CN104160027B - 同时表达十二聚体trail及hsv-tk自杀基因的载体及利用其的抗癌干细胞治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含编码十二聚体TRAIL的核苷酸序列及自杀基因核苷酸序列的DNA盒、包含所述DNA盒的重组表达载体、利用所述重组表达载体制备的重组腺病毒、用所述重组腺病毒转染的宿主细胞、包含所述宿主细胞的癌治疗用组合物以及包括向个体给予所述癌治疗用组合物的步骤的癌治疗方法。通过导入本发明的DNA盒从而同时生产十二聚体TRAIL及HSV-TK的干细胞治疗剂与现有治疗剂相比抗癌效果更加优异，因此能够有效地用于治疗多种实体癌及转移癌。

Description

同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK自杀基因的载体及利用其的抗癌干细胞治疗剂
技术领域
本发明涉及同时表达十二聚体TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)及HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)自杀基因的载体及利用其的抗癌干细胞治疗剂。更为详细地，本发明涉及包含编码十二聚体TRAIL的核苷酸序列及自杀基因核苷酸序列的DNA盒、包含所述DNA盒的重组表达载体、利用所述重组表达载体制备的重组腺病毒、用所述重组腺病毒转染的宿主细胞、包含所述宿主细胞的癌治疗用组合物以及包括向个体给予所述癌治疗用组合物的步骤的癌治疗方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC)作为能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的多能(pluripotent)成体干细胞，被广泛用于组织再生目的的多种疾病的治疗剂。而且，已知间充质干细胞具有能够在体内特异性地找出并移动至肿瘤位点的特性，近来作为靶向递送载体用于抗癌剂受到瞩目(Aboodyetal.,ProcNatlAcadSci,97:12846,2000)。就利用间充质干细胞的癌特异趋向性对转移癌进行靶向治疗已进行了许多研究。实际上，报道称将抗癌细胞因子IL-12或IFN-β，或者溶瘤病毒搭载在间充质干细胞上对转移癌小鼠全身给药时，转移癌的大小减小并且小鼠的存活延长(Shahetal.AdvancedDrugDeliveryReviews,2011)。
已知TRAIL作为TNF(肿瘤坏死因子)家族蛋白，具有能够选择性地诱导癌细胞凋亡的特征(Wileyetal.,Immunity,3(6):673-682,1995)。实际上，已查明TRAIL具有对健康组织无损伤并且只对多种癌细胞系展现毒性的特征(Ashkenazietal.,J.Clin.Invest.,104:155-162,1999；Walczaketal.,Nat.Med.,5:157-163,1999)，这是由于在正常细胞表面上表达了高水平的诱饵受体1、2(DcR1、DcR2)(Sheridanetal.,Science,277:818-821,1997)。DcR1、DcR2虽然能够与TRAIL结合，但由于它们缺乏胞内信号转导结构域而不转导由TRAIL介导的细胞凋亡信号。TRAIL基于其诱导癌细胞特异性凋亡的能力，作为癌治疗的具有前景的治疗剂而受到瞩目。本发明人在先前专利中，为了实现利用TRAIL进行有效的抗癌基因治疗，在能与TRAIL受体DR4、DR5结合的TRAIL的胞外结构域(氨基酸114-281)的氨基酸末端连接作为分泌信号序列的tPA(组织纤溶酶原激活剂)及作为十二聚体形成结构域的SPD(表面活性蛋白D)，从而发明了十二聚体TRAIL(国际申请号PCT/KR2007/001099)。
自杀基因疗法作为抗癌基因治疗方法之一，是向癌细胞直接传递HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450、PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)等自杀基因的方法。自杀基因表达上述酶中的一种，该酶通过酶促反应将注射的对细胞无害的前药转化为具有细胞毒性的物质，其通过间隙连接从表达自杀基因的细胞传递到相邻的细胞中，从而诱导周边细胞凋亡，该现象被称为旁观者效应(bystandereffect)。实际上，诱导自杀基因表达于癌组织后，对活体全身性地给予前药时，只在治疗基因得到表达的肿瘤细胞中前药被转化为毒性物质，从而能够破坏肿瘤细胞而不给正常组织带来明显损伤(TheFASEBjournal,23:1584,2009)。
在各种自杀基因中，HSV-TK作为最为广泛被使用的自杀基因，已经被III期临床试验证实其功效和安全性。HSV-TK将被称为更昔洛韦(GCV)的前药磷酸化，而通过被磷酸化的更昔洛韦三磷酸盐(GCV-3P)插入DNA中阻止正常基因的合成，从而诱导细胞凋亡(Mooltenetal.,CancerRes.46:5276,1986)。GCV-3P的作用是特异性地作用于快速增殖的细胞，因此该方法可用于选择性地消除癌细胞而避免杀伤正常细胞。实际上，当通过腺病毒或慢病毒将HSV-TK传递到局部肿瘤位点后再给予GCV，则可以期待癌细胞特异性的细胞凋亡，并且为了进一步提高癌特异性，采用癌特异性启动子或病毒载体的向性修饰的策略。
TRAIL及HSV-TK在能够诱导癌细胞特异性的细胞凋亡这一点上，作为靶向癌治疗中安全的候补物质，已经被应用于利用间充质干细胞治疗转移癌，但仅TRAIL或HSV-TK的单独治疗抗癌功效微弱，在抗癌治疗的临床应用中难以成功(Loebingeretal.,CancerRes,69:4134,2009；Mileticetal.MolecularTher,15:1373,2007)。
发明内容
技术课题
本发明人为了研发功效优异的靶向抗癌基因治疗，构建了同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK自杀基因的载体，并随后制备了同时表达这些基因的重组腺病毒，将其传递到干细胞时，转染的细胞针对多种癌细胞展现出高的细胞凋亡诱导能力。与单独表达TRAIL、十二聚体TRAIL或HSV-TK的间充质干细胞相比，同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的间充质干细胞显示了协同地增加的抗癌功效。此外，将同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的间充质干细胞向小鼠转移性肾癌模型全身给药时，发现间充质干细胞能够特异性定位于肿瘤结节附近，并显著地减少转移性肿瘤结节的大小和数目，从而能够明显提高小鼠的存活率。特别是，通过反复给予同时表达十二聚体TRAIL和HSV-TK的干细胞治疗剂，使得抗癌效果进一步提高，并且通过3次反复给药后小鼠的所有转移性肿瘤结节得到完全治愈，从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供包含编码十二聚体TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)的核苷酸序列及自杀基因核苷酸序列的DNA盒。
本发明的另一个目的是提供包含上述DNA盒的重组表达载体。
本发明的又一个目的是提供利用上述重组表达载体制备的重组腺病毒。
本发明的又一个目的是提供用上述重组腺病毒转染的宿主细胞。
本发明的又一个目的是提供包含上述宿主细胞的癌治疗用组合物。
本发明的又一个目的是提供包括向疑似患有癌症的个体给予上述癌治疗用组合物的步骤的癌治疗方法。
有益效果
相比现有治疗剂，通过导入本发明的DNA盒而同时生产十二聚体TRAIL及HSV-TK的干细胞治疗剂的抗癌效果更加优异，因此能够有效地用于治疗多种不同的实体癌及转移癌。
附图说明
图1所示为由人十二聚体TRAIL序列、IRES序列以及HSV-TK序列组成的DNA盒(dTRAIL-TK)的示意图。
图2所示为导入dTRAIL-TKDNA盒的间充质干细胞(MSC/dTRAIL-TK)的TRAIL表达及HSV-TK表达的结果。
图3所示为进行GCV处理后，导入dTRAIL-TKDNA盒的间充质干细胞(MSC/dTRAIL-TK)的细胞存活及TRAIL表达的结果。
图4所示为体外的RENCA细胞中同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的间充质干细胞(MSC/dTRAIL-TK)的增进的癌细胞杀伤能力的结果。
图5所示为用MSC/dTRAIL-TK处理后，小鼠转移性肾癌模型中的肺肿瘤结节的数目。
图6所示为给予MSC/dTRAIL-TK后，转移性肾癌小鼠的存活率。
图7所示为反复给予MSC/dTRAIL-TK后，转移性肾癌小鼠的存活率。
优选实施方式
作为实现上述目的的一个方面，本发明提供包含编码十二聚体TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)的核苷酸序列及自杀基因核苷酸序列的DNA盒。
本发明的术语“十二聚体TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)”是指，通过表达的TRAIL蛋白多聚化而具有十二聚体结构的分泌型TRAIL蛋白，其可以是由国际公开专利第WO2007/102690号及韩国公开专利第10-2009-0015885号记载的方法制备的十二聚体TRAIL。已确认相比单聚体或三聚体结构的TRAIL，本发明的十二聚体TRAIL蛋白显示出更高的癌细胞选择性凋亡诱导活性。本发明中，为了将TRAIL蛋白制备为十二聚体形态，使编码十二聚体形成结构域的核苷酸序列位于编码TRAIL蛋白的核苷酸序列的5’上游区，为了蛋白的细胞外分泌，使编码分泌信号序列的核苷酸序列位于十二聚体形成结构域的5’上游区。
本发明虽然使用了十二聚体TRAIL，但只要其与本发明的自杀基因同时表达用于治疗剂时能够显示出协同性抗癌效果，三聚体以上的TRAIL也可以包含于本发明的范围内。
编码本发明的十二聚体TRAIL的核苷酸序列可以包含编码分泌信号序列的核苷酸序列、编码十二聚体形成结构域的核苷酸序列以及编码TRAIL的核苷酸序列。
本发明中，术语“TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)”是指这样一种蛋白，其作为配体以诱导被称为凋亡的细胞死亡过程。在本发明中，编码TRAIL的核苷酸序列可以为来自人、猴子、大鼠、小鼠或其它物种的编码TRAIL蛋白的基因，可以优选使用人TRAIL基因。
因由本发明的编码TRAIL的核苷酸序列表达的蛋白具有与TRAIL的受体DR4或DR5反应的活性，仅可使用编码TRAIL的核苷酸序列的一部分。可以优选使用编码TRAIL的114～281氨基酸的核苷酸序列。编码上述TRAIL的核苷酸序列可由本领域技术人员从基因库(GeneID:8743,Pitti.R.M.etal.,J.Biol.Chem.271:12687,1996)获取信息而容易地制备。
本发明中，分泌信号序列起到能够使TRAIL蛋白向细胞外部分泌的引导作用。因TRAIL蛋白表达于细胞表面上，因此其不具有自身的分泌信号序列，已知TRAIL胞外结构域通过TRAIL蛋白诱导细胞凋亡信号。本发明中，使用分泌信号序列以便使十二聚体结构的TRAIL蛋白向胞外结构域分泌，从而增加抗癌效果，并且可以使编码该分泌信号序列的核苷酸序列位于编码十二聚体形成结构域的核苷酸序列的5’上游区。上述分泌信号序列的实例可包括但不限于，tPA、HSV、gDs、SEC2、SEC(CV)等，可以优选使用tPA(组织纤溶酶原激活剂)。
在本发明的一个实施方案中，使用tPA作为上述分泌信号序列，tPA为具有优异的分泌诱导性的分泌信号序列，且能够将本发明的十二聚体TRAIL蛋白向胞外结构域更有效地分泌出去。
本发明中，十二聚体形成结构域有助于使TRAIL蛋白形成为十二聚体，以便通过TRAIL蛋白多聚化将其制备成稳定形态，为此，使编码上述十二聚体形成结构域的核苷酸序列位于编码TRAIL蛋白的核苷酸序列的5’上游区。上述十二聚体形成结构域优选为，但不限于SPD(表面活性蛋白D)。
如上所述，编码本发明的十二聚体TRAIL的核苷酸序列可由编码分泌信号序列的核苷酸序列、编码十二聚体形成结构域的核苷酸序列及编码TRAIL的核苷酸序列组成。本发明的一个实施方案中，将SEQIDNO.4的编码tPA分泌信号序列的核苷酸序列、SEQIDNO.5的编码SPD十二聚体形成结构域的核苷酸序列，以及SEQIDNO.6的编码TRAIL核苷酸序列化学合成，从而制备密码子优化的编码十二聚体人TRAIL的核苷酸序列，最终制得SEQIDNO.1的tPA-SPD-TRAILDNA盒。本发明的编码十二聚体TRAIL的核苷酸序列可以优选为具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。
本发明中，术语“自杀基因”是能够诱导细胞凋亡的基因，且其优选为但不限于HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)，可以更优选为HSV-TK。此外，上述HSV-TK可以优选为由SEQIDNO.2表示的密码子优化的HSV-TK。
本发明的编码十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白的核苷酸序列可以原原本本地使用与野生型相同的序列，但可以优选使用十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白的基因密码子优化的序列，以增加哺乳类特别是人细胞内蛋白的表达频率。上述“基因密码子优化的序列”或本发明中使用的术语“密码子优化”是指，用增加哺乳类特别是人细胞内目标蛋白表达水平的密码子取代编码目标蛋白(例如，本发明的十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白等)的氨基酸密码子中的一些氨基酸密码子。这种一些氨基酸密码子的取代可由本领域技术人员进行多种组合并应用。本发明中，可以将编码十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白的以下密码子中的一个或多个取代为在人细胞内被高频率识别的密码子：编码丙氨酸(Ala:A)、精氨酸(Arg:R)、天冬酰胺(Asn:N)、天冬氨酸(Asp:D)、半胱氨酸(Cys:C)、谷氨酰胺(Gln:Q)、谷氨酸(Glu:E)、甘氨酸(Gly:G)、甘氨酸(His:H)、异亮氨酸(Ile:I)、亮氨酸(Leu:L)、赖氨酸(Lys:K)、苯基丙氨酸(Phe:F)、脯氨酸(Pro:P)、丝氨酸(Ser:S)、苏氨酸(Thr:T)、缬氨酸(Val:V)及酪氨酸(Tyr:Y)的密码子。
本发明的具体实施方案中，对编码tPA分泌信号序列的核苷酸序列中的1～23号核苷酸进行密码子优化，并将优化所得的序列表示为SEQIDNO.4，所述编码tPA分泌信号序列的核苷酸序列组成编码十二聚体TRAIL的核苷酸序列，并且对编码十二聚体形成结构域的SPD核苷酸序列中的78号～314号核苷酸进行密码子优化，将优化所得的序列表示为SEQIDNO.5，将密码子优化后的编码TRAIL的核苷酸序列表示为SEQIDNO.6。由此，将密码子优化后的编码十二聚体TRAIL及HSV-TK的核苷酸序列分别表示为SEQIDNO.1和2。因此，与野生型相比，上述密码子优化后的编码十二聚体TRAIL及HSV-TK的核苷酸序列能够显示出更高的蛋白表达水平，因而可以具有优异的诱导抗癌基因分泌的能力。
本发明的DNA盒还可在编码上述十二聚体TRAIL的核苷酸序列及自杀基因核苷酸序列之间，包含转录/翻译起始核苷酸序列。该序列是为了在一个载体上同时表达两种基因的序列，可以优选使用IRES序列、9-nt序列或双元启动子系统，更优选可以使用IRES序列。
本发明中术语“IRES(internalribosomeentrysite)”也被称为内部核糖体进入位点，是指核糖体直接与其结合的存在于mRNA内部的特定区域以便能够在真核细胞中由单个mRNA合成多种蛋白，并且起到能够同时表达本发明的十二聚体TRAIL及自杀基因的作用。在本发明的一个实施方案中，表示为SEQIDNO.3的IRES序列与编码十二聚体TRAIL及HSV-TK的核苷酸序列被化学合成，从而制备dTRAIL-IRES-TK盒(图1)。
在另一个方面，本发明提供包含上述DNA盒的重组表达载体。
本发明的载体作为能够在宿主细胞内表达目的蛋白，即十二聚体TRAIL及自杀基因蛋白的重组表达载体，可以包含必要的调控元件，基因插入物(上述DNA盒)可操作性地与其连接以使所述基因插入物被表达。
本发明中术语“可操作地连接”是指核苷酸表达控制序列和编码目的蛋白的核苷酸序列被功能性连接，以执行一般功能。可以利用本领域公知的基因重组技术来制备与重组表达载体的可操作性连接，可以使用本领域周知的酶来实施特定位点上的DNA裂解及连接。载体可包含启动子、操纵基因、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号及增强子等表达调控元件。起始密码子及终止密码子通常被视为编码靶蛋白的核苷酸序列的一部分，其为在被给予基因构建体的个体中显现出功能所必需的，并且必须与所述编码序列在框内(inframe)。
本发明的载体可包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体及病毒载体等，但不限于此，优选病毒载体，更优选腺病毒载体。腺病毒载体作为转染各种细胞的效率优异的载体，是在癌症患者的基因治疗中被最广泛使用的载体之一。
本发明所使用的重组腺病毒为5型，并且是缺乏复制所必需的E1A基因的无法自我复制的腺病毒。本发明的一个实施方案中，将通过编码十二聚体TRAIL核苷酸序列、IRES序列及HSV-TK序列的化学合成而制备的DNA盒插入腺病毒穿梭载体中，从而制备能够同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的重组表达载体。
而且，在另一个方面，本发明提供利用上述重组表达载体制备的重组腺病毒。
上述重组腺病毒可以通过以下方法来制备：将包含本发明的DNA盒的源自腺病毒的重组表达载体转导到包装细胞系，培养所述包装细胞，从而收获由包装细胞产生的重组腺病毒。
上述重组腺病毒包括含有诱导型启动子以响应特定化合物来调控表达的诱导型腺病毒。上述诱导型启动子为CMV-Tet10，其表达由四环素诱导。四环素诱导系统在体内最为广泛地被使用，不存在令人担忧的副作用，并且十分经济。
在又一个方面，本发明提供被上述重组腺病毒转染的宿主细胞。本发明的上述宿主细胞同时表达生产十二聚体TRAIL及HSV-TK而能够杀灭癌细胞，并且癌治疗效果优异，从而能够用于癌治疗用细胞治疗剂。
上述宿主细胞可以使用本领域公知的宿主细胞，只要是能够用于细胞治疗剂的宿主细胞，均可使用，可以优选使用干细胞。在上述宿主细胞为干细胞的情况下，可以将其用作癌治疗用干细胞治疗剂。
本发明中术语“干细胞”是指，能够分化为许多种类的细胞并且能够自我更新的细胞，本发明中优选成体干细胞，更优选成体干细胞、间充质干细胞，最优选具有肿瘤趋向特性的人间充质干细胞。
由于间充质干细胞的肿瘤趋向特性，同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的间充质干细胞能够优先向肿瘤移动，从而能够稳定地分泌十二聚体TRAIL，并且HSV-TK将前药转换为毒性物质，并将其传递到相邻的肿瘤细胞中。特别是，相比单聚体TRAIL，十二聚体TRAIL作为分泌型更稳定，并且具有更高的诱导癌细胞凋亡的能力，不仅对于直接将其注射到癌细胞中，而且对于细胞治疗剂制备也特别有用。此外发现，相比仅表达十二聚体TRAIL或HSV-TK的间充质干细胞，同时表达十二聚体TRAIL或HSV-TK的间充质干细胞显示出协同增加的抗癌效果。
在本发明的一个实施方案中，利用重组腺病毒制备同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的间充质干细胞，并且发现在上述间充质干细胞在体外与癌细胞共培养的情况下，癌细胞的特异性细胞凋亡显著增加(图4)，并且在转移性肾癌小鼠模型中，通过给予改造的间充质干细胞，也使肺肿瘤结节减少(图5)，并且小鼠的生存时间显著增加(图6)。由上述结果可知，本发明的细胞，特别是干细胞可以作为用于治疗癌的抗癌细胞治疗剂使用。
在又一个方面，本发明提供包含上述宿主细胞的癌治疗用组合物。如上所述，上述宿主细胞通过同时表达十二聚体TRAIL及自杀基因蛋白使抗癌功效协同增加，从而具有癌治疗效果。
除了上述宿主细胞，能够同时生产本发明的十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白的重组表达载体、利用该载体制备的重组腺病毒也可以包含于本发明的癌治疗用组合物中作为有效成分。
能够被本发明的组合物治疗的癌包括普通的所有癌症，可以包括但不限于能够由本发明的细胞治疗剂诱导癌细胞凋亡的癌。其实例可以包括肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌等周知的所有癌，也可以包括实体癌及转移癌，可以优选为转移癌。本发明的一个实施方案中，利用由肾癌细胞RENCA细胞构建的小鼠模型，确认了癌治疗功效(图5～7)。
本发明的组合物包含药物上可接受的载体，且可以被制备成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆剂、薄片、注射剂等多种剂型。药物上可接受的载体包括任意类型的所有溶剂、分散介质、涂膜剂、抗细菌剂或抗真菌剂、等渗剂和吸收阻碍剂等。有效地用于具有药学活性的成分中的这些介质及材料是公知的。
上述组合物可根据目的制备成适宜的药物组合物形态。
在本发明的具体实施方案中，提供了表达本发明的上述十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白的载体、利用上述载体制备的腺病毒或干细胞作为癌治疗用组合物。上述治疗组合物可以注射到包括人的其它哺乳类。
在具体实施方案中，包含本发明的十二聚体TRAIL和HSV-TK蛋白的组合物可以口服给药或经肌肉内注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、皮下及皮内注射等非口服给药。优选的给药方式及制剂为静脉内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌内注射剂、点滴注射剂、瘤内注射剂等。上述组合物可以单次剂量给药或多次剂量给药。特别是，本发明的组合物可与GCV(更昔洛韦)一起给药或在给予GCV后给药。
此外，上述组合物必须以药学有效量给药。药学有效量可根据给药方式及频率、癌的种类及严重程度、患者的年龄及性别、患者的状态及其它医学领域周知的因素来决定。上述组合物可以单次或多次剂量给药。
此外，在又一个方面，本发明提供包括向疑似患有癌症的个体给予上述癌治疗用组合物的步骤的癌治疗方法。所述癌及癌治疗用组合物与上文描述的相同，并且所述癌治疗用组合物通过同时表达十二聚体TRAIL及自杀基因蛋白使抗癌功效协同增加，从而能够具有癌治疗效果，由此通过将其给予至个体中能够用于癌治疗。
向疑似患有癌症的个体给予的癌治疗用组合物不仅可以包含上述说明的宿主细胞，也可以包含能够同时表达本发明的十二聚体TRAIL及HSV-TK蛋白的重组表达载体和利用上述载体制备的重组腺病毒作为有效成分。
本发明中术语“个体”是指，具有通过给予本发明的癌治疗用药物组合物能够使症状得到改善的癌症的人和马、羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等动物。通过向个体给予上述癌治疗用组合物，能够有效地预防和治疗癌。
本发明的术语“给予/给药”是指，通过某种适宜的方法向个体引入预定的物质，本发明的癌治疗用组合物的给药路径如上所述，只要能够到达目的组织，即可通过任何普通的路径，经口或非经口给药。此外，本发明的癌治疗用组合物可以通过能将活性成分向靶细胞输送的任意器械来给药。
本发明的癌治疗方法还可以包括给予更昔洛韦(GCV)的步骤。上述GCV可以与癌治疗用组合物一起给药或在给予上述癌治疗用组合物之前或之后给药。在本发明的一个实施方案中，在给予本发明的干细胞治疗剂之后，给予GCV，从而评价了癌细胞杀灭及癌治疗功效。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明更加详细地说明。本发明所属技术领域的技术人员应明确，这些实施例只是为了更加详细地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不受限于这些实施例。
实施例1：tPA-SPD-TRAILDNA盒(dTRAIL)的构建
将密码子优化后的tPA分泌信号序列和密码子优化后的SPD十二聚体形成序列以连接形式进行化学合成，所述tPA分泌信号序列具有SEQIDNO.4的核苷酸序列，所述SPD十二聚体形成序列具有SEQIDNO.5的核苷酸序列。在其末端添加KpnI(5')和NotI(3')位点，以使其有效地插入载体中。将tPA-SPD信号序列插入被KpnI和NotI酶切的作为诱导型腺病毒穿梭载体的pShuttle-Tet10载体中，以构建pShuttle-Tet10/tPA-SPD载体。作为诱导型腺病毒穿梭载体的pShuttle-Tet10具有作为诱导型启动子的CMV-Tet10。接着，化学合成具有SEQIDNO.6的核苷酸序列的密码子优化后的人TRAIL(114-281)。同样，在其末端添加了NotI(5')和XbaI(3')位点，以便其有效地插入载体中。之后，将其插入被NotI和XbaI酶切的pShuttle-Tet10/tPA-SPD载体中，以构建pShuttle-Tet10/tPA-SPD-TRAIL，从而制备tPA-SPD-TRAILDNA盒(SEQIDNO.1)。
实施例2：dTRAIL-IRES-TK盒的构建
分别化学合成具有上述实施例1中制备的SEQIDNO.1的核苷酸序列并且密码子优化后的十二聚体人TRAIL序列、具有SEQIDNO.2的核苷酸序列的IRES序列及具有SEQIDNO.3的核苷酸序列并且密码子优化后的HSV-TK序列，从而构建DNA盒(图1)。所构建的DNA盒被插入作为腺病毒穿梭载体的pShuttle载体中，以构建pShuttle/dTRAIL-IRES-TK载体。用PmeI酶切pShuttle/dTRAIL-IRES-TK后，在BJ5183感受态细胞中的无法自我复制的pAd/Easy载体中实施同源重组。之后，利用卡那霉素抗生素来筛选含有dTRAIL-IRES-TK盒的pAd/dTRAIL-IRES-TK。为了精确的确认，用PacI将其酶切，确认35+4.5kb的DNA带。然后，将pAd/dTRAIL-IRES-TK转化到作为包装细胞的293细胞系中，10天后获得表达dTRAIL-IRES-TK盒的重组腺病毒rAd/dTRAIL-IRES-TK。
实施例3：MSC/dTRAIL-TK的TRAIL及HSV-TK表达检测
利用上述实施例2中制备的rAd/dTRAIL-IRES-TK及铁离子对骨髓衍生的鼠间充质干细胞(rBM-MSC)转导30分钟，以制备同时表达上述dTRAIL和HSV-TK的间充质干细胞(MSC)MSC/dTRAIL-TK。转导24小时后，通过蛋白质印迹法并利用细胞溶解产物检测人TRAIL的表达，并通过RT-PCR法检测HSV-TK的表达(图2)。结果发现，制得的MSC/dTRAIL-TK同时表达出TRAIL及HSV-TK。
实施例4：GCV(更昔洛韦)处理对MSC/dTRAIL-TK的细胞存活率及TRAIL表达率的影响
用10、30、100μM的GCV对细胞进行处理，以检测经GCV(更昔洛韦)处理的MSC/dTRAIL-TK的自杀诱导效果。从GCV处理1天之后起，每隔一天用MTS方法检测MSC/dTRAIL-TK的细胞存活率。结果发现，用100μM的GCV处理后经过一周，几乎所有细胞被清除(图3)。
接着，为了检测由如上所述被诱导的MSC/dTRAIL-TK细胞凋亡导致TRAIL的表达减少程度，经过上述浓度的GCV处理后，每隔24小时收集培养液，并通过ELISA(酶联免疫吸附分析)来检测TRAIL的表达。结果发现，随着经GCV/TK处理的改造的MSC细胞的凋亡，TRAIL的表达减少(图3)。
实施例5：检测体外dTRAIL及HSV-TK的共表达导致的显著增加的癌细胞死亡
为了在体外检测同时表达十二聚体TRAIL及HSV-TK的MSC在癌细胞的细胞凋亡中是否具有复合效应(协同效应)，将癌细胞和MSC/dTRAIL-TK共培养，从而分析发生细胞凋亡的细胞和死亡细胞。此时，为了比较，将未表达任何物质的MSC/模拟(Mock)、只表达HSV-TK的MSC/TK及只表达dTRAIL的MSC/dTRAIL共培养作为对照组。为了检测癌细胞特异性细胞凋亡，用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记肾癌细胞RENCA细胞并与上述MSC共培养48小时后，用100μMGCV进行处理。将细胞进一步培养48小时或72小时后，收集所有细胞，再进行Annexin-V和7-AAD染色，用FACS(荧光激活细胞分选器)测定细胞凋亡。结果，相比与MSC/dTRAIL或MSC/TK共培养的细胞，在与MSC/dTRAIL-TK共培养的RENCA细胞中观察到显著增加的癌细胞死亡，特别是确认了在GCV处理72小时后90％以上的癌细胞被清除(图4)。通过这种体外直接共培养实验结果，由本发明的MSC/dTRAIL-TK同时表达十二聚体TRAIL和HSV-TK的情况下，可以确认显现出癌细胞凋亡诱导的协同效应。
实施例6：小鼠转移癌模型中MSC/dTRAIL-TK的癌治疗功效评估
为了RENCA转移癌小鼠模型中评估在体外被证实的MSC/dTRAIL-TK的抗癌效果，给小鼠静脉注射5×105的RENCA细胞，7天后静脉注射相同个数的MSC/dTRAIL-TK。此时，为了比较，使用MSC/EGFP、MSC/dTRAIL、MSC/TK作为对照组。注射2天后，连续7天每天腹腔注射50mg/kgGCV，在注射肿瘤第14天后，观察转移至肺的肿瘤结节(nodule)的数目。结果发现，与MSC/TK及MSC/dTRAIL处理组相比，在MSC/dTRAIL-TK处理组中减少了35％左右的肺肿瘤结节数目(图5)。此外，连续地观察转移癌小鼠的存活率，结果发现，MSC/dTRAIL-TK处理的转移癌小鼠的存活时间延长至80天(图6)。通过上述结果表明，本发明的MSC/dTRAIL-TK在体内动物模型实验中也显现出优异的抗癌效果。
实施例7：通过反复给予MSC/dTRAIL-TK诱导的转移癌的100％治愈率
为了检测通过反复给药是否能够提高MSC/dTRAIL-TK的转移癌治疗功效，在与上述实施例6中相同的小鼠转移癌模型中，在注射肿瘤后第7天给予MSC/dTRAIL-TK，每隔2周给药2次或3次。观察转移癌小鼠的存活率，结果，在给药1次的情况下，90天之前所有转移癌小鼠出现死亡，相反，在给药2次的组中，70％的转移癌小鼠被治愈(图7)。此外，当给予MSC/dTRAIL-TK3次时，100％的转移癌小鼠被治愈。应当指出，转移癌的治愈不仅通过现有的化疗、放射线疗法难以实现，而且也没有报道过仅利用现有基于干细胞的基因治疗获得100％的转移癌治愈率的结果。因此，本发明提供了非常优异及显著的结果。

Claims (12)

1.同时表达十二聚体TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)及自杀基因的具有肿瘤趋向特性的成体干细胞。
2.如权利要求1所述的成体干细胞，其中所述成体干细胞包含编码十二聚体TRAIL的核苷酸序列及自杀基因核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的成体干细胞，其中编码所述十二聚体TRAIL的核苷酸序列由编码分泌信号序列的核苷酸序列、编码十二聚体形成结构域的核苷酸序列以及编码TRAIL的核苷酸序列组成。
4.如权利要求3所述的成体干细胞，其中所述分泌信号序列为tPA(组织纤溶酶原激活剂)。
5.如权利要求3所述的成体干细胞，其中所述十二聚体形成结构域为SPD(表面活性蛋白D)。
6.如权利要求3所述的成体干细胞，其中所述TRAIL为与TRAIL氨基酸全序列中的114～281位氨基酸残基对应的胞外结构域。
7.如权利要求1所述的成体干细胞，其中所述自杀基因选自：HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)。
8.如权利要求1所述的成体干细胞，其中所述自杀基因为HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)。
9.如权利要求2所述的成体干细胞，其中编码所述十二聚体TRAIL的核苷酸序列由SEQIDNO.1的核苷酸序列组成。
10.如权利要求8所述的成体干细胞，其中编码所述HSV-TK的核苷酸序列由SEQIDNO.2的核苷酸序列组成。
11.如权利要求1所述的成体干细胞，其中所述成体干细胞为间充质干细胞。
12.癌治疗用组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的成体干细胞。
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