언급되지 않더라도, 본원에서 기재되는 시약은 단지 예시적이며 이들의 등가물이 당업계에 공지되어 있다는 것이 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 은 당업자에 의해 이해될 것이며 사용되는 문맥에 따라서 어느 정도 가변적일 것이다. 사용되는 문맥을 고려했을 때 당업자에게 분명하지 않은 용어가 사용되는 경우, "약" 은 특정한 용어의 10% 까지를 더하거나 뺀 것을 의미할 것이다.
용어 활성제의 "투여" 또는 활성제를 "투여하는" 은 개인의 신체에 치료적으로 유용한 형태 및 치료적 유효량으로 도입될 수 있는 형태로 치료를 필요로 하는 대상에게 활성제를 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하지만 다른 것은 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우 "~로 본질적으로 이루어지는" 은 조성물 또는 방법에 임의의 필수적인 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. "~로 이루어지는" 은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대한 다른 구성성분의 미량 초과의 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의되는 구현예는 본 개시물의 범주 내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물이 추가의 단계 및 성분을 포함할 수 있거나 (포함하는), 대안적으로, 중요하지 않은 단계 또는 조성물을 포함하거나 (본질적으로 이루어지는), 또는 대안적으로, 오직 언급된 방법 단계 및 조성물을 의도하는 (이루어지는) 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현", "발현된" 또는 "인코딩하는" 은 폴리뉴클레오티드가 mRNA 로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA 가 이후 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA 의 스플라이싱 또는 전사후 변형 또는 번역후 변형의 다른 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 "PKU" 로도 나타내는 용어 "페닐케톤뇨증" 은 페닐알라닌 히드록실라아제의 만성적 결핍 뿐만 아니라 경증 및 고전적 형태의 질환을 포함하여 이와 관련된 모든 증상을 지칭한다. 따라서, "페닐케톤뇨증" 의 치료는 PKU 와 관련된 모든 또는 일부 증상의 치료에 관한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "페닐알라닌 히드록실라아제" 는 또한 본원에서 PAH 로도 지칭될 수 있다. 인간 PAH 는 또한 본원에서 hPAH 로도 지칭될 수 있다. 마우스 PAH 는 또한 본원에서 mPAH 로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "shPAH" 는 PAH 를 표적으로 하는 작은 헤어핀 RNA 를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "hAAT-hPAH-3'UTR289" 은 또한 본원에서 U289 로도, 또는 일반적으로 이식유전자-발현 절두된 hPAH 3'UTR 로도, 또는 일반적으로 절두된 3' UTR 로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "hAAT-hPAH-3'UTR238" 은 또한 본원에서 U238 로도, 또는 일반적으로 이식유전자-발현 절두된 hPAH 3'UTR 로도, 또는 일반적으로 절두된 3' UTR 로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형 hPAH" 는 또한 본원에서 "내인성 PAH" 또는 "전장 PAH" 로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "절두된" 은 또한 본원에서 "단축된" 또는 "갖지 않는" 으로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체" 는 또한 본원에서 유사체 또는 변이로도 지칭될 수 있다. 변이체는 뉴클오티드 서열에 대한 임의의 치환, 결실 또는 부가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전적 약물" 또는 "유전적 약물들" 은 일반적으로 임상적 질환 또는 징후를 치료하기 위해 유전적 표적에 초점을 두는 치료제 및 치료 전략을 지칭한다. 용어 "유전적 약물"은 유전자 요법 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개인", "대상" 및 "환자" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 개별 포유동물 대상, 예를 들어 소, 개, 고양이, 말 또는 인간을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV" 는 일반적으로 "렌티바이러스" 를 지칭한다. 예를 들어, "LV-shPAH" 에 대한 언급은 PAH 를 표적으로 하는 shRNA 를 발현하는 렌티바이러스에 대한 언급이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키징 세포주" 는 렌티바이러스 입자를 발현하는데 사용될 수 있는 임의의 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일성 %" 는, 하기 기재된 서열 비교 알고리즘 중 하나 (예를 들어 BLASTP 및 BLASTN 또는 기타 숙련자가 이용가능한 기타 알고리즘) 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같은, 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때 동일한 특정 백분율의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라, "동일성 %" 는 비교되는 서열의 부위에 걸쳐, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로, 비교될 2 개 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재한다. 서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열을 그에 대해 비교하는 참조 서열로서 역할한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들) 의 서열 동일성 % 를 계산한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬을 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) 의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis. 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 에 의해, 또는 육안 검사에 의해 (일반적으로, 상기 Ausubel et al. 참조) 실시할 수 있다.
서열 동일성 % 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 알고리즘이며 이는 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)] 에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information) 웹사이트로부터 공개적으로 입수가능하다.
2 개 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 % 는 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램을 사용하여 (http://www.gcg.com 에서 이용가능), NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 중량 40, 50, 60, 70 또는 80 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 을 사용하여 측정될 수 있다. 2 개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 % 는 ALIGN 프로그램 (version 2.0) 에 통합된 E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) 의 알고리즘을 사용하여, PAM120 중량 잔류 테이블 (weight residue table), 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4 를 사용하여 또한 측정될 수 있다. 또한, 2 개 아미노산 서열 사이의 동일성 % 는 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com 에서 이용가능) 에 통합된 Needleman and Wunsch (J. Mol . Biol . (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 을 사용하여 측정될 수 있다.
본 개시물의 핵산 및 단백질 서열은 또한, 예를 들어 관련된 서열을 확인하기 위해 공개적 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열 (query sequence)" 로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 [Altschul, et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10] 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (version 2.0) 을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 개시물에서 제공된 핵산 분자와 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12 로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 개시물의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3 으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭화된 정렬 (gapped alignment) 을 수득하기 위해, Gapped BLAST 를 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402] 에서 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어 XBLAST 및 NBLAST) 의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한" 은 타당한 의료적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제점 또는 합병증이 합당한 이익/위험 비에 비례하지 않으면서, 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과 접촉하여 사용하기에 적합한 이러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 생리적으로 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 지칭하며 포함한다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 산 부가염 또는 염기 부가염을 포함할 수 있다 (예를 들어, Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66:1-19 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SEQ ID NO" 는 용어 "서열 ID 번호 (Sequence ID No)" 와 동의어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작은 RNA" 는 일반적으로 약 200 개 이하의 뉴클레오티드 길이이며 침묵 또는 간섭 기능을 갖는 비-코딩 RNA 를 지칭한다. 다른 구현예에서, 작은 RNA 는 약 175 개 이하의 뉴클레오티드, 약 150 개 이하의 뉴클레오티드, 약 125 개 이하의 뉴클레오티드, 약 100 개 이하의 뉴클레오티드, 또는 약 75 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 RNA 는 microRNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 이중가닥 RNA (dsRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 를 포함한다. 개시물의 "작은 RNA" 는 일반적으로 표적 유전자 mRNA 의 파괴를 초래하는 경로를 통해 표적 유전자의 유전자 발현을 억제 또는 녹다운시킬 수 있어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량" 은 특정한 질병, 상해, 질환 또는 병상을 앓고 있는 환자에서 보이는 합병증의 증상, 진행 또는 개시를 치료하거나 예방하기 위한, 적합한 조성물, 및 적합한 투약 형태 중 본 개시물의 활성제의 충분한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 환자의 병상의 상태 또는 이의 중증도, 및 치료하려는 대상의 연령, 체중 등에 따라 가변적일 것이다. 치료적 유효량은 예를 들어 투여 경로, 대상의 병상 뿐만 아니라 당업자에 의해 이해되는 기타 인자를 포함하는, 임의의 수많은 인자에 따라 가변적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 벡터" 는 비제한적으로, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 언급을 포함한다. 추가로, 렌티바이러스 벡터 시스템과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터" 는 용어 "플라스미드" 와 동의어이다. 예를 들어, 2-벡터 및 3-벡터 패키징 시스템을 포함하는 3-벡터 및 4-벡터 시스템은 또한, 3-플라스미드 및 4-플라스미드 시스템으로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는" 은 일반적으로 치료하는 대상의 자연적 과정을 변경시키려고 시도하는 중재술을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 저해, 감소 또는 억제, 질환 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도의 야기 또는 개선된 예후를 포함한다. 따라서 특정한 치료는 표적이 될 질환 상태, 및 의학적 치료요법의 현재 또는 미래 상태에 따라 좌우될 것이다. 치료는 관련된 독성을 가질 수 있다.
개시물의
양태 및
구현예의
설명
본 개시물의 한 양태에서, 바이러스 벡터가 개시된다. 바이러스 벡터는 치료적 카고 (cargo) 부분을 포함하며, 여기서 치료적 카고 부분은 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 구현예에서, PAH 서열 또는 변이체는 절두된다. 구현예에서, 절두되는 PAH 서열 또는 이의 변이체의 부분은 PAH 서열 또는 이의 변이체의 3' 미번역 부위 (UTR) 이다. 구현예에서, PAH 서열 또는 이의 변이체는 하기와 적어도 80%, 또는 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그 이상의 동일성 % 를 갖는 서열을 포함한다:
구현예에서, 변이체는 상기 기재된 서열 중 임의의 것으로 만들어질 수 있다. 구현예에서, PAH 서열 또는 이의 변이체는 (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 3) 또는 (SEQ ID NO: 4) 를 포함한다.
구현예에서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 전장 UTR 을 함유하는 상보적 mRNA 서열을 표적으로 한다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 절두된 UTR 을 함유하는 상보적 mRNA 서열을 표적으로 하지 않는다. 구현예에서, 절두된 UTR 은 본원에 확인된 절두된 서열 또는 이의 임의의 변이체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 구현예에서, 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열은 PAH mRNA 서열이다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 shRNA 를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 제 1 프로모터의 제어 하에 있으며, PAH 서열 또는 이의 변이체는 제 2 프로모터의 제어 하에 있다. 구현예에서, 제 1 프로모터는 H1 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 제 2 프로모터는 간-특이적 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 하기와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그 이상의 동일성 % 를 갖는 서열을 포함한다:
구현예에서, 변이체는 상기 기재된 서열로 만들어질 수 있다. 구현예에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 (SEQ ID NO: 5) 또는 (SEQ ID NO: 6) 을 포함한다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자가 개시된다. 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시키기 위해 최적화된 외피 단백질을 포함하고; 본원에 상세히 나타낸 바와 같은 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 구현예에서, 표적 세포는 간 세포이다.
또 다른 양태에서, 대상에서의 PKU 의 치료 방법이 개시된다. 방법은 본원에서 상세히 나타낸 바와 같은 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상에서의 PKU 의 예방 방법이 개시된다. 방법은 본원에서 상세히 나타낸 바와 같은 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 구현예에서, 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자는 복수의 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다. 구현예에서, 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자는 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다. 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의, 바이러스 벡터를 포함하는 제 1 렌티바이러스 입자 및 제 2 렌티바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 구현예에서, 제 1 렌티바이러스 입자는 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, 제 2 렌티바이러스 입자는 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상에서의 PKU 의 치료 또는 예방 방법이 개시된다. 구현예에서, 대상은 자궁내에 있다. 구현예에서, PKU 의 치료 또는 예방 방법은 PKU 표현형과 상호연관되는 대상에서의 PKU 유전자형을 진단하는 것을 추가로 포함한다. 구현예에서, PKU 의 치료 또는 예방 방법은 대상의 태아기 스크리닝 동안 진단을 포함한다. 그러나 구현예에서, 대상은 치료 전에 또는 치료 후에 언제라도 진단될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 다른 양태 및 이점은 예로서 본 발명의 양태를 설명하는 수반되는 도면과 함께 취해져, 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
페닐케톤뇨증
PKU 는 PAH 의 돌연변이 및/또는 PAH 보조인자 (즉; BH4) 의 합성 또는 재생 결함에 의해 유발된다고 여겨진다. 특히, 몇몇 PAH 돌연변이는 소포체에서의 단백질 폴딩에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 효소 촉매 활성을 약화시키거나 크게 철폐시키는 단백질 구조에서의 미스센스 돌연변이 (63%) 및 작은 결실 (13%) 로 인한 가속화된 분해 및/또는 응집을 초래한다. PAH 의 기능성에 영향을 줄 수 있는 수많은 돌연변이가 존재하므로, PKU 를 치료하기 위한 효과적인 치료적 접근방식은 비정상 PAH 및/또는 대체 PAH 가 투여될 수 있는 방식을 다룰 수 있다.
일반적으로, 3 가지 주요 표현형 군은 진단시 측정된 Phe 수준, Phe 에 대한 식이 내성 및 치료요법에 대한 잠재적 반응성을 기반으로 하여 PKU 에서 분류된다. 이들 군은 고전적 PKU (Phe > 1200 μΜ), 비정형 또는 경증 PKU (Phe 가 600 - 1200 μΜ 임) 및 영구적인 경증 고페닐알라닌혈증 (HPA, Phe 120 - 600 μΜ) 을 포함한다.
PKU 의 검출은 전형적으로 보편적 신생아 스크리닝 (NBS) 동안 발생한다. 힐 스틱으로부터 수집한 1 점적의 혈액을 페닐알라닌 수준에 대해 검사한다. NBS 는 USA 의 모든 50 개 주에서 의무적이다.
유전적 약물
유전적 약물은 질환 치료 또는 예방의 목적으로 숙주 세포에 유전적 구축물을 전달하는데 사용되는 바이러스 벡터에 대한 언급을 포함한다.
유전적 구축물은 비제한적으로, 존재하는 결함을 교정하거나 보완하기 위한 기능적 유전자 또는 유전자의 일부, 조절 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 안티센스, 짧은 상동성 RNA, 긴 비-코딩 RNA, 작은 간섭 RNA 또는 기타의 것들을 포함하는 조절 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열, 및 질환 상태를 변경하기 위해 중요한 세포 인자에 대해 경쟁하도록 설계된 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 디코이 서열 (decoy sequence) 을 포함할 수 있다. 유전적 약물은 특징 질환의 치료 또는 완화를 제공하기 위해 이러한 치료적 유전적 구축물을 표적 세포에 전달하는 것을 포함한다.
기능적 PAH 유전자를 간에 생체내 전달함으로써, 그의 활성이 재구성될 수 있어, 혈액 내 Phe 의 정상적인 정리 (clearance) 를 초래하여 따라서 식이 제한 또는 빈번한 효소 대체 치료요법에 대한 필요성을 제거한다. 이러한 치료적 접근방식의 효과는 내인성 PAH 에 대한 shRNA 의 표적화에 의해 개선될 수 있다. 개시물의 한 양태에서, 기능적 PAH 유전자 또는 이의 변이체는, 태아가 PKU 유전자형을 가질 위험성이 있는 것으로 확인된 경우, 특히 부모 유전자형이 공지되는 경우, 자궁내 전달될 수 있다. 치료는 생체내 또는 자궁내 발생할 수 있다. 구현예에서, 진단 단계는 태아가 PKU 표현형에 대한 위험성이 있는지 여부를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 진단 단계에서 태아가 PKU 표현형에 대한 위험성이 있는 것으로 결정되는 경우, 태아는 본원에 상세히 나타낸 유전적 약물로 치료될 수 있다.
치료적 벡터
본원의 다양한 양태 및 구현예에 따른 렌티바이러스 비리온 (입자) 은 비리온 (바이러스 입자) 를 생성하기 위해 필요한 바이러스 단백질을 인코딩하는 벡터 시스템에 의해 발현된다. 다양한 구현예에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 렌티바이러스 pol 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 하나의 벡터가 역전사 및 통합을 위해 제공된다. 또 다른 구현예에서, pol 단백질은 다수의 벡터에 의해 발현된다. 다른 구현예에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 바이러스 캡시드를 형성하기 위한 렌티바이러스 Gag 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터가 제공된다. 구현예에서, 이러한 gag 핵산 서열은 적어도 일부의 pol 핵산 서열 외에 별개의 벡터 상에 존재한다. 다른 구현예에서, gag 핵산은 pol 단백질을 인코딩하는 모든 pol 핵산 서열로부터 별개의 벡터 상에 존재한다.
야생형 복귀 돌연변이체 (revertant) 를 수득하는 가능성을 더 최소화하기 위해, 입자 생성에 사용되는 본원의 벡터에 수많은 변형이 이루어질 수 있다. 이들은 비제한적으로, LTR 의 U3 부위의 결실, tat 결실 및 매트릭스 (MA) 결실을 포함한다. 구현예에서, gag, pol 및 env 벡터(들) 는 렌티바이러스 패키징 서열로 지칭되는, 렌티바이러스 RNA 를 패키징하는 렌티바이러스 게놈으로부터의 뉴클레오티드를 함유하지 않는다.
입자를 형성하는 벡터(들) 는 바람직하게는 외피 단백질을 발현하는 렌티바이러스 게놈으로부터의 핵산 서열을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 프로모터에 작동가능하게 연결된 외피 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 별개의 벡터가 사용된다. 이러한 env 벡터는 또한 렌티바이러스 패키징 서열을 함유하지 않는다. 한 구현예에서 env 핵산 서열은 렌티바이러스 외피 단백질을 인코딩한다.
또 다른 구현예에서 외피 단백질은 렌티바이러스로부터가 아니라 상이한 바이러스로부터 유래된다. 생성된 입자는 위형 입자 (pseudotyped particle) 로 지칭된다. 외피를 적절히 선택함으로써 사실상 임의의 세포를 "감염" 시킬 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, VSV-G, 알파 바이러스 (셈리키 삼림열바이러스, 신드비스 바이러스), 아레나바이러스 (림프구성 맥락수막염 바이러스), 플라비바이러스 (진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, C 형 간염 바이러스, GB 바이러스), 랍도바이러스 (수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스), 파라믹소바이러스 (볼거리 또는 홍역) 및 오르토믹소바이러스 (인플루엔자 바이러스) 의 것과 같은 세포내이입성 구획을 표적으로 하는 외피 단백질을 인코딩하는 env 유전자를 사용할 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 다른 외피는 MLV-E, MLV-A 및 GALV 와 같은 몰로니 백혈병 바이러스로부터의 것들을 포함한다. 이들 후자의 외피는 숙주 세포가 1 차 세포인 경우에 특히 바람직하다. 원하는 숙주 세포에 따라 다른 외피 단백질이 선택될 수 있다.
본원에서 제공된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 gag, pol 또는 rev 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함한다. 각각의 gag, pol 및 rev 유전자는 개별 플라스미드 상에 제공될 수 있거나, 하나 이상의 유전자가 동일한 플라스미드 상에 함께 제공될 수 있다. 한 구현예에서, gag, pol 및 rev 유전자는 동일한 플라스미드 상에 제공된다 (예를 들어, 도 1). 또 다른 구현예에서, gag 및 pol 유전자는 제 1 플라스미드 상에 제공되며 rev 유전자는 제 2 플라스미드 상에 제공된다 (예를 들어, 도 2). 따라서, 3-벡터 및 4-벡터 시스템 둘 모두가 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스를 생성하는데 사용될 수 있다. 구현예에서, 치료적 벡터, 적어도 하나의 외피 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포, 예를 들어 패키징 세포주에 형질감염된다. 패키징 세포주의 비제한적인 예는 293T/17 HEK 세포주이다. 치료적 벡터, 외피 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주에 형질감염되는 경우, 렌티바이러스 입자가 궁극적으로 생성된다.
또 다른 양태에서, 렌티바이러스 입자를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시된다. 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터; 세포를 감염시키기 위해 최적화된 외피 단백질을 발현하기 위한 외피 플라스미드; 및 gag, pol 및 rev 유전자를 발현하기 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하며, 여기서 렌티바이러스 벡터, 외피 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주에 형질감염되는 경우, 렌티바이러스 입자가 패키징 세포주에 의해 생성되며, 렌티바이러스 입자는 PAH 의 생성을 억제하고/하거나 내인성 PAH 의 발현을 억제할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 치료적 벡터로도 지칭되는 렌티바이러스 벡터는 하기 요소를 포함한다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (RSV/5' LTR) (SEQ ID NO: 7-8), Psi 서열 (RNA 패키징 위치) (SEQ ID NO: 9), RRE (Rev-반응 요소) (SEQ ID NO: 10), cPPT (폴리퓨린 관) (SEQ ID NO: 11), 항 알파 트립신 프로모터 (hAAT) (SEQ ID NO: 12), 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) (SEQ ID NO: 1-4), 우드척 전사후 조절 요소 (Woodchuck Post-Transcriptional Regulatory Element) (WPRE) (SEQ ID NO: 13) 및 △U3 3' LTR (SEQ ID NO: 14). 구현예에서, 치환, 결실에 의한 서열 변이, 또 다른 양태에서, 본원에서 치료적 벡터로도 지칭되는 렌티바이러스 벡터는 하기 요소를 포함한다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (RSV/5' LTR) (SEQ ID NO: 7-8), Psi 서열 (RNA 패키징 위치) (SEQ ID NO: 9), RRE (Rev-반응 요소) (SEQ ID NO: 10), cPPT (폴리퓨린 관) (SEQ ID NO: 11), H1 프로모터 (SEQ ID NO: 15), PAH shRNA (SEQ ID NO: 1-4), 항 알파 트립신 프로모터 (hAAT) (SEQ ID NO: 12), PAH shRNA (SEQ ID NO: 1-4), 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE) (SEQ ID NO: 13) 및 △U3 3' LTR (SEQ ID NO: 14). 구현예에서, 치환, 결실, 부가 또는 돌연변이에 의한 서열 변이는 본원에서 서열 참조물을 변형시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 하기 요소를 포함한다: CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 16); HIV 성분 gag (SEQ ID NO: 17); HIV 성분 pol (SEQ ID NO: 18); HIV Int (SEQ ID NO: 19); HIV RRE (SEQ ID NO: 20); 및 HIV Rev (SEQ ID NO: 21). 또 다른 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 gag 및 pol 유전자를 발현하기 위한 제 1 헬퍼 플라스미드, 및 rev 유전자를 발현하기 위한 제 2 및 별개의 플라스미드를 포함하도록 변형될 수 있다. 구현예에서, 치환, 결실, 부가 또는 돌연변이에 의한 서열 변이는 본원에서 서열 참조물을 변형시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 외피 플라스미드는 하기 요소를 포함한다: RNA 폴리머라아제 II 프로모터 (CMV) (SEQ ID NO: 22) 및 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질 (VSV-G) (SEQ ID NO: 23). 구현예에서, 치환, 결실, 부가 또는 돌연변이에 의한 서열 변이는 본원에서 서열 참조물을 변형시키는데 사용될 수 있다.
다양한 양태에서, 렌티바이러스 패키징에 사용된 플라스미드는 벡터 기능의 손실 없이 다양한 요소의 치환, 부가, 감산 또는 돌연변이에 의해 변형된다. 예를 들어, 비제한적으로, 하기 요소는 패키징 시스템을 포함하는 플라스미드 내의 유사한 요소를 대체할 수 있다: 신장 인자-1 (EF-1), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 및 유비퀴틴 C (UbC) 프로모터는 CMV 또는 CAG 프로모터를 대체할 수 있다. SV40 폴리 A 및 bGH 폴리 A 는 토끼 베타 글로빈 폴리 A 를 대체할 수 있다. 헬퍼 플라스미드 내 HIV 서열은 상이한 HIV 계통 또는 클레이드로부터 구축될 수 있다. VSV-G 당단백질은 고양이 내인성 바이러스 (RD114), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 광견병 (FUG), 림프성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 인플루엔자 A 가금류 바이러스 (FPV), 로스 리버 알파바이러스 (RRV), 쥐 백혈병 바이러스 10A1 (MLV) 또는 에볼라 바이러스 (EboV) 로부터의 멤브레인 당단백질로 치환될 수 있다.
다양한 렌티바이러스 패키징 시스템은 상업적으로 구입할 수 있으며 (예를 들어 OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD 로부터의 Lenti-vpak packaging kit), 또한 본원에 기재된 바와 같이 설계될 수 있다. 더욱이, 렌티바이러스 입자의 생성 효율을 포함하여 임의의 수의 관련 인자를 개선하기 위해 렌티바이러스 패키징 시스템의 양태를 치환하거나 변형시키는 것은 당업자의 기술 내에 있다.
또 다른 양태에서, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용할 수 있다.
AAV 벡터 구축.
PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 5) 또는 PAH shRNA 서열 #2 (SEQ ID NO: 6) 는 pAAV 플라스미드 (Cell Biolabs) 에 삽입될 수 있다. BamHI 및 EcoRI 제한 위치를 함유하는 PAH 올리고뉴클레오티드 서열은 Eurofins MWG Operon 에 의해 합성될 수 있다. 중첩 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 70℃ 에서 실온으로 냉각하는 동안 혼합 및 어닐링될 수 있다. pAAV 는 제한 효소 BamHI 및 EcoRI 으로 1 시간 동안 37℃ 에서 소화될 수 있다. 소화된 pAAV 플라스미드는 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제되고 Thermo Scientific 으로부터의 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 추출될 수 있다. DNA 농도를 측정할 수 있고, 벡터 대 올리고 (3:1 비) 를 혼합하고, 어닐링하고, 라이게이션할 수 있다. 라이게이션 반응은 30 분 동안 실온에서 T4 DNA 리가아제에 의해 수행될 수 있다. 2.5 ㎕ 의 라이게이션 믹스를 25 ㎕ 의 STBL3 적격 박테리아 세포에 첨가할 수 있다. 형질전환을 42℃ 에서 열 충격 후 달성할 수 있다. 박테리아 세포를 암피실린을 함유하는 아가 플레이트 상에 스프레딩할 수 있고, 약물-내성 콜로니 (암피실린 내성 플라스미드의 존재를 나타냄) 를 회수하고 LB 브로쓰에서 확장시킬 수 있다. 올리고 서열의 삽입을 확인하기 위해, 플라스미드 DNA 를 Thermo Scientific DNA mini prep 키트를 사용하여 수확된 박테리아 배양물로부터 추출할 수 있다. pAAV 플라스미드 내의 shRNA 서열의 삽입은 shRNA 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
PAH (SEQ ID NO: 1) 를 발현하기 위한 예시적인 AAV 플라스미드 시스템을 도 3 에서 도시한다. 간략하게, 가장 좌측의 AAV 헬퍼 플라스미드는 좌측 ITR (SEQ ID NO: 47), 프로트롬빈 인핸서 (SEQ ID NO: 48), 인간 항 알파 트립신 프로모터 (SEQ ID NO: 12), PAH 요소 (SEQ ID NO: 1), 폴리 A 요소 (SEQ ID NO: 49) 및 우측 ITR (SEQ ID NO: 50) 을 함유한다. 도 3 의 가운데에 도시한 AAV 플라스미드는 적합한 프로모터 요소 (SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 22), 및 E2A 요소 (SEQ ID NO: 51), E4 요소 (SEQ ID NO: 52), VA RNA 요소 (SEQ ID NO: 53), 및 폴리 A 요소 (SEQ ID NO: 49) 를 함유하는 AAV 플라스미드를 나타낸다. 가장 우측의 플라스미드는 적합한 프로모터 요소, Rep 요소 (SEQ ID NO: 54), Cap 요소 (SEQ ID NO: 55) 및 폴리 A 요소 (SEQ ID NO: 49) 를 함유하는 AAV Rep/Cap 플라스미드를 도시한다.
AAV 입자의 생성. AAV-PAH shRNA 플라스미드는 플라스미드 pAAV-RC2 (Cell Biolabs) 및 pHelper (Cell Biolabs) 와 조합될 수 있다. pAAV-RC2 플라스미드는 Rep 및 AAV2 캡시드 유전자를 함유할 수 있으며, pHelper 는 아데노바이러스 E2A, E4 및 VA 유전자를 함유할 수 있다. AAV 입자를 생성하기 위해, 이들 플라스미드를 1:1:1 비 (pAAV-shPAH: pAAV-RC2: pHelper) 로 293T 세포에 형질감염시킬 수 있다. 150 mm 디쉬 (BD Falcon) 에서 세포의 형질감염을 위해, 10 ㎍ 의 각각의 플라스미드를 1 ㎖ 의 DMEM 중 함께 첨가할 수 있다. 또 다른 튜브에서, 60 ㎕ 의 형질감염 시약 PEI (1 ㎍/㎖) (Polysciences) 를 1 ㎖ 의 DMEM 에 첨가할 수 있다. 2 개의 튜브를 함께 혼합하여 15 분 동안 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음, 형질감염 혼합물을 세포에 첨가할 수 있고, 세포를 3 일 후 수집할 수 있다. 세포를 드라이 아이스/이소프로판올 중 동결/해동 용해 (lysis) 에 의해 용해할 수 있다. 벤조나아제 뉴클레아제 (Sigma) 를 37℃ 에서 30 분 동안 세포 용해물에 첨가할 수 있다. 그런 다음, 세포 잔해를 4℃ 에서 15 분 동안 12,000 rpm 에서 원심분리에 의해 펠렛화할 수 있다. 상청액을 수집한 다음, 표적 세포에 첨가할 수 있다.
투약량 및 투약 형태
개시된 벡터 시스템은 개시된 벡터의 에피솜 유지 및 관심 유전자 또는 서열의 단기간, 중간 기간 또는 장기간 발현을 가능하게 한다. 따라서, 용량 용법은 치료되는 병상 및 투여 방법을 기반으로 가변적일 수 있다.
구현예에서, 벡터 조성물은 가변적 용량으로 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 특히, 대상은 약 ≥ 106 감염 용량 (여기서 1 용량이 1 표적 세포를 형질도입시키는데 평균적으로 필요함) 이 투여될 수 있다. 보다 특히, 대상은 약 ≥ 107, 약 ≥ 108, 약 ≥ 109 또는 약 ≥ 1010 감염 용량, 또는 이들 값 사이의 임의 수의 용량을 투여받을 수 있다. 용량의 상한치는 특정 암 유형을 포함하는 각각의 질환 징후에 대해 결정될 것이며, 각각의 개별 제품 또는 제품 로트에 대한 독성/안전성 프로파일에 따라 좌우될 것이다.
추가로, 본 개시물의 벡터 조성물은 1 일 1 회 또는 2 회와 같이 주기적으로, 또는 임의의 다른 적합한 시간으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 벡터 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 1 주에 1 회, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 1 개월에 1 회, 2 개월마다, 3 개월마다, 6 개월마다, 9 개월마다, 1 년에 1 회, 18 개월마다, 2 년마다, 30 개월마다, 또는 3 년마다 투여될 수 있다.
구현예에서, 개시된 벡터 조성물은 약학 조성물로서 투여된다. 구현예에서, 약학 조성물은 임상 적용을 위한 코, 폐, 경구, 국소 또는 비경구 투약 형태를 비제한적으로 포함하는 광범위한 투약 형태로 제형화될 수 있다. 각각의 투약 형태는 다양한 가용화제, 붕해제, 계면활성제, 충전제, 증점제, 결합제, 희석제 예컨대 습윤제 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 주사, 흡입, 주입 또는 피내 노출을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 주사가능 제형은 적합한 pH 및 등장성에서 수성 또는 비-수성 용액 중에 개시된 벡터를 포함할 수 있다.
개시된 벡터 조성물은 종양 위치 또는 감염 위치에 직접 주사를 통해 대상에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 전신 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 조성물은 유도 관삽입 (guided cannulation) 을 통해 종양 또는 감염 위치를 바로 둘러싼 조직에 투여될 수 있다.
개시된 벡터 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 방법, 예컨대 비내, 구강, 설하, 경구, 직장, 안구, 비경구 (정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내), 폐, 질내, 국부 투여, 국소 투여, 난절 이후 국소 투여, 점막 투여를 사용하여, 에어로졸을 통해, 반고체 매질 예컨대 아가로오스 또는 젤라틴에서, 또는 구강 또는 코 스프레이 제형을 통해 투여될 수 있다.
또한, 개시된 벡터 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 투약 형태, 예컨대 고체 투약 형태, 정제, 알약, 로젠지, 캡슐, 액체 분산액, 겔, 에어로졸, 폐 에어로졸, 코 에어로졸, 연고, 크림, 반고체 투약 형태, 용액, 에멀젼 및 현탁액으로 제형화될 수 있다. 또한, 약학 조성물은 제어 방출 제형, 지속 방출 제형, 즉시 방출 제형 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 또한, 약학 조성물은 경피 전달 시스템일 수 있다.
구현예에서, 약학 조성물은 경구 투여용 고체 투약 형태로 제형화될 수 있고, 고체 투약 형태는 분말, 과립, 캡슐, 정제 또는 알약일 수 있다. 구현예에서, 고체 투약 형태는 하나 이상의 부형제 예컨대 칼슘 카르보네이트, 전분, 수크로오스, 락토오스, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴을 포함할 수 있다. 또한, 고체 투약 형태는 부형제에 추가로, 윤활제 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경구 투약 형태는 즉시 방출 또는 변형 방출 형태일 수 있다. 변형 방출 투약 형태는 제어 또는 연장 방출, 장 방출 등을 포함한다. 변형 방출 투약 형태에서 사용되는 부형제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
구현예에서, 약학 조성물은 설하 또는 구강 투약 형태로서 제형화될 수 있다. 이러한 투약 형태는 혀 아래에 투여되는 설하 정제 또는 용액 조성물 및 뺨과 잇몸 사이에 놓여지는 구강 정제를 포함한다.
구현예에서, 약학 조성물은 코 투약 형태로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 이러한 투약 형태는 코 전달을 위한 용액, 현탁액 및 겔 조성물을 포함한다.
구현예에서, 약학 조성물은 경구 투여용 액체 투약 형태, 예컨대 현탁액, 에멀젼 또는 시럽으로 제형화될 수 있다. 구현예에서, 액체 투약 형태는 통용되는 단순한 희석제 예컨대 물 및 액체 파라핀에 추가로, 다양한 부형제 예컨대 보습제, 감미제, 방향제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 구현예에서, 조성물은 소아과 환자에게 투여하기 적합하도록 제형화될 수 있다.
구현예에서, 약학 조성물은 비경구 투여용 투약 형태, 예컨대 멸균 수용액, 현탁액, 에멀젼, 비-수용액 또는 좌제로 제형화될 수 있다. 구현예에서, 용액 또는 현탁액은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일 또는 주사가능 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함할 수 있다.
약학 조성물의 투약량은 환자의 체중, 연령, 성별, 투여 시기 및 방식, 배설률, 및 질환의 중증도에 따라 가변적일 수 있다.
구현예에서, 벡터 조성물은 정맥 또는 동맥 관삽입 또는 주사, 피내 전달, 근육내 전달 또는 질환 위치 근처의 배수 기관으로의 주사에 의해 뇌척수액, 혈액 또는 림프 순환에 투여된다.
하기 실시예는 본 발명의 양태를 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에서 기재되는 특정한 상태 또는 세부 사항에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 참조하는 모든 인쇄된 공개물은 명확하게 참조로 통합된다.
실시예
실시예
1:
렌티바이러스
벡터 시스템의 개발
렌티바이러스 벡터 시스템을 도 1 (원형화된 형태) 에서 요약한 바와 같이 개발하였다. 렌티바이러스 입자를 293T/17 HEK 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 로부터 구입) 에서 생성시킨 후, 치료적 벡터, 외피 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드로 형질감염하였다. 기능적 바이러스 입자를 생성한 293T/17 HEK 세포의 형질감염에는 시약 폴리(에틸렌이민) (PEI) 을 이용하여 플라스미드 DNA 흡수 효율을 증가시켰다. 플라스미드 및 DNA 를 초기에 3:1 의 비 (PEI 대 DNA 의 질량비) 로, 혈청 없는 배양 배지에서 별도로 첨가하였다. 2-3 일 후, 세포 배지를 수집하고 렌티바이러스 입자를 고속 원심분리 및/또는 여과에 의해 정제한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 렌티바이러스 입자의 농도는 형질도입 단위/㎖ (TU/㎖) 로 표현될 수 있다. TU 의 결정은 배양액 (p24 단백질이 렌티바이러스 입자에 통합됨) 중 HIV p24 수준을 측정함으로써, 정량 PCR 에 의해 형질도입된 세포 당 바이러스 DNA 카피수를 측정함으로써, 또는 세포를 감염시키고 광을 사용하여 (벡터가 루시퍼라아제 또는 형광 단백질 마커를 인코딩하는 경우) 달성되었다.
상기 언급한 바와 같이, 3-벡터 시스템 (즉, 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함함) 은 렌티바이러스 입자의 생성을 위해 설계되었다. 3-벡터 시스템의 개략도를 도 1 에 나타낸다. 간략하게, 도 1 을 참조하면, 최상부 벡터는 헬퍼 플라스미드이며, 이러한 경우, 이는 Rev 를 포함한다. 도 1 의 중앙에 나타나는 벡터는 외피 플라스미드이다. 최하부 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 치료용 벡터이다.
도 1 을 참조하면, 헬퍼 플러스 Rev 플라스미드는 CAG 인핸서 (SEQ ID NO: 24); CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 16); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 25); HIV gag (SEQ ID NO: 17); HIV Pol (SEQ ID NO: 18); HIV Int (SEQ ID NO: 19); HIV RRE (SEQ ID NO: 20); HIV Rev (SEQ ID NO: 21); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 26) 를 포함한다.
외피 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 22); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 27); VSV-G 외피 당단백질 (SEQ ID NO: 23); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 26) 를 포함한다.
헬퍼 (플러스 Rev) 및 외피 플라스미드로 이루어지는 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함하는 3-벡터 시스템의 합성이 개시된다.
재료 및 방법:
헬퍼 플라스미드의 구축: Gag, Pol 및 인테그라아제 유전자를 함유하는 pNL4-3 HIV 플라스미드 (NIH Aids Reagent Program) 로부터 DNA 단편의 초기 PCR 증폭에 의해 헬퍼 플라스미드를 구축하였다. 프라이머는, pCDNA3 플라스미드 (Invitrogen) 의 동일한 위치에서 삽입하는데 사용될 수 있는 EcoRI 및 NotI 제한 위치를 갖는 단편이 증폭되도록 설계되었다. 정방향 프라이머는 (5'-TAAGCAGAATTCATGAATTTGCCAGGAAGAT-3') (SEQ ID NO: 28) 였으며, 역방향 프라이머는 (5'-CCATACAATGAATGGACACTAGGCGGCCGCACGAAT-3') (SEQ ID NO: 29) 였다.
Gag, Pol, 인테그라아제 단편에 대한 서열은 하기와 같았다:
다음으로, XbaI 및 XmaI 측방 (flanking) 제한 위치를 갖는 Rev, RRE 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A 서열을 함유하는 DNA 단편을 Eurofins Genomics 에 의해 합성하였다. 그런 다음, DNA 단편을 XbaI 및 XmaI 제한 위치에서 플라스미드에 삽입하였다. DNA 서열은 하기와 같았다:
마지막으로, pCDNA3.1 의 CMV 프로모터를 CAG 인핸서/프로모터 + 닭 베타 액틴 인트론 서열로 대체하였다. MluI 및 EcoRI 측방 제한 위치를 갖는 CAG 인핸서/프로모터/인트론 서열을 함유하는 DNA 단편을 Eurofins Genomics 에 의해 합성하였다. 그런 다음, DNA 단편을 MluI 및 EcoRI 제한 위치에서 플라스미드에 삽입하였다. DNA 서열은 하기와 같았다:
VSV-G 외피 플라스미드의 구축:
수포성 구내염 인디아나 바이러스 당단백질 (VSV-G) 서열을 측방 EcoRI 제한 위치로, Eurofins Genomics 에 의해 합성하였다. 그런 다음, DNA 단편을 EcoRI 제한 위치에서 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen) 에 삽입하고, CMV 특이적 프라이머를 사용하는 서열분석에 의해 올바른 배향을 결정하였다.
DNA 서열은 하기와 같았다:
3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함하는 4-벡터 시스템은 또한, 본원에 기재된 방법 및 재료를 사용하여 설계되고 생성되었다. 4-벡터 시스템의 개략도를 도 2 에 나타낸다. 간략하게, 도 2 를 참조하면, 최상부 벡터는 헬퍼 플라스미드이며, 이러한 경우, 이는 Rev 를 포함하지 않는다. 상부로부터 두 번째 벡터는 별개의 Rev 플라스미드이다. 하부로부터 두 번? 벡터는 외피 플라스미드이다. 최하부 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 치료적 벡터이다.
도 2 를 참조하면, 헬퍼 플라스미드는 CAG 인핸서 (SEQ ID NO: 24); CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 16); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 25); HIV gag (SEQ ID NO: 17); HIV Pol (SEQ ID NO: 18); HIV Int (SEQ ID NO: 19); HIV RRE (SEQ ID NO: 20); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 26) 를 포함한다.
Rev 플라스미드는 RSV 프로모터 (SEQ ID NO: 7); HIV Rev (SEQ ID NO: 21); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 26) 를 포함한다.
외피 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 22); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 27); VSV-G (SEQ ID NO: 23); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 26) 를 포함한다.
한 양태에서, 치료적 PAH 렌티바이러스 플라스미드는 도 4A 에 나타낸 모든 요소를 포함한다. 또 다른 양태에서, 치료적 PAH 렌티바이러스 플라스미드는 도 4B 에서 나타낸 모든 요소를 포함한다.
헬퍼, Rev 및 외피 플라스미드로 이루어지는 3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함하는 4-벡터 시스템의 합성이 개시된다.
재료 및 방법:
Rev 가 없는 헬퍼 플라스미드의 구축:
RRE 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A 서열을 함유하는 DNA 단편을 삽입하여, Rev 가 없는 헬퍼 플라스미드를 구축하였다. 이 서열을 측방 XbaI 및 XmaI 제한 위치로, Eurofins Genomics 에 의해 합성하였다. 그런 다음, RRE/토끼 폴리 A 베타 글로빈 서열을 XbaI 및 XmaI 제한 위치에서 헬퍼 플라스미드에 삽입하였다.
DNA 서열은 하기와 같다:
Rev 플라스미드의 구축:
측방 MfeI 및 XbaI 제한 위치로, Eurofins Genomics 에 의해 단일 DNA 단편으로서 RSV 프로모터 및 HIV Rev 서열을 합성하였다. 그런 다음, DNA 단편을, CMV 프로모터가 RSV 프로모터로 대체되는 MfeI 및 XbaI 제한 위치에서 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen) 에 삽입하였다. DNA 서열은 하기와 같았다:
패키징 시스템에서 사용한 플라스미드는 유사한 요소로 변형될 수 있으며, 인트론 서열은 벡터 기능의 손실 없이 잠재적으로 제거될 수 있다. 예를 들어, 하기 요소는 패키징 시스템에서 유사한 요소를 대체할 수 있다:
프로모터: 신장 인자-1 (EF-1) (SEQ ID NO: 34), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) (SEQ ID NO: 35) 및 유비퀴틴 C (UbC) (SEQ ID NO: 36) 는 CMV (SEQ ID NO: 22) 또는 CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 16) 를 대체할 수 있다. 이러한 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더 가변적일 수 있다.
폴리 A 서열: SV40 폴리 A (SEQ ID NO: 37) 및 bGH 폴리 A (SEQ ID NO: 38) 는 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 26) 를 대체할 수 있다. 이러한 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더 가변적일 수 있다.
HIV Gag, Pol 및 인테그라아제 서열: 헬퍼 플라스미드에서의 HIV 서열은 상이한 HIV 계통 또는 클레이드로부터 구축될 수 있다. 예를 들어, Bal 계통으로부터의 HIV Gag (SEQ ID NO: 17); HIV Pol (SEQ ID NO: 18); 및 HIV Int (SEQ ID NO: 19) 는 본원에 요약된 바와 같은 헬퍼/헬퍼 플러스 Rev 플라스미드에 함유된 gag, pol 및 int 서열과 상호교환될 수 있다. 이러한 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더 가변적일 수 있다.
외피: VSV-G 당단백질은 고양이 내인성 바이러스 (RD114) (SEQ ID NO: 39), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) (SEQ ID NO: 40), 광견병 (FUG) (SEQ ID NO: 41), 림프성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) (SEQ ID NO: 42), 인플루엔자 A 가금류 바이러스 (FPV) (SEQ ID NO: 43), 로스 리버 알파바이러스 (RRV) (SEQ ID NO: 44), 쥐 백혈병 바이러스 10A1 (MLV) (SEQ ID NO: 45) 또는 에볼라 바이러스 (EboV) (SEQ ID NO: 46) 로부터의 멤브레인 당단백질로 치환될 수 있다. 이러한 외피에 대한 서열은 본원의 서열 부분에서 확인된다. 추가로, 이러한 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더 가변적일 수 있다.
요약하여, 3-벡터 시스템 대 4-벡터 시스템은 하기와 같이 비교되고 대조될 수 있다. 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 하기를 함유한다: 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 인테그라아제 및 Rev/Tat; 2. 외피 플라스미드: VSV-G/FUG 외피; 및 3. 치료적 벡터: RSV 5'LTR, Psi 패키징 신호, RRE, cPPT, ApoE 인핸서, 항-알파 트립신 프로모터, 페닐알라닌 히드록실라아제, 3' UTR, WPRE, 및 3'델타 LTR. 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 하기를 함유한다: 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 및 인테그라아제; 2. Rev 플라스미드: Rev; 3. 외피 플라스미드: VSV-G/FUG 외피; 및 4. 치료적 벡터: RSV 5'LTR, Psi 패키징 신호, RRE, cPPT, ApoE 인핸서, 항-알파 트립신 프로모터, 페닐알라닌 히드록실라아제, WPRE, 및 3' 델타 LTR. 상기 요소에 상응하는 서열은 본원의 서열 목록 부분에서 확인된다.
실시예
2. 치료적 벡터
예시적인 치료적 벡터는 예를 들어 도 4 에서 나타낸 바와 같이 설계되고 개발되었다.
먼저 도 4A 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심적 유전적 요소는 하기와 같다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 위치), RRE (Rev-반응 요소), cPPT (폴리퓨린 관), hAAT 프로모터, PAH 또는 이의 변이체 (본원에 상세히 나타낸 바와 같음), 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 부위에서의 결실을 갖는 LTR.
다음으로 도 4B 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심적 유전적 요소는 하기와 같다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 위치), RRE (Rev-반응 요소), cPPT (폴리퓨린 관), H1 프로모터, PAH shRNA 서열 또는 이의 변이체 (본원에서 상세히 나타낸 바와 같음), hAAT 프로모터, PAH 서열 및 이의 변이체 (본원에 상세히 나타낸 바와 같음) 를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 부위에서의 결실을 갖는 LTR.
도 4A 및 4B 에서 일반적으로 요약한 벡터를 생성하기 위해, 하기의 방법 및 재료를 이용하였다.
억제 RNA 설계: 호모 사피엔스 (Homo sapiens) 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) (NM_000277.1) mRNA 의 서열을, 인간 세포에서 PAH 수준을 녹다운시키기 위한 잠재적 shRNA 후보물에 대한 검색에 사용하였다. 잠재적 RNA shRNA 서열을 Broad Institute 에 의해 주관되는 GPP 웹 포털 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/) 또는 Thermo Scientific 으로부터의 BLOCK-iT RNAi Designer (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) 와 같은 siRNA 또는 shRNA 설계 프로그램에 의해 선택된 후보물에서 선택하였다. 개별 선택된 shRNA 서열을 RNA 폴리머라아제 III 프로모터 H1 (SEQ ID NO: 15) 에 바로 3 프라임 (prime) 으로 렌티바이러스 벡터에 삽입하여, shRNA 발현을 조절하였다. 이러한 렌티바이러스 shRNA 구축물을 사용하여, 세포를 형질도입하고 특정 mRNA 수준에서의 변화를 측정하였다.
벡터 구축: PAH shRNA 에 대해, BamHI 및 EcoRI 제한 위치를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 Eurofins MWG Operon 에 의해 합성하였다. 중첩 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 70℃ 에서 실온으로 냉각하는 동안 혼합 및 어닐링하였다. 렌티바이러스 벡터를 제한 효소 BamHI 및 EcoRI 으로 1 시간 동안 37℃ 에서 소화시켰다. 소화된 렌티바이러스 벡터를 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하고, Thermo Scientific 으로부터의 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 추출하였다. DNA 농도를 측정하고, 벡터 대 올리고 (3:1 비) 를 혼합하고, 어닐링하고, 라이게이션하였다. 라이게이션 반응을 T4 DNA 리가아제로 30 분 동안 실온에서 수행하였다. 2.5 ㎕ 의 라이게이션 믹스를 25 ㎕ 의 STBL3 적격 박테리아 세포에 첨가하였다. 형질전환을 42℃ 에서 열 충격 후 달성하였다. 박테리아 세포를 암피실린을 함유하는 아가 플레이트 상에 스프레딩하고, 약물-내성 콜로니 (암피실린 내성 플라스미드의 존재를 나타냄) 를 회수하고 LB 브로쓰에서 확장시켰다. 올리고 서열의 삽입을 확인하기 위해, 플라스미드 DNA 를 Thermo Scientific DNA mini prep 키트를 사용하여 수확된 박테리아 배양물로부터 추출하였다. 렌티바이러스 벡터 내의 shRNA 의 삽입은 shRNA 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 하기 표적 서열을 사용하여, 예시적 shRNA 서열을 PAH 를 녹다운시키는 것으로 결정하였다.
PAH shRNA 서열 #1:
PAH shRNA 서열 #2:
실시예
3 - 완전한 5' 및 3'
UTR
을 포함하는 페닐알라닌
히드록실라아제
오픈
리딩
프레임
Hepa1-6 마우스 간암 세포를, 도 5 에서 나타낸 바와 같이 그의 전체 5 프라임 미번역 부위 및 그의 전체 3 프라임 미번역 부위 (SEQ ID NO: 3) 를 포함하는 PAH 유전자 (SEQ ID NO: 1) 를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 도 5 는 인간 PAH 에 대한 cDNA 발현 구축물의 완전한 DNA 서열을 제공한다 (SEQ ID NO: 57). 이러한 버전은 미손상 (intact) 5' UTR 부위 (볼드체로 나타냄), hPAH 에 대한 코딩 부위, 및 완전한 3' UTR (볼드체로 나타냄) 을 포함한다. 이러한 감염에 대한 결과를 본원의 추가 실시예에서 상세히 나타낸다.
실시예
4 - 완전한 5'
UTR
및
절두된
3'
UTR
을 포함하는 페닐알라닌
히드
록실라아제 오픈 리딩 프레임
Hepa1-6 마우스 간암 세포를, 도 6 에서 나타낸 바와 같이 그의 전체 5 프라임 미번역 부위 및 절두된 3 프라임 미번역 부위 (SEQ ID NO: 4) 를 포함하는 PAH 유전자 (SEQ ID NO: 1) 를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 도 6 은 5' UTR (897 개 뉴클레오티드) (볼드체로 나타냄), hPAH 에 대한 코딩 부위, 및 절두된 3' UTR (289 개 뉴클레오티드) (볼드체로 나타냄) 을 포함하는 인간 PAH 에 대한 cDNA 서열을 제공한다 (SEQ ID NO: 58).
실시예
5.
PAH
에 대한 재료 및 방법
호모 사피엔스 페닐알라닌 히드록실라아제 (hPAH) mRNA 의 서열 (Gen Bank: NM_000277.1) 을 유전자의 원위 및 근위 말단에 위치한 EcoRI 및 SalI 제한 효소 위치로 화학적으로 합성하였다. EcoRI 및 SalI 제한 효소로 처리된 hPAH 를 절단하고, ApoE (NM_000001.11, U35114.1) 및 hAAT (HG98385.1) 유전자좌 제어 부위의 부분을 포함하는 하이브리드 프로모터의 제어 하에 pCDH 플라스미드에 라이게이션하였다. 유사하게, 마우스 PAH 유전자 (mPAH) (NM_008777.3) 를 합성하고, 동일한 하이브리드 프로모터의 제어 하에 pCDH 에 삽입하였다. 추가로, 인간 PAH 는 3' 미번역 부위 (UTR) 를 포함하도록 합성하였다.
추가 변형에서, 간-특이적 프로모터 hAAT 에 의해 제어될 때 hPAH 유전자의 발현이 개선되도록 자연 발생적 UTR 을 절두하였다. hPAH, 전장 UTR 을 갖는 hPAH, 절두된 UTR 을 갖는 hPAH, 또는 mPAH 단독 (BamHI 및 EcoRI 제한 위치를 가짐) 을 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열을 Eurofins Genomics 에 의해 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 서열을 70℃ 에서 인큐베이션하고 실온으로 냉각시켜 어닐링하였다. 렌티바이러스 벡터를 제한 효소 BamHI 및 EcoRI 으로 1 시간 동안 37℃ 에서 소화시켰다. 소화된 렌티바이러스 벡터를 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하고, Invitrogen 으로부터의 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 추출하였다. DNA 농도를 측정한 다음, 3:1 삽입물 대 벡터의 벡터 대 올리고 서열 비를 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드 (hPAH 또는 mPAH) 와 혼합하였다. 혼합물을 T4 DNA 리가아제로 30 분 동안 실온에서 라이게이션하였다. 2.5 ㎕ 의 라이게이션 믹스를 25 ㎕ 의 STBL3 적격 박테리아 세포에 첨가하였다. 형질전환을 42℃ 에서 열 충격에 의해 실행하였다. 박테리아 세포를 암피실린을 함유하는 아가 플레이트에 스트리킹한 다음, 콜로니를 LB 브로쓰에서 확장시켰다. 올리고 서열의 삽입을 확인하기 위해, 플라스미드 DNA 를 Invitrogen DNA mini prep 키트를 사용하여 수확된 박테리아 배양물로부터 추출하였다. 렌티바이러스 벡터 (LV) 내의 shRNA 서열의 삽입은 shRNA 발현을 위해 사용되는 프로모터에 대해 상보적인 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, 확인된 hPAH 또는 mPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, PAH 를 발현하는 능력을 시험하기 위해 렌티바이러스 입자를 패키징하였다. 포유동물 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하였다. 세포를 2-4 일 후 수집하고, 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
hPAH
서열의 변형:
hPAH 서열의 여러 변형을 세포 발현 수준을 개선시키기 위해 포함시켰다. 먼저, 정상 hPAH 3' 미번역 부위 (UTR) 를 PAH 코딩 부위 후 및 mRNA 말단 전에 삽입하였다. 이는 LV-hAAT-hPAH-UTR 을 생성시켰다. hPAH 발현의 수준은 3' UTR 을 첨가함으로써 증가하였으나, 유사한 벡터에서 발현된 mPAH 의 수준에 도달하지는 않았다.
다음으로, 간-특이적 프로모터의 제어 하에 발현 수준을 개선시키기 위해 hPAH UTR 부위를 변형시켰다. 서열의 원위 절반과 대략 동일한 미번역 부위의 일부가 제거되었다. 이러한 변형은 LV-hAAT-hPAH-UTR 의 발현을 mPAH 발현에 대해 달성된 것과 유사한 수준까지 증가시켰다. 놀랍게도, 간-특이적 hAAT 프로모터를 사용할 때 UTR 의 절두는 단지 높은 수준 발현에만 요구되었다. CMV 즉시 초기 프로모터의 제어 하에 hPAH 발현 구축물을 생성시키는 것은, UTR 의 존재 또는 부재에 관계없이, 그리고 UTR 이 절두되었는지 여부에 관계없이 높은 수준 발현을 제공하였다. hPAH 유전자의 유전자좌에 대한 구조 기능을 이해하는데 있어서 이러한 중요한 진전은, hPAH 의 높은 수준 생성을 달성하면서 간 조직에서의 특이적 발현을 위한 구축물을 생성할 수 있게 한다. 간 세포에 대한 이식유전자 발현을 제한하는 것은, 페닐케톤뇨증에 대한 유전적 약물에서 벡터 안전성 및 표적 특이성을 위한 중요한 고려 사항이다.
실시예
6. 인간 및 마우스
PAH
유전자에 대한 발현 수준을
비교하는
면역블롯
분석
인간 및 마우스 PAH 유전자에 대한 발현 수준을 비교하는 면역블롯 분석을 도 7 에서 요약한 바와 같이 수행하였다. 이 실시예는 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (Hepa1-6) 에서 마우스 PAH 의 발현이 Hepa1-6 에서 인간 PAH 의 거의 검출불가능한 발현과 비교하여 더 높다는 것을 설명한다.
인간 및 마우스 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 그런 다음, 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 이후, 올바른 hPAH 또는 mPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입하였다. 세포를 2-4 일 후 수집하고, 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. Hepa1-6 세포를 형질도입 효율에 대한 마커로서 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 함유하는 렌티바이러스 입자로 감염시켰다. 인간 또는 마우스 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 를 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다.
실시예
7.
Hepa1
-6 세포에서 3'
UTR
부위를 갖거나 갖지 않는
hPAH
의
렌티바이러스
-전달된 발현
이 실시예는 도 8 에 나타낸 바와 같이 렌티바이러스 벡터가 5' UTR 및 3' UTR 둘 모두를 포함하는 hPAH 를 발현할 때 Hepa1-6 암종 세포에서 PAH 의 발현이 실질적으로 증가한다는 것을 설명한다. 이 실시예는 또한 hPAH 에 대한 코딩 부위만을 발현하는 렌티바이러스 벡터가 Hepa1-6 세포에서 PAH 단백질의 수준을 증가시키지 않는다는 것을 설명한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 렌티바이러스 벡터는 그의 3' UTR 의 존재 또는 부재 하에 인간 PAH 유전자를 포함하였다. 또한, 이들 구축물에서 hPAH 발현은 hAAT 프로모터에 의해 구동되었다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. Hepa1-6 세포를 형질도입 효율에 대한 마커로서 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 함유하는 렌티바이러스 입자로 감염시켰다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 를 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다.
도 8 에서 나타낸 바와 같이, 하기 3 개 군을 비교한다: Hepa1-6 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), hPAH 에 대한 코딩 부위만을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 발현하는 군 (레인 2), 및 hPAH 를 발현하며 5' 및 3' UTR 부위 둘 모두를 포함하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3). 특히, Hepa1-6 암종 세포는 마우스 간 조직으로부터 유래되며, 따라서 레인 1 에서 관찰된 PAH 의 자연적 배경 발현이 존재한다 (표지된 hAAT). 도 8 은 PAH shRNA 를 발현하는 렌티바이러스 (LV) 가 5' UTR 및 3' UTR 둘 모두를 포함할 때 Hepa1-6 암종 세포에서 PAH 의 발현이 실질적으로 증가한다는 것을 입증한다.
실시예
8.
Hepa1
-6 세포에서
절두된
3'
UTR
을 갖는
hPAH
를 발현하는
렌티바이러스
벡터
이 실시예는 도 9 에 나타낸 바와 같이, 절두된 3' UTR (hPAH-3'UTR) 을 갖는 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 전장 3'UTR 서열을 함유하는 구축물에 비해 hPAH 의 실질적으로 증가한 발현을 입증한다는 것을 설명한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 렌티바이러스 벡터는 그의 3' UTR 의 존재 또는 부재 하에 인간 PAH 유전자를 포함하였다. 또한, 이들 구축물에서 hPAH 발현은 hAAT 프로모터에 의해 구동되었다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. Hepa1-6 세포를 형질도입 효율에 대한 마커로서 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 함유하는 렌티바이러스 입자로 감염시켰다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 및 로딩 대조군 베타-액틴을 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다.
도 9 는 Hepa1-6 암종 세포에서 hPAH 구축물의 발현을 나타낸다. 도 9 에서 나타낸 바와 같이, 하기 3 개 군을 비교한다: hPAH 에 대한 코딩 부위만을 발현하는 대조군 렌티바이러스 벡터 (레인 1), hPAH-3'UTR 을 함유하는 구축물 (레인 2) 및 전장 hPAH 3'UTR 서열 (레인 3). 특히, Hepa1-6 암종 세포는 인간 간 조직으로부터 유래되며, 따라서 레인 1 에서 관찰된 PAH 의 자연적 배경 발현이 존재한다 (표지된 hAAT). 이 실시예는 hPAH-3'UTR 이 Hepa1-6 세포에서 야생형 3'UTR 서열에 비해 hPAH 발현을 증가시킨다는 것을 설명한다.
실시예
9. 마우스
Hepa1
-6 세포에서
WPRE
를 갖거나 갖지 않는 코돈-최적화된
hPAH
의 발현
이 실시예는 hAAT-hPAH-3'UTR289 를 함유하는 렌티바이러스 벡터로부터 WPRE 요소를 제거하는 것이, hPAH 발현을 현저히 감소시킨다는 것을 설명하며, 이는 도 10 에서 나타낸 바와 같이 WPRE 가 최적 단백질 발현에 필요하다는 것을 나타낸다. 이 실시예는 또한 바람직한 인간 코돈 편향 (PAH-OPT) 을 기반으로 하는 코돈 선택 최적화가, hPAH 발현 수준을 증가시키는데 실패하였음을 설명한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 마우스 Hepa1-6 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 또한, 이들 구축물에서 hPAH 발현은 hAAT 프로모터에 의해 구동되었다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 및 로딩 대조군 베타-액틴을 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다.
이 실시예는 1) hPAH 코딩 부위의 코돈 최적화 및 2) WPRE 유전자 성분의 결실의, Hepa1-6 세포에서의 hPAH 발현에 대한 효과를 나타낸다. 이 문제점을 다루기 위해 마우스 Hepa1-6 세포에서의 다양한 hPAH 구축물의 발현을 비교하였다. 도 10 에서 나타낸 바와 같이, 하기 5 개 군을 비교한다: 베타-액틴 로딩 대조군 (레인 1), 최적화된 코돈 대조군 구축물 (레인 2), 절두된 hPAH 3'UTR 서열을 함유하는 최적화된 코돈 구축물 (레인 3), 절두된 hPAH 3'UTR 서열을 함유하는 대조군 구축물 (레인 4), 및 결실된 WPRE 서열을 가지며 절두된 hPAH 3'UTR 을 함유하는 구축물 (레인 5). Hepa1-6 암종 세포는 마우스 간 조직으로부터 유래되며, 따라서 레인 1 에서 관찰된 PAH 의 자연적 배경 발현이 존재한다 (표지된 hAAT). 이 실시예는 바람직한 인간 코돈 편향 (PAH-OPT) 을 기반으로 하는 코돈 선택 최적화가, hPAH 발현 수준을 증가시키는데 실패하였음을 설명한다. 야생형 hPAH 유전자에서 관찰된 바와 같이, 절두된 3'UTR (UTR289) 을 포함시키는 것은 hPAH 발현을 증가시키지만 UTR289 에 연결된 야생형 (최적화되지 않은) 서열에서 관찰되는 것보다 실질적으로 낮은 수준으로만 증가시킨다. hAAT-hPAH-3'UTR289 를 함유하는 렌티바이러스 벡터로부터 WPRE 요소를 제거하는 것은 또한 hPAH 발현을 감소시키며, 이는 WPRE 가 최적 단백질 발현에 필요하다는 것을 나타낸다.
실시예
10.
shPAH
-1 및
shPAH
-
2 가 인간
Hep3B
세포에서
hPAH
발현을 감소시킴
이 실시예는 도 11 에서 나타낸 바와 같이, 렌티바이러스-전달된 PAH shRNA 가 인간 Hep3B 세포에서의 hPAH 발현을 감소시킨다는 것을 입증한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인간 Hep3B 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 또한, 이들 구축물에서 hPAH 발현은 hAAT 프로모터에 의해 구동되었다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 렌티바이러스 벡터 (LV) 내의 shRNA 서열의 삽입은 shRNA 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터에 대해 상보적인 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 및 로딩 대조군 베타-액틴을 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다.
도 11 은 2 가지 상이한 shRNA 구축물, 즉 PAH shRNA 서열 #1 (shPAH-1) 및 PAH shRNA 서열 #2 (shPAH-2) 의, Hep3B 세포에서의 hPAH 발현을 감소시키는 능력을 비교한다. 도 11 에서 나타낸 바와 같이, 하기 3 개 구축물을 비교한다: Hep3B 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), Hep3B 세포 + shPAH-1 을 함유하는 구축물 (레인 2), 및 Hep3B 세포 + shPAH-2 를 함유하는 구축물 (레인 3). 특히, Hep3B 세포는 내인성 PAH 를 유의한 수준으로 발현시킨다. 이 실시예는 shPAH-1 및 shPAH-2 둘 모두가 내인성 hPAH 발현 수준을 감소시키는데 있어서 효과적이었음을 설명한다.
실시예
11.
Hep3B
세포에서 내인성
hPAH
및
hAAT
-
hPAH
-
3'UTR
289
의
shPAH
-1 억제
이 실시예는 도 12 에서 나타낸 바와 같이, shPAH-1 이 Hep3B 세포에서 내인성 PAH 및 절두된 hPAH 3'UTR (hAAT-hPAH-3'UTR289) 의 발현을 억제한다는 것을 입증한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인간 Hep3B 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 및 로딩 대조군 베타-액틴을 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다. 전장 및 3'UTR-절두된 구축물 둘 모두에서의 hPAH 발현은 hAAT 프로모터에 의해 구동되었다. 렌티바이러스 벡터는 다양한 경우에, 그의 3'UTR 을 갖는 인간 PAH 유전자, 절두된 3'UTR 을 갖는 인간 PAH 유전자 및/또는 shPAH-1 을 포함하였다. 렌티바이러스 벡터 (LV) 내의 shRNA 서열의 삽입은 shRNA 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터에 대해 상보적인 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. shPAH-1 에 대한 표적 서열은 전장 및 단축 버전 둘 모두에서 보존되는 3'UTR 의 부분에 존재한다.
도 12 는 인간 Hep3B 세포에서의 hPAH 및 PAH shRNA 의 발현을 나타낸다. 도 12 에서 나타낸 바와 같이, 하기 4 개 군을 비교한다: Hep3B 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), Hep3B 세포 + shPAH-1 을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 군 (레인 2), hAAT-hPAH-3'UTR289 단독을 포함하는 대조군 (레인 3), 및 hAAT-hPAH-3'UTR289 및 shPAH-1 을 발현하는 렌티바이러스 벡터 둘 모두를 함유하는 군 (레인 4). 특히, Hep3B 세포 단독은 내인성 PAH 를 유의한 수준으로 발현시킨다. 이 실시예는 shPAH-1 이 내인성 PAH 및 hAAT-hPAH-3'UTR289 의 발현 둘 모두를 억제한다는 것을 설명한다. 또한, 이는 Hep3B 세포에서 내인성 PAH 및 hAAT-hPAH-3'UTR289 에 대한 shPAH-1의 유의한 효능을 확인시켜준다.
실시예
12.
HepG2
세포에서 내인성
hPAH
의
shPAH
-2 억제, 그러나
hAAT
-hPAH-3'UTR
289
에 대해서는 억제하지 않음
이 실시예는 도 13 에서 나타낸 바와 같이, shPAH-2 이 HepG2 세포에서 내인성 PAH 의 발현을 억제하나 hAAT-hPAH-3'UTR289 의 발현은 억제하지 않는다는 것을 설명한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인간 Hep3B 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 및 로딩 대조군 베타-액틴을 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다. 전장 및 3'UTR-절두된 구축물 둘 모두에서의 hPAH 발현은 hAAT 프로모터에 의해 구동되었다. 렌티바이러스 벡터는 다양한 경우에, 그의 3'UTR 을 갖는 인간 PAH 유전자, 절두된 3'UTR 을 갖는 인간 PAH 유전자 및/또는 shPAH-2 을 포함하였다. 렌티바이러스 벡터 (LV) 내의 shRNA 서열의 삽입은 shPAH-2 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터에 대해 상보적인 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. shPAH-2 에 대한 표적 서열은 전장 hPAH 구축물에 존재하지만 절두된 hPAH 구축물 (hAAT-hPAH-3'UTR289) 에는 부재하는 hPAH 3'UTR 의 원위 부분에 존재한다.
도 13 은 인간 Hep3B 세포에서의 hPAH 및 PAH shRNA 의 발현을 나타낸다. 도 13 에서 나타낸 바와 같이, 하기 4 개 군을 비교한다: HepG2 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), HepG2 세포 + shPAH-2 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), 절두된 hPAH 3'UTR 을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 대조군 (레인 3), 및 절두된 hPAH 3'UTR (hPAH-3'UTR) 을 발현하는 렌티바이러스 벡터 및 shPAH-2 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 둘 모두를 포함하는 레인 (레인 4). 이 실시예는 shPAH-2 서열이 내인성 PAH 의 발현을 억제하지만 hAAT-hPAH-3'UTR289 의 발현에는 확실한 효과를 갖지 않는다는 것을 설명한다.
실시예
13.
Pah
(
enu2
)
마우스
에서
hAAT
-
PAH
-
UTR
의 예비 시험
도 14 는 PKU 에 대한 실험적 연구를 위한 표준 모델인 Pah(enu2) 마우스에서의 hAAT-PAH-UTR 의 예비 시험 결과를 요약한다 (Shedlovsky, McDonald et al. 1993, Fang, Eisensmith et al. 1994, Mochizuki, Mizukami et al. 2004, Oh, Park et al. 2004). 패널 A 는 신생아 Pah(enu2) 마우스의 간에 직접 주사된 렌티바이러스 벡터 hAAT-PAH 가, PAH 를 발현하지 않는 대조군 렌티바이러스 벡터만을 받은 마우스에서 나타난 성장 결함을 실질적으로 교정한다는 것을 보여준다. 패널 B 는 정상 마우스에 대한 체중 증가 곡선과 LV-hAAT-PAH 로 처리된 Pah(enu2) 사이에 명백한 중첩을 나타내는 패널 A 에서의 데이터의 클러스터 플롯 표시를 제공한다. 패널 C 는 LV-hAAT-PAH 가 암컷 마우스에서 효과적이었다는 것을 보여준다. 암컷에서의 PAH 결함은 수컷 마우스에 비해 교정하기가 더 어려우므로, 이는 중요한 것이다. 패널 D 는 대조군 (정상) 마우스, LV-hAAT-PAH 로 처리된 Pah(enu2) 마우스 및 PAH 를 발현하지 않는 대조군 렌티바이러스 벡터로 처리된 Pah(enu2) 마우스에 대한 혈장 페닐알라닌 수준을 플롯팅한다.
실험 방법론:
1 내지 2 일령의 신생아 마우스를 각각 4 마리 신생아 마우스의 3 개 군으로 나누었다. 신생아 마우스의 제 1 군은 정상적인 PAH 발현 활성을 갖는 대조군을 포함한다. 신생아 마우스의 제 2 및 제 3 군은 돌연변이 PAH(enu2) 를 함유하며, 이는 PAH 의 효소 활성을 억제하는 PAH 유전자에서 화학적으로 유도된 돌연변이이다.
신생아 마우스의 제 1 군에 hAAT 프로모터, 인간 PAH, 신장 인자 (EF1) 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 주사하였다. 신생아 마우스의 제 2 군에 인간 PAH 가 없으나 hAAT 프로모터, 신장 인자 (EF1) 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 주사하였다. 신생아 마우스의 제 3 군에 hAAT 프로모터, 인간 PAH, 신장 인자 (EF1) 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 주사하였다.
신생아 마우스에 생리식염수 또는 혈장 대체재 1 ㎖ 당 1x106 내지 1x1010 형질도입 단위를 함유하는 10 ㎕ 의 렌티바이러스 입자 현탁액을 간에 직접 주사하였다. 주사하기 전에, 신생아 마우스를 클로드로네이트 (clodronate) 리포솜으로 처리하여 간 쿠퍼 세포 (liver Kupffer cell) 를 고갈시켰다.
신생아 마우스를 털 색 변화, PAH 및 페닐알라닌 수준, 및 거동을 포함하여 혈액에서 감소된 페닐알라닌 수준과 관련된 표현형 변화에 대해 모니터링하였다. 주사 후 0, 4 및 8 주에, 혈액 페닐알라닌 수준을 측정하였다. 주사 후 0, 2, 4 및 8 주에, 신생아 마우스 체중을 측정하였다. 군 3 에서의 신생아 마우스의 성장이 군 2 에서의 신생아 마우스의 성장에 비해 개선된 경우, T-미로 자발적 교차 시험 (T-maze Spontaneous Alternation Test) 및 윈-스테이 8-팔 방사형 미로 작업 (Win-Stay Eight-arm Radial Maze Task) 을 포함하는 거동 시험이 수행될 것이다. 주사 후 8 주에, 각 군으로터 2 마리의 마우스가 희생되고 간에서의 인간 PAH 발현이 측정될 것이다. 희생된 마우스에 대해 메틸옴 (Methylome) 평가 및 긴 뼈와 척추 뼈 평가가 수행될 것이다. 남아 있는 마우스를 유지시켰고, 주사 후 6 개월에 혈액 페닐알라닌을 측정할 것이다.
실시예
14.
Hepa1
-6 마우스 간암 세포에서
hAAT
및
CMV
프로모터를 사용하는 인간
PAH
유전자의
렌티바이러스
-전달된 발현
이 실시예는 도 15 에서 나타낸 바와 같이, CMV 즉시 초기 프로모터의 제어 하에 hPAH 발현 구축물을 이용하는 것이 3'UTR 의 존재 또는 부재에 관계없이, 그리고 3'UTR 이 절두되었는지 여부에 관계없이 높은 수준 발현을 제공한다는 것을 설명한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인간 Hep3B 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 인간 PAH 의 상대 발현은 항-PAH 항체 (Abcam) 또는 로딩 대조군으로서 항-튜불린 항체 (Sigma) 를 사용하는 면역블롯에 의해 검출되었다. 전장 및 3'UTR-절두된 구축물 둘 모두에서의 hPAH 발현은 각각 hAAT 프로모터 또는 CMV 프로모터에 의해 구동되었다. 렌티바이러스 벡터는 다양한 경우에, 그의 3'UTR 을 갖는 인간 PAH 유전자, 절두된 3'UTR 을 갖는 인간 PAH 유전자를, hAAT 프로모터 또는 CMV 프로모터의 존재 또는 부재 하에 포함하였다.
도 15 에서 나타낸 바와 같이, 하기 4 개 군을 비교한다: Hepa1-6 세포 및 hAAT 프로모터 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), hAAT 프로모터의 제어 하에 전장 3'UTR hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), hAAT 프로모터의 제어 하에 절두된 3'UTR hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3) 및 CMV 프로모터의 제어 하에 절두된 3'UTR hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 군 (레인 4). 이 실시예는 CMV 즉시 초기 프로모터의 제어 하의 hPAH 발현이 UTR 의 존재 또는 부재에 관계없이, 그리고 UTR 이 절두되었는지 여부에 관계없이 높은 수준 발현을 야기한다는 것을 설명한다. 이는 hPAH 의 높은 수준 생성을 달성하면서 간 조직에서 특이적 발현을 위한 구축물의 생성을 허용한다. 특히, 간 세포에 대한 이식유전자 발현을 제한하는 것은, 페닐케톤뇨증에 대한 유전적 약물에서 벡터 안전성 및 표적 특이성을 위한 중요한 고려 사항이다.
실시예
15. 마우스
Hepa1
-6 세포에서
hAAT
프로모터 및 간-특이적
인핸서
요소
ApoE
(1),
ApoE
(2), 또는 프로트롬빈을 갖는 발현 구축물을 사용하는
hPAH
의
렌티바이러스
-전달된 발현
이 실시예는 ApoE (1), ApoE (2) 및 프로트롬빈 인핸서가 마우스 Hepa1-6 세포에서 PAH 의 발현을 증가시키기 위해 이용될 수 있다는 것을 설명한다.
인간 PAH 를 합성하고 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그런 다음, hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인간 Hep3B 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 에서 구입) 를 형질도입시켰다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 2-4 일 후 단백질을 PAH 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. PAH 는 항-PAH 항체 및 항-베타 액틴 항체 (로딩 대조군용) 를 사용하는 면역 블롯에 의해 검출되었다.
도 16 에서 나타낸 바와 같이, 하기 4 개 군을 비교한다: Hepa1-6 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), hAAT 프로모터의 제어 하의 전장 3'UTR hPAH 를 갖는 ApoE(1) 인핸서를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), hAAT 프로모터의 제어 하의 전장 3'UTR hPAH 를 갖는 ApoE(2) 인핸서를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3) 및 hAAT 프로모터의 제어 하의 전장 3'UTR hPAH 를 갖는 프로트롬빈 인핸서를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4). 이 실시예는 ApoE (1), ApoE (2) 및 프로트롬빈 인핸서가 각각 hAAT 프로모터의 제어 하에 마우스 Hepa1-6 세포에서 PAH 의 발현을 증가시키기 위해 이용될 수 있다는 것을 설명한다.
상기 실시예 구현예의 개시물은 하기 청구범위 및 그의 등가물에 나타내는 본 발명의 범주를 예시하는 것으로 의도되지만 이를 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 구현예가 이해의 명확성을 목적으로 일부 상세히 기재되었으나, 특정 변화 및 변형이 하기의 청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 하기 청구범위에서, 요소 및/또는 단계는 청구범위에 명시적으로 언급되거나 본 개시물에 의해 암시적으로 요구되지 않는 한, 임의의 특정 작업 순서를 의미하지 않는다.
서열 목록
<110> American Gene Technologies International Inc.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PHENYLKETONURIA
<130> 70612.00716
<140> WO PCT/US2018/025733
<141> 2018-04-02
<150> US 62/480,962
<151> 2017-04-03
<150> US 62/491,118
<151> 2017-04-27
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAH
<400> 1
atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60
gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120
ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180
aacctgaccc acattgaatc tagaccttct cgtttaaaga aagatgagta tgaatttttc 240
acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300
gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cgagataaga agaaagacac agtgccctgg 360
ttcccaagaa ccattcaaga gctggacaga tttgccaatc agattctcag ctatggagcg 420
gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480
tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540
gaggaagaaa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600
catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660
gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720
cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780
cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840
cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900
cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960
ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020
aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080
aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140
gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200
aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260
attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320
attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359
<210> 2
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimized PAH
<400> 2
atgagcacag ctgtgttgga aaatcctggg ctgggccgta agctttccga tttcggccag 60
gagacttcat acattgagga caactgcaac cagaatgggg ccatttcttt gatcttcagt 120
ctcaaagaag aggtaggcgc tctggctaag gtcctgaggc tgtttgagga aaatgacgtg 180
aatctgacac acattgagtc taggccttcc cgacttaaga aggatgagta tgagttcttc 240
acacacctgg acaaacgatc tctcccagca ctgaccaata tcatcaagat tctcaggcat 300
gatatcggtg ccacggtcca cgaactttca cgcgataaga agaaagacac agttccctgg 360
ttcccgagaa ccattcagga actggatagg tttgccaatc agattctgag ctatggggca 420
gagttggatg ccgaccatcc aggcttcaaa gaccccgtat atcgggctcg gagaaagcag 480
tttgcagaca tcgcttacaa ttacaggcat ggacagccca tccctagagt ggagtacatg 540
gaagaaggca agaaaacctg gggaacggtg tttaagaccc tcaaaagcct gtataagacc 600
cacgcgtgtt atgagtacaa ccacattttc ccattgctgg agaagtactg tggctttcac 660
gaggacaaca tccctcaact ggaggatgtt tcacagttcc ttcagacttg cactggtttc 720
cgccttcgac ctgtggctgg gctgcttagc tcacgggact tcctgggagg cctggccttc 780
agagtctttc actgcactca gtacattcgg catggctcta agccaatgta cacccctgaa 840
ccggatatat gccacgagct gttgggacat gtgcccctgt tttctgatcg cagctttgcc 900
cagttttccc aggagattgg cctggcaagt cttggtgcgc ctgatgagta catcgagaag 960
ctcgcgacaa tctactggtt caccgtggaa tttggactct gcaaacaagg ggactctatc 1020
aaagcctacg gagcaggact cctctccagc ttcggtgaac tgcagtattg tctgtccgag 1080
aaacccaaac tcttgcccct ggaactggaa aagactgcca tccaaaacta tactgtcacg 1140
gaatttcagc cactgtatta tgtggctgaa tcctttaacg atgccaagga gaaggtccgt 1200
aattttgctg ccacaatacc acgccccttc agcgtgagat acgacccgta tacacaacgg 1260
atagaggttc tggacaacac ccagcaactg aaaattctgg cagacagtat aaacagcgaa 1320
atagggatcc tctgtagtgc cctgcagaaa atcaaatga 1359
<210> 3
<211> 897
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAH 3'UTR sequence (897 nucleotides)
<400> 3
agccatggac agaatgtggt ctgtcagctg tgaatctgtt gatggagatc caactatttc 60
tttcatcaga aaaagtccga aaagcaaacc ttaatttgaa ataacagcct taaatccttt 120
acaagatgga gaaacaacaa ataagtcaaa ataatctgaa atgacaggat atgagtacat 180
actcaagagc ataatggtaa atcttttggg gtcatctttg atttagagat gataatccca 240
tactctcaat tgagttaaat cagtaatctg tcgcatttca tcaagattaa ttaaaatttg 300
ggacctgctt cattcaagct tcatatatgc tttgcagaga actcataaag gagcatataa 360
ggctaaatgt aaaacccaag actgtcatta gaattgaatt attgggctta atataaatcg 420
taacctatga agtttatttt ttattttagt taactatgat tccaattact actttgttat 480
tgtacctaag taaattttct ttaagtcaga agcccattaa aatagttaca agcattgaac 540
ttctttagta ttatattaat ataaaaacat ttttgtatgt tttattgtaa tcataaatac 600
tgctgtataa ggtaataaaa ctctgcacct aatccccata acttccagta tcattttcca 660
attaattatc aagtctgttt tgggaaacac tttgaggaca tttatgatgc agcagatgtt 720
gactaaaggc ttggttggta gatattcagg aaatgttcac tgaataaata agtaaataca 780
ttattgaaaa gcaaatctgt ataaatgtga aatttttatt tgtattagta ataaaacatt 840
agtagtttaa acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaactcgact ctagatt 897
<210> 4
<211> 289
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAH 3'UTR sequence (289 nucleotides)
<400> 4
agccatggac agaatgtggt ctgtcagctg tgaatctgtt gatggagatc caactatttc 60
tttcatcaga aaaagtccga aaagcaaacc ttaatttgaa ataacagcct taaatccttt 120
acaagatgga gaaacaacaa ataagtcaaa ataatctgaa atgacaggat atgagtacat 180
actcaagagc ataatggtaa atcttttggg gtcatctttg atttagagat gataatccca 240
tactctcaat tgagttaaat cagtaatctg tcgcatttca tcaagatta 289
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAH shRNA sequence #1
<400> 5
tcgcatttca tcaagattaa tctcgagatt aatcttgatg aaatgcgatt ttt 53
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAH shRNA sequence #2
<400> 6
actcataaag gagcatataa gctcgagctt atatgctcct ttatgagttt ttt 53
<210> 7
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rous Sarcoma virus (RSV) promoter
<400> 7
gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 60
cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 120
tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 180
gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacg 228
<210> 8
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' Long terminal repeat (LTR)
<400> 8
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180
180
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Psi Packaging signal
<400> 9
tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga g 41
<210> 10
<211> 233
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rev response element (RRE)
<400> 10
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233
<210> 11
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Central polypurine tract (cPPT)
<400> 11
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaatttta 118
<210> 12
<211> 397
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human alpha-1 antitrypsin promoter (hAAT)
<400> 12
gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60
agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120
gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180
ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240
tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300
cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360
cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat 397
<210> 13
<211> 590
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Long WPRE sequence
<400> 13
aatcaacctc tgattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60
cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120
tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180
ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240
gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300
ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360
tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420
cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480
atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540
gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct 590
<210> 14
<211> 250
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' delta LTR
<400> 14
tggaagggct aattcactcc caacgaagat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta 240
gttcatgtca 250
<210> 15
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1 Promoter
<400> 15
gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60
cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120
tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180
gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accactt 217
<210> 16
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAG promoter
<400> 16
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 540
ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 600
cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cg 642
<210> 17
<211> 1503
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV Gag
<400> 17
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300
ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360
gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420
caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480
gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540
ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600
ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660
gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720
agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780
atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840
agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900
tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960
ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020
gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080
agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140
ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500
taa 1503
<210> 18
<211> 1872
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV Pol
<400> 18
atgaatttgc caggaagatg gaaaccaaaa atgatagggg gaattggagg ttttatcaaa 60
gtaggacagt atgatcagat actcatagaa atctgcggac ataaagctat aggtacagta 120
ttagtaggac ctacacctgt caacataatt ggaagaaatc tgttgactca gattggctgc 180
actttaaatt ttcccattag tcctattgag actgtaccag taaaattaaa gccaggaatg 240
gatggcccaa aagttaaaca atggccattg acagaagaaa aaataaaagc attagtagaa 300
atttgtacag aaatggaaaa ggaaggaaaa atttcaaaaa ttgggcctga aaatccatac 360
aatactccag tatttgccat aaagaaaaaa gacagtacta aatggagaaa attagtagat 420
ttcagagaac ttaataagag aactcaagat ttctgggaag ttcaattagg aataccacat 480
cctgcagggt taaaacagaa aaaatcagta acagtactgg atgtgggcga tgcatatttt 540
tcagttccct tagataaaga cttcaggaag tatactgcat ttaccatacc tagtataaac 600
aatgagacac cagggattag atatcagtac aatgtgcttc cacagggatg gaaaggatca 660
ccagcaatat tccagtgtag catgacaaaa atcttagagc cttttagaaa acaaaatcca 720
gacatagtca tctatcaata catggatgat ttgtatgtag gatctgactt agaaataggg 780
cagcatagaa caaaaataga ggaactgaga caacatctgt tgaggtgggg atttaccaca 840
ccagacaaaa aacatcagaa agaacctcca ttcctttgga tgggttatga actccatcct 900
gataaatgga cagtacagcc tatagtgctg ccagaaaagg acagctggac tgtcaatgac 960
atacagaaat tagtgggaaa attgaattgg gcaagtcaga tttatgcagg gattaaagta 1020
aggcaattat gtaaacttct taggggaacc aaagcactaa cagaagtagt accactaaca 1080
gaagaagcag agctagaact ggcagaaaac agggagattc taaaagaacc ggtacatgga 1140
gtgtattatg acccatcaaa agacttaata gcagaaatac agaagcaggg gcaaggccaa 1200
tggacatatc aaatttatca agagccattt aaaaatctga aaacaggaaa atatgcaaga 1260
atgaagggtg cccacactaa tgatgtgaaa caattaacag aggcagtaca aaaaatagcc 1320
acagaaagca tagtaatatg gggaaagact cctaaattta aattacccat acaaaaggaa 1380
acatgggaag catggtggac agagtattgg caagccacct ggattcctga gtgggagttt 1440
gtcaataccc ctcccttagt gaagttatgg taccagttag agaaagaacc cataatagga 1500
gcagaaactt tctatgtaga tggggcagcc aatagggaaa ctaaattagg aaaagcagga 1560
tatgtaactg acagaggaag acaaaaagtt gtccccctaa cggacacaac aaatcagaag 1620
actgagttac aagcaattca tctagctttg caggattcgg gattagaagt aaacatagtg 1680
acagactcac aatatgcatt gggaatcatt caagcacaac cagataagag tgaatcagag 1740
ttagtcagtc aaataataga gcagttaata aaaaaggaaa aagtctacct ggcatgggta 1800
ccagcacaca aaggaattgg aggaaatgaa caagtagatg ggttggtcag tgctggaatc 1860
aggaaagtac ta 1872
<210> 19
<211> 867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV Int
<400> 19
tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60
gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120
gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180
tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240
agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300
ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360
ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420
attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480
attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540
ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600
gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660
caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720
ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780
ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840
gtggcaagta gacaggatga ggattaa 867
<210> 20
<211> 234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV RRE
<400> 20
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234
<210> 21
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV Rev
<400> 21
atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gaactcctca aggcagtcag actcatcaag 60
tttctctatc aaagcaaccc acctcccaat cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 120
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatcctt 180
agcacttatc tgggacgatc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccacc gcttgagaga 240
cttactcttg attgtaacga ggattgtgga acttctggga cgcagggggt gggaagccct 300
caaatattgg tggaatctcc tacaatattg gagtcaggag ctaaagaata g 351
<210> 22
<211> 577
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV Promoter
<400> 22
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360
agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420
gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480
gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 540
gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagc 577
<210> 23
<211> 1531
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VSV-G / DNA fragment containing VSV-G / Envelope Glycoprotein
<400> 23
gaattcatga agtgcctttt gtacttagcc tttttattca ttggggtgaa ttgcaagttc 60
accatagttt ttccacacaa ccaaaaagga aactggaaaa atgttccttc taattaccat 120
tattgcccgt caagctcaga tttaaattgg cataatgact taataggcac agccttacaa 180
gtcaaaatgc ccaagagtca caaggctatt caagcagacg gttggatgtg tcatgcttcc 240
aaatgggtca ctacttgtga tttccgctgg tatggaccga agtatataac acattccatc 300
cgatccttca ctccatctgt agaacaatgc aaggaaagca ttgaacaaac gaaacaagga 360
acttggctga atccaggctt ccctcctcaa agttgtggat atgcaactgt gacggatgcc 420
gaagcagtga ttgtccaggt gactcctcac catgtgctgg ttgatgaata cacaggagaa 480
tgggttgatt cacagttcat caacggaaaa tgcagcaatt acatatgccc cactgtccat 540
aactctacaa cctggcattc tgactataag gtcaaagggc tatgtgattc taacctcatt 600
tccatggaca tcaccttctt ctcagaggac ggagagctat catccctggg aaaggagggc 660
acagggttca gaagtaacta ctttgcttat gaaactggag gcaaggcctg caaaatgcaa 720
tactgcaagc attggggagt cagactccca tcaggtgtct ggttcgagat ggctgataag 780
gatctctttg ctgcagccag attccctgaa tgcccagaag ggtcaagtat ctctgctcca 840
tctcagacct cagtggatgt aagtctaatt caggacgttg agaggatctt ggattattcc 900
ctctgccaag aaacctggag caaaatcaga gcgggtcttc caatctctcc agtggatctc 960
agctatcttg ctcctaaaaa cccaggaacc ggtcctgctt tcaccataat caatggtacc 1020
ctaaaatact ttgagaccag atacatcaga gtcgatattg ctgctccaat cctctcaaga 1080
atggtcggaa tgatcagtgg aactaccaca gaaagggaac tgtgggatga ctgggcacca 1140
tatgaagacg tggaaattgg acccaatgga gttctgagga ccagttcagg atataagttt 1200
cctttataca tgattggaca tggtatgttg gactccgatc ttcatcttag ctcaaaggct 1260
caggtgttcg aacatcctca cattcaagac gctgcttcgc aacttcctga tgatgagagt 1320
ttattttttg gtgatactgg gctatccaaa aatccaatcg agcttgtaga aggttggttc 1380
agtagttgga aaagctctat tgcctctttt ttctttatca tagggttaat cattggacta 1440
ttcttggttc tccgagttgg tatccatctt tgcattaaat taaagcacac caagaaaaga 1500
cagatttata cagacataga gatgagaatt c 1531
<210> 24
<211> 352
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAG enhancer
<400> 24
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tc 352
<210> 25
<211> 960
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chicken beta actin intron
<400> 25
ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120
ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180
cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240
gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 300
gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 360
gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 420
gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 480
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg 540
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 600
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg 660
tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg 720
acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct 780
agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc 840
gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga 900
cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 960
960
<210> 26
<211> 448
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabbit beta globin poly A
<400> 26
agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 60
ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 120
ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 180
ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag 240
gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 300
cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 360
aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 420
tagctgtccc tcttctctta tgaagatc 448
<210> 27
<211> 573
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta globin intron
<400> 27
gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60
ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120
ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180
cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240
atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300
tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360
ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420
cttattggta gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480
tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540
aaccatgttc atgccttctt ctctttccta cag 573
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 28
taagcagaat tcatgaattt gccaggaaga t 31
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 29
ccatacaatg aatggacact aggcggccgc acgaat 36
<210> 30
<211> 2745
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gag, Pol, Integrase fragment
<400> 30
gaattcatga atttgccagg aagatggaaa ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt 60
atcaaagtaa gacagtatga tcagatactc atagaaatct gcggacataa agctataggt 120
acagtattag taggacctac acctgtcaac ataattggaa gaaatctgtt gactcagatt 180
ggctgcactt taaattttcc cattagtcct attgagactg taccagtaaa attaaagcca 240
ggaatggatg gcccaaaagt taaacaatgg ccattgacag aagaaaaaat aaaagcatta 300
gtagaaattt gtacagaaat ggaaaaggaa ggaaaaattt caaaaattgg gcctgaaaat 360
ccatacaata ctccagtatt tgccataaag aaaaaagaca gtactaaatg gagaaaatta 420
gtagatttca gagaacttaa taagagaact caagatttct gggaagttca attaggaata 480
ccacatcctg cagggttaaa acagaaaaaa tcagtaacag tactggatgt gggcgatgca 540
tatttttcag ttcccttaga taaagacttc aggaagtata ctgcatttac catacctagt 600
ataaacaatg agacaccagg gattagatat cagtacaatg tgcttccaca gggatggaaa 660
ggatcaccag caatattcca gtgtagcatg acaaaaatct tagagccttt tagaaaacaa 720
aatccagaca tagtcatcta tcaatacatg gatgatttgt atgtaggatc tgacttagaa 780
atagggcagc atagaacaaa aatagaggaa ctgagacaac atctgttgag gtggggattt 840
accacaccag acaaaaaaca tcagaaagaa cctccattcc tttggatggg ttatgaactc 900
catcctgata aatggacagt acagcctata gtgctgccag aaaaggacag ctggactgtc 960
aatgacatac agaaattagt gggaaaattg aattgggcaa gtcagattta tgcagggatt 1020
aaagtaaggc aattatgtaa acttcttagg ggaaccaaag cactaacaga agtagtacca 1080
ctaacagaag aagcagagct agaactggca gaaaacaggg agattctaaa agaaccggta 1140
catggagtgt attatgaccc atcaaaagac ttaatagcag aaatacagaa gcaggggcaa 1200
ggccaatgga catatcaaat ttatcaagag ccatttaaaa atctgaaaac aggaaagtat 1260
gcaagaatga agggtgccca cactaatgat gtgaaacaat taacagaggc agtacaaaaa 1320
atagccacag aaagcatagt aatatgggga aagactccta aatttaaatt acccatacaa 1380
aaggaaacat gggaagcatg gtggacagag tattggcaag ccacctggat tcctgagtgg 1440
gagtttgtca atacccctcc cttagtgaag ttatggtacc agttagagaa agaacccata 1500
ataggagcag aaactttcta tgtagatggg gcagccaata gggaaactaa attaggaaaa 1560
gcaggatatg taactgacag aggaagacaa aaagttgtcc ccctaacgga cacaacaaat 1620
cagaagactg agttacaagc aattcatcta gctttgcagg attcgggatt agaagtaaac 1680
atagtgacag actcacaata tgcattggga atcattcaag cacaaccaga taagagtgaa 1740
tcagagttag tcagtcaaat aatagagcag ttaataaaaa aggaaaaagt ctacctggca 1800
tgggtaccag cacacaaagg aattggagga aatgaacaag tagataaatt ggtcagtgct 1860
ggaatcagga aagtactatt tttagatgga atagataagg cccaagaaga acatgagaaa 1920
tatcacagta attggagagc aatggctagt gattttaacc taccacctgt agtagcaaaa 1980
gaaatagtag ccagctgtga taaatgtcag ctaaaagggg aagccatgca tggacaagta 2040
gactgtagcc caggaatatg gcagctagat tgtacacatt tagaaggaaa agttatcttg 2100
gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag taattccagc agagacaggg 2160
caagaaacag catacttcct cttaaaatta gcaggaagat ggccagtaaa aacagtacat 2220
acagacaatg gcagcaattt caccagtact acagttaagg ccgcctgttg gtgggcgggg 2280
atcaagcagg aatttggcat tccctacaat ccccaaagtc aaggagtaat agaatctatg 2340
aataaagaat taaagaaaat tataggacag gtaagagatc aggctgaaca tcttaagaca 2400
gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac 2460
agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa 2520
aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag agatccagtt 2580
tggaaaggac cagcaaagct cctctggaaa ggtgaagggg cagtagtaat acaagataat 2640
agtgacataa aagtagtgcc aagaagaaaa gcaaagatca tcagggatta tggaaaacag 2700
atggcaggtg atgattgtgt ggcaagtaga caggatgagg attaa 2745
<210> 31
<211> 1586
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Fragment containing Rev, RRE and rabbit beta globin poly A
<400> 31
tctagaatgg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc 60
atcaagcttc tctatcaaag caacccacct cccaatcccg aggggacccg acaggcccga 120
aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 180
atccttggca cttatctggg acgatctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accaccgctt 240
gagagactta ctcttgattg taacgaggat tgtggaactt ctgggacgca gggggtggga 300
agccctcaaa tattggtgga atctcctaca atattggagt caggagctaa agaatagagg 360
agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 420
gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 480
gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 540
ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tagatctttt 600
tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta 660
ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 720
aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt 780
ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg gctataaaga ggtcatcagt 840
atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt 900
agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct 960
tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc 1020
ctcttctctt atgaagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag 1080
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 1140
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 1200
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt 1260
cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg 1320
cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct 1380
cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca 1440
aaaagctaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 1500
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1560
tgtatcttat cagcggccgc cccggg 1586
<210> 32
<211> 1614
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment containing the CAG enhancer/promoter/intron sequence
<400> 32
acgcgttagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180
acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360
tattaccatg ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 420
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 480
gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 540
cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 600
aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 660
ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 720
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 780
cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc 840
cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 900
ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg 960
gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt 1020
gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc 1080
agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta acccccccct gcacccccct ccccgagttg 1140
ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtgcggg gcgtggcgcg gggctcgccg 1200
tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg 1260
gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc 1320
gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc 1380
ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg 1440
cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc 1500
gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc ggggctgccg cagggggacg gctgccttcg 1560
ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggga attc 1614
<210> 33
<211> 884
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV promoter and HIV Rev
<400> 33
caattgcgat gtacgggcca gatatacgcg tatctgaggg gactagggtg tgtttaggcg 60
aaaagcgggg cttcggttgt acgcggttag gagtcccctc aggatatagt agtttcgctt 120
ttgcataggg agggggaaat gtagtcttat gcaatacact tgtagtcttg caacatggta 180
acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg 240
gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacaggtct gacatggatt 300
ggacgaacca ctgaattccg cattgcagag ataattgtat ttaagtgcct agctcgatac 360
aataaacgcc atttgaccat tcaccacatt ggtgtgcacc tccaagctcg agctcgttta 420
gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 480
cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagcta gcgattaggc atctcctatg gcaggaagaa 540
gcggagacag cgacgaagaa ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 600
gcaacccacc tcccaatccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt 660
ggagagagag acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatccttagc acttatctgg 720
gacgatctgc ggagcctgtg cctcttcagc taccaccgct tgagagactt actcttgatt 780
gtaacgagga ttgtggaact tctgggacgc agggggtggg aagccctcaa atattggtgg 840
aatctcctac aatattggag tcaggagcta aagaatagtc taga 884
<210> 34
<211> 1104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elongation Factor-1 alpha (EF1-alpha) promoter
<400> 34
ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 60
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 120
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc 180
ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg cccctggctg 240
cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct 300
tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc 360
cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta 420
gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta 480
aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg 540
gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga 600
atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg 660
tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa 720
agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga 780
gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct 840
tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt 900
tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact 960
gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt 1020
gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt 1080
tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1104
<210> 35
<211> 511
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promoter-PGK
<400> 35
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511
<210> 36
<211> 1162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promoter-UbC
<400> 36
gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60
agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120
ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180
cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240
gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300
taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360
cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420
gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480
tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540
tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600
aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660
cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720
gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780
gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840
acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900
ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960
gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020
tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080
tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140
ttttcagtgt tagactagta aa 1162
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poly A-SV40
<400> 37
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 60
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 120
120
<210> 38
<211> 227
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poly A-bGH
<400> 38
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 60
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 120
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 180
ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatgg 227
<210> 39
<211> 1695
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-RD114
<400> 39
atgaaactcc caacaggaat ggtcatttta tgtagcctaa taatagttcg ggcagggttt 60
gacgaccccc gcaaggctat cgcattagta caaaaacaac atggtaaacc atgcgaatgc 120
agcggagggc aggtatccga ggccccaccg aactccatcc aacaggtaac ttgcccaggc 180
aagacggcct acttaatgac caaccaaaaa tggaaatgca gagtcactcc aaaaaatctc 240
acccctagcg ggggagaact ccagaactgc ccctgtaaca ctttccagga ctcgatgcac 300
agttcttgtt atactgaata ccggcaatgc agggcgaata ataagacata ctacacggcc 360
accttgctta aaatacggtc tgggagcctc aacgaggtac agatattaca aaaccccaat 420
cagctcctac agtccccttg taggggctct ataaatcagc ccgtttgctg gagtgccaca 480
gcccccatcc atatctccga tggtggagga cccctcgata ctaagagagt gtggacagtc 540
caaaaaaggc tagaacaaat tcataaggct atgcatcctg aacttcaata ccacccctta 600
gccctgccca aagtcagaga tgaccttagc cttgatgcac ggacttttga tatcctgaat 660
accactttta ggttactcca gatgtccaat tttagccttg cccaagattg ttggctctgt 720
ttaaaactag gtacccctac ccctcttgcg atacccactc cctctttaac ctactcccta 780
gcagactccc tagcgaatgc ctcctgtcag attatacctc ccctcttggt tcaaccgatg 840
cagttctcca actcgtcctg tttatcttcc cctttcatta acgatacgga acaaatagac 900
ttaggtgcag tcacctttac taactgcacc tctgtagcca atgtcagtag tcctttatgt 960
gccctaaacg ggtcagtctt cctctgtgga aataacatgg catacaccta tttaccccaa 1020
aactggacag gactttgcgt ccaagcctcc ctcctccccg acattgacat catcccgggg 1080
gatgagccag tccccattcc tgccattgat cattatatac atagacctaa acgagctgta 1140
cagttcatcc ctttactagc tggactggga atcaccgcag cattcaccac cggagctaca 1200
ggcctaggtg tctccgtcac ccagtataca aaattatccc atcagttaat atctgatgtc 1260
caagtcttat ccggtaccat acaagattta caagaccagg tagactcgtt agctgaagta 1320
gttctccaaa ataggagggg actggaccta ctaacggcag aacaaggagg aatttgttta 1380
gccttacaag aaaaatgctg tttttatgct aacaagtcag gaattgtgag aaacaaaata 1440
agaaccctac aagaagaatt acaaaaacgc agggaaagcc tggcatccaa ccctctctgg 1500
accgggctgc agggctttct tccgtacctc ctacctctcc tgggacccct actcaccctc 1560
ctactcatac taaccattgg gccatgcgtt ttcaatcgat tggtccaatt tgttaaagac 1620
aggatctcag tggtccaggc tctggttttg actcagcaat atcaccagct aaaacccata 1680
gagtacgagc catga 1695
<210> 40
<211> 2013
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-GALV
<400> 40
atgcttctca cctcaagccc gcaccacctt cggcaccaga tgagtcctgg gagctggaaa 60
agactgatca tcctcttaag ctgcgtattc ggagacggca aaacgagtct gcagaataag 120
aacccccacc agcctgtgac cctcacctgg caggtactgt cccaaactgg ggacgttgtc 180
tgggacaaaa aggcagtcca gcccctttgg acttggtggc cctctcttac acctgatgta 240
tgtgccctgg cggccggtct tgagtcctgg gatatcccgg gatccgatgt atcgtcctct 300
aaaagagtta gacctcctga ttcagactat actgccgctt ataagcaaat cacctgggga 360
gccatagggt gcagctaccc tcgggctagg accaggatgg caaattcccc cttctacgtg 420
tgtccccgag ctggccgaac ccattcagaa gctaggaggt gtggggggct agaatcccta 480
tactgtaaag aatggagttg tgagaccacg ggtaccgttt attggcaacc caagtcctca 540
tgggacctca taactgtaaa atgggaccaa aatgtgaaat gggagcaaaa atttcaaaag 600
tgtgaacaaa ccggctggtg taaccccctc aagatagact tcacagaaaa aggaaaactc 660
tccagagatt ggataacgga aaaaacctgg gaattaaggt tctatgtata tggacaccca 720
ggcatacagt tgactatccg cttagaggtc actaacatgc cggttgtggc agtgggccca 780
gaccctgtcc ttgcggaaca gggacctcct agcaagcccc tcactctccc tctctcccca 840
cggaaagcgc cgcccacccc tctacccccg gcggctagtg agcaaacccc tgcggtgcat 900
ggagaaactg ttaccctaaa ctctccgcct cccaccagtg gcgaccgact ctttggcctt 960
gtgcaggggg ccttcctaac cttgaatgct accaacccag gggccactaa gtcttgctgg 1020
ctctgtttgg gcatgagccc cccttattat gaagggatag cctcttcagg agaggtcgct 1080
tatacctcca accatacccg atgccactgg ggggcccaag gaaagcttac cctcactgag 1140
gtctccggac tcgggtcatg catagggaag gtgcctctta cccatcaaca tctttgcaac 1200
cagaccttac ccatcaattc ctctaaaaac catcagtatc tgctcccctc aaaccatagc 1260
tggtgggcct gcagcactgg cctcaccccc tgcctctcca cctcagtttt taatcagtct 1320
aaagacttct gtgtccaggt ccagctgatc ccccgcatct attaccattc tgaagaaacc 1380
ttgttacaag cctatgacaa atcacccccc aggtttaaaa gagagcctgc ctcacttacc 1440
ctagctgtct tcctggggtt agggattgcg gcaggtatag gtactggctc aaccgcccta 1500
attaaagggc ccatagacct ccagcaaggc ctaaccagcc tccaaatcgc cattgacgct 1560
gacctccggg cccttcagga ctcaatcagc aagctagagg actcactgac ttccctatct 1620
gaggtagtac tccaaaatag gagaggcctt gacttactat tccttaaaga aggaggcctc 1680
tgcgcggccc taaaagaaga gtgctgtttt tatgtagacc actcaggtgc agtacgagac 1740
tccatgaaaa aacttaaaga aagactagat aaaagacagt tagagcgcca gaaaaaccaa 1800
aactggtatg aagggtggtt caataactcc ccttggttta ctaccctact atcaaccatc 1860
gctgggcccc tattgctcct ccttttgtta ctcactcttg ggccctgcat catcaataaa 1920
ttaatccaat tcatcaatga taggataagt gcagtcaaaa ttttagtcct tagacagaaa 1980
tatcagaccc tagataacga ggaaaacctt taa 2013
<210> 41
<211> 1530
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-FUG
<400> 41
atggttccgc aggttctttt gtttgtactc cttctgggtt tttcgttgtg tttcgggaag 60
ttccccattt acacgatacc agacgaactt ggtccctgga gccctattga catacaccat 120
ctcagctgtc caaataacct ggttgtggag gatgaaggat gtaccaacct gtccgagttc 180
tcctacatgg aactcaaagt gggatacatc tcagccatca aagtgaacgg gttcacttgc 240
acaggtgttg tgacagaggc agagacctac accaactttg ttggttatgt cacaaccaca 300
ttcaagagaa agcatttccg ccccacccca gacgcatgta gagccgcgta taactggaag 360
atggccggtg accccagata tgaagagtcc ctacacaatc cataccccga ctaccactgg 420
cttcgaactg taagaaccac caaagagtcc ctcattatca tatccccaag tgtgacagat 480
ttggacccat atgacaaatc ccttcactca agggtcttcc ctggcggaaa gtgctcagga 540
ataacggtgt cctctaccta ctgctcaact aaccatgatt acaccatttg gatgcccgag 600
aatccgagac caaggacacc ttgtgacatt tttaccaata gcagagggaa gagagcatcc 660
aacgggaaca agacttgcgg ctttgtggat gaaagaggcc tgtataagtc tctaaaagga 720
gcatgcaggc tcaagttatg tggagttctt ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc 780
gcgatgcaaa catcagatga gaccaaatgg tgccctccag atcagttggt gaatttgcac 840
gactttcgct cagacgagat cgagcatctc gttgtggagg agttagttaa gaaaagagag 900
gaatgtctgg atgcattaga gtccatcatg accaccaagt cagtaagttt cagacgtctc 960
agtcacctga gaaaacttgt cccagggttt ggaaaagcat ataccatatt caacaaaacc 1020
ttgatggagg ctgatgctca ctacaagtca gtccggacct ggaatgagat catcccctca 1080
aaagggtgtt tgaaagttgg aggaaggtgc catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 1140
ggtataatat tagggcctga cgaccatgtc ctaatcccag agatgcaatc atccctcctc 1200
cagcaacata tggagttgtt ggaatcttca gttatccccc tgatgcaccc cctggcagac 1260
ccttctacag ttttcaaaga aggtgatgag gctgaggatt ttgttgaagt tcacctcccc 1320
gatgtgtaca aacagatctc aggggttgac ctgggtctcc cgaactgggg aaagtatgta 1380
ttgatgactg caggggccat gattggcctg gtgttgatat tttccctaat gacatggtgc 1440
agagttggta tccatctttg cattaaatta aagcacacca agaaaagaca gatttataca 1500
gacatagaga tgaaccgact tggaaagtaa 1530
<210> 42
<211> 1497
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-LCMV
<400> 42
atgggtcaga ttgtgacaat gtttgaggct ctgcctcaca tcatcgatga ggtgatcaac 60
attgtcatta ttgtgcttat cgtgatcacg ggtatcaagg ctgtctacaa ttttgccacc 120
tgtgggatat tcgcattgat cagtttccta cttctggctg gcaggtcctg tggcatgtac 180
ggtcttaagg gacccgacat ttacaaagga gtttaccaat ttaagtcagt ggagtttgat 240
atgtcacatc tgaacctgac catgcccaac gcatgttcag ccaacaactc ccaccattac 300
atcagtatgg ggacttctgg actagaattg accttcacca atgattccat catcagtcac 360
aacttttgca atctgacctc tgccttcaac aaaaagacct ttgaccacac actcatgagt 420
atagtttcga gcctacacct cagtatcaga gggaactcca actataaggc agtatcctgc 480
gacttcaaca atggcataac catccaatac aacttgacat tctcagatcg acaaagtgct 540
cagagccagt gtagaacctt cagaggtaga gtcctagata tgtttagaac tgccttcggg 600
gggaaataca tgaggagtgg ctggggctgg acaggctcag atggcaagac cacctggtgt 660
agccagacga gttaccaata cctgattata caaaatagaa cctgggaaaa ccactgcaca 720
tatgcaggtc cttttgggat gtccaggatt ctcctttccc aagagaagac taagttcttc 780
actaggagac tagcgggcac attcacctgg actttgtcag actcttcagg ggtggagaat 840
ccaggtggtt attgcctgac caaatggatg attcttgctg cagagcttaa gtgtttcggg 900
aacacagcag ttgcgaaatg caatgtaaat catgatgccg aattctgtga catgctgcga 960
ctaattgact acaacaaggc tgctttgagt aagttcaaag aggacgtaga atctgccttg 1020
cacttattca aaacaacagt gaattctttg atttcagatc aactactgat gaggaaccac 1080
ttgagagatc tgatgggggt gccatattgc aattactcaa agttttggta cctagaacat 1140
gcaaagaccg gcgaaactag tgtccccaag tgctggcttg tcaccaatgg ttcttactta 1200
aatgagaccc acttcagtga tcaaatcgaa caggaagccg ataacatgat tacagagatg 1260
ttgaggaagg attacataaa gaggcagggg agtacccccc tagcattgat ggaccttctg 1320
atgttttcca catctgcata tctagtcagc atcttcctgc accttgtcaa aataccaaca 1380
cacaggcaca taaaaggtgg ctcatgtcca aagccacacc gattaaccaa caaaggaatt 1440
tgtagttgtg gtgcatttaa ggtgcctggt gtaaaaaccg tctggaaaag acgctga 1497
<210> 43
<211> 1692
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-FPV
<400> 43
atgaacactc aaatcctggt tttcgccctt gtggcagtca tccccacaaa tgcagacaaa 60
atttgtcttg gacatcatgc tgtatcaaat ggcaccaaag taaacacact cactgagaga 120
ggagtagaag ttgtcaatgc aacggaaaca gtggagcgga caaacatccc caaaatttgc 180
tcaaaaggga aaagaaccac tgatcttggc caatgcggac tgttagggac cattaccgga 240
ccacctcaat gcgaccaatt tctagaattt tcagctgatc taataatcga gagacgagaa 300
ggaaatgatg tttgttaccc ggggaagttt gttaatgaag aggcattgcg acaaatcctc 360
agaggatcag gtgggattga caaagaaaca atgggattca catatagtgg aataaggacc 420
aacggaacaa ctagtgcatg tagaagatca gggtcttcat tctatgcaga aatggagtgg 480
ctcctgtcaa atacagacaa tgctgctttc ccacaaatga caaaatcata caaaaacaca 540
aggagagaat cagctctgat agtctgggga atccaccatt caggatcaac caccgaacag 600
accaaactat atgggagtgg aaataaactg ataacagtcg ggagttccaa atatcatcaa 660
tcttttgtgc cgagtccagg aacacgaccg cagataaatg gccagtccgg acggattgat 720
tttcattggt tgatcttgga tcccaatgat acagttactt ttagtttcaa tggggctttc 780
atagctccaa atcgtgccag cttcttgagg ggaaagtcca tggggatcca gagcgatgtg 840
caggttgatg ccaattgcga aggggaatgc taccacagtg gagggactat aacaagcaga 900
ttgccttttc aaaacatcaa tagcagagca gttggcaaat gcccaagata tgtaaaacag 960
gaaagtttat tattggcaac tgggatgaag aacgttcccg aaccttccaa aaaaaggaaa 1020
aaaagaggcc tgtttggcgc tatagcaggg tttattgaaa atggttggga aggtctggtc 1080
gacgggtggt acggtttcag gcatcagaat gcacaaggag aaggaactgc agcagactac 1140
aaaagcaccc aatcggcaat tgatcagata accggaaagt taaatagact cattgagaaa 1200
accaaccagc aatttgagct aatagataat gaattcactg aggtggaaaa gcagattggc 1260
aatttaatta actggaccaa agactccatc acagaagtat ggtcttacaa tgctgaactt 1320
cttgtggcaa tggaaaacca gcacactatt gatttggctg attcagagat gaacaagctg 1380
tatgagcgag tgaggaaaca attaagggaa aatgctgaag aggatggcac tggttgcttt 1440
gaaatttttc ataaatgtga cgatgattgt atggctagta taaggaacaa tacttatgat 1500
cacagcaaat acagagaaga agcgatgcaa aatagaatac aaattgaccc agtcaaattg 1560
agtagtggct acaaagatgt gatactttgg tttagcttcg gggcatcatg ctttttgctt 1620
cttgccattg caatgggcct tgttttcata tgtgtgaaga acggaaacat gcggtgcact 1680
atttgtatat aa 1692
<210> 44
<211> 1266
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-RRV
<400> 44
agtgtaacag agcactttaa tgtgtataag gctactagac catacctagc acattgcgcc 60
gattgcgggg acgggtactt ctgctatagc ccagttgcta tcgaggagat ccgagatgag 120
gcgtctgatg gcatgcttaa gatccaagtc tccgcccaaa taggtctgga caaggcaggc 180
acccacgccc acacgaagct ccgatatatg gctggtcatg atgttcagga atctaagaga 240
gattccttga gggtgtacac gtccgcagcg tgctccatac atgggacgat gggacacttc 300
atcgtcgcac actgtccacc aggcgactac ctcaaggttt cgttcgagga cgcagattcg 360
cacgtgaagg catgtaaggt ccaatacaag cacaatccat tgccggtggg tagagagaag 420
ttcgtggtta gaccacactt tggcgtagag ctgccatgca cctcatacca gctgacaacg 480
gctcccaccg acgaggagat tgacatgcat acaccgccag atataccgga tcgcaccctg 540
ctatcacaga cggcgggcaa cgtcaaaata acagcaggcg gcaggactat caggtacaac 600
tgtacctgcg gccgtgacaa cgtaggcact accagtactg acaagaccat caacacatgc 660
aagattgacc aatgccatgc tgccgtcacc agccatgaca aatggcaatt tacctctcca 720
tttgttccca gggctgatca gacagctagg aaaggcaagg tacacgttcc gttccctctg 780
actaacgtca cctgccgagt gccgttggct cgagcgccgg atgccaccta tggtaagaag 840
gaggtgaccc tgagattaca cccagatcat ccgacgctct tctcctatag gagtttagga 900
gccgaaccgc acccgtacga ggaatgggtt gacaagttct ctgagcgcat catcccagtg 960
acggaagaag ggattgagta ccagtggggc aacaacccgc cggtctgcct gtgggcgcaa 1020
ctgacgaccg agggcaaacc ccatggctgg ccacatgaaa tcattcagta ctattatgga 1080
ctataccccg ccgccactat tgccgcagta tccggggcga gtctgatggc cctcctaact 1140
ctggcggcca catgctgcat gctggccacc gcgaggagaa agtgcctaac accgtacgcc 1200
ctgacgccag gagcggtggt accgttgaca ctggggctgc tttgctgcgc accgagggcg 1260
aatgca 1266
<210> 45
<211> 1938
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-MLV 10A1
<400> 45
atggaaggtc cagcgttctc aaaacccctt aaagataaga ttaacccgtg gaagtcctta 60
atggtcatgg gggtctattt aagagtaggg atggcagaga gcccccatca ggtctttaat 120
gtaacctgga gagtcaccaa cctgatgact gggcgtaccg ccaatgccac ctccctttta 180
ggaactgtac aagatgcctt cccaagatta tattttgatc tatgtgatct ggtcggagaa 240
gagtgggacc cttcagacca ggaaccatat gtcgggtatg gctgcaaata ccccggaggg 300
agaaagcgga cccggacttt tgacttttac gtgtgccctg ggcataccgt aaaatcgggg 360
tgtggggggc caagagaggg ctactgtggt gaatggggtt gtgaaaccac cggacaggct 420
tactggaagc ccacatcatc atgggaccta atctccctta agcgcggtaa caccccctgg 480
gacacgggat gctccaaaat ggcttgtggc ccctgctacg acctctccaa agtatccaat 540
tccttccaag gggctactcg agggggcaga tgcaaccctc tagtcctaga attcactgat 600
gcaggaaaaa aggctaattg ggacgggccc aaatcgtggg gactgagact gtaccggaca 660
ggaacagatc ctattaccat gttctccctg acccgccagg tcctcaatat agggccccgc 720
atccccattg ggcctaatcc cgtgatcact ggtcaactac ccccctcccg acccgtgcag 780
atcaggctcc ccaggcctcc tcagcctcct cctacaggcg cagcctctat agtccctgag 840
actgccccac cttctcaaca acctgggacg ggagacaggc tgctaaacct ggtagaagga 900
gcctatcagg cgcttaacct caccaatccc gacaagaccc aagaatgttg gctgtgctta 960
gtgtcgggac ctccttatta cgaaggagta gcggtcgtgg gcacttatac caatcattct 1020
accgccccgg ccagctgtac ggccacttcc caacataagc ttaccctatc tgaagtgaca 1080
ggacagggcc tatgcatggg agcactacct aaaactcacc aggccttatg taacaccacc 1140
caaagtgccg gctcaggatc ctactacctt gcagcacccg ctggaacaat gtgggcttgt 1200
agcactggat tgactccctg cttgtccacc acgatgctca atctaaccac agactattgt 1260
gtattagttg agctctggcc cagaataatt taccactccc ccgattatat gtatggtcag 1320
cttgaacagc gtaccaaata taagagggag ccagtatcgt tgaccctggc ccttctgcta 1380
ggaggattaa ccatgggagg gattgcagct ggaataggga cggggaccac tgccctaatc 1440
aaaacccagc agtttgagca gcttcacgcc gctatccaga cagacctcaa cgaagtcgaa 1500
aaatcaatta ccaacctaga aaagtcactg acctcgttgt ctgaagtagt cctacagaac 1560
cgaagaggcc tagatttgct cttcctaaaa gagggaggtc tctgcgcagc cctaaaagaa 1620
gaatgttgtt tttatgcaga ccacacggga ctagtgagag acagcatggc caaactaagg 1680
gaaaggctta atcagagaca aaaactattt gagtcaggcc aaggttggtt cgaagggcag 1740
tttaatagat ccccctggtt taccacctta atctccacca tcatgggacc tctaatagta 1800
ctcttactga tcttactctt tggaccctgc attctcaatc gattggtcca atttgttaaa 1860
gacaggatct cagtggtcca ggctctggtt ttgactcaac aatatcacca gctaaaacct 1920
atagagtacg agccatga 1938
<210> 46
<211> 2030
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Envelope-Ebola
<400> 46
atgggtgtta caggaatatt gcagttacct cgtgatcgat tcaagaggac atcattcttt 60
ctttgggtaa ttatcctttt ccaaagaaca ttttccatcc cacttggagt catccacaat 120
agcacattac aggttagtga tgtcgacaaa ctggtttgcc gtgacaaact gtcatccaca 180
aatcaattga gatcagttgg actgaatctc gaagggaatg gagtggcaac tgacgtgcca 240
tctgcaacta aaagatgggg cttcaggtcc ggtgtcccac caaaggtggt caattatgaa 300
gctggtgaat gggctgaaaa ctgctacaat cttgaaatca aaaaacctga cgggagtgag 360
tgtctaccag cagcgccaga cgggattcgg ggcttccccc ggtgccggta tgtgcacaaa 420
gtatcaggaa cgggaccgtg tgccggagac tttgccttcc acaaagaggg tgctttcttc 480
ctgtatgacc gacttgcttc cacagttatc taccgaggaa cgactttcgc tgaaggtgtc 540
gttgcatttc tgatactgcc ccaagctaag aaggacttct tcagctcaca ccccttgaga 600
gagccggtca atgcaacgga ggacccgtct agtggctact attctaccac aattagatat 660
caagctaccg gttttggaac caatgagaca gagtatttgt tcgaggttga caatttgacc 720
tacgtccaac ttgaatcaag attcacacca cagtttctgc tccagctgaa tgagacaata 780
tatacaagtg ggaaaaggag caataccacg ggaaaactaa tttggaaggt caaccccgaa 840
attgatacaa caatcgggga gtgggccttc tgggaaacta aaaaaacctc actagaaaaa 900
ttcgcagtga agagttgtct ttcacagctg tatcaaacag agccaaaaac atcagtggtc 960
agagtccggc gcgaacttct tccgacccag ggaccaacac aacaactgaa gaccacaaaa 1020
tcatggcttc agaaaattcc tctgcaatgg ttcaagtgca cagtcaagga agggaagctg 1080
cagtgtcgca tctgacaacc cttgccacaa tctccacgag tcctcaaccc cccacaacca 1140
aaccaggtcc ggacaacagc acccacaata cacccgtgta taaacttgac atctctgagg 1200
caactcaagt tgaacaacat caccgcagaa cagacaacga cagcacagcc tccgacactc 1260
cccccgccac gaccgcagcc ggacccctaa aagcagagaa caccaacacg agcaagggta 1320
ccgacctcct ggaccccgcc accacaacaa gtccccaaaa ccacagcgag accgctggca 1380
acaacaacac tcatcaccaa gataccggag aagagagtgc cagcagcggg aagctaggct 1440
taattaccaa tactattgct ggagtcgcag gactgatcac aggcgggagg agagctcgaa 1500
gagaagcaat tgtcaatgct caacccaaat gcaaccctaa tttacattac tggactactc 1560
aggatgaagg tgctgcaatc ggactggcct ggataccata tttcgggcca gcagccgagg 1620
gaatttacat agaggggctg atgcacaatc aagatggttt aatctgtggg ttgagacagc 1680
tggccaacga gacgactcaa gctcttcaac tgttcctgag agccacaacc gagctacgca 1740
ccttttcaat cctcaaccgt aaggcaattg atttcttgct gcagcgatgg ggcggcacat 1800
gccacatttt gggaccggac tgctgtatcg aaccacatga ttggaccaag aacataacag 1860
acaaaattga tcagattatt catgattttg ttgataaaac ccttccggac cagggggaca 1920
atgacaattg gtggacagga tggagacaat ggataccggc aggtattgga gttacaggcg 1980
ttataattgc agttatcgct ttattctgta tatgcaaatt tgtcttttag 2030
<210> 47
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Left ITR
<400> 47
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prothrombin enhancer
<400> 48
gcgagaactt gtgcctcccc gtgttcctgc tctttgtccc tctgtcctac ttagactaat 60
atttgccttg ggtactgcaa acaggaaatg ggggagggac aggagtaggg cggagggtag 120
120
<210> 49
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PolyA
<400> 49
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 60
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 120
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 180
ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggc 228
<210> 50
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Right ITR
<400> 50
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 51
<211> 1470
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 51
ttaaaagtcg aaggggttct cgcgctcgtc gttgtgcgcc gcgctgggga gggccacgtt 60
gcggaactgg tacttgggct gccacttgaa ctcggggatc accagtttgg gcactggggt 120
ctcggggaag gtctcgctcc acatgcgccg gctcatctgc agggcgccca gcatgtcagg 180
cgcggagatc ttgaaatcgc agttggggcc ggtgctctgc gcgcgcgagt tgcggtacac 240
tgggttgcag cactggaaca ccatcagact ggggtacttc acactagcca gcacgctctt 300
gtcgctgatc tgatccttgt ccaggtcctc ggcgttgctc aggccgaacg gggtcatctt 360
gcacagctgg cggcccagga agggcacgct ctgaggcttg tggttacact cgcagtgcac 420
gggcatcagc atcatccccg cgccgcgctg catattcggg tagagggcct tgacgaaggc 480
cgcgatctgc ttgaaagctt gctgggcctt ggccccctcg ctgaaaaaca ggccgcagct 540
cttcccgctg aactgattat tcccgcaccc ggcatcatgg acgcagcagc gcgcgtcatg 600
gctggtcagt tgcaccacgc tccgtcccca gcggttctgg gtcaccttgg ccttgctggg 660
ttgctccttc agcgcacgct gcccgttctc actggtcaca tccatctcca ccacgtggtc 720
cttgtggatc atcaccgtcc catgcagaca cttgagctgg ccttccacct cggtgcagcc 780
gtggtcccac agggcactgc cggtgcactc ccagttcttg tgcgcgatcc cgctgtggct 840
gaagatgtaa ccttgcaaca ggcgacccat gatggtgcta aagctcttct gggtggtgaa 900
ggtcagttgc agaccgcggg cctcctcgtt catccaggtc tggcacatct tttggaagat 960
ctcggtctgc tcgggcatga gcttgtaagc atcgcgcagg ccgctgtcga cgcggtagcg 1020
ttccatcagc acattcatgg tatccatgcc cttctcccag gacgagacca gaggcagact 1080
cagggggttg cgcacgttca ggacaccggg ggtcgcgggc tcgacgatgc gttttccgtc 1140
cttgccttcc ttcaacagaa ccggcggctg gctgaatccc actcccacga tcacggcttc 1200
ttcctggggc atctcttcgt ctgggtctac cttggtcaca tgcttggtct ttctggcttg 1260
cttctttttt ggagggctgt ccacggggac cacgtcctcc tcggaagacc cggatcccac 1320
ccgctgatac tttcggcgct tggttggcag aggaggtggc ggcgaggggc tcctctcctg 1380
ctccggcgga tagcgcgctg aaccgtggcc ccggggcgga gtggcctctc ggtccatgaa 1440
ccggcgcacg tcctgactgc cgccggccat 1470
<210> 52
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E4
<400> 52
tcatgtatct ttattgattt ttacaccagc acgggtagtc agtctcccac caccagccca 60
tttcacagtg taaacaattc tctcagcacg ggtggcctta aatagggcaa tattctgatt 120
agtgcgggaa ctggacttgg ggtctataat ccacacagtt tcctggcgag ccaaacgggg 180
gtcggtgatt gagatgaagc cgtcctctga aaagtcatcc aagcgagcct cacagtccaa 240
ggtcacagta ttatgataat ctgcatgatc acaatcgggc aacaggggat gttgttcagt 300
cagtgaagcc ctggtttcct catcagatcg tggtaaacgg gccctgcgat atggatgatg 360
gcggagcgag ctggattgaa tctcggtttg cat 393
<210> 53
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VA RNA
<400> 53
agcgggcact cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg 60
gggttcgagc cccgtatccg gccgtccgcc gtgatccatg cggttaccgc ccgcgtgtcg 120
aacccaggtg tgcgacgtca gacaacgggg gagtgctcct tt 162
<210> 54
<211> 2208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2 Rep
<400> 54
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380
cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440
ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500
tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560
ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680
gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740
accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800
cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860
attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920
caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980
ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040
gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100
acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160
tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208
<210> 55
<211> 1866
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2 Cap
<400> 55
atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240
caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300
aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360
taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480
acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540
aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780
tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840
cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900
attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960
acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020
accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140
aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200
gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320
ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380
gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440
gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500
gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560
gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620
aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680
ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740
tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800
ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860
caataa 1866
<210> 56
<211> 1227
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Fragment containing RRE and rabbit beta globin poly A
<400> 56
tctagaagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc 60
gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 120
caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat 180
caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct 240
agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 300
ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 360
ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 420
ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag 480
gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 540
cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 600
aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 660
tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc tcgacctgca gcccaagctt ggcgtaatca 720
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 780
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 840
gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagcg gatccgcatc 900
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 960
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 1020
aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 1080
gcttttgcaa aaagctaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 1140
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 1200
actcatcaat gtatcttatc acccggg 1227
<210> 57
<211> 2312
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hPAH with fill 5' and 3' UTR
<400> 57
ggcacgaggt acctgaggcc ctaaaaagcc agagacctca ctcccgggga gccagcatgt 60
ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg gcaggaaact ctctgacttt ggacaggaaa 120
caagctatat tgaagacaac tgcaatcaaa atggtgccat atcactgatc ttctcactca 180
aagaagaagt tggtgcattg gccaaagtat tgcgcttatt tgaggagaat gatgtaaacc 240
tgacccacat tgaatctaga ccttctcgtt taaagaaaga tgagtatgaa tttttcaccc 300
atttggataa acgtagcctg cctgctctga caaacatcat caagatcttg aggcatgaca 360
ttggtgccac tgtccatgag ctttcacgag ataagaagaa agacacagtg ccctggttcc 420
caagaaccat tcaagagctg gacagatttg ccaatcagat tctcagctat ggagcggaac 480
tggatgctga ccaccctggt tttaaagatc ctgtgtaccg tgcaagacgg aagcagtttg 540
ctgacattgc ctacaactac cgccatgggc agcccatccc tcgagtggaa tacatggagg 600
aagaaaagaa aacatggggc acagtgttca agactctgaa gtccttgtat aaaacccatg 660
cttgctatga gtacaatcac atttttccac ttcttgaaaa gtactgtggc ttccatgaag 720
ataacattcc ccagctggaa gacgtttctc agttcctgca gacttgcact ggtttccgcc 780
tccgacctgt agctggcctg ctttcctctc gggatttctt gggtggcctg gccttccgag 840
tcttccactg cacacagtac atcagacatg gatccaagcc catgtatacc cccgaacctg 900
acatctgcca tgagctgttg ggacatgtgc ccttgttttc agatcgcagc tttgcccagt 960
tttcccagga aattggcctt gcctctctgg gtgcacctga tgaatacatt gaaaagctcg 1020
ccacaattta ctggtttact gtggagtttg ggctctgcaa acaaggagac tccataaagg 1080
catatggtgc tgggctcctg tcatcctttg gtgaattaca gtactgctta tcagagaagc 1140
caaagcttct ccccctggag ctggagaaga cagccatcca aaattacact gtcacggagt 1200
tccagcccct gtattacgtg gcagagagtt ttaatgatgc caaggagaaa gtaaggaact 1260
ttgctgccac aatacctcgg cccttctcag ttcgctacga cccatacacc caaaggattg 1320
aggtcttgga caatacccag cagcttaaga ttttggctga ttccattaac agtgaaattg 1380
gaatcctttg cagtgccctc cagaaaataa agtaaagcca tggacagaat gtggtctgtc 1440
agctgtgaat ctgttgatgg agatccaact atttctttca tcagaaaaag tccgaaaagc 1500
aaaccttaat ttgaaataac agccttaaat cctttacaag atggagaaac aacaaataag 1560
tcaaaataat ctgaaatgac aggatatgag tacatactca agagcataat ggtaaatctt 1620
ttggggtcat ctttgattta gagatgataa tcccatactc tcaattgagt taaatcagta 1680
atctgtcgca tttcatcaag attaattaaa atttgggacc tgcttcattc aagcttcata 1740
tatgctttgc agagaactca taaaggagca tataaggcta aatgtaaaac ccaagactgt 1800
cattagaatt gaattattgg gcttaatata aatcgtaacc tatgaagttt attttttatt 1860
ttagttaact atgattccaa ttactacttt gttattgtac ctaagtaaat tttctttaag 1920
tcagaagccc attaaaatag ttacaagcat tgaacttctt tagtattata ttaatataaa 1980
aacatttttg tatgttttat tgtaatcata aatactgctg tataaggtaa taaaactctg 2040
cacctaatcc ccataacttc cagtatcatt ttccaattaa ttatcaagtc tgttttggga 2100
aacactttga ggacatttat gatgcagcag atgttgacta aaggcttggt tggtagatat 2160
tcaggaaatg ttcactgaat aaataagtaa atacattatt gaaaagcaaa tctgtataaa 2220
tgtgaaattt ttatttgtat tagtaataaa acattagtag tttaaacaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaact cgactctaga tt 2312
<210> 58
<211> 1704
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hPAH with full 5' UTR and truncated 3' UTR
<400> 58
ggcacgaggt acctgaggcc ctaaaaagcc agagacctca ctcccgggga gccagcatgt 60
ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg gcaggaaact ctctgacttt ggacaggaaa 120
caagctatat tgaagacaac tgcaatcaaa atggtgccat atcactgatc ttctcactca 180
aagaagaagt tggtgcattg gccaaagtat tgcgcttatt tgaggagaat gatgtaaacc 240
tgacccacat tgaatctaga ccttctcgtt taaagaaaga tgagtatgaa tttttcaccc 300
atttggataa acgtagcctg cctgctctga caaacatcat caagatcttg aggcatgaca 360
ttggtgccac tgtccatgag ctttcacgag ataagaagaa agacacagtg ccctggttcc 420
caagaaccat tcaagagctg gacagatttg ccaatcagat tctcagctat ggagcggaac 480
tggatgctga ccaccctggt tttaaagatc ctgtgtaccg tgcaagacgg aagcagtttg 540
ctgacattgc ctacaactac cgccatgggc agcccatccc tcgagtggaa tacatggagg 600
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cttgctatga gtacaatcac atttttccac ttcttgaaaa gtactgtggc ttccatgaag 720
ataacattcc ccagctggaa gacgtttctc agttcctgca gacttgcact ggtttccgcc 780
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tcttccactg cacacagtac atcagacatg gatccaagcc catgtatacc cccgaacctg 900
acatctgcca tgagctgttg ggacatgtgc ccttgttttc agatcgcagc tttgcccagt 960
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aaaccttaat ttgaaataac agccttaaat cctttacaag atggagaaac aacaaataag 1560
tcaaaataat ctgaaatgac aggatatgag tacatactca agagcataat ggtaaatctt 1620
ttggggtcat ctttgattta gagatgataa tcccatactc tcaattgagt taaatcagta 1680
atctgtcgca tttcatcaag atta 1704
Claims (22)
- 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 바이러스 벡터로서, PAH 서열이 절두되는 바이러스 벡터.
- 제 1 항에 있어서, PAH 서열이 서열의 3' 미번역 부위 (UTR) 에서 절두되는 바이러스 벡터.
- 제 1 항에 있어서, PAH 서열이 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4 중 적어도 하나와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 4 항에 있어서, 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열이 전장 3' 미번역 부위 (UTR) 를 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 4 항에 있어서, 적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열이 PAH mRNA 서열인 바이러스 벡터.
- 제 4 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열이 shRNA 를 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 4 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열이 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6 중 적어도 하나와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성 중 적어도 하나를 갖는 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 4 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열이 제 1 프로모터의 제어 하에 있고, PAH 서열이 제 2 프로모터의 제어 하에 있는 바이러스 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 제 1 프로모터가 H1 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 제 2 프로모터가 간-특이적 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 11 항에 있어서, 간-특이적 프로모터가 hAAT 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
- 적어도 하나의 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 를 발현하기 위한 PAH 서열 또는 이의 변이체; 및
적어도 하나의 사전결정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열
을 포함하는 바이러스 벡터. - 제 13 항에 있어서, PAH 서열이 SEQ ID NO: 1 과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 벡터.
- 패키징 세포에 의해 생성되며 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자로서:
표적 세포를 감염시킬 수 있는 외피 단백질; 및
제 4 항에 따른 바이러스 벡터
를 포함하는 렌티바이러스 입자. - 제 15 항에 있어서, 표적 세포가 간 세포, 근육 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 신경내분비 세포, 내분비 세포, 림프구, 골수 세포, 고형 기관 내에 존재하는 세포, 또는 조혈 계통의 세포, 조혈모세포, 또는 전구체 조혈모세포 중 적어도 하나인 렌티바이러스 입자.
- 대상에서 페닐케톤뇨증 (PKU) 을 치료하기 위한 방법으로서, 치료적 유효량의 제 15 항의 렌티바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서, 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자가 복수의 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함하는 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서, 치료적 유효량의 렌티바이러스 입자가 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함하는 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서, 대상이 자궁내 (in utero) 에 있는 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서, PKU 표현형과 상호연관되는 대상에서의 PKU 유전자형을 진단하는 것을 추가로 포함하는 치료 방법.
- 제 21 항에 있어서, 진단이 대상의 태아기 스크리닝 동안 발생하는 치료 방법.
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| CA3057142A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | American Gene Technologies International Inc. | Compositions and methods for treating phenylketonuria |
| AU2018345745A1 (en) * | 2017-10-02 | 2020-04-30 | American Gene Technologies International Inc. | Vectors with promoter and enhancer combinations for treating phenylketonuria |
| EP3692141A1 (en) * | 2017-10-03 | 2020-08-12 | Children's Hospital and Clinics of Minnesota | Vectors and methods of use |
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| US20220162643A1 (en) * | 2019-05-31 | 2022-05-26 | American Gene Technologies International Inc. | Optimized phenylananine hydroxylase expression |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5668255A (en) * | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| AU6014094A (en) | 1992-12-02 | 1994-06-22 | Baylor College Of Medicine | Episomal vectors for gene therapy |
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| AU8828598A (en) | 1997-08-15 | 1999-03-08 | Rubicon Laboratory, Inc. | Retrovirus and viral vectors |
| US6399383B1 (en) | 1997-10-28 | 2002-06-04 | Maxygen, Inc. | Human papilloma virus vectors |
| ES2235470T3 (es) | 1998-03-20 | 2005-07-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Composiciones y metodos para la produccion libre de cooperadores de virus adnoasociados recombinantes. |
| DK1115290T3 (da) | 1998-10-01 | 2009-06-22 | Univ Southern California | Retroviralt gentilförselssystem og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
| US6156514A (en) | 1998-12-03 | 2000-12-05 | Sunol Molecular Corporation | Methods for making recombinant cells |
| US6410013B1 (en) | 1999-01-25 | 2002-06-25 | Musc Foundation For Research Development | Viral vectors for use in monitoring HIV drug resistance |
| WO2000072886A1 (en) | 1999-05-26 | 2000-12-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Episomally replicating lentiviral vectors |
| EP1232276B8 (en) | 1999-11-16 | 2007-06-27 | Genzyme Corporation | Vectors and transgenes with regulatory elements for gene delivery to the liver |
| WO2001083797A2 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Avigen, Inc. | Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production |
| WO2001087350A2 (en) | 2000-05-12 | 2001-11-22 | The Regents Of The University Of California | Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells |
| AU2001265187A1 (en) | 2000-05-30 | 2001-12-11 | Baylor College Of Medicine | Chimeric viral vectors for gene therapy |
| NO314588B1 (no) | 2000-09-04 | 2003-04-14 | Bionor Immuno As | HIV-peptider, antigener, vaksinesammensetning, immunoassay- testsett og en fremgangsmåte for å påvise antistoffer indusert av HIV |
| US7122181B2 (en) | 2000-12-19 | 2006-10-17 | Research Development Foundation | Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof |
| US20030138444A1 (en) | 2001-08-18 | 2003-07-24 | Myriad Genetics, Incorporated | Composition and method for treating HIV infection |
| US20030119770A1 (en) | 2001-08-02 | 2003-06-26 | Zhennan Lai | Intercellular delivery of a herpes simplex virus VP22 fusion protein from cells infected with lentiviral vectors |
| US7737124B2 (en) | 2001-09-13 | 2010-06-15 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell |
| US20070203333A1 (en) | 2001-11-30 | 2007-08-30 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| AU2003224725A1 (en) | 2002-03-20 | 2003-10-08 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Hiv therapeutic |
| US20030198620A1 (en) | 2002-04-16 | 2003-10-23 | Keiya Ozawa | Method of treating amino acid metabolic disorders using recombinant adeno-associated virus virions |
| WO2003093436A2 (en) | 2002-04-30 | 2003-11-13 | University Of Florida | Treatment for phenylketonuria |
| US20040161412A1 (en) | 2002-08-22 | 2004-08-19 | The Cleveland Clinic Foundation | Cell-based VEGF delivery |
| DK1545204T3 (en) | 2002-09-06 | 2016-11-14 | The Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services | Immunotherapy with in vitro selected antigen-specific lymphocytes following non-myeloablative lymphodepletive chemotherapy |
| US20040192629A1 (en) * | 2002-11-04 | 2004-09-30 | University Of Massachusetts | Allele-specific RNA interference |
| AU2003283174A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-06-30 | Cytos Biotechnology Ag | Method for protein production |
| WO2004104591A2 (en) | 2003-05-23 | 2004-12-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Improvements to gamma delta t cell-mediated therapy |
| WO2005005644A1 (en) | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Cytos Biotechnology Ag | Gene expression system |
| US20050019927A1 (en) | 2003-07-13 | 2005-01-27 | Markus Hildinger | DECREASING GENE EXPRESSION IN A MAMMALIAN SUBJECT IN VIVO VIA AAV-MEDIATED RNAi EXPRESSION CASSETTE TRANSFER |
| US20050138677A1 (en) | 2003-09-16 | 2005-06-23 | Pfister Herbert J. | Transgenic animal model for the treatment of skin tumors |
| EP1678292A4 (en) | 2003-09-18 | 2008-05-07 | Univ Emory | IMPROVED MVA VACCINES |
| WO2005033282A2 (en) | 2003-10-01 | 2005-04-14 | Pharmacia & Upjohn Company Llc | Polyamide compositions and therapeutic methods for treatment of human papilloma virus |
| US20080039413A1 (en) | 2003-10-21 | 2008-02-14 | Morris David W | Novel compositions and methods in cancer |
| WO2005081911A2 (en) | 2004-02-25 | 2005-09-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF HIV INFECTION USING TRIM5α |
| JP2007527240A (ja) | 2004-03-01 | 2007-09-27 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | アレルギー性鼻炎および喘息のためのＲＮＡｉベースの治療 |
| TWI556829B (zh) | 2004-04-09 | 2016-11-11 | 艾伯維生物技術有限責任公司 | 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法 |
| US20080227736A1 (en) | 2004-06-03 | 2008-09-18 | Regents Of The University Of California, | Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors |
| US20080131940A1 (en) | 2004-06-25 | 2008-06-05 | Robert Chiu | Target Cell-Specific Short Interfering Rna and Methods of Use Thereof |
| US8168601B2 (en) | 2004-08-16 | 2012-05-01 | Immune Disease Institute, Inc. | Method of delivering RNA interference and uses thereof |
| WO2006039721A2 (en) | 2004-10-08 | 2006-04-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Bisphosphonate compounds and methods for bone resorption diseases, cancer, bone pain, immune disorders, and infectious diseases |
| EP1647595A1 (en) | 2004-10-15 | 2006-04-19 | Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam | Nucleic acids against viruses, in particular HIV |
| WO2006048215A1 (en) | 2004-11-02 | 2006-05-11 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Adenoviral amplicon and producer cells for the production of replication-defective adenoviral vectors, methods of preparation and use thereof |
| US7790446B2 (en) | 2005-02-11 | 2010-09-07 | Kosagen Cell Factory Oü | Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products |
| MX2007010008A (es) | 2005-02-16 | 2008-01-18 | Lentigen Corp | Vectores lentivirales y su uso. |
| CA2609142C (en) | 2005-05-27 | 2016-02-09 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Therapeutic gene vectors comprising mirna target sequences |
| WO2007015122A1 (en) | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Genexel, Inc. | Therapy for alzheimer’s disease |
| US20070032443A1 (en) | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Jaeseob Kim | Therapy for Alzheimer's disease |
| US20070105835A1 (en) | 2005-11-07 | 2007-05-10 | Kazantsev Aleksey G | Compositions and methods for modulating poly(ADP-ribose) polymerase activity |
| WO2007133674A2 (en) | 2006-05-12 | 2007-11-22 | Lentigen Corporation | Lentiviral vector compositions, methods and applications |
| US8535897B2 (en) | 2006-06-19 | 2013-09-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Assays for non-apoptotic cell death and uses thereof |
| US20080003225A1 (en) | 2006-06-29 | 2008-01-03 | Henri Vie | Method for enhancing the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and uses of T cells expressing CD16 receptors |
| WO2008008719A2 (en) | 2006-07-10 | 2008-01-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the myc gene |
| EP1878440A1 (en) | 2006-07-13 | 2008-01-16 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic antibodies using gamma delta cell activator compounds |
| JP2009544733A (ja) | 2006-07-26 | 2009-12-17 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | ウンデカプレニルピロホスフェートシンターゼの阻害剤 |
| US20080199961A1 (en) | 2006-08-25 | 2008-08-21 | Avi Biopharma, Inc. | ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS |
| WO2008100292A2 (en) | 2006-10-16 | 2008-08-21 | Genelux Corporation | Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods |
| WO2008090185A1 (en) | 2007-01-23 | 2008-07-31 | Virco Bvba | Method for designing a drug regime for hiv-infected patients |
| CN101679466A (zh) | 2007-04-12 | 2010-03-24 | 伊利诺伊大学评议会 | 对包括fpps、ggpps和dpps在内的多靶点效力提高的二膦酸盐化合物及方法 |
| US20080293142A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-11-27 | The Board Of Regents For Oklahoma State University | Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction |
| EP2008656A1 (en) | 2007-06-28 | 2008-12-31 | Bergen Teknologioverforing AS | Compositions for the treatment of hyperphenylalaninemia |
| US20110177155A1 (en) | 2007-08-21 | 2011-07-21 | Immune Disease Institute, Inc. | Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells |
| EP2090659A1 (en) | 2008-02-14 | 2009-08-19 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Infectious particle, process for its preparation and use thereof |
| GB0810209D0 (en) | 2008-06-04 | 2008-07-09 | Cambridge Entpr Ltd | Pluripotency associated epigenetic factor |
| US8629334B2 (en) | 2008-07-16 | 2014-01-14 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Viral-based transient-expression vector system for trees |
| WO2010022195A2 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Virxsys Corporation | Non-integrating lenti/adeno-associated virus hybrid vector system |
| US8871515B2 (en) | 2008-09-17 | 2014-10-28 | Isogenis, Inc. | Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof |
| US20100183558A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-07-22 | Zhennan Lai | Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules |
| CN102753193A (zh) | 2008-10-31 | 2012-10-24 | 比奥根艾迪克Ma公司 | Light靶向分子及其用途 |
| WO2010051521A1 (en) | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Lentigen Corporation | Cell therapy product for the treatment of hiv infection |
| US20110263001A1 (en) | 2008-11-14 | 2011-10-27 | Life Technologies Corporation | Compositions and Methods for Engineering Cells |
| EP2191834A1 (en) | 2008-11-26 | 2010-06-02 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Compositions and methods for treating retrovirus infections |
| CN102438631A (zh) | 2009-04-09 | 2012-05-02 | 史坦赛特股份有限公司 | 抗hiv干细胞及其用途 |
| JP5727458B2 (ja) | 2009-04-13 | 2015-06-03 | アプセト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフトＡｐｃｅｔｈ Ｇｍｂｈ ＆ Ｃｏ． Ｋｇ | 改変間葉系幹細胞及びそれを使用した腫瘍の治療方法 |
| US8728458B2 (en) | 2009-04-30 | 2014-05-20 | The Regents Of The University Of California | Combination anti-HIV vectors, targeting vectors, and methods of use |
| EP2453735B1 (en) | 2009-07-15 | 2015-07-08 | Calimmune Inc. | Dual Vector for Inhibition of Human Immunodeficiency Virus |
| US20120027725A1 (en) | 2009-11-30 | 2012-02-02 | Galvin Jeffrey A | Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules to treat liver cancer |
| CN101805750B (zh) | 2009-12-29 | 2011-11-30 | 浙江大学 | 法呢基焦磷酸合成酶rna干扰重组慢病毒载体构建及用途 |
| EP2536838A4 (en) | 2010-02-18 | 2013-08-21 | Univ Emory | VECTOR FOR THE EXPRESSION OF HIV ANTIGENES AND GM-CSF AND CORRESPONDING METHODS FOR GENERATING IMMUNE RESPONSE |
| WO2011119942A1 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Vistagen Therapeutics, Inc. | Induction of ips cells using transient episomal vectors |
| US20130090371A1 (en) | 2010-04-20 | 2013-04-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for inhibition of beta2-adrenergic receptor degradation |
| PL2561078T3 (pl) | 2010-04-23 | 2019-02-28 | Cold Spring Harbor Laboratory | Nowe, strukturalnie zaprojektowane shRNA |
| WO2011148194A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Oxford Biomedica (Uk) Ltd | Delivery of lentiviral vectors to the brain |
| WO2012020757A1 (ja) | 2010-08-10 | 2012-02-16 | タカラバイオ株式会社 | 細胞集団の製造方法 |
| US20130281493A1 (en) | 2010-10-07 | 2013-10-24 | The Trustees Of The University Of Columbia In The City Of New York | Method for Treating Cancer Harboring a p53 Mutation |
| WO2012061075A2 (en) | 2010-10-25 | 2012-05-10 | The Regents Of The University Of California | Hiv resistant and functional hematopoietic stem/progenitor cells and macrophages from induced pluripotent stem cells |
| JP6091435B2 (ja) * | 2011-02-22 | 2017-03-08 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクターを用いたタンパク質の送達 |
| EP2699680B1 (en) | 2011-04-21 | 2017-12-27 | University of Massachusetts | Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies |
| JP6348064B2 (ja) | 2011-11-22 | 2018-06-27 | ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア | 効率の高いトランスジーン送達のためのウイルスベクター |
| WO2013096455A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for diagnosing and treating oncogenic kras-associated cancer |
| MX367842B (es) | 2012-02-07 | 2019-09-09 | Global Bio Therapeutics Inc | Método compartimentado de administración de ácidos nucleicos y composiciones y usos del mismo. |
| US20140010861A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-01-09 | modeRNA Therapeutics | Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease |
| WO2013174404A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
| CA2875624A1 (en) | 2012-06-06 | 2013-12-12 | Bionor Immuno As | Hiv vaccine |
| JP2015524264A (ja) | 2012-07-17 | 2015-08-24 | ユニベルシテ ドゥ ジュネーブ | 遺伝子発現の下方制御のための核酸 |
| CA2922005A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-03 | Population Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for screening and treating developmental disorders |
| EP2920306B1 (en) | 2012-11-13 | 2018-06-27 | Codiak BioSciences, Inc. | Delivery of therapeutic agent |
| EP2929017A4 (en) * | 2012-12-05 | 2016-09-28 | Sangamo Biosciences Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR REGULATION OF METABOLIC DISORDERS |
| US9642921B2 (en) | 2012-12-20 | 2017-05-09 | Tocagen Inc. | Cancer combination therapy and recombinant vectors |
| WO2014117050A2 (en) | 2013-01-26 | 2014-07-31 | Mirimus, Inc. | Modified mirna as a scaffold for shrna |
| CN103184224A (zh) | 2013-04-03 | 2013-07-03 | 衡阳师范学院 | 一种抗艾滋病病毒感染的三联miRNA及构建方法 |
| EP2999797B1 (en) | 2013-05-21 | 2018-07-04 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Isoforms of gata6 and nkx2-1 as markers for diagnosis and therapy of cancer and as targets for anti-cancer therapy |
| EP3027755B1 (en) | 2013-08-02 | 2019-10-09 | The Regents of The University of California | Engineering antiviral t cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors |
| WO2015042308A2 (en) | 2013-09-18 | 2015-03-26 | City Of Hope | Rna-based hiv inhibitors |
| EA201992208A1 (ru) | 2013-10-22 | 2020-07-31 | Транслейт Био, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК |
| CN111218447A (zh) | 2013-11-07 | 2020-06-02 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| EP2878674A1 (en) | 2013-11-28 | 2015-06-03 | Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) | Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors |
| GB201322091D0 (en) | 2013-12-13 | 2014-01-29 | Cambridge Entpr Ltd | Modified serpins for the treatment of bleeding disorders |
| RU2763795C2 (ru) | 2014-04-23 | 2022-01-11 | Джуно Терапьютикс, Инк. | Способы выделения, культивирования и генетической инженерии популяций клеток иммунной системы для адоптивной терапии |
| JP6730193B2 (ja) | 2014-04-25 | 2020-07-29 | ジェネトン | 高ビリルビン血症の処置 |
| US10774343B2 (en) | 2014-04-25 | 2020-09-15 | Bluebird Bio, Inc. | MND promoter chimeric antigen receptors |
| WO2016033163A1 (en) | 2014-08-29 | 2016-03-03 | Immunomedics, Inc. | Identification of cancer genes by in-vivo fusion of human cancer cells and animal cells |
| WO2016046234A2 (en) * | 2014-09-22 | 2016-03-31 | Nexttobe Ab | Recombinant phe-free proteins for use in the treatment of phenylketonuria |
| US11053314B2 (en) | 2014-10-10 | 2021-07-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods to eliminate cancer stem cells by targeting CD47 |
| US10968451B2 (en) | 2014-10-14 | 2021-04-06 | Texas Tech University System | Multiplexed shRNAs and uses thereof |
| WO2016069716A1 (en) | 2014-10-30 | 2016-05-06 | The Scripps Research Institute | Compositions and methods comprising tyrosyl-trna synthetases and resveratrol compounds |
| KR101762135B1 (ko) * | 2015-01-29 | 2017-07-27 | 인제대학교 산학협력단 | 세포성점균을 이용한 인간 페닐알라닌 수산화효소의 활성분석 방법 |
| GB201509202D0 (en) | 2015-05-28 | 2015-07-15 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Semi-static cell culture |
| US20180161455A1 (en) | 2015-06-10 | 2018-06-14 | American Gene Technologies International, Inc. | Non-integrating viral delivery system and methods of use therof |
| EP3319631A4 (en) | 2015-07-08 | 2019-01-09 | American Gene Technologies International Inc. | HIV PREMUNICATION AND IMMUNOTHERAPY |
| CA2994192C (en) | 2015-08-13 | 2020-06-16 | Beihao Stem Cell And Regenerative Medicine Research Institute Co., Ltd. | Induced extended pluripotent stem cells, methods of making and using |
| CN105112370B (zh) | 2015-08-25 | 2019-02-05 | 杭州优善生物科技有限公司 | 一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用 |
| US10968253B2 (en) | 2015-10-20 | 2021-04-06 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Methods and products for genetic engineering |
| US11389546B2 (en) | 2015-12-09 | 2022-07-19 | Modernatx, Inc. | Heterologous UTR sequences for enhanced mRNA expression |
| IL310925A (en) | 2016-01-15 | 2024-04-01 | American Gene Tech Int Inc | Methods and preparations for activating GAMMA-DELTA T cells |
| US10137144B2 (en) | 2016-01-15 | 2018-11-27 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
| JP7153332B2 (ja) | 2016-02-08 | 2022-10-14 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | Ｈｉｖワクチン接種および免疫療法 |
| EP4036231A1 (en) | 2016-03-09 | 2022-08-03 | American Gene Technologies International Inc. | Combination vectors and methods for treating cancer |
| US20190117799A1 (en) | 2016-04-01 | 2019-04-25 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications |
| AU2017248189B2 (en) | 2016-04-08 | 2021-04-29 | Translate Bio, Inc. | Multimeric coding nucleic acid and uses thereof |
| US11976292B2 (en) | 2016-06-08 | 2024-05-07 | American Gene Technologies International Inc. | Non-integrating viral delivery system and methods related thereto |
| CA3028982A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
| JP7176756B2 (ja) | 2016-07-21 | 2022-11-22 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | パーキンソン病を処置するためのウイルスベクター |
| JP7229161B2 (ja) | 2016-12-30 | 2023-02-27 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | フェニルケトン尿症を処置するための遺伝子療法 |
| CA3048643A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv immunotherapy with no pre-immunization step |
| WO2018148443A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Tunable endogenous protein degradation with heterobifunctional compounds |
| CA3057142A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | American Gene Technologies International Inc. | Compositions and methods for treating phenylketonuria |
| US20200181645A1 (en) | 2017-06-16 | 2020-06-11 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of tumor cytotoxicity via human gamma-delta t-cells |
| AU2018345745A1 (en) | 2017-10-02 | 2020-04-30 | American Gene Technologies International Inc. | Vectors with promoter and enhancer combinations for treating phenylketonuria |
| EP3876952A4 (en) | 2018-11-05 | 2022-08-24 | American Gene Technologies International Inc. | VECTOR SYSTEM FOR EXPRESSING REGULATORY RNA |
| US20220162643A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-05-26 | American Gene Technologies International Inc. | Optimized phenylananine hydroxylase expression |
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