KR102053385B1 - 12량체 ｔｒａｉｌ 및 ｈｓｖ-ｔｋ 자살유전자를 동시에 발현하는 벡터 및 이를 이용한 항암 줄기세포 치료제 - Google Patents

12량체 ｔｒａｉｌ 및 ｈｓｖ-ｔｋ 자살유전자를 동시에 발현하는 벡터 및 이를 이용한 항암 줄기세포 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열 및 자살유전자 핵산서열을 포함하는 DNA 카세트, 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 재조합 아데노바이러스, 상기 재조합 아데노바이러스로 형질감염된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 카세트가 도입되어 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 생산하는 줄기세포 치료제는 기존 치료제에 비하여 항암 효과가 보다 우수하므로, 다양한 고형암 및 전이암 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

12량체 ＴＲＡＩＬ 및 ＨＳＶ-ＴＫ 자살유전자를 동시에 발현하는 벡터 및 이를 이용한 항암 줄기세포 치료제{Vector coexpressing dodecameric TRAIL and suicide gene HSV-TK, and anticancer stem cell medicine using thereof}
본 발명은 12량체 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand) 및 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase) 자살유전자를 동시에 발현하는 벡터 및 이를 이용한 항암 줄기세포 치료제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열 및 자살유전자 핵산서열을 포함하는 DNA 카세트, 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 재조합 아데노바이러스, 상기 재조합 아데노바이러스로 형질감염된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 조골세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 지방세포(adipocyte) 등으로 분화가 가능한 다분화성 성체 줄기세포로서, 조직재생이 필요한 여러 질환의 치료제로 널리 사용되고 있다. 뿐만 아니라, 중간엽 줄기세포는 생체 내에서 암 병변을 특이적으로 찾아 이동할 수 있는 성질을 가지고 있다고 알려져, 표적형 항암 치료를 위한 전달체로서 최근 각광 받고 있다(Aboody et al., Proc Natl Acad Sci, 97: 12846, 2000). 많은 연구들이 중간엽 줄기세포의 암특이적 이동성을 이용하여 표적형 전이암 치료 연구를 수행해왔다. 실제로, 항암 사이토카인인 IL-12나 IFN-beta, 혹은 온코리틱 바이러스를 중간엽 줄기세포에 탑재하여 전이암 쥐에 전신 투여하였을 때, 전이암의 크기와 쥐의 생존이 증가됨이 보고되었다(Shah et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 2011).
TRAIL은 TNF(tumor necrosis factor) family 단백질로서 선택적으로 암세포의 사멸을 유도할 수 있다는 특징이 알려져 있다(Wiley et al., Immunity, 3(6):673-682, 1995). 실제 TRAIL은 일반 세포에 대해서는 무해하면서, 다양한 암 세포주에 대해서만 독성을 유도한다는 특징들이 밝혀졌다(Ashkenazi et al., J. Clin. Invest.,104:155-162, 1999; Walczak et al., Nat. Med.,5:157-163, 1999). 이러한 일반 세포에 무해한 특성은 일반 세포의 표면에만 존재하는 유인 수용체 1, 2 (DcR1, DcR2)의 기능 때문이다(Sheridan et al., Science,277:81 8-821, 1997). DcR1, DcR2는 TRAIL과 결합이 가능하지만, 세포내 신호 전달 부분이 결여되어 있어서 일반 세포들은 TRAIL에 의한 세포 사멸 유도가 일어나지 않게 된다. 이러한 TRAIL의 선택적인 암세포 사멸 유도 특징은 암치료의 획기적인 매개체로 주목을 받고 있다. 본 발명자들은 선행특허에서, TRAIL을 이용한 효과적인 항암 유전자 치료를 위해 TRAIL 수용체 DR4, DR5와 반응하는 TRAIL의 세포외부 부분(아미노산 114-281)의 아미노 말단에 분비신호서열인 tPA(tissue plasminogen activation) 및 12량체 형성 도메인인 SPD(surfactant protein D)을 연결함으로써 12량체 TRAIL을 고안하였다(국제출원번호 PCT/KR2007/001099).
자살유전자(suicide gene) 치료법은 항암 유전자치료의 방법의 하나로, 암세포에 직접 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 시토신 디아미나제(Cytosin deaminase), 니트로리덕타제(Nitroreductase), 카르복실에스테라제(Carboxylesterase), 시토크롬 P450(Cytochrome P450), PNP(Purine nucleoside phosphorylase) 등의 자살유전자를 전달하는 방법이다. 자살유전자는 일종의 효소를 발현하며, 이 효소는 외부에서 주입된 세포에 무해한 전구약물(prodrug)을 효소반응을 통해 세포독성을 가지는 물질로 바꿈으로써 자살유전자를 가지는 세포뿐만 아니라, 간극연접(gap junction)을 통해 독성물질이 인접한 세포에 전달되어 주위의 세포 사멸을 유도하는 방관자 효과(bystander effect)를 가지는 특징이 있다. 실제로, 자살유전자를 암 조직에서 발현시킨 뒤, 전구체를 생체에 전신적으로 투여했을 때 정상세포에는 독성이 나타나지 않지만 치료유전자가 발현되는 종양세포에만 전구체가 독성물질로 전환되어 종양세포를 파괴할 수 있다(The FASEB journal, 23:1584, 2009).
여러 자살유전자 중에서 HSV-TK는 가장 널리 사용되고 있는 자살유전자로 실제 임상 3상까지 완료된 보고가 있는 효능과 안전성이 입증된 후보물질이다. HSV-TK는 ganciclovir(GCV)라는 전구약물을 인산화시키고, 인산화된 ganciclovir triphosphate(GCV-3P)는 DNA에 끼어들어감으로써 정상적인 유전자의 합성을 방해하여 세포사멸을 유도한다(Moolten et al., Cancer Res. 46: 5276, 1986). GCV-3P의 작용은 빠르게 증식하는 세포에 특이적으로 작용하기 때문에 정상세포에 비해 암세포를 선택적으로 제거할 수 있는 방법이 될 수 있다. 실제 국소부위에 형성된 종양의 경우, 병변부위에 아데노바이러스나 렌티바이러스를 통해 HSV-TK를 전달한 뒤, GCV를 투여하면 암세포 특이적인 세포사멸을 기대할 수 있으며, 암 특이성을 더욱 높이기 위해 암 특이적 프로모터나 바이러스의 향성(tropism)을 변형하는 전략들이 이용되고 있다.
TRAIL 및 HSV-TK는 암세포 특이적인 세포사멸을 유도할 수 있다는 점에서 항암 유전자 치료에 있어 안전성이 우수한 표적형 항암 치료물질 후보로서 중간엽 줄기세포를 이용한 전이암 치료에도 연구가 되고 있지만, 그 단독치료만으로는 항암 효능이 미비하며 성공적인 항암치료를 위한 임상적용에 어려움이 있는 실정이다 (Loebinger et al., Cancer Res, 69: 4134, 2009; Miletic et al. Molecular Ther, 15: 1373, 2007).
이에 본 발명자들은 효능이 우수한 표적형 항암 유전자 치료를 위하여, 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 자살유전자를 동시에 발현하는 벡터를 개발하고 재조합 아데노바이러스를 생산하였으며, 이를 줄기세포에 전달했을 때 다양한 암세포에서 높은 세포사멸 유도 능력을 보임을 확인하였다. 12량체 TRAIL 및 HSV-TK을 동시에 발현하는 줄기세포의 항암효능은 TRAIL, 12량체 TRAIL이나 HSV-TK를 단독으로 발현하는 줄기세포와 비교했을 때보다 시너지스틱하게 증가되었음을 발견하였다. 또한, 중간엽 줄기세포의 암특이적 이동능력을 이용해, 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현하는 중간엽 줄기세포를 생쥐 전이성 신장암 모델에 전신 투여하였을 때, 세포가 전이암 특이적으로 이동할 수 있으며, 전이암의 크기와 숫자를 크게 감소시킴으로써 쥐의 생존율을 연장할 수 있음을 확인하였다. 특히, 12량체 TRAIL과 HSV-TK를 동시에 발현하는 줄기세포 치료제의 반복투여에 의해 항암효과가 월등히 증진되었으며, 3회의 반복투여로 전이암 쥐가 완치됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 12량체 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)을 암호화하는 핵산서열, 및 자살유전자 핵산서열을 포함하는 DNA 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 아데노바이러스로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 12량체 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)을 암호화하는 핵산서열, 및 자살유전자 핵산서열을 포함하는 DNA 카세트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "12량체 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)"은 발현된 TRAIL이 결합하여 12량체(dodecamer)의 구조를 가지는 분비형 TRAIL 단백질을 말하며, 한국공개특허 제10-2009-0015885호에 기재된 방법에 의해 제조된 12량체 TRAIL일 수 있다. 본 발명의 12량체 TRAIL 단백질은 단량체 또는 삼량체 구조의 TRAIL보다 증가된 선택적인 암세포 사멸 유도 활성을 보임을 확인하였다. 본 발명에 있어서 TRAIL 단백질을 12량체 형태로 제조하기 위하여 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산서열이 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산서열의 5' 상부에 위치하도록 하였으며, 단백질의 세포 밖 분비를 위하여 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산서열을 12량체 형성 도메인의 5' 상부에 위치하도록 하였다.
본 발명에서는 12량체 TRAIL을 사용하였으나, 본 발명의 자살 유전자와 함께 발현되어 치료제로 사용되었을 때 시너지스틱한 항암 효과를 나타낼 수 있는 한, 삼량체 이상의 TRAIL 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 분비 신호 서열(secretion signal sequence)을 암호화하는 핵산서열, 12량체 형성 도메인(dodecamer-forming domain)을 암호화하는 핵산서열, 및 TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)"은 아폽토시스라고 불리는 세포 사멸 과정을 유도하는 리간드로서의 기능을 하는 단백질의 하나로서, 본 발명에서 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 사람, 원숭이, 쥐, 생쥐 혹은 다른 종 유래 TRAIL 단백질을 암호화하는 유전자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 사람 TRAIL 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 TRAIL을 암호화하는 핵산서열에서 발현되는 단백질이 TRAIL 수용체 DR4 또는 DR5와 반응하는 활성을 가진다면 TRAIL을 암호화하는 핵산서열의 일부만을 이용할 수 있다. 바람직하게는 TRAIL의 114 내지 281의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 이용할 수 있다. 상기 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 당해 분야의 통상의 지식을 가지는 자가 GenBank(GeneID: 8743, Pitti. R. M. et al., J. Biol. Chem. 271: 12687, 1996)로부터 용이하게 정보를 입수하여, 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에서 분비 신호 서열(secretion signal sequence)은 TRAIL 단백질을 세포외부로 분비될 수 있도록 안내자 역할을 한다. TRAIL 단백질은 원래 세포막에 위치하는 단백질이기 때문에 자체적인 분비 신호 서열을 가지고 있지 않으며, TRAIL 세포 외부 부분은 TRAIL 단백질에 의한 세포사멸 신호를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 12량체 구조의 TRAIL 단백질을 세포 외부로 분비하여 항암 효과를 증대시키기 위하여 분비 신호 서열을 사용하며, 이 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산서열을 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산서열의 5' 상부에 위치하도록 할 수 있다. 상기 분비 신호 서열은 이에 제한되지는 않으나, tPA, HSV, gDs, SEC2, SEC(CV) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 tPA(tissue plasminogen activator)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 분비 신호 서열로서 tPA를 사용하였으며, 이는 우수한 분비 유도성을 가지는 분비 신호 서열로서, 본 발명의 12량체 TRAIL 단백질을 세포 외부로 보다 우수하게 분비시킬 수 있다.
본 발명에서 12량체 형성 도메인은 TRAIL 단백질이 12량체를 형성하도록 한다. 이는 TRAIL 단백질을 다량체화하여 안정한 형태로 만들기 위함이며, 이를 위하여 상기 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산서열이 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산서열의 5' 상부에 위치하도록 하였다. 상기 12량체 형성 도메인은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 SPD(surfactant protein D)를 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산서열, 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산서열 및 TRAIL을 암호화하는 핵산서열로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 4의 tPA 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산서열, 서열번호 5의 SPD 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산서열, 및 서열번호 6의 TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 화학적으로 합성하여 코돈 최적화된 12량체 사람 TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 제조하여, 최종적으로 서열번호 1의 tPA-SPD-TRAIL DNA 카세트를 제조하였다. 본 발명의 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "자살유전자"는 세포사멸을 유도할 수 있는 유전자로서, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 시토신 디아미나제(Cytosin deaminase), 니트로리덕타제(Nitroreductase), 카르복실에스테라제(Carboxylesterase), 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 또는 PNP(Purine nucleoside phosphorylase)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 HSV-TK일 수 있다. 또한, 상기 HSV-TK는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 코돈 최적화된 HSV-TK일 수 있다.
본 발명의 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질을 암호화하는 핵산서열은 야생형과 동일한 서열을 그대로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 포유류, 특히 인간 세포 내에서 단백질의 발현 빈도가 증가하도록 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질의 유전자 코돈을 최적화한 서열을 사용할 수 있다. 상기 "유전자 코돈을 최적화한 서열" 또는 본 발명에서 사용된 용어 "코돈 최적화"는 포유류, 특히 인간 세포 내에서 목적 물질(예를 들어, 본 발명의 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질 등)의 발현량이 증가하도록 목적 물질을 암호화하고 있는 아미노산 코돈 중 일부 아미노산 코돈을 치환하는 것을 말한다. 이러한 아미노산 코돈의 일부 치환은 당업자에 의하여 다양한 조합 및 응용이 가능할 것이다. 본 발명에서는, 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질의 아미노산 코돈, 구체적으로 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 아스파라긴(Asn: N), 아스파테이트(Asp: D), 시스테인(Cys: C), 글루타민(Gln: Q), 글루타메이트(Clu: E), 글리신(Gly: G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile: I), 류신(Leu: L), 라이신(Lys: K), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 세린(Ser: S), 쓰레오닌(Thr: T), 발린(Val: V) 및 타이로신(Tyr: Y)을 암호화하는 하나 이상의 유전자 코돈을 인간 세포에서 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 구성하는 tPA 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산서열에서 1번 내지 23번 뉴클레오타이드를 코돈 최적화하여 이를 서열번호 4로 나타내었고, 12량체 형성 도메인인 SPD를 암호화하는 핵산서열에서 78번 내지 314번 뉴클레오타이드를 코돈 최적화하여 이를 서열번호 5로 나타내었으며, 코돈 최적화된 TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 서열번호 6으로 나타내었다. 그에 따라, 코돈 최적화된 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 암호화하는 핵산서열을 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었다. 따라서, 상기 코돈 최적화된 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 암호화하는 핵산서열은 야생형에 비하여 우수한 발현 정도를 나타낼 수 있으며, 그에 따라 우수한 분비 유도성 또는 항암 효능을 가질 수 있다.
본 발명의 DNA 카세트는 상기 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열 및 자살유전자 핵산서열 사이에 전사/번역 개시 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 이는 하나의 벡터에서 두 유전자를 동시에 발현하도록 하기 위한 서열로서, 바람직하게는 IRES 서열, 9-nt 서열 또는 dual promoter system을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 IRES 서열을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "IRES(internal ribosome entry site)"는 내부리보좀유입점이라고도 하며, 진핵세포에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하도록 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역을 의미하며, 본 발명의 12량체 TRAIL 및 자살유전자를 동시에 발현할 수 있도록 하는 역할을 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 3으로 표시되는 IRES 서열을 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 암호화하는 핵산서열과 화학적으로 합성하여 dTRAIL-IRES-TK 카세트를 제조하였다(도 1).
다른 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질, 즉 12량체 TRAIL 및 자살유전자 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현벡터로서, 유전자 삽입물(상기 DNA 카세트)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적 조절요소를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스 벡터는 다양한 세포에 유전자 전달 효율이 우수한 벡터로, 암 환자의 유전자 치료에 가장 흔하게 사용되는 벡터 중의 하나이다.
본 발명에 사용된 재조합 아데노바이러스는 타입 5이고 복제에 필수 요소인 E1A 유전자가 결여된 복제 불능의 아데노바이러스이다. 본 발명의 일실시예에서는 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열, IRES 서열 및 HSV-TK 서열을 화학적으로 합성하여 제작한 DNA 카세트를 아데노바이러스 셔틀 벡터에 삽입시켜 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 구성하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
상기 재조합 아데노바이러스는 본 발명의 DNA 카세트를 포함하는 아데노바이러스 유래의 재조합 발현벡터를 패키징 세포에 전달하고, 이를 배양하여 패키징 세포로부터 생성된 재조합 아데노바이러스를 수확하는 방법으로 생성이 가능하다.
상기 재조합 아데노바이러스는 유도성 프로모터를 이용해서 특정 물질에 의해 발현을 조절할 수 있는 유도성 아데노바이러스를 포함한다. 상기 유도성 프로모터는 CMV-Tet10이며, 테트라사이클린(tetracyclin)에 의해 발현이 유도된다. 테트라사이클린을 이용한 유도성 시스템은 생체 내에서 가장 광범위하게 사용되고 있으며, 우려할 만한 부작용이 없고 경제성 측면에서도 우수하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 상기 숙주세포는 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현 생산함으로써, 암세포를 사멸할 수 있고 암치료 효능이 우수하여 암 치료용 세포 치료제로 사용될 수 있다.
상기 숙주세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포를 사용할 수 있고, 세포 치료제로 사용 가능한 숙주세포는 어느 것이든 사용할 수 있으며, 바람직하게는 줄기세포를 사용할 수 있다. 상기 숙주세포가 줄기세포일 경우, 암 치료용 줄기세포 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 여러 종류의 세포로 분화 가능하고 자가 재생(self-renewal)이 가능한 세포를 의미하며, 본 발명에서 바람직하게는 태아 줄기세포나 성체 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 성체줄기세포인 중간엽 줄기세포이며, 더욱 바람직하게는 항암 특이적 이동성을 가지는 사람 중간엽 줄기세포이다.
중간엽 줄기세포의 암 특이적 이동능력을 이용하면, 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현하는 중간엽 줄기세포가 암 특이적으로 이동하게 되어, 안정적으로 12량체 TRAIL을 분비할 수 있고, HSV-TK 발현물질에 의해 전구약물을 독성물질로 전환하여 인접한 암세포에 전달할 수 있다. 특히, 12량체 TRAIL은 단량체 TRAIL보다 분비형으로서 안정화되고 암세포 사멸 유도 활성이 증가되어 암세포에 직접 주입하는 것뿐만 아니라, 세포 치료제 제조에 특히 더 유용하다. 또한 12량체 TRAIL 또는 HSV-TK를 단독으로 발현하는 줄기세포와 비교했을 때보다 시너지스틱하게 증가된 항암효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현하는 중간엽 줄기세포를 제작하였으며, 상기 중간엽 줄기세포가 시험관 내에서 암세포와 함께 배양될 경우 암세포 특이적인 세포 사멸이 현저하게 증가됨을 확인하였으며(도 4), 전이성 신장암 마우스 모델에서도 상기 중간엽 줄기세포 투여에 의해 폐 종양 결절이 감소되고(도 5), 생쥐의 생존기간이 현저하게 증가됨을 확인하였다(도 6). 이러한 결과를 통해서 본 발명의 세포, 특히 줄기세포는 암을 치료하기 위한 항암 세포 치료제로서 사용할 수 있음을 알 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다. 상기 숙주세포는 상기에서 설명한 바와 같이, 12량체 TRAIL 및 자살유전자 단백질을 동시에 발현함으로써, 항암 효능이 시너지스틱하게 증가하여 암 치료 효과를 가질 수 있다.
상기 숙주세포뿐만 아니라, 본 발명의 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질을 동시에 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터를 이용하여 제조한 재조합 아데노바이러스 역시 본 발명의 암 치료용 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 일반적인 암 질환들을 모두 포함하며, 본 발명의 세포 치료제에 의하여 사멸이 유도될 수 있는 암세포에 의한 암은 제한 없이 포함할 수 있다. 그 예로, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암, 신장암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 갑상선암 등 일반적으로 알려진 모든 암을 포함할 수 있고, 고형암 및 전이암이 모두 포함될 수 있으며, 바람직하게는 전이암일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 신장암세포인 RENCA 세포에 의한 전이암 마우스 모델을 이용하여 암 치료 효능을 확인하였다(도 5 내지 7).
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 주사제 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 약제학적 수용가능한 담체는 임의 모든 용매, 분산 매체, 피복제, 항균 및 항곰팡이제, 등장액, 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 활성 물질에 대한 이와 같은 매체 및 물질은 공지되어 있다.
상기 조성물은 목적에 따라 적절한 약제학적 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명의 상기 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질을 생산하는 벡터, 상기 벡터를 이용하여 생성된 아데노바이러스 혹은 줄기세포는 암 질환 치료 조성물로 제공된다. 상기 치료 조성물은 사람을 포함하여 다른 포유류에 접종될 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명의 12량체 TRAIL과 HSV-TK 단백질을 포함하는 조성물은 경구 투여, 또는 근육, 정맥, 동맥, 복강, 피하, 피내 등의 비경구 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제, 종양 내에 직접 주사 등이다. 상기 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 GCV(ganciclovir)와 함께 또는 GCV 투여 이후에 투여될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약제학적으로 유효량 투여되도록 한다. 약제학적 유효량은 투여 방법 및 횟수, 암의 종류 및 중증도, 환자의 연령과 성별, 환자의 상태, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 투여 유효량은 결정될 수 있다. 상기 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 암 치료용 조성물을 암 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 상기 암 및 암 치료용 조성물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 암 치료용 조성물은 상기에서 설명한 바와 같이 12량체 TRAIL 및 자살유전자 단백질을 동시에 발현함으로써, 항암 효능이 시너지스틱하게 증가하여 암 치료 효과를 가질 수 있으며, 이에 따라 개체에의 투여를 통해 암 치료 방법에 이용할 수 있다.
암 의심 개체에 투여하는 암 치료용 조성물은 상기에서 설명한 숙주세포뿐만 아니라, 본 발명의 12량체 TRAIL 및 HSV-TK 단백질을 동시에 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터를 이용하여 제조한 재조합 아데노바이러스 역시 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체"는 본 발명에 따른 암 치료용 약제학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 질환인 암을 가진 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 상기 암 치료용 조성물을 개체에 투여함으로써, 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 암 치료용 조성물의 투여 경로는 상기에서 설명한 바와 같이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 암 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 암 치료 방법은 간사이클로비르(ganciclovir, GCV)를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 GCV는 본 발명의 암 치료용 조성물과 함께 또는 상기 암 치료용 조성물 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 줄기세포 치료제 투여 이후에 GCV를 투여하여 암세포 사멸 및 암치료 효능을 평가하였다.
본 발명의 DNA 카세트가 도입되어 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 생산하는 줄기세포 치료제는 기존 치료제에 비하여 항암 효과가 보다 우수하므로, 다양한 고형암 및 전이암 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 사람 12량체 TRAIL 서열, IRES 서열, 및 HSV-TK 서열로 구성된 DNA 카세트(dTRAIL-TK)의 개략도를 나타낸다.
도 2는 dTRAIL-TK DNA 카세트가 도입된 중간엽 줄기세포(MSC/dTRAIL-TK)의 TRAIL 발현 및 HSV-TK 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 dTRAIL-TK DNA 카세트가 도입된 중간엽 줄기세포(MSC/dTRAIL-TK)에 GCV 처리 후 세포생존 및 TRAIL 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 시험관 내 RENCA 세포에서 12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현하는 중간엽 줄기세포(MSC/dTRAIL-TK)의 증진된 암세포 살상능력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 MSC/dTRAIL-TK의 항암 효능을 생쥐 전이성 신장암 모델에서 폐 종양 결절 감소를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 MSC/dTRAIL-TK의 투여에 의하여 연장된 전이성 신장암 생쥐의 생존기간을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 MSC/dTRAIL-TK의 반복투여에 의한 전이성 신장암 생쥐의 증가된 생존율 및 완치율을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1: tPA-SPD-TRAIL DNA 카세트(dTRAIL)의 구성
서열번호 4의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 tPA 분비 신호 서열과 서열번호 5의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 SPD 12량체(dodecamer) 형성 서열을 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하기 위해 말단에 KpnI(5')과 NotI(3') 사이트를 첨가하였다. tPA-SPD 신호 서열을 KpnI과 NotI으로 절단된 유도성 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-Tet10 벡터에 삽입시켜 pShuttle-Tet10/tPA-SPD 벡터를 구성하였다. 유도성 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-Tet10은 유도성 프로모터인 CMV-Tet10을 가지고 있다. 이어서 서열번호 6의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 사람 TRAIL(114-281)을 화학적으로 합성하였다. 마찬가지로 벡터 삽입을 용이하게 하기 위해 말단에 NotI(5')과 XbaI(3') 사이트를 첨가하였다. 이 후 NotI과 XbaI으로 절단된 pShuttle-Tet10/tPA-SPD 벡터에 삽입하여 pShuttle-Tet10/tPA-SPD-TRAIL을 구축하여, tPA-SPD-TRAIL DNA 카세트를 제조하였다(서열번호 1).
실시예 2: dTRAIL-IRES-TK 카세트의 구성
상기 실시예 1에서 제조한 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 12량체 사람 TRAIL 서열, 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 IRES 서열, 및 서열번호 3의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 HSV-TK 서열을 각각 화학적으로 합성하여 DNA 카세트를 제작하였다(도 1). 제작된 DNA 카세트는 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle 벡터에 삽입시켜 pShuttle/dTRAIL-IRES-TK 벡터를 구성하였다. pShuttle/dTRAIL-IRES-TK를 PmeI으로 절단한 후 복제 불가능한 pAd/Easy 벡터와 BJ5183 컴피턴트 세포(competent cell)에서 상동 재조합(homologous recombination) 반응을 수행하였다. 이후 카나마이신(Kanamycin) 항생제를 이용하여 dTRAIL-IRES-TK 카세트가 내재된 pAd/dTRAIL-IRES-TK를 선별하였다. 정확한 확인을 위해 PacI으로 절단하여 35+4.5kb의 DNA 밴드를 확인하였다. 그리고 pAd/dTRAIL-IRES-TK를 패키징 세포인 293 세포주에 형질전환시켜 10일 후 dTRAIL-IRES-TK 카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스 rAd/dTRAIL-IRES-TK를 얻었다.
실시예 3: MSC/dTRAIL-TK의 TRAIL 및 HSV-TK 발현 확인
상기 dTRAIL 및 HSV-TK를 모두 발현하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)인 MSC/dTRAIL-TK 제작을 위해, 상기 실시예 2에서 제조한 rAd/dTRAIL-IRES-TK 및 철이온을 이용하여 30분 동안 골수 유래 쥐 중간엽 줄기세포(rBM-MSC)를 감염하였다. 감염 24시간 후, 세포 파쇄물(cell lysate)을 이용하여 사람 TRAIL의 발현을 웨스턴 블랏팅(westernblotting) 방법으로 확인하였고, HSV-TK의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인하였다(도 2). 그 결과, 제작된 MSC/dTRAIL-TK는 TRAIL 및 HSV-TK를 발현함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: GCV(ganciclovir) 처리에 의한 MSC/dTRAIL-TK의 세포 생존율 및 TRAIL 발현율 확인
GCV(ganciclovir) 처리에 의한 MSC/dTRAIL-TK의 자살유도효과를 확인하기 위해 10, 30, 100 μM의 GCV를 세포에 처리하였다. GCV 처리 1일 후부터 2일 간격으로 MSC/dTRAIL-TK의 세포 생존율을 MTS 방법으로 확인하였다. 실험 결과, 100 μM의 GCV를 처리한 후 일주일이 지났을 때 거의 모든 세포가 제거되는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
다음으로, 상기와 같이 유도된 MSC/dTRAIL-TK 세포사멸에 의해 TRAIL의 발현이 감소되는 정도를 확인하기 위하여, 위와 같은 농도의 GCV 처리 후 24시간 간격으로 배양액을 모아 TRAIL의 발현을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 확인하였다. 실험 결과, GCV/TK 처리에 의한 세포사멸에 따라 TRAIL 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 5: 시험관 내에서 dTRAIL 및 HSV-TK 동시 발현에 의해 현저하게 증가된 암세포 사멸 확인
12량체 TRAIL 및 HSV-TK를 동시에 발현하는 MSC가 암세포 세포사멸에 있어서 복합효과(시너지 효과)가 있는지를 in vitro 상에서 확인하기 위하여, 암세포와 MSC/dTRAIL-TK를 함께 배양하여 세포사멸이 일어난 세포와 죽은 세포를 분석하였다. 이때, 비교를 위하여 대조군으로서 아무것도 발현하지 않는 MSC/Mock, HSV-TK만을 발현하는 MSC/TK, 및 dTRAIL만을 발현하는 MSC/dTRAIL를 함께 배양한 군을 사용하였다. 암세포 특이적인 세포사멸을 확인하기 위하여, CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)를 표시하여 상기 MSC를 신장암세포인 RENCA 세포와 48시간동안 배양한 후, GCV 100μM를 처리하였다. 48시간 혹은 72시간동안 추가적으로 배양을 시킨 후, 모든 세포를 모은 뒤, Annexin-V와 7-AAD 염색을 하여 세포사멸을 FACS(fluorescense activated cell sorter)로 측정하였다. 그 결과, MSC/dTRAIL 혹은 MSC/TK와 함께 배양된 세포에 비해 MSC/dTRAIL-TK가 처리된 RENCA 세포에서 현저하게 증가된 암세포 사멸이 관찰되었으며, 특히 72시간째는 90% 이상의 암세포가 제거됨을 확인하였다(도 4). 이러한 in vitro direct co-culture 실험결과를 통하여, 본 발명의 MSC/dTRAIL-TK에 의해 12량체 TRAIL과 HSV-TK가 동시에 발현되는 경우, 암세포 사멸 유도의 시너지 효과가 나타난다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 생쥐 전이암 모델에서 MSC/dTRAIL-TK의 암치료 효능 평가
In vitro에서 입증된 MSC/dTRAIL-TK의 항암 효과를 RENCA 전이암 마우스 모델에서 확인하기 위하여, 5x105의 RENCA 세포를 정맥주사를 하고, 7일 뒤 동일한 수의 MSC/dTRAIL-TK를 정맥주사 하였다. 이때, 비교를 위하여 대조군으로서 MSC/EGFP, MSC/dTRAIL, MSC/TK를 사용하였다. 2일 후, 50mg/kg GCV를 7일간 매일 복강주사를 하였으며, 종양을 주사한지 14일째에 폐에 전이된 종양 결절(nodule)의 수를 관찰하였다. 그 결과, MSC/TK 및 MSC/dTRAIL 투여 그룹에 비하여 MSC/dTRAIL-TK 투여 그룹에서 35% 정도의 폐 종양 결절 감소를 확인하였다(도 5). 또한, 전이암 생쥐의 생존률을 지속적으로 관찰한 결과, MSC/dTRAIL-TK 투여에 의하여 전이암 생쥐의 생존기간이 80일까지 연장되는 것을 확인할 수 있었다(도 6). 이러한 결과를 통하여, 본 발명의 MSC/dTRAIL-TK가 in vivo 동물 모델을 이용한 실험에서도 우수한 항암 효과를 나타낸다는 확인할 수 있었다.
실시예 7: MSC/dTRAIL-TK의 반복 투여에 의해 유도된 전이암의 100% 완치율
반복 투여를 통해 MSC/dTRAIL-TK의 전이암 치료효능을 증진시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6에서와 동일한 생쥐 전이암 모델에서 MSC/dTRAIL-TK를 종양 투여 후, 7일째부터 2주 간격으로 2회 혹은 3회 투여하였다. 전이암 생쥐의 생존율을 관찰한 결과, 1회 투여했을 경우 90일 이전에 모든 전이암 생쥐가 죽는 반면, 2회 투여한 그룹에서는 생쥐들의 70%가 완치되었음을 확인하였다(도 7). 또한, MSC/dTRAIL-TK를 3회 투여한 전이암 생쥐는 100%가 완치되었음을 알 수 있었다. 전이암의 완치는 기존 화학요법, 방사선요법으로 치료가 매우 어려울 뿐 아니라, 기존 유전자 치료를 단독으로 이용한 전이암 치료연구에서 완치율 100%의 결과를 얻은 보고가 없다는 점에서 본 연구의 결과는 매우 우수하고 차별화된 결과라고 할 수 있다.
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Artificial Sequence <220> <223> sequence for codon optimized HSV-TK <400> 2 atggccagct acccctgtca ccagcacgcc agcgccttcg accaggccgc tagaagcaga 60 ggccacagca acagaagaac cgccctgaga cccagaagac agcaggaggc cacagaggtg 120 agactggagc agaagatgcc caccctgctg agagtgtaca tcgatggacc ccacggcatg 180 ggcaagacca caacaaccca gctgctggtg gccctgggca gcagagacga catcgtgtac 240 gtgcccgagc ccatgaccta ctggcaggtg ctgggagcca gcgagaccat cgccaacatc 300 tacaccacac agcacagact ggaccagggc gagatcagcg ccggcgacgc tgccgtggtg 360 atgaccagcg cccagatcac aatgggcatg ccctacgccg tgaccgatgc cgtgctggct 420 ccccacgtgg gcggagaggc cggcagcagc cacgcccctc cccctgccct gaccctgatc 480 ttcgacagac accccatcgc cgccctgctg tgctaccccg ccgctagata cctgatgggc 540 agcatgacac cccaggccgt gctggccttc gtggccctga tcccccctac cctgcccggc 600 accaacatcg tgctgggcgc cctgcccgag gacagacaca tcgacagact ggctaagaga 660 cagagacccg gcgagagact ggacctggcc atgctggccg ccatcagaag agtgtacggc 720 ctgctggcca acaccgtgag atacctgcag ggaggcggca gctggtggga ggactggggc 780 cagctgagcg gcaccgccgt gcctccccag ggcgccgagc cccagagcaa cgccggccct 840 agaccccaca tcggcgacac cctgttcacc ctgtttagag cccccgagct gctggccccc 900 aacggcgacc tgtacaacgt gttcgcctgg gccctggacg tgctggccaa gagactgaga 960 cccatgcacg tgttcatcct ggactacgac cagagccccg ccggctgcag agatgccctg 1020 ctgcagctga ccagcggcat ggtgcagacc cacgtgacca cacccggcag catccccacc 1080 atctgcgacc tggccagaac ctttgccaga gagatgggcg aggccaactg a 1131 <210> 3 <211> 586 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence for IRES <400> 3 gaattccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 60 ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 120 ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 180 caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 240 aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 300 gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 360 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 420 caacaagggg 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cttcgagctg 420 aaagaaaatg accggatttt cgtgagcgtg accaacgagc acctgattga tatggaccac 480 gaggccagct tcttcggggc attcctggtg ggttga 516

Claims (17)

12량체 TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) 및 자살유전자를 발현하는 줄기세포.
제1항에 있어서, 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열 및 자살유전자 핵산서열을 포함하는 것인, 줄기세포.
제2항에 있어서, 상기 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 분비 신호 서열 (secretion signal sequence) 을 암호화하는 핵산서열, 12량체 형성 도메인 (dodecamer-forming domain) 을 암호화하는 핵산서열, 및 TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것인, 줄기세포.
제3항에 있어서, 상기 분비 신호 서열은 tPA(tissue plasminogen activator)인 것인, 줄기세포.
제3항에 있어서, 상기 12량체 형성 도메인은 SPD(surfactant protein D)인 것인, 줄기세포.
제3항에 있어서, 상기 TRAIL은 TRAIL 단백질 전체 서열에서 114 내지 281 아미노산 서열 범위에 상응하는 세포외부 도메인인 것인, 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 자살유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)인 것인, 줄기세포.
제2항에 있어서, 상기 12량체 TRAIL을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1의 핵산서열을 포함하는 것인, 줄기세포.
제7항에 있어서, 상기 HSV-TK를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 2의 핵산서열을 포함하는 것인, 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인, 줄기세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 줄기세포를 포함하는, 암 치료용 조성물.
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