KR20200001596A - 인위적으로 조작된 조작면역세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역세포를 인위적으로 조작하기 위한 면역세포 조작용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 면역세포를 인위적으로 조작하기 위한 면역세포 조작용 조성물 및 이를 이용한 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및 인공 수용체를 포함하는 조작면역세포 생산 및 이용에 관한 것이다.

Description

인위적으로 조작된 조작면역세포
본 발명은 면역 조절 유전자의 인위적인 조작 또는 변형에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 유전자 조작용 조성물 및 인위적으로 조작된 면역 조절 유전자를 포함하는 면역세포에 관한 것이다.
세포치료제는 손상되었거나 질병이 있는 세포/조직을 회복시키기 위해 살아있는 세포를 사용해 재생을 유도하는 의약품으로서, 자가, 동종, 이종 세포를 체외에서 배양·증식하거나 선별하는 등 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품을 말한다.
그 중에서, 면역조절 세포치료제란 수지상세포(dendritic cell), 자연 살해 세포(natural killer cell), T 세포 등 면역세포를 이용하여 체내의 면역반응을 활성화시켜 질병을 치료할 목적으로 사용되는 의약품이다.
현재, 면역조절 세포치료제는 주로 암 치료를 적응증으로 개발되고 있으며, 환자에게 직접 면역세포를 투여하여 면역 기능을 활성화하여, 치료 효과를 얻기 때문에 기존의 암 치료에 이용되는 수술 요법, 항암제나 방사선 치료와는 차별화되는 치료 기전 및 효능으로, 향후 바이오 신약의 주요한 부분을 차지할 것으로 예상되는 분야이다.
면역조절 세포치료제의 종류에 따라서 세포에 도입하는 항원의 물리·화학적 특징이 서로 다르고, 면역 세포에 외래 유전자가 바이러스 벡터 등으로 도입되는 경우 세포치료제이자 유전자치료제라는 두 가지 모두의 특징을 가지게 된다.
상기 면역조절 세포치료제는 채집(apheresis)를 통해 환자로부터 분리한 PBMC(pheripheral blood mononuclear cell), T 세포, NK세포 등 다양한 면역세포를 다양한 항체 및 사이토카인으로 활성화 시킨 뒤, 이를 체외에서 증식시켜 다시 환자에게 주입하거나, TCR (T-Cell Receptor)이나 CAR (Chimeric Antigen Receptor) 등의 유전자를 도입한 면역세포를 환자에게 다시 주입하는 방식으로 이루어진다.
엑스 비보(ex vivo)에서 만들어내는 자기유래(autologous) 항원-특이적 면역세포(예를 들어, T 세포)들의 전달을 수반하는 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)은 암뿐만 아니라 다양한 면역 질환을 치료하는 유망한 전략이 될 수 있을 것이다.
최근 면역세포치료제가 항암 기능뿐 아니라 자가면역 억제제 등으로 다양하게 활용될 수 있다는 것이 보고된 바, 면역세포치료제는 면역 반응을 조절함으로써 다양한 적응증에 사용될 수 있다. 따라서, 입양 면역요법에 사용되는 조작된 면역 세포의 치료 효능의 개선 및 개발 요구가 매우 큰 실정이다.
본 발명은 일 구체예로서 면역세포를 인위적으로 조작하기 위한 면역세포 조작용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구체예로서 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및 하나 이상의 인공 수용체를 포함하는 조작면역세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구체예로서 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및 하나 이상의 인공 수용체를 포함하는 조작면역세포를 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구체예로서 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및 하나 이상의 인공 수용체를 포함하는 조작면역세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 치료 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 면역세포를 인위적으로 조작하기 위한 면역세포 조작용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 면역세포를 인위적으로 조작하기 위한 면역세포 조작용 조성물 및 이를 이용한 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및 인공 수용체를 포함하는 조작면역세포 생산 및 이용에 관한 것이다.
본 발명은 특정 목적을 위해 면역세포 조작용 조성물을 제공한다.
“면역세포 조작용 조성물”은 면역세포를 인위적으로 조작 또는 변형시키기 위해 사용되는 하나 이상의 DNA, RNA, 핵산, 단백질, 바이러스, 화합물 등의 물질을 의미한다.
구현예에서, 면역세포 조작용 조성물은 다음을 포함할 수 있다:
PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자의 표적 서열과 결합을 형성할 수 가이드핵산 및
자연발생적으로 존재하지 않는 인위적으로 생성된 수용체인 인공 수용체.
“면역 조절 유전자(immunity regulating gene)”는 면역기능 또는 면역반응의 형성 및 수행과 관련된 기능을 하는 직접적으로 참여하거나 또는 간접적으로 영향을 미치는 모든 유전자를 의미한다. 본 발명에서 면역 조절 유전자는 면역세포뿐만 아니라, 면역세포와 상호작용할 수 있는 식세포 등의 기능 조절에 직접적으로 참여하거나 또는 간접적으로 영향을 미치는 모든 유전자를 포함한다. 이때, 상기 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자 자체 또는 면역 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역기능 또는 면역반응의 형성 및 수행과 관련 기능을 수행할 수 있다.
"인공 수용체(artificial receptor)"는 야생형 수용체가 아닌 인위적으로 만들어진, 항원에 대한 인식능력을 가지며 특정한 기능을 하는 기능체를 의미한다.
상기 면역세포 조작용 조성물은 선택적으로 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에디터단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 3'-UTR(Untranslated Region), 또는 5'-UTR의 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 핵산서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 PAM 서열은 다음의 서열 중 1 이상인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물:
5'-NGG-3'(N은 A, T, C 또는 G임);
5'-NNNNRYAC-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
5'-NNAGAAW-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
5'-NNNNGATT-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
5'-NNGRR(T)-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임); 및
5'-TTN-3' (N은 A, T, C 또는 G임).
일 구체예로서, 상기 표적 서열은 서열번호 1 내지 289번 중 선택된 1 이상인 것일 수 있다.
상기 가이드핵산은 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 할 수 있는 가이드 도메인을 포함하며, 이때, 상기 상보적 결합은 0 내지 5개의 미스매칭(mismatching) 결합을 포함할 수 있다.
이때, 상기 가이드 도메인은 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 0 내지 5개의 미스매칭을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
상기 인공 수용체는 하나 이상의 항원에 결합 특이성을 가지는 것일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 항원은 암세포 및/또는 바이러스 특이적으로 발현되는 항원일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen)일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 항원은 A33, ALK, 알파페토단백질(AFP), 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3), alpha-folate receptor, AD034, AKT1, BCMA, 베타-인간 융모막 고나도트로핀, B7H3(CD276), BST2, BRAP, CD5, CD13, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44v6, CD52, CD72, CD79a, CD79b, CD89, CD97, CD123, CD138, CD160, CD171, CD179a, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CA-125, 발암배아성 항원(CEA), CCR4, C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1), 클라우딘 6(CLDN6), CXORF61, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, ERBB2, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 신장 인자 2 돌연변이된(ELF2M), 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2), EMR2, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3), FCRL5, Fibulin-1, G250, GD2, 당단백질 36(gp36), 당단백질 100(gp100), 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), GPRC5D, GloboH, G 단백질-결합된 수용체 20(GPR20), GPC3, hsp70-2, 고분자량-흑색종-관련 항원(HMWMAA), A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1), 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6), 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7), HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Galectin9, HOM-MEEL- 40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB 1, 인슐린 성장 인자(IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2), 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra), IGLL1, KIT(CD117), KM-HN-3, KM-KN- 1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGA-1a, LAGE-1, LAIR1, LILRA2, LY75, Lewis Y antigen, MUC1, MN-CA IX, M-CSF, MAGE-1, MAGE-4a, 메소텔린, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MART1, MPPl 1, MSLN, 신경세포 부착 분자(NCAM), NY-ESO-1, NY-ESO-5, Nkp30, NKG2D, 유선 분화 항원(NY-BR-1), NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NNP-1, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK1 1, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2), OGFr, PSMA, 전립선 산성 포스파타제(PAP), p53, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 프로테아제세린 21(테스티신 또는 PRSS21), 혈소판-유래된 성장인자 수용체 베타(PDGFR-beta), PLAC1, 파넥신 3(PANX3), PLU-1, ROR-1, RAGE-1, RU1, RU2, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4), SCP1, SSX3, SSX4, SSX5, Tyrp-1, TAG72, 티로글로불린, 인간 텔로머라제역전사효소(hTERT), 5T4, 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제(Tyrosinase), 트랜스글루타미나제 5(TGS5), TEM1, TEM7R, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), Tie 2, TRP-2, TOP2A, TOP2B, 유로플라킨 2(UPK2), 비멘틴(Vimentin), 혈관 내피성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름 종양 단백질(WT1) 및 루이스(Y) 항원으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 인공 수용체는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)일 수 있다.
상기 인공 수용체는 인위적으로 조작 또는 변형된 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)일 수 있다.
상기 가이드핵산, 인공 수용체 및 에디터단백질은 각각을 암호화하는 핵산 서열일 수 있다.
상기 핵산 서열은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
이때, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 인공 수용체 및 에디터단백질은 각각을 암호하는 mRNA 형태일 수 있다.
상기 인공 수용체 및 에디터단백질은 폴리펩타이드 또는 단백질 형태일 수 있다.
상기 면역세포 조작용 조성물이 선택적으로 에디터단백질을 더 포함하는 경우, 가이드핵산 및 에디터단백질은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 형태일 수 있다.
본 발명은 특정 목적을 위해 조작면역세포를 제공한다.
“조작면역세포(manipulated immune cell)”는 자연상태가 아닌 인위적인 조작을 가한 면역세포를 의미한다.
구현예에서, 상기 조작면역세포는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및/또는 이의 발현산물; 및 하나 이상의 인공 수용체 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 내에 인위적인 변형을 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 표적 서열 내에 또는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함할 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실은 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 뉴클레오타이드의 결실일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실은 연속하는 2 내지 50bp 뉴클레오타이드 조각의 결실일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 뉴클레오타이드의 삽입일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 연속하는 5 내지 1000bp 뉴클레오타이드 조각의 삽입일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 면역세포에 포함되지 않는 외부에서 유집된 외인성의 유전자(exogenous gene)일 수 있다.
상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 면역세포의 게놈에 존재하는 내생의 유전자(endogenous gene)일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 동일한 뉴클레오타이드 서열 부위에서 발생하는 것일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열 부위에서 발생하는 것일 수 있다.
상기 발현산물은 mRNA 및/또는 단백질일 수 있다.
상기 발현산물은 인위적으로 조작되지 않은 야생형의 면역세포에서 발현되는 발현산물에 비해 그발현양이 감소되거나 억제된 것일 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작되지 않은 야생형의 면역세포는 인간에게서 분리한 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작되지 않은 야생형의 면역세포는 인위적인 조작을 가하지 전의 면역세포일 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈에 삽입되지 않는 형태로 세포 내에 존재할 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 중 면역 조절 유전자의 3'-UTR, 5'-UTR, 인트론, 엑손, 프로모터 및/또는 인핸서 위치에 삽입될 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 인트론들 중 하나 이상의 인트론에 삽입될 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 엑손들 중 하나 이상의 엑손에 삽입될 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 프로모터들 중 하나 이상의 프로모터에 삽입될 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 인핸서들 중 하나 이상의 인핸서에 삽입될 수 있다.
상기 인공 수용체를 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 인트론, 엑손, 프로모터 및 인핸서를 제외한 부분 중 하나 이상의 부분에 삽입될 수 있다.
상기 조작면역세포는 수지상세포(dendritic cell), T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 CIK 세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인위적으로 조작된 세포일 수 있다.
본 발명은 특정 목적을 위해 하나 이상의 특성을 보이는 조작면역세포를 제공한다.
구현예에서, 상기 하나 이상의 특성은
사이토카인(cytokine) 생성 및/또는 분비 증가;
세포 증식(proliferation); 및
세포독성(cytotoxicity) 증가
로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
이때, 상기 사이토카인(cytokine)은 IL-2, TNFα 및 IFN-γ로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수있다.
상기 조작면역세포 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
본 발명은 특정 목적을 위해 조작면역세포 제조 방법을 제공한다.
구현예에서, 상기 조작면역세포 제조 방법은
(a) 면역세포;
(b) 인공 수용체 발현용 조성물 또는 인공 수용체 단백질; 및
(c) PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작할 수 있는 유전자 조작용 조성물
을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (a) 면역세포는 인체에서 분리한 면역세포 또는 줄기세포로부터 분화시킨 면역세포일 수 있다.
상기 (b) 인공 수용체 발현용 조성물은 인공 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 (c) 유전자 조작용 조성물은
PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역조절인자의 핵산서열 중 서열번호 1 내지 289번의 표적서열에 상동성을 가지거나 또는 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드핵산 또는 가이드핵산을 암호화하는 핵산; 및
스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 에디터단백질 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
이때, 상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 각각 뉴클레오타이드 서열의 형태로 하나 이상의 벡터 형태이거나, 또는 가이드핵산과 에디터단백질이 결합한 가이드핵산-에디터단백질 복합체 형태일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 (a) 면역세포에 (b) 인공 수용체 발현용 조성물과 (c) 유전자 조작용 조성물을 순차적으로 접촉시키거나 또는 동시에 접촉시키는 것일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 하나 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명은 특정 목적을 위해 조작면역세포를 이용한 면역질환 치료 방법을 제공한다.
구현예에서, 상기 면역질환 치료 방법은 조작면역세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 조작면역세포 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 약학적 조성물은 부가적 요소를 추가로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 부가적 요소는 면역체크포인트 저해제(immune checkpoint inhibitor)일 수 있다.
상기 면역체크포인트 저해제(immune checkpoint inhibitor)는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, BTLA, IDO, VISTA, ICOS, KIRs, CD160, CD244 또는 CD39의 저해제일 수 있다.
이때, 상기 부가적 요소는 항원결합매개체, 사이토카인, 사이토카인 분비촉진제 또는 사이토카인 억제제일 수 있다.
이때, 상기 부가적 요소는 조작면역세포를 체내에 전달하기 위한 적절한 담체일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 조작면역세포는 환자의 자가세포 또는 환자의 동종이계세포일 수 있다.
상기 면역질환은 자가면역질환일 수 있다.
이때, 상기 자가면역질환은 이식편대숙주병(GVHD, Graft versus host disease), 루푸스(systemic lupus erythematosus), 셀리악 병(celiac disease), 제1 형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 그레이브스 병(graves disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 건선(psoriasis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 다발성 경화증(muliple sclerosis)일 수 있다.
상기 면역질환은 병원체가 알려졌으나 치료법이 알려지지 않은 난치성 질병일 수 있다.
이때, 상기 난치성 질병은 바이러스 감염 질환, 프리온 병원체 유래 질병 또는 암일 수 있다.
상기 약학적 조성물을 면역질환 환자에 투여하는 단계는 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)의 방법으로 투여될 수 있다.
상기 치료 대상은 인간, 원숭이, 마우스, 래트를 포함하는 포유동물일 수 있다.
도 1-27은 표적 유전자의 인위적인 변형 또는 조작된 형태의 예시를 도식화한 것이다.
도 28은 CRISPR/Cas9을 처리한 139 CAR-T 세포에서의 CAR 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 29는 CRISPR/Cas9 복합체를 전기천공한 후 T 세포의 성장을 보여주는 그래프이다.
도 30은 T 세포에서 CRISPR/Cas9에 의한 특이적으로 DGKs KO을 보여주는 것으로, (A) DGKs의 indel(%) 및 (B) DGKs의 단백질 발현 확인한 그래프이다.
도 31는 Digenome-Seq.를 이용한 각 DGKs를 위한 gRNA의 off-target 사이트를 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 32는 CRISPR/Cas9에 의해 AAVS1 KO된 139 CAR-T 세포의 세포독성 효과를 보여주는 그래프이다.
도 33은 CRISPR/Cas9에 의해 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 (A) 세포독성 효과 및 (B) 사이토카인 분비량을 비교한 그래프이다.
도 34은 (A) U87vIII에서 PDL-1의 발현량, (B) U87 또는 U87vIII 세포와 139 CAR-T 세포와 공배양한 후 T 세포에서 PD-1의 발현량을 비교한 그래프이다.
도 35은 DGKs KO된 139 CAR-T 세포에서의 (A) 칼슘 유입 변화를 나타낸 그래프 및 (B) pERK 단백질의 발현을 확인한 이미지이다.
도 36는 면역억제인자가 존재하는 상태에서 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 세포독성 효과 및 사이토카인 분비량을 비교한 그래프로, (A) TGF-β 존재 상태에서, (B) PEG2 존재 상태에서 각각을 나타내었다.
도 37은 면역억제인자가 존재하는 상태에서 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 effector 기능을 나타낸 그래프이다.
도 38은 면역억제인자가 존재하는 상태에서 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 c259 TCR T 세포의 effector 기능을 나타낸 그래프이다.
도 39는 DGKs KO된 T 세포의 반복적인 항원 노출 환경에서의 effector 기능을 확인하기 위한 실험 설계를 도식하여 나타낸 것이다.
도 40은 반복적인 항원 노출 환경에서 DGKs KO된 T 세포의 세포 증식을 나타낸 것으로, (A) 생존한 세포 수 비교 및 (B) 증식한 세포 수(%)를 비교한 그래프이다.
도 41는 DGKs KO된 T 세포에서 세포 사멸을 유도하는 Fas 매개 활성을 나타낸 것으로, (A) 세포 사멸을 유도하는 활성(Activation Induced Cell Death; AICD, %) 및 (B) Fas의 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 42는 반복적인 종양 접종에 따른 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 사이토카인 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 43은 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 (A) naive T 세포 집단량 및 (B) 이펙터 메모리 T 세포 집단량을 나타낸 그래프이다.
도 44은 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 (A) 이펙터 메모리 조절인자의 발현량, (B) 1형 사이토카인 발현량 및 (C) 2형 사이토카인 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 45은 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포에서 T 세포 고갈과 관련된 마커의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 46는 AAVS1 KO 또는 DGKs KO된 139 CAR-T 세포의 항종양 효과를 나타낸 것으로, (A) 정맥 내 주입시 항종양 효과 및 (B) 종양 내 주입시 항종양 효과 보여주는 그래프와 (C) 각 조건에서의 종양 크기를 비교한 이미지이다.
도 47은 (A, B) in vivo로 주입한 AAVS1, αKO, ζKO, 및 dKO 139 CAR-T cells의 잔존 여부, (C) 각 조건에서의 종양의 크기를 비교하는 그래프 및 (D) 각 조건에서 종양 침투 T 세포(tumor infiltrating T cell)의 수를 나타낸 그패프이다.
도 48은 in vivo로 주입한 AAVS1, αKO, ζKO, 및 dKO 139 CAR-T cells의 (A)IFN-γ, TNFα 양성 세포(%), (B) Ki-67 양성 세포(%), (C) T-bet 양성 세포(%)를 비교한 그래프이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 가이드핵산에 관한 것이다.
“가이드핵산”은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체를 인지하고, 및 에디터단백질과 상호작용할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 의미한다. 이때, 상기 가이드핵산은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체 내의 일부 뉴클레오타이드서열과 상보적인 결합할 수 있다. 또한 상기 가이드핵산의 일부 뉴클레오타이드서열은 에디터단백질의 일부 아미노산과 상호작용하여 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성할 수 있다.
상기 가이드핵산은 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 표적 핵산, 유전자 또는 염색체의 표적 영역에 위치할 수 있도록 유도하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 가이드핵산은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼합의 형태일 수 있고, 5 내지 150개의 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 하나의 연속된 핵산서열일 수 있다.
예를 들어, 하나의 연속된 핵산 서열은 (N)m 일 수 있고, 이때 N은 A, T, C 또는 G, 또는 A, U, C 또는 G이며, m은 1 내지 150의 정수를 의미한다.
상기 가이드핵산은 연속된 핵산서열이 두 개 이상일 수 있다.
예를 들어, 두 개 이상의 연속된 핵산서열은 (N)m과 (N)o 일 수 있고, 이때 N은 A, T, C 또는 G, 또는 A, U, C 또는 G이며, m 및 o는 1 내지 150의 정수를 의미하며, m과 o는 서로 같거나 다를 수 있다.
상기 가이드핵산은 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
상기 도메인은 가이드 도메인, 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인, 꼬리도메인 등의 기능적 도메인일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
이때, 하나의 가이드핵산은 2 이상의 기능적 도메인을 가질 수 있다. 이때, 상기 2 이상의 기능적 도메인은 서로 상이할 수 있다. 또는 하나의 가이드핵산에 포함된 2 이상의 기능적 도메인은 서로 동일할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 가이드핵산은 2 이상의 근위 도메인을 가질 수 있고, 다른 예를 들어, 하나의 가이드핵산은 2 이상의 꼬리도메인을 가질 수 있다. 다만, 하나의 가이드핵산에 포함되어 있는 기능적 도메인이 서로 동일한 도메인이라는 말은 두 기능적 도메인의 시퀀스가 동일하다는 의미는 아니며, 시퀀스가 상이하여도 기능적으로 동일한 기능을 수행하고 있으면 동일한 도메인이라고 할 수 있다.
기능적 도메인에 대해서 이하에서 구체적으로 설명한다.
i) 가이드 도메인
"가이드 도메인"은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 결합을 할 수 있는 도메인으로, 표적 유전자 또는 핵산과의 특이적인 상호작용을 위해 역할한다. 예를 들어, 가이드 도메인은 표적 유전자 또는 핵산의 특정 뉴클레오타이드서열을 가지는 위치로 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 유도하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드 도메인은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 가이드 도메인은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 가이드 도메인은 가이드 서열을 포함할 수 있다.
“가이드 서열”은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열이며, 이때 상기 가이드 서열은 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 가이드 서열은 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드 서열은 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 25개의 뉴클레오타이드서열 또는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 가이드 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열 또는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 가이드 도메인은 추가 뉴클레오타이드서열을 더 포함할 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 가이드 도메인의 기능 향상 또는 저하를 위한 것일 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 가이드 서열의 기능 향상 또는 저하를 위한 것일 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 2내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 4 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 6 내지 10개의 뉴클레오타이드서열 또는 8 내지 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 3개의 뉴클레오타이드서열, 3 내지 6개의 뉴클레오타이드서열 또는 7 내지 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1개의 뉴클레오타이드서열, 2개의 뉴클레오타이드서열, 3개의 뉴클레오타이드서열, 4개의 뉴클레오타이드서열, 5개의 뉴클레오타이드서열, 6개의 뉴클레오타이드서열, 7개의 뉴클레오타이드서열, 8개의 뉴클레오타이드서열, 9개의 뉴클레오타이드서열 또는 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1개의 뉴클레오타이드서열 G(구아닌)일 수 있으며, 또는 2개의 뉴클레오타이드서열 GG일 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 상기 가이드 서열의 5' 말단에 위치할 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 상기 가이드 서열의 3' 말단에 위치할 수 있다.
ii) 제 1 상보적 도메인
"제 1 상보적 도메인"은 이하에서 설명하는 제 2 상보적 도메인에 대해 상보적 뉴클레오타이드서열을 포함하는 도메인으로, 제 2 상보적 도메인과 이중가닥을 형성할 수 있을 정도로 상보성을 가진다. 예를 들어, 제 1 상보적 도메인은 제 2 상보적 도메인에 대해 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 제 1 상보적 도메인은 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다. 이때, 상기 형성된 이중가닥은 에디터단백질의 일부 아미노산과 상호작용하여 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성하는 역할을 할 수 있다.
상기 제 1 상보적 도메인은 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 제 1 상보적 도메인은 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로서, 상기 제 1 상보적 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
iii) 연결 도메인
"연결 도메인"은 두 개 이상의 도메인을 연결하는 뉴클레오타이드서열로, 연결 도메인은 동일한 또는 서로 다른 두 개 이상의 도메인을 연결한다. 연결 도메인은 두 개 이상의 도메인과 공유결합 또는 비공유결합을 할 수 있고, 또는 두 개 이상의 도메인을 공유적 또는 비공유적으로 연결할 수 있다.
상기 연결 도메인은 1 내지 30개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로서, 상기 연결 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열 또는 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로서, 상기 연결 도메인은 1 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
iv) 제 2 상보적 도메인
"제 2 상보적 도메인"은 전술한 제 1 상보적 도메인과 상보적 핵산서열을 포함하는 뉴클레오타이드서열을 포함하는 도메인으로, 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성할 수 있을 정도로 상보성을 가진다. 예를 들어, 제 2 상보적 도메인은 제 1 상보적 도메인에 대해 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 제 2 상보적 도메인은 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다. 이때, 상기 형성된 이중가닥은 에디터단백질의 일부 아미노산과 상호작용하여 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성하는 역할을 할 수 있다.
제 2 상보적 도메인은 제 1 상보적 도메인과 상보적 뉴클레오타이드서열 및 제 1 상보적 도메인과의 상보성이 없는 뉴클레오타이드서열, 예를 들어, 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하지 않는 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있으며, 제 1 상보적 도메인보다 뉴클레오타이드서열의 길이가 길 수 있다.
상기 제 2 상보적 도메인은 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 제 2 상보적 도메인은 1 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 제 2 상보적 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
v) 근위 도메인(proximal domain)
"근위 도메인"은 제 2 상보적 도메인에 근접하게 위치하는 뉴클레오타이드서열이다.
근위 도메인은 근위 도메인 내의 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있으며, 상보적인 뉴클레오타이드서열에 의해 이중가닥을 형성할 수 있다.
상기 근위 도메인은 1 내지 20개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로서, 상기 근위 도메인은 1 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드서열 또는 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로서, 상기 근위 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열 또는 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
vi) 꼬리 도메인
"꼬리 도메인"은 가이드핵산의 양 말단 중 어느 하나 이상의 말단에 위치하는 뉴클레오타이드서열이다.
꼬리 도메인은 꼬리 도메인 내의 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있으며, 상보적인 뉴클레오타이드서열에 의해 이중가닥을 형성할 수 있다.
상기 꼬리 도메인은 1 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 꼬리 도메인은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 30 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 35 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 40 내지 50개의 뉴클레오타이드서열 또는 45 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 꼬리 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 35 내지 40개의 뉴클레오타이드서열, 40 내지 45개의 뉴클레오타이드서열 또는 45 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
한편, 상기 도메인들, 즉, 가이드 도메인, 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인이 포함하는 핵산 서열의 일부 또는 전부는 선택적 또는 추가적으로 화학적 변형을 포함할 수 있다.
상기 화학적 변형은 methylation, acetylation, phosphorylation, phosphorothioate linkage, locked nucleic acid(LNA), 2'-O-methyl 3'phosphorothioate(MS) 또는 2'-O-methyl 3'thioPACE(MSP)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
가이드핵산은 하나 이상의 도메인을 포함한다.
상기 가이드핵산은 가이드 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 연결 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 제 2 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 근위 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 도메인의 개수는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상일 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 가이드 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 연결 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 제 2 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 근위 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 가이드핵산은 하나의 도메인이 중복되어 포함될 수 있다.
상기 가이드핵산은 여러 도메인을 중복 또는 중복시키지 않고 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 같은 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 같은 종류의 도메인은 동일한 핵산서열을 가지거나 또는 서로 다른 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 두 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 두 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 세 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 세 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 네 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 네 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 다섯 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 다섯 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 여섯 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 여섯 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
예를 들면, 가이드핵산은 [가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]으로 구성될 수 있으며, 이때, 두 개의 가이드 도메인은 서로 다른 또는 동일한 표적을 위한 가이드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 두 개의 제 1 상보적 도메인과 두 개의 제 2 상보적 도메인 동일한 핵산서열을 가지거나 다른 핵산서열을 가질 수 있다. 가이드 도메인이 서로 다른 표적을 위한 가이드 서열을 포함하는 경우, 상기 가이드핵산은 두 개의 표적에 특이적으로 결합할 수 있으며, 이때, 특이적 결합을 동시에 일어나거나 순차적으로 일어날 수 있다. 또한, 상기 연결 도메인은 특정 효소에 의해 절단될 수 있으며, 특정 효소의 존재 하에서 상기 가이드핵산은 두 부분 또는 세 부분으로 나누어질 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, 가이드핵산은 gRNA일 수 있다.
gRNA
“gRNA”는 표적 유전자 또는 핵산에 대한 gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 특이적 표적화할 수 있는 RNA를 지칭한다. 또한, 상기 gRNA는 표적 유전자 또는 핵산 특이적 RNA를 의미하며, CRISPR 효소과 결합하여 CRISPR 효소를 표적 유전자 또는 핵산으로 인도할 수 있다.
상기 gRNA는 다수의 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 도메인에 의해 3차원 행태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
gRNA는 단일가닥 gRNA(단일 RNA 분자; single gRNA; sgRNA); 또는 이중 gRNA(하나 초과의 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭될 수 있다.
일 구체예에서, 단일가닥 gRNA는 5'으로부터 3' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 연결 도메인; 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인; 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
다른 일 구체예로서, 이중 gRNA는 5'으로부터 3' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인 및 제 1 상보적 도메인을 포함하는 제 1가닥; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인, 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는 제 2 가닥을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다. 상기 crRNA는 가이드 도메인과 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 tracrRNA는 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 단일가닥 gRNA는 3'으로부터 5' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 자연유래의 제 1 상보적 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 제 1 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 제 1 상보적 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 1 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 상보적 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 제 1 상보적 도메인 또는 유래된 제 1 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 1 상보적 도메인인 경우, 상기 제 1 상보적 도메인은 5'-GUUUUAGAGCUA-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUA-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-GUUUUAGAGCUA(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 1 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 1 상보적 도메인인 경우, 상기 제 1 상보적 도메인은 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU(X)n-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 상보적 도메인은 팔쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17)), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MC2017)), 부티리비브리오 프로테오클라시커스(Butyrivibrio proteoclasiicus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10)), 액시다미노코커스 에스피(Acidaminococcus sp. (BV3L6)), 포르피로모나스 마카캐(Porphyromonas macacae), 라츠노피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (ND2006)), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디이엔스(Prevotella disiens), 모라셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi (237)), 스미이헬라 에스피(Smiihella sp. (SC_KO8D17)), 렙포스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MA2020)), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida (U112)), 캔디다투스 메타노플라즈마 털미툼(Candidatus Methanoplasma termitum) 또는 에유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens)의 제 1 상보적 도메인 또는 유래된 제 1 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 1 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 1 상보적 도메인인 경우, 상기 제 1 상보적 도메인은 5'-UUUGUAGAU-3' 일 수 있고, 또는 5'-UUUGUAGAU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-(X)nUUUGUAGAU-3' 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 5의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 연결 도메인은 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 연결하는 역할을 하는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 연결 도메인은 제 1 상보적 도메인 및 제 2 상보적 도메인과 각각 공유결합 또는 비공유결합을 할 수 있다.
상기 연결 도메인은 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 공유적 또는 비공유적으로 연결할 수 있다.
상기 연결 도메인은 단일가닥 gRNA 분자에 사용하기에 적합하며, 이중 gRNA의 제 1 가닥 및 제 2 가닥과 공유결합 또는 비공유결합 하거나, 또는 제 1 가닥 및 제 2 가닥을 공유적 또는 비공유적으로 연결하여 단일가닥 gRNA을 생성에 사용될 수 있다.
상기 연결 도메인은 이중 gRNA의 crRNA 및 tracrRNA과 공유결합 또는 비공유결합 하거나, 또는 crRNA 및 tracrRNA를 공유적 또는 비공유적으로 연결하여 단일가닥 gRNA를 생성에 사용될 수 있다.
이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 자연유래의 제 2 상보적 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 제 2 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 제 2 상보적 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 2 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 상보적 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 제 2 상보적 도메인 또는 유래된 제 2 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 2 상보적 도메인인 경우, 상기 제 2 상보적 도메인은 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다(밑줄 표시는 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하는 뉴클레오타이드서열). 이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 추가로 (X)n 또는/및 (X)m을 포함, 즉, 5'-(X)n UAGCAAGUUAAAAU(X)m-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n 및 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 상기 n은 1 내지 15의 정수일 수 있고, 상기 m은 1 내지 6일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한 (X)m은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 m개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 m개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 2 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 2 상보적 도메인인 경우, 상기 제 2 상보적 도메인은 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다(밑줄 표시는 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하는 뉴클레오타이드서열). 이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 추가로 (X)n 또는/및 (X)m을 포함, 즉, 5'-(X)n AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU(X)m-3' 또는 5'-(X)n AAGGGACUAAAAU(X)m-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 1 내지 15의 정수일 수 있고, 상기 m은 1 내지 6일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한 (X)m은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 m개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 m개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 상보적 도메인은 팔쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17)), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MC2017)), 부티리비브리오 프로테오클라시커스(Butyrivibrio proteoclasiicus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10)), 액시다미노코커스 에스피(Acidaminococcus sp. (BV3L6)), 포르피로모나스 마카캐(Porphyromonas macacae), 라츠노피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (ND2006)), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디이엔스(Prevotella disiens), 모라셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi (237)), 스미이헬라 에스피(Smiihella sp. (SC_KO8D17)), 렙포스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MA2020)), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida (U112)), 캔디다투스 메타노플라즈마 털미툼(Candidatus Methanoplasma termitum) 또는 에유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens)의 제 2 상보적 도메인 또는 유래된 제 2 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 2 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 2 상보적 도메인인 경우, 상기 제 2 상보적 도메인은 5'-AAAUUUCUACU-3' 일 수 있고, 또는 5'-AAAUUUCUACU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다(밑줄 표시는 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하는 뉴클레오타이드서열). 이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 추가로 (X)n 또는/및 (X)m을 포함, 즉, 5'-(X)nAAAUUUCUACU (X)m-3' 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n 및 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 상기 n은 1 내지 10의 정수일 수 있고, 상기 m은 1 내지 6일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한 (X)m은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 m개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 m개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 제 1 상보적 도메인과 상기 제 2 상보적 도메인은 상보적 결합을 할 수 있다.
상기 제 1 상보적 도메인과 상기 제 2 상보적 도메인은 상기 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다.
상기 형성된 이중가닥은 CRISPR 효소와 상호작용할 수 있다.
선택적으로, 상기 제 1 상보적 도메인은 제 2 가닥의 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 하지않는 추가 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 15개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 또는 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 근위 도메인은 제 2 상보적 도메인의 3' 방향에 위치하는 도메인일 수 있다.
상기 근위 도메인은 자연유래의 근위 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 근위 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 근위 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 근위 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 근위 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 근위 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 근위 도메인 또는 유래된 근위 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 근위 도메인인 경우, 상기 근위 도메인은 5'-AAGGCUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 근위 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-AAGGCUAGUCCG(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 근위 도메인이 캄필로박터 제주니의 근위 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 근위 도메인인 경우, 상기 근위 도메인은 5'-AAAGAGUUUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAGAGUUUGC-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 근위 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-AAAGAGUUUGC(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 40의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 꼬리 도메인은 단일가닥 gRNA 또는 이중 gRNA의 제 1 가닥 또는 제 2 가닥의 3' 말단에 선택적으로 추가될 수 있다.
상기 꼬리 도메인은 자연유래의 꼬리 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 꼬리 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 꼬리 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 꼬리 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 꼬리 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 꼬리 도메인 또는 유래된 꼬리 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 꼬리 도메인인 경우, 상기 꼬리 도메인은 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 꼬리 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 캄필로박터 제주니의 꼬리 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 꼬리 도메인인 경우, 상기 꼬리 도메인은 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 꼬리 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예에서, 상기 꼬리 도메인은 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, T7 프로모터가 gRNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 상기 꼬리 도메인은 DNA 주형의 3' 말단에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한, U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUUUU일 수 있으며, H1 프로모터가 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUU일 수 있고, pol-III 프로모터를 사용하는 경우에는, 상기 꼬리 도메인은 여러 개의 우라실 뉴클레오타이드거나 또는 대안 될 수 있는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
gRNA는 상기에 기재된 바와 같이 다수의 도메인을 포함할 수 있어, gRNA가 포함하는 도메인의 종류 및 개수에 따라 핵산 서열의 길이를 조절할 수 있으며, 각각의 도메인에 의해 3차원 형태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
gRNA는 단일가닥 gRNA(단일 RNA 분자); 또는 이중 gRNA(하나 초과의 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭될 수 있다.
이중 gRNA
이중 gRNA는 제 1 가닥 및 제 2 가닥으로 구성된다.
이때, 상기 제 1 가닥은
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-3'으로 구성될 수 있고,
상기 제 2 가닥은
5'-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-3' 또는
5'-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-[꼬리 도메인]-3'으로 구성될 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥 및 제 2가닥은 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 가닥은
5'-(Ntarget)-(Q)m-3'; 또는
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-3'일 수 있다.
이때, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열로서, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산 상의 표적 서열에 따라 변할 수 있는 뉴클레오타이드서열 부위이다.
이때, 상기 (Q)m은 제 1 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 2 가닥의 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Q)m은 자연에 존재하는 종의 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Q는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 35의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUA-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUA-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 1 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (X)a, (X)b 및 (X)c는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 a, b 및 c는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 가닥은
5'-(Z)h-(P)k-3'; 또는
5'-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-3' 일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 가닥은
5'-(Z)h-(P)k-(F)i-3'; 또는
5'-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-(F)i-3' 일 수 있다.
이때, 상기 (Z)h는 제 2 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 가닥의 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Z)h은 자연에 존재하는 종의 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Z는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 h은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 2 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (P)k는 근위 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 근위 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 P는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 k은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 20의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 근위 도메인이 캄필로박터 제주니의 근위 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAAGAGUUUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAGAGUUUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (F)i는 꼬리 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 F는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 i은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 캄필로박터 제주니의 꼬리 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (F)i는 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, T7 프로모터가 gRNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 상기 꼬리 도메인은 DNA 주형의 3' 말단에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한, U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUUUU일 수 있으며, H1 프로모터가 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUU일 수 있고, pol-III 프로모터를 사용하는 경우에는, 상기 꼬리 도메인은 여러 개의 우라실 뉴클레오타이드거나 또는 대안될 수 있는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (X)d, (X)e 및 (X)f는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 d, e 및 f는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
단일가닥 gRNA
단일가닥 gRNA는 제 1 단일가닥 gRNA 및 제 2 단일가닥 gRNA로 나뉠 수 있다.
제 1 단일가닥 gRNA
제 1 단일가닥 gRNA는 상기 이중 gRNA의 제 1 가닥과 제 2 가닥을 연결 도메인으로 연결한 단일가닥 gRNA이다.
구체적으로, 상기 단일가닥 gRNA는
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-3',
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-3' 또는
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-[꼬리 도메인]-3'으로 구성될 수 있다.
상기 제 1 단일가닥 gRNA는 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 단일가닥 gRNA는
5'-(Ntarget)-(Q)m-(L)j-(Z)h-3';
5'-(Ntarget)-(Q)m-(L)j-(Z)h-(P)k-3'; 또는
5'-(Ntarget)-(Q)m-(L)j-(Z)h-(P)k-(F)i-3'일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 단일가닥 gRNA는
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-3';
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-3'; 또는
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-(F)i-3'일 수 있다.
이때, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열로서, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산 상의 표적 서열에 따라 변할 수 있는 뉴클레오타이드서열 부위이다.
상기 (Q)m은 제 1 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Q)m은 자연에 존재하는 종의 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Q는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 35의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUA-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUA-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 1 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3' 일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (L)j는 연결 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 연결하여 단일가닥 gRNA을 생성할 수 있도록 하는 뉴클레오타이드서열이다. 이때, 상기 L은 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 j은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 30의 정수일 수 있다.
상기 (Z)h는 제 2 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Z)h은 자연에 존재하는 종의 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Z는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 h은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 2 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (P)k는 근위 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 근위 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 P는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 k은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 20의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 근위 도메인이 캄필로박터 제주니의 근위 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAAGAGUUUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAGAGUUUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (F)i는 꼬리 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 F는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 i은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 캄필로박터 제주니의 꼬리 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (F)i는 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, T7 프로모터가 gRNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 상기 꼬리 도메인은 DNA 주형의 3' 말단에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한, U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUUUU일 수 있으며, H1 프로모터가 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUU일 수 있고, pol-III 프로모터를 사용하는 경우에는, 상기 꼬리 도메인은 여러 개의 우라실 뉴클레오타이드거나 또는 대안될 수 있는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (X)a, (X)b, (X)c, (X)d, (X)e 및 (X)f는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 a, b, c, d, e 및 f는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
제 2 단일가닥 gRNA
제 2 단일가닥 gRNA는 가이드 도메인, 제 1 상보적 도메인 및 제 2 상보적 도메인으로 구성되는 단일가닥 gRNA일 수 있다.
이때, 상기 제 2 단일가닥 gRNA는
5'-[제 2 상보적 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[가이드 도메인]-3'; 또는
5'-[제 2 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[가이드 도메인]-3'으로 구성될 수 있다.
상기 제 2 단일가닥 gRNA는 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 단일가닥 gRNA는
5'-(Z)h-(Q)m-(Ntarget)-3'; 또는
5'-(X)a-(Z)h-(X)b-(Q)m-(X)c-(Ntarget)-3'일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 단일가닥 gRNA는
5'-(Z)h-(L)j-(Q)m-(Ntarget)-3'; 또는
5'-(X)a-(Z)h-(L)j-(Q)m-(X)c-(Ntarget)-3'일 수 있다.
이때, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열로서, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산 상의 표적 서열에 따라 변할 수 있는 뉴클레오타이드서열 부위이다.
상기 (Q)m은 제 1 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Q)m은 자연에 존재하는 종의 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Q는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 35의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 1 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-UUUGUAGAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UUUGUAGAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (Z)h는 제 2 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Z)h은 자연에 존재하는 종의 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Z는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 h은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 2 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-AAAUUUCUACU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAUUUCUACU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (L)j는 연결 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 연결하는 뉴클레오타이드서열이다. 이때, 상기 L은 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 j은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 30의 정수일 수 있다.
또한, 상기 (X)a, (X)b 및 (X)c는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 a, b 및 c는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양으로서, 가이드핵산은 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 gRNA일 수 있다.
“면역 조절 유전자(immunity regulating gene)”는 면역기능 또는 면역반응의 형성 및 수행과 관련된 기능을 하는 직접적으로 참여하거나 또는 간접적으로 영향을 미치는 모든 유전자를 의미한다. 본 발명에서 면역 조절 유전자는 면역세포뿐만 아니라, 면역세포와 상호작용할 수 있는 식세포 등의 기능 조절에 직접적으로 참여하거나 또는 간접적으로 영향을 미치는 모든 유전자를 포함한다. 이때, 상기 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자 자체 또는 면역 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역기능 또는 면역반응의 형성 및 수행과 관련 기능을 수행할 수 있다.
상기 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질의 기능에 따라 면역 조절 유전자를 분류할 수 있다. 이하 분설하는 면역 조절 유전자들은 기능에 따른 면역 조절 유전자의 일 예일 뿐이므로, 본 명세서가 포괄하는 면역 조절 유전자들의 종류들을 한정한 것이 아니다. 이하 나열된 유전자는 단 한 종류의 면역 조절 기능만 갖는 것이 아니라, 복수 종류의 기능이 있을 수 있다. 또한, 필요에 따라 2 이상의 면역 조절 유전자를 제공할 수 있다.
일 예로, 상기 면역 조절 유전자는 면역세포 활성 조절 유전자일 수 있다.
“면역세포 활성 조절 유전자(immune cell activation regulating gene)”는 면역 반응의 정도 또는 활성을 조절하는 기능을 하는 유전자로서, 예를 들어, 면역 반응의 정도 또는 활성을 향상 또는 억제하는 기능을 하는 유전자일 수 있다. 이때, 상기 면역세포 활성 조절 유전자는 면역세포 활성 조절 유전자 자체 또는 면역세포 활성 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역 반응의 정도 또는 활성을 조절하는 기능을 수행할 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 면역세포의 활성화 또는 비활성화에 관련된 기능을 할 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 면역반응을 촉진하거나 향상시키는 기능을 할 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 면역반응을 억제하는 기능을 할 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 면역세포막의 채널 단백질, 수용체와 결합하여 면역반응을 조절하는 단백질의 합성에 관련된 기능을 할 수 있다.
예를 들어,
면역세포 활성 조절 유전자는 PD-1일 수 있다.
PD-1 유전자 (PDCD1 유전자로도 칭해짐; 이하, PD-1 유전자와 PDCD1유전자는 동일한 유전자를 의미하기 위하여 사용됨)는 CD279 (cluster of differentiation 279)로도 칭해지는 단백질 PD-1 (Programmed cell death protein)를 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)를 의미한다. 일 예에서, PD-1 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 PD-1 (e.g., NCBI Accession No. NP_005009.2 등)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_005018.2, NG_012110.1 등으로 표현되는 PD-1 유전자.
면역세포 활성 조절 유전자는 CTLA-4일 수 있다.
CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 유전자는 CD152 (cluster of differentiation 152)로도 칭해지는 단백질 CTLA-4를 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)를 의미한다. 일 예에서, CTLA-4 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 CTLA-4 (e.g., NCBI Accession No. NP_001032720.1,NP_005205.2 등)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No.NM_001037631.2, NM_005214.4, NG_011502.1 등으로 표현되는 CTLA-4 유전자.
면역세포 활성 조절 유전자는 CBLB일 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 PSGL-1일 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 ILT2일 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 KIR2DL4일 수 있다.
면역세포 활성 조절 유전자는 SHP-1일 수 있다.
상기 유전자들은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 면역세포 활성 조절 유전자는 면역반응을 촉진하는 기능을 할 수 있다.
상기 면역세포 활성 조절 유전자는 면역세포 생장 조절 유전자일 수 있다.
“면역세포 생장 조절 유전자(immune cell growth regulating gene)”는 면역세포 내의 단백질 합성 등을 조절하여 면역세포의 생장을 조절하는 기능을 하는 유전자를 의미하고, 예를 들어, 면역세포의 생장을 촉진 또는 억제하는 유전자일 수 있다. 이때, 상기 면역세포 생장 조절 유전자는 면역세포 생장 조절 유전자 자체 또는 면역세포 생장 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역세포 내의 단백질 합성 등을 조절하여 면역세포의 생장을 조절하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 면역세포 생장 조절 유전자는 DNA의 전사, RNA의 해독, 세포 분화에 관련된 기능을 할 수 있다.
면역세포 생장 조절 유전자의 예는 NFAT, IκB/NFκB, AP-1, 4E-BP1, eIF4E, S6의 발현 경로(pathway)에 관여하는 유전자일 수 있다.
예를 들어,
면역세포 생장 조절 유전자는 DGK-alpha일 수 있다.
DGKA (Dgk-alpDha) 유전자는 DGKA (Diacylglycerol kinase alpha)를 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)를 의미한다. 일 예에서, DGKA 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 DGKA (e.g., NCBI Accession No. NP_001336.2, NP_958852.1,NP_958853.1, NP_963848.1 등)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_001345.4, NM_201444.2, NM_201445.1, NM_201554.1, NC_000012.12 등으로 표현되는 DGKA 유전자.
면역세포 생장 조절 유전자는 DGK-zeta일 수 있다.
DGKZ (Dgk-zeta) 유전자는 DGKZ (Diacylglycerol kinase zeta)를 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)를 의미한다. 일 예에서, DGKZ 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 DGKZ (e.g., NCBI Accession No. NP_001099010.1, NP_001186195.1, NP_001186196.1, NP_001186197.1, NP_003637.2, NP_963290.1, NP_963291.2 등)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_001105540.1, NM_001199266.1, NM_001199267.1, NM_001199268.1, NM_003646.3, NM_201532.2, NM_201533.3, NG_047092.1 등으로 표현되는 DGKZ 유전자.
면역세포 생장 조절 유전자는 EGR2일 수 있다.
EGR2 유전자는 EGR2 (Early growth response protein 2)를 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)를 의미한다. 일 예에서, EGR2 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 EGR2 (e.g., NCBI Accession No. NP_000390, NP_001129649, NP_001129650, NP_001129651, NP_001307966 등)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_000399, NM_001136177, NM_001136178, NM_001136179, NM_001321037 등으로 표현되는 EGR2 유전자.
면역세포 생장 조절 유전자는 EGR3일 수 있다.
면역세포 생장 조절 유전자는 PPP2r2d일 수 있다.
면역세포 생장 조절 유전자는 A20(TNFAIP3)일 수 있다.
상기 유전자들은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 면역세포 활성 조절 유전자는 면역세포 사멸 조절 유전자일 수 있다.
“면역세포 사멸 조절 유전자(immune cell death regulating gene)”는 면역세포의 사멸에 관련된 기능을 하는 유전자로서, 예를 들어, 면역세포의 사멸을 촉진 또는 억제하는 기능을 하는 유전자일 수 있다. 이때, 상기 면역세포 사멸 조절 유전자는 면역세포 사멸 조절 유전자 자체 또는 면역세포 사멸 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역세포의 사멸을 조절하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 면역세포 사멸 조절 유전자는 면역세포의 세포 사멸(apoptosis) 또는 세포괴사(necrosis)에 관련된 기능을 할 수 있다.
예를 들어,
면역세포 사멸 조절 유전자는 caspase cascade-associated 유전자일 수 있다.
이때, 면역세포 사멸 조절 유전자는 FAS일 수 있다. 이하 유전자를 언급할 때, 그 유전자가 작용하는 수용체, 결합부분을 조작할 수 있음은 통상의 기술자에게 당연하다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 Death domain-associated 유전자일 수 있다.
이때, 면역세포 사멸 조절 유전자는 Daxx일 수 있다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 Bcl-2 family 유전자일 수 있다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 BH3-only family 유전자일 수 있다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 Bim일 수 있다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 Bid일 수 있다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 BAD일 수 있다.
면역세포 사멸 조절 유전자는 면역세포외막에 위치한 리간드 또는 수용체를 암호화하는 유전자일 수 있다.
이때, 면역세포 사멸 조절 유전자는 PD-1일 수 있다.
또한, 면역세포 사멸 조절 유전자는 CTLA-4일 수 있다.
상기 유전자들은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 면역세포 활성 조절 유전자는 면역세포 기능소실 조절 유전자일 수 있다.
“면역세포 기능소실 조절 유전자(immune cell exhaustion regulating gene)”는 면역세포의 점진적인 기능의 소실에 관련된 기능을 하는 유전자로서, 이때, 상기 면역세포 기능소실 조절 유전자는 면역세포 기능소실 조절 유전자 자체 또는 면역세포 기능소실 조절 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역세포의 점진적인 기능의 소실을 조절하는 기능을 수행할 수 있다.
면역세포 기능소실 조절 유전자는 면역세포의 비활성화에 관여하는 유전자의 전사 또는 번역을 돕는 기능을 할 수 있다.
이때, 전사를 돕는 기능은 해당 유전자를 demethylation하는 기능일 수 있다.
또한, 면역세포의 비활성화에 관여하는 유전자는 상기 면역세포 활성 조절 유전자를 포함한다.
예를 들어,
면역세포 기능소실 조절 유전자는 TET2일 수 있다.
TET2 유전자는 TET2 (Tet methylcytosine dioxygenase 2)를 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)를 의미한다. 일 예에서, TET2 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 TET2 (e.g., NCBI Accession No. NP_001120680.1, NP_060098.3 등)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession NM_001127208.2, No. NM_017628.4, NG_028191.1 등으로 표현되는 TET2 유전자.
면역세포 기능소실 조절 유전자는 면역세포의 지나친 성장에 관여하는 기능을 할 수 있다. 이때,지나친 성장만을 하고 재생하지 않는 면역세포는 기능을 소실하게 된다.
이때, 면역세포 기능소실 조절 유전자는 Wnt일 수 있다.
또한, 면역세포 기능소실 조절 유전자는 Akt일 수 있다.
상기 유전자들은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
다른 일 구체예에서, 면역세포 활성 조절 유전자는 사이토카인 분비 유전자일 수 있다.
“사이토카인 분비 유전자(cytokine production regulating gene)”는 면역세포의 사이토카인 분비에 관여하는 요소로 이러한 기능을 하는, 면역세포에서 발현되는 유전자로서, 이때, 상기 사이토카인 분비 유전자는 사이토카인 분비 유전자 자체 또는 사이토카인 분비 유전자에 의해 발현되는 단백질로 인해 면역세포의 사이토카인 분비를 조절하는 기능을 수행할 수 있다.
사이토카인(cytokine)은 면역 세포가 분비하는 단백질을 통틀어 일컫는 말로서, 생체에서 중요한 역할을 하는 신호 단백질이다. 감염, 면역, 염증, 외상(trauma), 부패, 암 등에 관여한다. 사이토카인은 세포로부터 분비된 후 다른 세포나 분비한 세포 자신에게 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 대식세포의 증식을 유도하거나 분비 세포 자신의 분화를 촉진하기도 한다. 하지만 지나치게 많은 양으로 분비되는 경우 정상 세포를 공격하는 문제가 나타나는 등 면역 반응에서는 사이토카인의 적절한 분비량도 중요하다.
사이토카인 분비 유전자는 예를 들어, 바람직하게는 TNFα, IFN-γ, TGF-β, IL-4, IL-10, IL-13, IL-1, IL-6, IL-12, IFN-a 분비에 관한 유전자 경로에 있는 유전자일 수 있다.
또는, 상기 사이토카인은 다른 면역세포에게 신호를 전달하여 면역세포가 인식한 항원보유세포를 사멸시키도록 유도하거나 분화를 돕는 기능을 할 수 있다. 이때, 사이토카인 분비 유전자는 바람직하게는 IL-12 분비에 관한 유전자 경로에 있는 유전자일 수 있다.
상기 유전자들은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
구현예에서,
본 명세서에 의해 개시되는 면역 조절 유전자는 면역세포 활성 조절 유전자일 수 있다.
상기 면역 조절 유전자는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 가이드핵산은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 표적 서열에 상보적으로 결합하는 gRNA일 수 있다.
“표적 서열”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 “표적 영역”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단백질에 의해 변형될 수 있는 부위이다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 유전자는 면역 조절 유전자일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 유전자는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자일 수 있다.
이하에서, 표적 서열이라 함은 두 가지의 뉴클레오타이드서열 정보 모두를 의미하는 용어로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 경우, 표적 서열은 표적 유전자 DNA의 transcribed strand의 서열 정보를 의미하는 것일 수도 있고, 또는 non-transcribed strand의 뉴클레오타이드서열 정보를 의미하는 것일 수도 있다.
예를 들어, 표적 서열은 표적 유전자 A의 표적 영역 중 일부 뉴클레오타이드서열(transcribed strand)인 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'을 의미할 수도 있으며, 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열(non-transcribed strand)인 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3' 을 의미할 수도 있다.
표적 서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서 상기 표적 서열은 16개의 뉴클레오타이드서열, 17개의 뉴클레오타이드서열, 18개의 뉴클레오타이드서열, 19개의 뉴클레오타이드서열, 20개의 뉴클레오타이드서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드서열, 23개의 뉴클레오타이드서열, 24개의 뉴클레오타이드서열 또는 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
표적 서열은 가이드핵산 결합 서열 혹은 가이드핵산 비결합 서열을 포함한다.
“가이드핵산 결합 서열”은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열로, 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 상보적인 결합을 할 수 있다. 표적 서열 및 가이드핵산 결합 서열은 표적 유전자 또는 핵산에 따라, 즉 유전자 조작 또는 교정하고자 하는 대상에 따라 달라질 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 표적 유전자 또는 핵산에 따라 다양하게 설계될 수 있다.
“가이드핵산 비결합 서열”은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열로, 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 상보적인 결합을 할 수 없다. 또한, 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열과 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열로, 가이드핵산 결합 서열과 상보적인 결합을 할 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 표적 서열 중 일부 뉴클레오타이드서열로, 표적 서열의 두 가지 서로 다른 서열순서를 가지는 뉴클레오타이드서열, 즉, 서로 상보적인 결합을 할 수 있는 두 가지의 뉴클레오타이드서열 중 한 가지 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열을 제외한 나머지 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
예를 들면, 표적 유전자 A의 표적 영역 중 일부 뉴클레오타이드서열인 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'과 이에 상보적인 뉴클레오타이드서열인 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'을 표적 서열로 할 때, 가이드핵산 결합 서열은 두 개의 표적 서열 중 하나, 즉, 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3' 또는 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은, 가이드핵산 결합 서열이 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'인 경우, 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'일 수 있고, 또는 가이드핵산 결합 서열이 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'인 경우 가이드핵산 비결합 서열은 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'일 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 표적 서열, 즉, transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 및 non-transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 중 선택된 하나의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열, 즉, transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 및 non-transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 중 선택된 하나의 뉴클레오타이드서열을 제외한 나머지 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 표적 서열의 길이와 동일할 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 표적 서열 또는 가이드핵산 결합 서열의 길이와 동일할 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서 상기 가이드핵산 결합 서열은 16개의 뉴클레오타이드서열, 17개의 뉴클레오타이드서열, 18개의 뉴클레오타이드서열, 19개의 뉴클레오타이드서열, 20개의 뉴클레오타이드서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드서열, 23개의 뉴클레오타이드서열, 24개의 뉴클레오타이드서열 또는 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서 상기 가이드핵산 비결합 서열은 16개의 뉴클레오타이드서열, 17개의 뉴클레오타이드서열, 18개의 뉴클레오타이드서열, 19개의 뉴클레오타이드서열, 20개의 뉴클레오타이드서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드서열, 23개의 뉴클레오타이드서열, 24개의 뉴클레오타이드서열 또는 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열과 일부 또는 완전한상보적인 결합을 할 수 있으며, 상기 가이드핵산 결합 서열의 길이는 가이드 서열의 길이와 동일할 수 있다.
상기 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보적이거나 또는 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상보적이지 않은 1 내지 8개의 뉴클레오타이드서열을 가지거나 또는 포함할 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있으며, 상기 가이드핵산 비결합 서열의 길이는 가이드 서열의 길이와 동일할 수 있다.
상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상동성을 가진 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성이거나 또는 완전하게 상동성인 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상동적이 않은 1 내지 8개의 뉴클레오타이드서열을 가지거나 포함할 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열과 상보적 결합을 할 수 있으며, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열의 길이와 동일할 수 있다.
상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 90% 또는 95% 이상의 상보적이거나 또는 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열에 상보적이지 않은 1 내지 2개의 뉴클레오타이드서열을 가지거나 포함할 수 있다.
또한, 상기 가이드핵산 결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열에 근접한 위치에 위치한 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열에 근접한 위치에 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
구현예에서,
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'-UTR, 5'-UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적 서열은 면역 조절 유전자의 핵산서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
“PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열”은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열이다. 이때, PAM 서열은 에디터단백질의 종류 및 유래된 종에 따라 뉴클레오타이드서열에 차이가 있을 수 있다.
이때, 상기 PAM 서열은 예를 들어, 하기의 서열 중 1 이상일 수 있다(5'에서 3'방향으로 기재함).
NGG(N은 A, T, C 또는 G임);
NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
NNAGAAW(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
NNNNGATT(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
NNGRR(T)(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임); 및
TTN(N은 A, T, C 또는 G임).
이때, 상기 표적 서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PD-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 CTLA-4 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 A20 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKA 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 DGKZ 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 FAS 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 EGR2 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PPP2r2d 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 TET2 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 PSGL-1 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적 서열은 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이하, 본 발명의 일 구체예에서 사용할 수 있는 표적 서열들의 일 예들은 표로 정리하였으며, 표에 기재된 표적 서열은 가이드핵산 비결합 서열로, 기재한 서열을 통해 상보적인 서열, 즉, 가이드핵산 결합 서열은 예측될 수 있다:
[표 1] 면역 조절 유전자의 표적 서열(Target sequences of immunity regulating gene)
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 유전자 조작용 조성물에 관한 것이다.
상기 유전자 조작용 조성물은 인위적으로 조작된 면역 조절 유전자의 생성에 이용될 수 있다. 또한, 상기 유전자 조작용 조성물에 의해 인위적으로 조작된 면역 조절 유전자는 면역 시스템을 조절할 수 있다.
“인위적으로 조작된(artificially modified or engineered or artificially engineered)”이라는 용어는 자연상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적으로 변형을 가한 상태를 의미한다. 이하에서, 비자연적인 인위적으로 조작된 또는 변형된 면역 조절 유전자는 인위적인 면역 조절 유전자라는 용어와 혼용하여 사용할 수 있다.
"면역 시스템(system)"은 인위적으로 조작된 면역 조절 유전자의 기능 변경에 의해 체내 면역반응에 영향을 끼치는, 즉 새로운 면역효능을 나타내는 메커니즘에 관여하는 모든 현상을 포함하는 용어로서, 이러한 면역 시스템에 직접적으로 또는 간접적으로 관여하는 모든 물질, 조성물, 방법 및 용도를 포함한다. 예를 들어, 선천면역, 적응면역, 세포성 면역, 체액성 면역, 능동면역, 수동면역 반응에 관여하는 유전자, 면역세포 및 면역기관/조직을 모두 포함한다.
본 명세서에 의해 개시되는 유전자 조작용 조성물은 가이드핵산 및 에디터단백질을 포함할 수 있다.
유전자 조작용 조성물은
(a) 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
(b) 하나 이상의 에디터단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열
을 포함할 수 있다.
상기 면역 조절 유전자 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 표적 서열 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
유전자 조작용 조성물은 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 포함할 수 있다.
“가이드핵산-에디터단백질 복합체”는 가이드핵산과 에디터단백질의 상호작용을 통해 형성된 복합체를 의미한다.
상기 가이드핵산 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 “에디터단백질”은 핵산과 직접적으로 결합하거나, 또는 직접 결합하지는 않지만 상호작용할 수 있는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다.
이때, 상기 핵산은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체에 포함된 핵산일 수 있다.
이때, 상기 핵산은 가이드핵산일 수 있다.
상기 에디터단백질은 효소일 수 있다.
이때, 상기 “효소”는 핵산, 유전자 또는 염색체를 절단할 수 있는 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다.
상기 효소는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
상기 에디터단백질은 완전 활성 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 “완전 활성 효소”는 야생형(wild type) 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능과 동일한 기능을 가지는 효소를 의미한다. 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소는 DNA 이중 가닥을 모두 절단하는 완전한 활성 효소일 수 있다. 또 다른 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소가 인위적인 조작에 의해 아미노산 서열 중 일부 서열이 삭제(deletion) 또는 치환(substitution)된 경우, 인위적으로 조작된 효소 변이체가 야생형 효소와 동일하게 DNA의 이중 가닥을 절단한다면, 상기 인위적으로 조작된 효소 변이체는 완전 활성 효소일 수 있다.
또한, 상기 완전 활성 효소는 야생형의 효소의 기능보다 향상 된 기능을 가지고 있는 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태는 야생형 효소보다 증가된 완전한 효소 활성, 즉, 증가된 DNA 이중 가닥을 절단하는 활성을 가질 수 있다.
상기 에디터단백질은 불완전 또는 부분 활성 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 "불완전 또는 부분 활성 효소"는 야생형 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능의 일부만을 가지는 효소를 의미한다. 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태는 제1 기능을 가지는 형태 또는 제2 기능을 가지는 형태일 수 있다. 이때, 제1 기능은 DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 기능이고, 제2 기능은 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 기능일 수 있다. 이때, 상기 제1 기능을 가지는 효소 또는 제2 기능을 가지는 효소는 불완전 또는 부분 활성 효소일 수 있다.
상기 에디터단백질은 불활성 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 "불활성 효소"는 야생형 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능이 모두 불활성화 된 효소를 의미한다. 예를 들면, 야생형 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태는 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 형태, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 제2 가닥을 절단하는 제2 기능이 모두 상실된 형태일 수 있다. 이때, 상기 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 효소는 불활성 효소일 수 있다.
상기 에디터단백질은 융합단백질일 수 있다.
이때, 상기 “융합 단백질”은 효소에 추가적인 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 융합하여 생성한 단백질을 의미한다.
상기 추가적인 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 효소에 포함된 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 동일하거나 다른 기능을 가지는 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 효소의 중간부; 또는 이들 조합의 하나 이상에 상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 부가된 형태일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 일 수 있으며, 또는 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스래디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
상기 NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 또는 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 추가적인 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 특정 기능을 수행하지 않는 비기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 이때, 상기 비기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 효소의 기능에 영향을 주지 않는 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 효소의 중간부; 또는 이들 조합의 하나 이상에 상기 비기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 부가된 형태일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하는 효소 또는 융합 단백질일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하는 효소 또는 융합 단백질의 일부가 변형된 형태일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하지 않는 인위적으로 생성된 효소 또는 융합 단백질일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하지 않는 인위적으로 생성된 효소 또는 융합 단백질의 일부가 변형된 형태일 수 있다.
이때, 상기 변형은 에디터단백질에 포함된 아미노산의 치환, 제거, 부가 또는 이의 혼합일 수 있다.
또는 상기 변형은 에디터단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드서열 중 일부 뉴클레오타이드의 치환, 제거, 부가 또는 이의 혼합일 수 있다.
또한, 상기 유전자 조작용 조성물은 삽입을 원하는 특정 뉴클레오타이드서열을 포함하는 도너 또는 이를 암호화하는 핵산서열을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 삽입은 원하는 핵산서열은 면역 참여 유전자의 일부 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 삽입은 원하는 핵산서열은 조작하고자 하는 면역 조절 유전자의 돌연변이를 교정하거나 돌연변이를 도입하기 위한 핵산 서열일 수 있다.
상기 "도너(donor)"는 손상된 유전자 또는 핵산의 상동성 재조합에 의한 수복을 돕는 뉴클레오타이드서열을 의미한다.
상기 도너는 이중가닥 핵산 또는 단일가닥 핵산일 수 있다.
상기 도너는 선형 또는 원형일 수 있다.
상기 도너는 표적 유전자 또는 핵산에 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 도너는 특정 뉴클레오타이드서열을 삽입하고자 하는 위치, 예를 들어, 손상된 핵산의 왼쪽(upstream)및 오른쪽(downstream)의 뉴클레오타이드서열과 각각 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 삽입하고자 하는 특정 뉴클레오타이드서열은 손상된 핵산의 오른쪽 뉴클레오타이드서열에 대해 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열과 손상된 핵산의 왼쪽 뉴클레오타이드서열에 대해 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열은 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖거나 또는 완전하게 상동성을 가질 수 있다.
상기 도너는 선택적으로 부수적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 부수적인 핵산서열은 도너의 안정성, 표적 내 삽입 효율 또는 상동성 재조합 효율을 높이는 역할을 하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 부수적인 뉴클레오타이드서열은 뉴클레오타이드 A, T가 풍부한 핵산서열, 즉, A-T 풍부 도메인(A-T rich domain)일 수 있다. 예를 들면, 상기 부수적인 뉴클레오타이드서열은 SMAR(scaffold/matrix attachment region)일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 다양한 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
이때, "대상"은 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 도입되는 유기체, 또는 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 작동하는 유기체 또는 유기체로부터 획득한 검체 또는 시료를 의미한다.
상기 대상은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 표적 유전자 또는 염색체를 포함하는 유기체일 수 있다.
상기 유기체는 동물, 동물의 조직 또는 동물 세포일 수 있다.
상기 유기체는 인간, 인간의 조직 또는 인간 세포일 수 있다.
상기 조직은 안구, 피부, 간, 신장, 심장, 폐, 뇌, 근육 또는 혈액일 수 있다.
상기 세포는 NK세포(자연살해세포), T세포, B세포, 수지상세포 등의 면역세포, 대식세포 또는 줄기세포일 수 있다.
상기 검체 또는 시료는 침, 혈액, 간조직, 뇌조직, 간세포, 신경세포, 식세포, 대식세포, T 세포, B 세포, 성상교세포, 암세포 또는 줄기세포 등 표적 유전자 또는 염색체를 포함하는 유기체에서 획득한 것 일 수 있다.
바람직하게는, 상기 대상은 면역 조절 유전자를 포함하는 유기체일 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 DNA, RNA 또는 이의 혼합의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
이때, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 DNA, RNA 또는 이의 혼합의 형태는 당업계에 공지된 방법에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
또는, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 DNA, RNA 또는 이의 혼합의 형태는 벡터, 비벡터 또는 이들의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체 또는 mRNA일 수 있다.
일 구현예로, 상기 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 벡터에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 벡터는 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 벡터는 가이드핵산과 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 동시에 포함할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 벡터는 가이드핵산 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 가이드핵산에 포함되는 도메인은 하나의 벡터에 모두 포함되거나 또는 각각의 도메인을 나누어 각각의 벡터에 포함시킬 수 있다.
다른 일 예로, 상기 벡터는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 에디터단백질의 경우, 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 조절/제어 구성요소는 포로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(즉, 가이드핵산 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다.
예를 들어, 가이드핵산을 위해 유용한 프로모터는 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 에디터단백질을 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 일 수 있다.
이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 또는 단순포진 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로 바이러스는 숙주(예를 들면, 세포)를 감염시켜, 숙주 내에 바이러스의 유전정보를 암호화하는 핵산을 도입시키거나 숙주의 게놈 내로 유전정보를 암호화하는 핵산을 삽입시킬 수 있다. 이러한 특징을 가지는 바이러스를 이용하여 대상 내로 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 도입시킬 수 있다. 바이러스를 이용하여 도입된 가이드핵산 및/또는 에디터단백질은 대상(예를 들면, 세포)에서 일시적으로 발현될 수 있다. 또는 바이러스를 이용하여 도입된 가이드핵산 및/또는 에디터단백질은 대상(예를 들면, 세포)에서 장기간(예를 들면, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적) 지속적으로 발현될 수 있다.
바이러스의 패키징 능력은 적어도 2kb 내지 50kb로 바이러스 종류에 따라 다를 수 있다. 이러한 패키징 능력에 따라 가이드핵산 또는 에디터단백질을 단독으로 포함하는 바이러스 벡터를 설계하거나 가이드핵산 및 에디터단백질을 모두 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다. 또는 가이드핵산, 에디터단백질 및 추가 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다.
일 예로, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 재조합 렌티바이러스에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 일 예로, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 재조합 아데노바이러스에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
또 다른 일 예로, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 재조합 AAV에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 일 예로, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재한 바이러스 중 하나 이상의 혼성체에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 일 구현예로, 상기 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 비벡터로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
비벡터는 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA 또는 이의 혼합일 수 있다.
상기 비벡터는 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6322-6327]에 기재되어 있음), 지질-매개 형질감염, 덴드리머, 나노입자, 인산칼슘, 실리카, 실리케이트(오르모실) 또는 이의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내에서 세포와 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 혼합하고, 정해진 지속시간 및 진폭의 전기적 자극을 적용에 의해 수행될 수 있다.
다른 일 예로, 나노입자를 이용하여 비벡터를 전달할 수 있다. 상기 나노입자는 무기 나노입자(예를 들면, 자기 나노입자, 실리카 등) 또는 유기 나노입자(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 지질 등)일 수 있다. 상기 나노입자의 외면은 부착을 가능하게 하는 양 전하로 하전된 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린 등)와 컨쥬케이팅될 수 있다.
임의의 구체예로, 지질 외피를 이용하여 전달할 수 있다.
임의의 구체예로, 엑소좀을 이용하여 전달할 수 있다. 엑소좀은 뇌 및 다른 표적 기관에 RNA를 전달할 수 있는, 단백질 및 RNA를 수송하는 내인성 나노-소낭이다.
임의의 구체예로, 리포좀을 이용하여 전달할 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 만들어질 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는데 인지질이 가장 통상적으로 사용된다.
또한, 비벡터의 전달을 위한 조성물은 기타 몇몇 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 에디터단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 에디터단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태는 당업계에 공지된 방법에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태는 전기천공법, 미량주사법, 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6322-6327]에 기재되어 있음), 지질-매개 형질감염, 나노파티클, 리포솜, 펩타이드-매개 전달 또는 이의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 전달은 가이드핵산을 암호화하는 핵산서열과 함께 전달될 수 있다.
일 예로, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내에서 가이드핵산와 함께 또는 가이드핵산 없이 에디터단백질을 도입시킬 세포와 혼합하고, 정해진 지속시간 및 진폭의 전기적 자극을 적용에 의해 수행될 수 있다.
상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 핵산-단백질 혼합의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
예를 들어, 상기 가이드핵산은 DNA, RNA 또는 이의 혼합 형태일 수 있다. 상기 에디터단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태일 수 있다.
일 예로, 가이드핵산 및 에디터단백질은 RNA 형태의 가이드핵산과 단백질 형태의 에디터단백질이 가이드핵산-에디터단백질 복합체, 즉 ribonucleoprotein(RNP)의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 표적 핵산, 유전자 또는 염색체를 변형시킬 수 있다.
예를 들어, 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 표적 핵산, 유전자 또는 염색체의 서열에 변형(modification)을 유도한다. 그 결과, 상기 표적 핵산, 유전자 또는 염색체에 의해 발현되는 단백질은 그 구조 및/또는 기능이 변형되거나, 그 단백질의 발현이 조절되거나, 그 단백질의 발현이 제거될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 DNA, RNA, 유전자 또는 염색체 수준에서 작용할 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 표적 유전자를 조작 또는 변형하여 표적 유전자가 암호화하는 단백질의 발현을 조절(예를 들어, 억제, 저해, 감소, 증가 또는 촉진) 하거나, 또는 단백질 활성 조절(예를 들어, 억제, 저해, 감소, 증가 또는 촉진) 또는 변형된 단백질을 발현할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 유전자의 전사와 번역의 단계에서 작용할 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 표적 유전자의 전사를 촉진 또는 저해하여 표적 유전자가 암호화하는 단백질의 발현을 조절(예를 들어, 억제, 저해, 감소, 증가 또는 촉진)할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 표적 유전자의 번역을 촉진 또는 저해하여 표적 유전자가 암호화하는 단백질의 발현을 조절(예를 들어, 억제, 저해, 감소, 증가 또는 촉진)할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, 유전자 조작용 조성물은 gRNA 및 CRISPR 효소를 포함할 수 있다.
유전자 조작용 조성물은
(a) 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
(b) 하나 이상의 CRISPR 효소 또는 이를 암호화하는 핵산서열
을 포함할 수 있다.
상기 면역 조절 유전자 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 표적 서열 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
유전자 조작용 조성물은 gRNA-CRISPR 효소 복합체를 포함할 수 있다.
“gRNA-CRISPR 효소 복합체”는 gRNA과 CRISPR 효소의 상호작용을 통해 형성된 복합체를 의미한다.
상기 gRNA 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 “CRISPR 효소”는 CRISPR-Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, gRNA와 복합체를 형성하여 CRISPR-Cas 시스템을 형성한다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
Type II CRISPR 효소의 결정 구조는 2종 이상의 자연유래 미생물 Type II CRISPR 효소 분자에 대한 연구(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 gRNA와 함께 복합체를 이루는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)에 대한 연구(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)를 통해 결정되었다.
Type II CRISPR 효소는 2개의 로브, 즉, 인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브를 포함하며, 각각의 로브는 여러 개의 도메인을 포함한다.
상기 REC 로브는 아르기닌-풍부 브릿지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다.
이때, 상기 BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌 풍부 영역이며, 상기 REC1 및 REC2 도메인은 gRNA 내의 형성되는 이중가닥의, 예를 들어, 단일가닥 gRNA, 이중 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요한 역할을 한다.
상기 NUC 로브는 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. 이때, 상기 RuvC 도메인은 RuvC-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용되고, 또한 상기 HNH 도메인은 HNH-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용된다.
이때, 상기 RuvC 도메인은 Type II CRISPR 효소를 포함하는 자연상태에 존재하는 미생물의 구성원에 대해 구조적으로 유사성을 공유하며, 단일가닥, 예를 들어 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단한다. 상기 RuvC 도메인은 종종 당업계에서 RuvCI 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서, 통상적으로 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII로 지칭된다.
상기 HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 위치한다.
상기 PI 도메인은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식하거나 또는 PAM과 상호작용한다. 이때, 상기 PAM은 Type II CRISPR 효소의 유래(origin)에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9(StCas9)인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, 네이세리아 메닝기디티스 Cas9(NmCas9)인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, 캄필로박터 제주니 Cas9(CjCas9)의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 다만, 전술한 효소의 유래에 따라 PAM이 결정되는 것으로 일반적으로 이해되고 있으나, 해당 유래의 효소의 돌연변이(mutant)에 대한 연구가 진행됨에 따라, 상기 PAM은 달라질 수도 있다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
상기 Cas9은 gRNA와 결합하여 표적 유전자 또는 핵산 상에서 표적 서열 또는 위치를 절단 또는 변형시키는 효소로서, gRNA가 상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 HNH 도메인, gRNA와 비상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 RuvC 도메인, 표적, 즉, 타겟과 상호작용하는 REC 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cas9의 구조적 특성은 Hiroshi Nishimasu et al. (2014) Cell 156:935-949를 참고할 수 있다.
상기 Cas9은 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 Type V CRISPR 효소일 수 있다.
Type V CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 상응하는 유사한 RuvC 도메인이 있으며, Type II CRISPR 효소의 HNH 도메인은 결핍되어 있고, 대신에 Nuc 도메인을 포함하며, 표적과 상호작용하는 REC 도메인과 WED 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Type V CRISPR 효소의 구조적 특성은 Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949-962를 참고할 수 있다.
Type V CRISPR 효소는 gRNA와 상호작용할 수 있으며, gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 형성할 수 있고, gRNA와 협력하여 가이드 서열을 및 PAM 서열을 포함하는 표적 서열로 근접시킬 수 있다. 이때, 표적 유전자 또는 핵산과 상호작용하기 위한 Type V CRISPR 효소의 능력은 PAM 서열에 의존적이다.
상기 PAM 서열은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 서열로, Type V CRISPR 효소의 PI 도메인에 의해 인식될 수 있다. 상기 PAM 서열은 Type V CRISPR 효소의 유래에 따라 그 서열이 다를 수 있다. 즉, 종마다 특이적으로 인식할 수 있는 PAM 서열이 존재한다. 예를 들어, Cpf1이 인식하는 PAM 서열은 5'-TTN-3' (N은 A, T, C 또는 G)일 수 있다. 다만, 전술한 효소의 유래에 따라 PAM이 결정되는 것으로 일반적으로 이해되고 있으나, 해당 유래의 효소의 돌연변이(mutant)에 대한 연구가 진행됨에 따라, 상기 PAM은 달라질 수도 있다.
상기 Type V CRISPR 효소는 Cpf1일 수 있다.
상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.
상기 Cpf1은 Cas9의 RuvC 도메인에 상응하는 유사한 RuvC 도메인이 있으며, Cas9의 HNH 도메인은 결핍되어 있고, 대신에 Nuc 도메인을 포함하며, 타겟과 상호작용하는 REC 도메인과 WED 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cpf1의 구조적 특성은 Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949-962를 참고할 수 있다.
상기 Cpf1는 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 절단하는 기능을 가지는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
"완전 활성"는 야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능과 동일한 기능을 가지고 있는 상태를 의미하며, 이러한 상태의 CRISPR 효소를 완전 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 이때, “야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능”은 DNA의 이중 가닥을 절단하는 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 모두 가지는 상태를 말한다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소를 변형 또는 조작시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산이 제거된 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 부가된 효소일 수 있다. 이때, 부가되는 아미노산의 위치는 야생형 효소의 N 말단, C 말단 또는 아미노산 서열 내일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 향상된 완전 활성 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 결합하지 않거나 또는 일정한 거리 간격을 유지한 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 향상된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 일정 거리이상으로 근접한 상태 또는 특정 결합이 형성된 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이때, 특정 결합은, 예를 들어, 효소의 특정 위치의 아미노산과 절단 위치의 DNA 뉴클레오타이드서열과의 결합일 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불완전 또는 부분 활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 중 선택된 하나의 기능을 가지는 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 또한 상기 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소는 니카아제(nickase)로 지칭될 수 있다.
“니카아제(nickase)”는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 중 한 가닥만 절단되도록 조작 또는 변형된 CRISPR 효소를 의미하며, 상기 니카아제는 단일가닥, 예를 들어, 표적 유전자 또는 핵산의 gRNA와 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 이중가닥을 절단하기 위해서는 2개의 니카아제의 뉴클레아제 활성이 필요하다.
상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 840번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 559번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또한, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 RuvC 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능이 모두 상실된 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소로 명칭한다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성을 가지는 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불활성을 가질 수 있다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불화성을 가질 수 있다. 즉, 상기 불활성 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인 및 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 불활성 CRISPR 효소는 변형된 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산과 840번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산과 559번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
상기 CRISPR 효소는 상기 기재된 뉴클레아제 활성 외에도 헬리카제 활성, 즉, 이중가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 헬리카제 활성에 대해 완전 활성, 불완전 또는 부분 활성, 또는 불활성이 되도록 CRISPR 효소를 변형시킬 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소를 인위적으로 조작 또는 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 변형시키기 위해 인위적으로 조작 또는 변형된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 상실된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 gRNA와 상호작용을 통한 gRNA-CRISPR 효소 복합체 형성할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 gRNA와 상호작용하는 기능을 변형시키기 위해 인위적으로 조작 또는 변형된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
이때, gRNA와 CRISPR 효소 변이체의 상호작용 세기에 따라 다양한 gRNA-CRISPR 효소 복합체가 형성될 수 있고, CRISPR 효소 변이체에 따라 표적 서열에 접근 또는 절단하는 기능에 차이가 생길 수 있다.
예를 들어, gRNA와의 상호작용이 감소된 CRISPR 효소 변이체에 의해 형성된 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 gRNA와 완전히 상보적 결합을 하는 표적 서열에 근접 또는 국소화되는 경우에만 오직 표적 서열의 이중가닥 또는 단일가닥을 절단할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 변형된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산의 치환된 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 제거된 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산의 치환, 제거 및/또는 부가된 것일 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능, 이외에 선택적으로 기능적(functional) 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능 이외에 부가적인 기능을 가질 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있으며, 또는 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예로, SpCas9 니카아제에 시티딘 디아미네이즈, 예를 들면, APOBEC1(apolipoprotein B editing complex 1)를 추가하여 융합 단백질을 생성할 수 있다. 이렇게 형성된 [SpCas9 니카아제]-[APOBEC1]은 뉴클레오타이드 C를 T 또는 U로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용되거나, 또는 뉴클레오타이드 G를 A로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예로, SpCas9 니카아제에 아데닌 디아미네이즈, 예를 들면, TadA variants, ADAR2 variants, ADAT2 variants 등을 추가하여 융합 단백질을 생성할 수 있다. 이렇게 형성된 [SpCas9 니카아제]-[TadA variant], [SpCas9 니카아제]-[ADAR2 variant] 또는 [SpCas9 니카아제]-[ADAT2 variant]는 뉴클레오타이드 A를 inosine으로 변형시키며, 변형된 inosine은 polymerase에 의해 뉴클레오타이드 G로 인식되어 실질적으로 뉴클레오타이드 A를 G로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집되는 효과를 보이므로, 뉴클레오타이드 A를 G로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용되거나, 또는 뉴클레오타이드 T를 C로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용될 수 있다.
상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
일 예로, CRISPR 효소는 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 CRISPR 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 또는 이들의 조합에 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 상기 NLS는 하기로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK.
또한, 상기 CRISPR 효소 변이체는 CRISPR 효소를 분할하여 두 개 이상의 부분으로 나눈 스플릿(split) 형태의 CRISPR 효소를 포함할 수 있다. “스플릿(split)”은 단백질을 기능적으로 또는 구조적으로 또는 임의로 두 개 이상으로 분할하는 것을 의미한다.
상기 스플릿(split) 형태의 CRISPR 효소는 완전 활성 효소, 불완전 또는 부분 활성 효소 또는 불활성 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소가 SpCas9의 경우, 656번 타이로신과 657번 트레오닌 사이를 분할하여 두 개의 부분으로 나눈 스플릿 SpCas9을 생성할 수 있다.
상기 스플릿(split) 형태의 CRISPR 효소는 선택적으로 재구성(reconstitution)을 위한 추가 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
상기 재구성을 위한 추가 도메인, 펩타이드 폴리펩타이드 또는 단백질은 스플릿(split) 형태의 CRISPR 효소가 구조적으로 야생형 CRISPR 효소와 동일하거나 유사하도록 조립될 수 있다.
상기 재구성(reconstitution)을 위한 추가 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 FRB 및 FKBP dimerization domains; 인테인(intein); ERT 및 VPR domains 또는 특정 조건에서 이량이질체(heterodimer)를 형성하는 도메인일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소가 SpCas9의 경우, 713번 세린과 714번 글라이신 사이를 분할하여 두 개의 부분으로 나눈 스플릿 SpCas9에 두 부분 중 하나에 FRB 도메인을 연결하고, 나머지 하나에 FKBP 도메인을 연결할 수 있다. 이렇게 생성된 스플릿 SpCas9은 라파마이신이 존재하는 환경에서 FRB 도메인과 FKBP 도메인이 다이머를 형성하여 재구성된 CRISPR 효소를 생성할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체는 폴리펩타이드, 단백질 또는 이를 암호화하는 서열을 가지는 핵산일 수 있으며, 상기 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체를 도입하고자 하는 대상에 맞추어 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
“코돈 최적화”는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노상 서열을 유지함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 가지며, 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 mRNA의 번역의 효율과 상호관련 되며, 이는 번역되는 코돈의 특성 및 특정 tRNA 분자의 이용가능성에 의해 좌우되는 것을 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 gRNA, CRISPR 효소 또는 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 다양한 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 대상 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
일 구현예로서, gRNA 및/또는 CRISPR 효소는 각각을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 벡터에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
벡터는 gRNA 및/또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 벡터는 gRNA 및 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열을 동시에 포함할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 벡터는 gRNA 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 gRNA에 포함되는 도메인은 하나의 벡터에 모두 포함되거나 또는 각각의 도메인을 나누어 각각의 벡터에 포함시킬 수 있다.
다른 일 예로, 상기 벡터는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소의 경우, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열은 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 조절/제어 구성요소는 포로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(즉, gRNA 및/또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다.
예를 들어, gRNA를 위해 유용한 프로모터는 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소를 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 일 수 있다.
이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 또는 단순포진 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, gRNA 및/또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열은 재조합 렌티바이러스에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 일 예로, gRNA 및/또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열은 재조합 아데노바이러스에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
또 다른 일 예로, gRNA 및/또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열은 재조합 AAV에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 일 예로, gRNA 및/또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산서열은 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재한 바이러스 중 하나 이상의 혼성체에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
일 구현예로서, gRNA-CRISPR 효소 복합체의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
예를 들어, 상기 gRNA는 DNA, RNA 또는 이의 혼합 형태일 수 있다. 상기 CRISPR 효소는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태일 수 있다.
일 예로, gRNA 및 CRISPR 효소는 RNA 형태의 gRNA와 단백질 형태의 CRISPR gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉 ribonucleoprotein(RNP)의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 CRISPR gRNA-CRISPR 효소 복합체는 전기천공법, 미량주사법, 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6322-6327]에 기재되어 있음), 지질-매개 형질감염, 나노파티클, 리포솜, 펩타이드-매개 전달 또는 이의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작 또는 변형시키는데 이용될 수 있다.
표적 유전자는 앞서 기재한 gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 이용하여 조작 또는 변형할 수 있다. 이때, 표적 유전자의 조작 또는 변형은 i) 표적 유전자의 절단 또는 손상과 ii) 손상된 표적 유전자의 수선 또는 수복하는 단계를 모두 포함한다.
상기 i) 표적 유전자의 절단 또는 손상은 CRISPR 복합체를 이용한 표적 유전자의 절단 또는 손상일 수 있으며, 구체적으로는 표적 유전자 내의 표적 서열의 절단 손상일 수 있다.
상기 표적 서열은 gRNA-CRISPR 효소 복합체의 타겟이 될 수 있고, 상기 표적 서열은 CRISPR 효소가 인식하는 PAM 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 이러한 표적 서열은 실시자에게 gRNA 설계 단계에서 중요한 기준을 제공할 수 있다.
상기 표적 서열은 gRNA-CRISPR 효소 복합체의 gRNA에 의해 특이적으로 인식될 수 있으며, 이로 인해 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 인식된 표적 서열에 근접하게 위치할 수 있다.
표적 부위의 "절단(cleavage)"은 폴리뉴클레오타이드의 공유결합(covalent backbone)의 파손(breakage)을 의미한다. 절단은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이외의 다양한 여러 가지 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 단일가닥의 절단 및 이중가닥의 절단 모두 가능하며, 이중가닥의 절단은 두 개의 구별되는(distinct) 단일-가닥의 절단의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥의 절단은 blunt ends 또는 staggered end(또는 sticky end)를 생성할 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 복합체를 이용한 표적 유전자의 절단 또는 손상은 표적 서열의 이중가닥이 모두 절단 또는 손상되는 것일 수 있다.
일 구체예로서, CRISPR 효소가 야생형의 SpCas9인 경우, CRISPR 복합체는 gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 이중가닥을 모두 절단시킬 수 있다.
다른 일 구체예로서, CRISPR 효소가 SpCas9 니카아제(D10A)와 SpCas9 니카아제(H840A)인 경우, 각각의 CRISPR 복합체는 gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 두 개의 단일가닥을 각각 절단시킬 수 있다. 즉, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 상보성 단일가닥은 SpCas9 니카아제(D10A)에 의해 절단되고, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 비상보성 단일가닥은 SpCas9 니카아제(H840A)에 의해 절단될 수 있고, 각각의 절단은 순차적으로 또는 동시에 발생할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 복합체를 이용한 표적 유전자 또는 핵산의 절단 또는 손상은 표적 서열의 이중가닥 중 단일가닥만 절단 또는 손상되는 것일 수 있다. 이때, 단일가닥은 gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 가이드핵산 결합 서열, 즉, 상보성 단일가닥일 수 있고, 또는 gRNA와 상보적 결합을 하지 않는 가이드핵산 비결합 서열, 즉, gRNA와 비상보성 단일가닥일 수 있다.
일 구체예로서, CRISPR 효소가 SpCas9 니카아제(D10A)인 경우, CRISPR 복합체는 gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 가이드핵산 결합 서열, 즉, 상보성 단일가닥은 SpCas9 니카아제(D10A)에 의해 절단되고, gRNA와 상보적 결합을 하지 않는 표적 서열의 가이드핵산 비결합 서열, 즉, gRNA와 비상보성 단일가닥은 절단되지 않을 수 있다.
다른 일 구체예로서, CRISPR 효소가 SpCas9 니카아제(H840A)인 경우, CRISPR 복합체는 gRNA와 상보적 결합을 하지 않는 표적 서열의 가이드핵산 비결합 서열, 즉, gRNA와 비상보성 단일가닥은 SpCas9 니카아제(H840A)에 의해 절단되고, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 가이드핵산 결합 서열, 즉, 상보성 단일가닥은 절단되지 않을 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 복합체를 이용한 표적 유전자 또는 핵산의 절단 또는 손상은 일부 핵산 조각(fragment)를 제거하는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 CRISPR 복합체가 서로 다른 표적 서열에 상보적 결합을 하는 두 개의 gRNA와 야생형 SpCas9에 의해 구성되는 경우, 제 1 gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 이중가닥을 절단하고, 제 2 gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열의 이중가닥을 절단하여 제 1 gRNA와 제 2 gRNA 및 SpCas9에 의해 핵산 조각을 제거할 수 있다.
상기 ii) 손상된 표적 유전자의 수선 또는 수복은 비-상동성 말단-결합 (NHEJ) 및 상동 재조합 수리(HDR)을 통해 수선 또는 수복될 수 있다.
상기 비-상동성 말단-결합 (Non-homologous end joining, NHEJ)은 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 양 말단이 함께 결합함으로써 DNA 내 이중가닥 파손을 수복 또는 수선하는 방법으로, 일반적으로, 이중가닥의 파손(예를 들어, 절단)에 의해 형성된 2 개의 적합성 말단이 빈번한 접촉을 반복하여 2개의 말단이 완전히 결합되는 경우 파손된 이중가닥이 복구된다. NHEJ는 모든 세포주기에서 가능한 수복 방식으로, 주로 G1 시기와 같이 세포 내에 주형으로 쓸 상동유전체가 없을 때 발생한다.
NHEJ를 이용한 손상된 유전자 또는 핵산의 수복 과정에서 NHEJ 수선 부위에 핵산 서열의 일부 삽입 및/또는 결실(삽입결실)을 초래하며, 이러한 삽입 및/또는 결실은 리딩 프레임을 변경시키고, 프레임쉬프트 된 전사체 mRNA를 만들어내고, 결과적으로 넌센스-매개 붕괴(nonsense mediated decay)를 겪거나 정상적인 단백질을 합성하는데 실패함으로써 본래의 기능을 상실하게 된다. 또는 추가적으로, 리딩 프레임을 유지하지만, 상당한 양의 서열을 삽입 또는 결실시키는 돌연변이를 초래해 단백질의 기능성을 파괴할 수 있다. 이는 중요한 기능적 도메인의 돌연변이가 단백질의 비중요 영역에서의 돌연변이보다 덜 용인될 가능성이 있기 때문에 좌위 의존적이다.
NHEJ에 의해 생성된 삽입결실 돌연변이는 자연 상태에서 예측 불가능하지만, 주어진 파손 부위에서 특정 삽입 결실 서열이 선호되며, 이는 마이크로상동성의 작은 영역에 기인할 가능성이 있다. 통상적으로 결실 길이는 1 bp 내지 50 bp 범위이며, 삽입은 더 짧게 되는 경향이 있고, 종종 파손 부위를 바로 둘러싸는 짧은 중복 서열을 포함한다.
또한, NHEJ는 돌연변이를 유발하는 과정으로, 특이적 최종 서열의 생성이 필요하지 않은 경우, 작은 서열의 모티프를 결실시키는데 사용될 수 있다.
이러한 NHEJ를 이용하면, CRISPR 복합체에 의해 표적되는 유전자의 특이적 넉아웃(knockout)할 수 있다. CRISPR 효소, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1을 이용하여 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 또는 두 개의 단일가닥의 절단하고, 파손된 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 또는 두 개의 단일가닥은 NHEJ에 의해 삽입결실이 생성되며, 이를 통해 표적 유전자 또는 핵산의 특이적 넉아웃을 유도할 수 있다. 이때, 상기 CRISPR 효소에 의해 절단되는 표적 유전자 또는 핵산의 위치는 비암호 영역 또는 암호 영역일 수 있으며, 더불어 NHEJ에 의해 수복되는 표적 유전자 또는 핵산의 위치는 비암호 영역 또는 암호 영역일 수 있다.
일 예로, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자의 이중가닥을 절단하고 NHEJ에 의해 수복되는 과정을 통해 수복 부위에 다양한 인델 (indel; insertion and deletion)이 발생할 수 있다.
"인델(indel)"은 DNA의 뉴클레오타이드 배열에서 일부 뉴클레오타이드가 중간에 삽입 (insertion)되거나 결실 (deletion) 된 변이를 총칭한다. 인델은 상술한 바와 같이 gRNA-CRISPR 효소 복합체가 면역 참여 인자의 핵산(DNA, RNA)를 절단하는 경우, HDR 또는 NHEJ 기작에 의해 수선되는 과정에서 표적 서열에 도입되는 것일 수 있다.
상기 상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR)는 손상된 유전자 또는 핵산을 수선 또는 수복하기 위해 상동성을 가진 서열을 주형으로 이용하는 방식으로 오류 없이 교정할 수 있는 방법으로, 일반적으로, 파손된 DNA을 수선 또는 수복하기 위해, 즉 세포가 가지고 있는 원래의 정보를 복원하기 위해, 변형이 이루어지지 않은 상보적인 뉴클레오타이드서열의 정보를 이용하거나 자매 염색분체의 정보를 이용하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복한다. HDR의 가장 일반적인 형태는 상동성 재조합(homologous recombination, HR)이다. HDR은 통상적으로 활발하게 분열하는 세포의 S나 G2/M 시기에 주로 발생하는 수선 또는 수복 방식이다.
HDR을 이용한 손상된 DNA 수선 또는 수복을 위해, 세포가 본래 가지는 상보적인 뉴클레오타이드서열 또는 자매 염색분체를 이용하는 대신에, 상보적인 뉴클레오타이드서열 또는 상동성 뉴클레오타이드서열 정보를 이용한 인공적으로 합성한 DNA 주형, 즉, 상보적인 뉴클레오타이드서열 또는 상동성 뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 수 있다. 이때, 상기 핵산 주형에 추가로 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함시켜 파손된 DNA를 수선 또는 수복 할 때, 파손된 DNA에 추가로 포함시킨 핵산 서열 또는 핵산 조작을 삽입(Knock-In)할 수 있다. 추가로 포함시킨 핵산 서열 또는 핵산 조각은 돌연변이의 변형된 표적 유전자 또는 핵산을 정상 유전자 또는 핵산으로 교정하기 위한 핵산 서열 또는 핵산 조각이거나 세포 내에서 발현을 원하는 유전자 또는 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 또는 단일가닥을 절단하고, 절단 위치와 근접한 뉴클레오타이드서열과 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 뉴클레오타이드서열을 HDR 방법으로 수선 또는 수복할 수 있다.
이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산 주형은 파손된 DNA, 즉 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 상보적인 뉴클레오타이드서열을 가지며, 추가로 파손된 DNA에 삽입하기 원하는 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함할 수 있다. 이와 같이 상보적인 뉴클레오타이드서열과 삽입하고자 하는 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함하는 핵산 주형을 이용하여 파손된 DNA, 즉 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 위치에 추가적인 핵산 서열 또는 핵산 조각을 삽입할 수 있다. 이때, 상기 삽입하고자 하는 핵산 서열 또는 핵산 조각 및 추가적인 핵산 서열 또는 핵산 조각은 돌연변이의 변형된 표적 유전자 또는 핵산을 정상 유전자 또는 핵산으로 교정하기 위한 핵산 서열 또는 핵산 조각이거나 세포 내에서 발현을 원하는 유전자 또는 핵산일 수 있다. 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 파손된 DNA, 즉 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 오른쪽 및 왼쪽의 뉴클레오타이드서열과 상보적인 결합을 하는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또는 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 파손된 DNA, 즉 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 3' 및 5' 말단과 상보적인 결합을 하는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 15 내지 3000개의 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 핵산 주형의 크기 또는 표적 유전자 또는 핵산에 따라 적절하게 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열의 길이 또는 크기를 설계할 수 있다. 이때, 핵산 주형을 이중가닥 또는 단일가닥의 핵산일 수 있으며, 선형 또는 원형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 일 예로, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 또는 단일가닥을 절단하고, 절단 위치와 근접한 뉴클레오타이드서열과 상동성 뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 뉴클레오타이드서열을 HDR 방법으로 수선 또는 수복할 수 있다.
이때, 상기 상동성 뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산 주형은 파손된 DNA, 즉 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 상동성 뉴클레오타이드서열을 가지며, 추가로 파손된 DNA에 삽입하기 원하는 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함할 수 있다. 이와 같이 상동성 뉴클레오타이드서열과 삽입하고자 하는 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함하는 핵산 주형을 이용하여 파손된 DNA, 즉 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 위치에 추가적인 핵산 서열 또는 핵산 조각을 삽입할 수 있다. 이때, 상기 삽입하고자 하는 핵산 서열 또는 핵산 조각 및 추가적인 핵산 서열 또는 핵산 조각은 돌연변이의 변형된 표적 유전자 또는 핵산을 정상 유전자 또는 핵산으로 교정하기 위한 핵산 서열 또는 핵산 조각이거나 세포 내에서 발현을 원하는 유전자 또는 핵산일 수 있다. 상기 상동성 뉴클레오타이드서열은 파손된 DNA, 즉 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 오른쪽 및 왼쪽의 뉴클레오타이드서열과 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또는 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 파손된 DNA, 즉 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 3' 및 5' 말단과 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 상기 상동성 뉴클레오타이드서열은 15 내지 3000개의 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 핵산 주형의 크기 또는 표적 유전자 또는 핵산에 따라 적절하게 상기 상동성 뉴클레오타이드서열의 길이 또는 크기를 설계할 수 있다. 이때, 핵산 주형을 이중가닥 또는 단일가닥의 핵산일 수 있으며, 선형 또는 원형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 NHEJ와 HDR 외에도 손상된 표적 유전자를 수선 또는 수복하는 다양한 방법이 존재한다. 예를 들어, 손상된 표적 유전자의 수선 또는 수복 방법은 단일가닥 어닐링, 단일가닥 파손 수선, 미스매치 수선, 뉴클레오타이드 절단 수선 또는 뉴클레오타이드 절단 수선을 이용한 방법일 수 있다.
상기 단일가닥 어닐링(Single-strand annealing, SSA)은 표적 핵산 중에 존재하는 2개의 반복부 서열 사이의 이중가닥 파손을 수선하는 방법으로, 일반적으로 30개 초과의 뉴클레오타이드서열의 반복부 서열을 이용할 수 있다. 파손 말단에서 표적 핵산의 이중가닥에 대해 반복부 서열을 각각의 단일가닥이 가지도록 절단(Sticky end가 되도록)되며, 절단 후 반복부 서열을 함유하는 단일가닥 돌출부는 반복체 서열이 자체적으로 부적절하게 어닐링되는 것을 방지하기 위해 RPA 단백질로 코팅된다. RAD52는 돌출부 상의 각각의 반복부 서열에 결합하고, 상보성 반복부 서열의 어닐링을 가능하게 하는 서열을 정렬한다. 어닐링 후에, 돌출부의 단일가닥 플랩(flap)은 절단되고, 새로운 DNA 합성이 임의의 갭을 채우면서 DNA 이중가닥을 복원한다. 이러한 수복 또는 수선의 결과로, 2개의 반복체 사이의 DNA 서열이 결실되며, 결실 길이는 이용되는 2개의 반복체의 위치를 포함하는 다수의 인자 및 절단 경로 또는 진행도에 의존될 수 있다.
SSA는 HDR 방식과 유사하게는 상보성 서열, 즉 상보성 반복부 서열을 이용하고, 대조적으로는 표적 핵산 서열을 변경 또는 수정하기 위한 핵산 주형을 필요로 하지 않는다.
게놈 내 단일가닥 파손은 상기 논의된 수선 메커니즘과는 별도의 메커니즘인 단일가닥 파손 수선(Single-strand break repair, SSBA)을 통해 수선 또는 수복될 수 있다. DNA 파손의 형태가 단일가닥 파손일 때, PARP1 및/또는 PARP2는 파손을 인식하고 수선 기작을 동원한다. DAN 파손에서 PARP1의 결합 및 활성을 일시적이며, 손상부에 SSBR 단백질 복합체의 안정성을 촉진함으로써 SSBR을 촉진시킨다. SSBR 복합체에서 가장 중요한 단백질은 XRCC1으로, 이는 DNA의 3' 및 5' 말단 가공을 촉진하는 단백질과 상호작용하며, 안정화시킨다. 말단 가공은 일반적을 손상된 3' 말단을 하이드록실화 된 상태 및/또는 5' 말단을 인산염 모이어티로 복구하는 것을 수반하며, 말단이 가공되면, DNA 갭 채우기가 일어난다. DNA 갭 채우기에는 2가지 방법, 즉, 짧은 패치 수선 및 긴 패치 수선이 있으며, 이때 짧은 패치 수선은 빠져있는 단일 뉴클레오타이드의 삽입을 수반한다. DNA 갭 채우기 후, DNA 리가아제는 말단의 결합을 촉진한다.
상기 미스매치 수선(Mismatch repair, MMR)은 잘못 짝지어진 DNA 뉴클레오타이드상에서 작용할 수 있다. MSH2/6 또는 MSH2/3 복합체는 둘 다 미스매치 인식 및 수선의 개시에서 중요한 역할을 하는 ATP 분해효소 활성을 가지며, MSH2/6는 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 미스매치를 우선적으로 인식하고, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드의 미스매치를 동정하는 반면, MSH2/3는 더 큰 미스매치를 우선적으로 인식한다.
상기 뉴클레오타이드 절단 수선(Base excision repair, BER)은 세포주기 전체에서 활성이며, 게놈으로부터 작은 비-나선-뒤틀림 뉴클레오타이드 손상부를 제거하는데 이용되는 수선 방식이다. 손상된 DNA는 당 인산화 백본에 뉴클레오타이드를 연결하는 N-글리코사이드 결합을 절단하여 손상된 뉴클레오타이드를 절단하고, 이어서 포스포디에스테르 백본을 절단하여 DNA 단일가닥 파손을 생성한다. 이렇게 형성된 파손된 단일가닥 말단을 제거하고, 제거된 단일가닥에 의해 발생된 갭을 새로운 상보성 뉴클레오타이드로 채운 후, DNA 리가아제로 새로 채워진 상보성 뉴클레오타이드 말단과 백본을 결합시켜 손상된 DNA를 수선 또는 수복한다.
상기 뉴클레오타이드 절단 수선(Nucleotide excision repair, NER)은 DNA로부터 큰 나선-뒤틀림 손상을 제거하는 중요한 절단 메커니즘으로, 손상이 인식되면, 손상부를 함유하는 짧은 단일가닥 DNA 세그먼트를 제거하여, 22개 내지 30개 뉴클레오타이드의 단일가닥 갭을 생성한다. 생성된 갭은 새로운 상보성 뉴클레오타이드로 채운 후, DNA 리가아제로 새로 채워진 상보성 뉴클레오타이드 말단과 백본을 결합시켜 손상된 DNA를 수선 또는 수복한다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 인위적인 조작 효과는 크게 넉아웃(knockout), 넉다운(knockdown), 넉인(knockin)일 수 있다.
"넉아웃(knockout)"은 표적 유전자 또는 핵산을 불활성화시키는 것을 의미하며, “표적 유전자 또는 핵산의 불활성화”는 표적 유전자 또는 핵산의 전사 및/또는 번역이 되지 못하는 상태를 의미한다. 넉아웃을 통해 질병을 유발하는 유전자 또는 비정상적 기능을 가지는 유전자의 전사 및 번역을 억제하여 단백질의 발현을 막을 수 있다.
예를 들어, gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 염색체를 편집 또는 교정하는 경우, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 염색체를 절단할 수 있다. CRISPR 복합체를 이용하여 손상된 표적 유전자 또는 염색체는 NHEJ를 통해 손상된 유전자 또는 염색체가 수복될 수 있다. 파손된 표적 유전자 또는 염색체는 NHEJ에 의해 삽입결실이 생성되며, 이를 통해 표적 유전자 또는 염색체의 특이적 넉아웃을 유도할 수 있다.
다른 예를 들어, gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체 및 도너을 이용하여 표적 유전자 또는 염색체를 편집 교정하는 경우, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있다. CRISPR 복합체를 이용하여 손상된 표적 유전자 또는 핵산은 도너를 이용해 HDR을 통해 손상된 유전자 또는 염색체가 수복될 수 있다. 이때, 도너는 상동성 뉴클레오타이드서열 및 삽입시키길 원하는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 이때, 삽입시키길 원하는 뉴클레오타이드서열은 개수는 삽입 위치 또는 목적에 따라 다양하게 조절될 수 있다. 도너를 이용해 손상된 유전자 또는 염색체가 수복된 경우, 손상된 뉴클레오타이드서열 부위에 삽입시키길 원하는 뉴클레오타이드서열이 삽입되며, 이를 통해 표적 유전자 또는 염색체의 특이적 넉아웃을 유도할 수 있다.
"넉다운(knockdown)"은 표적 유전자 또는 핵산의 전사 및/또는 번역을 감소시키거나 표적 단백질의 발현이 감소하는 것을 의미한다. 넉다운을 통해 과발현되는 유전자 또는 단백질의 발현을 조절하여 질병의 발생을 막거나 질병을 치료할 수 있다.
예를 들어, gRNA- CRISPR 불활성 효소-전사 저해 활성 도메인 복합체, 즉, 전사 저해 활성 도메인을 포함하는 CRISPR 불활성 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 염색체를 편집 또는 교정하는 경우, 상기 CRISPR 불활성 복합체가 표적 유전자 또는 염색체에 특이적으로 결합하고, CRISPR 불활성 복합체에 포함된 전사 저해 활성 도메인에 의해 표적 유전자 또는 염색체의 전사가 저해되어 해당 유전자 또는 염색체의 발현이 저해되는 넉다운을 유도할 수 있다.
다른 예를 들어, gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 염색체를 편집 교정하는 경우, 상기 CRISPR 복합체가 표적 유전자 또는 염색체의 프로모터 및/또는 인핸서 부위를 절단할 수 있다. 이때, 상기 gRNA는 표적 유전자 또는 염색체의 프로모터 및/또는 인핸서 부위의 일부 뉴클레오타이드서열을 표적 서열로 인식할 수 있다. CRISPR 복합체를 이용하여 손상된 표적 유전자 또는 염색체는 NHEJ를 통해 손상된 유전자 또는 염색체가 수복될 수 있다. 파손된 표적 유전자 또는 염색체는 NHEJ에 의해 삽입결실이 생성되며, 이를 통해 표적 유전자 또는 염색체의 특이적 넉다운을 유도할 수 있다. 또는 선택적으로 도너를 이용하는 경우, CRISPR 복합체를 이용하여 손상된 표적 유전자 또는 염색체는 HDR을 통해 손상된 유전자 또는 염색체가 수복될 수 있다. 도너를 이용해 손상된 유전자 또는 염색체가 수복된 경우, 손상된 뉴클레오타이드서열 부위에 삽입시키길 원하는 뉴클레오타이드서열이 삽입되며, 이를 통해 표적 유전자 또는 염색체의 특이적 넉다운을 유도할 수 있다.
"넉인(knockin)"은 표적 유전자 또는 핵산에 특정 핵산 또는 유전자를 삽입하는 것을 의미하며, 이때, "특정 핵산 또는 유전자"은 삽입하고자 하는 또는 발현시키기 원하는 핵산 또는 유전자를 의미한다. 넉인을 통해 질병을 유발하는 돌연변이 유전자를 올바르게 교정하거나, 정상 유전자를 삽입하여 정상 유전자의 발현을 유도하여 질병 치료에 이용할 수 있다.
더불어, 넉인은 추가적으로 도너(donor)를 필요로 할 수 있다.
예를 들어, gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체 및 도너를 이용하여 표적 유전자 또는 핵산을 편집 또는 교정하는 경우, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있다. CRISPR 복합체를 이용하여 손상된 표적 유전자 또는 핵산은 도너를 이용해 HDR를 통해 손상된 유전자 또는 핵산이 수복될 수 있다. 이때, 도너는 특정 핵산 또는 유전자를 포함하며, 이를 이용하여 손상된 유전자 또는 염색체에 특정 핵산 또는 유전자를 삽입할 수 있다. 이때, 삽입된 특정 핵산 또는 유전자는 단밸질도의 발현이 유도할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, gRNA-CRISPR 효소 복합체는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자에 인위적인 조작 또는 변형을 가할 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 표적 서열을 특이적으로 인식할 수 있다.
상기 표적 서열은 gRNA-CRISPR 효소 복합체의 gRNA에 의해 특이적으로 인식될 수 있으며, 이로 인해 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 인식된 표적 서열에 근접하게 위치할 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자에 인위적인 변형이 일어나는 부위 또는 영역일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 3'-UTR 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 5'-UTR 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적 서열은 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 핵산서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 PAM 서열은 예를 들어, 하기의 서열 중 1 이상일 수 있다(5'에서 3'방향으로 기재함).
NGG(N은 A, T, C 또는 G임);
NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
NNAGAAW(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
NNNNGATT(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
NNGRR(T)(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임); 및
TTN(N은 A, T, C 또는 G임).
일 구체예에서, 상기 표적 서열은 표 1에 기재된 뉴클레오타이드서열 중 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 gRNA와 CRISPR 효소로 구성될 수 있다.
상기 gRNA는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열과 일부 또는 완전한 상보적 결합을 할 수 있는 가이드 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 가이드핵산 결합 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성이거나 또는 완전하게 상보성일 수 있다.
상기 가이드 도메인은 PD-1 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 CTLA-4 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 A20 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 DGKA 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 DGKZ 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 FAS 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 EGR2 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 PPP2r2d 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 TET2 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 PSGL-1 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 KDM6A 유전자의 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드서열은 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
상기 gRNA는 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 에디터단백질은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질 또는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 gRNA 및 CRISPR 효소의 종류에 따라 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자에 다양한 인위적인 조작 또는 변형을 가할 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 SpCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자는 각 유전자의 표적 영역 내 존재하는 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 바람직하게는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 CjCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자는 각 유전자의 표적 영역 내 존재하는 5'-NNNNRYAC-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C 또는 T임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 바람직하게는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 StCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자는 각 유전자의 표적 영역 내 존재하는 5'-NNAGAAW-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 바람직하게는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 NmCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자는 각 유전자의 표적 영역 내 존재하는 5'-NNNNGATT-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 바람직하게는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 SaCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자는 각 유전자의 표적 영역 내 존재하는 5'-NNGRR(T)-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 바람직하게는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Cpf1 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자는 각 유전자의 표적 영역 내 존재하는 5'-TTN-3'(N은 A, T, C 또는 G임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 바람직하게는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인위적인 조작 효과는 넉아웃(knockout)일 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인위적인 조작 효과는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자에 의해 각각 암호화되는 단백질의 발현이 억제될 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인위적인 조작 효과는 넉다운(knockdown)일 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인위적인 조작 효과는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자에 의해 각각 암호화되는 단백질의 발현이 감소될 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인위적인 조작 효과는 넉인(knockin)일 수 있다.
이때, 상기 넉인 효과는 gRNA-CRISPR 효소 복합체 및 추가적으로 외부 유래 뉴클레오타이드서열 또는 유전자를 포함하는 도너에 의해 유도된 것일 수 있다.
상기 gRNA-CRISPR 효소 복합체에 의한 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자의 인위적인 조작 효과는 외부 유래 뉴클레오타이드서열 또는 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 단백질이 발현될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 조작면역세포에 관한 것이다.
“면역세포(immune cell)”는 면역 반응에 관여하는 세포로서, 면역반응에 직접 또는 간접적으로 관여하는 모든 세포 및 이들의 분화하기 전 세포를 포함한다.
면역세포는 사이토카인의 분비, 다른 면역세포의 분화, 세포 독성의 기능을 가질 수 있다. 면역세포는 자연상태로부터 변이가 일어난 세포도 포함한다.
면역세포들은 골수에 있는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)로부터 분화하여 크게 림포이드계열 전구세포 (lymhoid progenitor cells)와 미엘로이드계열 전구세포(myeloid progenitor cells)를 포함한다. 림포이드계열 전구세포가 분화하여 후천면역을 담당하는 T세포 및 B 세포; 및 미엘로이드계열 전구세포로부터 분화한 대식세포 (macrophage), 호산구(eosinophil), 호중구 (basophil), 호뉴클레오타이드구(basophil), 과립거대핵세포 (megakaryocyte), 적혈구 (erythrocyte) 등을 모두 포함한다.
구체적으로 예를 들어, 상기 세포는 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 (e.g., CD8+ naive T 세포, CD8+ effector T 세포, central memory T 세포, 또는 effector memory T 세포), CD4+ T 세포, natural killer T 세포 (NKT 세포), regulatory T 세포 (Treg), 줄기세포 memory T 세포, 림프구 전구세포 (lymphoid progenitor cell), hematopoietic 줄기세포, natural killer 세포 (NK 세포), 수지상세포(dendritic cell), 싸이토카인 유도 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer cell), PBMC(Peripheral blood mononuclear cell), 단핵세포 (monocyte), 대식세포 (macrophage), NKT(Natural Killer T)세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
“조작면역세포(manipulated immune cell)”는 자연상태가 아닌 인위적인 조작을 가한 면역세포를 의미한다. 최근, 면역세포를 체내에서 추출하고 인위적인 조작을 가하여 면역 효능을 증강하는 기술이 적극적으로 연구되고 있다. 이렇게 조작을 가한 면역세포는 특정한 질병에 대한 면역효능이 탁월하여 새로운 치료방법으로서 조명을 받고 있다. 특히, 암의 치료에 관련하여 조작면역세포의 연구가 활발히 진행되고 있다.
조작면역세포는 면역세포 조작용 조성물에 의해 인위적으로 조작 또는 변형된 면역세포일 수 있다. 이때, “면역세포 조작용 조성물”은 면역세포를 인위적으로 조작 또는 변형시키기 위해 사용되는 하나 이상의 DNA, RNA, 핵산, 단백질, 바이러스, 화합물 등의 물질을 의미하며, 예를 들어, 면역세포 조작용 조성물은 유전자 조작용 조성물 전체 또는 일부를 포함할 수 있으며, 또한 외인성 단백질을 발현하기 위한 외인성 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
조작면역세포는 유전자 조작에 의해 생성된 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 유전자 조작은 유전자의 발현 조절 과정을 고려하여 이루어질 수 있다.
일 예로, 유전자 조작은 전사 조절, RNA 가공 조절, RNA 수송 조절, RNA 분해 조절, 번역 조절 또는 단백질 변형 조절 단계에서 각 단계에 적합한 조작수단을 선택하여 이루어질 수 있다.
예를 들어, 유전자 조작은 RNAi (RNA 간섭 or RNA silencing)을 이용하여 전사된 mRNA를 단백질 합성에 이용되지 못하도록 방해하거나 경우에 따라서 파괴하여 단백질 합성정보가 중간에서 전달되지 못하게 함으로써 유전정보의 발현을 제어할 수 있다.
다른 예로, 유전자 조작은 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들(bonds)의 가수분해(절단(cleavage))을 촉매화할 수 있는 야생형 또는 변종(variant) 효소를 이용할 수 있다. 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 이용할 수 있다.
예를 들어, 유전자 조작은 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제,　CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1(Cpf1 단백질) 및 TALE-뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레아제를 이용하여 유전자를 조작하여 유전정보의 발현을 제어할 수 있다.
바람직한 예로서, 비제한적으로, 유전자 조작은 가이드핵산-에디터단백질 복합체에 의한 것일 수 있으며, 상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체 관련 설명은 상기에 기술한 바와 같다.
또한, 조작면역세포는 특정 단백질의 기능 상실 또는 손상에 의해 기능이 변형된 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 특정 단백질의 기능 상실 또는 손상은 화합물에 의한 것일 수 있다.
상기 화합물은 특정 단백질과 결합하여 면역 조절 인자의 기능을 방해할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 특정 단백질과 결합하여 면역 조절 인자의 구조를 변형시켜 정상적인 기능을 방해할 수 있다.
이 외에도 상기 특정 단백질의 기능 상실 또는 손상은 특정 단백질과 결합하는 단백질의 변형 등을 통해 유발될 수 있다.
조작면역세포는 기능조작형 면역세포 또는 복합조작형 면역세포일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, 조작면역세포는 기능조작형 면역세포일 수 있다.
상기 “기능조작형 면역세포(functionally manipulated immune cell)”는 면역세포로서, 자연상태의 면역 조절 인자의 발현이 변형되거나 면역 조절 인자의 기능이 손상되도록 인위적으로 조작된 면역세포를 의미한다.
“면역 조절 인자”는 면역 조절 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 또는 단백질로, 면역 조절 유전자에 의해 전사 및 번역되어 발현되는 면역 조절 단백질로도 지칭될 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제되도록 조작된 면역세포일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포는 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제시키기 위해 면역 조절 유전자가 조작된 면역세포일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 면역세포 활성 조절 유전자가 조작된 것일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포는 SHP-1, PD-1, CTLA-4, CBLB, ILT-2, KIR2DL4 및 PSGL-1 중 선택된 하나 이상의 유전자가 불활성화된 면역세포일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 면역세포 생장 조절 유전자가 조작된 것일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포는 DGK-alpha, DGK-zeta, FAS, EGR2, EGR3, PPP2r2d 및 A20 중 선택된 하나 이상의 유전자가 불활성화된 면역세포일 수 있다. 바람직한 실시양태는 DGK-alpha, DGK-zeta, EGR2, PPP2r2d 및 A20 중 선택된 하나 이상을 불활성화하는 것이다.
상기 기능조작형 면역세포는 면역세포 사멸 조절 유전자가 조작된 것일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포는 DAXX, BIM, BID, BAD, PD-1 및 CTLA-4 중 선택된 하나 이상의 유전자가 불활성화된 면역세포일 수 있다.
또한, 상기 기능조작형 면역세포는 스스로 사멸을 유도하는 요소가 삽입된 면역세포일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 면역세포기능소실요소가 조작된 것일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포는 TET2, WNT 및 AKT 중 선택된 하나 이상의 유전자가 불활성화된 면역세포일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 사이토카인 분비요소가 조작된 것일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 항원결합 조절 요소가 조작된 것일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포는 dCK, CD52, B2M 및 MHC 중 선택된 하나 이상의 유전자가 불활성화된 면역세포일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 상기 언급된 것들과 다른 면역 조절 유전자가 조작된 것일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 한 개 이상의 면역 조절 유전자가 동시에 조작된 것일 수 있다. 이때, 한 종류 이상의 면역 조절 유전자가 조작될 수 있다.
이때, 한 면역 조절 유전자를 조작하는 경우 반드시 한 종류의 새로운 면역효능이 나타나야만 하는 것은 아니다. 한 면역 조절 유전자의 조작은 여러 가지의 새로운 면역효능을 야기하거나 억제할 수도 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 면역 조절 유전자 외에 추가적으로 야생수용체를 암호화하는 유전자가 조작된 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 야생수용체는 TCR(T cell receptor)일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 야생수용체가 표면에 없거나 더 적은 비율로 존재하는 것일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 야생수용체가 표면에 더 많은 비율로 존재하는 것일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 야생수용체의 특정 항원에 대한 인식능력이 증강된 것일 수 있다.
상기 야생수용체와 하나 이상의 면역 조절 유전자의 조작에 의해 기능조작형 면역세포는 새로운 면역효능을 가질 수 있다.
새로운 면역효능은 특정 항원에 대한 인식능력이 조절된 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 특정 항원에 대한 인식능력이 향상된 것일 수 있다.
이때, 특정 항원은 질병의 항원일 수 있다. 예를 들어, 암세포의 항원일 수 있다.
새로운 면역효능은 특정 항원에 대한 인식능력이 저하된 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 면역능력이 향상된 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 면역세포의 생장이 조절된 것일 수 있다. 이때, 면역효능은 면역세포의 생장과 분화가 촉진하거나 완화하는 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 면역세포의 사멸이 조절된 것일 수 있다. 이때, 면역효능은 면역세포의 사멸을 막는 것일 수 있다. 또한, 면역효능은 면역세포가 적절한 시간이 지났을 때 스스로 사멸하도록 하는 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 면역세포의 기능소실이 완화된 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 면역세포의 사이토카인 분비가 조절된 것일 수 있다. 이때, 면역효능은 사이토카인의 분비를 촉진하거나 억제하는 것일 수 있다.
새로운 면역효능은 면역세포에서 야생수용체의 항원 결합능을 조절하는 것일 수 있다. 이때, 면역효능은 야생수용체의 특정 항원에 대한 특이성을 향상하는 것일 수 있다.
또한, 상기 기능조작형 면역세포는 면역 조절 인자의 기능이 손상되도록 조작된 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 면역 조절 인자의 기능 상실 또는 손상은 화합물에 의한 것일 수 있다.
상기 화합물은 면역 조절 인자 또는 면역 조절 인자의 상호작용하는 특정 단백질과 결합하여 면역 조절 인자의 기능을 방해할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 면역 조절 인자와 결합하여 면역 조절 인자의 삼차원 구조를 인위적으로 변형시켜 정상적인 기능을 방해할 수 있다.
이 외에도 상기 면역 조절 인자의 기능 상실 또는 손상은 면역 조절 인자와 상호작용하는 단백질의 변형 등을 통해 유발될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예로서, 조작면역세포는 면역 조절 유전자가 인위적으로 조작된 기능조작형 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 면역 조절 유전자는 PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포는 유전자 조작용 조성물에 의해 조작된 것일 수 있다.
상기 유전자 조작용 조성물 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 기능조작형 면역세포는 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 또는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
일 예로, 상기 기능조작형 면역세포는 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 또는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하는 면역 조절 유전자일 수 있다.
예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 위치한 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함할 수 있다.
이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 연속되지 않는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 4bp의 뉴클레오타이드는 1bp의 뉴클레오타이드 및 연속되는 3bp의 뉴클레오타이드이거나, 또는 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드 및 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 1). 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속되지 않는 30bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 30bp의 뉴클레오타이드는 연속되는 25bp의 뉴클레오타이드, 연속되는 4bp의 뉴클레오타이드 및 연속되지 않는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다.
또는 이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는 2bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 조각은 2bp 내지 5bp, 6bp 내지 10bp, 11bp 내지 15bp, 16bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 26bp 내지 30bp, 31bp 내지 35bp, 36bp 내지 40bp, 41bp 내지 45bp 또는 46bp 내지 50bp일 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 2bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 10bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 16bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 2).
또는 이때, 결실된 뉴클레오타이드는 2 이상의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 이때, 2 이상의 뉴클레오타이드 조각은 뉴클레오타이드 서열이 연속되지 않는, 즉, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 간격을 가지는 각각의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 결실된 2 이상의 뉴클레오타이드 조각에 의해 2 이상의 결실 부위가 발생할 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 2bp의 뉴클레오타이드 조각 및 6bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 12bp의 뉴클레오타이드 조각 및 6bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 3).
다른 예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함할 수 있다.
이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속되는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속되지 않는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 4bp의 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속되는 3bp의 뉴클레오타이드 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 4). 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속되지 않는 25bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 25bp의 뉴클레오타이드는 연속되는 15bp의 뉴클레오타이드, 연속되는 8bp의 뉴클레오타이드, 연속되지 않는 1bp 및 연속되지 않는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다.
또는 이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는 2bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 조각은 2bp 내지 5bp, 6bp 내지 10bp, 11bp 내지 15bp, 16bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 26bp 내지 30bp, 31bp 내지 35bp, 36bp 내지 40bp, 41bp 내지 45bp 또는 46bp 내지 50bp일 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 2bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 10bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 20bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 5).
또는 이때, 결실된 뉴클레오타이드는 2 이상의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 이때, 2 이상의 뉴클레오타이드 조각은 뉴클레오타이드 서열이 연속되지 않는, 즉, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 간격을 가지는 각각의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 결실된 2 이상의 뉴클레오타이드 조각에 의해 2 이상의 결실 부위가 발생할 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 3bp의 뉴클레오타이드 조각 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 6bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 12bp의 뉴클레오타이드 조각 및 6bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 6).
또 다른 예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내 및 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함할 수 있다.
이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속되지 않는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 3bp의 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 7). 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속되지 않는 40bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 25bp의 뉴클레오타이드는 연속되는 10bp의 뉴클레오타이드, 연속되는 8bp의 뉴클레오타이드, 연속되지 않는 5bp(연속되지 않는 1bp, 1bp, 1bp, 1bp, 1bp)의 뉴클레오타이드일 수 있다.
또는 이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는 2bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 조각은 2bp 내지 5bp, 6bp 내지 10bp, 11bp 내지 15bp, 16bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 26bp 내지 30bp, 31bp 내지 35bp, 36bp 내지 40bp, 41bp 내지 45bp 또는 46bp 내지 50bp일 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 25bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내, 표적 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 인접하여 위치하는 35bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 8).
또는 이때, 결실된 뉴클레오타이드는 2 이상의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 이때, 2 이상의 뉴클레오타이드 조각은 뉴클레오타이드 서열이 연속되지 않는, 즉, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 간격을 가지는 각각의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 결실된 2 이상의 뉴클레오타이드 조각에 의해 2 이상의 결실 부위가 발생할 수 있다. 예를 들면, 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 6bp의 뉴클레오타이드 조각과 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 13bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 17bp의 뉴클레오타이드 조각과 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 4bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 9).
다른 일 예로, 상기 기능조작형 면역세포는 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 또는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 면역 조절 유전자일 수 있다.
예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 위치한 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함할 수 있다.
이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다. 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속되지 않는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 3bp의 뉴클레오타이드는 1bp의 뉴클레오타이드 및 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속되지 않는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 4bp의 뉴클레오타이드는 1bp의 뉴클레오타이드, 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드 및 또 다른 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 10). 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속되지 않는 30bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 30bp의 뉴클레오타이드는 연속되는 15bp의 뉴클레오타이드, 연속되는 12bp의 뉴클레오타이드 및 연속되지 않는 3bp(연속되지 않는 1bp, 1bp, 1bp)일 수 있다.
또는 이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 연속되는 5bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 조각은 5bp 내지 10bp, 11bp 내지 50bp, 50bp 내지 100bp, 100bp 내지 200bp, 200bp 내지 300bp, 300bp 내지 400bp, 400bp 내지 500bp, 500bp 내지 750bp 또는 750bp 내지 1000bp일 수 있다. 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 10bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 28bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 11).
또는 이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하지 않는 외부에서 유입된 유전자일 수 있다. 또는 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하는 유전자, 예를 들어, 인간세포 게놈에 존재하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다(도 12).
다른 예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함할 수 있다.
이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다. 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속하지 않은 3bp의 뉴클레오타이드일 수있으며, 상기 연속하지 않는 3bp의 뉴클레오타이드는 1bp의 뉴클레오타이드 및 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 13). 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 연속되지 않는 40bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 연속되지 않는 40bp의 뉴클레오타이드는 연속되는 15bp의 뉴클레오타이드, 연속되는 20bp의 뉴클레오타이드 및 연속되는 5bp일 수 있다.
또는 이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 연속되는 5bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 조각은 5bp 내지 10bp, 11bp 내지 50bp, 50bp 내지 100bp, 100bp 내지 200bp, 200bp 내지 300bp, 300bp 내지 400bp, 400bp 내지 500bp, 500bp 내지 750bp 또는 750bp 내지 1000bp일 수 있다. 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 22bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 37bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 14).
또는 이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하지 않는 외부에서 유입된 유전자일 수 있다. 또는 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하는 유전자, 예를 들어, 인간세포 게놈에 존재하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다. 또는 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열 부위에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다(도 15).
또 다른 일 예로, 상기 기능조작형 면역세포는 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 또는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입을 포함하는 면역 조절 유전자일 수 있다.
예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내에 위치한 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입을 포함할 수 있다.
이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다.
이때, 삽입된 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다.
상기 삽입되는 뉴클레오타이드 조각은 5bp 내지 10bp, 11bp 내지 50bp, 50bp 내지 100bp, 100bp 내지 200bp, 200bp 내지 300bp, 300bp 내지 400bp, 400bp 내지 500bp, 500bp 내지 750bp 또는 750bp 내지 1000bp일 수 있다.
상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하지 않는 외부에서 유입된 유전자일 수 있다. 또는 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하는 유전자, 예를 들어, 인간세포 게놈에 존재하는 유전자일 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내에 유사한 위치에서 발생할 수 있으며,상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 20bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다(도 16).
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내에 서로 다른 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 결실이 발생하지 않은 다른 위치에 삽입된 12bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 5bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 결실이 발생하지 않은 다른 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다(도 17).
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내에 유사한 위치 또는 서로 다른 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드 및 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들 중 하나, 1bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 10bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 5bp의 뉴클레오타이드 및 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들 중 하나, 연속하는 5bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다(도 18).
또는 이때, 결실되는 뉴클레오타이드는 2bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다.
상기 결실되는 뉴클레오타이드 조각은 2bp 내지 5bp, 6bp 내지 10bp, 11bp 내지 15bp, 16bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 26bp 내지 30bp, 31bp 내지 35bp, 36bp 내지 40bp, 41bp 내지 45bp 또는 46bp 내지 50bp일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내에 유사한 위치에서 발생할 수 있으며,상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 10bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 17bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 20bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 15bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 내생의 유전자(endogenous gene)는 표적 유전자, 즉, 면역 조절 유전자의 대립 유전자이거나 또는 표적 유전자 외의 다른 유전자일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 7bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(도 19).
또는 이때, 결실되는 뉴클레오타이드는 2 이상의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다. 또한, 상기 삽입은 결실된 2 이상의 부위에 일부 또는 전체 부위에서 발생할 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내에 유사한 위치 및/또는 서로 다른 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 6bp의 뉴클레오타이드 조각 및 12bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들 중 하나, 6bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 15bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 12bp의 뉴클레오타이드 조각 및 8bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 12bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 13bp의 뉴클레오타이드 조각 및 8bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 13bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 7bp의 뉴클레오타이드 조각 및 8bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 7bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열 및 8bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 9bp의 뉴클레오타이드 조각 및 8bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 9bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 8bp의 전체 뉴클레오타이드 조각 및 8bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(도 20).
다른 예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입을 포함할 수 있다.
이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다.
상기 삽입되는 뉴클레오타이드 조각은 5bp 내지 10bp, 11bp 내지 50bp, 50bp 내지 100bp, 100bp 내지 200bp, 200bp 내지 300bp, 300bp 내지 400bp, 400bp 내지 500bp, 500bp 내지 750bp 또는 750bp 내지 1000bp일 수 있다.
상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하지 않는 외부에서 유입된 유전자일 수 있다. 또는 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하는 유전자, 예를 들어, 인간세포 게놈에 존재하는 유전자일 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 20bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드 및 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 1bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열 및 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 21).
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치 또는 서로 다른 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 1bp의 뉴클레오타이드 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들 중 하나, 연속하는 3bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 8bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접한 결실이 발생하지 않은 다른 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(도 22).
또는 이때, 결실되는 뉴클레오타이드는 2bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다.
상기 결실되는 뉴클레오타이드 조각은 2bp 내지 5bp, 6bp 내지 10bp, 11bp 내지 15bp, 16bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 26bp 내지 30bp, 31bp 내지 35bp, 36bp 내지 40bp, 41bp 내지 45bp 또는 46bp 내지 50bp일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 17bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 연속되는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 15bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 30bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 15bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 25bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(도 23).
또는 이때, 결실되는 뉴클레오타이드는 2 이상의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4 또는 5bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다. 또한, 상기 삽입은 결실된 2 이상의 부위에 일부 또는 전체 부위에서 발생할 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 7bp의 뉴클레오타이드 조각 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 18bp의 뉴클레오타이드 조각 일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 7bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열 및 18bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 12bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 10bp의 뉴클레오타이드 조각 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 6bp의 뉴클레오타이드 조각 일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 10bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열 및 6bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있다(도 24).
또 다른 예를 들어, 상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 표적 서열 내 및 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입을 포함할 수 있다.
이때, 결실된 뉴클레오타이드는 연속되는; 연속되지 않는; 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp 일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다.
상기 삽입되는 뉴클레오타이드 조각은 5bp 내지 10bp, 11bp 내지 50bp, 50bp 내지 100bp, 100bp 내지 200bp, 200bp 내지 300bp, 300bp 내지 400bp, 400bp 내지 500bp, 500bp 내지 750bp 또는 750bp 내지 1000bp일 수 있다.
상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하지 않는 외부에서 유입된 유전자일 수 있다. 또는 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간세포가 포함하는 유전자, 예를 들어, 인간세포 게놈에 존재하는 유전자일 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내, 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 4bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 5bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 표적 서열 내에 위치하는 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 10bp의 뉴클레오타이드 조각 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 2bp의 뉴클레오타이드가 결실된 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(도 25).
또는 이때, 결실되는 뉴클레오타이드는 2bp 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 조각일 수 있다.
상기 결실되는 뉴클레오타이드 조각은 2bp 내지 5bp, 6bp 내지 10bp, 11bp 내지 15bp, 16bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 26bp 내지 30bp, 31bp 내지 35bp, 36bp 내지 40bp, 41bp 내지 45bp 또는 46bp 내지 50bp일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내, 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 25bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내, 표적 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 인접하여 위치하는 30bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 결실된 뉴클레오타이드 서열 위치에 삽입된 45bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다(도 26).
또는 이때, 결실되는 뉴클레오타이드는 2 이상의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다.
이때, 삽입되는 뉴클레오타이드는 연속되는, 연속되지 않는, 또는 두 가지 형태(즉, 연속 및 연속되지 않은)가 혼합된 1 내지 50bp; 뉴클레오타이드 조각; 또는 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 상기 결실과 삽입은 순차적으로 일어나거나 동시에 발생할 수 있다. 또한, 상기 삽입은 결실된 2 이상의 부위에 일부 또는 전체 부위에서 발생할 수 있다.
예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입은 표적 서열 내, 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 유사한 위치에서 발생할 수 있으며, 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 25bp의 뉴클레오타이드 조각 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 6bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 25bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열 및 6bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 20bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있다. 또는 상기 결실된 뉴클레오타이드는 표적 서열 내 및 표적 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 10bp의 뉴클레오타이드 조각과 표적 서열 내 및 표적 서열의 3' 말단에 인접하여 위치하는 22bp의 뉴클레오타이드 조각일 수 있으며, 이때, 상기 삽입된 뉴클레오타이드는 두 개의 결실된 뉴클레오타이드 서열들에 각각, 즉, 10bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 내생의 유전자(endogenous gene)의 일부 뉴클레오타이드 서열 및 22bp의 뉴클레오타이드 조각이 결실된 위치에 삽입된 외인성의 유전자(exogenous gene)의 전체 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(도 27).
상기 기능조작형 면역세포는 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
상기 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 SpCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 또는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 CjCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 5'-NNNNRYAC-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C 또는 T임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 또는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 StCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 5'-NNAGAAW-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 또는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 NmCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 5'-NNNNGATT-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 또는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 SaCas9 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 5'-NNGRR(T)-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 또는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Cpf1 단백질인 경우, 상기 인위적인 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 5'-TTN-3'(N은 A, T, C 또는 G임) PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp, 1bp 내지 40bp, 1bp 내지 30bp, 또는 1bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열 부위 내에 다음 중 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실,
ii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환,
iii) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 또는
iv) 상기 i) 내지 iii) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.
상기 상기 기능조작형 면역세포는 넉아웃(knockout)된 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 넉아웃(knockout)은 면역 조절 유전자의 인위적 조작 또는 변형에 의한 효과일 수 있다.
이때, 상기 넉아웃(knockout)은 인위적으로 조작 또는 변형에 의해 면역 조절 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 억제되는 것일 수 있다.
상기 상기 기능조작형 면역세포는 넉다운(knockdown)된 하나 이상의 인위적으로 조작 또는 변형된 면역 조절 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 넉다운(knockdown)은 면역 조절 유전자의 인위적 조작 또는 변형에 의한 효과일 수 있다.
이때, 상기 넉다운(knockdown)은 인위적으로 조작 또는 변형에 의해 면역 조절 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 감소되는 것일 수 있다.
상기 상기 기능조작형 면역세포는 하나 이상의 넉인(knockin)된 외부 유래 핵산 또는 외부 유래 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 넉인(knockin)된 외부 유래 핵산 또는 외부 유래 유전자는 면역 조절 유전자의 인위적 조작 또는 변형에 의해 도입된 것일 수 있다.
이때, 상기 하나 이상의 넉인(knockin)된 외부 유래 핵산 또는 외부 유래 유전자는 암호화하는 외부 유래 펩타이드 또는 외부 유래 단백질의 발현시킬 수 있다.
또한, 상기 기능조작형 면역세포는 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제된 면역세포일 수 있다.
이때, 면역 조절 인자는 면역 조절 유전자, 즉, PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및/또는 KDM6A 유전자에 의해 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포의 변형된 면역 조절 인자의 발현량은 야생형 면역세포, 즉, 자연적으로 발생한 면역세포에서 발현되는 면역 조절 인자의 발현량과 비교하여 적어도 30%이상 발현량이 감소된 것일 수 있다. 이때, 비교 기준이 되는 야생형 면역세포의 면역 조절 인자의 발현량은 면역 이상 질환, 예를 들면, 암, 후천면역결핍증후군(AIDS) 등을 가지지 않는 건강한 사람들에게서 추출된 자연 발생적으로 존재하는 야생형 면역세포에서 면역 조절 인자의 발현량 평균치일 수 있으며, 이때, 모집단, 즉 야생형 면역세포를 수득할 수 있는 건강한 사람은 최소 50명 이상일 수 있다.
이때, 기능조작형 면역세포의 변형된 면역 조절 인자의 발현량은 야생형 면역세포, 즉, 인위적으로 조작되기 전의 면역세포에서 발현되는 면역 조절 인자의 발현량과 비교하여 적어도 30%이상 발현량이 감소된 것일 수 있다. 이때, 비교 기준이 되는 야생형 면역세포의 면역 조절 인자의 발현량은 인위적인 조작을 가하기 전, 예를 들면, 인간에서 분리한 면역세포로, 면역 조절 유전자을 표적하는 유전자 조작용 조성물 또는 면역세포 조작용 조성물을 처리하기 전의 면역세포일 수 있으며, 이러한 야생형 면역세포에서 발현되는 면역 조절 인자의 발현량 평균치일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, 조작면역세포는 복합조작형 면역세포일 수 있다.
상기 “복합조작형 면역세포(hybrid manipulated immune cell)”는 면역세포로서, 하나 이상의 인공구조(artificial structure)가 부가된 인위적으로 조작된 기능조작형 면역세포 또는 자연상태의 면역 조절 인자의 발현이 변형되거나 면역 조절 인자의 기능이 손상되도록 인위적으로 조작된 인공구조부가형 면역세포(artificial structure supplemented immune cell)를 의미한다.
"인공구조부가형 면역세포"는 면역세포 내 하나 이상의 인공구조를 부가시킨 것을 의미한다.
예를 들어, 상기 인공구조는 인공 수용체일 수 있다.
"인공 수용체(artificial receptor)"는 야생형 수용체가 아닌 인위적으로 만들어진, 항원에 대한 인식능력을 가지며 특정한 기능을 하는 기능체를 의미한다.
이러한 인공 수용체는 특정 항원에 대한 인식능력이 개선되거나 증강된 면역반응신호를 생성하여 면역반응의 향상에 기여할 수 있다.
일 예로, 인공 수용체는 하기와 같은 구성을 가질 수 있다.
(i) 항원인식부
인공 수용체는 항원인식부를 포함한다.
"항원인식부(antigen recognizing part)"는 인공수용체의 일부로서 항원을 인식하는 부위를 의미한다.
항원인식부는 특정 항원에 대한 인식능력이 야생수용체보다 개선된 것일 수 있다. 이때, 특정 항원은 암세포의 항원일 수 있다. 또한, 특정 항원은 일반적인 체내 세포의 항원일 수 있다.
항원인식부는 항원과의 친결합성을 가질 수 있다.
항원인식부는 항원과 결합하면서 신호를 생성할 수 있다. 상기 신호는 전기적 신호일 수 있다. 상기 신호는 화학적 신호일 수 있다.
항원인식부는 신호서열을 포함할 수 있다.
상기 신호서열은 단백질이 합성되는 과정에서 단백질을 특정한 위치로 전달되도록하는 펩타이드 서열을 의미한다.
신호서열은 항원인식부의 N 말단에 가까운 위치에 있을 수 있다. 이때, N 말단으로부터의 거리는 100개 아미노산 내외일 수 있다. 신호서열은 항원인식부의 C 말단에 가까운 위치에 있을 수 있다. 이때, C 말단으로부터의 거리는 100개 아미노산 내외일 수 있다.
항원인식부는 제1 신호발생부와 유기적인 기능 관계를 가질 수 있다.
항원인식부는 항체의 Fab 도메인과 상동성이 있을 수 있다.
항원인식부는 scFv(single-chain variable fragment)일 수 있다.
항원인식부는 그 자체로서 항원을 인식하거나 또는 항원인식구조체를 형성하여 항원을 인식 가능할 수 있다.
항원인식구조체는 특정 구조를 이루어야 항원을 인식할 수 있고, 이러한 특정 구조를 이루는 단위체 및 상기 단위체들의 결합은 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 이해할 수 있다. 또한 항원인식구조체는 1개 또는 2이상의 단위체로 구성될 수 있다.
항원인식구조체는 단위체가 일렬로 연결된 구조일 수 있거나, 또는 병렬적으로 연결된 구조일 수 있다.
일렬로 연결된 구조는 2이상의 단위체가 일 방향으로 이어서 연속적으로 결합되어 있는 형태를 의미하고, 병렬적으로 연결된 구조는 1개의 단위체의 말단부위에 2개 이상의 각 단위체가 동시에, 예를 들어 서로 다른 방향으로 결합되어 있는 형태를 의미한다.
예를 들어,
상기 단위체는 무기물일 수 있다.
상기 단위체는 생화학적 리간드일 수 있다.
상기 단위체는 야생형 수용체의 항원인식부와 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 항체 단백질과 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 이뮤노글로불린의 중쇄부(heavy chain) 또는 이와 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 이뮤노글로불린의 경쇄부(light chain) 또는 이와 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 신호서열을 포함할 수 있다.
한편, 상기 단위체는 화학적 결합으로 결합되어 있거나, 특정 결합부를 통해 결합되어 있을 수 있다.
"항원인식구조단위체 결합부(antigen recognizing unit uniting part)"는 항원인식구조단위체가 서로 결합되는 부위로서, 두 개 이상의 항원인식구조단위체로 이루어진 항원인식구조체가 있을 때 존재하는 선택적인 구성일 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 펩타이드일 수 있다. 이때, 결합부는 세린과 트레오닌의 비율이 높을 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 화학적 결합일 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 특정 길이를 가짐으로써 항원인식구조단위체의 입체구조 발현을 도울 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 항원인식구조단위체 간에 특정한 위치 관계를 갖도록 하여 항원인식구조체의 기능을 도울 수 있다.
(ii) 수용체몸체부
인공 수용체는 수용체몸체부를 포함한다.
"수용체몸체부"는 항원인식부와 신호발생부 간의 연결을 매개하는 부위로서, 항원인식부와 신호발생부를 물리적으로 연결하는 것일 수 있다.
수용체몸체부의 기능은 항원인식부 또는 신호발생부에서 생성한 신호를 전달하는 것일 수 있다.
수용체몸체부의 구조는 경우에 따라 신호발생부의 기능을 동시에 가질 수도 있다.
수용체몸체부의 기능은 인공수용기체가 면역세포에 위치함에 있어 인공수용기체가 고정되도록 하는 것일 수 있다.
수용체몸체부는 아미노산 나선 구조를 포함할 수 있다.
수용체몸체부의 구조는 체내에 존재하는 일반적인 수용체(receptor) 단백질의 일부와 상동성이 있는 부분을 포함할 수 있다. 상동성의 범위는 50 내지 100%일 수 있다.
수용체몸체부의 구조는 면역세포 상의 단백질과 상동성이 있는 부분을 포함할 수 있다. 상동성의 범위는 50 내지 100%일 수 있다.
예를 들어,
수용체몸체부는 CD8 막횡단 영역(transmembrane domain)일 수 있다.
수용체몸체부는 CD28 막횡단 영역일 수 있다. 이때 제2 신호발생부가 CD28인 경우, CD28은 동시에 제2 신호발생부와 수용체몸체부의 기능을 할 수 있다.
(iii) 신호발생부
인공 수용체는 신호발생부를 포함할 수 있다.
"제1 신호발생부"는 인공수용체의 일부로서 면역반응신호를 생성하는 부위를 말한다.
"제2 신호발생부"는 인공수용체의 일부로서 제1 신호발생부와 상호작용하여 또는 독립적으로 면역반응신호를 생성하는 부위를 말한다.
인공 수용체는 제1 신호발생부 및/또는 제 2신호발생부를 포함할 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부를 각각 2개 이상 포함할 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부는 특정 서열모티프를 포함할 수 있다.
서열모티프는 CD(cluster of designition) 단백질의 모티프와 상동성이 있을 수 있다.
이때, CD 단백질은 CD3, CD247, CD79일 수 있다.
서열모티프는 YxxL/I의 아미노산 서열일 수 있다.
서열모티프는 제1 및/또는 제2 신호발생부에 다중적으로 포함될 수 있다.
이때, 첫 번째 서열모티프는 제1 신호발생부의 시작 위치로부터 1 내지 200 아미노산 갯수만큼 떨어진 위치에 있을 수 있다. 두 번째 서열모티프는 제2 신호발생부의 시작 위치로부터 1 내지 200 아미노산 갯수만큼 떨어진 위치에 있을 수 있다.
또한, 각 서열모티프 간의 이격은 1 내지 15 아미노산 갯수일 수 있다.
이 때, 바람직한 각 서열모티프 간의 이격은 6 내지 8 아미노산 갯수이다.
예를 들어,
제1 및/또는 제2 신호발생부는 CD3 ζ일 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부는 FcεRIγ일 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부는 특정 조건이 만족 되어야만 면역반응 신호를 생성하는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부가 항원을 인식하는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부가 항원과 결합을 형성하는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부와 항원이 결합을 형성할 때 생성된 신호를 전달받는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부가 항원을 인식하거나 결합하다가 분리되는 것일 수 있다.
면역반응신호는 면역세포의 생장과 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역세포의 사멸과 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역세포의 활성과 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역반응의 보조와 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 항원인식부에서 생성된 신호와 특이적일 수 있다.
면역반응신호는 목적 유전자의 발현을 조절하는 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역반응을 억제하는 신호일 수 있다.
일 예에서, 상기 신호발생부는 부가적 신호발생부를 포함할 수 있다.
"부가적 신호발생부"는 인공수용체의 일부로서 제1 및/또는 제2 신호발생부가 생성하는 면역반응신호에 대하여 부가적인 면역반응신호를 생성하는 부위를 의미한다.
이하 부가적 신호발생부는 그 순서에 따라 제n 신호발생부(n≠1)로 호칭한다.
인공수용체는 제1 신호발생부 외에도 부가적 신호발생부를 포함할 수 있다.
부가적 신호발생부는 2개 이상이 인공수용체에 포함될 수 있다.
부가적 신호발생부는 4-1BB, CD27, CD28, ICOS, OX40 혹은 그 외의 면역반응신호를 발생하는 구조일 수 있다.
부가적 신호발생부가 면역반응신호를 생성하는 조건 및 생성하는 면역반응신호의 특성은 상기 제1 및/또는 제2 신호발생부의 면역반응신호와 상응하는 내용을 포함한다.
면역반응신호는 사이토카인의 합성을 촉진하는 것일 수 있다. 이때, 사이토카인은 바람직하게는 IL-2, TNFα 또는 IFN-γ일 수 있다.
면역반응신호는 다른 면역세포의 생장 또는 분화를 돕는 신호일 수 있다.
면역반응신호는 다른 면역세포를 신호가 발생하는 위치로 유인하는 신호일 수 있다.
본 발명은 인공수용체의 모든 가능한 결합관계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인공수용체의 양태는 여기서 언급한 것들에만 한정되지 않는다.
인공수용체는 항원인식부-수용체몸체부-제1 신호발생부로 구성될 수 있다. 수용체몸체부는 선택적으로 포함될 수 있다.
인공수용체는 항원인식부-수용체몸체부-제2 신호발생부-제1 신호발생부로 구성될 수 있다. 수용체몸체부는 선택적으로 포함될 수 있다. 이때, 제1 신호발생부와 제2 신호발생부의 위치는 바뀔 수 있다.
인공수용체는 항원인식부-수용체몸체부-제2 신호발생부-제3 신호발생부-제1 신호발생부로 구성될 수 있다. 수용체몸체부는 선택적으로 포함될 수 있다. 이때, 제1 신호발생부 내지 제3 신호발생부의 위치는 바뀔 수 있다.
인공수용체에서 신호발생부의 갯수는 1 내지 3개에 한정되지 않고, 3개를 초과하여 포함될 수 있다.
상기 예들 외에도 인공수용체는 항원인식부-신호발생부-수용체몸체부의 구조를 가질 수 있다. 상기 구조는 인공수용체를 갖는 세포 외에서 작용하는 면역반응신호를 생성해야 하는 때에 유리할 수 있다.
인공수용체는 야생 수용체에 상응하는 기능을 할 수 있다.
인공수용체는 특정 항원과 결합을 형성하여 특정 위치관계를 형성하는 기능을 할 수 있다.
인공수용체는 특정 항원을 인식하여 특정 항원에 대한 면역반응을 촉진하는 면역반응신호를 생성하는 기능을 할 수 있다.
인공수용체는 일반적인 체내세포의 항원을 인식하여 체내세포에 대한 면역반응을 억제하는 기능을 할 수 있다.
(iv) 신호서열
일 예에서, 상기 인공 수용체는 신호서열을 선택적으로 포함할 수 있다.
인공 수용체가 특정 단백질의 신호서열을 포함한다면 인공 수용체가 면역세포 막에 용이하게 위치하는 데 도움을 줄 수 있다. 바람직하게는, 면역세포 안에 있는 인공 수용체가 막관통단백질의 신호서열을 포함한다면 인공 수용체가 면역세포막을 통과하여, 면역세포의 외막에 위치하는 것을 도울 수 있다.
인공 수용체는 하나 이상의 신호서열을 포함할 수 있다.
신호서열은 양전하 아미노산을 많이 포함할 수 있다.
신호서열은 N 또는 C 말단에 가까운 위치에 양전하 아미노산을 포함할 수 있다.
신호서열은 막관통단백질의 신호서열일 수 있다.
신호서열은 면역세포의 외막에 위치한 단백질의 신호서열일 수 있다.
신호서열은 바람직하게는 scFv의 신호서열이다.
상기 신호서열은 인공수용체가 갖는 구조, 즉 항원인식부, 수용체몸체부, 제1 신호발생부, 부가적 신호발생부에 포함될 수 있다.
이때, 신호서열은 각 구조의 N 또는 C 말단에 가까운 위치에 있을 수 있다.
이때, N 또는 C 말단으로부터의 거리는 100개 아미노산 내외일 수 있다.
일 구체예로, 인공 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)일 수 있다.
상기 키메릭 항원 수용체는 하나 이상의 항원에 결합 특이성을 가지는 수용체일 수 있다.
상기 하나 이상의 항원은 암세포 및/또는 바이러스 특이적으로 발현되는 항원일 수 있다.
상기 하나 이상의 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen)일 수 있다.
상기 하나 이상의 항원은, 이에 제한되지 않지만, A33, ALK, 알파페토단백질(AFP), 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3), alpha-folate receptor, AD034, AKT1, BCMA, 베타-인간 융모막 고나도트로핀, B7H3(CD276), BST2, BRAP, CD5, CD13, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44v6, CD52, CD72, CD79a, CD79b, CD89, CD97, CD123, CD138, CD160, CD171, CD179a, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CA-125, 발암배아성 항원(CEA), CCR4, C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1), 클라우딘 6(CLDN6), CXORF61, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, ERBB2, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 신장 인자 2 돌연변이된(ELF2M), 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2), EMR2, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3), FCRL5, Fibulin-1, G250, GD2, 당단백질 36(gp36), 당단백질 100(gp100), 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), GPRC5D, GloboH, G 단백질-결합된 수용체 20(GPR20), GPC3, hsp70-2, 고분자량-흑색종-관련 항원(HMWMAA), A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1), 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6), 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7), HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Galectin9, HOM-MEEL- 40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB 1, 인슐린 성장 인자(IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2), 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra), IGLL1, KIT(CD117), KM-HN-3, KM-KN- 1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGA-1a, LAGE-1, LAIR1, LILRA2, LY75, Lewis Y antigen, MUC1, MN-CA IX, M-CSF, MAGE-1, MAGE-4a, 메소텔린, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MART1, MPPl 1, MSLN, 신경세포 부착 분자(NCAM), NY-ESO-1, NY-ESO-5, Nkp30, NKG2D, 유선 분화 항원(NY-BR-1), NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NNP-1, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK1 1, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2), OGFr, PSMA, 전립선 산성 포스파타제(PAP), p53, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 프로테아제세린 21(테스티신 또는 PRSS21), 혈소판-유래된 성장인자 수용체 베타(PDGFR-beta), PLAC1, 파넥신 3(PANX3), PLU-1, ROR-1, RAGE-1, RU1, RU2, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4), SCP1, SSX3, SSX4, SSX5, Tyrp-1, TAG72, 티로글로불린, 인간 텔로머라제역전사효소(hTERT), 5T4, 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제(Tyrosinase), 트랜스글루타미나제 5(TGS5), TEM1, TEM7R, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), Tie 2, TRP-2, TOP2A, TOP2B, 유로플라킨 2(UPK2), 비멘틴(Vimentin), 혈관 내피성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름 종양 단백질(WT1) 또는 루이스(Y) 항원 등일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구체예로서, 복합조작형 면역세포는 다음을 모두 포함하는 인위적으로 조작된 면역세포일 수 있다:
(i) 인위적으로 조작 또는 변형된 하나 이상의 면역 조절 유전자 및/또는 이의 발현산물; 및
(ii) 인공 수용체 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산.
상기 인위적으로 조작 또는 변형된 하나 이상의 면역 조절 유전자 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 (i)의 발현산물은 인위적으로 조작 또는 변형된 하나 이상의 면역 조절 유전자에 의해 발현되는 mRNA 또는 단백질일 수 있다.
또한, 상기 인공 수용체 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
예를 들어, 상기 복합조작형 면역세포는 인공 수용체를 포함하는 기능조작형 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 인공 수용체는 키메릭 항원 수용체일 수 있으며, 이와 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 복합조작형 면역세포는 하나 이상의 키메릭 항원 수용체를 포함하는 하나 이상의 면역 조절유전자가 인위적으로 조작 또는 변형된 면역세포일 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 면역 조절 유전자가 인위적으로 조작 또는 변형된 면역세포는 기능조작형 면역세포일 수 있으며, 이와 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 복합조작형 면역세포는 하나 이상의 키메릭 항원 수용체를 포함하는 하나 이상의 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제된 면역세포일 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제된 면역세포 기능조작형 면역세포일 수 있으며, 이와 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
일 예로, 복합조작형 면역세포는 하나 이상의 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자가 기능조작형 면역세포에 인위적으로 도입시킴으로써 생성된 면역세포일 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈에 삽입되지 않는 형태로 세포 내에 존재할 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈 중 특정 유전자 자리에 삽입될 수 있다. 상기 특정 유전자 자리는 면역 조절 유전자의 인트론, 엑손, 프로모터 또는 인핸서 위치일 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈 내에 존재하는 인트론들 중 랜덤하게 하나 이상의 인트론에 삽입될 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈 내에 존재하는 엑손들 중 랜덤하게 하나 이상의 엑손에 삽입될 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈 내에 존재하는 프로모터들 중 랜덤하게 하나 이상의 프로모터에 삽입될 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈 내에 존재하는 인핸서들 중 랜덤하게 하나 이상의 인핸서에 삽입될 수 있다.
이때, 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자는 기능조작형 면역세포의 게놈 내에 존재하는 인트론, 엑손, 프로모터 및 인핸서를 제외한 부분 중 랜덤하게 하나 이상의 부분에 삽입될 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포에 인위적으로 도입된 키메라 항원 수용체는 복합조작형 면역세포 내에서 단백질의 형태로 발현될 수 있으며, 단백질로 발현된 키메라 항원 수용체는 복합조작형 면역세포의 표면에 위치할 수 있다. 이때, 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 또는 유전자가 인위적으로 도입된 기능조작형 면역세포는 복합조작형 면역세포의 일 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 복합 조작형 면역세포는 하나 이상의 키메릭 항원 수용체 단백질을 기능조작형 면역세포에 인위적으로 도입시킴으로써 생성된 면역세포일 수 있다.
상기 기능조작형 면역세포에 인위적으로 도입된 키메라 항원 수용체 단백질은 복합조작형 면역세포의 표면에 위치할 수 있다. 이때, 키메라 항원 수용체 단백질이 인위적으로 도입된 기능조작형 면역세포는 복합조작형 면역세포의 일 형태일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 복합조작형 면역세포는 인위적으로 조작 또는 변형된 하나 이상의 면역 조절 유전자를 포함하는 인공구조부가형 면역세포일 수 있다.
이때, 인공구조부가형 면역세포는 인공 수용체를 포함하는 면역세포일 수 있다. 상기 인공 수용체는 키메릭 항원 수용체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작 또는 변형된 하나 이상의 면역 조절 유전자가 포함된 인공구조부가형 면역세포는 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제될 수 있다. 이때, 하나 이상의 면역 조절 유전자가 인위적으로 변형된 인공구조부가형 면역세포는 복합조작형 면역세포의 일 형태일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 복합조작형 면역세포는 하나 이상의 면역 조절 인자의 발현이 저해 또는 억제된 인공구조부가형 면역세포일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 조작면역세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
인위적으로 조작된 면역 조절 유전자에 관한 설명은 앞서 기재한 설명을 참조할 수 있다. 이하, 조작면역세포의 대표적인 예시 중심으로 상기 방법을 설명한다.
일 예로, 상기 조작면역세포를 제조하는 방법은 기능조작형 면역세포를 제조하는 방법일 수 있다. 상기 방법은 생체 내, 생체 외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 인간 또는 비인간 동물로부터 세포 또는 세포 집단을 시료추출하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 변형하는 단계를 포함한다. 배양은 생체외에서 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 심지어 비인간 동물 또는 식물에 재도입될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은
(a) 면역세포;
(b) PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작할 수 있는 유전자 조작용 조성물
을 접촉시키는 단계를 포함하는 인위적으로 조작된 하나 이상의 면역 조절 유전자를 포함하는 기능조작형 면역세포 제조 방법일 수 있다.
이때, 상기 (a) 면역세포는 인체에서 분리한 면역세포 또는 줄기세포로부터 분화시킨 면역세포일 수 있다.
상기 (b) 유전자 조작용 조성물은
(b') PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자의 핵산서열 중 서열번호 1 내지 289번의 표적서열에 상동성을 가지거나 또는 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드핵산; 및
(b'') 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 에디터단백질을 포함할 수 있다.
상기 유전자 조작용 조성물 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 접촉시키는 단계는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 (b) 유전자 조작용 조성물을 (a) 면역세포로 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 생체 내 또는 생체 외, 예컨대 인체 외에서 진행되는 것일 수 있다.
예를 들어, 접촉시키는 단계는 생체외에서 수행될 수 있고, 접촉된 세포는 접촉시키는 단계 후에 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
상기 방법은 생체 내의 면역세포 또는 생체, 예컨대, 인체로부터 분리된 면역세포 또는 인공적으로 생산한 면역세포를 이용할 수 있다. 일 예로서, 암으로 고통받는 대상체로부터의 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 면역 세포는, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류를 포함하는 포유동물에서 유래한 면역세포일 수 있다. 예를 들어 NKT 세포, NK세포, T 세포 등일 수 있다. 이 때, 면역 수용체(immune receptor)가 부가된 (예를 들어, CAR(키메라 항원 수용체), 또는 조작된 TCR(T-세포 수용체) 부가) 조작된 면역세포일 수 있다.
상기 방법은 면역세포에 적합한 배지, 예컨대, 혈청 (예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFNgammaI1L-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-15, TGF-beta, 및 TNF-alpha 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존능력(viability)에 필요한 인자들을 포함할 수 있는, 적절한 배지 (예컨대, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo-10, -15, -20, (Lonza))에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 일 예로, 상기 조작면역세포를 제조하는 방법은 복합조작형 면역세포를 제조하는 방법일 수 있다. 상기 방법은 생체 내, 생체 외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 인간 또는 비인간 동물로부터 세포 또는 세포 집단을 시료추출하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 변형하는 단계를 포함한다. 배양은 생체외에서 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 심지어 비인간 동물 또는 식물에 재도입될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은
(a) 면역세포;
(b) 인공 수용체 발현용 조성물 또는 인공 수용체 단백질; 및
(c) PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작할 수 있는 유전자 조작용 조성물
을 접촉시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 인위적으로 조작된 면역 조절 유전자 및 하나 이상의 인공 수용체를 포함하는 복합조작형 면역세포 제조 방법일 수 있다.
상기 (a) 면역세포는 인체에서 분리한 면역세포 또는 줄기세포로부터 분화시킨 면역세포일 수 있다.
상기 (b) 인공 수용체 발현용 조성물은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 벡터를 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 (b) 인공 수용체 발현용 조성물은 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 면역세포 내에 도입될 수 있다.
예를 들어, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1이상일 수 있다.
상기 (c) 유전자 조작용 조성물은
(c') PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자의 핵산서열 중 서열번호 1 내지 289번의 표적서열에 상동성을 가지거나 또는 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드핵산; 및
(c'') 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 에디터단백질을 포함할 수 있다.
상기 유전자 조작용 조성물 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 접촉시키는 단계는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 (a) 면역세포에 (b) 인공 수용체 발현용 조성물과 (c) 유전자 조작용 조성물을 순차적으로 접촉시키거나 또는 동시에 접촉시키는 것일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 (a) 면역세포에 (c) 유전자 조작용 조성물과 (b) 인공 수용체 발현용 조성물을 순차적으로 접촉시키거나 또는 동시에 접촉시키는 것일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 (b) 인공 수용체 발현용 조성물과 (c) 유전자 조작용 조성물을 (a) 면역세포로 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 생체 내 또는 생체 외, 예컨대 인체 외에서 진행되는 것일 수 있다.
예를 들어, 접촉시키는 단계는 생체외에서 수행될 수 있고, 접촉된 세포는 접촉시키는 단계 후에 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
상기 방법은 생체 내의 면역세포 또는 생체, 예컨대, 인체로부터 분리된 면역세포 또는 인공적으로 생산한 면역세포를 이용할 수 있다. 일 예로서, 암으로 고통받는 대상체로부터의 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 면역 세포는, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류를 포함하는 포유동물에서 유래한 면역세포일 수 있다. 예를 들어 NKT 세포, NK세포, T 세포 등일 수 있다. 이 때, 면역 수용체(immune receptor)가 부가된 (예를 들어, CAR(키메라 항원 수용체), 또는 조작된 TCR(T-세포 수용체) 부가) 조작된 면역세포일 수 있다.
상기 방법은 면역세포에 적합한 배지, 예컨대, 혈청 (예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFNgamma, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-15, TGF-beta, 및 TNF-alpha 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존능력(viability)에 필요한 인자들을 포함할 수 있는, 적절한 배지 (예컨대, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo-10, -15, -20, (Lonza))에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 태양은 조작면역세포를 이용한 질병 치료방법에 관한 것이다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구체예는 대상체에 대한 인위적으로 조작된 세포, 예컨대 유전적으로 조작된 키메라 항원 수용체 함유 면역세포의 투여를 포함하는 면역요법 접근을 사용하는 질환 치료 용도이다.
치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구체예는 인위적으로 조작된 면역세포를 이용하여 질환 치료에 이용하고자 하는 약학적 조성물이다.
상기 약학적 조성물은 면역 반응을 이용하여 질환 치료에 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 조작면역세포를 함유하는 조성물이다. 상기 약학적 조성물은 치료용 조성물 또는 세포치료제로도 칭할 수 있다.
일 예로, 상기 약학적 조성물은 기능조작형 면역세포를 포함할 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 기능조작형 면역세포 집단(population)은 약학적 조성물에 포함되는 전체 면역세포 집단의 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 100%를 차지할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 약학적 조성물은 복합조작형 면역세포를 포함할 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 기능조작형 면역세포 집단(population)은 약학적 조성물에 포함되는 전체 면역세포 집단의 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 100%를 차지할 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 약학적 조성물은 기능조작형 면역세포 및 복합조작형 면역세포를 포함할 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 기능조작형 면역세포 집단(population)은 약학적 조성물에 포함되는 전체 면역세포 집단의 1% 내지 20%, 20% 내지 60%, 60% 내지 80% 또는 80% 내지 99%를 차지할 수 있으며, 이때, 상기 복합조작형 면역세포 집단(population)은 약학적 조성물에 포함되는 전체 면역세포 집단의 80% 내지 99%, 60% 내지 80%, 40% 내지 60%, 20% 내지 40% 또는 1% 내지 20%를 차지할 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물은 부가적 요소를 추가로 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 약학적 조성물은 면역 체크포인트 저해제(immune checkpoint inhibitor)를 포함할 수 있다.
이때, 상기 면역체크포인트 저해제는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, BTLA, IDO, VISTA, ICOS, KIRs, CD160, CD244 또는 CD39의 저해제일 수 있다. 이때, 상기 저해제는 항체; 화합물; 면역 체크포인트와 결합하거나 상호작용할 수 있는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질; RNA 간섭(RNA interference; RNAi)을 위한 microRNA(miRNA), small interfering RNA(siRNA) 또는 short hairpin RNA(shRNA); 또는 면역 체크포인트 유전자의 녹아웃 또는 녹다운을 위한 Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nucleases(TALEN) 또는 CRISPR/Cas system 등의 뉴클레아제일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
상기 약학적 조성물은 항원결합매개체를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 사이토카인을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 사이토카인 분비촉진제 또는 억제제를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 조작면역세포를 체내에 전달하기 위한 적절한 담체를 포함할 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 면역세포는 환자의 자가 세포 또는 환자의 동종이계 세포일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 다른 구체예는 상기 설명한 약학적 조성물의 생산 및 유효량의 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는 환자에서 질병의 치료 방법이다.
- 치료 대상 질병
질병은 면역질환일 수 있다.
이때, 면역질환은 면역능력이 저하되는 질병일 수 있다.
상기 면역질환은 자가면역질환일 수 있다.
이때, 자가면역질환은 이식편대숙주병(GVHD, Graft versus host disease), 루푸스(systemic lupus erythematosus), 셀리악 병(celiac disease), 제1 형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 그레이브스 병(graves disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 건선(psoriasis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(muliple sclerosis) 등을 포함한다.
또한, 질병은 병원체가 알려졌으나 치료법이 알려지지 않은 난치성 질병일 수 있다.
상기 난치성 질병은 바이러스 감염 질환일 수 있다.
상기 난치성 질병은 프리온 병원체 유래 질병일 수 있다.
상기 난치성 질병은 암일 수 있다.
- 면역능력 증강 치료
면역능력이 현저히 저하된 환자의 경우, 가벼운 감염도 치명적인 결과를 불러올 수 있다. 면역능력 저하는 면역세포의 기능 저하, 면역세포 생산량의 감소 등에 의해 발생한다. 이러한 면역능력 저하를 치료하기 위한 면역능력 증강 치료에는 정상적인 면역세포의 생산을 활성화하는 영구적 치료방법이 있는 반면 일시적으로 면역세포를 주입하는 일시적 치료방법이 있을 수 있다.
면역능력 증강 치료는 상기 치료 조성물을 환자의 체내에 주입하여 영구적으로 면역능력을 증강하고자 하는 것일 수 있다.
면역능력 증강 치료는 환자의 특정 신체 부위에 치료 조성물을 주입하는 방법일 수 있다. 이때, 특정 신체 부위는 면역세포공급원 조직을 가지는 부위일 수 있다.
면역능력 증강 치료는 환자의 체내에 새로운 면역세포공급원을 생성하는 것일 수 있다. 이때, 일 예로, 치료 조성물은 줄기세포를 포함할 수 있다. 이때, 줄기세포는 조혈모세포일 수 있다.
면역능력 증강 치료는 상기 치료 조성물을 환자의 체내에 주입하여 일시적으로 면역능력을 증강하고자 하는 것일 수 있다.
면역능력 증강 치료는 치료 조성물를 환자의 체내에 주입하는 것일 수 있다.
이때, 바람직한 치료 조성물은 분화를 마친 면역세포를 포함할 수 있다.
면역능력 증강 치료에 사용되는 치료 조성물은 특정 갯수의 면역세포를 포함할 수 있다.
특정 갯수는 면역능력이 저하된 정도에 따라 바뀔 수 있다.
특정 갯수는 체내의 용적에 따라 바뀔 수 있다.
특정 갯수는 환자의 사이토카인 분비량에 따라 조절될 수 있다.
- 난치성 질병 치료
면역세포 조작기술은 HIV, 프리온, 암 등 병원체에 대한 완전한 치료가 알려지지 않은 질병에 대한 치료방법을 제공할 수 있다. 이러한 질병들은 병원체가 알려졌음에도 항체 형성이 어렵고, 진행이 매우 빠르고, 면역체계를 무력화하고, 병원체가 체내에 잠복하는 특성이 있어 치료가 어려운 경우가 많다. 조작면역세포는 상기 문제들을 해결하기 위한 강력한 수단이 될 수 있다.
난치성 질병 치료는 상기 치료조성물을 체내에 주입하여 이루어질 수 있다. 이때, 바람직한 치료조성물은 조작된 면역세포를 포함할 수 있다. 또한, 치료조성물은 특정한 신체 위치에 주입될 수 있다.
조작면역세포는 목적 질병의 병원체에 대한 인식능력이 개선된 것일 수 있다.
조작면역세포는 면역반응의 세기 또는 활성이 증강된 것일 수 있다.
- 유전자 교정 치료
외부로 추출한 면역세포를 이용한 치료방법 외에도 직접적으로 생체의 유전자를 조작하여 면역세포의 발현에 영향을 주는 치료방법이 있을 수 있다. 이러한 치료방법은 생체의 유전자를 조작하기 위한 유전자 교정용 조성물을 체내에 직접 주입하여 이루어질 수 있다.
유전자 교정용 조성물은 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 포함할 수 있다.
유전자 교정용 조성물은 특정 신체 위치에 주입될 수 있다.
특정 신체 위치는 면역세포공급원일 수 있다. 예를 들어, 골수이다.
조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물일 수 있다.
조성물의 투여는 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic), 복막내(intraperitoneally) 등에서 선택될 수 있다.
조성물의 1회 투여량(소정의 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량)은 투여 대상의 체중 kg 당 104-109　세포, 예컨대, 105　내지 106 세포/kg(체중) 정도로 상기 수치 범위들 내의 모든 정수값들 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 투여 대상의 연령, 건강 및 체중, 동시에 받는 치료의 종류, 만약 있다면 치료의 빈도, 원하는 효과의 특성 등을 고려하여 적절히 처방될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 유전자 조작용 조성물에 의해 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작하여 조절할 경우, 면역세포의 생존(survival), 증식(proliferation), 지속(persistency), 세포독성(cytotoxicity), 사이토카인 분비(cytokine-release) 및/또는 침윤(infiltration) 등에 관여하는 면역 효능이 향상될 수 있다. 또한, 본 명세서에 의해 개시되는 조작면역세포을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적 조성물을 이용한 치료 방법을 통해, 면역질환 및 난치성 질병이 완화시키거나 치료할 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실험방법
1. sgRNA 설계
CRISPR RGEN Tools (Institute for Basic Science, Korea)을 사용하여 인간의 PD-1 유전자 (PDCD1; NCBI Accession No. NM_005018.2), CTLA-4 유전자 (NCBI Accession No. NM_001037631.2), A20 유전자 (TNFAIP3; NCBI Accession No. NM_001270507.1), Dgk-alpha 유전자 (NCBI Accession No. NM_001345.4), Dgkzeta 유전자 (NCBI Accession No. NM_001105540.1), Egr2 유전자 (NCBI Accession No. NM_000399.4), PPP2r2d 유전자 (NCBI Accession No. NM_001291310.1), PSGL-1유전자 (NCBI Accession No. NP_001193538.1), 및 Tet2 유전자 (NCBI Accession No. NM_017628.4)의 CRISPR/Cas9 표적 부위 선별 및 추정 오프-타겟 검사를 수행하였다. CRISPR/Cas9 표적 부위로서 인간 게놈 (GRCh38/hg38) 내에서 온타겟 서열부위를 제외하고 0-, 1-, 또는 2bp 미스매치(mismatch) 부위가 없는 DNA 서열들을 sgRNA 타겟부위로 선정하였다.
2. sgRNA 합성
2 개의 상보적 올리고뉴클레오타드를 어닐링 및 연장시켜 sgRNA 합성을 위한 주형들을 PCR-증폭시켰다.
이 때 사용된 타겟 부위 서열, 이를 증폭시키기 위한 프라이머 서열, 및 이로부터 얻어진 sgRNA이 타겟팅하는 DNA 표적 서열을 아래의 표 2에 정리하였다.
상기 주형 DNA (표적 서열에서 3' 말단의 'NGG' 제외)에 대하여 T7 RNA polymerase (New England Biolabs)를 이용하여 in vitrotranscription을 수행하고, 제조자 사용 설명서에 따라서 RNA를 합성한 후 DNAase(Ambion)를 사용하여 주형 DNA를 제거하였다. Expin Combo kit (GeneAll)과 이소프로판올 침전에 의하여 전사된 RNA를 정제하였다.
T 세포를 이용한 실험에서는 sgRNA의 immunogenicity와 degradation을 최소화하기 위해서 상기의 방법으로 합성된 sgRNA에 alkaline phosphatase(New England Biolabs)를 이용하여 5'말단의 phosphate 잔기를 제거한 후 Expin Combo kit(GeneAll)과 이소프로판올 침전으로 다시 RNA를 정제하여 사용하였다. 또한 일부 T 세포를 이용한 실험에서는 chemically synthesized sgRNA(Trilink)를 사용하였다.
본 실시예에서, 상기 chemically synthesized sgRNA는 2'OMe 및 phosphorothioate로 변형된 것을 사용하였다.
예시로 본 실시예에 사용된 DGKα sgRNA #11는 5'-2'OMe(C(ps)U(ps)C(ps)) UCA AGC UGA GUG GGU CCG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC 2'OMe(U(ps)U(ps)U(ps)U -3' 구조식을 갖는다(2'OMe = 2'-methly RNA and ps=phosphorothioate).
다른 예에서 본 실시예에서 사용된 A20 sgRNA #1은 GCUUGUGGCGCUGAAAACGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (볼드체는 타겟 서열 부위에 혼성화하는 서열임; 다른 타겟 유전자 및 다른 타겟 서열에 대한 sgRNA는 상기 볼드체 서열이 타겟 서열(단, T가 U로 바뀜)을 갖는 것임) 또는 상기 서열의 3' 말단의 3개의 뉴클레오타이드 및 5' 말단의 3개의 뉴클레오타이드가 2'-OMe 변형 및 포스포로티오에이트 백본이 도입된 변형이 가해진 것일 수 있다.
[표 2]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
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Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
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Figure pct00033
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Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
한편, PSGL-1 유전자에 대해서 표 1에 기재된 #1-84의 DNA 표적 서열에 대하여 상기와 동일한 방법으로 sgRNA를 제작하였다.
3. Jurkat 세포에서의 sgRNAs 선별
상기 합성된 A20, Dgkα, Egr2, PPP2r2d, PD-1, CTLA-4, Dgkζ, PSGL-1, KDM6A 및 Tet2의 엑손을 타겟팅하는 sgRNA들의 활성을 Jurkat 세포에서 시험하였다.
Jurkat 세포 (ATCC TIB-152; 인간 T-세포의 불멸화 세포주)를 10%(v/v) fetal bovine serum (GeneAll)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포들은 37℃및 5% CO2 조건 하의 인큐베이터에서 배양하였다.
세포 활성화를 위하여, 상기 배지 내 세포들의 농도는 각각 1×106cells/mL로 하였다.
CD2/CD3/CD28 비드 (anti-CD2/3/CD28 Dynabeads; Miltenyi Biotec)를 3:1의 비율(비드:세포; 비드 및 세포의 개수 기준) 이 되도록 넣어주고, 상기 세포들을 37℃및 5% CO2 조건 하의 인큐베이터에서 배양하였다.상기와 같은 세포 활성화를 72 시간 동안 수행한 후, 상기 CD2/CD3/CD28 비드를 자석을 이용하여 제거하고, 비드가없는 상태에서 상기 세포들을 12-24시간 동안 더 배양하였다.
상기 배양된 Jurkat 세포 1×106개에 상기 합성된 in vitro transcribed sgRNA 1㎍(microgram) 및 Cas9 단백질 (ToolGen) 4㎍을 전기천공으로 도입시켰다(in vitro). Neon Transfection System (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)의 tip 10㎕를 사용하여 다음의 조건으로 유전자를 도입하였다: Jurkats (Buffer R): 1,400 V, 20 ms, 2 pulses.
상기 형질도입시킨 세포들은 무항생제 배지 500㎕에 플레이팅하고 37℃및 5% CO2조건 하의 인큐베이터에서 배양하였다.
형질도입시킨 Jurkat 세포 ('+ aRGEN'으로 표시)에서의 indel ratio를 형질도입이 없는 Jurkat 세포 ('- aRGEN'으로 표시)와 비교하여 시험하였다. 상기 시험된 CRISPR/Cas9 표적 서열을 표 3에, 각 sgRNA의 indel ratio를 표 4에 각각 정리하였다.
[표 3]
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
[표 4] 표적 서열에 대한 각각의 sgRNA의 Jurkat 세포에서의 활성
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
4. 종양 세포주 배양
EGFRvIII positive U87 MG glioblastoma cell line (U87vIII)는 Celther Polska에서 구입하였다. A375P melanoma cell line는 한국 세포주 은행(Korean Cell line Bank)에서 구입하였다. 상기 세포주들은 10% fetal bovine serum albumin (FBS)를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
5. 렌티바이러스 제조
CD8 힌지(hinge)와 융합된 anti-EGFRVIII scFV, 4-1BB 및 CD3ζ 도메인을 포함하는 융합 단백질인 139 CAR와 NY-ESO-1을 표적하는 c259 TCR construct는 Sampson, Choi et al.의 연구를 참고하였다(Sampson et al. 2014, Rapoport, Stadtmauer et al. 2015). 코돈 최적화된 cDNA CAR 및 TCR construct를 pLVX 벡터로 서브클로닝하였다. 상기 렌티바이러스 벡터 및 헬퍼 플라스미는 Lipofectamine2000 (ThermoFisher SCIENTIFIC)을 이용하여 293T cell에 형질도입하였고, 형질도입된 293T cell를 배양하여 렌티바이러스가 생성된 배양상청액을 수득하였다. 배양상청액을 수확한 후, 렌티바이러스가 포함된 배양상청액을 수크로즈 함유 버퍼(100mM NaCl, 0.5mM ethylene diamine tetra acetic acid [EDTA], 50mM Tri-HCl, pH 7.4)에 4:1의 비율로 오버레이시킨 후, 4℃에서 4시간동안 10000g에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 인산 완충 식염수(PBS)를 가하여 재현탁시켰다.
6. Construction of DGK KO 139 CAR-T cells
인간 말초 혈액 T 세포(human peripheral blood T cells, pan-T cell)는 STEMCELL TECHNOLOGIES에서 구입하였다. 해동시킨 T 세포는 활성화시키기 전에 50 U/mL의 hIL-2와 5 ng/mL의 hIL-7 및 FBS를 첨가한 RPMI 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 활성화시키기 위해 항-CD3/28 Dynabeads(ThermoFisher Scientific)를 이용하였으며, 이때 10% FBS를 첨가한 RPMI 배지에서 3:1의 비율(비드:세포)로 사용하였다. 24시간동안 활성 시킨 후, T 세포는 100 ㎍/mL 레트로넥틴(retronectin)이 코팅된 플레이트에서 139-CAR 렌티바이러스와 48시간동안 혼합시켰다. 자극 3일 후에 비드를 제거하였다. Amaxa P3 Primary Cell kit and 4D-Nucleofecter (Lonza)를 이용하여 전기천공을 수행하였다. Cas9 ribonuclear protein (RNP) 복합체를 형성시키기 위해, 재조합 S. pyogenes Cas9(Toolgen) 40 ㎍과 화학적 합성 tracr/crRNA (Integrated DNA Technologies) 10 ㎍을 20분동안 인큐베이션하였다. P3 버퍼에서 재현탁한 3×106개의 자극시킨 T 세포에 미리 인큐베이션한 Cas9 RNP 복합체를 첨가하였다. 상기 세포들은 프로그램 EO-115를 이용해 Cas9 RNP 복합체를 핵안으로 도입시켰다. 전기천공 시킨 후에, 상기 세포들은 50 U/mL의 hIL-2와 5 ng/mL의 hIL-7 및 10% FBS를 첨가한 RPMI 배지에 5×105 cells/mL로 씨딩(seeding)하였다. 실험에 사용된 crRNA의 표적 서열은 다음과 같다: DGKα: ctctcaagctgagtgggtcc, DGKζACGAGCACTCACCAGCATCC.
7. Flow cytometry staining and antibodies
세포 염색은 달리 명시하지 않는한 1% FBS가 첨가된 PBS에서 4 ℃상태로 수행하였다. Flow cytometry와 기능적 연구를 위한 항체 및 시약의 목록은 다음과 같다: CellTrace CFSE/Far red (ThermoFisher), 7-AAD (Sigma), anti-CD3: UCHT1 (BD), anti-CD4: RPA-T4 (BD), anti-CD8: HIT8a (BD), anti-CD56: B159 (BD), anti-NKG2D: 1D11 (Biolegend), anti-CD45RO: UCHL1 (BD), anti-CCR7: 150513 (BD), anti-PD-1: EH12.2H7 (Biolegend), anti-CD25: M-A251 (BD), anti-Fas: Dx2 (BD), anti-CD107a: H4A3 (Molecular Probes), anti-EGFRviii: (Biorbyt), goat anti-human IgG: (Biorad). 데이터는 Attune NxT Acoustic Focusing Cytomete에 수집되었고, FlowJo를 이용하여 분석하였다.
8. In vitro killing assay, cytokine release, and proliferation assay
U87vIII 및 A375P는 CellTrace Far red (Invitrogen)로 염색하였다. 종양 세포주는 지시된 비율로 T 세포와 함께 공동배양하였고, U-bottom 96-well 플레이트에 각 웰당 2×104에서 5×104개의 종양 세포주를 분주하였다. 휴식된(rested) 139 CAR-T 세포 및 c259 T 세포를 지시된 이펙터:타겟(Effector:Target; E:T) 비율로 각 표적 세포에 첨가하였다. 공동배양 18시간 후, 세포를 수거하였고, 생존/사멸 식별을 위해 7-aminoactinomycin로 염색하였다. 시료는 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer로 측정되었고, FlowJo로 분석하였다. 세포독성(Cytotoxicity)은 [(%lysis sample%lysis minimum)/(%lysis max [100%]-%lysis minimum]×100%의 수식을 이용해 계산하였다. 3번 반복 실험을 수행하였다. 공동배양 후 수득된 배양상청액는 ELISA Kit (Biolegend)를 이용한 IL-2와 IFN-γ의 분비량을 측정을 위해 이용되었다. 증식 어세이를 위해, Celltrace-labeled 139CAR-T 세포를 U87vIII 세포와 4일 동안 공동배양하였고, 4일 후에 139 CAR-T 세포에서의 Celltrace의 분포를 flow cytometry를 이용하여 평가하였다.
9. Repetitive tumor challenging experiment
연속적 종양에 대한 실험을 위해, IL-7 배지에서 139 CAR-T를 3:1의 E:T 비율로 U87vIII와 공동배양하였다(Day0). Day4에 139 CAR-T 세포를 수거하고, 다시 IL-7 배지에서 동일한 E:T 비율로 U87vIII와 공동배양하였다. 1차 및 2차 종양 접종 후 각각 24시간 후에 배양상청액을 수집하여 IFN-γ및 IL-2 방출을 평가하였다.
10. Western blot analysis
T 세포의 TCR 원위 신호를 평가하기 위해, 1×106 세포를 anti-CD3 활성화 비드 (Miltenyi Biotec)를 1:2의 비드:세포 비율로 사용하여 15분 및 60분동안 활성화시켰다. ERK, pERK 및 GAPDH의 측정을 위해, 세포 용해물을 RIPA lysis 및 추출 버퍼를 사용하여 준비하였다. 실험에 이용된 모든 항체는 cell signaling에서 구입하였다.
11. Calcium influx
T 세포의 칼슘 유입 측정은 Calcium assay kit(BD)의 매뉴얼에 따라 수행되었다. 간단히, T 세포를 RPMI 배지로 세척하고 동일한 배지에 재현탁하고 37℃에서 1 시간동안 염료와 인큐베이션하였다. 비-처리 세포로부터 FITC 신호의 기초 수준을 얻은 후, anti-CD3 활성화 비드(Miltenyi Biotec)를 5:1의 비드:세포 비로 첨가하고 flow cytometry로 측정하였다. Flow cytometry로부터 수집된 데이터는 kinetic 모드를 사용한 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.
12. Real-time PCR
RNA 시퀀싱을 위해, 1×106 세포를 human T activator anti-CD3/28 Dynabeads (Thermofisher)를 1:1의 비드:세포 비율로 사용하여 48시간동안 활성화시켰다. RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 사용하여 추출하였고, cDNA는 제조사 지시사항(ABI)에 따라 생산하였다. Real-time PCR은 TaqMan 유전자 발현 분석 키트/프로브 세트(Thermofisher)를 사용하여 수행되었다. 각 유전자의 발현은 GAPDH의 발현으로 표준화(normalization)하였다. 이때, 실험에 사용된 프라이머는 다음과 같다: hDGKα F: 5'-AATACCTGGATTGGGATGTGTCT-3', hDGKα R: 5'- GTCCGTCGTCCTTCAGAGTC, hDGKζF: 5'- GTACTGGCAACGACTTGGC-3', hDGKζR: 5'-GCCCAGGCTGAAGTAGTTGTT-3', hβF: 5'-ggcactcttccagccttc-3', hβR: 5'- tacaggtctttgcggatgtc-3', ID2: Hs00747379_m1, PRDM1: HS00153357_m1, IL10: 00174086_m1, IFNG: Hs00174143_m1, IL2: HS00174114.
13. Digenome-sequencing
인간 T 세포의 게놈 DNA는 DNeasy Tissue kit (Qiagen)를 사용하여 분리되었다. 게놈 DNA(20㎍)은 반응액(NEB3.1 buffer) 1000㎕에 Cas9 단백질 (10 μg), crRNA (3.8㎍) 및 tracrRNA (3.8㎍)와 함께 처리되었고, 37℃에서 4시간동안 배양되었다. 소화된 DNA는 RNase A (50 ㎍/mL)와 함께 37℃에서 30분동안 배양되었고, DNeasy Tissue kit로 정제되었다. 소화된 DNA는 Covaris 시스템을 이용하여 단편화시키고 라이브러리 형성을 위해 어댑터로 연결시켰다. DNA 라이브러리는 THERAGEN ETEX에서 Illumina HiSeq × Ten Sequencer를 사용하여 전체 게놈 서열에 적용되었다. Bam 파일을 생성하기 위해 다음 매개 변수를 사용하여 Isaac aligner를 이용하였다: ver. 01.14.03.12; Human genome reference, hg19 from UCSC (original GRCh37 from NCBI, Feb. 2009), Mouse genome reference, mm10 from UCSC; Base quality cutoff, 15; Keep duplicate reads, yes; Variable read length support, yes; Realign gaps, no; 및 Adaptor clipping, yes (adaptor: 5'-AGATCGGAAGAGC-3', 5'-GCTCTTCCGATCT-3')
14. Mouse xenograft studies
U87vIII 종양 모델을 위해, 6-8주령 암컷 NSC 마우스에 1×106 U87vIII 세포를 100㎕ PBS 볼륨으로오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다(Day 0). 이식 후 28일째에, 종양의 크기가 150±50 mm2에 도달하였고, 마우스들은 무작위로 그룹을 나누었다. 각 그룹은 6-8마리 마우스로 구성되며, 종양의 크기는 유사하였다. 각 그룹별로 T 세포, 139 AAVS1 CAR-T 세포 및 139 DGKαζCAR-T 세포의 각각 5×106개 세포를 28 일째와 32 일째에 정맥 내(IV) 또는 종양 내(IT) 주입 하였다. 139 AAVS1 CAR-T 세포 및 139 DGKαζCAR-T 세포의 표면 CAR 발현을 확인하였다(표면 CAR 발현 범위: 25% - 70%). 모든 마우스는 32-35 일에 Temozolomide (TMZ) (Sigma) (0.33mg/mouse/day)를 매일 복강 내 투여 하였다. 종양 크기는 캘리퍼스로 일주일에 두번씩 모니터링하였다. 상기 마우스는 종양 직경이 2000 mm3에 이르면 희생시켰다. In vivo 전달 후 CAR-T 세포의 추가 연구를 위해, 각각의 마우스에서 말초혈액, 비장 및 종양 조직을 분리하였다. 종양 조직을 분리하기 위해, 종양 샘플을 가위로 다듬고 100 U/ml 콜라겐나아제 IV(collagenase IV) 및 20 U/ml 디옥시리보핵산가수분해효소(DNase)를 37℃ 항온수조(water bath)에서 1시간동안 처리하였다. 그 후 세포를 추가 조사를 위해 무균 세포 여과기(strainer)에 통과시켰다. 비장에서 세포를 분리하기 위해 조직을 멸균 플런저로 분쇄하고 무균 세포 여과기(strainer)를 통과시켰다. 적혈구 용해를 위해, 세포 현탁액에 5분 동안 ACK 완충액 (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.2)을 추가로 처리 하였다. 종양 침윤 T 세포의 effector 기능을 분석하기 위해 종양 조직에서 해리 된 세포를 50 ng/ml PMA와 1 ㎍/ml 이오노마이신(Ionomycin)으로 CO2 인큐베이터에서 5시간동안 재활성화시키고 세포 내 IFN-γ와 TNFα의 염색을 수행하였다.
실시예 1. 최적화된 CRISPR/Cas9 RNP 전달에 의한 Human primary T cell에서 DGK의 효과적인 저해
Human primary T cell의 항종양 활성에서 DGKs의 역할을 확인하기 위해, DGKα 유전자의 엑손 5-7 및 DGKζ 유전자의 엑손 3-12를 각각 표적하는 gRNA를 스크리닝하였다. 최적화된 CRISPR/Cas9 RNP 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입 후, CRISPR/Cas9가 처리된 T 세포는 활발한 CAR 발현을 보였다(도 28). 비록 생존력과 세포 성장의 미미한 감소가 발견되었지만, 전기천공 2일 후에 빠르게 회복되었다(도 29). 실시예에서, glioblastoma 세포를 표적하기 위해 높은 특이성을 가지는 anti-EGFRvIII CAR인 139 CAR를 사용하였다(Sampson et al. 2014). EGFRvIII의 발현은 악성 조직에 엄격히 국한되어 있기 때문에 139 CAR을 사용하여 조작된 CAR-T 세포의 잠재적 인 안전성 우려, 예를 들면 온-타겟 효과를 개선 할 수 있을 것으로 추정하였다. 단일 유전자 KO 실험의 인델 비율은 80% - 90%정도로 딥 시퀀싱에 의해 측정되었다(도 30). 절단 위치의 상세한 시퀀스 분석 결과, DGKα 및 DGKζ139 CAR-T 세포에서 NHEJ 수복에 의해 유도된 out-of-frame mutation이 각각 66.7% 및 59.6%로 나타났으며, 이는 DGK 단백질의 발현 감소와 크게 일치하였다(도 30). 이전 연구에서 DGKα와 DGKζ의 비중복 기능이 보고되었으므로, 단일 DGK KO 139 T 세포와 비교할만한 녹아웃 효율을 보인 DGKαζ이중 녹아웃 T 세포를 생성하여 시너지 효과를 확인하였다(도 30). DGKs를 타겟하는 CRISPR/Cas9의 오프-타겟을 조사하기 위해, DGKα 139 CAR-T 및 DGKζ139 CAR-T에서 mismatch-based in silico 분석과 게놈 전체에 걸친 off-target 확인 방법인 Digenome-seq을 수행했다(도 31). 총체적으로, 결과는 CRISPR/Cas9 매개 유전자 조작이 Human primary T cell에서 세포 성장 및 CAR 발현을 심각하게 둔화시키지 않으면서 효율적이고 특이적인 DGKs 저해시킴을 보여준다.
실시예 2. 인위적으로 조작된 DGK에 의한 증폭된 CD3 말단 신호에 나타내는 effector 기능을 향상
DGKζ 결핍 T 세포의 사이토카인의 분비 증가는 이전에 다른 그룹에 의해 보고되었으므로, 실시예에서 DGK 139 CAR-T 세포의 항 종양 기능을 평가했다(Shin et al. 2012, Riese et al. 2013). In vitro 특성 분석에서, 음성 대조군으로 139 CAR-T의 세포독성은 유지하면서 139 CAR-T보다 DGKs 139 CAR-T와 유사한 생리학적 상태를 가지는 AAVS1 139 CAR-T를 사용하였다(도 32). DGKs 139 CAR-T는 AAVS1 CAR-T와 비교하여 U87vIII와의 공동 배양시 세포독성 및 사이토카인의 현저한 증가 등의 우수한 effector 기능을 보였다(도 33). 흥미롭게도, DGKαζ139 CAR-T는 DGKα 또는 DGKζ139 CAR-T보다 더 많은 IFN-γ 및 IL-2를 생성하였는데, 이는 항종양 활성에서 DGKs 이중 넉아웃의 시너지 효과가 있음을 강하게 의미한다. 또한, CAR-T 세포와 타겟 암세포주를 공배양하였을 때, PD-1의 발현이 증가하여 있고, U87vIII glioblastoma cell line에서 PD-L1도 강하게 발현함을 확인하였다, 이는 PD-1 antibody 또는 PD-1 KO과 같은 PD-1 blockade와 함께 병용하였을 때 시너지 효과를 낼 수 있음을 의미한다(도 34).
다음으로 signal1(CD3 signal) 경로가 DGKs 파괴에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하였다. AAVS1 T 세포 및 DGKs T 세포를 지시된 시간동안 항 CD3 비드로 자극한 후 칼슘 유입 및 signal1의 말단 신호인 ERK를 측정하였다. 칼슘 유입은 TCR 활성화에 영향을 받지 않았지만, 인산화된 ERK 신호는 증폭되었고 DGKs KO 변이체에서 더 오래 지속되었다(도 35). DGKαζT 세포의 인산화 된 ERK 신호의 현저한 증가는 도 33의 DGKs 이중 KO의 시너지 효과 작용과 일치한다. 이러한 결과는 DGK의 제거가 TCR 말초 신호를 증가시킴으로써 T 세포의 세포독성 및 사이토카인 방출을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 3. DGKs가 인위적으로 조작된 T 세포의 TGF-β와 PGE2의 면역 억제 효과 회피
앞선 실시예를 통해 DGKs를 제거하는 것이 TCR 신호 전달을 효과적으로 활성화시킴을 발견한 후, 인위적으로 조작된 DGKs가 signal1 억제제에 대한 T 세포의 민감성을 감소시킬 수 있는지 시험하였다. CAR-T 치료법의 치료 결과는 면역 억제성 종양 미세환경(tumor microenvironment; TME)에서 TGF-β와 PGE2의 높은 수치로 인해 제한적이었으므로, 억제 인자들 중에서 TGF-β와 PGE2에 초점을 두었다(Arumugam, Bluemn et al. 2015, Perng and Lim 2015, O'Rourke, Nasrallah et al. 2017). 우선, U87vIII에 대한 CAR-T 활성에서 TGF-β저해 효과를 조사하였다. DGKs 이중 녹아웃 139 CAR-T가 PGE2와 TGF-β매개 면역 억제에서 시너지 저항성을 보였으므로, 시험을 위해 DGKαζ139 CAR-T를 사용했다(도 36). TGF-β(10ng/mL)의 높은 생리적 농도에 노출된 AAVS1 139 CAR-T는 종양 사멸 활성, IFN-γ및 IL-2 생산 등의 활성이 급격히 줄어들었다(도 36) (Xu, Ahmad et al. 2000) (Ivanovic, Todorovic-Rakovic et al. 2003). 반면에, DGKαζ139 CAR-T는 TGF-β를 처리한 경우에도 effector 기능을 유지하였다. 마찬가지로, PGE2 처리에 의한 세포 독성 능력이 심각하게 손상된 AAVS1 139 CAR-T와는 대조적으로, DGKαζ139 CAR-T는 저해 인자에 상대적으로 둔감하였다(도 36). 요약하면, AAVS1 CAR-T는 종양에 대한 반응성이 현저한 상실되었지만, DGKs CAR-T 세포는 TGF-β및 PGE2에 노출시에도 그의 활성의 49 % 내지 99 %를 유지하면서 지속적인 항종양 기능을 나타내었다(도 37). 또한 c259 TCR-T에서 DGK 녹아웃의 유리한 역할을 확인하였다. NY-ESO를 발현하는 A375P 세포와 함께 배양했을 때, DGKs c259 TCR-T는 TGF-β및 PGE2에 덜 민감하여 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)에서 DGK KO 플랫폼의 융통성을 보였다(도 38). TGF-β및 PGE2 억제 실험 동안 DGKαζ139 CAR-T의 항 종양 활성의 미미한 감소는 DGKα 및 DGKζ의 out-of-frame 녹아웃율이 66.7% 및 59.6%이므로, DGKs의 불완전한 파괴로 인한 것으로 사료된다(도 30). 상기 데이터는 DGKs KO에 의한 세포 내 DAG 가용성의 증가는 T 세포가 signal1 억제제의 면역 억제를 극복 할 수있게 함을 의미하며, signal 2 억제제와의 병용투여를 하였을 때 효과적으로 시너지 효과를 낼 수 있음을 암시한다.
실시예 4. 반복적인 항원 자극에서 DGKs가 인위적으로 조작된 T 세포의 effector 기능 유지
반복적으로 항원을 인식하는 경우, T 세포는 종종 IL-2 분비와 세포 독성을 잃는 아네르기 (anergy)라고 하는 기능저하 상태가 된다. DAG 대사는 T 세포 활성화 및 아네르기를 조절하는 중요한 결정 인자이다(Olenchock, Guo et al. 2006, Zha, Marks et al. 2006). 상당수의 연구에서 DGKα의 약리학적 억제가 마우스 T 세포의 아네르기 상태를 역전시킬 수 있음을 보고하고 있으며 이에 DGKs가 인위적으로 조작된 인간 T 세포가 T 세포 아네르기를 극복하는지 확인하였다(Olenchock, Guo et al. 2006, Moon, Wang et al. 2014). 우선, 반복적인 항원 공격시 DGKαζ139 CAR-T의 증식 능력을 평가하였다. 139 CAR-T 세포를 U87vIII와 96시간동안 배양 한 후, U87vIII를 다시 접종하였고, CAR-T의 세포증식능은 Celltrace 분포 및 세포 계수를 이용해 측정하였다(도 39). 미미한 증식을 보이는 AAVS1 139 CAR-T와는 달리, DGKαζ139 CAR-T는 반복적인 활성화에서 성공적으로 증식하였다(도 40). DGKαζ139 CAR-T의 우수한 확장이 증식 능력의 증가 또는 감소된 activation induced cell death(AICD)의 결과인지 여부를 확인하기 위해, 세포 사멸 분석을 수행하였다. U87vIII와 마주친 139 CAR T 세포를 7-AAD로 염색하였을 때, DGKαζ139 CAR-T는 AAVS1 139 CAR-T와 비교하여 더 큰 7-AAD 양성 T 세포 집단을 나타냈다(도 41). DGKα의 억제가 FAS 의존성 세포사멸을 유도 할 수 있기 때문에, 139 CAR-T에서 FAS 발현을 확인하였고, 그 결과 139 CAR-T의 표면에 FAS의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다(도 41) (Alonso, Rodriguez et al. 2005). 이러한 데이터는 종양 인식에 의한 증가된 DGKαζ139 CAR-T 세포는 주로 세포 증식 능력에 의한 것이며, 그 증가가 종양 인식에 의해 유발된 T 세포 세포사멸을 상쇄함을 보여준다. 다중 종양 접종시 DGKαζ139 CAR-T의 사이토카인 분비를 분석하였다(도 42). AAVS1 139 CAR-T 세포가 U87vIII 1차 노출에서 IFN-γ및 IL-2를 강하게 생산하였지만, AAVS1 139 CAR-T 세포를 수거하고 새로운 U87vIII에 재노출시킨 후, ELISA를 이용해 사이토카인 생성을 확인한 결과, 사이토카인 생성 능력이 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이와 대조적으로, DGKαζ139 CAR-T는 2차 노출에도 U87vIII에 의한 활성화에 반응하여 사이토카인의 분비가 유지되었고, 이는 DGKs KO이 T 세포 아네르기를 회피하도록 하는 함을 보여준다.
실시예 5. DGKs가 인위적으로 조작된 T 세포의 이펙터 메모리 T 세포로의 재프로그래밍 효과
DGKα 및 DGKζ모두의 손실은 CD8 T 세포가 짧은 수명의 이펙터 세포 및 이펙터 메모리 집단으로 분화되도록 한다고 보고되어 있다(Yang, Zhang et al. 2016). DGKs 결핍이 T 세포 분화를 변화시키는지를 조사하기 위해, DGKs가 조작된 139 CAR-T 세포를 U87vIII와 4일 동안 공동배양하면서 DGKs가 조작된 CAR-T 세포의 메모리 서브세트의 특성을 나타내었다. 종양에 접종되기 전, DGKαζ139 CAR-T 세포는 AAVS1 139 CAR-T 세포보다 작은 naive T 세포 집단을 나타내었다(도 43). 4 일간의 종양 접종 후, DGKαζ139 CAR-T 세포의 naive T 세포 집단은 우선적으로 이펙터 메모리 세포로 분화되었고, 그 결과 더 작은 naive 및 센트럴 메모리 T 세포 집단을 형성하였다(도 43). 다음으로 DGK의 인위적인 조작이 전사적으로 T 세포를 재프로그램하는지 여부를 조사하였다. CD3/28 dynabead를 사용하여 48 시간의 T 세포 활성화 시킨 후 관련 전사인자를 확인한 결과, DGKαζT 세포의 이펙터 메모리 조절인자인 ID2, PRDM1의 현저한 증가를 확인하였다(도 44). 또한, DGKs가 인위적으로 조작된 T 세포에서 I 형 사이토카인의 발현은 증가하였지만, II 형 사이토카인인 IL-10의 전사는 유의하게 감소하였다(도 44). 마지막으로 DGKs KO에 의해 생성된 effector T 세포가 기능 장애가 없음을 확인하기 위해, DGKαζ139 CAR-T에서 고갈 마커 인 PD-1과 TIM-3를 조사하였다. 7일 동안 U87vIII를 사용하여 139 CAR-T 세포를 활성화시킨 경우, DGKs 139 CAR-T는 AAVS1 139 CAR-T와 비교하여 비슷한 수준의 PD-1 및 Tim-3 발현을 나타내었다(도 45). DGKs가 인위적으로 조작된 T 세포는 T 세포의 고갈없이 이펙터 메모리 T 세포로 재프로그래밍되고, 그 결과 체외에서 강력한 항 종양 효과를 나타내었다.
실시예 6. DGKs가 인위적으로 조작된 T 세포의 종양 침투능 및 종양 제거 효과
DGKαζ139 CAR-T의 향상된 이펙터 기능의 생체 내 기능적 관련성을 조사하기 위하여, U87vIII 이식 NSG 마우스에 AAVS1 139 CAR-T 또는 DGKαζ139 CAR-T를 정맥 내 (IV) 또는 종양 내(IT)로 주입하였다. 입양 세포 전이의 효과는 종양 존재량 및 면역 세포 수에 따라 크게 달라질 수 있다. Levi J, Rupp et al.은 대조군 CD19 CAR-T 세포와 PD1 KO CD19 CAR-T 세포 모두에서 높은 T 세포 투여를 통해 적은 종양 존재량를 가진 마우스 실험에서 종양을 완전히 제거 할 수 있음을 입증하였다(Rupp, Schumann et al. 2017). 따라서, 본 연구에서는 DGKs KO T 세포의 생체 내 효능을 조사하기 위하여 높은 종양 존재량 모델에서 낮은 T 세포량을 사용하였다. 종양의 부피가 150±50 mm3에 도달했을 때 T 세포를 1차 주입하였고, 4일 후에 종양의 크기가 400±50mm3에 이르면 2차로 T 세포 주사를 시행하였다. 이때, 대략적으로 각각 1:10과 1:20의 E:T 비율로 1차 및 2차 주입하였다. 여러 연구에서 항EGFRvIII glioblastoma-표적화 T 세포 치료 시 temozolomide(TMZ) 없이 치료하는 것은 종종 비효율적인 결과를 보인다고 보고하고 있으므로((Ohno, Ohkuri et al. 2013, Johnson, Scholler et al. 2015), 2차 T 세포 주입에서 temozolomide 보조제를 종양 퇴행을 촉진시키기위해 복막 내 투여하였다. 모든 IV 주사군은 32일째 TMZ 치료 후 종양 성장 지연을 보였으 나, AAVS1 139 CAR-T를 주사한 마우스는 대조군 T 세포 마우스군에 비해 항종양 효과를 보이지 않았다(도 46). 이와 대조적으로, DGKαζ139 CAR-T 마우스군에서 56일째 완전한 종양 퇴화를 관찰되었다. 마찬가지로, AAVS1 139 CAR-T의 종양 내 주사는 U87vIII 종양을 제거할 수 없었지만, DGKαζ 139 CAR-T의 입양 세포 전이는 52일째 종양 세포 퇴행하는 의미있는 결과를 보였다. DGKαζ139 CAR-T의 생체 내 기능을 특성화하기 위해, 49 일째 종양을 추출하고, 종양 침윤 T 세포의 수를 측정하였다.
추가로 DGK KO 139 CAR-T 세포의 생체 내 기능을 특성화하기 위해, 주사한 AAVS1, αKO, ζ및 dKO 139 CAR-T 세포의 잔존 여부를 분석하였다. 그 결과 ζKO 및 dKO 139 CAR-T 세포가 종양 내에서 현저히 높은 수로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(도 47). 이는 Ki-67 염색된 세포로 대변되는 분열하는 T 세포가 더 많이 있기 때문이며, 이들이 기능적으로 우월한 effector T 세포임을 T-bet 발현의 증가 및, IFN-γ와 TNF-α 와 같은 사이토카인 분비 능력 향상을 통해 확인하였다(도 48).
결론적으로, 상기 데이터 결과는 CRIPSR / Cas9에 의한 DGKs의 인위적인 조작이 인간 CAR-T 세포의 생체 내 항종양 효능을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및 인공 수용체를 포함하는 조작면역세포를 통해 효과적인 면역세포 치료제를 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역세포 조작용 조성물에 의해 인위적으로 조작된 면역세포 또는 조작면역세포를 이용할 경우, 특정 항원 특이적 결합이 가능한 면역세포의 생존(survival), 증식(proliferation), 지속(persistency), 세포독성(cytotoxicity), 사이토카인 분비(cytokine-release) 및/또는 침윤(infiltration) 등에 관여하는 면역 효능이 향상됨에 따라 효과적인 면역세포 치료제로 이용될 수 있다.
면역 조절 유전자의 표적 서열(Target sequences of immunity regulating gene)
<110> ToolGen Incorporation <120> Artificially manipulated immune cells <130> OPP17-041-NP-PCT-PCT <150> US 62/502,822 <151> 2017-05-08 <150> PCT/KR 2017/008835 <151> 2017-08-14 <150> US 62/595159 <151> 2017-12-06 <160> 289 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cttgtggcgc tgaaaacgaa cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 2 atgccacttc tcagtacatg tgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 3 gccacttctc agtacatgtg ggg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 4 gccccacatg tactgagaag tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 5 tcagtacatg tggggcgttc agg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 6 gggcgttcag gacacagact tgg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 7 cacagacttg gtactgagga agg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 8 ggcgctgttc agcacgctca agg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 9 cacgcaactt taaattccgc tgg 23 <210> 10 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caagctgagt ggg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 22 tctctcaagc tgagtgggtc cgg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 23 ctctcaagct gagtgggtcc ggg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 24 caagctgagt gggtccgggc tgg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 25 ttgacatgac tggagagaag agg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 26 gactggagag aagaggtcgt tgg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 27 gagacgggag caaagctgct ggg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 28 agagacggga gcaaagctgc tgg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 29 tggtttctag gtgcagagac ggg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 30 taagtgaagg tctggtttct agg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 31 tgcccatgta agtgaaggtc tgg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 32 gaacttgccc atgtaagtga agg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 33 tccattgacc ctcagtaccc tgg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 34 tatgccttct gggtagcagc tgg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 35 tgagtgcagg catcttgcaa ggg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 36 gagtgcaggc atcttgcaag ggg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 37 gatgaggctg tggttgaagc tgg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 38 ccactggcca caggacccct ggg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 39 gggacatggt gcacacaccc agg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 40 gagtacaggt ggtccaggtc agg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 41 gcggagagta caggtggtcc agg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 42 gcggtggcgg agagtacagg tgg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 43 tctcctgcac agccagaata agg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 44 acgcagaagg gtcctggtag agg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA 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<213> Homo Sapiens <400> 92 cggagagctt cgtgctaaac tgg 23 <210> 93 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 93 cagcttgtcc gtctggttgc tgg 23 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 94 aggcggccag cttgtccgtc tgg 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 95 ccgggctggc tgcggtcctc ggg 23 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 96 cgttgggcag ttgtgtgaca cgg 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 97 cataaagcca tggcttgcct tgg 23 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 98 ccttggattt cagcggcaca agg 23 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 99 ccttgtgccg ctgaaatcca agg 23 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 100 cactcacctt tgcagaagac agg 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 101 ttccatgcta gcaatgcacg tgg 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 102 ggccacgtgc attgctagca tgg 23 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 103 ggcccagcct gctgtggtac tgg 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 104 aggtccgggt gacagtgctt cgg 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 105 ccgggtgaca gtgcttcggc agg 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 106 ctgtgcggca acctacatga tgg 23 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 107 caactcattc cccatcatgt agg 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 108 ctagatgatt ccatctgcac ggg 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 109 ggctaggagt cagcgacata tgg 23 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 110 gctaggagtc agcgacatat ggg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 111 ctaggagtca gcgacatatg ggg 23 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 112 gtactgtgta gccaggatgc tgg 23 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 113 acgagcactc accagcatcc tgg 23 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 114 aggctccagg aatgtccgcg agg 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 115 acttacctcg cggacattcc tgg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 116 caccctgggc acttacctcg cgg 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 117 gtgccgtaca aaggttggct ggg 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 118 ggtgccgtac aaaggttggc tgg 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 119 ctctcctcag taccacagca agg 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 120 cctggggcct ccgggcgcgg agg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 121 agtactcacc tggggcctcc ggg 23 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 122 agggtctcca gcggccctcc tgg 23 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 123 gcaagtactt acgcctcctt ggg 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 124 ttgcggtaca tctccagcct ggg 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 125 tttgcggtac atctccagcc tgg 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 126 gcaaaacctg tccactctta tgg 23 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 127 ttggtgccat aagagtggac agg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 128 ggtgcaagtt tcttatatgt tgg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 129 acctgatgca tataataatc agg 23 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 130 acctgattat tatatgcatc agg 23 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 131 cagagcacca gagtgccgtc tgg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 132 agagcaccag agtgccgtct ggg 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 133 agagtgccgt ctgggtctga agg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 134 aggaaggccg tccattctca ggg 23 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 135 ggatagaacc aaccatgttg agg 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 136 tctgttgccc tcaacatggt tgg 23 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 137 ttagtctgtt gccctcaaca tgg 23 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 138 gtctggcaaa tgggaggtga tgg 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 139 cagaggttct gtctggcaaa tgg 23 <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 140 ttgtagccag aggttctgtc tgg 23 <210> 141 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 141 acttctggat gagctctctc agg 23 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 142 agagctcatc cagaagtaaa tgg 23 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 143 ttggtgtctc catttacttc tgg 23 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 144 ttctggcttc ccttcataca ggg 23 <210> 145 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 145 caggactcac acgactattc tgg 23 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 146 ctactttctt gtgtaaagtc agg 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 147 gactttacac aagaaagtag agg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 148 gtctttctcc attagccttt tgg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 149 aatggagaaa gacgtaactt cgg 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Sapiens <400> 161 cataaatgcc attaacagtc agg 23 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 162 attagtagcc tgactgttaa tgg 23 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 163 cgatgggtga gtgatctcac agg 23 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 164 actcacccat cgcatacctc agg 23 <210> 165 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 165 ctcacccatc gcatacctca ggg 23 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 166 agcaacagga ggagttgcag agg 23 <210> 167 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 167 ccagtaggat cagcaacagg agg 23 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 168 ctcctgttgc tgatcctact ggg 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 169 ggcccagtag gatcagcaac agg 23 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 170 ttgctgatcc tactgggccc tgg 23 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 171 tggcaacagc ttgcagctgt ggg 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 172 cttgggtccc ctgcttgccc ggg 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Sapiens <400> 184 atttctggag gctccgtttc tgg 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 185 actgacacca ctcctctgac tgg 23 <210> 186 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 186 ctgacaccac tcctctgact ggg 23 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 187 accactcctc tgactgggcc tgg 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 188 aacccctgag tctaccactg tgg 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 189 ctccacagtg gtagactcag ggg 23 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 190 gctccacagt ggtagactca ggg 23 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 191 ggctccacag tggtagactc agg 23 <210> 192 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 192 cctgctgcaa ggcgttctac tgg 23 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 193 ccagtagaac gccttgcagc agg 23 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 194 cgttctactg gcctggatgc agg 23 <210> 195 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 195 tctactggcc tggatgcagg agg 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Sapiens <400> 207 tcttttggta gtaggttcca tgg 23 <210> 208 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 208 atggaaccta ctaccaaaag agg 23 <210> 209 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 209 aacagacctc ttttggtagt agg 23 <210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 210 gggtatgaac agacctcttt tgg 23 <210> 211 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 211 tgtgtcctct gttactcaca agg 23 <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 212 gtgtcctctg ttactcacaa ggg 23 <210> 213 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 213 gtagttgacg gacaaattgc tgg 23 <210> 214 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 214 tttgtccgtc aactacccag tgg 23 <210> 215 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 215 ttgtccgtca actacccagt ggg 23 <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 216 tgtccgtcaa ctacccagtg ggg 23 <210> 217 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 217 gtccgtcaac tacccagtgg ggg 23 <210> 218 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 218 ctctgtgaag cagtgcctgc tgg 23 <210> 219 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 219 cctgctggcc atcctaatct tgg 23 <210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 220 ccaagattag gatggccagc agg 23 <210> 221 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 221 ggccatccta atcttggcgc tgg 23 <210> 222 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 222 caccagcgcc aagattagga tgg 23 <210> 223 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 223 agtgcacacg aagaagatag tgg 23 <210> 224 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 224 tatcttcttc gtgtgcactg tgg 23 <210> 225 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 225 cttcgtgtgc actgtggtgc tgg 23 <210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 226 ggcggtccgc ctctcccgca agg 23 <210> 227 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 227 gcggtccgcc tctcccgcaa ggg 23 <210> 228 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 228 aattacgcac ggggtacatg tgg 23 <210> 229 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 229 tgggggagta attacgcacg ggg 23 <210> 230 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 230 gtgggggagt aattacgcac ggg 23 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 231 ggtgggggag taattacgca cgg 23 <210> 232 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 232 taattactcc cccaccgaga tgg 23 <210> 233 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 233 agatgcagac catctcggtg ggg 23 <210> 234 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 234 gagatgcaga ccatctcggt ggg 23 <210> 235 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 235 tgagatgcag accatctcgg tgg 23 <210> 236 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 236 ggatgagatg cagaccatct cgg 23 <210> 237 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 237 atctcatccc tgttgcctga tgg 23 <210> 238 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 238 tcatccctgt tgcctgatgg ggg 23 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 239 ctcaccccca tcaggcaaca ggg 23 <210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 240 gagggcccct cacccccatc agg 23 <210> 241 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 241 gggccctctg ccacagccaa tgg 23 <210> 242 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 242 ccctctgcca cagccaatgg ggg 23 <210> 243 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 243 cccccattgg ctgtggcaga ggg 23 <210> 244 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 244 gcccccattg gctgtggcag agg 23 <210> 245 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 245 ggacaggccc ccattggctg tgg 23 <210> 246 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 246 ccgggctctt ggccttggac agg 23 <210> 247 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 247 ctgtccaagg ccaagagccc ggg 23 <210> 248 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 248 tggcgtcagg cccgggctct tgg 23 <210> 249 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 249 cgggcctgac gccagagccc agg 23 <210> 250 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 250 caacaaccat gctgggcatc tgg 23 <210> 251 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 251 gagggtccag atgcccagca tgg 23 <210> 252 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 252 catctggacc ctcctacctc tgg 23 <210> 253 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 253 agggctcacc agaggtagga ggg 23 <210> 254 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 254 ggagttgatg tcagtcactt ggg 23 <210> 255 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 255 tggagttgat gtcagtcact tgg 23 <210> 256 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 256 agtgactgac atcaactcca agg 23 <210> 257 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 257 gtgactgaca tcaactccaa ggg 23 <210> 258 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 258 actccaaggg attggaattg agg 23 <210> 259 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 259 cttcctcaat tccaatccct tgg 23 <210> 260 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 260 tacagttgag actcagaact tgg 23 <210> 261 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 261 ttggaaggcc tgcatcatga tgg 23 <210> 262 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 262 agaattggcc atcatgatgc agg 23 <210> 263 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 263 gacagggctt atggcagaat tgg 23 <210> 264 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 264 tgtaacatac ctggaggaca ggg 23 <210> 265 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 265 gtgtaacata cctggaggac agg 23 <210> 266 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 266 cgtacctgtg caactcctgt tgg 23 <210> 267 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 267 gatctactgg aattcctaat ggg 23 <210> 268 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 268 gagtcagctg ttggcccatt agg 23 <210> 269 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 269 ctgcctacaa actcagtctc tgg 23 <210> 270 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 270 gggcaggcag gacggactcc agg 23 <210> 271 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 271 ggagtccgtc ctgcctgccc tgg 23 <210> 272 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 272 gagtccgtcc tgcctgccct ggg 23 <210> 273 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 273 gaaaagggtc cattggccaa agg 23 <210> 274 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 274 gcctgcagaa aagggtccat tgg 23 <210> 275 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 275 ttgatgtgct acagggaaca tgg 23 <210> 276 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 276 agcgttcttg atgtgctaca ggg 23 <210> 277 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 277 cagcgttctt gatgtgctac agg 23 <210> 278 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 278 ctgtagcaca tcaagaacgc tgg 23 <210> 279 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 279 tgtagcacat caagaacgct ggg 23 <210> 280 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 280 ataggcaata atcatataac agg 23 <210> 281 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 281 agtgcgtttc gctgcaggta agg 23 <210> 282 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 282 gagtgagtgc gtttcgctgc agg 23 <210> 283 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 283 gtcaggtttg tgcggttatg agg 23 <210> 284 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 284 cgctgctggt caggtttgtg cgg 23 <210> 285 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 285 aaacctgacc agcagcgcag agg 23 <210> 286 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 286 ccagcagcgc agaggagccg tgg 23 <210> 287 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 287 ccacggctcc tctgcgctgc tgg 23 <210> 288 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 288 ccaactatct aactccactc agg 23 <210> 289 <211> 23 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 289 cctgagtgga gttagatagt tgg 23

Claims (70)

  1. PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자의 표적 서열과 결합을 형성할 수 가이드핵산 및 자연발생적으로 존재하지 않는 인위적으로 생성된 수용체인 인공 수용체를 포함하는 면역세포 조작용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포 조작용 조성물은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에디터단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 3'-UTR(Untranslated Region), 또는 5'-UTR의 영역에 위치한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 면역 조절 유전자의 핵산서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 PAM 서열은 다음의 서열 중 1 이상인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물:
    5'-NGG-3'(N은 A, T, C 또는 G임);
    5'-NNNNRYAC-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
    5'-NNAGAAW-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
    5'-NNNNGATT-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
    5'-NNGRR(T) -3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임); 및
    5'-TTN-3' (N은 A, T, C 또는 G임).
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열은 서열번호 1 내지 289번 중 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 가이드핵산은 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 할 수 있는 가이드 도메인을 포함하며, 이때, 상기 상보적 결합은 0 내지 5개의 미스매칭(mismatching) 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 가이드 도메인은 면역 조절 유전자의 표적 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이때, 상기 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 0 내지 5개의 미스매칭을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 가이드핵산은 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 인공 수용체는 하나 이상의 항원에 결합 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항원은 암세포 및/또는 바이러스 특이적으로 발현되는 항원인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen)인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항원은 A33, ALK, 알파페토단백질(AFP), 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3), alpha-folate receptor, AD034, AKT1, BCMA, 베타-인간 융모막 고나도트로핀, B7H3(CD276), BST2, BRAP, CD5, CD13, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44v6, CD52, CD72, CD79a, CD79b, CD89, CD97, CD123, CD138, CD160, CD171, CD179a, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CA-125, 발암배아성 항원(CEA), CCR4, C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1), 클라우딘 6(CLDN6), CXORF61, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, ERBB2, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 신장 인자 2 돌연변이된(ELF2M), 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2), EMR2, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3), FCRL5, Fibulin-1, G250, GD2, 당단백질 36(gp36), 당단백질 100(gp100), 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), GPRC5D, GloboH, G 단백질-결합된 수용체 20(GPR20), GPC3, hsp70-2, 고분자량-흑색종-관련 항원(HMWMAA), A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1), 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6), 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7), HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Galectin9, HOM-MEEL- 40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB 1, 인슐린 성장 인자(IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2), 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra), IGLL1, KIT(CD117), KM-HN-3, KM-KN- 1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGA-1a, LAGE-1, LAIR1, LILRA2, LY75, Lewis Y antigen, MUC1, MN-CA IX, M-CSF, MAGE-1, MAGE-4a, 메소텔린, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MART1, MPPl 1, MSLN, 신경세포 부착 분자(NCAM), NY-ESO-1, NY-ESO-5, Nkp30, NKG2D, 유선 분화 항원(NY-BR-1), NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NNP-1, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK1 1, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2), OGFr, PSMA, 전립선 산성 포스파타제(PAP), p53, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 프로테아제세린 21(테스티신 또는 PRSS21), 혈소판-유래된 성장인자 수용체 베타(PDGFR-beta), PLAC1, 파넥신 3(PANX3), PLU-1, ROR-1, RAGE-1, RU1, RU2, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4), SCP1, SSX3, SSX4, SSX5, Tyrp-1, TAG72, 티로글로불린, 인간 텔로머라제역전사효소(hTERT), 5T4, 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제(Tyrosinase), 트랜스글루타미나제 5(TGS5), TEM1, TEM7R, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), Tie 2, TRP-2, TOP2A, TOP2B, 유로플라킨 2(UPK2), 비멘틴(Vimentin), 혈관 내피성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름 종양 단백질(WT1) 및 루이스(Y) 항원으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 인공 수용체는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 인공 수용체는 인위적으로 조작 또는 변형된 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  20. 제1항 및 제2항에 있어서,
    상기 가이드핵산, 인공 수용체 및 에디터단백질은 각각을 암호화하는 핵산 서열 형태인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  23. 제1항 및 제2항에 있어서,
    상기 인공 수용체 및 에디터단백질은 각각을 암호하는 mRNA 형태인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  24. 제1항 및 제2항에 있어서,
    상기 인공 수용체 및 에디터단백질은 폴리펩타이드 또는 단백질 형태인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  25. 제2항에 있어서,
    상기 면역세포 조작용 조성물은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 형태인 것을 특징으로 하는 면역세포 조작용 조성물.
  26. PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자 및/또는 이의 발현 산물; 및
    하나 이상의 인공 수용체 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 조작면역세포.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 내에 인위적인 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 표적 서열 내에 또는 표적 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 하나 이상의 인위적으로 변형된 면역 조절 유전자는 면역 조절 유전자의 뉴클레오타이드 서열 중 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp의 뉴클레오타이드 서열 부위에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  30. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실은 연속되는; 연속되지 않는; 또는 이들 두 가지 형태가 혼합된 1 내지 50bp 뉴클레오타이드의 결실인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  31. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실은 연속되는 2 내지 50bp 뉴클레오타이드 조각의 결실인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  32. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 연속되는; 연속되지 않는; 또는 이들 두 가지 형태가 혼합된 1 내지 50bp 뉴클레오타이드의 삽입인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  33. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 연속하는 5 내지 1000bp 뉴클레오타이드 조각의 삽입인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  34. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 특정 유전자의 일부 또는 전체 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 면역세포에 포함되지 않는 외부에서 도입된 외인성 유전자(exogenous gene)인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  36. 제34항에 있어서,
    상기 특정 유전자는 면역 조절 유전자를 포함하는 면역세포의 게놈에 존재하는 내생성 유전자(endogenous gene)인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  37. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 동일한 뉴클레오타이드 서열 부위에서 발생하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  38. 제28항 및 제29항에 있어서,
    상기 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입은 서로 다른 뉴클레오타이드 서열 부위에서 발생하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  39. 제26항에 있어서,
    상기 발현산물은 mRNA 및/또는 단백질인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  40. 제26항에 있어서,
    상기 발현산물은 인위적으로 조작되지 않은 야생형의 면역세포에서 발현되는 발현산물에 비해 그 발현양이 감소되거나 억제된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 인위적으로 조작되지 않은 야생형의 면역세포는 인간에게서 분리한 면역세포인 것을 특징으로 하는 하는 조작면역세포.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 인위적으로 조작되지 않은 야생형의 면역세포는 인위적인 조작을 가하지 전의 면역세포인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  43. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈에 삽입되지 않는 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  44. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 중 면역 조절 유전자의 3'-UTR, 5'-UTR, 인트론, 엑손, 프로모터 및/또는 인핸서 위치에 삽입된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  45. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 인트론들 중 하나 이상의 인트론에 삽입된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  46. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 엑손들 중 하나 이상의 엑손에 삽입된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  47. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 프로모터들 중 하나 이상의 프로모터에 삽입된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  48. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 인핸서들 중 하나 이상의 인핸서에 삽입된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  49. 제26항에 있어서,
    상기 인공 수용체 단백질을 암호화하는 핵산은 조작면역세포의 게놈 내에 존재하는 인트론, 엑손, 프로모터 및 인핸서를 제외한 부분 중 하나 이상의 부분에 삽입된 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  50. 제26항에 있어서,
    상기 조작면역세포는 수지상세포(dendritic cell), T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 CIK 세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인위적으로 조작된 세포인 것을 특징으로 하는 조작면역세포.
  51. 제26항에 있어서, 다음 중 하나 이상의 특성을 보이는 조작면역세포:
    사이토카인(cytokine) 생성 및/또는 분비 증가;
    세포 증식(proliferation); 및
    세포독성(cytotoxicity) 증가.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 사이토카인(cytokine)은 IL-2, TNFα 및 IFN-γ로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제26항의 조작면역세포.
  53. (a) 면역세포;
    (b) 인공 수용체 발현용 조성물 또는 인공 수용체 단백질; 및
    (c) PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역 조절 유전자를 인위적으로 조작할 수 있는 유전자 조작용 조성물
    을 접촉시키는 단계를 포함하는 조작면역세포 제조 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 (a) 면역세포는 인체에서 분리한 면역세포 또는 줄기세포로부터 분화시킨 면역세포인 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법.
  55. 제53항에 있어서,
    상기 (b) 인공 수용체 발현용 조성물은 인공 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법
  56. 제53항에 있어서,
    상기 (c) 유전자 조작용 조성물은
    PD-1 유전자, CTLA-4 유전자, DGKA 유전자, DGKZ 유전자, FAS 유전자, EGR2 유전자, PPP2r2d 유전자, TET2 유전자, PSGL-1 유전자, A20 유전자 및 KDM6A 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 면역조절인자의 핵산서열 중 서열번호 1 내지 289번의 표적서열에 상동성을 가지거나 또는 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드핵산 또는 가이드핵산을 암호화하는 핵산; 및
    스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 에디터단백질 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산을
    포함하는 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 각각 뉴클레오타이드 서열의 형태로 하나 이상의 벡터 형태이거나, 또는 가이드핵산과 에디터단백질이 결합한 가이드핵산-에디터단백질 복합체 형태인 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법.
  58. 제53항에 있어서,
    상기 접촉시키는 단계는 생체 외에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법.
  59. 제53항에 있어서,
    상기 접촉시키는 단계는 상기 (a) 면역세포에 (b) 인공 수용체 발현용 조성물과 (c) 유전자 조작용 조성물을 순차적으로 접촉시키거나 또는 동시에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법.
  60. 제53항에 있어서,
    상기 접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 조작면역세포 제조 방법.
  61. 제26항의 조작면역세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환 치료 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 조성물은 항원결합매개체, 사이토카인, 사이토카인 분비촉진제 또는 사이토카인 억제제 및 면역체크포인트 저해제(immune checkpoint inhibitor)중 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 조성물은 조작면역세포를 체내에 전달하기 위한 적절한 담체를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  64. 제62항에 있어서,
    상기 면역체크포인트 저해제(immune checkpoint inhibitor)는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, BTLA, IDO, VISTA, ICOS, KIRs, CD160, CD244 또는 CD39의 저해제인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  65. 제61항에 있어서,
    상기 조성물에 포함되는 조작면역세포는 환자의 자가 세포 또는 환자의 동종이계 세포인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  66. 제61항에 있어서,
    상기 면역질환은 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 이식편대숙주병(GVHD, Graft versus host disease), 루푸스(systemic lupus erythematosus), 셀리악 병(celiac disease), 제1 형 당뇨병(diabetes mellitus type 1), 그레이브스 병(graves disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 건선(psoriasis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 다발성 경화증(muliple sclerosis)인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  68. 제61항에 있어서,
    상기 면역질환은 바이러스 감염 질환, 프리온 병원체 유래 질병 또는 암인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  69. 제61항에 있어서,
    상기 조성물은 면역질환 환자에 투여하는 단계는 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)의 방법으로 투여되는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료 방법.
  70. 제61항에 있어서,
    상기 치료 대상은 인간, 원숭이, 마우스, 래트를 포함하는 포유동물인 것을 특으로 하는 면역질환 치료 방법.
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