CN102695517A - 经改造的间充质干细胞和用其治疗肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用遗传修饰的间充质干细胞治疗患肿瘤的对象的方法，其中每个遗传修饰的间充质干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此在所述遗传修饰的间充质干细胞与肿瘤的间质组织接近时选择性地表达所述细胞毒性蛋白。本发明还提供了用于该方法的遗传修饰间充质干细胞。

Description

经改造的间充质干细胞和用其治疗肿瘤的方法
在本申请全文中引用了多篇出版物。这些出版物的公开内容在本文中通过引用被并入到到本申请中，以对本发明所属技术的状态进行更全面的描述。
背景技术
一种新理论提出恶性细胞存在于显著影响恶性表型的发生和维持的复杂的细胞和细胞外微环境中。1，2可以发现实体瘤由恶性细胞和包含基质的支持细胞构成，所述包含基质的细胞包括成纤维细胞、内皮、周细胞、淋巴和通常的单核浸润。2-6这些基质细胞对肿瘤存活的重要性使其成为化学治疗性干预的重要靶标。
间充质干细胞(MSC)是帮助多种组织维持和再生的多能祖细胞7，8。可以在如骨髓、血液或不同来源的间充质组织的许多组织中发现MSC，它们在其中作为干细胞的局部来源。MSC有助于损伤后或慢性炎症期间的组织重构。认为受损的组织释放特定的内分泌物，而后这些内分泌物调动多潜能MSC并随后使其汇集至损伤部位。MSC也被肿瘤基质强烈吸引。融合到实验动物血液中的MSC定位至恶性肿瘤。一旦定位，MSC可以形成包括肿瘤血管和基质成纤维细胞的包含肿瘤基质的多种细胞类型。
近期Karnoub等指出，在乳腺癌中，肿瘤部位的MSC释放一种小蛋白质，趋化因子CCL5。CCL5可作为多种基质细胞的化学引诱剂9-10并且其表达与增强的肿瘤新生血管生成相关。此外，CCL5可通过将多种基质细胞类型汇集至原发肿瘤生长部位来帮助癌的生长和转移。9，11，12
近期发现MSC祖细胞的CD34-亚群被汇集至正在生长的肿瘤并通过分化为新血管内皮细胞(EC)或周细胞来帮助肿瘤的新血管生成。13-15重要的是，在将MSC直接注射入外周循环后可以观察到这些和相关的直接影响。16
存在对这样的基于干细胞的疗法的未满足需求：使用基于对细胞毒性蛋白表达而言与肿瘤间质组织本身的接近的细胞毒性蛋白表达，而不是基于与正在血管发生的肿瘤组织的接近的细胞毒性蛋白表达。对于还没有经历血管生成的转移性肿瘤的治疗，此需求尤为急切。
发明内容
本发明的一个实施方案提供用于治疗患肿瘤的对象的方法，包括向所述对象的血流中引入治疗有效量的遗传修饰的间充质干细胞，其中每个遗传修饰的间充质干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，其可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此在所述遗传修饰的间充质干细胞与肿瘤的间质组织接近时选择性地表达所述细胞毒性蛋白。
本发明的另一实施方案还提供用于本专利申请中公开的任何治疗患肿瘤对象的方法的遗传修饰间充质干细胞。
本发明还提供用于治疗患胰腺肿瘤的人对象的方法，包括向所述对象的血流中引入约1×105至约1×109细胞/kg体重的遗传修饰的CD34-干细胞，其中(a)每个遗传修饰的CD34-干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区，其可操作性地连接至(ii)RANTES启动子，(b)以允许单纯疱疹病毒胸苷激酶致使更昔洛韦成为细胞毒性的方式用更昔洛韦治疗所述对象，以及(c)在所述遗传修饰的间充质干细胞的引入之后、同时或之前没有髓抑制(myeloablation)。
本发明还提供包含外源核酸的遗传修饰的间充质干细胞，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，其可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此在所述遗传修饰的间充质干细胞与肿瘤的间质组织接近时选择性地表达所述细胞毒性蛋白。
本发明的另一实施方案涉及逆转录病毒包装细胞，所述逆转录病毒包装细胞包含：
-逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)可由炎症介质诱导的启动子或启动子/增强子组合；以及
-编码病毒表面蛋白的基因，所述病毒表面蛋白为间充质干细胞或CD34-干细胞提供趋向性。
此外所述逆转录病毒包装细胞还包含编码结构蛋白质的基因和用于从包装细胞生成假病毒粒子的酶。
最后，本发明提供包含外源核酸的遗传修饰的人CD34-干细胞，所述外源核酸包含(i)单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区，其可操作性地连接至(ii)RANTES启动子。
附图说明
图1
(A)通过位于左侧的1cm切口曝露胰腺。用1ml注射器将150,000Panc02胰腺癌细胞注射入胰腺。(B)手术后2周，所有小鼠长出可触知的肿瘤并被随机分入各个实验组。
图2
用改良的博伊登室分析法(Modified Boyden Chamber assay)来评估C57B16 MSC到源自Panc02细胞的条件培养基的迁移响应。结果显示MSC到源自Panc02的生长培养基的剂量依赖性诱导迁移。
图3
检测MSC(被改造为在CMV启动子的控制下组成性地表达eGFP)渗透植入的Panc02肿瘤的能力。将500,000细胞静脉内注射入有生长的胰腺肿瘤的小鼠，一周三次。在5周后，处死小鼠移出肿瘤并分析GFP的表达。(A)结果显示与肿瘤相关的强GFP表达。(B)发现在实验过程中MSC的过继转移增加植入肿瘤的生长。
图4
CCL5启动子对靶向Panc02肿瘤的MSC提供增加的报告基因表达选择性。MSC被改造为在CCL5启动子的控制下表达RFP或eGFP。每周注射500,000细胞持续三周后，处死动物，通过荧光显微镜检测肿瘤中报告基因的表达。由CCL5驱动的eGFP(A)和RFP-(B)报告基因均在肿瘤环境中显示表达。通过免疫组织化学使用RFP特异多克隆抗体在固定的组织切片上观察更精细的肿瘤形态(C和D)。(C)结果显示在肿瘤的基质区有RFP的集中表达(100X)。(D+E)在更高的放大倍数(分别为200X、500X)下类似的肿瘤样品显示出肿瘤环境中显示RFP报告基因的表达的MSC的大量浸润。
图5
将被改造为CCL5启动子的控制下表达HSV-TK的MSC与GVC联合应用作为胰腺癌的治疗模式。(A)用于将MSC改造为表达HSV-TK自杀基因的构建体的概示图。(B)对于治疗方案，静脉内注射500,000CCL-5TK改造的MSC。在3天中使细胞汇集至生长的肿瘤并激活TK基因的表达。小鼠接受1天1次的7.5mg GVC的静脉内注射，持续4天，而后中止1天。然后对小鼠再注射经改造的干细胞并在实验期间重复该循环。在3次循环(引入肿瘤36天或第一次注射MSC后21天)后，处死动物并评估肿瘤生长。(C)从用载体对照、经改造的MSC对照(RFP、eGFP)和HSV-TK/GCV处理的动物中切取的肿瘤的实例。(D)在实验过程中HSV-TK/GCV处理导致肿瘤生长的显著降低。
图6
具有若干基因元件实例的转基因盒的示意性概示图。可诱导启动子(pInd)连接至细胞毒性蛋白编码区。第二组成型细胞或病毒启动子(pConst)连接至选择标记基因。两个单元可以被绝缘子序列分隔(+/-绝缘子)。
图7
携带用于MSC遗传修饰的图6所示转基因盒的逆转录病毒载体的概示图。载体产生由5’长末端重复(LTR)的U3区的启动子活性驱动。5’U3区可被其他病毒启动子替换。包装信号Ψ帮助载体基因组包囊(incapsidation)到载体颗粒中。对于慢病毒颗粒的产生，需要另外的元件如加速反应元件(rev responsive element，RRE)和中央多聚嘌呤区(cPPT)。任选添加土拨鼠肝炎转录后调控元件(wPRE)有助于增加载体效价和转基因表达。可诱导启动子(pInd)连接至细胞毒性蛋白编码区。第二组成型细胞或病毒启动子(pConst)连接至选择标记基因。两个单元可以被绝缘子序列分隔(+/-绝缘子)。
图8
用于在RANTES启动子控制下表达HSV-tk的慢病毒载体质粒图谱。
图9
用TNFα(10ng/ml)和IFNγ(10ng/ml)诱导MSC后的RANTES mRNA的表达。以0小时未诱导样品作为归一化值用ΔΔCT法计算相对RANTES mRNA量。显示2个生物样品的平均值。
图10
用更昔洛韦处理hMSC导致在用TNFα和IFNγ诱导RANTES启动子后特异性细胞死亡。未处理的hMSC的代表性显微图片(A)、用TNFα和IFNγ诱导的hMSC的代表性显微图片(B)、仅用更昔洛韦处理的hMSC的代表性显微图片(C)或先用TNFα和IFNγ诱导而后用更昔洛韦处理的hMSC的代表性显微图片(D)。放大倍数100X。
具体实施方式
术语
在本申请中，使用具有下列意义的特定术语。
当在本文中使用时，如果细胞或任何其前体细胞来自于相同物种的另一对象则该细胞是相对于对象的“异体”细胞。
当在本文中使用时，如果细胞或其前体细胞来自于相同对象则该细胞是相对于所述对象的“自体”细胞。
当在本文中使用时，“CD34-干细胞”是指在其表面缺乏CD34的干细胞。CD34-干细胞及其分离方法在如Lange C.等，Accelerated and safe expansion of humanmesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation andregenerative medicine.J.Cell Physiol.2007年4月25日[印刷前的电子出版]中进行了描述。
当在本文中使用时，“细胞毒性蛋白”是指当在细胞内、细胞上和/或在细胞附近存在时直接和/或间接导致细胞死亡的蛋白质。细胞毒性蛋白质包括，例如自杀蛋白(例如HSV-tk)和凋亡诱导物。细胞毒性基因包括用于基因敲除(例如CCR5-/-)的零基因、siRNA或miRNA。已识别了多种自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichiacoli)gpt基因和大肠杆菌Deo基因。胞嘧啶脱氨酶；细胞色素P450；嘌呤核苷磷酸化酶；羧肽酶G2；硝基还原酶。如在Yazawa K，Fisher WE，Brunicardi FC：Current progressin suicide gene therapy for cancer.World J Surg.2002 Jul；26(7)：783-9中详细描述的。细胞毒性因子包括以下：(i)回归因子如趋化因子和粘蛋白趋化因子GPI融合物(趋化因子衍生试剂可用于促进经改造干细胞的定向汇集，参见例如关于GPI锚定粘蛋白融合物的PCT国际申请No.PCT/EP2006/011508)；(ii)作为细胞毒性蛋白的病毒抗原(麻疹、鸡痘)；和(iii)在施用Her2/neu抗体和针对CD52表位的CamPath
Figure BPA00001480965900051
(阿伦单抗)后能够存在于经改造干细胞表面上的Her2/neu抗原。
当在本文中使用时，如果核酸被人工引入细胞或任何该细胞的前体细胞则核酸相对于该细胞是“外源的”。
当在本文中使用，如果干细胞或任何其前体细胞具有人工引入其中的核酸则该干细胞是“遗传修饰的”。用于产生遗传修饰干细胞的方法包括使用病毒或非病毒基因转移(例如质粒转移、噬菌体整合酶、转座子、AdV、AAV和慢病毒)。
当在本文中使用时，将干细胞“引入”对象的血流包括但不限于通过注射将该细胞引入对象的一条静脉或动脉。这种施用也可以进行例如一次、多次和/或在一段或更多段时间内进行。优选单次注射，但在一些情况下可能需要在一段时间内(例如每天、每三天、每周、每两周、每月、每季度、每半年或每年)重复注射。这种施用还优选使用干细胞和药学可接受的载体的混合物进行。药学可接受的载体对本领域技术人员是公知的并且包括但不限于0.01-0.1M并优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。此外，这种药学可接受的载体可以是水性或非水性的溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液和混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液和固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的载体等。常用于静脉内施用的流体例如在Remington(34)中查找。还可以存在防腐剂或其他添加剂如抗菌剂、抗氧化剂、鳌合剂、惰性气体等。
“间充质干细胞”(也称为“MSC”)可以生成结缔组织、骨、软骨和循环系统与淋巴系统细胞。间充质干细胞存在于间充质中，它是由松散聚集的纺锤形或星形未分化细胞组成的胚胎中胚层的一部分。当在本文中使用时，间充质干细胞包括但不限于CD34-干细胞。
在本发明的一个实施方案中，MSC在Horwitz等49中被定义为多能间充质基质细胞的成纤维细胞样塑性粘附细胞，并且也包括CD34-细胞。为了避免任何疑问，术语“多能间充质基质细胞”还包括间充质干细胞及其前体的亚群，所述亚群由能够在体内分化成特定的多种细胞类型的多能自我更新细胞构成。
当在本文中使用时，“髓抑制”是指由例如施用高剂量的化学治疗或放射治疗引起的骨髓细胞的严重或完全缺失。髓抑制是标准过程并在如Deeg(33)中进行了描述。
当在本文中使用时，“核酸”是指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA及其杂交体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U及其衍生物。这些碱基的衍生物在本领域公知并且在PCR Systems，Reagents and Consumables(Perkin ElmerCatalogue 1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，N.J.，USA)中示例。
当在本文中使用时，如果启动子或启动子/增强子组合在合适的环境下引起细胞毒性蛋白的表达，则该细胞毒性蛋白编码核酸区被“可操作性地连接”至启动子或启动子/增强子组合。
当在本文中使用时，“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。“肽”通常是指较短的多肽(例如10个氨基酸残基)，“蛋白质”通常是指较长的多肽(例如200个氨基酸残基)。氨基酸残基可以是天然存在的或者其化学类似物。多肽还可以包含修饰，如糖基化、脂质连接、硫酸盐化、羟基化和ADP-核糖基化。
当在本文中使用时，与组织“接近”包括例如距所述组织1mm内、距所述组织0.5mm内和距所述组织0.25mm内。
本文所用术语“RANTES”启动子与术语“CCL5”启动子同义。
当在本文中使用时，当编码细胞毒性蛋白的遗传修饰间充质干细胞接近肿瘤基质组织时，如果在该区域中细胞毒性蛋白的表达比对象中任何其他区域的表达多，则细胞毒性蛋白是被“选择性地表达”的。优选地，与对象中任何其他区域的表达相比，细胞毒性蛋白在该区域的表达大至少10倍。
当在本文中使用时，术语“对象”是指任何动物，如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
当在本文中使用时，“治疗”患疾病的对象是指减缓、停止或逆转疾病的进展。在一个优选的实施方案中，治疗患疾病的对象是指逆转疾病的进展，理想的是达到消除疾病本身的程度。当在本文中使用时，改善疾病和治疗疾病是等同的。
当在本文中使用时，“肿瘤”包括但不限于前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、鳞状上皮细胞癌、乳腺肿瘤、黑素瘤、基底细胞癌、肝细胞癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、胶质瘤或恶性星形细胞瘤如多形性胶质母细胞瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜癌、肺癌、卵巢肿瘤、子宫颈肿瘤、骨肉瘤、横纹肌/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和恶性淋巴瘤。这些包括原发肿瘤和转移肿瘤(血管化的和非血管化的)。
当在本文使用时，如果细胞或任何其前体细胞来自不同物种的另一对象则该细胞相对于对象是“异种”的。
当在本文中使用时，术语“肿瘤的基质组织”包括肿瘤附近的结缔组织和结构组织，它们包含多种细胞如成纤维细胞/肌成纤维细胞、胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、血管细胞、平滑肌细胞和免疫细胞。肿瘤基质还提供细胞外基质和细胞外分子53。
当在本文中使用时，术语“炎症介质”包括在组织损伤和肿瘤生长部位发挥作用并介导对组织损伤和肿瘤生长的促炎性和抗炎性应答的免疫调节分子。炎症介质的非限制性实例有趋化因子和类二十烷酸。已知肿瘤细胞和周围的基质细胞产生调节炎性反应的多种促炎性介质如促炎性趋化因子和蛋白酶。这些介质的实例为TNFα和IL-6。另外，肿瘤细胞和基质细胞能通过分泌抗炎性分子如TGFβ、IL-10和M-CSF来抑制免疫应答，它们例如抑制树突状细胞成熟54。
本发明一些实施方案
本发明提供用于治疗患肿瘤的对象的方法，所述方法包括向所述对象的血流中引入治疗有效量的遗传修饰的间充质干细胞，其中每个遗传修饰的间充质干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此当所述遗传修饰的间充质干细胞与所述肿瘤的基质组织接近时，选择性地表达所述细胞毒性蛋白。
被治疗的对象可以是任何动物，优选为人。被治疗的肿瘤可以是原发性的或转移性的，并且可以是血管化的或非血管化的。优选地，肿瘤是转移性的并且是非血管化的。例如肿瘤可以是前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、鳞状上皮细胞癌、乳腺肿瘤、黑素瘤、基底细胞癌、肝细胞癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、胶质瘤或恶性星形细胞瘤如多形性胶质母细胞瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜癌、肺癌、卵巢肿瘤、子宫颈肿瘤、骨肉瘤、横纹肌/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏(Ewing)肉瘤/PNET和恶性淋巴瘤。优选地，所述肿瘤是胰腺肿瘤。在另一个优选的实施方案中，所述治疗肿瘤的基质组织包含成纤细胞样细胞。
可以从多种来源分离间充质干细胞：例如骨髓、脐带血、(动员的)外周血和脂肪组织49。在另一优选的实施方案中，遗传修饰的间充质干细胞是CD34-干细胞。另外，遗传修饰的间充质干细胞相对于对象可以是异体的、自体的或异种的。在使用遗传修饰干细胞的本发明方法中，当干细胞(i)接近靶组织的适当细胞，(ii)分化，和/或(iii)与靶组织中的适当细胞融合时，外源基因被表达，即被“启动”。
在本发明中，优选在遗传修饰间充质干细胞的引入之后、同时或之前没有髓抑制。
本发明的另一实施方案提供用于在治疗患肿瘤对象的任何方法中使用的间充质或CD34-干细胞。特别是，所述间充质或CD34-干细胞可以包含启动子或启动子/增强子组合，所述启动子或启动子/增强子组合可以由炎症介质诱导并控制细胞毒性蛋白编码区的转录。这些炎症介质可由肿瘤的基质组织释放，从而在干细胞接近肿瘤基质组织时诱发细胞毒性蛋白在间充质干细胞中的表达。例如炎症介质可以是趋化因子，如TNFα或IFNγ。特别是，启动子可以是RANTES启动子，其特别地被TNFα或IFNγ诱导35。在MSC分化环境中RANTES启动子也可以被分化信号诱导。可被促炎症介质诱导的启动子的其他实例有NF-kB-应答元件36和可由IL1β或TNFα37诱导的通用启动子。
此外，由抗炎症介质(例如TGF-β)激活的启动子可用于在间充质干细胞中实现细胞毒性蛋白的靶向表达。实例有包含Smad结合元件的启动子55。
使用可由炎症介质诱导的启动子能够选择性地治疗未经历血管生成的肿瘤。
用于本发明任何治疗方法的干细胞还可以包含(iii)选择标记基因，所述选择标记基因可操作性地连接至(iv)组成型启动子或启动子/增强子组合。选择标记基因可以包括抗生素抗性基因，如提供嘌呤霉素、新霉素和哇巴因抗性的基因38。可使用抗生素抗性基因从而在抗生素存在下选择遗传修饰的间充质干细胞并抑制未修饰的间充质干细胞，后者由于促进肿瘤的可能性不应被用于肿瘤治疗。另外或作为抗生素抗性基因的替代物，可以使用编码表面标记蛋白的基因，该蛋白只在遗传修饰的间充质干细胞表面表达。表面标记蛋白的非限制性实例是CD34和CD24的剪接变体39-40。可以使用携带识别表面标记蛋白之特异抗体的磁珠以选择遗传修饰的间充质干细胞41。
控制选择标记基因转录的组成型启动子可以是多种不同的启动子如pCAG42、EF1α43、PGK42、CMV和SFFV42。
此外，本发明的各种实施方案的干细胞可以包含(v)位于细胞毒性蛋白编码区和选择标记基因之间的绝缘子序列。绝缘子序列可以保证选择标记基因的组成型启动子不会在不存在任何炎性介质的情况下影响和“启动”细胞毒性蛋白编码区的转录44。
优选地，将可操作性地连接至启动子或启动子/增强子组合的细胞毒性蛋白编码区和可操作性地连接至组成型启动子或启动子/增强子组合的选择标记基因整合于干细胞基因组中。这能产生比携带染色体外的载体的遗传修饰干细胞更稳定的遗传修饰间充质干细胞。
在本发明的另一实施方案中，遗传修饰的间充质干细胞还包含整合到干细胞基因组的前病毒序列，其中可操作性地连接至启动子或启动子/增强子组合的细胞毒性蛋白编码区和可操作性地连接至组成型启动子或启动子/增强子组合的选择标记基因是前病毒序列的一部分。特别是，可使用来自逆转录病毒科家族的病毒来稳定遗传修饰的间充质干细胞。逆转录病毒的实例有慢病毒、α逆转录病毒或γ逆转录病毒。
以下将描述包含具有两个功能性单元的转基因盒的逆转录病毒载体(图6)。两个功能性单元为：
1.体外选择：连接至选择标记基因如抗生素抗性基因(例如嘌呤霉素抗性基因)或适于磁珠分离的表面标记基因(例如CD34)的细胞或病毒源性组成型启动子(例如CAG启动子)。
2.旁观杀死(by-stander killing)：连接至细胞毒性蛋白编码区(例如单纯疱疹胸苷激酶的编码区)的细胞或病毒源性可诱导肿瘤特异启动子(例如RANTES启动子)。
任选地，可用绝缘子序列分隔功能单元以防止两个启动子之间的启动子干扰。
上述转基因盒会被整合到用于在MSC中递送和稳定表达的多种病毒和非病毒载体系统中，如衍生自逆转录病毒的病毒载体系统。
用于MSC遗传修饰的逆转录病毒载体源自α-、γ-逆转录病毒或(人或非人)慢病毒。逆转录病毒载体系统包含转化载体骨架，其携带关注的转基因，即细胞毒性蛋白编码区和载体DNA逆转录和整合所需的所有序列元件，但缺乏大部分或全部病毒基因，如gag-、pol-和env-基因。最新一代的逆转录病毒载体携带特别安全的修饰：在这些所谓的自失活(SIN)载体中，部分或完全地去除了3’U3区以关闭病毒启动子活性并防止宿主细胞基因组中临近基因的反式激活50。
对于载体颗粒的产生，需要反式提供结构蛋白质、酶和包膜蛋白的多种辅助质粒50。可产生携带外源包膜糖蛋白的病毒颗粒。该过程称为假型包装(pseudotyping)。其允许改变载体颗粒的向性并且在某些情况下增强载体效价。
上述转基因盒会通过使用标准分子生物学方法被插入SIN-逆转录病毒载体骨架并根据标准方法产生病毒颗粒50。
图7显示α-和γ-逆转录病毒和慢病毒载体构建体的示例性概示图，该构建体携带图6中所述的转基因。
计划用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV GP)、水疱性口膜炎病毒(VSV-g)、RD114-TR或长臂猿白血病病毒(GALV env)的糖蛋白来假型包装载体颗粒。
遗传修饰间充质干细胞的另一替代性方法是化学(例如脂质体(lipofectamin))或物理(例如电穿孔)转染。之后可按照上述从转染细胞中选择稳定转染的MSC，其中转基因盒随机整合到间充质干细胞基因组中。
遗传修饰MSC的另一替换性方法是通过使用衍生自转座子的非病毒载体系统。在使上述表达盒与末端反相重复侧翼相接之后，可通过转染将构建体转移至MSC中。如果在转染中反式表达了转座酶如睡美人(Sleeping Beauty)51或Piggybac转座因子52，则表达盒会稳定整合到MSC的基因组中。
本发明一些实施方案的遗传修饰间充质干细胞可以通过用假型包装的病毒粒转导天然间充质干细胞来制备，所述病毒粒在其表面表达改变病毒粒向性并通常改变其效价的外源糖蛋白。
假型包装的病毒粒可在逆转录病毒包装细胞的协助下产生，所述逆转录病毒包装细胞包含：
-逆转录病毒载体，其包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)可由炎症介质诱导的启动子或启动子/增强子组合，和
-编码病毒表面蛋白的基因，所述病毒表面蛋白为间充质干细胞或CD34-干细胞提供趋向性的。
另外，逆转录病毒包装细胞还包含用于从包装细胞产生假型包装病毒粒的结构蛋白和酶编码基因，例如gag-、pol-和env-基因，它们能组装假型包装的病毒粒。
优选地，编码结构蛋白和酶的这些基因和编码为间充质或CD34-干细胞提供向性的病毒表面蛋白的基因位于不同的载体上以产生具有感染性但不能复制的病毒粒。这些假型包装的病毒粒携带细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合并表达病毒表面蛋白。通常含有假型包装病毒粒的逆转录病毒包装细胞的上清液用于转导间充质干细胞。
编码为间充质或CD34-干细胞(假型包装的)提供向性的病毒表面蛋白的基因可以是提供广泛宿主向性的多种糖蛋白如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV GP)45、水疱性口膜炎病毒(VSV-g)45、RD114-TR46或长臂猿白血病病毒(GALV env)47。
如以上所述，启动子或启动子/增强子组合可被趋化因子或其他炎症介质诱导。在一个优选的实施方案中，启动子为RANTES启动子。逆转录病毒包装细胞还可以包含其他基因和启动子。
在本发明的另一具体实施方案中，理想的细胞毒性蛋白为单纯疱疹病毒胸苷激酶，并且理想地以允许单纯疱疹病毒胸苷激酶使更昔洛韦成为细胞毒性的方式用更昔洛韦治疗所述对象。更昔洛韦和其使用方法是本领域已知的。还可以用胞嘧啶脱氨酶作为细胞毒性蛋白，其将5-氟胞嘧啶转化为毒性化合物5-氟尿嘧啶48。
在本发明中，遗传修饰的间充质干细胞的治疗有效量包括但不限于以下量和量的范围：(i)约1×105至约1×109细胞/kg体重；(ii)约1×106至约1×108细胞/kg体重；(iii)约5×106至约2×107细胞/kg体重；(iv)约5×106至约1×107细胞/kg体重；(v)约1×107至约2×107细胞/kg体重；(vi)约7×106至约9×106细胞/kg体重；(vii)约1×105细胞/kg体重；(viii)约1×106细胞/kg体重；(ix)约5×106细胞/kg体重；(x)约1×107细胞/kg体重；(xi)约6×106细胞/kg体重；(xii)约7×106细胞/kg体重；(xiii)约8×106细胞/kg体重；和(ix)约9×106细胞/kg体重。预想的人体重包括但不限于约50kg；约60kg；约70kg；约80kg；约90kg；和约100kg。这些数值是建立在MSC移植的临床前动物实验和标准实验方案的基础上。
本发明还提供用于治疗患胰腺肿瘤的人对象的方法，所述方法包括向所述对象的血流中引入约5×106至约2×107细胞/kg体重的遗传修饰的CD34-干细胞，其中(a)每个遗传修饰的CD34-干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区可操作性地连接至(ii)RANTES启动子，(b)以允许单纯疱疹病毒胸苷激酶使更昔洛韦成为细胞毒性的方式用更昔洛韦治疗所述对象，和(c)在所述遗传修饰的间充质干细胞的引入之后、同时或之前没有髓抑制。在该方法中，肿瘤优选为转移性的，并且可以是血管化的或非血管化的。此外，遗传修饰的间充质干细胞相对于所述对象可以是异体的、自体的或异种的。
本发明还提供包含外源核酸的遗传修饰的间充质干细胞，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此当所述遗传修饰的间充质干细胞与肿瘤的基质组织接近时，选择性地表达所述细胞毒性蛋白。优选地，所述间充质干细胞是人CD34-干细胞。还优选的是包含RANTES启动子的外源核酸，其中所述细胞毒性蛋白是单纯疱疹病毒胸苷激酶。
最后，本发明提供包含外源核酸的遗传修饰的人CD34-干细胞，所述外源核酸包含(i)单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区可操作性地连接至(ii)RANTES启动子。
本领域技术人员可容易地获得本发明中使用的多种蛋白质和调控序列。例如RANTES启动子在(22)中公开，并且可通过普通技术获得。HSV TK-V00467疱疹病毒基因可用作胸苷激酶(ATP：5’胸苷磷酸转移酶，e.c.2.7.1.21)(类型1菌株CL101)。
参照以下的详细实验会更好地理解本发明，但本领域技术人员会容易地理解具体的详细实验只是对权利要求中更全面描述的本发明的示例。
详细实验
概述
目的：为了分析基于经改造的间充质干细胞的疗法对胰腺肿瘤基质的效力。
背景数据概述：间充质干细胞(MSC)被主动汇集至肿瘤基质，在那里它们增强肿瘤的生长和转移。已证明肿瘤基质中MSC对趋化性细胞因子CCL5的上调在该过程中起中心作用。鼠MSC被改造为在CCL5启动子控制下表达报告基因或治疗性基因，并过继转移至具有生长的胰肿瘤的小鼠中。然后评价对肿瘤生长和转移的作用。
方法：用RANTES启动子驱动的红色荧光蛋白(RFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)或单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(tk)基因稳定转染从C57/Bl6 p53(-/-)小鼠骨髓分离的MSC。对携带原位同源胰Panc02肿瘤的小鼠每周1次静脉内施用MSC，持续3周。
结果：在经处理的胰肿瘤样品中通过荧光检测到CCL5启动子驱动的eGFP和RFP信号。在施用干细胞后5-7天用前药更昔洛韦(GCV)腹腔内处理的HSV-tk治疗组导致原发胰腺肿瘤生长减少50％(p＜0.0003，学生t检验)并降低肝转移(30％相对于100％)。
结论：用eGFP-和RFP报告基因确认MSC到原发胰腺肿瘤基质的主动回归和RANTES启动子的激活。在更昔洛韦的存在下，HSV-tk转染的MSC导致原发胰腺肿瘤生长和转移发生的显著降低。
材料和方法
间充质干细胞
按照所述的从p53靶向删除的纯合C57BL/6小鼠骨髓分离间充质干细胞。15细胞在细胞培养基中粘附连续生长。在亚克隆后，选择单细胞克隆并表征。15用连接至CCL5启动子的红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(eGFP)或HSV胸苷激酶转染细胞。启动子序列占用上游区域的-972和完全5’非翻译区。18此外，所有载体包含CMV控制的Bsr2杀稻瘟菌素抗性基因。以5μg/ml的浓度使用杀稻瘟菌素选择转染细胞。在注射入小鼠前，从培养瓶中脱离细胞，用PBS清洗2次并在PBS中重新混悬。
改良的博伊登室分析法
用改良的博伊登室分析法进行体外定向MSC迁移。15干细胞逆Panc02同源胰腺肿瘤细胞上清液浓度降低的方向迁移。
原位胰癌模型
C57BL6小鼠得自Jackson实验室。所有动物实验在巴伐利亚州动物保护委员会的专门允许下进行。将平均重量约20g的2月龄至3月龄C57BL/6小鼠用于Panc02(与C57BL/6小鼠同源)胰腺肿瘤的植入。19用开他敏(100mg/kg体重)、甲苯噻嗪(5mg/kg体重)和阿托品麻醉小鼠。将小鼠左侧的手术部位剃毛并以无菌方式准备。通过左侧1cm的切口暴露胰。用校准推钮装置(购自Hamilton Syringe公司，USA)和有30G针头的1ml注射器(均购自BD Biosciences公司，Spain)将150,000Panc02胰癌细胞的40ul PBS溶液注射入胰腺。小心操作以保证没有胰癌细胞散布到腹膜。为此，在将针抽出胰后在注射部位轻柔地压上棉签(Q-tip)1分钟。注射肿瘤细胞后，用4-0缝线(购自Braun AG公司，Germany)间断缝术闭合腹腔和皮肤。手术后2周，所有小鼠均生长出可触知的肿瘤，并随机分配入各个实验组。组A不接受干细胞或更昔洛韦注射，组B接受未修饰的干细胞，组C接受C57BL/6 p53-/- CCL5/HSV-tk+间充质干细胞和GCV注射，组D接受C57BL/6 p53-/- CCL5/RFP+间充质干细胞，组E接受C57BL/6 p53-/- CCL5/eGFP间充质干细胞。所有干细胞注射的剂量为0.5×106细胞/周，并经尾静脉施用。组C的GCV(Cymeven
Figure BPA00001480965900141
购自Roche公司，Germany)注射剂量为1.5mg，是在干细胞注射后5至7天腹腔内施用。在3次处理循环后处死全部小鼠，分离肿瘤并称重。用对独立样品的未配对双尾t-检验获得统计学显著性。
荧光显微镜观察
将胰腺肿瘤组织样品包埋在Tissue-Tek O.C.T.(购自Miles Inc.公司USA)中并在液氮中快速冷冻。获得5um厚的低温切片。向切片上加入DAPI核染色溶液(Vectashield“Hard set mounting medium with Dapi”，USA)，立即评测GFP或RFP荧光信号。用AxioCam显微照相机获得照片，用Photoshop
Figure BPA00001480965900142
(Adobe，USA)软件重叠不同荧光通道的图像。
MSC注射和更昔洛韦处理
在注射前，计数细胞并稀释至1×106细胞/ml PBS的终浓度。在H2O(注射用水(aquaad iniectabilia))中溶解更昔洛韦(GCV)(Cymeven；Roche)至浓度为10mg/ml。细胞混悬液用26G针头经尾静脉施用，药物经腹腔内注射施用。在第1天开始处理，注射0.5ml细胞(500,000细胞)。在第5至7天，每天以60μg/g体重(例如对体重25g的小鼠为150μl)的剂量施用更昔洛韦。在第7天后，重复处理循环直至解剖。在处理期间记录肿瘤进展和行为。
组织和肿瘤制备
在解剖后，所有肿瘤均独立第制备。每个肿瘤的三分之一用甲醛固定并包埋在石蜡中，而将另外的三分之一快速冷冻。剩下的三分之一根据制造商说明保存在RNAlater溶液(Ambion)中以备以后的RNA分离和预期的qRT-PCR分析。
免疫组织化学
如之前所述在5μm切片上进行免疫组织化学。20对于第一抗体，将多克隆兔抗RFP抗体(Mbl Medical and Biological Laboratories，Japan)以1∶50在封闭溶液(乳+超级块(superblock))中稀释。对于第二抗体，将多克隆生物素化山羊抗兔(Linaris，Wertheim-Bettingen，Germany)抗体以1∶300稀释在乳中。
结果
MSC到胰腺肿瘤的汇集
之前在C57Bl/6小鼠背景下建立了同源原位鼠胰腺肿瘤。31，32植入于胰被膜下的肿瘤细胞生长并显示出深入的肿瘤血管组织(图1)。用从P53(-/-)骨髓分离的CD34-MSC评价经改造的MSC对肿瘤基质的靶向效力。15，16，21
首先为了评价MSC对Panc02肿瘤的总体向性，使用了改良的博伊登室分析法来研究C57Bl6 MSC向肿瘤衍生因子的诱导迁移。结果显示响应于增高水平的条件肿瘤培养基的MSC剂量依赖性迁移(图2)。
然后在CMV启动子控制下用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒改造细胞。一周一次，将500,000个细胞静脉内注射入具有生长的胰腺肿瘤的小鼠中。5周后处死小鼠，取出肿瘤并分析GFP表达。结果显示与肿瘤相关的强GFP表达(图3A)。还发现细胞迁移至二级脾、淋巴结、胸腺、皮肤和胆(数据未示出，(15))。这证明全身注射的干细胞回归至生长的肿瘤。对具有生长的胰腺肿瘤的C57B16小鼠静脉内注射MSC也导致肿瘤生长的显著增加(图3B)。
还评价了静脉内施用的MSC对至肝、脾和腹膜转移的作用。发现施用MSC显著增加对腹膜的转移(表1)。
CCL5启动子驱动肿瘤基质中的报告基因表达
然后我们研究了在使用CCL5使MSC汇集至肿瘤基质的条件下驱动更加受控制的报告基因表达的可能性。为此，在CCL5启动子控制下用RFP和eGFP报告基因改造P53(-/-)MSC C57/Bl6细胞系。18，22CCL5启动子通常在组织压力或损伤的环境中在多种组织类型中有活性。23-27紧靠-972上游的核苷酸和起始翻译的完全5’非翻译区被克隆进载体中的eGFP或RFP上游。
所得的CCL5-eGFP或RFP稳定改造的MSC经FACS显示弱但可检测的报告子表达水平(数据未显示)。然后每8天将细胞(500,000)注射入具有生长的胰腺肿瘤的小鼠的外周循环中，持续21天。
3周后处死小鼠，通过荧光显微镜观察和免疫组织化学分析肿瘤和周围组织的RFP和eGFP报告基因表达。所得结果显示了生长肿瘤中RFP和GFP荧光的表达(图4A和图4B)。为了更好地检查组织样品中RFP表达的形态，通过免疫组织化学检测甲醛固定样品的RFP蛋白质表达。在肿瘤基质中检测到表达RFP的MSC(图4C、图4D和图4E)。
在经改造的MSC中使用HSV-tk作为治疗模式
在下一阶段的试验中，检测了使用CCL5启动子的治疗性基因的递送。为此，将单纯疱疹胸苷激酶(HSV-Tk)28基因克隆在CCL5启动子之后(图5A)。
在注射0.5×106个CCL5-tk改造MSC后，用3天使细胞汇集至生长的肿瘤基质，进行分化和随后的tk基因表达。然后小鼠接受由一天一次腹膜内注射1.5mg GVC(进行3天)组成的疗程。然后对小鼠再次注射经改造的干细胞，然后在实验持续期间重复循环(图5B)。36天后，处死动物并评价肿瘤生长(图5C和图5D)。结果显示与具有未接受处理或接受对照MSC(CCL5-RFP MSC和CCL5-eGFP MSC)的肿瘤的对照动物相比，接受治疗性CCL5/HSV-Tk干细胞构建体和GCV的小鼠组肿瘤体积显著减小。图5C显示试验完成后切取的代表性肿瘤。肿瘤重量与未处理或处理的对照动物相比显示统计学显著降低。
作为另外的参数，分析了处理的情况下肝、脾和腹膜的转移。尽管施用MSC增加腹膜中转移的量，但是用GCV处理导致脾和肝转移的显著降低(双尾Fisher’s精确测试)(表2)。通过检视脾、肝和腹膜并触摸相应器官来评估转移。
讨论
间充质干细胞主动汇集至肿瘤基质，在肿瘤基质中它们对肿瘤生长的多个方面做出贡献。MSC可以作为肿瘤血管的前体细胞发挥作用，还似乎对基质成纤维细胞样细胞产生有贡献。肿瘤相关基质细胞对肿瘤生长和转移潜能的具体影响是目前正在研究的问题。在乳癌(mamma-carcinoma)模型的临床前研究中，证明肿瘤基质中的间充质干细胞(MSC)产生增加水平的细胞因子CCL5。CCL5的分泌导致肺转移发生率升高。
在胰腺泡周(periacinar)肌成纤维细胞中CCL5的分泌也被区别地调控，这暗示这些细胞在介导浸润和胰中炎性细胞累积中的作用。29在患胰腺癌的患者中，胰腺炎与CCL5启动子多态性显著相关。30本文所述的工作评价了使用经改造的MSC作为在肿瘤基质环境中选择性地递送自杀基因的治疗载剂对原发肿瘤生长和转移的作用。
MSC被改造为在CCL5启动子的控制下表达单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)以进行组织特异性表达。用单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)在CCL5启动子的控制下转染MSC，从而有更多组织特异的基因表达。Tk磷酸化更昔洛韦(GCV)，产生杀死转染细胞和经旁观作用(bystander effect)杀死周围肿瘤细胞的毒性。使用更昔洛韦的HSV-TK基因治疗构成自杀基因治疗的广泛使用策略的基础。17
由于实体瘤对循环祖细胞有强的回归作用，使用本方法可有效靶向肿瘤环境。该载体干细胞的靶向加上由自杀基因的CCL5启动子驱动的组织特异性基因表达导致了高效和低副作用的特性。此外，可以从癌症患者自身获得骨髓源性MSC。这允许经过简单的静脉内施用递送自杀基因而不需要髓抑制和骨髓移植。
基于临床前研究的胰腺癌治疗策略在显著延长患者生存方面还未取得成功。在诊断时，仅有20％患胰腺癌的患者具有可以手术的局部疾病。40％的患者具有局部晚期(因此不能切除)疾病，而另外40％已有远端转移。胰腺肿瘤模型证明MSC在胰腺癌中起重要作用。如通过迁移测定和CCL5/RFP MSC系统注射所示，细胞主动寻找肿瘤。全身注射的干细胞仅在肿瘤中被发现。随后的肿瘤体积减小和腹腔癌减少为患者特制的干细胞/自杀基因组合疗法有望于临床应用。
汇集至其他组织部位的经改造干细胞不进行相同的分化过程，因此不表达治疗性基因。该方法允许在确定的微环境中对治疗性基因的选择性表达进行很大程度的控制。
将干细胞疗法与选择性基因疗法结合为患病或丢失细胞的再生或替换并为破坏肿瘤增大了治疗选择。本文证明遗传修饰的干细胞可作为将组织特异性基因治疗输送到肿瘤的载体，并且用CCL5启动子改造的MSC可驱动tk表达。
表1
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MSC处理对转移发生的作用。比较载体对照和用天然MSC处理(在3周时间内每周给予500,000细胞的MSC)的动物。通过在肿瘤生长36天后检视并触摸来进行检测。数字表示具有转移瘤的动物。用双尾Fisher精确测试检测显著性。
表2
Figure BPA00001480965900181
表2.肿瘤转移的分布。将载剂对照动物和GFP与RFP报告基因转染的对照MSC与用自杀基因疗法处理的动物比较。通过在肿瘤生长36天后检视并触摸来进行检测。数字表示具有转移瘤的动物。用双尾Fisher精确测试检测显著性。所有MSC为在3周时间内每周给予500,000细胞。
稳定转导人MSC的体外实验和诱导HSV tk表达的体外测定
遗传修饰的人MSC的生成
用复制缺陷的慢病毒孵育人MSC过夜，所述慢病毒携带具有RANTES启动子控制下的HSV tk基因和SV40启动子控制下的杀稻瘟菌素抗性基因的pLenti6 TK RANTES载体(复合感染(MOI)：10)(见图8)。
在过夜孵育后，去除含有病毒的培养基并替换为新鲜培养基。第二天向细胞中加入杀稻瘟菌素(6μg/ml)以选择遗传修饰的MSC。包含杀稻瘟菌素的培养基每3至4天更换，最少持续6天。
RANTES启动子的体外诱导
已证明细胞因子TNFα(10ng/ml)和IFNγ(10ng/ml)的组合导致人脐静脉内皮细胞(HUVECS)中RANTES启动子的诱导35。
在我们的实验中，我们想证明相同的细胞因子组合也导致MSC中内源RANTES启动子的诱导。我们想使用该测定诱导外源性HSV tk的体外表达。用TNFα和IFNγ或不用细胞因子将遗传改造的MSC培养最多48小时，在0、24和48小之后分离整个RNA。将RNA(600ng)逆转录成cDNA，随后用LighCycler系统(Roche，引物：正向：CCT CATTGC TAC TGC CCT CT；反向：GGT GTG GTG TCC GAG GAA TA；通用探针16)在qRT-PCR反应中使用cDNA以定量内源RANTES表达。为确保对不同样品使用相同量的RNA，用看家基因(肌动蛋白)作为参照基因(通用探针实验室人ACTB基因分析法，Roche)，用ΔΔCT法计算相对量。
如图9所示，我们能在用TNFα(10ng/ml)和IFNγ(10ng/ml)诱导MSC24和48小时后检测到内源RANTES mRNA的显著增加。这些发现证明TNFα和IFNγ不只在HUVEC中也在人MSC中诱导RANTES表达。
更昔洛韦处理后遗传修饰MSC诱导的特定细胞死亡
在我们证明RANTES启动子的可诱导性后，我们继续研究是否可以诱导外源RANTES启动子控制下的HSV tk表达，并随之在用更昔洛韦处理诱导细胞后促使细胞死亡。用TNFα(10ng/ml)和IFNγ(10ng/ml)处理上述产生的遗传修饰细胞(每6孔50000细胞)，每3天添加新鲜细胞因子。随后用100μM更昔洛韦孵育细胞3天。
结果清楚地证明用TNFα和IFNγ诱导并随后用更昔洛韦处理的遗传修饰MSC不存活(图10D)。这与只用TNFα和IFNγ(图10B)诱导或用更昔洛韦处理(图10C)的细胞相反。
参考文献
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Claims (41)

1.用于治疗患肿瘤对象的遗传修饰的间充质干细胞，其中每个遗传修饰的间充质干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此在治疗有效量的所述干细胞被引入所述对象的血流后当所述遗传修饰的间充质干细胞与所述肿瘤的基质组织接近时，选择性地表达所述细胞毒性蛋白。
2.权利要求1的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述对象是人。
3.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述肿瘤是转移性的。
4.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述肿瘤是血管化的。
5.权利要求1至3中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述肿瘤不是血管化的。
6.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞是CD34-干细胞。
7.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞相对于所述对象是异体的。
8.权利要求1至6中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞相对于所述对象是自体的。
9.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述肿瘤的基质组织包含成纤细胞样细胞。
10.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中在所述遗传修饰的间充质干细胞的引入之后、同时或之前没有髓抑制。
11.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述肿瘤选自前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、胰肿瘤、鳞状细胞癌、乳腺肿瘤、黑素瘤、基底细胞癌、肝细胞癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、胶质瘤或恶性星形细胞瘤如多形性胶质母细胞瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈肿瘤、骨肉瘤、横纹肌/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和恶性淋巴瘤。
12.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述肿瘤是胰肿瘤。
13.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述启动子是RANTES启动子。
14.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述细胞毒性蛋白是单纯疱疹病毒胸苷激酶，并且以允许单纯疱疹病毒胸苷激酶使更昔洛韦成为细胞毒性的方式用更昔洛韦治疗所述对象。
15.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞的治疗有效量为约1×105至约1×109个细胞/kg体重。
16.前述权利要求中任一项的遗传修饰的间充质干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞的治疗有效量为约1×106至约1×108个细胞/kg体重。
17.权利要求16的修饰的间充质干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞的治疗有效量为约5×106至约2×107细胞/kg体重。
18.用于治疗患肿瘤的人对象的遗传修饰的CD34-干细胞，所述治疗通过向所述对象的血流中引入约5×106至约2×107个细胞/kg体重的所述遗传修饰的CD34-干细胞来进行，其中(a)每个遗传修饰的CD34-干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区可操作性地连接至(ii)RANTES启动子，(b)以使允许单纯疱疹病毒胸苷激酶使更昔洛韦成为细胞毒性的方式用更昔洛韦治疗所述对象，和(c)在所述遗传修饰的间充质干细胞的引入之后、同时或之前没有髓抑制。
19.权利要求18的遗传修饰的CD34-干细胞，其中所述肿瘤是转移性的。
20.权利要求18或19中任一项的遗传修饰的CD34-干细胞，其中所述肿瘤是血管化的。
21.权利要求19的遗传修饰的CD34-干细胞，其中所述肿瘤不是血管化的。
22.权利要求18至21中任一项的遗传修饰的CD34-干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞相对于所述对象是异体的。
23.权利要求18至21中任一项的遗传修饰的CD34-干细胞，其中所述遗传修饰的间充质干细胞相对于所述对象是自体的。
24.遗传修饰的间充质干细胞，所述遗传修饰的间充质干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)启动子或启动子/增强子组合，据此当所述遗传修饰的间充质干细胞与肿瘤的基质组织接近时，选择性地表达所述细胞毒性蛋白。
25.权利要求24的干细胞，其中所述干细胞是人干细胞。
26.权利要求24或25中任一项的干细胞，其中所述干细胞是CD34-干细胞。
27.权利要求24至26中任一项的干细胞，其中所述启动子或启动子/增强子组合可由炎症介质诱导。
28.前一权利要求的干细胞，其中所述启动子或启动子/增强子组合可由细胞因子诱导。
29.权利要求24至28中任一项的干细胞，其中所述启动子是RANTES启动子。
30.权利要求24至29中任一项的干细胞，还包含(iii)选择标记基因，所述选择标记基因可操作性地连接至(iv)组成型启动子或启动子/增强子组合。
31.权利要求30的干细胞，其中所述选择标记基因包括抗生素抗性基因或编码表面标记蛋白的基因。
32.权利要求30或31中任一项的干细胞，还包含(v)位于所述细胞毒性蛋白编码区和所述表面标记基因之间的绝缘子序列。
33.权利要求24至32中任一项的干细胞，其中所述可操作性地连接至启动子或启动子/增强子组合的细胞毒性蛋白编码区被整合到所述干细胞的基因组中。
34.权利要求30至32中任一项的干细胞，其中所述可操作性地连接至组成型启动子或启动子/增强子组合的选择标记基因被整合到所述干细胞的基因组中。
35.权利要求33或34中任一项的干细胞，还包含整合到所述干细胞的基因组中的前病毒序列，其中所述可操作性地连接至启动子或启动子/增强子组合的细胞毒性蛋白编码区和所述可操作性地连接至组成型启动子或启动子/增强子组合的选择标记基因是所述前病毒序列的一部分。
36.权利要求35的干细胞，其中所述前病毒序列是慢病毒序列、α逆转录病毒序列或γ逆转录病毒序列。
37.权利要求24至36中任一项的干细胞，其中所述细胞毒性蛋白是单纯疱疹病毒胸苷激酶或胞嘧啶脱氨酶。
38.逆转录病毒包装细胞，包含：
-逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体包含(i)细胞毒性蛋白编码区，所述细胞毒性蛋白编码区可操作性地连接至(ii)可由炎症介质诱导的启动子或启动子/增强子组合；以及
-编码为间充质干细胞或CD34-干细胞提供趋向性的病毒表面蛋白的基因。
39.前一权利要求的逆转录病毒包装细胞，其中所述启动子或启动子/增强子组合可由细胞因子诱导。
40.前述权利要求38或39的逆转录病毒包装细胞，其中所述启动子是RANTES启动子。
41.遗传修饰的人CD34-干细胞，所述遗传修饰的人CD34-干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶编码区可操作性地连接至(ii)RANTES启动子。
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