CN102438631A - 抗hiv干细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
对HIV感染有抗性之重组干细胞系被揭露。该等重组干细胞在治疗AIDS上之用途亦被揭露。
Description
相关申请案
本申请案系请求于2009年4月9日申请之美国临时申请案第61/167967号之优先权,该美国暂时申请案之内容系于此处藉由参考被整体并入。
发明领域
本发明是关于使用对HIV感染具有抗性之干细胞来治疗AIDS。
背景技术
人类免疫缺乏症病毒(HIV-1)于成人及孩童上造成后天性免疫缺乏症候群。仅在2007年内,估计有约370,000孩童被HIV感染。在2007年由于AIDS而死亡的约二百万人中,有七分之一为孩童。的确,母亲对孩童之HIV传染对大多数经感染有HIV的孩童负有责任。尽管此传染系可经由母亲之抗病毒疗法与在分娩中小心限制暴露在母亲体液下而被避免,但许多幼儿仍因为许多原因而持续被感染。首先,经HIV感染幼儿之现有治疗方法系受限且相对不有效的。其次,AIDS倾向在幼儿内快速地进展。第三,特殊的诊断技术系被需要用于侦测小于18个月大的幼儿,且在小于18个月大时,幼儿可能尚未发产出对HIV的抗体或幼儿可能具有衍生自母亲的抗体。最后,尽管抗逆反转录病毒(anti-retroviral)疗法可被使用于治疗幼儿,该等疗法无法修复对孩童幸存于一般孩童时期疾症是必须的免疫功能,该等一般孩童时期疾症系诸如水痘与腮腺炎。因此,有需要一用于治疗在婴儿内AIDS的方法。
发明内容
本发明是基于,至少部分地,不可预期的发现到诸如在婴儿出生时收集之脐带血细胞的干细胞系可被感染以使该等干细胞对于HIV-1感染具有抵抗性,且传输该经感染之细胞回至该婴儿或至另一人类个体,且产生抗HIV血液与免疫细胞。因此,经感染之细胞系可被使用于治疗AIDS而不导致骨髓摧毁(myeloablation)。
因此,本发明一态样之特征在于一用于治疗人类个体的方法,该人类个体具有,或有危险具有HIV感染。此方法包括获得含有第一RNAi试剂与第二RNAi试剂之人类干细胞,该第一RNAi试剂抑制CCR5的表现,该第二RNAi试剂CXCR4的表现,以及将一有效量之干细胞投药至需要其的人类个体。CCR5与CSCR4系趋化激素受器,且其等对于HIV感染淋巴球与巨噬细胞是必须的。经改良的干细胞对于HIV感染具有抵抗性且可在体外及体内形成族群形成单位(CFU)且在免疫缺乏人类个体(例如,幼儿)内移植及修复免疫功能。在一范例中,干细胞系在人体脐带血细胞内所发现的干细胞。
上述方法可被使用于治疗一由具有HIV感染之母亲所产出的幼儿。较佳地,干细胞(例如,脐带血细胞)系个体所自体衍生的。脐带血细胞系可藉由下列方法所获得,该方法包括将(1)第一RNAi试剂或一编码该第一RNAi试剂之第一核酸以及(2)第二RNAi试剂或一编码该第二RNAi试剂之第二核酸瞬间转送至细胞。该制备方法可进一步包括将一编码可选择性标记蛋白质之重组核酸输入至该细胞,且强化该等细胞在该可选择性标记蛋白质上之表现。上述该等细胞可进一步含有第三RNAi试剂,且该第三RNAi试剂抑制对于HIV复制或感染是必须之另一基因的表现。基因的范例包括编码CD4、HIV-1 gag、HIV-1 vive、HIV-1 tat及HIV-1 rev之基因。在一实施例中,一非病毒之方法系被使用于以短抑制RNAs(siRNA)来感染脐带血细胞(初生儿血液),且该等RNA阻断趋化激素受器(诸如CCR5与CXCR4)之合成。
本发明另一态样的特征在于一经分离之人类干细胞(例如,脐带血细胞)或含有此等细胞之组成物。该等细胞含有上述之第一RNAi试剂与一第二RNAi试剂。
一欲被治疗的个体系可藉由供HIV感染用之标准诊断技术而被鉴别。“治疗”意指将组成物(例如,细胞组成物)投药至个体,该个体系患有或有危险地形成有疾症,该个体具有治愈、减轻、缓解、补救、延迟开始、或改善疾症、疾症症状、次于疾症之疾病状态、或损伤/疾症之素因。“有效量”意指一能够在治疗各体内产生医学上所欲求结果之组成物量。治疗方法可被单独被施行或与其它药物或疗法结合施行。个体意指人类或非人类动物。非人类动物之范例包括所有脊椎动物,例如,哺乳动物,诸如非人类之灵长类动物(特定为较高等之灵长类动物)。在一较佳实施例中,个体为人类。在另一实施例中,个体为实验动物或适合作为疾症模式之动物。
本发明之一或更多实施例的细节系于如下说明中所列示。本发明之其它特征、目标及优点系明显见于说明、图式及申请专利范围中。此处所有援引之参考文件系欲协助了解本发明,且该等参考文件之整体系被并入以用于所有目的而不受限制。
附图说明
图1为一显示趋化激素共受器之图式。HIV-1结合至存在于经活化之T细胞上的CD4与CCR5共受器。CCR5之自然配位基(natural ligand)包括RANTES、MIP-1a、以及MIP-1b,其预防HIV-1结合至CCR5。HIV-1亦结合至CXCR4。SDF-1系用于CXCR4之自然配位基且迫使受器内在化且迫使该受器在作为用于HIV结合之共受器上具有较小的可用性。尽管CCR5与CD4为用于HIV-1结合之共受器,CXCR4、CCR3与CCR2b可不需要CD4而结合至HIV-1。HIV-1系甚少结合至CCR1,但可与其它共受器来结合至CCR1。受器系经G-蛋白质所耦合,且CCR5受器之活化系促进病毒复制。G-蛋白质之阻断倾向于减少病毒复制。
图2为一显示降低HIV-1感染之非遗传性方法的图式。将作为部分IgG融合蛋白之RANTES予以投药系显著地降低结合至CCR5之HIV-1以及细胞后续产生的感染。干扰素-β降低CD4与CCR5的表现且同时增加RANTES的产生,预防降低在巨噬细胞及其它免疫细胞上CXCR4的表现。
图3为显示趋化激素受器抑制方法。数种研究法系被设计来压抑CXCR4与CCR-5共受器在细胞表面上的表现。最有效且最流行的方法为RNA干扰(RNAi)方法,该方法为抑制受器蛋白质的转录。另一研究法为使用核糖酶,该核糖酶会破坏特定RNA。RANTES Kdel方法将内质网序列接附至RANTES。该方法将RANTES固定在内质网,且在该处RANTES可捕抓CCR5蛋白质。
图4为显示AIDS之组合疗法之图式。数种疗法系在绿色盒子中指出。例如,TAR诱饵法是在核仁内设置诱饵来吸引tat RNA,tat RNA为HIV-1包膜蛋白中之关键组分。抗tat si-RNA破坏tat RNA。抗rev si-RNA破坏rev RNA,rev RNA为另一重要的包膜蛋白。抗CCR5 siRNA或核糖酶是用于促进破坏CCR5 RNA与从而破坏CCR5 RNA表现的方法。阻断融合包膜醣蛋白之蛋白质gp41与gp120亦预防感染,藉由诸如T20(恩夫韦地(enfurvirtide))与C34之药物。抗CD4之抗体(抗CD mab)、马拉维诺(maraviroc)及其它药物亦可阻断受器。
图5为显示一经提议之脐带血细胞治疗的图式。在渗透猝以移除红血球与血小板之后,在DNAase存在下,带血单核细胞(cord blood mononuclear cell)系以Ficoll梯度(Ficoll gradient)分离。四种基因系藉由电穿孔法(electroporation)被转换至细胞内:CCR5Δ32、新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白质(GFP)、以及CXCR4 siRNA。CCR5Δ32是CCR5之突变形式,CCR5Δ32结合至CCR5且预防CCR5到达表面。CXCR4 siRNA是短的抑制RNA且其预防CXCR4之转录。绿色荧光允许经成功转染的细胞被观察到。新霉素抗性基因允许细胞对新霉素毒性具有抗性,简化经转染细胞之纯化。
具体实施方式
本发明是关于使用对HIV感染具有抗性之干细胞来治疗AIDS。
干细胞
不同的干细胞可被使用在本发明中。干细胞的范例包括脐带血细胞、造血干细胞、胚胎干细胞及其它干细胞,该等干细胞系可分化为功能性免疫细胞,诸如辅助型T细胞(T-helper cells)。
术语“干细胞”意指一能够分化为多种最终、经分化之细胞类别的细胞。干细胞系可分化全能或分化多能的。分化全能干细胞典型地具有可发展成为任何细胞类别的能力。分化全能干细胞在最初时系可为胚胎或非胚胎的。分化多能干细胞系为典型地具有可发展成为数种不同、最终经分化之细胞类别之能力的细胞。单势细胞系仅可制造一细胞类别,但具有自我更新之特性,该自我更新之特性将单势细胞与其它干细胞区别开。干细胞可源自不同的组织或器官系统,包括,但不限制于,血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨头、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺与其类似者。根据本发明,干细胞可衍生自成人或初生儿组织或器官。
于本发明中所述之细胞系基本上纯净的。术语“基本上纯净的”,当对应于干细胞或衍生自干细胞(经分化的细胞)时,该术语意指特定的细胞在制备中构成细胞的基本部分或细胞的大部分(亦即,多于20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%)。一般而言,在制备中基本上经纯化之细胞总数构成制备中细胞的至少约70%,制备中细胞的通常约80%(例如,95%、97%、99%、或100%)。
在较佳实施例中,脐带血细胞系被使用。该等干细胞系藉由此项技艺中已知的方法被增殖,且接着藉由已知技术被测试。为了确认细胞之分化潜能,该等细胞系可藉由此项技艺中已知的方法被诱导形成,例如,不同的族群形成单位。
因此经确认之细胞系可进一步在非分化培养基中增殖以供多于10、20、50或100族群倍增,而没有自发性分化、老化、型态变异、增加生长速率或改变在分化至神经元之能力的迹象。该等细胞在使用前可藉由标准方法被储存。
术语“增殖”及“扩大”于此处关于细胞上系可被互换使用,意指相同类型的细胞数量藉由分裂而增加。术语“分化”意指一发展过程,藉由此发展过程细胞变成为专一于特定功能,例如,其中细胞具有一或多个形态特征及/或功能且该等形态特征及/或功能系不同于初始细胞之形态特征及/或功能。术语“分化”包括谱系提交(lineage commitment)与最后分化方法。分化系可被评估,例如,藉由监测谱系标记(lineage marker)的存在或不存在,使用免疫组织化学或其它为熟悉此项技艺者所知的步骤。衍生自原始细胞之经分化子代细胞系可,但不必需,与如同干细胞之原组织的相同胚层或组织相关联。例如,神经原始细胞与肌肉原始细胞可分化为造血细胞谱系。术语“谱系提交”及“特殊化(specification)”于此处可被互换使用,意指干细胞进行的过程,其中干细胞引发一指定用于形成特定限制范围之经分化细胞类型的原始细胞。经指定使用之原始细胞系通常能够自我更新或细胞分裂。术语“最后分化”意指细胞最后分化为一成熟、完全分化的细胞。例如,神经原始细胞及肌肉细胞原始细胞可分化为造血细胞谱系,该等原始细胞之最后分化导致特定细胞类型之成熟血球。通常地,最后分化与自细胞周期退出及增殖中止相关。术语“原始细胞”,如此处所使用,意指一指定用于特定谱系提交之细胞,且该原始细胞藉由一连串的细胞分裂来引发此谱系的细胞。原始细胞之范例系为肌胚细胞,该肌胚细胞系能够分化为仅一种类型的细胞,但该肌胚细胞本身系没有完全成熟或完全分化。
RNAi/核酸/载体
上述干细胞系可被转染以表现一或多个RNAi试剂(例如,抗CCR5或CXCR4之RNAi试剂),该等试剂使得细胞具有对抗HIV之抗性。
术语“RNAi”或“RNA干扰”意指一特定序列或选择性方法,藉由该选择性方法来调降目标分子(例如,目标基因、蛋白质或RNA)。使用特征在于降解RNA分子(例如,在细胞内)之RNAi系落在本发明范围内。降解系藉由酵素性、由RNA诱导之沉默复合体(RNA-induced silencing complex)(RISC)而被催化。RNAi在细胞内自然地发生以移除外来RNAs(例如,病毒RNAs)。天然RNAi系藉由自由双股RNA所分裂之片段而进行,该天然RNAi导引降解机制。选择性地,RNAi可藉由人手而被起始,例如,压制目标基因的表现。
术语“RNAi试剂”意指一RNA(或其类似物),对一目标RNA(亦即,被降解之RNA)具有充分序列互补性以导引RNAi。具有“对目标RNA序列充分互补以导引RNAi之序列”的RNA试剂意指RNA试剂具有一藉由RNAi机制(例如,RISC复合体)或方法足以引发破坏目标RNA之序列。具有“对目标RNA序列充分互补以导引RNAi之序列”的RNA试剂亦意指RNA试剂具有一藉由RNAi机制或方法足以引起目标RNA之转译抑制的序列。RNA试剂亦可具有一与由目标DNA序列所编码之目标RNA充分互补的序列,以使得该目标DNA序列系染色质静默的(chromaticallysilenced)。换句话说,RNA试剂具有一足以诱导转录基因沉默的序列,例如,位于或邻近目标DNA序列上以降调节基因表现,例如,藉由诱导染色质结构在目标DNA序列上或邻近目标DNA序列上改变。术语“RNA”或“RNA分子”或“核醣核酸分子”意指核醣核苷酸之聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核醣核酸分子”意指脱氧核醣核苷酸之聚合物。DNA及RNA系可自然地被合成(例如,分别藉由DNA复制或DNA转录)。RNA可被后转录地修饰。DNA及RNA亦可被化学合成。DNA及RNA可单股(亦即,分别为ssRNA与ssDNA)或多股(例如,双股,亦即,分别为dsRNA与dsDNA)。
小、干扰RNA(siRNA)分子系典型地为双股RNA分子(RNA系通常为单股),且该等双股RNA分子抑制其目标mRNA的表现。如此处所使用,术语siRNA可包括有时被称为如短发夹型RNA(hairpin RNA)(shRNA)分子之事物。典型地,shRNA分子系以藉由小循环序列分开之短互补序列所构成,其中该等序列中之一者系与基因目标互补。shRNA分子系在细胞内典型地藉由核酸内切酶被处理为siRNA。
藉由本发明之RNAi表现套组(RNAi expression cassette)所编码之RNAi序列造成小干扰RNAs的表现,该等小干扰RNAs为短、双股之RNAs且在正常哺乳动物细胞内是没有毒性的。在此类DNA衍生RNAi(ddRNAi)试剂之长度并没有特别的限制,只要该等试剂不显现出细胞毒性。RNAis可为,例如,15至49bp之长度,较佳为15至35bp之长度,且更较佳为19至29bp之长度。RNAis之双股RNA部分系可全部为同源的,或可含有非配对部分,该非配对部份系由序列错配(sequencemismatch)(对应之各股核苷酸系不互补)、凸出(在一股上缺乏相对应之互补核苷酸),及类似者所造成。此类非配对部分可被容许至该等非配对部分不显著干扰RNAi双股形成(duplex formation)或效能的程度。
在ddRNAi试剂有效地使目标基因静默的时候,如本发明之ddRNAi试剂之末端子系可为平钝的(blunt)或黏性的(突出的)。在产生之ddRNAi试剂系能够诱导RNAi效果的时候,该黏性的(突出的)末端结构并没有限制仅在3’突出,亦可包括5’突出结构。除此之外,突出核苷酸之数目系可为任何数字,只要产生的ddRNAi试剂系能够诱导RNAi效果。例如,若存在,突出可由1至8个核苷酸所构成:较佳为突出由2至4个核苷酸所构成。
在本发明中所使用之ddRNAi试剂可具有一茎环(stem-loop)结构之前趋物(shRNA),其中双股RNA之末端系藉由单股连接,该单股为联接子RNA(linkerRNA)。该shRNA之环部分的长度可为5至20bp长,且较佳为5至9bp长。
核酸序列系为用于本发明之RNAi表现套组的标地,且该核酸序列包括涉及HIV复制或感染之基因。用于RNAi试剂或试剂的序列系依据选自标地基因序列之基因序列;以及较佳系基于标地基因序列之区域且该等区域为保守的。供比较用之序列比对方法与RNAi序列选择法系此项技艺中为人所熟知的。测定二或多个序列之间之百分比一致性(identity)系可使用数学算法而完成。此类数学算法之较佳、无限制的范例系Myers与Millers(1988)之算法;Pearson与Lipman(1988)之寻找相似性方法(search-for-similarity-method);以及Karlin与Altschul(1993)之算法。此类数学算法之较佳、计算机设备系被利用。此类设备包括,但不限制于:PC/基因程序内之CLUSTAL(可自Intelligenetics,Mountain View,Calif.获得);ALIGN程序(2.0版本)、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、Megalign(使用Jotun Hein、Martinez、Needleman-Wunsch算法)、DNAStar Lasergene(参阅www.dnastar.com)以及威士康新基因软件程序包(Wisconsin Genetics Software Package)内之TFASTA、第8版本(可自Genetics Computer Group(GCG)、575 Science Drive、Madison、Wis.、USA获得)。使用此等程序之对准(alignment)系可使用系统内定参数或由操作者选用的参数而被操作。CLUSTAL程序系由Higgins所详尽的描述。ALIGN程序系基于Myers与Miller之算法;以及BLAST程序系基于Karlin与Altschul之算法。用于操作BLAST分析之程序系可经由生物科技信息国家中心(National Center for BiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公开获得。
典型地,藉由RNAi来抑制标地序列需要在标地序列与RNAi分子之义股(sensestrand)之间之高程度的序列同源性。在一些实施例中,此同源性系高于约70%,且可高于约75%。较佳地,同源性系高于约80%,且系高于85%或甚至90%。更较佳地,标地序列与RNAi之义股之间之序列同源性系高于约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。
除了基于标地基因之保守区域来挑选RNAi序列之外,RNAi序列之挑选系可基于其它因素。该等因素之范例包括GC含量之百分比、转译起始密码子之位置、或序列相似性,该序列相似性系基于一用于搜寻经建议之RNAi同源性的经由计算机仿真之序列数据库、热力学配对准则。择一地,个别特定候选RNAi聚核苷酸序列系典型地可被生成且被测试以测定所欲求之标地表现的干扰是否可被诱导出。
当使用ddRNAi试剂,RNAi表现套组系被接合至一输送载体。此构成物系可衍生自病毒且适合病毒输送,且RNAi表现套组系被插入至该构成物且被使用于在不同细胞种类中ddRNAi试剂之高效能传导与表现;择一地,非病毒输送方法可被使用。此构成物的产生系可使用此项技艺中习知之任何适合的基因改造技术而被完成,包括PCR之标准技术、寡核苷酸合成、限制核酸内切酶分解、接合、转形、质体纯化、以及DNA定序。若此构成物示病毒性构成物,则此构成物系较佳地包含,例如,必须用于将RNAi表现构成物包封至病毒颗粒的序列及/或允许RNAi表现构成物结合至标地细胞基因体之序列。病毒构成物亦可含有允许病毒复制且增值的基因,尽管在其它实施例中此类基因系在过程中(in trans)被提供。额外地,病毒构成物可含有来自任何已知有机体之基因体的基因或基因序列,且该有机体之基因体系以原型或经改善者而被并入。例如,较佳的病毒构成物可包含有益于细菌内构成物复制的序列。
该构成物亦可含有额外之遗传因子(genetic element)。因子类型系可被包括在构成物内但不限制于任何形式,且其可藉由此项技艺中之熟悉此技艺者所选择。例如,额外遗传因子可包括一受器基因,诸如一或多个用于诸如GFP或REP之荧光标记蛋白质的基因;一简易分析酶,诸如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-醛糖酸化合物酶、氯霉素乙酰转移酶或经分泌之胚胎碱性磷酸酶;或诸如荷尔蒙或细胞介素之蛋白质,且其等免疫分析法亦可易于获得。其它遗传因子可发现使用于本发明实施例中,且包括编码为具有一在细胞上有选择性生长优势之蛋白质的遗传因子,该等蛋白质系诸如腺苷去胺酶、胺甘醇磷酸转移酶(aminoglycodic phosphotransferase)、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、抗药剂、或编码为蛋白质之基因且该等蛋白质提供一自自营生物中所缺乏之生物合成能力。若报告基因系与RNAi表现套组一起被包括,则内部核糖体插入位点(IRES)序列系可被包括。较佳地,额外之遗传因子系可操作地与一独立启动子/增强子连接或被该独立启动子/增强子所控制。除此之外,用于在细菌内增殖构成物之适合的复制原点系可被使用。复制原点之序列系通常系与ddRNAi序列及其它欲在细胞内被表现之基因序列分隔开。此类复制原点系为此项技艺中所习知且包括pUC、ColE1、2-micro或SV40复制原点。
用于表现siRNA分子之载体较佳使用一强大的启动子,该启动子可为固有的或被经调控的。此等启动子系于此项技艺中所习知且包括,但不限制于,RNA聚合酶II启动子、T7聚合酶启动子、及RNA聚合酶III启动子U6与H1(参阅,例如,Myslinski et al.(2001)Nucl.Acids Res.,29:2502-09)。较佳地,RNA聚合酶III启动子系被使用。用于表现本发明之siRNA分子的较佳表现载体为质体与病毒载体(参阅,例如,Sui et al.(2002)PNAS 99:5515-5520;Xia et al.(2002)Nature Biotech.20:006-1010;Barton与Medzhitov(2002)PNAS 99:14943-14945;Brummelkamp et al.(2002)Science 296:50-553;Devroe与Silver(2002)BMC Biotechnol.,2(1):15;Tiscorniaet al.(2003)PNAS,100:1844-1848)。
传输系统
本发明之RNAi表现构成物与RNAi试剂系可在活体外或生物体之外被引用至标地细胞,且接着后续地被置放入病人内以影响疗法,或藉由活体投药来直接投药至病人。标地细胞可自下列所获得:脐带血、骨髓、末梢血液或任何其它此项技艺中习知之用于获得干细胞的方法。
病毒为主之系统
基于任何适合病毒之病毒传输系统系可被使用于传输本发明之RNAi表现构成物。除此之外,杂交病毒系统系可被使用。病毒传输系统之选择系依据不同的参数,诸如传输至细胞内之效率、系统之传导效率、致病力、免疫与毒性关系及其类似者。当挑选一用于使用于苯发明之病毒传输系统时,选择一系统是重要的,其中含有病毒颗粒之RNAi表现构成物系较佳为:1)复制且稳定增殖;2)能够被纯化至高效价(titer);且3)能够媒介标地传输(将多启动子RNAi表现构成物传输至所需细胞且不广泛散布)。一般而言,使用于基因疗法中之五种最常被使用的病毒系统种类系可被分类为二个群组,且其等系依据其等基因体是否融合入宿主细胞染色质(致癌反转录病毒(oncoretroviruses)及慢病毒(lentiviruses))或显著地存在于细胞核中作为染色体外之离合染色小体(腺相关病毒、腺病毒与疱疹病毒)而被分类。
例如,在本发明之实施例中,来自小DNA病毒科(Parvoviridae family)之病毒系被使用。小DNA病毒系一小单股、具有约5000核苷酸长之基因体之非外套膜DNA病毒的科。被包括在该科的成员有腺相关病毒(AAV)、一独立小病毒且根据定义该独立小病毒为需要与另一病毒(典型地为一腺病毒或疱疹病毒)共感染以起始且维持一生产感染循环。在缺乏此类辅助病毒的情况下,AAV系仍然能够藉由经受器媒介之结合与内在化、穿透在未分裂细胞及分裂细胞中之细胞核来感染或传感一标地细胞。不同于反转录病毒、腺病毒与单纯性疱疹病毒,AAV显现出缺乏人类致病力与毒性(Kay,et al.,Nature.424:251(2003)与Thomas,et al.,Nature Reviews,Genetics4:346-58(2003))。
另一因本发明之RNAi表现构成物而有用之病毒传输系统系一基于来自反转录病毒科之病毒的系统。反转录病毒包含单股RNA动物病毒,且该病毒之特征在于二个独特特性。第一,反转录病毒之基因体为二倍体,且由RNA之二拷贝所构成。第二,RNA系藉由与病毒体相关之酶反转录酶而被转录为双股DNA。此双股DNA或原病毒可接着融合至宿主染色体中且作为宿主染色体之稳定融合成分而自母细胞被传递至子代细胞。
慢病毒亦可被使用于本发明中。慢病毒载体系经常以水泡性口炎病毒-醣蛋白(VSV-G)而为假型(pseudotyped),且系已衍生自人类免疫缺乏症病毒(HIV),人类后天性免疫缺乏症候群(AIDS)之病原学上试剂;visan-maedi,其造成绵羊之脑炎(visna)或肺炎;马传染性贫血症病毒(EIAV),其造成马之自体免疫性溶血性贫血及脑病变;猫免疫缺乏症病毒(FIV),其造成猫之免疫缺乏症;牛免疫缺乏症病毒(BIV),其造成牛之淋巴结肿大与淋巴球增多症;以及猴免疫缺乏症病毒(SIV),其造成非人类灵长目之免疫缺乏症及脑病变。载体系基于之HIV,且该载体一般系维持<5%亲代基因体,且<25%之基因体系被并入至包封构成物内,该基因体减小恢复可复制HIV世代之可能性。生物安全已进一步藉由自我失去活性载体之发展而增加,该载体含有在下游长端重复序列中删除调控因子,减少自经融合之原病毒的转录。
其它在此项技艺中为熟悉此技艺者已知的病毒系统可被使用来传输本发明之RNAi表现套组至细胞。
该等范例包括经删除基因之腺病毒-转位子载体,该载体经由融合入宿主细胞内维持活体内经病毒编码之基因转殖(参阅Yang,et al.,Nature Biotech.20:999-1004(2002));衍生自新德比斯病毒(Sindbis virus)或圣利基森林病毒(Semliki forestvirus)之系统(参阅Peri,et al.,J.Virol.74(20):9802-07(2002));衍生自新城病病毒(Newcastle disease virus)或仙台病毒(Sendai Virus)之系统。
非病毒系统
择一地,RNAi表现套组或相关载体可藉由非病毒方法传输至细胞。范例包括磷酸钙共沉淀、经DEAE-类糊精媒介之转染、脂质体转染(lipofection)、电穿孔法、或显微注射法。又,没有影响细胞多能性之方法系较佳的。此类技术之叙述系可自下列被发现,例如,美国专利案第7,422,736号及第5,592,625号及美国专利申请案第20020127715号。进一步之范例包括细菌载体或微环(mini-circles)(参阅Chen,et al.,Molecular Therapy.8(3):495-500(2003)及美国专利公开案第2004/0214329号)。微环系非病毒DNA载体且其提供用于持续高度表现之核酸转录。微环载体之特征在于缺乏表现静默化(expression-silencing)之细菌DNA序列,且可包括非直接之特定位置重组产物序列,除了ddRNAi表现套组之外。
上述核酸或载体亦可藉由使用此项技艺中已知的聚合性、生物降解微粒或微胶囊传输组件而被传输。另一达致吸收核酸之方式为使用微脂粒,其系藉由标准方法所制备。聚核苷酸可被单独并入至传输媒剂或与特定组织之抗体共被并入。择一地,人可制备由质体或其它载体所构成之分子共轭体(molecular conjugate),该质体或载体藉由静电或共价力接附至聚-L-离胺酸。聚-L-离胺酸结合至配位基,该配位基可结合至标地细胞上之受器(Cristiano,et al.,1995,J.Mol.Med.73:479)。择一地,组织特异性标地可藉由使用此项技艺中已知之组织特异性转录调控因子而被达成。“裸露DNA”(亦即,不需传输媒剂)之传输至肌内、皮内、或皮下位置系另一达到活体内表现的手段。
常见之转染试剂系带电亲脂化合物,该化合物可穿越过细胞膜。当该等化合物与RNAi试剂错合时,该等化合物可作用于携带RNAi试剂横越过细胞膜。大量此类化合物系可商业上获得。聚伸乙亚胺(PEI)系一转染试剂种类,与亲脂化合物化学上不相同且以与亲脂化合物之相似方式作用,但聚伸乙亚胺具有亦可穿越过核膜之优点。此类试剂之范例为ExGen 500(Fermentas)。如本发明之构成物可被包封如一线性片段在合成微脂体或微胞中以用于传输至标地细胞。
另一有效用于本发明之传输方法包含使用CyclosertTM技术,该技术系如在美国专利案号第6,509,323号中所述。此技术平台系基于葡萄糖之杯状环型重复分子,亦被知悉为环糊精。环糊精分子之“杯”可与其它分子形成“包容错合物(inclusioncomplex)”,使该分子可以其它部分接合CYCLOSERT聚合物来增强稳定性或添加标地配位基。除此之外,环糊精在人类中系已被发现为安全的(各环糊精在经FDA认证之口服及IV药物中一般地增强稳定性)且可以药物等级大规模低花费下被购买。此等聚合物在治疗剂量下系非常水可溶性、非毒性且非产生免疫性的,甚至当重复投药时。该等聚合物可被轻易适用来在药物装载量下携带广泛范围之小分子治疗剂,该范围之小分子治疗剂系可显著高于微脂体。
经化学改良之siRNA分子可被使用于本发明中。此化学改良之范例包括,而非限制,硫代磷酸酯核苷酸间键合、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟-核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“一般碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、及经转化脱氧脱碱残基并入。较佳地,化学改良保存在细胞内未经改良之siRNA分子的抑制活性,尽管,在同时,增加化合物之血清稳定性或siRNA分子之其它有利特性。美国专利申请公开案第20050032733号,此处藉由参考而并入,提供诸多siRNA分子之合适改良。
使用及应用
本发明中所述之干细胞系可被使用于多种方式。人可使用该等细胞用于治疗人类个体中之AIDS。特定地,该等细胞可被用于治疗自具有HIV母亲所出生之幼儿。
例如,人亦可自此一新生儿中分离出脐带血细胞。之后,人可将一表现核酸载体引用入至该等细胞中,该载体系以上述方式编码上述之RNAi试剂。在传输载体至该等细胞后,人可使用此项技艺中已知方法将该等细胞移殖回新生儿。当该等细胞自相同人被制造出时,治疗没有造成免疫排斥。
择一地,人可使一般捐赠细胞自干细胞(例如,脐带血细胞)被制造出,且该等干细胞系自健康个体被制备。用于制造一般捐赠细胞之方法系为此项技艺中所已知的,且用于供治疗AIDS用之一般捐赠细胞的制备方法将于下列述明。
在适合的条件下,经移植的细胞可发展成为功能性血球及免疫细胞。为促进该等细胞之发展,可以诱导该等细胞发展之因子投药于病人。此类因子可为小分子化合物、胜肽、及核酸。范例包括促使免疫细胞分化之细胞介素。
上述细胞与方法可被使用于此项技艺中已知之不同基因疗法。基因疗法包括活体外或活体内之技术。特定地,上述干细胞系可以寡核苷酸调节子或编码调节子之核酸分子被活体外进行基因改造,且经改造过之细胞系可接着被提供给欲被治疗的病人。细胞培养可被配置供投药于病人用,例如,藉由分离细胞(例如,藉由机械式分离)且以药学上可接受载剂(例如,经磷酸缓冲之生理食盐水)仔细掺合细胞。择一地,细胞可被培养在适合之生物兼容撑体上,且被移植至病人中。经改造之细胞系典型为自体的,以使得防止异种或异型排斥。此类活体外方法系此项技艺中已知的。
上述干细胞可被基因改造为产生组织兼容捐赠细胞或组织以用于移植至其它病人。移植与细胞疗法之目的为以功能捐赠组织或器官来成功取代衰退的组织或器官。然而,为了成功移植,二个重要阻碍必须被克服:合适的捐赠组织或器官的可获得性与免疫排斥。衰退组织或器官之取代以及排斥之治疗系受限于可接受之捐赠者的数量与毒性抑制免疫药物之共投药及长期抑制免疫规程结合的需要。现今且实验性移植规程主要仰赖兄弟姐妹之捐赠者、其它一小群同种性捐赠者、及异种捐赠者。上述经基因改造之干细胞可被使用于克服此等限制。
更特定地,此处所述之该等干细胞系可被基因改造以不表现在其等表面第II类MHC分子上。更较佳地,该等细胞系被改造以实质上不表现所有细胞表面第I类及第II类MHC分子。如此处所使用,术语“不表现”意指不足量被表现在细胞表面以引起反应,或意指被表现之蛋白质不足且因此无法引起反应。
MHC分子意指HLA分子,特定为HLA A、B,及C类,以及第II类HLADP、DQ、及DR,以及其等之子类。术语系通常被解释如特定用于人类MHC,但此处倾向包括来自其它捐赠细胞种类之相同MHC基因,例如,若细胞系为猪来源,则术语HLA将意指为相同之猪MHC分子,不论是MHC I或是II。当第II类MHC分子被移除时,CD4+T细胞无法辨认经基因改造之内皮细胞;当第I类与第II类MHC分子被移除时,CD4+或CD8+皆无法辨认经改良之细胞。
较佳在干细胞上操作之基因改造包括1)分裂内生性不变链基因,该基因作用于组合与输送第II类MHC分子至细胞表面且负载抗原性胜肽,以及2)分裂内生性β2-微球蛋白基因(β2M基因),该基因编码有全部第I类MHC分子之细胞表面表现所需的蛋白质。择一地,仅不变链基因被分裂。不变链被相信是将抗原性胜肽片段插入至MHC第II类分子所必需要者。同时,抗原性胜肽与MHC系被T细胞所辨认。在缺乏抗原性胜肽下,T细胞辨认系无法被正常获得,且MHC第II类分子亦无法合适地折迭。因此,在细胞缺乏不变链下,胜肽之显现将被消除,且甚至在微量的细胞表面MHC被获得下,细胞可缺乏胜肽且因此为无产生免疫性的。
分裂基因可经由同源重组基因标地技术之手段而被完成。该等技术系此项技艺中所已知的。参阅美国专利案号第6916654与6986887,Zijlstra et al.,1989,Nature342:435438;及Koller et al.,1990 Science 248:1227-1230。
组成物
本发明提供含有上述细胞及选择性其它活性抗-HIV试剂/化合物(例如,用于治疗AIDS之药物)之药学组成物。抗-HIV试剂之范例包括HIV疫苗、蛋白酶抑制剂(例如,INDINAVIR、RITONAVIR、SAQINAVIR、NELFINAVIR、及AMPRENAVIR)、核苷反转录酶抑制剂(例如,ZIDOVUDINE(AZT)、DIDANOSINE、ZALCITABINE、LAMIVUDINE、STAVUDINE及ABACAVIR)、非核苷反转录酶抑制剂(例如,NEVIRAPINE、DELAVIRDINE、及EFAVIRENZ)、整合酶抑制剂、及融合抑制剂。
药学组成物可藉由混合治疗有效量之细胞及,选择性其它活性试剂/化合物,与药学上可接受载剂而被制备。载剂考具有不同形式,依据投药的路径。
如上所述之药学组成物可藉由传统药学赋形剂与制备方法所制备。所有赋形剂可与破碎试剂、溶剂、粒化试剂、保湿剂、及结合剂混合。如此处所使用,术语“有效量”或“治疗有效量”意指一造成至少一症状或特定异常参数之可测量改善的量。上述细胞之治疗有效量可藉由此项技艺中已知的方法而测定。治疗一异常之有效量可轻易藉由此项技艺中为通常知识者所熟知之以经验为依据的方法来被测定。欲被投药给病人之确切量将会依据异常之状态与严重性以及病人之身体情况而变动。任何症状或参数之可测量改善系可藉由此项技艺中熟悉此技艺者或藉由病人对医生之报告所测定。将可被了解到,任何症状或上述异常参数之任何临床或统计上显著减少或改善系在本发明之范围内。临床上显著减少或改善代表病人及/或医生系可察觉到的。
惯用语“药学上可接受”意指分子实体及此类组成物之其它成分,且当被投药至人类时,该等分子实体及此类组成物之其它成分系生理上可忍受且典型地不产生不需要的反应。较佳地,术语“药学上可接受”意指经由联邦或州政府之管理机构或列示在美国药典或其它一般认可之使用于哺乳动物,且更特定于人类之药典所认可。药学上可接受盐类、有关其等盐类之酯类、酰胺类、及前趋药(例如,羧酸盐、胺基酸添加盐类)、酯类、酰胺类、及前趋药,其等系在合理医疗判断之范围内,适合使用于与病人组织接触而不需过度毒性、刺激、过敏反应、或类似者,与合理之效益/风险比率相对应,且对其等意欲达到的用途系有效的。
施用于上述药学组成物之载剂指的是稀释剂、赋形剂、或是媒剂,其等与化合物系被投药。此类药学载剂可为无菌液体、诸如水及油。水或水溶液、食盐水溶液、及水葡萄糖及甘油溶液系较佳被使用如载剂,特定用于可注射溶液。合适的药学载剂系如E.W.Martin之“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第18版。
上述细胞或活化试剂可经由浸渍或注射(例如,静脉内、鞘内、肌内、腔内、气管内、腹膜内、或皮下)、口服、经皮肤吸收或其它此项技艺中已知的方法被投药至个体。可每二周投药一次、一周一次、或更常,但在疾症或异常之维持期期间之频率可被降低。
异源与自体衍生细胞系皆可被使用。在前者中,HLA配对相合系可被进行以避免或减少宿主反应。在后者中,自体衍生细胞系自个体中被增丰且被纯化,且被储存以供后续使用。该等细胞可在活体外宿主或移植T细胞的存在下被培养且被再输入至该宿主。此可具有宿主辨识该等细胞如自身者且较宜于提供降低T细胞活性的优点。
剂量或投药频率将依据临床标记,其确认缓解期之维持,以减少或缺乏至少一或多个,较佳为多于一个之急性期的临床标记,该临床标记系为此项技艺中熟悉此技艺者已知。更通常地,剂量或投药频率将部分依据病理标记与疾症情况或异常之临床和无症状性症状的退减,该疾症情况或异常系被预期以上述组成物治疗。剂量及投药疗程可依据年龄、性别、被投药之身体情况、及需要被治疗之病人或哺乳类内的副作用与共轭利益、以及医生判断而被调节。在所有上述方法中,被投药至个体之细胞为1x104至1x1010/时间。
CKR5Δ32突变
HIV-1结合至CD4+单核球,但需要共受器以感染细胞。趋化激素受器5(CKR5或CCR5)作为一供约半数之HIV-1菌株用的第二受器。CCR5之特定突变给予了对抗藉由HIV-1暴露之感染的强力保护。位于人类染色体3p21上之CCR5基因失去一称为(CKR5Δ32)之32碱基对对偶基因。存在于约10%于欧洲及美国的高加索人中,突变给予对抗AIDS的保护。注意到的是鼠类CCR5,即使该鼠类CCR5系对于人类CCR5具有82%之一致性,该鼠类CCR5不支持HIV-1结合(Atchison,et al.,1996,Science.274:1924-6),阐明了老鼠淋巴球对HIV-1之抗性。病人对于CKR5Δ32系为同型合子且保持HIV-1抗体阴性,尽管持续暴露在HIV-1下。Dean,et al.(Dean et al.,1996,Science,Science.273:1856-62)检验1955位病人,该等病人系为充分表现特性之AIDS世代研究之一部分。在612位病人中有17位病人为CKR5Δ32同型合子,且该等612位病人为暴露在HIV-1下但为HIV-1抗体阴性。在1343位经HIV-1感染之个体当中,没有个体对于CKR5Δ32为同型合子。CKR5Δ325之频率在幸免于HIV-1感染多于10年之个体中亦显著增加。同样地,Huang,et al.(Huanget al.,1996,Nat Med.2:1240-3)在1252位被HIV感染之个体中没有发现到CKR5Δ325同型合子,但3.6%经HIV曝露而未被感染之参与者系CKR5Δ32同型合子。CKR5Δ32突变可已进化为保护对抗鼠疫及天花(Galvani et al.,2003,Proc Natl AcadSci USA.100:15276-9;Hendrick et al.,2006,Trends Genet.22:293-6;Sabeti et al.,2005,PLoS Biol.3:e378;及Stumpf et al.,2004,Trends Ecol Evol.19:166-8),鼠疫及天花在500-600年前在欧洲为全国流行的。在11-14世纪被发现之突变系仍在波兰且具有约5%之流行程度(Zawicki et al.,2008,Infect Genet Evol.8:146-51)。些许近期之研究暗示到CKR5Δ32突变最早存在于铜器时代,将突变时代推回至至少3000且可能5000年前。淋巴腺鼠疫系不为一可能选择因素,因为缺乏CCR5而增加鼠疫杆菌之可感染性(Styer et al.,2007,Microbes Infect.9:1135-8)。疫苗病毒,给予对天花之抗性,偏好于感染CD8+t细胞,且该细胞表现CCR5(Vanpouille et al.,2007.J.Virol.81;12458-64)。CKR5Δ32基因在欧洲或许经演化。CKR5Δ32突变以在高加索俄罗斯人中自0.13至以在鞑靼人、乌兹别克人、哈萨克人、阿塞拜疆人、回纥人(Uigurts)、图瓦人、及乔治亚人。具有防卫性CKR-5同型合子对偶基因之个体在细胞表面上不表现可侦测之CCR5,且可幸免于多重曝露在HIV-1感染下(Liu et al.,1996,Cell.86:367-77)。CKR5同型合子发生10-20%在欧洲高加索人中,且缓慢疾正发展(Huang et al.,1996,Nat Med.2:1240-3与Rowe PM(1996)。CKR-5 deletionheterozygous progress slower to AIDS。Lancet.348:947)。CKR5Δ32不给予绝对保护(Balotta et al.,1997,Aids.11:F67-71)。巨噬细胞表现CCR5。末梢巨噬细胞表现CCR5且结核病增强CCR5表现与在巨噬细胞内HIV-1之复制。嗜M淋巴细胞病毒但没有嗜T淋巴细胞病毒系被防止进入于缺乏功能性CCR5受器之个体的树突细胞(Granelli-Piperno et al.,1996,J Exp Med.184:2433-8)。类似地,缺血与内毒素系藉由鼠类大脑小神经胶质来上调控CCR5受器表现(Spleiss et al.,1998,J Neurosci Res.53:16-28),暗示到CCR5仅在大脑巨噬细胞对HIV-1感染之可感染性上扮演重要角色。
CXCR4与其它亦影响HIV可感染性之受器
趋化激素受器CXCR4、CCR3及CCR2b亦可作为HIV-1之共受器(Alkhatib etal.,1997,J Biol Chem.272:20420-6)。Ayehunie,et al.(Ayehunie et al.,1997,Blood,90:1379-86)显示了HIV-1经由不同CC与CXC趋化激素共受器进入树突细胞。Bjorndal,et al.(Bjorndal et al.,1997,J Virol.71:7478-87)使用表现CCR1、CCR2b、CCR3、CXCR4、与CCR5之神经胶瘤细胞系以研究HIV-1分离者。藉由缓慢/低分离者之感染系受限于表现CCR5之细胞,同时快速/高分离者使用多重趋化激素受器,该等受器包括CCR5、CXCR4、CCR3、与CCR2b。Xu,et al.(XU et al.,2008,JInfect Dis.197:309-18)发现到血单核球包藏有多样化的HIV-1表型且该等表型结合至多重趋化激素受器。所有血单核球使用CCR5,一些使用CXCR4,一些使用CCR3,且一些使用多重共受器(CCR1、CCR3、GPR15、CCR5、CXCR4)。CXCR4亦称做融合素(fusin)或融合素(Lestr)(Simmons et al.,1996,J Virol.70:8355-60)。SDF-1系供CXCR用之生理配位基。SDF-1造成CXCR4之快速内在化且极度抑制HIV进入CD4+淋巴球。在HIV感染早期,病毒分离者结合CCR5,同时自HIV感染后期之分离者倾向结合CXCR4(Bleul et al.,1997,Proc Natl Acad Sci USA.94:1925-1930)。MT-2(巨噬细胞营养型2)(Macrophage Trophic 2)阳性HIV-1菌株经由CXCR4进入巨噬细胞(Bratt et al.,1997,Acids.11:1415-9)。一些巨噬细胞菌株可与CXCR4相互作用,而不需依靠CD4(Hesselgesser et al.,1997,Curr Biol.7:112-21)。HIV-2菌株利用CXCR4且,较小程度之CCR3,以供细胞融合用(Bron et al.,1997,J Virol.71:8405-15)。CXCR4阻断剂亦预防HIV-1感染。例如,抗CXCR4因子系经巨噬细胞衍生之趋化激素配位基22(CCL22)。HIV-1可结合且藉由结合CCR3而进入T细胞(AaSA-Chapman et al.,2006,J Virol.80:10884-9)。一些HIV-1菌株可在巨噬细胞上使用CCR3。Th 1及Th2细胞系藉由其等细胞介素之特征与CCR5及CCR3之表现而被定义。Alkhatib,et al.(Alkhatib et al.,1997,J Biol Chem.272:20420-6)显示CCR3与使用CC5之嗜M巨噬细胞型HIV-1菌株相互作用、使用CXCR4嗜T之T细胞系HIV-1菌株、及双向菌株(dual tropic strain)。CCR1对于CCR3有最接近之同源性(53%胺基酸一致)但CCR1系非HIV-1共受器。类似CXCR4,CCR3可作为供HIV-1感染大脑细胞用之CD4独立受器(Martin-Garcia et al.,2006,Virology.346:169-79)。初始证据暗示到CCR2可为供HIV-1感染之共受器。在1998年,Ksotrikis,et al.(Kostrikis et al.,1998,Nat Med.4:350-3)报告了在CCR2之编码区域之保守取代系与较慢疾症发展相关但不与HIV-1传递相关。因为CCR2系稀少经由HIV-1而使用如一共受器与在穿膜区域之突变,作者提意且发现到CCR2-V641对偶基因系与在CCR5调控区域之点突变相关。Hendel,et al.(Hendel et al.,1998,J Acquir ImmuneDefic Syndr Hum Retrovirol.19:381-6)发现到病人内CCR5突变对偶基因(p<0.04),但没有CCR2(p-0.09)或SDF1(p-0.12)与长期缓慢AIDS发展的显著关联。Magierowska,et al.(Magierowska et al.,1999,Blood.93:936-41)使用CCR5、CCR2、SDF1、及HLA基因之经结合表型以预测经HIV-1感染个体之长期未发展状态。
简言之,当大部分HIV-1分离者使用CCR5作为共受器以进入T细胞,HIV-1可进入使用其它共受器之巨噬细胞、树突细胞、与大脑细胞。CXCR4与CCR3可作为供HIV-1用之共受器,但CCR2并未显示为供HIV-1用之共受器。对抗CD40之抗体压抑HIV-1,且该HIV-1未使用CCR5/CXCR4。
趋化激素受器阻断预防HIV感染
HIV-1藉由结合CD4及CCR5或CXCR4来结合CD4。CCR5与CXCR4系趋化激素受器(De Clercq et al.,2001,Antivir Chem Chemother.12Suppl 1:19-31)。病毒进入可藉由天然配位基而被抑制,该等天然配位基系用于CXCR4、CXC趋化激素SDF-1、趋化激素RANTES、MIP-1α、及MIP-1β。数种胜肽亦已被确认为CXCR4拮抗剂且显示出抗HIV活性,包括二环拉胺(bicyclam)衍生物。AMD3100系一特定CXCR4拮抗剂。TAK-779系一抗HIV之四级铵衍生物且与CCR5交互作用。CD4+T细胞分泌数种天然HIV压抑因子。抗CCR5因子包括巨噬细胞发炎蛋白质-1α(MIP-1α或CCL3,巨噬细胞发炎蛋白质-1β(MIP-1β或CCL4),及RANTES(调控正常表现或分泌之T细胞的活化或CCL5)。趋化激素不仅藉由主要、非合体细胞诱导(NSI)HIV-1菌株来抑制CD4+T细胞感染,亦阻断经env媒介细胞对细胞膜融合。刺激CCR5系有助于病毒复制(Rahbar et al.,2006,J Virol.80:7245-59)且阻断CCR5系降低HIV复制(Arenzana-Seidedos et al.,1996,Nature.383:400)。
HIV进入抑制药物对于发展有HIV-1感染之病人系特别重要的,该等HIV-1感染对于重组抗病毒疗法系变成为有抗性的(2006,GMHC Treat Issues.20:4-7)。尽管关于CCR5/CXCR4拮抗剂系免疫抑制剂之安全性(2006,Treatment Update.18:5-6;2006,Proj Inf Perspect.7-12;2006,AIDS Alert.21:11-2;2006,AIDS Patient Care STDS.20:380;以及2006,AIDS Read.16;448)以及HIV-1可适用于逃避阻断CCR5之ECL2区域的治疗试剂的证据(Aarons at al.,Virology.287:382-90),人类基因科学开始了以抗CCR5单株抗体之人类临床试验(2004,IAVI Rep.9:15)。其它CCR5抑制剂(2004,AIDS Alert.19:121,123-4)显示有希望且系可被采用至邻床试验(2005 AIDS PatientCare STDS.19:59及Jones et al.,2007,Eur J Med Res.12:391-6)。HIV-1共受器系一特定吸引药物标地,因为该等共受器具有多重穿膜区域及G蛋白质区域且在小药物可作用该等区域上(Leonard et al.,2006 Curr Med Chem.13:911-34)。除此之外,小分子拮抗剂系可被设计为结合CCR5与CXCR4,该二个受器系被知悉为供HIV-1进入至淋巴球中用的共受器(Ji et al.,2006,J Biomol Screen.11:65-74;Liu et al.,2007,CurrPharm Des.13:143-62;Perez-Nueno et al.,2008,J Chem Info Model.48:509-33;Rusconiet al.,2007,Curr Top Med Chem.7:1273-89;以及Wang et al.,2008,J Mol Graph Model.26;1287-95)。其它药物瞄准在病毒或细胞表面蛋白质二硫化物异构酶上gp120-结合位置(Ryser et al.,2005,10:1085-94)。CCR5亦已为疫苗之广泛标地,甚至CCR5之免疫攻击可造成免疫下降。在2007,FDA核准马拉维诺,其为阻断CCR5之咪唑吡啶配位基,以及第一受器拮抗剂疗法以用于多重药物抗反转录病毒疗法已失败之病人。包括1076位经HIV菌株所感染之病人的二个双盲安慰剂对照试验,该等试验使用CCR5共受器以用于进入CD4+淋巴球。在8个星期之后,经Maraviroc治疗之病人具有较少的病毒负担,亦即,不可侦测45.5%比16.7%之安慰剂对照组,且有多于2倍之CD4+细胞。马拉维诺与其它新病毒药物具有不良之皮肤反应(Borras-Blasco et al.,2008,J Antimicrob Chemother.62:879-88)。其它相似药物系在第3期试验(Emmelkamp et al.,2007,Eur J Med Res.12:409-17)。简言之,CCR5之阻断剂不仅预防HIV-1进入,亦压抑病毒复制。此等包括CCR5之天然配位基,包括MIP-1β、MIP-1α、及RANTES。对抗CCR5之抗体亦压抑HIV-1感染。数种药物结合CCR5与CXCR4,以及其它HIV-1之结合位置。
用于AIDS之脐带血(UCB)疗法
AIDS系与淋巴球减少症、特定为CD4+淋巴球,以及初始型CD8+T细胞与非淋巴单核球之短缺。UCB疗法系可因子个理由而有利于AIDS。第一,UCB应直接补充t细胞群体且增强免疫功能。第二,UCB可灌输且添加至干细胞群体。第三,UCB血球倾向对于HIV感染具有更高抵抗力相较于周边血球。UCB淋巴球表现CCR7与CXCR4,同时成熟淋巴球表现较多之CCR5(Loria et al.,2005,Cell Immunol.236:105-9)。胎儿或新生儿淋巴球系因此较少受到HIV-1感染(Vicenzi et al.,2002,JLeukoc Biol.72:913-20)。趋化激素吸引UCB淋巴球至受伤处,亦即,MCP-1与MIP-1α,下调控其等CCR5表现。(Jiang et al.,2008,Curr Neurovasx Res.5:118-24)。最后,在血球中由单核球衍生之树突细胞(Folcik et al.,2001,J Hematother StemCell Res.10:609:20)对于HIV感染具有受限的易感染性,系由于较低的CD4与CCR5表现,与较低之MIP-1α与MIP-1β程度相关(Wang et al.,1999,J AcquirImmune Defic Syndr.21:179-88)。USB CD34+细胞表现CCR1且几乎没有CCR5受器(de Wynter et al.,1998,Stem Cells.16:349-56)。因为HIV-1不结合CCR1,脐带血CD34+细胞对HIV-1具有抗性(Majka et al.,2000,Exp Hematol.28:1334-42),但当其等分化且表现CCR5时(Hariharan et al.,1999,AIDS Res Hum Retroviruses.15:1545-52),其等子代可成为对HIV具有易感染性(Zhao et al.,1998,J Infect Dis.178:1623-34)。HIV-1感染CD34细胞及其等子代系取决于CD4受器之膜表现,与一些趋化激素共受器。UCB CD4+T细胞相较于其等之成熟对应者具有较不成熟的(Delespesse etal.,1998,Vaccine.16:1415-9)。其等活化系取决于经CD28所媒介之共讯号,该等共讯号支配细胞界速特性且对IL-2反应。UCB细胞之CD28活化导致了具有增加IL1、IFN-γ、I与TNA-β表现之Th1表型。在缺乏CD28之刺激下,细胞藉由产生IL-4及IFN-γ来对IL-12反应。CD8+细胞系绝对需要外生IL-4以发展为IL4/5生产者。UCB细胞之亚群,然而,系易受HIV-1感染。例如,HIV-1感染脐带血内肥大细胞且该等细胞可作为持续HIV储藏处(Bannert et al.,2001,J Virol.75:10808-14)。偶然未受拘束之造血细胞可表现CCR5(Rosu-Myles et al.,2000,Stem Cell.18:374-81)且特定为CXCR4(Loria et al.,2005,Cell Immuno.236:105-9)。CD8+T细胞可活体外系藉由倾向感染巨噬细胞(macrophage tropic)(嗜M型)HIV-1分离者而被有效地感染,但对倾向感染T细胞(嗜T型)HIV菌株具有抗性(Yang et al.,1998,J Exp Med.187:1139-44)。经活化UCB CD8细胞表现高程度之CD4、CCR5、及CXCR4且系为易受HIV-1感染所感染的。脐带血内CD16+细胞表现高程度之CCR5,且易受HIV-1感染的(Jaworowski et al.,2007,J Infect Dis.196:38-42)。最后,新生儿内自胸腺释放之T细胞具有经提升之CXCR4程度(Berkowitz et al.,1998,J Immunol.161:3702-10),解释了为什么感染新生儿之HIV-1发展病毒血症程度且AIDS进展迅速(Sundaravaradan et al.,2006,Proc Natl Acad Sci USA.103:11701-6)。
简言之,尽管大部分之UCB细胞单核球,包括CD34+细胞与CD8+细胞,其倾向对HIV感染具有抗性。HIV-1可感染UCB细胞亚群,包括肥大细胞。不成熟CD8+淋巴球对HIV-1具有抗性,但当细胞变成为已活化时,细胞表现CD4、CXCR4、及CCR5。因此,尽管UCB输液可藉由补充人们t细胞、灌输,且产生免疫细胞而有益于该具有AIDS之人们,但该等细胞系作为供HIV-1感染之标地。
非遗传性预防UCB细胞之HIV-1感染
数种疗法可给予UCB细胞暂时地对HIV-1之抗性。例如,结合CCR5之趋化激素可预防脐带血细胞之HIV-1感染。在1998年,Chalita-Eid,et al.(Chalita-Eid et al.,1998,AIDS Res Hum Retroviruses.14:1617-24)显示RANTES-IgG3融合蛋白质系一新生儿血球之HIV-1感染的潜在抑制剂。干扰素-β(IFN-β)增加自脐带血CD34+细胞所衍生之巨噬细胞的HIV-1抗性(Cremer et al.,2000,J Immunol.164:1582-7),与RANTES之上调控及经降低之CCR5表现有相互关系。干扰素-γ(IFN-γ)上调控在脐带血吞噬细胞内CCR5表现(Hariharan et al.,1999,Blood.93:1137-44),该干扰素-γ在脐带血单核球内降低CD4表现且抑制HIV复制(Creery et al.,2004,Clin ExpImmunol.137:156-65),藉由提升SDF-1与RANTES之表现。β趋化激素阻断HIV-1复制(Ketas et al.,2003,AIDS Res Hum Retroviruses,19:177-86)。对CCR5之自体免疫可保护UCB细胞来对抗HIV-1感染。在2008年,Lobo,et al.(Lobo et al.,2008,JImmunol.180:1780-91)报告了IgM抗淋巴球自身抗体自然地结合CD3、CD4、CCR5、及CXCR4,抑制T细胞活化与趋化作用,且保护细胞对抗HIV-1感染(Loboet al.,2008,J Immunol.180:1780-91)。Ditzel,et al.(Ditzel et al.,1998,Proc Natl AcadSci USA.95:5241-5)发现到在CKR5Δ32同型合子个体内CCR5受器作用如一同种异体抗原,且来自此类个体之血清的自身抗体竞争结合至CCR5受器的放射性标记RANTES。
自身抗体对于挑选CCR5+UBC细胞系可为有用的。诱导自身上体对抗CCR5之疫苗亦可降低恒河猴(macque monkeys)感染HIV-1感染率。一些研究者已改造RANTES以加强分子之抗病毒活动,同时减低或除止发炎特性(Vangelista et al.,2008,Vaccine.26:3008-15)。例如,Sun,et al.(Sun et al.,2008,J Birol Methods)使用与内质网(endocytoplasmic reticulum)序列(RANTES-KDEL)结合之CCR5配位基RANTES,且该CCR5配位基RANTES在保留一分子在内质网(endocytoplasmic reticulum)上以抓住CCR5受器蛋白质且降低受器之表面表现。相似方法据推测可被使用以相同配位基用于其它共受器。在2002年,发现RNA干扰系暗示了阻断CCR5表现以给予对AIDS之抵抗力的可能性。An,et al.(An et al.,2007 Proc Natl Acad Sci USA.104:1311-5)阐明siRNA之稳定表现,且该稳定表现藉由CD34+造血干/先趋细胞移植来抑制CCR5表现。Anderson,et al.(Anderson et al.,2007,Mol Ther.15:1182-8)研制出含有三个抗HIV基因之慢病毒载体(CCR5核糖酶、tat-rev siRNA及TAR诱饵)在SCID-hu由老鼠衍生之T细胞内。经转染的细胞被注射入SCID老鼠内,该等经转染细胞制造T细胞且该等T细胞系相对地对HIV-1感染具有抗性。白血病抑制因子(LIF)经由限制stat 3活化来抑制HIV-1复制。Tjernlund,et al.显示LIF于活体外及于人类器官外植内显著地抑制HIV-1复制。LIF活化Jak/Stat讯号路径。以重组人类LIF预治疗细胞系显著地减少HIV-1病毒颗粒知吸收。类似地,HIV-1复制可被TRIM5α siRNA限制(Pineda et al.,2007,Virology.363:310-8)。
预防UCB细胞之HIV-1感染的遗传方法
源自高加索欧洲人之脐带血的CCR5Δ32对偶基因之流行程度可高达10%。此流行程度呈现出上升的,因为CCR5Δ32对偶基因的研究暗示到CCR5Δ32对偶基因系仅存在于来中世纪波兰之5%DNA样品中,然而现今估计有10.26%(Zawicki etal.,2008,Infect Genet Evol.8:146-51)。推测上地,基因的流行程度系已升高,因为选择优势给予个体之基因载剂,且该等个体不具有该基因。一方法系为收集脐带血单元,该等单元拥有CCR5Δ32对偶基因且增加该等单元以使得其等可被使用于治疗更多人。CKR5Δ32突变不是唯一对HIV感染之基因抗性来源。非洲幼儿表现CCL3(MIP1-α)之多重基因拷贝且对HIV感染具有较小的易感染性(Kuhn et al.,2007,Aids.21:1753-61)。CCL3L1之拷贝数目系与对HIV-1之减少的易感染性相关(Bugejaet al.,2004,Aids.18:1069-71及Gonzales et al.,2005,Science.307:1434-40)。来自由经HIV-1感染母亲所生下之未受感染幼儿的周边血白血球的分析指出,未经感染婴儿具有高比例之CXCR4表现细胞且几乎没有CCR5表现细胞(Shalekoff et al.,2004,Clin Diagn Lab Immunol.11:229-34)。编码CCLL1-CCR5基因型之基因的不同系与经细胞媒介改变的对HIV-AIDS免疫力相关(Dolan et al.,2007,Nat Immunol.8:1324-36)。其它影响HIV易感染性基因(Arenzana-Seisdedos et al.,2006,Semin Immunol.18:387-403)包括CCR2、CX3CR1、MIP-1α、MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5及SDF-1/CXCL12基因。Yoshina,et al.(Yoshida et al.,2008,Traffic.9:540-58)显示到CD63之N端删除(亦即,CD63δN)藉由压抑CXCR4表面表现来阻断HIV-1进入。CCR5基因之击毁或删除可具有不欲求之副作用。CCR5趋化激素受器调控白血球之趋化作用且在免疫方法(Tian et al.,2008,Cell Signal.20:1179-89),以及血管生成(Wuet al.,2008.J Immunol.181:638-93)中占有重要的角色。CCR5之删除或突变可影响脐带血细胞之施行免疫功能之能力。例如,CCL2L1-CCR5基因型影响在经HIV-1感染个体之抗反转录病毒疗法的期间免疫回复之续久性。CCR5之改变亦可增加自体免疫疾症之风险。例如,CCR5之多型性系与自体免疫疾症相关,该等疾症系诸如全身性红斑狼疮(Mamtani et al.,2008,Ann Rheum Dis.67:1067-83)。最后,些许HIV-1病毒不使用CCR5以进入细胞且阻断CCR5表现并无法提供完整的保护。基因型算法系可获得以确定HIV-1向性以预测共受器拮抗作用之成功性(Soulie et al.,2008,HIV Med.9:1-5)。CKR5Δ32或CCR5Δ32突变系可只不过为显性抑制的(dominantnegative)。在表面表现之前CCR5受器蛋白质必须藉由内质网被处理且被磷酸化且多聚化之一事系被发现(Benkirane et al.,1997,J Biol Chem.272:30603-6)。突变株CCR5Δ32可与CCR5形成错合物但不可被磷酸化。在没有磷酸化下,杂错合物不可被表现在细胞表面上,因此减少比预期自非工作受器蛋白质之简单异质结合表现还多之CCR5表现。然而,更多有效或有用之压抑CCR5表现之方法系已为可获得的且将于下叙述。
基因抑制方法
许多方法系可获得以压抑CCR5表现。在2000年,Cagnon与Rossi(Cagnon etal.,2000,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.10:251-61)发展出一锤头型核醣酶且该锤头型核醣酶在细胞内瞄准CCR5 mRNA与下调控CCR5表现,使用腺病毒聚合酶以表现细胞内之转录与显示出70%之经下调控之CCR5表现。在2000年,Bai,et a;.(Bai et al.,2000,Mol Ther.1:244-54)使用反转录病毒以转染抗CCR5核醣酶(R5Rbz)至CD34+细胞且显示出自该等经转染细胞所分化之巨噬细胞抵抗HIV-1感染。Bai,etal.(Bai et al.,2001,AIDS Res Hum Retroviruses.17:385-99)接续地建构抗CCR5核醣酶异二聚体,该抗CCR5核醣酶异二聚体瞄准CCR5 mRNA内之三个裂解处,显示出经抑制之CCR5表面表现与70%减少的HIV-1感染。然而,许多方法系被RNA干扰所取代。HIV-1特异性RNAi疗法,亦即,短抑制RNA(siRNA)与短发夹型RNA(shRNA)系减少CCR5(Boden et al.,2004,Curr Opin Mol Ther.6:373-80)与CXCR4(Zhou et al.,2004,Gene Ther.11:1703-12)表现之非常有效的方法。在2002年,Martinez,et al.(Martinez et al.,2002,Aids,16:2385-90)显示了siRNA瞄准了选择性停止共受器之细胞表面表现而没有影响彼此或CD4表现的CXCR4与CCR5。Novina,et al.(Novina et al.,2002,Nat Med.8:681-6)报告成功地压抑CD4表现、病毒结构Gag蛋白质或Nef调控蛋白质。Anderson与Akkina(Anderson et al.,2007,MolTher.15:1182-8)显示了经慢病毒载体表现之siRNA击毁CCR5且保护基因转殖巨噬细胞抵抗HIV-1感染。Anderson,et al.(Anderson et al.,2003,Oligonucleotides.13:303-12)使用双特异性siRNA瞄准CD4、CXCR、及CCR5。Tamhana与Akkina(Tamhana et al.,2008,AIDS Res Ther.5:16)使用睡美人(Sleeping Beauty)转位子系统以传送CCR5与CXCR4 siRNA、红色荧光蛋白质(RFP)报告子,以及可选择药物抗新霉素基因,使用过活性转位酶(HSB5)以传送质体至细胞内表现CD4、CXCR、及CCR5。此关闭细胞内CCR5与CXCR4表面表现。Kumar,et al.(Kumar et al.,2008,Cell.134:577-86)使用T细胞特异性siRNA对抗CCR5,显示了抗CCR5与抗病毒siRNAs与和寡-9-精胺酸胜肽(scfvCD7-9R)共轭之T细胞CD7特异性单链抗体错合且可对T细胞有特异性,控制病毒复制、且预防与疾症相关之CD4T细胞损失。Bhattacharyya,et al.(Bhattacharyya et al.,2008,Scand J Immunol.67:345-53)发现到CCR5特异性siRNA减少70%之海生巨噬细胞中的利什曼病的寄生负担。Poluri与Sutton(Poluri et al.,2008,Mol Ther.16:378-86)显示了编码有对抗CCR5之短发夹RNA(shRNA)的基因转移载体减少了>30倍之细胞内病毒效价。RNA干扰可被针对除了CCR5或CXCR4之外的基因。Lim,et al.(Lim et al.,2008,Mol Ther.16:565-70)使用siRNA对抗HIV-1之5’-长端重复(5’LTR)启动子且压抑二个表现CD4、CXCR、及CCR5之不同细胞系的大量感染。Harmon与Ratner(Harmon et al.,2008,JVirol与Harmon et al.,2008,J Virol.82:9191-205)显示了诱发Galpha(q)讯号级联对于病毒进入与Galpha抑制剂是必须的,若否,则siRNA将阻断病毒进入。Chen,et al.(Chen et al.,2008,Virology/379:191-6)显示了CD63在HIV复制与巨噬细胞及细胞系感染上占有重要的角色且siRNA对抗CD63将预防上述两者。最后,Tian,et al.(Tian et al,2008,Cell Signal.20:1179-89)瞄准了对抗造血特异性G(16)及G(14)之siRNA,G(16)及G(14)连接经G(i)耦合受器CCR1、CCR2a、CCR2b、CCR3、CCR5、及CCR7。此可减少多重受器之表现。最后,siRNA可被针对来对抗CCR4启动子(Giri et al.,2005,Am J Physiol Cell Physiol.289:C264-76)。
重组抗病毒基因疗法
重组基因疗法瞄准HIV-1进入与复制的多重机制。在2003年,Akkina,et al(Akkina et al.,2003,Anticancer Res.23:1997-2005)提出了同时使用siRNA对抗病毒包封蛋白质tat与rev、抗CCR5核醣体、及RNA(TAR)诱饵。针对病毒包封RNA,诸如rev与tat之RNAi,压抑病毒复制(Akkina et al.,2003,Anticancer Res.23:1997-2005)。TAR诱饵适体系核仁定位诱饵,该诱饵结合且隔绝HIV Tat蛋白质但不以正常胸腺细胞生成过程(thymopoiesis)(Banerjea et al.,2004,AIDS Res Ther.1:2)。使用表现经PolIII促进之抗HIV RNA与抗CCR5核醣体之慢病毒载体,Li,et al.(Li et al.,2003,Mol Ther,8:196-206)显示了此组合物有效地保护对抗HIV-1感染。
在2004年,Banerjea,et al.(Banerjea et al.,2004,AIDS Res Ther.1:2)使用TAR诱饵与CCR5核醣体之慢病毒转岛入CD34+原始细胞以生成HIV-1抗性T细胞与巨噬细胞(acrophage)。在2006年,Li,et al.(Li et al.,2006,Ann N Y Acad Sci.1082:172-9)使用多重RNAi与CCR5核醣体及TAR诱饵结合以治疗造血细胞之HIV感染。在2007年,Anderson,et al.(Anderson et al.,2007,Mol Ther.15:1182-8)使用含有三个抗HIV基因或三元-R(抗CCR5核醣体、rar-rev siRNA及TAR诱饵)之慢病毒载体以制造表型正常T细胞,且该等T细胞有效地对抗HIV-1感染。Morris,et al.(Morris etal.,2005,RNA Biol.2:17-20)测试了瞄准HIV-1 gag、vif、tat、rev及主CD4与CCR5之多重siRNA,发现到HIV-1之序列差异严重地限制抗病毒siRNA之使用。慢病毒载体系普遍用于转导基因至细胞,因为该慢病毒载体以高效率感染未分裂细胞且传递多重基因(Banerjea et al.,2004,AIDS Res Ther.1:2)。Qin,et al.(Qin et al.,2003,ProcNatl Acad Sci USA.100:183-8)显示了慢病毒可以CCR5 siRNA例行地转染超过40%之周边T淋巴球,且慢病毒降低超过10倍之CCR5表现且降低3-7倍之经感染细胞数目。Song,et al.(Song et al.,2003,J virol.77:7174-81)显示了来自siRNA之基因静默系在未分裂细胞内,诸如巨噬细胞,持续超过15天。
药物组合物之发展瞄准HIV反转录酶及蛋白酶酵素且该发展革命化HIV/AIDS之治疗,但以试剂,诸如病毒逃脱突变剂(Ray et al.,2007,J Virol.81:3240-50及Shafer et al.,2008,AIDS Rev.10:67-84)、反复出现之病毒储藏处、顺从复杂药物疗法、及毒性副作用之问题系限制此等药物对于病人之有用性。除了CD4、CCR5与CXCR4受器阻断,一种药抗HIV治疗之类别阻断基因融合包膜醣蛋白gp120之作用(Liu et al.,2008,J Mol Model.14:857-70;Plat et al.,2007,J Mol Biol.374:64-79;与Shafer et al.,2008,AIDS Rev.10:67-84)与gp41(Jacobs et al.,2008,Vaccine.26:3026-35;Sougrat et al.,2007,PLoS Pathog.3:e63;与Zahn et al.,2008,Gene Ther.15:1210-22),包括融合抑制子T20(恩夫韦地(enfurvirtide)),其系有用于预防巨噬细胞之HIV-1感染(Yi et al.,2008,J Acquir Immune Defic Syndr.47:285-92)与阻断HIV感染兰格罕细胞(langerhans cells)与T细胞之C34。如图4所示,多重药物可被使用于干扰细胞内病毒感染与复制。多重药物包括阻断受器(CD4、CXCR4与CCR5)之药物、基因融合醣蛋白(gp41、gp120)、病毒包膜蛋白质(tat、rev)、与核醣酶以及阻断细胞膜上CCR5与CXCR4受器复制之siRNA。在该等药物中,预防病毒进入者系可能为最佳的。一旦该等细胞进入细胞,预防病毒复制可减缓感染散布,但无法预防该等细胞成为病毒储藏处。然而,在植入之前以结合抗病毒治疗病人系可为重要的。
下列欲被解释之特定范例系仅为阐明,且无论以任何方式系不受限于内容之其余者。
不进一步详尽阐述,相信此项技艺之熟悉此技艺者,基于此处描述,将本发明应用至其极致。
材料与方法
我方建议下列制备HIV-1抗性脐带血细胞之方法,验证该等细胞植入免疫缺乏老鼠之能力,且接着进入具有AIDS之孩童与成人的临床试验。
转染.此方法应用Amaxa(http://www.amaxa.com)核靶电穿孔法,以超感染(superfect)与脂感染胺(lipofectamine)阳离子脂质质体(http://www.invitrogen.com)来插入下列基因至脐带血单核细胞内;对抗CCR5与CXCR5之siRNAs、GFP(绿色荧光蛋白质)、及PGK(磷酸甘油酸激酶)新霉素抗性基因。GFP作为诚供基因转移之标剂,同时新霉素在锂存在下允许我方挑选经转染之细胞,锂促使脐带血单核细胞(CBMC)之增殖。
验证.在转染细胞之后,验证数代之经转染的CBMC细胞植入且没有表现CCR5与CXCR5共受器。该等细胞系接着被转植入免疫缺乏老鼠内以说明经转染细胞植入至骨随内且生成血球,包括嗜中性球与淋巴球。之后,该等细胞系被测试其等在活体外对HIV-1感染之抗性。一旦确认后,下列临床试验系接着被处理。
自体衍生之脐带血输液之临床试验.脐带血样本系自孩童收集且该等孩童系自经HIV-1感染之母亲所生出。若该等孩童显示有感染HIV之证据,则单核细胞系亦自脐带血分离出,且以上述方式转染该等细胞,且接着将经改良细胞输液至孩童中。在移植后数次中,血液样本系被收集以确定是否植入已发生(亦即,血球之存在表现出绿色荧光蛋白质)。病毒载量系接着被确定,特别是在经移植之GFP表现细胞。第一终点为植入,制备HIV-1抗性免疫细胞,以及免疫功能之回复。第二终点为个体内AID之时间过程。
异种脐带血输液之临床试验.在不具有脐带血被收集之婴儿中,我方转染HLA配对相合之脐带血单元与对抗CCR5及CXCR4之siRNA,且移植此等细胞入具有HIV-1感染之婴儿内。再此地,此试验之第一终点为是否经转染之细胞已植入,且产生HIV-1抗性细胞而没有移植物对抗宿主疾病。第一终点为为个体内AIDS之时间过程。被预期AIDS之症状将随着更多且更多藉由移植造血细胞之细胞产生而被减缓。将有AIDS之复发是有可能的,如细胞之连续子代产生较少对抗CCR5与CXCR4之siRNA。上述各者将于下有更详尽的讨论。
范例1转染
非病毒方法戏被使用于转染且在人类脐带血单核细胞内过度表现四个基因:用于CCR5与CXCR4之siRNA、GFP、及新霉素抗性基因。在转染细胞之后,转染率系藉由表现GFP之细胞百分率与使用新霉素抗性基因以挑选经转染细胞所验证。产生之细胞应全部表现GFP但在其等表面部没有表现CCR5与CXCR4(藉由免疫组织化学)。
原理的阐述。CCR5系主要供HIV-1进入淋巴球用之受器,同时CXCR4siRNA应降低或预防CXCR4在单核球或巨噬细胞上表现。GFP基因表现GFP蛋白质且允许细胞被侦测。新霉素抗性基因允许我方使用新霉素来挑选且纯化经感染之细胞。使用转染细胞之非病毒电穿孔方法减小提供细胞安全性之负担。在我方经验中,AMAXA店穿孔方法系已非常有效的,允许转染超过80%之具有GFP基因的细胞。使用非病毒方法以转染细胞应增加安全性与表明细胞安全性之负担。因为电穿孔法部对基因体产生永久改变,所以肿瘤或其它问题的可能性系低的。类似地,因为细胞仅停止数代表现CCR5与CXCR4,所以应无法妥协使细胞免疫与干细胞长期作用但够长以允许保护对抗HIV-1。
预期结果。我方可应输入其它基因以完全压抑CCR5与CXCR4表面表现且用于长时间期间。为了实行后者,我方可应采用反转录病毒或慢病毒方法来插入基因至基因体内。被预期到的是细胞被转染且表现GFP。
范例2验证
在范例中,分析方法系被进行以验证经转染细胞植入在免疫缺乏动物内且持续数代几乎没有或不具有CCR5与CXCR4表现。分析方法亦系被进行以将人类CBMC植入至免疫缺乏老鼠(NOD/SCID/IL2Rγ缺陷型老鼠)内且以辐射线照射以伤害该等老鼠之骨髓。实验目的为显是细胞植入与产生HIV抗性细胞。
原理的阐述。实验目的系为显示经转染细胞系仍可做用如一造血细胞,产生免疫细胞。预期到的是源自CFUs(群落形成单位)之转染细胞。为了如此,我方移植人类细胞至免疫缺乏老鼠内。该等老鼠正常地接受人类脐带血单核细胞移植而没有骨髓肃清(myeloablation)(Watanabe et al.,2007,Blood.109:212-8)。
注意到猴子实验在此处可没有帮助。例如,为了取得人类细胞以殖入猴子内,我方将必须使用免疫压抑,诸如环孢霉素或FK506,其等将干扰细胞植入与藉由植入细胞所产生之细胞的免疫功能(Gardner et al.,1998,Exo Hematol.26:991-9)。
预期结果。被预期到的是,经转染细胞系被植入于免疫压抑之动物内。
范例3自体衍生之脐带血移植的临床试验
第一群组被测试之病患系自经HIV感染之母亲所生出的孩童,特别是具有高病毒载量者。脐带血系在出生时间所被收集。若孩童发展出HIV感染之证据,则脐带血细胞之单元系以具有对抗CCR5与CXCR4之siRNA、GFP及新霉素抗性基因所转染。
原理的阐述。尽管HIV没有经常穿过胎盘屏障(Roger et al.,1986,ObstetGynecol.68:2S-6S)且仅有2.7-4%之来自经HIV感染之母亲的脐带血系血清反应阳性的(Lester et al.,1992,West J Med.156:371-5;Nicolas et al.,1994,Arch Pediatr AdolescMed.148:813-9与Sperling et al.,1989,Obstet Gynecol.73:179-81)且剩余者系血清反应阴性的。经HIV感染之母亲的孩童具有高风险会成为被感染者(Pedersen et al.,2007,PLoS ONE.2:e838),特别系当母亲具有高病毒载量时。脐带血淋巴球对HIV-1系没有特别敏感(Krogstad et al.,1994,AIDS Res Hum Retroviruses.10:143-7)且以抗病毒治疗母亲可避免将此疾症传递给其等婴儿(Ripamonti et al.,2007,Aids.21:2409-15)。再者,该等孩童之脐带血应可有用于治疗在出生后被感染者。因为脐带血是自体衍生的,该等脐带血系应配对相合。我方将以CCR5与CXCR4siRNA、GFP与新霉素抗性基因转染细胞,且接着将血液输液回孩童,追踪孩童以观察是否细胞植入且输液具有者于该等细胞之免疫功能上造成何种影响以及AIDS过程。试验将告诉我方是否经移植细胞植入且是否对HIV免疫。
预期结果。我方预期取得脐带血以植入且产生数代之HIV免疫细胞。经与抗病毒疗法结合,将导致些许孩童之治愈。我方亦预期发现暂时改善与病毒复发于些许孩童中。风险是低的且效益系潜在重大的。
范例4在异种HLA配对相合之脐带血移植中的临床试验
我方接着确定是否HLA配对相合之脐带血的CRR5与CXCR4 siRNA转染单元可被移植至经HIV感染孩童以及是否该等单元是有效益的。此试验集中于具有HIV感染之孩童且该等孩童变成为折射媒介以结合抗病毒药物且呈现免疫妥协之证据。
原理的阐述。若CCR5与CXCR4 siRNA转染异质HLA配对详合脐带血单元系对HIV-1具有抗性且改良经HIV-1感染之孩童的免疫状态,此将扩张对孩童之治疗方法且该等孩童未在出生时收集脐带血。大多数该等孩童系被推测为年纪较大的孩童且系其等抗病毒疗法失败边缘。此等病人几乎没有其它药物可采用。该等病人之免疫系统系应衰退且HLA配对相合脐带血应改良其等免疫功能。第一结果衡量系植入细胞之后代出现。若有任何的HLA错配,则此错配可被使用于鉴定来自宿主之植入细胞。
预期结果。以HIV-1抗性脐带血治疗,特别在可为CNS症状之病人中,系不可能消除自所有潜在储藏处之病毒。就另一方面而言,治疗应恢复免疫系统至某种程度且因此对病人产生效益。治疗在个体中系可更有效的,该个体在HIV感染后仍系相较早期且必须没有在许多其它处具有HIV感染。在1995年,Ho,et al.(Ho et al.,1995,Stem Cells.13 Suppl 3:100-5)解释了自胎盘之CD34+细胞之高效转导与藉由含有核醣酶基因之反转录病毒的脐带血,其等使单核球对HIV-1感染具有抗性。核醣酶系非如siRNA或CCR5基因般有效。Battacharya,et al.(Battacharya et al.,2006,Clin Exp Obstet Gynecol.33:117-21)系以新鲜脐带血治疗123个HIV阳型病人,该等病人具有贫血与消瘦,发现输液显著地减少疲倦与改良病人之精力程度,以及如安宁感与增重。因为没有配对相合,此等有效益的影响系推测为脐带血细胞之直接影响。
讨论
我方建议以三阶段进行下列研究。在第一阶段,我方集中在插入CCR5与CXCR4 siRNA、GFP与NRG至新生老鼠与血单核细胞内。我方目标系制备HIV抗性细胞且该等细胞系植入且制造群落形成造血细胞。
第二阶段,我方研究在免疫缺乏鼠类与老鼠内之细胞影响,以观察是否基因改造细胞植入且在动物内产生免疫细胞且恢复免疫功能。
第三阶段,我方实行二个临床试验。一试验集中在于出生时收集的自体衍生脐带血单元,处理为抗HIV,且将该等单元输液回经HIV感染母亲的婴儿。另一为评估异质脐带血单元系基因改造以抵抗HIV感染。脐带血系已成功地治疗具有广泛不同造血异常、包括白血病、贫血、自体免疫及免疫缺乏症候群之人类。藉由恢复免疫功能,脐带血细胞应对具有AIDS之病人有益。然而,HIV-1将感染移植细胞,除非完成某事以使该等细胞具有免疫力对抗HIV。在过去十年里,CCR5与CXCR4受器系显示为对大多数HIV-1病毒所需以进入细胞的共受器。许多研究者已展示出藉由不同方法来阻断该等共受器,包括预防共受器之表面表现,可使细胞对HIV-1感染具有抗性。
我方使用下列方法以增加脐带血细胞对HIV-1感染脂抗性。我方自脐带血单元分离单核细胞,使用以DNAase之Ficoll梯度,且接着使用电穿孔法(Amaxa)以在单核细胞内输入siRNA来阻断CCR5与CXCR4基因。除此之外,我方包括绿色荧光TV以及新霉素抗性基因(NRG)以鉴定且纯化细胞,该等细胞系已被成功转染。在验证经转染细胞为抗HIV-1且生产群落形成造血单元之后,我方确定细胞是否植入且在免疫缺乏动物内是否恢复免疫功能,且接着在由具有HIV感染之母亲所生出的婴儿之临床试验里该等抗HIV-1细胞系被测试。
临床测试集中在植入GFP表现免疫细胞之造血的第一终点与减少AIDS症状且减少在HIV-1感染婴儿内病毒负担的第二终点。若细胞植入且生产细胞且该等细胞对HIV-1感染具有抗性,则此应改正免疫缺乏且减少感染细胞之群体。在婴儿中,我方测试初始同体衍生脐带血且接着异种HLA-配对相合血液。结果系被预期为展现出同体衍生与异种HLA-配对相合细胞皆植入,产生造血细胞、且没有造成严重移植物对抗宿主疾病。最后,试验将建立方法之可实行性且决定植入同体衍生与异种HLA-配对相合脐带血细胞以治疗具有AIDS之婴儿与成人的功效。
选择性基因压抑方法
电穿孔法以输入CCR5与CXCR4siRNA基因系可不产生足够之siRNA表现以根绝HIV-1感染,因为该等基因可无法施行许多世代。就另一方面言之,暂时性压抑细胞内CCR5与CXCR4表现之非病毒方法可有效于减少HIV-1感染且改良病人之免疫功能。永久压抑此等二种重要趋化激素受器系亦可具有细胞免疫功能之有害影响。
Tamhane,et al.(Tamhane et al.,2008,AIDS Res Ther.5:16)之近期研究报告了非病毒睡美人转为子系统之成功使用,系用于输入CCR5与CXCR4 siRNA。尽管慢病毒载体系已被成功使用于转为CCR5与CXCR4 siRNA基因,SBT系统产生CCR5与CXCR4 siRNA之稳定基因转移,造成显著地MAGI-CCR5与MAGI-CXCR4细胞系之病毒抗性。此方法系有吸引力的因为其不使用病毒插入至基因。若上述没有成功,则反转录病毒或慢病毒可被使用于相同目的。许多研究者已使用该等病毒于基因改造与输入siRNA至细胞内。
临床试验考虑
细胞植入与令人满意的造血系自血液内GFP表现细胞之存在与在免疫缺乏老鼠内且接着在人类内之免疫功能恢复来进行评估。注意到此概念之检验系可以数个个体所达成。安全性的阐明,然而,将需要更多个体。我方因此计划在异种移植试验里测试约10位病人。若脐带血植入且病人恢复免疫系统以及病毒存再减少或消失,此将意指治疗是成功的。我方预期植入发生而没有骨髓摧毁。
以自体衍生移植之移植物对抗宿主疾病(GVHD)的可能性系低的。然而,以异种移植可发生GVHD。若GVHD发生,我方将理所当然治疗病人,如同我方会以醣类皮质激素与抗发炎药物一般地治疗病人。然而,注意到GVHD之存在会暗示到植入细胞系可免疫反应。我方亦会能够追踪由植入细胞所产生之细胞数目,若有任何的HLA错配。细胞之第一少数世代应为GFP阳性。建议之疗法对幼儿几乎没有引起或没有引起风险,且该幼儿系经HIV感染,若没有骨髓摧毁化学疗法系被使用,则脐带血系被简单输液,且个体血液测试品系自中央静脉管被获得且该等测试品系被适用于细胞融合以及治疗前与治疗后之血液样品。因为式彦集中在年轻婴儿与孩童,其代血液单元内细胞剂量系足以产生令人满意的细胞植入。自体衍生血液输液,特定地,应对病人几乎没有引起或没有引起危险。预先警告将被进行在试验中处理或分析来自AIDS病人之血液样本。为了测试基因改变细胞之HIV-1可感染性,我方将细胞寄送至装备处理HIV感染之实验室。
类似地,所有来自具有AIDS病人之样本系在设备中分析,该等设备系合适地配备以处理经HIV-1感染之样本。除了血液测试外,与感染性材料接触将被严格限制。例如,自经HIV感染母亲所生出之婴儿的脐带血的过程将必须在特殊配备用于HIV-1研究之设备下被完成。
其它实施例
于本说明书内揭露之所有特征可与任何组合结合。于本说明书内揭露之各特征可藉由选择性特征所替代,该选择性特征系用作为相同、相等或相似的目的。因此,除非另外指明,揭露之各特征系仅为相等或相似特征之总称系列的范例。自上述说明,一熟悉此技艺者可轻易确认本发明之基本特征且不背离其精神与范围,可完成本发明之不同变化与改造以使本发明适用于不同用法及情况。因此,其它实施例亦系在下列申请专利范围之范围内。
Claims (9)
1.一种用于治疗一具有或有风险具有HIV感染之人类个体的方法,其特征在于,该方法包含:
获得含有一抑制CCR5表现之第一RNAi试剂与一抑制CXCR4表现之第二RNAi试剂的人类脐带血细胞;
将一有效量之脐带血细胞投药于需要其之人类个体。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,该个体为一由具有HIV感染之母亲所生出的婴儿。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,该脐带血细胞对于该个体系自体衍生的。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,该脐带血细胞系藉由一过程所获得,该过程包含将(1)该第一RNAi试剂或一编码该第一RNAi试剂之第一核酸以及(2)该第二RNAi试剂或一编码该第二RNAi试剂之第二核酸短暂转移至细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,该过程进一步包含:
将一重组核酸引入至该等细胞,该重组核酸编码一可选择性标记蛋白质;且
增加表现该可选择性标记蛋白质之细胞。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,脐带血细胞进一步含有一第三RNAi试剂,且该第三RNAi试剂抑制选自于由下列所构成的群组之基因的表现:CD4、HIV-1 gag、HIV-1 vif、HIV-1 tat及HIV-1 rev。
7.一种经分离之人类脐带血细胞,其特征在于,其含有一抑制CCR5表现之第一RNAi试剂以及一抑制CXCR4表现之第二RNAi试剂。
8.一种用于治疗一具有或有风险具有HIV感染之人类个体的方法,其特征在于,该方法包含:
获得一人类干细胞,该人类干细胞含有抑制CCR5表现之第一RNAi试剂与一抑制CXCR4表现之第二RNAi试剂;
将一有效量之干细胞投药于需要其之人类个体。
9.一种经分离之人类干细胞,其特征在于,其含有一抑制CCR5表现之第一RNAi试剂以及一抑制CXCR4表现之第二RNAi试剂。
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