JP5727458B2 - 改変間葉系幹細胞及びそれを使用した腫瘍の治療方法 - Google Patents
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Description
−(i)(ii)に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、(ii)炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
−間葉系幹細胞又はCD34-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞に関する。
本願において使用する特定の用語は、以下に定める意味を有するものとする。
本発明は、腫瘍に罹患した対象の治療方法を提供し、これは、対象の血流中に治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞を導入するステップを含み、ここで各遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、(i)(ii)に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、(ii)プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
1.インビトロ選択:抗生物質耐性遺伝子(例えばピューロマイシン耐性遺伝子)などの選択マーカー遺伝子又は磁気ビーズ分離に好適な表面マーカー遺伝子(例えばCD34)に連結された細胞由来又はウイルス由来の構成的プロモーター(例えばCAGプロモーター)
2.バイスタンダー死:細胞傷害性タンパク質コード領域(例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼをコードする)に連結された細胞由来又はウイルス由来の誘導性腫瘍特異的プロモーター(例えばRANTESプロモーター)
である。
− (i)(ii)に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、(ii)炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
− 間葉系幹細胞又はCD34-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞を用いて生成することができる。
概要
目的:膵腫瘍間質を対象とした改変間葉系幹細胞に基づく治療法の効力を分析すること。
間葉系幹細胞
記載されるとおりのp53標的欠失ホモ接合体のC57BL/6マウスの骨髄から間葉系幹細胞を単離した15。細胞を細胞培養において付着性で且つ連続的に増殖させた。サブクローニング後、単細胞クローンを選択し、特性決定した15。細胞に、CCL5プロモーターと連結した赤色蛍光タンパク質(RFP)、緑色蛍光タンパク質(eGFP)又はHSVチミジンキナーゼをトランスフェクトした。プロモーターの配列は、上流領域の−972及び全5’非翻訳領域を使用した18。加えて、全てのベクターが、CMVにより制御されるBsr2ブラストサイジン耐性遺伝子を含んだ。ブラストサイジンは、5μg/mlの濃度でトランスフェクト細胞を選択するために使用した。マウスに注入する前に、細胞は培養フラスコから剥離し、PBSで2回洗浄し、PBS中に再懸濁した。
変法ボイデンチャンバーアッセイを用いてインビトロでの特異的MSC遊走を実施した15。幹細胞は、Panc02同系膵癌細胞の上清濃度の減少に対して遊走させた。
Jackson研究所からC57BL6マウスを入手した。全ての動物実験は、バイエルン州の動物の権利に関する委員会から然るべき許可を得て行った。平均体重約20gの2ヶ月齢〜3ヶ月齢のC57BL/6マウスをPanc02(C57BL/6マウスと同系の)膵腫瘍の移植に使用した19。ケタミン(体重1kg当たり100mg)、キシラジン(体重1kg当たり5mg)及びアトロピンを使用してマウスを麻酔した。マウスの左側腹部における手術部位を無菌の方法で剃毛して準備した。左側腹部を1cm切開し、膵臓を露出させた。目盛り付き押しボタンデバイス(Hamilton Syringe Company、米国)及び30G針の1mlシリンジ(双方ともBD Biosciences、スペイン)を使用して、40μlのPBS溶液中の150,000個のPanc02膵癌細胞を膵臓に注入した。膵癌細胞が腹膜内に播種されないことを確実にするよう注意を払った。そのため、膵臓から針を抜いた後、Q−tipを注入部位に1分間軽く押し当てた。腫瘍細胞の注入後、4−0 prolene(Braun AG、独国)の結節縫合により腹膜及び皮膚を閉じた。この手技の2週間後、全てのマウスで触知可能な腫瘍が成長し、マウスをそれぞれの実験群に無作為に割り付けた。A群は幹細胞又はガンシクロビルの注入を受けず、B群は未修飾の幹細胞を投与され、C群はC57BL/6 p53−/− CCL5/HSV−tk+間葉系幹細胞及びGCV注入を受け、D群はC57BL/6 p53−/− CCL5/RFP+間葉系幹細胞を投与され、及びE群はC57BL/6 p53−/− CCL5/eGFP間葉系幹細胞を投与された。全ての幹細胞注入は0.5×106細胞/週の用量とし、尾静脈から投与した。C群のGCV(Cymeven(登録商標)、Roche、独国)の注入は、幹細胞注入後5〜7日目に1.5mgの用量で腹腔内に適用した。3サイクルの処置を経た後に全てのマウスを屠殺し、腫瘍を単離して計量した。統計的有意性の検定は、独立した試料に対する独立両側t検定により達成した。
膵腫瘍の組織試料をTissue−Tek O.C.T.(Miles Inc.米国)に包埋し、液体窒素でスナップ凍結した。5μm厚の低温切片を得た。DAPI核染色溶液(Vectashield「Hard set Dapi封入剤」、米国)を切片に加え、GFP又はRFP蛍光シグナルについて直ちに評価した。AxioCam MR顕微鏡カメラを使用して写真を撮り、ソフトウェアPhotoshop(登録商標)(Adobe、米国)を使用して種々の蛍光チャネルの画像を重ね合わせた。
注入前、細胞を計数し、1×106細胞/mlPBSの最終濃度に希釈した。ガンシクロビル(GCV)(Cymeven;Roche)をH2O(注射用水(aqua ad iniectabilia))中に溶解し、10mg/mlの濃度とした。細胞懸濁液を26G針で尾静脈から投与し、薬物を腹腔内注入により投与した。処置は、1日目に0.5ml細胞(500,000個の細胞)を注入して開始した。5〜7日目、ガンシクロビルを60μg/g体重の1日用量で、例えば体重25gのマウスについて150μlを適用した。7日目より後は、解剖まで処置サイクルを反復した。処置中は腫瘍の進行及び挙動を記録した。
解剖後、全ての腫瘍を個別に調製した。各腫瘍の3分の1をホルムアルデヒド固定してパラフィンワックスに包埋し、一方、別の3分の1をフラッシュ凍結した。残りの3分の1は、後にRNA単離及び目的とするqRT−PCR分析を行うため、製造者の指示に従いRNAlater溶液(Ambion)中に保存した。
5μm切片に対し、先述のとおり免疫組織化学を実施した20。一次抗体としては、ポリクローナルウサギ抗RFP抗体(株式会社医学生物学研究所、日本)をブロッキング溶液(乳+superblock)中に1:50希釈した。二次抗体としては、ポリクローナルビオチン化ヤギ抗ウサギ(Linaris、Wertheim−Bettingen、独国)抗体を乳中に1:300希釈した。
MSCの膵腫瘍への動員
C57Bl/6マウスのバックグラウンドにおいて同系同所性マウス膵腫瘍を予め確立した31、32。膵被膜下に移植した腫瘍細胞は成長し、深在性腫瘍血管系(図1)を示した。P53(−/−)の骨髄から単離したCD34- MSCを使用して、改変MSCの腫瘍間質を標的化する効力を評価した15、16、2l。
本発明者らは、次に、CCL5プロモーターを使用した腫瘍間質へのMSC動員との関連において、レポーター遺伝子のさらに制御された発現を駆動する可能性について調査した。これを目的として、P53(−/−)MSC C57/Bl6細胞系をCCL5プロモーターの制御下でRFP及びeGFPレポーター遺伝子により改変した18、22。CCL5プロモーターは、概して組織ストレス又は傷害との関連における種々の組織型で活性である23〜27。翻訳開始点に対する直近の−972上流のヌクレオチド及び完全5’非翻訳領域を、ベクターにおけるeGFP又はRFPの上流にクローニングした。
次の実験フェーズにおいて、CCL5プロモーターを使用した治療遺伝子の送達を調べた。これを目的として、単純ヘルペスチミジンキナーゼの遺伝子(HSV−Tk)28をCCL5プロモーターの後ろにクローニングした(図5A)。
間葉系幹細胞は腫瘍間質に能動的に動員され、そこで腫瘍増殖の種々の側面に寄与する。MSCは腫瘍血管の前駆細胞として機能し得るとともに、間質線維芽細胞様細胞の生成にも寄与するものと思われる。腫瘍関連間質細胞の腫瘍増殖に対する及び転移可能性に対する固有の影響は、最近の研究の課題である。乳癌モデルの前臨床試験では、腫瘍間質内の間葉系幹細胞(MSC)が高レベルのサイトカインCCL5を産生することが示された。CCL5の分泌は、肺転移の発生率上昇をもたらす。
遺伝子修飾されたヒトMSCの生成
ヒトMSCを、RANTESプロモーターの制御下にあるHSV tk遺伝子及びSV40プロモーターの制御下にあるブラストサイジン耐性遺伝子を含むベクターpLenti6 TK RANTESを有する複製欠損レンチウイルスと共に一晩インキュベートした(感染多重度(MOI):10)(図8を参照のこと)。
サイトカインTNFα(10ng/ml)とIFNγ(10ng/ml)との組み合わせがヒト臍帯血管内皮細胞(HUVECS)においてRANTESプロモーターの誘導をもたらすことが実証された35。
本発明者らは、内因性RANTESプロモーターの誘導能を実証することができた後、続いて外因性RANTESプロモーターの制御下にあるHSV tkの発現を誘導することが可能かどうか、及び結果として、誘導された細胞をガンシクロビルで処置した後に細胞死を促進することが可能かどうかを調査した。上記のとおり生成した遺伝子修飾細胞(6ウェル当たり50000個の細胞)を、3日毎に新鮮なサイトカインを添加しながら9日間にわたりTNFα(10ng/ml)及びIFNγ(10ng/ml)で処置した。続いて細胞を100μMガンシクロビルと共に3日間インキュベートした。
Claims (15)
- (i)細胞傷害性タンパク質コード領域を含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞であって、前記(i)細胞傷害性タンパク質コード領域は、(ii)プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結されており、前記プロモーターがRANTESプロモーターである遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
- ヒト幹細胞及び/又はCD34−幹細胞である、請求項1に記載の幹細胞。
- (iii)選択マーカー遺伝子をさらに含む幹細胞であって、前記(iii)選択マーカー遺伝子は、(iv)構成的プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結されており、以下の(a)及び(b)の場合を包含する請求項1又は2に記載の幹細胞。
(a) 前記選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子又は表面マーカータンパク質をコードする遺伝子を含む場合
(b) 前記幹細胞が、(v)前記細胞傷害性タンパク質コード領域と前記表面マーカー遺伝子との間に位置するインシュレーター配列をさらに含む場合 - 前記プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記細胞傷害性タンパク質コード領域が、前記幹細胞ゲノムに組み込まれるものであり、及び/又は、前記構成的プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記選択マーカー遺伝子が、前記幹細胞ゲノムに組み込まれるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の幹細胞。
- 前記幹細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルス配列をさらに含み、
前記プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記細胞傷害性タンパク質コード領域、及び前記構成的プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記選択マーカー遺伝子が、前記プロウイルス配列の一部であり、
前記プロウイルス配列が、レンチウイルス配列、α−レトロウイルス配列又はγ−レトロウイルス配列である場合を包含する、請求項4に記載の幹細胞。 - 前記細胞傷害性タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又はシトシンデアミナーゼである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の幹細胞。
- 腫瘍に罹患した対象を治療するための請求項1〜6のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞と薬学的に許容可能な担体との混合物。
- 前記対象がヒトである、請求項7に記載の混合物。
- 前記腫瘍が転移性である、及び/又は、前記腫瘍が血管新生しているかあるいは血管新生していないものである、請求項7又は8に記載の混合物。
- 前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が、前記対象に対して同種異系であるか、あるいは、前記対象に対して自家性である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記腫瘍の間質組織が線維芽細胞様細胞を含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記腫瘍が、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫(glioblastma multiforme)などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫/平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫/PNET及び悪性リンパ腫からなる群から選択されるものである、請求項7〜11のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記細胞傷害性タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、及び前記対象が、前記単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法で前記ガンシクロビルを受ける、請求項7〜12のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が、1×10 5 〜1×10 9 細胞/kg体重である請求項7〜13のいずれか一項に記載の混合物。
- (i)細胞傷害性タンパク質コード領域を含み、前記(i)細胞傷害性タンパク質コード領域は、(ii)プロモーター又はプロモーター/エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結されており、前記プロモーターがRANTESプロモーターである、レトロウイルスベクターと、
CD34−間葉系幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞。
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