CN115151275A - 用于向细胞递送核酸的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将核酸货物递送至细胞中的组合物及其使用方法。所述组合物通常包含(a)3E10单克隆抗体或其抗原结合、细胞穿透片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或者双体抗体；或其人源化形式或变体，和(b)核酸货物，包含例如，编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。元件(a)和(b)通常非共价连接以形成复合物。

Description

用于向细胞递送核酸的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月5日向美国专利商标局提交的标题为“用于向细胞递送核酸的组合物和方法”的美国临时申请号 62/944,281，2019年08月30日向专利合作条约美国受理局提交的标题为“用于增强基于供体寡核苷酸的基因编辑的组合物和方法”的国际申请号PCT/US2019/048953，以及2019年08月30日向专利合作条约美国受理局提交的标题为“用于增强基于三链体和核酸酶的基因编辑的组合物和方法”的国际申请号PCT/US2019/048962的权益和优先权。美国临时申请号62/944,281、国际申请号 PCT/US2019/048953、美国临时申请号62/725,920、国际申请号 PCT/US2019/048962、美国临时申请号62/725,852分别具体地以全文引用的方式并入本文。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的CA197574下由政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表的引用
创建于2020年08月31日并且大小为154,701字节的以名称为“YU_7503_3_ST25”的文本文件提交的序列表根据37C.F.R.§ 1.52(e)(5)通过引用特此并入。
技术领域
本发明总体上涉及核酸的细胞内递送领域，其应用包括但不限于体外、离体和体内基因疗法和基因编辑。
背景技术
基因疗法包括一系列应用，从遗传或后天疾病(如癌症)的基因替代和敲低到疫苗接种。病毒载体和合成脂质体已成为当今很多应用的首选媒介，但两者都有局限性和风险，包括生产的复杂性、有限的包装能力和不利的免疫学特征，这些都限制了基因疗法的应用并阻碍了预防性基因疗法的潜力(Seow和Wood,Mol Ther.17(5): 767–777(2009))。
已观察到核苷酸在细胞和组织中的体内摄取和分布(Huang等， FEBS Lett.,558(1-3):69-73(2004))。此外，尽管，例如，Nyce等已发现反义寡脱氧核苷酸(ODN)当吸入时与内源性表面活性剂(由肺细胞产生的脂质)结合并被肺细胞吸收，而无需另外的载体脂质(Nyce等，Nature,385:721-725(1997))，小核酸被摄入到T24膀胱癌组织培养细胞中(Ma等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:415-426(1998))，但仍需要改进的核酸转染技术，特别是对于体内应用而言。在2003年发现了AAV9，其仍是通常用于人类的病毒载体(Robbins,“Gene therapy pioneer says the field is behind–and that deliverytechnology is embarrassing,”Stat，2019年11月)。
因此，本发明的一个目的是提供组合物及其使用方法，以改进核酸进入细胞的递送。
发明内容
提供了用于将核酸货物递送到细胞中的组合物及其使用方法。该组合物通常包含(a)3E10单克隆抗体或其细胞穿透片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或者双体抗体；或其人源化形式或变体，和(b)核酸货物，其包含例如编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。元件(a)和(b)通常非共价连接以形成复合物。据信，除了DNA以外，3E10还与RNA、 PNA和其他核酸结合。
示例性3E10抗体及其片段和融合蛋白包含具有以下的那些：(i) SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中的任一个的CDR与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中的任一个的CDR的组合；(ii)选自SEQ ID NO:15-23、42或43中的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQ ID NO:24-30、44或45中的第一、第二和第三轻链CDR的组合； (iii)(i)或(ii)的人源化形式；(iv)包括与SEQ ID NO:1或2 中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与 SEQ ID NO:7或8包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；(v)(iv)的人源化形式；或者(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、 46-48或50-52中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合。
在一些实施方式中，所述抗体及其片段和融合蛋白是CDR1重链变体，其具有被精氨酸(R)或赖氨酸(L)取代的对应于3E10 重链氨基酸序列或其CDR的氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述抗体及其片段和融合蛋白包含SEQ ID NO:92或93的核酸结合口袋，或与核酸(如DNA、RNA或其组合) 结合的能力相同或提高的其变体。
还提供了结合蛋白本身，其包含CDR1重链变体，所述CDR1 重链变体具有被精氨酸(R)或赖氨酸(L)取代的对应于3E10重链氨基酸序列或其CDR1的D31或N31的氨基酸残基，以及结合蛋白本身，其具有SEQ ID NO:92或93的核酸结合口袋，或与核酸(如 DNA、RNA或其组合)结合的能力相同或提高的其变体。
在一些实施方式中，抗体或片段或融合蛋白可以是双特异性的，并且例如可以包含靶向目标细胞类型、组织或器官的结合序列。
核酸货物可以由DNA、RNA、修饰的核酸(包括但不限于PNA) 或其组合构成。核酸货物通常是功能性货物，如功能性核酸(例如，抑制性RNA)、mRNA或载体，例如表达载体。核酸货物(包括载体)可以包含与表达控制序列可操作地连接的编码目标多肽的核酸序列。载体可以是例如质粒。例如，货物通常不是随机剪切或片段化的基因组DNA。
在一些实施方式中，货物包含或由编码Cas核酸内切酶的核酸、 gRNA或其组合组成。在一些实施方式中，货物包含或由编码嵌合抗原受体多肽的核酸组成。在一些实施方式中，货物是功能性核酸，如反义分子、siRNA、微RNA(miRNA)、适体、核酶、RNAi或外部指导序列，或者编码其的核酸构建体。
货物可以包含或由多个单一核酸分子，或多个2、3、4、5、6、 7、8、9、10种或更多种不同核酸分子组成。在一些实施方式中，货物的核酸分子包含或由长度为约1至约25,000个核碱基的核酸分子组成。货物可以是单链核酸、双链核酸或其组合。
还提供了包含复合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，将复合物包封在聚合物纳米颗粒中。靶向部分、细胞穿透肽或其组合与纳米颗粒结合、连接、缀合或以其他方式直接或间接附接。
还提供了通过使细胞与单独的有效量的复合物或包封在纳米颗粒中的复合物接触来将核酸货物递送到细胞中的方法。接触可以在体外、离体或体内发生。在一些实施方式中，向有需要的受试者施用有效量的离体处理的细胞，例如，以治疗疾病或病症的一种或多种症状的有效量施用。
在一些实施方式中，在向有需要的受试者施用后，在体内发生接触。受试者可以患有疾病或病症，如遗传病症或癌症。可以向受试者施用有效量的组合物，例如通过注射或输注，以减轻受试者的疾病或病症的一种或多种症状。
还提供了组合物和方法的应用，其包括但不限于基因疗法和 CAR T细胞生产/形成/疗法。
附图说明
图1A-1C是散点图，显示了对照(1A)以及单独(1B)和与3E10 混合1小时(1C)时PNA的摄取。图1D是量化图1A-1C中数据的条形图。
图2A-2C是散点图，显示了对照(2A)以及单独(2B)和与3E10 混合24小时(2C)时PNA的摄取。图2D是量化图2A-2C中数据的条形图。
图3A-3C是散点图，显示了对照(3A)以及单独(3B)和与3E10 混合24小时(3C)时siRNA的摄取。图3D是量化图3A-3C中数据的条形图。
图4A-4H是散点图，显示了对照(4A)以及单独(4B)和与各种浓度3E10混合24小时(4C-4H)时mRNA的摄取。图4I是量化图4A-4H中数据的条形图。
图5A-5H是散点图，显示了对照(5A)以及单独(5B)和与各种浓度3E10混合1小时(5C-5H)时mRNA的摄取。图5I是量化图5A-5H中数据的条形图。
图6是一系列图像，显示了与3E10混合72小时后和与细胞孵育24小时后GFP报告质粒DNA的细胞表达。
图7A是条形图，显示了在小鼠中全身注射之前将荧光标记的 siRNA与增加剂量的3E10(0.25、0.5和1mg)在室温下混合15分钟在肿瘤中的累积。图7B是条形图，显示了在小鼠中全身注射之前将荧光标记的siRNA与1mg 3E10或0.1mg D31N变体3E10在室温下混合15分钟在肿瘤中的累积。注射后24小时分析所有肿瘤。
图8是线形图，显示了随着时间的推移(IM注射后天数)向小鼠肌肉(IM)的3E10介导的mRNA递送(生物发光(光子/秒))。
图9A和图9B是显示对照(图9A)和IV注射的3E10-D31N分布到肌肉(图9B)的图像，由IVIS(Perkin Elmer)在注射后24小时成像。图9C是量化IVIS图像中荧光的条形图。
图10是在将100μg或200μg用VivoTag680(Perkin Elmer)标记的3E10-D31N静脉注射到小鼠后24小时，量化3E10-D31N在组织中剂量依赖性生物分布的IVIS图像中的荧光的条形图。
图11A和图11B是显示对照(图11A)和IV注射的3E10-D31N 分布到同基因结肠肿瘤(CT26)(图11B)的图像，由IVIS(Perkin Elmer)在注射后24小时成像。图11C是量化IVIS图像中荧光的条形图。
图12A、12B和图12C是显示对照(图12A)，以及IV注射的裸单链DNA(ssDNA)(图12B)和3E10-D31N+ssDNA(图12C) 分布到同基因结肠肿瘤(CT26)的图像，由IVIS(PerkinElmer)在注射后24小时成像。图12D是量化IVIS图像中荧光的条形图。
图13是显示3E10介导的RIG-I递送和刺激的条形图。
图14A是3E10，其推定的核酸结合口袋(NAB1)，以及由其中的氨基酸突变诱导的预测结构变化的分子建模图示。图14B是 3E10-scFv(Pymol)的分子建模图示，其中NAB1氨基酸残基由点状点突出显示。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”是指单链可变片段，该单链可变片段包含由接头连接的单个多肽链中的轻链可变区(VL) 和重链可变区(VH)，该接头使scFv能够形成抗原结合的期望结构 (即，用于单个多肽链的VH和VL相互缔合以形成Fv)。VL区和 VH区可以来源于亲本抗体或者可以化学地或重组地合成。
如本文所用，术语“可变区”旨在区分免疫球蛋白的这种结构域与抗体广泛共享的结构域(如抗体Fc结构域)。可变区包含“高变区”，该高变区的残基负责抗原结合。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常在大约轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)处以及在大约重链可变结构域中的残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3) 处；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/ 或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32 (L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32 (H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987,J.Mol. Biol.196:901-917)。
如本文所用，如本文中定义的，术语“框架区”或“FR”残基是除了高变区残基以外的那些可变结构域残基。
如本文所用，术语“抗体”是指结合靶抗原的天然或合成抗体。该术语包含多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”中还包含那些免疫球蛋白分子的结合蛋白、片段和聚合物以及结合靶抗原的免疫球蛋白分子的人或人源化形式。
如本文所用，术语“细胞穿透抗体”是指被转运到活的哺乳动物细胞的细胞质和/或细胞核中的免疫球蛋白、其片段、变体或基于其的融合蛋白。“细胞穿透抗DNA抗体”特异性结合DNA(例如，单链和/或双链DNA)。在一些实施方式中，抗体在不借助于载体或缀合物的情况下被转运到细胞的细胞质中。在其他实施方式中，抗体与细胞穿透部分(如细胞穿透肽)缀合。在一些实施方式中，细胞穿透抗体在使用或不使用载体或缀合物的情况下转运在细胞核中。
除完整的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”还包含免疫球蛋白分子的片段、结合蛋白和聚合物、含有来自多于一个物种、种类或亚类免疫球蛋白的序列的嵌合抗体(如人或人源化抗体)以及至少含有特异性结合DNA的免疫球蛋白的独特型的重组蛋白。可以使用本文所述的体外测定或通过类似方法来测试抗体的期望活性，之后根据已知的临床测试方法来测试其体内治疗活性。
如本文所用，术语“变体”是指不同于参考多肽或多核苷酸但保留了基本性质的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一种参考多肽。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常类似并且在许多区域完全相同。变体和参考多肽在氨基酸序列上的不同之处可以在于一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。经取代的或插入的氨基酸残基可以是或者不是由遗传密码编码的残基。多肽的变体可以是天然存在的，如等位基因变体，或者可以是并非已知天然地存在的变体。
可以对本公开的多肽结构进行修饰和改变，并且仍然获得了具有与多肽类似的特性的分子(例如，保守性氨基酸取代)。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其他氨基酸，而没有明显的活性损失。因为多肽的相互作用能力和性质限定了多肽的生物功能活性，所以可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，但仍然获得了具有相似性质的多肽。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域中通常理解亲水氨基酸指数在向多肽赋予相互作用生物功能方面的重要性。已知某些氨基酸可以取代具有类似亲水指数或评分的其他氨基酸并且仍然产生具有类似生物活性的多肽。根据其疏水性和电荷特性，已经为每个氨基酸指定了亲水指数。这些指数为：异亮氨酸 (+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
据信，氨基酸的相对亲水特性确定了所得多肽的二级结构，这进而限定了多肽与如酶、底物、受体、抗体、抗原和辅因子的其他分子的相互作用。本领域中已知的是，氨基酸可以被具有类似亲水指数的另一个氨基酸取代并且仍然获得功能上等同的多肽。在此类改变中，优选亲水指数在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，并且甚至更加特别优选亲水指数在± 0.5以内的氨基酸的取代。
也可以在亲水性的基础上进行相似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物学功能等同多肽或肽旨在用于免疫学实施方式的情况下。已对氨基酸残基指定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸 (+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有类似亲水性值的另一种氨基酸并且仍然获得生物学上等同的，特别是免疫学上等同的多肽。在这种改变时，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所概述的，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的并且包含(原始残基：示例性取代)：(Ala：Gly，Ser)、(Arg：Lys)、(Asn： Gln，His)、(Asp：Glu，Cys，Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、 (Gly：Ala)、(His：Asn，Gln)、(Ile：Leu，Val)、(Leu：Ile， Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu，Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr： Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp，Phe)和(Val：Ile，Leu)。因此，本公开内容的实施方式考虑了如上所述的多肽的功能或生物学等效方案。具体地说，多肽的实施方式可以包含与所关注多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的变体。
如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”被定义为在必要时比对序列并引入空位以获得最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。可以用本领域技术中的多种方式来实现出于测定序列同一性百分比的目的进行的比对，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR) 软件。可以通过已知方法测定用于测量比对的适当参数，包含在被比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。
出于本文的目的，给定核苷酸或氨基酸序列C与、和或相对于给定核酸序列D的序列同一性％(该序列同一性％可以可替代地表述为给定序列C与、和或相对于给定序列D具有或包含一定序列同一性％)计算如下：
100乘以分数W/Z，
其中W是由序列比对程序在该程序对C和D的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数量，而其中Z是D中核苷酸或氨基酸的总数。应当理解，当序列C的长度不等于序列D的长度时，C与 D的序列同一性％将不等于D与C的序列同一性％。
如本文所用，术语“特异性地结合”是指抗体与其同源抗原(例如，DNA)结合，而不与其它抗原显著结合。在此类条件下抗体与靶标的特异性结合需要针对其对靶标的特异性来选择抗体。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白进行特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见例如Harlow和Lane(1988) Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPublications, New York，了解可以用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。优选地，抗体与该第二分子以大于约105mol-1(例如， 106mol-1、107mol-1、108mol-1、109mol-1、1010mol-1、1011mol-1和 1012mol-1或更大)的亲和常数(Ka)与抗原“特异性地结合”。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“MAb”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了抗体分子的小子集中可能存在的可能天然存在的突变外，群体中的单个抗体是相同的。
如本文所用，术语“受试者”意指作为施用靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人。该术语不指示具体的年龄或性别。
如本文所用，术语“有效量”意指使用的组合物的量是足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状的量。此类改善仅需要减少或改变，并不需要消除。精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者相关的变量(例如，年龄、免疫系统健康状况等)、所治疗疾病或病症以及施用途径和所施用药剂的药代动力学。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不是生物学上或在其它方面不期望的材料，即，该材料可以施用于受试者，而不会引起任何不期望的生物学效应或以任何有害的方式与含有该材料的药物组合物中的其他组分中的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“载体”或“赋形剂”是指制剂中的有机或无机成分、天然或合成的非活性成分，一种或多种活性成分与其组合。如本领域技术人员所熟知的，载体或赋形剂将被自然地选择来最小化活性成分的任何降解并且最小化受试者中的任何不良副作用。
如本文所用，术语“治疗”是指患者的医疗管理，其有意治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。此术语包括积极治疗，即特异性针对疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包含病因治疗，即针对相关疾病、病理状况或病症的病因的去除的治疗。此外，此术语包含姑息治疗，即设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防治疗，即针对使相关疾病、病理状况或病症的发展最小化或部分或完全抑制其发展的治疗；以及支持性治疗，即用于补充针对相关疾病、病理状况或病症的改善的另一种特定疗法的治疗。
如本文所用，“靶向部分”是可以将颗粒或分子指引到所选细胞或组织类型的受体位点，可以用作附接分子或用来偶联或附接另一个分子的物质。如本文所用，“指引”是指使分子优先附接到所选细胞或组织类型。如下文所述，这可以用于指引细胞材料、分子或药物。
如本文所用，术语“抑制”或“降低”意指减小活性、响应、病状、疾病或其他生物参数。这可以包含但不限于活性、响应、病状或疾病的完全消融。这还可以包含例如与天然或对照水平相比，活性、响应、病状或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 100％或其间的任何减少量。
如本文所用，“融合蛋白”是指通过将两个或更多个多肽通过在一个多肽的氨基端与另一个多肽的羧基端之间形成的肽键进行连接而形成的多肽。融合蛋白可以通过构成的多肽的化学偶联形成，或者可以从对单个连续融合蛋白进行编码的核酸序列表达为单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽主链的融合蛋白。可以使用分子生物学中的常规技术来制备融合蛋白，以将使用相同读框的两个基因连接成单个核酸序列，并且然后在产生融合蛋白的条件下在适合的宿主细胞中表达核酸。
除非本文中另外指明，否则对本文中值的范围的记载仅旨在用作单独地提及落入该范围的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同在本文中单独地叙述一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其他实施方式中，这些值可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所述值的值范围内；在其他实施方式中，这些值可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所述值的值范围内；在其他实施方式中，这些值可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所述值的值范围内。上述范围旨在根据上下文确定，并且未隐含进一步限制。
除非另外指明或明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以按任何适合的顺序执行。除非另外要求，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明实施例，而不构成对实施例的范围的限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
II.组合物
已发现3E10抗体有助于将核酸递送穿过质膜并进入细胞质和细胞核。因此，提供了使用3E10增强核酸构建体递送的组合物和方法。通常将有效量的3E10抗体与需要递送到细胞中的核酸接触。通常，接触发生足够长的时间以使3E10和核酸货物形成复合物。使复合物与细胞接触足够长时间以使得将核酸货物递送到细胞中。与在不存在抗体的情况下细胞与核酸货物接触的情况相比，货物可以以更大的数量、更高的质量(例如，更完整、更高功能性等)或更快的速率或其组合累积。因为将抗体作为递送手段，所以递送系统通常是非病毒的。
A.3E10抗体
尽管在本文中通常称为“3E10”或“3E10”抗体，但应当意识到的是，片段和结合蛋白，包括抗原结合片段、变体和融合蛋白如 scFv、di-scFv、tr-scFv，和其他单链可变片段，以及本文公开的其他细胞穿透的核酸转运分子均被该短语涵盖，其也明确提供用于本文公开的组合物和方法。因此，抗体和其他结合蛋白在本文中也称为细胞穿透的。
在优选实施方式中，在没有载体或偶联物的辅助下将3E10抗体转运到细胞的细胞质和/或细胞核中。例如，在Richard Weisbart的美国专利号4,812,397和7,189,396中公开了在体内转运至哺乳动物细胞核而无细胞毒性作用的单克隆抗体3E10及其活性片段。
在一些实施方式中，抗体可以结合和/或抑制Rad51。参见例如，在Turchick等，Nucleic Acids Res.,45(20):11782-11799(2017)，WO 2020/047344和WO 2020/047353中描述的抗体，其每一个均以引用方式具体并入本文。
可用于组合物和方法的抗体包括任何类别的完整免疫球蛋白 (即，完整抗体)、其片段和至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白。可变结构域在抗体之间的序列不同，并用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不会在抗体可变结构域中均匀分布。其通常集中在轻链和重链可变结构域中称为互补性决定区(CDR)或高变区的三个片段中。可变结构域中较高度保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR区，主要采用β折叠片构型，由三个CDR连接，其形成连接β折叠片结构，且在一些情况下形成β折叠片结构的一部分的环。每条链中的CDR由FR区紧密保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。因此，抗体通常至少包含维持DNA结合和/或干扰DNA修复所必需的CDR。
3E10抗体通常是单克隆3E10，或其变体、衍生物、片段、融合物或人源化形式，其结合与3E10相同或不同的表位。
2000年9月6日收到根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)条款的产生单克隆抗体3E10的杂交瘤细胞系的保藏，并被美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801UniversityBlvd.,Manassas,VA 20110-2209,USA接受，并获得专利保藏号PTA-2439。
因此，抗体可以具有与由ATCC No.PTA 2439杂交瘤产生的单克隆抗体3E10相同或不同的表位特异性。抗体可以具有单克隆抗体 3E10的互补位。抗体可以是3E10的单链可变片段或变体，例如，其保守性变体。例如，抗体可以是3E10的单链可变片段(3E10 Fv) 或其变体。
1.3E10序列
单克隆抗体3E10的氨基酸序列是本领域已知的。例如，下文提供了3E10重链和轻链的序列，其中单下划线表示根据Kabat系统鉴定的CDR区，而在SEQ ID NO:12-14中，斜体表示可变区并且双下划线表示信号肽。还提供了根据IMGT系统的CDR。
a.3E10重链
在一些实施方式中，3E10的重链可变区是：
Figure BDA0003624229800000141
Figure BDA0003624229800000142
(SEQ ID NO:1；Zack等，Immunology and Cell Biology,72:513-520(1994)；GenBank：L16981.1–小鼠Ig重排L链基因，部分cds；以及GenBank：AAA65679.1–免疫球蛋白重链，部分[小家鼠])。
在一些实施方式中，3E10重链表达为
Figure BDA0003624229800000151
Figure BDA0003624229800000152
(3E10WT重链；SEQ ID NO:12)。
将突变并入到野生型序列中的3E10抗体的变体在本领域中也是已知的，如在例如，Zack等，J.Immunol.,157(5):2082-8(1996)中公开的。例如，已测定3E10的重链可变区的氨基酸位置31对抗体和其片段穿透细胞核并与DNA结合的能力有影响(在SEQ ID NO:1、2和13中以粗体表示)。CDR1中的D31N突变(在SEQ ID NO:2 和13中以粗体表示)穿透细胞核并结合DNA，其效率比原始抗体高得多(Zack等，Immunology and Cell Biology,72:513-520(1994)， Weisbart等，J.Autoimmun.,11,539-546(1998)；Weisbart,Int.J.Oncol.,25,1867-1873(2004))。在一些实施方式中，抗体具有D31N取代。
在一些实施方式中，3E10的重链可变区的优选变体的氨基酸序列是：
Figure BDA0003624229800000153
Figure BDA0003624229800000154
(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中，3E10重链表达为
Figure BDA0003624229800000155
Figure BDA0003624229800000156
(3E10D31N变体重链；SEQ ID NO:13)。
在一些实施方式中，在3E10重链可变区中，SEQ ID NO:1或2 的C端丝氨酸不存在或被例如丙氨酸取代。
由Kabat鉴定的互补决定区(CDR)上方用下划线示出，并且包含CDR H1.1(原始序列)：DYGMH(SEQ ID NO:15)；CDR H1.2 (具有D31N突变)：NYGMH(SEQ ID NO:16)；CDR H2.1：YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO:17)；CDR H3.1：RGLLLDY (SEQ ID NO:18)。
Kabat CDR H2.1的变体包括YISSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:19)和YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:42)。
另外地或替代地，可以根据IMGT系统定义重链互补决定区 (CDR)。由IMGT系统鉴定的互补决定区(CDR)包含CDR H1.3 (原始序列)：GFTFSDYG(SEQ ID NO:20)；CDR H1.4(具有D31N 突变)：GFTFSNYG(SEQ ID NO:21)；CDR H2.2：ISSGSSTI(SEQ ID NO:22)和变体ISSSSSTI(SEQ ID NO:43)；CDR H3.2： ARRGLLLDY(SEQ ID NO:23)。
b.3E10轻链
在一些实施方式中，3E10的轻链可变区是：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQ PPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:7)。
3E10轻链可变区的氨基酸序列也可以是：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQ PPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFHLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLELK(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方式中，3E10轻链表达为
Figure BDA0003624229800000161
Figure BDA0003624229800000162
(3E10 WT轻链；SEQ ID NO:14)。
其他3E10轻链序列是本领域已知的。参见，例如，Zack等，J. Immunol.,15；154(4):1987-94(1995)；GenBank：L16981.1–小鼠Ig 重排L轻链，部分cds；GenBank：AAA65681.1–免疫球蛋白轻链，部分[小鼠])。
如由Kabat鉴定的互补决定区(CDR)用下划线示出，包含CDR L1.1：RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:24)；CDR L2.1：YASYLES (SEQ ID NO:25)；CDR L3.1：QHSREFPWT(SEQ ID NO:26)。
Kabat CDR L1.1的变体包括RASKSVSTSSYSYLA(SEQ ID NO: 27)和RASKTVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:44)。
Kabat CDR L2.1的变体是YASYLQS(SEQ ID NO:28)。
另外地或替代地，可以根据IMGT系统定义重链互补决定区 (CDR)。如由IMGT系统鉴定的互补决定区(CDR)包含CDR L1.2 KSVSTSSYSY(SEQ ID NO:29)和变体KTVSTSSYSY(SEQ ID NO: 45)；CDR L2.2：YAS(SEQ ID NO:30)；CDR L3.2：QHSREFPWT (SEQ ID NO:26)。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:7或8的序列的C末端进一步包含3E10轻链可变区中的精氨酸。
2.人源化3E10
在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。用于使非人抗体人源化的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人的来源引入到其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，这些输入残基通常取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵对抗体分子的一条或多条多肽链进行编码的DNA序列。
在WO 2015/106290、WO 2016/033324、WO 2019/018426和 WO/2019/018428中讨论并在下文提供了示例性3E10人源化序列。
a.人源化3E10重链可变区
在一些实施方式中，人源化3E10重链可变结构域包含 EVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSS(hVH1,SEQ ID NO:3)，或
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTLTVSS(hVH2,SEQ ID NO:4)，或
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTLVTVSS(hVH3,SEQ ID NO:5)，或
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEYVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKRGLL LDYWGQGTLVTVSS(hVH4,SEQ ID NO:6)，或
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSS(变体2、6和10，SEQ ID NO:46)，或
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYI SSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL
LDYWGQGTTVTVSS(变体3、7和11，SEQ ID NO:47)，或 EVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYI SSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL
LDYWGQGTTVTVSS(变体4、8和12，SEQ ID NO:48)，或 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL
LDYWGQGTTVTVSS(变体13、16和19，SEQ ID NO:50)，或 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSS(变体14和17，SEQ ID NO:51)，或
EVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSS(变体15和18，SEQ ID NO:52)。
b.人源化3E10轻链可变区
在一些实施方式中，人源化3E10轻链可变结构域包含
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYLAWYQQKPEKAPKLL IKYASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GAGTKLELK(hVL1,SEQ ID NO:9)，或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPEKAPKLL IKYASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHSREFPWTF GAGTKLELK(hVL2,SEQ ID NO:10)，或
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IYYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIK(hVL3,SEQ ID NO:11)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIK(变体2、3和4，SEQ ID NO:53)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIK(变体6、7和8，SEQ ID NO:54)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIK(变体10、11和12，SEQ ID NO:55)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIK(变体13、14和15，SEQ ID NO:56)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIK(变体16、17和18，SEQ ID NO:57)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIK(变体19，SEQ ID NO:58)
c.细胞穿透和核定位
所公开的组合物和方法通常利用维持穿透细胞和任选地细胞核的能力的抗体。
通过自身抗体的细胞内化机制是多种多样的。一些通过静电相互作用或FcR介导的内吞作用进入细胞，而另一些则利用基于与细胞表面肌球蛋白或钙网蛋白结合的机制，然后通过内吞作用 (Ying-Chyi等，Eur J Immunol 38,3178-3190(2008)，Yanase等，JClin Invest 100,25-31(1997))。3E10以不依赖于Fc的机制穿透细胞 (如通过缺乏Fc的3E10片段穿透细胞的能力所证明的)，但涉及存在核苷转运蛋白ENT2(Weisbart等，Sci Rep5:12022.doi: 10.1038/srep12022.(2015)，Zack等，J Immunol 157,2082-2088(1996)，Hansen等，J Biol Chem 282,20790-20793(2007))。因此，在一些实施方式中，在所公开的组合物和方法中使用的抗体是以非Fc依赖性的机制穿透细胞但涉及存在核苷转运蛋白ENT2的抗体。
3E10中干扰其结合DNA能力的突变可能会导致抗体无法穿透核。因此，通常，所公开的抗体变体和人源化形式保持结合核酸(特别是DNA)的能力。此外，3E10 scFv先前已被证明能够以ENT2 依赖性方式穿透活细胞和核，其在ENT2缺陷细胞中的摄取效率受损(Hansen等，J.Biol.Chem.282,20790-20793(2007))。因此，在一些实施方式中，所公开的抗体变体和人源化形式保持以ENT-依赖性，优选ENT2-依赖性方式穿透细胞核的能力。
如在WO 2019/152806和WO 2019/152808中所讨论的，发现一些人源化3E10变体比原始鼠3E10(D31N)di-scFv更有效地穿透细胞核，而发现其他的失去了穿透细胞核的能力。特别是，与鼠抗体相比，变体10和13非常好地穿透细胞核。
已鉴定人源化3E10 VL中潜在的二分核定位信号(NLS)，其可能包括以下部分或全部序列：
RASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY(SEQ ID NO: 88)；
RASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY(SEQ ID NO: 89)；或
RVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKL(SEQ ID NO: 90)。
示例性共有NLS可以是或包括，
(X)RASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL(X)KY(其中(X)＝任何残基，但优选碱性残基(R或K)(SEQ ID NO:91)，或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:53具有至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性。
因此，在一些实施方式中，特别是在核输入很重要的情况下，所公开的抗体可以包含可以易位到细胞核中的SEQ ID NO:88-91的任一序列，或者其片段和变体(例如，与SEQID NO:88-91的任一个具有70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％氨基酸序列同一性)。
NLS的存在表明3E10可能通过核输入途径穿过核被膜。在一些实施方式中，NLS通过与输入途径的一个或多个成员相互作用来改善输入。因此，在一些实施方式中，NLS可以结合至输入蛋白-β、输入蛋白-β/输入蛋白-α异二聚体或其组合。
3.核酸结合
所公开的组合物和方法通常利用保持结合核酸(如DNA、RNA 或其组合)的能力的抗体。
以下实施例说明了3E10和其他3E10变体的分子建模。3E10的分子建模(Pymol)揭示了推定的核酸结合口袋(NAB1)(参见，例如，图14A和图14B)，并且用下面带下划线的序列说明。
WT重链scFv序列
E VQLVESGGGL VKPGGSRKLS CAASGFTFSD YGMHWVRQAP EKGLEWVAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTIS RDNAKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCARRGL LLDYWGQGTT LTVS(SEQ ID NO:92)
轻链scFv序列
D IVLTQSPASL AVSLGQRATI SCRASKSVST SSYSYMHWYQ QKPGQPPKLL IKYASYLESGVPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYY CQHSREFPWT FGGGTKLEIK RADAAPGGGG SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:93)
在一些实施方式中，所公开的抗体包括一些或全部带有下划线的NAB1序列。在一些实施方式中，抗体包括具有改变的结合核酸能力的变体序列。在一些实施方式中，NAB1中的突变(例如，取代、插入和/或缺失)改善了抗体与核酸(如DNA、RNA或其组合)的结合。在一些实施方式中，突变是保守性取代。在一些实施方式中，突变增加NAB1口袋的阳离子电荷。
如本文所讨论和举例说明的，将CDR1的残基31处的天冬氨酸突变为天冬酰胺增加了该残基的阳离子电荷并增强了体内核酸结合和递送(3E10-D31N)。
其他示例性变体包括将CDR1的残基31处的天冬氨酸突变为精氨酸(3E10-D31R)，其建模表明扩大了阳离子电荷，或者赖氨酸 (3E10-D31K)，其建模表明改变了电荷方向。因此，在一些实施方式中，3E10结合蛋白包括D31R或D31K取代。
本文公开的所有具有对应于3E10 D31或N31的残基的序列都明确公开了其中的D31R或D31K或N31R或N31K取代。
3E10的分子建模(Pymol)揭示了推定的核酸结合口袋(NAB1) (图14A-14B)。将CDR1的残基31处的天冬氨酸突变为天冬酰胺增加了该残基的阳离子电荷并增强了体内核酸结合和递送 (3E10-D31N)。
将CDR1的残基31处的天氨酸突变为精氨酸(3E10-D31R)，进一步扩大了阳离子电荷，而突变为赖氨酸(3E10-D31K)改变了电荷方向(图14A)。
从分子建模预测的NAB1氨基酸在上面的重链和轻链序列中已加下划线。图14B是显示3E10-scFv的分子建模(Pymol)的图示，其中NAB1氨基酸残基以点状点图示。
4.片段、变体和融合蛋白
抗DNA抗体可以由抗体片段或融合蛋白构成，该抗体片段或融合蛋白包含可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列，该氨基酸序列与 3E10或其人源化形式的重链和/或轻链(例如，SEQ ID NO:1-11或 46-58中的任一个，或SEQ ID NO:12-14中的任一个的重链和/或轻链)的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。
抗DNA抗体可以由抗体片段或融合蛋白构成，该抗体片段或融合蛋白包含与3E10或其变体或人源化形式的CDR(例如，SEQ ID NO: 1-11或46-58、或SEQ ID NO:12-14或SEQID NO:15-30或42-45 中的任一个的CDR)的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％％、至少95％、至少99％或100％相同的一个或多个CDR。可以通过BLAST蛋白比较来测定两个氨基酸序列的同一性百分比。在一些实施方式中，抗体包含上述优选的可变结构域的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR。
优选地，抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3中的每一个中的一个与轻链CDR1、CDR2和CDR3中的每一个中的一个的组合。
上文提供了3E10的轻链可变序列的预测的互补决定区(CDR)。还参见GenBank:AAA65681.1-免疫球蛋白轻链，部分[小鼠]以及 GenBank：L34051.1-小鼠Ig重排κ链mRNA V区。上文提供了3E10 的重链可变序列的预测的互补决定区(CDR)。参见例如Zack等，Immunology and Cell Biology,72:513-520(1994)，GenBank登录号 AAA65679.1.Zach等，J.Immunol.154(4),1987-1994(1995)以及 GenBank：L16982.1-小鼠Ig重排H链基因，部分cds。
因此，在一些实施方式中，细胞穿透抗体含有SEQ ID NO:1或 2的CDR或整个重链和轻链可变区或SEQ ID NO:12或13的重链区；或与SEQ ID NO:7或8组合的其人源化形式或SEQ ID NO:14的轻链区；或其人源化形式。在一些实施方式中，细胞穿透抗体含有与 SEQID NO:9、10或11组合的SEQ ID NO:3、4、5或6的CDR或整个重链和轻链可变区。在一些实施方式中，细胞穿透肽含有与SEQ ID NO:53-58的任一个组合的SEQ ID NO:46-48或50-52的任一个的CDR或者整个重链和轻链可变区。
本文公开的所有具有对应于3E10 D31或N31的残基的序列都明确公开了其中具有D31R或D31K或N31R或N31K取代。因此，在一些实施方式中，3E10结合蛋白是任何前述或以下序列的变体，其中对应于3E10重链残基31的氨基酸残基被精氨酸(R)或赖氨酸(K) 取代。
还包含具有生物活性的抗体片段。无论是否与其他序列附接，片段都包含特定区或特异性氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定的修饰，条件是片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相比未显著改变或受损。
还可以采用用于产生对本公开的抗原蛋白具有特异性的单链抗体的技术。用于产生单链抗体的方法是本领域技术人员熟知的。可以通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起来创建单链抗体，从而在单个分子上重构抗原结合位点。在未显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下，已经开发出单链抗体可变片段 (scFv)，其中一个可变结构域的C端通过具有15到25个氨基酸的肽或接头与另一个可变结构域的N端栓连。选择接头以允许重链和轻链以其合适的构象定向结合在一起。
可以对抗DNA抗体进行修饰以提高其治疗潜力。例如，在一些实施方式中，将细胞穿透抗DNA抗体与对靶细胞的细胞质和/或细胞核中的第二治疗性靶标具有特异性的另一种抗体缀合。例如，细胞穿透抗DNA抗体可以是含有3E10 Fv和特异性结合第二治疗性靶标的单克隆抗体的单链可变片段的融合蛋白。在其他实施方式中，细胞穿透抗DNA抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体具有来自 3E10的第一重链和第一轻链以及来自特异性结合第二治疗性靶标的单克隆抗体的第二重链和第二轻链。
在Weisbart等，Mol.Cancer Ther.,11(10):2169-73(2012)，和 Weisbart等，Int.J.Oncology,25:1113-8(2004)，以及美国专利申请号2013/0266570中对具有来自3E10的第一重链和第一轻链以及来自特异性结合第二靶标的单克隆抗体的第二重链和第二轻链的双特异性抗体和其他结合蛋白进行了讨论，其全部内容以引用方式具体并入本文。在一些实施方式中，第二靶标对于对于靶细胞类型、组织、器官等是特异性的。因此，第二重链和第二轻链可以用作将复合物靶向至靶细胞类型、组织、器官的靶向部分。在一些实施方式中，第二重链和第二轻链靶向造血干细胞、CD34+细胞、T细胞或任何其他优选的细胞类型，例如，通过靶向在优选的细胞类型上表达的受体或配体。在一些实施方式中，第二重链和第二轻链靶向胸腺、脾脏或癌细胞。
在一些实施方式中，特别是用于体内靶向T细胞的那些，例如，用于CAR T细胞的体内产生，可以靶向免疫细胞或T细胞标志物，如CD3、CD7或CD8。例如，抗CD8抗体和抗CD3 Fab片段均已用于在体内靶向T细胞(Pfeiffer等，EMBO Mol Med.,10(11)(2018).pii:e9158.doi:10.15252/emmm.201809158.，Smith等，Nat Nanotechnol., 12(8):813-820(2017).doi:10.1038/nnano.2017.57)。因此，在一些实施方式中，3E10抗体或抗原结合片段或融合蛋白是双特异性抗体部分，其可以特异性结合CD3、CD7、CD8或另一种免疫细胞(例如， T细胞)标志物，或特定组织如胸腺、脾脏或肝脏的标志物。
二价单链可变片段(二-scFv)可以通过连接两个scFv工程化。这可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单个肽链来完成，从而得到串联scFv。ScFv还可以设计为具有接头肽，该接头肽太短而舍不得两个可变区无法折叠在一起(约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双体抗体。双体抗体已被证明具有比相应 scFv低多至40倍的解离常数，这意味着它们对其靶标具有高得多的亲和力。还更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体(三链抗体或三体抗体)形成。四链抗体也已经产生。其对靶标表现出的亲和力甚至比双体抗体更高。在一些实施方式中，抗DNA抗体可以含有3E10的两个或更多个连接的单链可变片段(例如，3E10二-scFv、 3E10三-scFv)或其保守性变体。在一些实施方式中，抗DNA抗体是双体抗体或三体抗体(例如，3E10双体抗体、3E10三体抗体)。在WO 2017/218825和WO 2016/033321中提供了3E10的单个和两个或更多个连接的单链可变片段的序列。
抗体的功能可以通过将抗体或其片段与治疗剂偶联来增强。抗体或片段与治疗剂的此类偶联可以通过制备免疫缀合物或通过制备融合蛋白或通过将抗体或片段与如DNA或RNA(例如，siRNA)等核酸连接从而包括抗体或抗体片段和治疗剂来实现。
重组融合蛋白是通过融合基因的基因工程产生的蛋白。这通常涉及从编码第一蛋白的cDNA序列中去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR同框附接第二蛋白的cDNA序列。然后DNA序列将被细胞表达为单个蛋白质。可以对蛋白质进行工程化，以使其包含两个原始蛋白质的完整序列或仅其中任一个的一部分。如果两个实体是蛋白质，则通常还会添加接头(或“间隔区”)肽，这使蛋白质更有可能独立折叠并如预期表现。
在一些实施方式中，对细胞穿透抗体进行修饰以改变其半衰期。在一些实施方式中，期望增加抗体的半衰期，使得抗体在循环中或治疗位点处存在更长时间段。例如，可以期望在循环中或待治疗位置处维持抗体的滴度延长的时间段。在其他实施方式中，减小抗DNA 抗体的半衰期以减少潜在的副作用。抗体片段(如3E10Fv)的半衰期可能比全尺寸抗体的半衰期短。改变半衰期的其他方法是已知的，并且可以在所描述的方法中使用。例如，抗体可以被工程化为具有延长半衰期的Fc变体，例如使用XtendTM抗体半衰期延长技术(Xencor,Monrovia,CA)。
a.接头
如本文所使用的，术语“接头”包含但不限于肽接头。肽接头可以是任何大小，只要其不干扰通过可变区与表位的结合即可。在一些实施方式中，接头包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸残基。单价单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端通常通过15到25个氨基酸肽或接头与另一个可变结构域的N端栓连。选择接头以允许重链和轻链以其合适的构象定向结合在一起。如上所述，双体抗体、三体抗体等中的接头通常包含比单价scFv的接头短的接头。二价、三价和其它多价scFv通常包含三个或更多个接头。接头的长度和/或氨基酸组成可以相同或不同。因此，如本领域中已知的，可以基于scFv的期望价位来测定接头的数量、接头的组成和接头的长度。接头可以允许或驱动二价、三价和其他多价scFv 的形成。
例如，接头可以包含4-8个氨基酸。在特定实施方式中，接头包含氨基酸序列GQSSRSS(SEQ ID NO:31)。在另一个实施方式中，接头包含15-20个氨基酸，例如18个氨基酸。在特定实施方式中，接头包含氨基酸序列GQSSRSSSGGGSSGGGGS(SEQ ID NO:32)。其他柔性接头包括但不限于氨基酸序列Gly-Ser、Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO:33)、Ala-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:34)、 (Gly4-Ser)2(SEQ ID NO:35)和(Gly4-Ser)4(SEQ IDNO:36)以及(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:37)。
其他示例性接头包括，例如，
RADAAPGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:59)和
ASTKGPSVFPLAPLESSGS(SEQ ID NO:60)。
b.示例性抗DNA scFv序列
在WO 2016/033321、WO 2017/218825、WO 2019/018426和 WO/2019/018428中公开并在下文提供了示例性鼠3E10 scFv序列，包含单-、二-和三-scFv。用于所公开的组合物和方法中的细胞穿透抗体包含示例性scFv及其片段和变体。
scFv 3E10(D31N)的氨基酸序列是：
AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQP PKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREF PWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGS RKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRF TISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQ KLISEEDLNSAVDHHHHHH
(SEQ ID NO:38)。
参考SEQ ID NO:38注释scFv蛋白结构域
·AGIH序列增加溶解度(SEQ ID NO:38的氨基酸1-4)
·Vk可变区(SEQ ID NO:38的氨基酸5-115)
·轻链CH1的初始(6aa)(SEQ ID NO:38的氨基酸116-121)
·(GGGGS)3(SEQ ID NO:37)接头(SEQ ID NO:38的氨基酸 122-136)
·VH可变区(SEQ ID NO:38的氨基酸137-252)
·Myc标签(SEQ ID NO:38的氨基酸253-268)
·His 6标签(SEQ ID NO:38的氨基酸269-274)
3E10 di-scFv(D31N)的氨基酸序列
Di-scFv 3E10(D31N)是双单链可变片段，该双单链可变片段包含2X的3E10重链和轻链可变区，并且其中重链的位置31处的天冬氨酸突变为天冬酰胺。Di-scFv 3E10(D31N)的氨基酸序列为：
AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQP PKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREF PWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGS RKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRF TISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSAST KGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYS YMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEED AATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSS TIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
(SEQ ID NO:39)。
参考SEQ ID NO:39注释di-scFv蛋白结构域
·AGIH序列增加溶解度(SEQ ID NO:39的氨基酸1-4)
·Vk可变区(SEQ ID NO:39的氨基酸5-115)
·轻链CH1的初始(6aa)(SEQ ID NO:39的氨基酸116-121)
·(GGGGS)3(SEQ ID NO:37)接头(SEQ ID NO:39的氨基酸 122-136)
·VH可变区(SEQ ID NO:39的氨基酸137-252)
·由人IgG CH1初始13个氨基酸组成的Fv片段之间的接头(SEQ ID NO:39的氨基酸253-265)
·旋转序列(SEQ ID NO:39的氨基酸266-271)
·Vk可变区(SEQ ID NO:39的氨基酸272-382)
·轻链CH1的初始(6aa)(SEQ ID NO:39的氨基酸383-388)
·(GGGGS)3(SEQ ID NO:37)接头(SEQ ID NO:39的氨基酸 389-403)
·VH可变区(SEQ ID NO:39的氨基酸404-519)
·Myc标签(SEQ ID NO:39的氨基酸520-535)
·His 6标签(SEQ ID NO:39的氨基酸536-541)
tri-scFv的氨基酸序列
Tri-scFv 3E10(D31N)是三单链可变片段，该三单链可变片段包含3X的310E重链和轻链可变区，并且其中重链的位置31处的天冬氨酸突变为天冬酰胺。Tri-scFv 3E10(D31N)的氨基酸序列为：
AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQP PKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREF PWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGS RKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRF TISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSAST KGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYS YMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEED AATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSS TIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWG QGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTD FTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKG LEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYY CARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
(SEQ ID NO:40)。
参考SEQ ID NO:40注释tri-scFv蛋白结构域
·AGIH序列增加溶解度(SEQ ID NO:40的氨基酸1-4)
·Vk可变区(SEQ ID NO:40的氨基酸5-115)
·轻链CH1的初始(6aa)(SEQ ID NO:40的氨基酸116-121)
·(GGGGS)3(SEQ ID NO:37)接头(SEQ ID NO:40的氨基酸 122-136)
·VH可变区(SEQ ID NO:40的氨基酸137-252)
·由人IgG CH1初始13个氨基酸组成的Fv片段之间的接头 (SEQ ID NO:40的氨基酸253-265)
·旋转序列(SEQ ID NO:40的氨基酸266-271)
·Vk可变区(SEQ ID NO:40的氨基酸272-382)
·轻链CH1的初始(6aa)(SEQ ID NO:40的氨基酸383-388)
·(GGGGS)3(SEQ ID NO:37)接头(SEQ ID NO:40的氨基酸 389-403)
·VH可变区(SEQ ID NO:40的氨基酸404-519)
·由人IgG CH1初始13个氨基酸组成的Fv片段之间的接头 (SEQ ID NO:40的氨基酸520-532)
·旋转序列(SEQ ID NO:40的氨基酸533-538)
·Vk可变区(SEQ ID NO:40的氨基酸539-649)
·轻链CH1的初始(6aa)(SEQ ID NO:40的氨基酸650-655)
·(GGGGS)3(SEQ ID NO:37)接头(SEQ ID NO:40的氨基酸 656-670)
·VH可变区(SEQ ID NO:40的氨基酸671-786)
·Myc标签(SEQ ID NO:40的氨基酸787-802)
·His 6标签(SEQ ID NO:40的氨基酸803-808)
WO 2016/033321和Noble等，Cancer Research,75(11):2285-2291 (2015)显示与其单价对应物相比，di-scFv和tri-scFv具有一些改善的和另外的活性。上文还提供了与示例性融合蛋白中的每个示例性融合蛋白的不同结构域相对应的子序列。本领域技术人员应当理解，示例性融合蛋白或其结构域可以用于构建上文更详细讨论的融合蛋白。例如，在一些实施方式中，di-scFv包含第一scFv，该第一scFv 包含Vk可变区(例如，SEQ ID NO:39的氨基酸5-115或其功能变体或片段)，该Vk可变区连接于VH可变结构域(例如，SEQ ID NO:39的氨基酸137-252或其功能变体或片段)、其连接于包含Vk可变区(例如，SEQ ID NO:39的氨基酸272-382或其功能变体或片段) 的第二scFv、其连接于VH可变结构域(例如，SEQ IDNO:39的氨基酸404-519或其功能变体或片段)。在一些实施方式中，tri-scFv 包含与第三scFv结构域连接的di-scFv，该第三scFv结构域包含与 VH可变结构域(例如，SEQ ID NO:40的氨基酸671-786或其功能变体或片段)连接的Vk可变区(例如，SEQ ID NO:40的氨基酸539-649或其功能变体或片段)。
Vk可变区可以单独地或与轻链CH1的(6aa)(SEQ ID NO:39 的氨基酸116-121)组合通过例如接头(例如，(GGGGS)3(SEQ ID NO: 37))与VH可变结构域连接。上文讨论了其他合适的接头，并且其是本领域已知的。scFv可以单独地或与旋转序列(例如，SEQ ID NO: 39的氨基酸266-271)组合通过接头(例如，SEQ ID NO:39的人IgG CH1初始13个氨基酸(253-265))连接。上文讨论了其他合适的接头，并且其是本领域已知的。
因此，di-scFv可以包含SEQ ID NO:39的氨基酸5-519。tri-scFv 可以包含SEQ IDNO:40的氨基酸5-786。在一些实施方式中，融合蛋白包含另外的结构域。例如，在一些实施方式中，融合蛋白包含增强溶解度的序列(例如，SEQ ID NO:39的氨基酸1-4)。因此，在一些实施方式中，di-scFv可以包含SEQ ID NO:39的氨基酸1-519。tri-scFv可以包含SEQ IDNO:40的氨基酸1-786。在一些实施方式中，融合蛋白包含增强融合蛋白的纯化、分离、捕获、鉴定、分离等的一个或多个结构域。示例性结构域包含例如Myc标签(例如， SEQ ID NO:39的氨基酸520-535)和/或His标签(SEQ ID NO:39 的氨基酸536-541)。因此，在一些实施方式中，di-scFv可以包含 SEQ ID NO:39的氨基酸序列。tri-scFv可以包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。上文更详细地讨论了其他可取代的结构域和另外的结构域。
在WO 2016/033324中讨论了示例性3E10人源化Fv序列：
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IYYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGF TFSNYGMHWVRQAPGKGLEYVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNT LYLQMSSLRAEDTAVYYCVKRGLLLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:41)。
在WO 2019/018426和WO/2019/018428中讨论了示例性3E10 人源化di-scFv序列，并且包括：
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATY YCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体2，SEQ ID NO:61)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATY YCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体3，SEQ ID NO:62)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATY YCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体4，SEQ ID NO:63)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体6，SEQ ID NO:64)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体7，SEQ ID NO:65)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS（变体8，SEQ ID NO:66），
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS（变体10，SEQ ID NO:67），
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS（变体11，SEQ ID NO:68），
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHW YQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体12，SEQ ID NO:69)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLI KYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGG GTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLA PLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPG QPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSRE FPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGS LRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS(变体 13，SEQ ID NO:70)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHW YQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATY YCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体14，SEQ ID NO:71)，
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHW YQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATY YCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体15，SEQ ID NO:72)，
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHW YQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体16，SEQ ID NO:73)，
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHW YQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体17，SEQ ID NO:74)，
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHW YQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体18，SEQ ID NO:75)，和
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTF GQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHW YQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTT VTVSS(变体19，SEQ ID NO:76)。
c.其他序列
可用于构建抗DNA抗原结合蛋白、抗体、片段和融合蛋白的其他序列包括但不限于，
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1 L2345A/L235A重链全长序列，SEQ ID NO:77)，
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(IgG1 重链恒定区1，SEQ ID NO:78)，
EPKSCDKTHTCP(IgG1铰链区，SEQ ID NO:79)， PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(IgG1 L2345A/L235A重链恒定区2，SEQ ID NO:80)， GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK(IgG1重链恒定区3，SEQ ID NO:81)，
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1 N297D重链全长序列，SEQ ID NO:82)，
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAK(IgG1 N297D重链恒定区2，SEQ IDNO:83)，
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLL LDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1 L2345A/L235A/N297D重链全长序列，SEQ ID NO:84)，
PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAK(IgG1 L2345A/L235A/N297D重链恒定区2，SEQ ID NO:85)，
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAK(SEQ ID NO:86，未修饰的重链恒定区2)，和 DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL IKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTF GGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(轻链全长序列，SEQ ID NO:87)。
B.货物
如在本文提供的方法中使用的，3E10通常与核酸货物复合而与细胞接触。抗体或结合蛋白与核酸货物之间的相互作用是非共价的。
核酸货物可以是单链或双链的。核酸货物可以是或包括DNA、 RNA、核酸类似物或其组合。如下文更详细讨论的，核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架处修饰的。此类修饰可以改善例如核酸的稳定性、杂交或溶解度。
核酸货物通常是在一旦递送到细胞中就具有生物活性的物质或者编码这种物质的意义上是有功能的。示例性货物在下文更详细讨论，但包括，例如，编码目标多肽(包括例如表达构建体和载体) 的mRNA或DNA，抑制性核酸如siRNA，或编码抑制性核酸(包括例如表达构建体和载体)的核酸。
所公开的组合物可以包含多个单一核酸货物分子。在一些实施方式中，组合物包含多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)不同的核酸分子。
在一些实施方式中，货物分子的长度是0.001、0.01、1、数十、数百、数千、数万和/或数十万个千碱基。
在一些实施方式中，例如，货物可以是在0.001kb和100kb之间、或0.001kb和50kb之间、或0.001kb和25kb之间、或0.001kb 和12.5kb之间、或0.001kb和10kb之间、或0.001kb和8kb、或 0.001kb和5kb之间、或0.001kb和2.5kb之间、或0.001kb和1kb 之间、或0.01kb和100kb之间、或0.01kb和50kb之间、或0.01kb 和25kb之间、或0.01kb和12.5kb之间、或0.01kb和10kb之间、或0.01kb和8kb之间、或0.01kb和5kb之间、或0.01kb和2.5kb 之间、或0.01kb和1kb之间、或0.1kb和100kb之间、或0.1kb 和50kb之间、或0.1kb和25kb之间、或0.1kb和12.5kb之间、或0.1kb和10kb之间、或0.1kb和8kb之间、或0.1kb和5kb之间、或0.1kb和2.5kb之间、或0.1kb和1kb之间、或1kb和100kb 之间、或1kb和50kb之间、或1kb和25kb之间、或1kb和12.5kb 之间、或1kb和10kb之间、或1kb和8kb之间、或1kb和5kb 之间、或1kb和2.5kb之间(各自包含)。
在一些实施方式中，例如，货物可以是在0.2kb和10kb之间、或0.2kb和5kb之间、或0.2kb和2.5kb之间、或0.2kb和1kb之间、或0.2kb和0.5kb之间、或0.2kb和0.25kb之间、或0.5kb和 10kb之间、或0.5kb和5kb之间、或1kb和5kb之间、或1kb和 3kb之间、或2kb和10kb之间、或3kb和5kb之间。
将意识到的是，对于特定应用，核酸货物可以是一个或多个离散长度，例如，落入上述范围(含端点)之一内，针对每个的具体值都被明确公开。例如，尺寸可以小到单个核苷酸或核碱基。在示例性应用中，货物是环状二核苷酸，如cGAMP，其是STING激动剂。在其他实施方式中，货物是短寡聚物。例如，可以将短至8-mer 的寡聚物用于反义或剪接转换。稍长的(例如，18至20mer)可用于基因编辑。
1.货物的形式
核酸货物是核酸，并且可以是分离的核酸组合物。如本文所用，“分离的核酸”指与哺乳动物基因组中存在的其他核酸分子分离的核酸，包括在哺乳动物基因组中通常位于核酸一侧或两侧的核酸。如本文所用，关于核酸的术语“分离的”还包括与任何非天然存在的核酸序列的组合，因此这类非天然存在的序列在自然界中不存在，并且在天然存在的基因组中没有紧邻连续的序列。
分离的核酸可以是例如DNA分子，只要在天然存在的基因组中通常发现紧邻该DNA分子两侧的核酸序列之一被去除或缺失即可。因此，分离的核酸包括但不限于作为独立于其他序列的单独分子存在的DNA分子(例如，化学合成的核酸，或者通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及整合到载体、自主复制质粒、病毒(例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可以包括工程化的核酸，如作为杂合或融合核酸的部分的重组DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库或包含基因组DNA限制性消化的凝胶切片中的数百至数百万其他核酸中的核酸不应被视为分离的核酸。
编码多肽的核酸序列包括基因组序列。还提供了其中已将外显子删除的mRNA/cDNA序列。还公开了编码多肽的其他核酸序列，如包含上文鉴定的氨基酸序列及其片段和变体的多肽。可以对编码多肽的核酸进行优化以在选择的表达宿主中表达。密码子可以用编码相同氨基酸的可选密码子替代，以说明核酸序列来源的生物体和表达宿主之间密码子使用的差异。以这种方式，可以使用表达宿主偏好的密码子来合成核酸。
核酸可以是有义或反义定向，或者可以例如与编码多肽的参考序列互补。
a.载体
货物可以是载体，例如编码多肽和/或功能性核酸的载体。可以将核酸，如上文所述的那些，插入载体中以在细胞中表达。如本文所用，“载体”是复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，其中可以插入另一DNA区段以引起插入区段的复制。载体可以是表达载体。“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体，并且“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA 序列。
载体中的核酸可以与一个或多个表达控制序列可操作地连接。例如，可以将控制序列引入基因构建体中，从而表达控制序列有效地控制目标编码序列的表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由DNA分子区构成的表达控制序列，通常位于转录起始点上游100个核苷酸内(通常靠近RNA聚合酶II 的起始位点)。为了将编码序列置于启动子的控制之下，必须将多肽翻译阅读框架的翻译起始位点定位在启动子下游1至约50个核苷酸之间。增强子在时间、位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同，增强子可以在距转录位点的各种不同距离处发挥作用。增强子还可以位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录为mRNA时，编码序列在细胞中与表达控制序列“可操作地连接”和“受其控制”，然后mRNA可以翻译成由编码序列编码的蛋白。
适宜的表达载体包括但不限于来源于例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相关病毒的质粒、粘粒和病毒载体。很多载体和表达系统可以从诸如Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)和Invitrogen Life Technologies(Carlsbad, CA)的公司购得。
在一些实施方式中，将货物递送至细胞中并保持在染色体外。在一些实施方式中，将货物引入宿主细胞中并整合到宿主细胞的基因组中。如以下更详细讨论的，组合物可用于基因治疗方法。基因治疗的方法可以包括将改变细胞基因型的多核苷酸引入细胞中。多核苷酸的引入可以通过基因重组校正、替代或以其他方式改变内源性基因。方法可以包括引入缺陷基因、异源基因或小核酸分子如寡核苷酸的完整替代拷贝。例如，可以将校正基因引入宿主基因组内的非特定位置中。
在一些实施方式中，货物是载体。构建包含遗传序列和适当的转录和翻译控制元件的表达载体的方法是本领域众所周知的。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。表达载体通常含有调控序列和插入的编码序列(例如，其可以是目标多核苷酸)的翻译和/或转录所必需的元件。编码序列可以与启动子和/或增强子可操作地连接，以帮助控制所需基因产物的表达。根据基因表达控制的预期类型，生物技术中使用的启动子具有不同的类型。其通常可分为组成型启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子和合成启动子。
例如，在一些实施方式中，目标多核苷酸与本领域公知的启动子或其他调控元件可操作地连接。因此，货物可以是载体，如表达载体。用于在原核或真核系统中表达的多核苷酸的工程化可以通过重组表达技术人员通常公知的技术进行。表达载体通常包括在一个或多个启动子控制下的公开的组合物之一。为了将编码序列置于启动子的“控制下”，通常将阅读框的翻译起始位点的5’末端定位在所选启动子“下游”(即，3’)的约1至50个核苷酸之间。“上游”启动子刺激插入的DNA的转录并促进编码的重组蛋白或功能性核酸的表达。这就是此处使用的上下文中“重组表达”的含义。
很多标准技术可用于构建包含适当核酸和转录/翻译控制序列的表达载体，以便在各种宿主表达系统中实现蛋白或肽或功能性核酸表达。
用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括复制起点(根据需要)、位于待表达基因前面的启动子，以及任何必要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。复制起点可以通过构建载体以包含外源起点来提供，如可以来源于SV40或其他病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)来源，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合到宿主细胞染色体中，则后者通常就足够了。
启动子可以来自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒 7.5K启动子)。此外，还可能并且可能需要利用通常与所需基因序列相关的启动子或控制序列，只要此类控制序列与宿主细胞系统相容。
可以使用多种基于病毒的表达系统，例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40(SV40)。SV40 病毒的早期和晚期启动子是有用的，因为其都可以很容易地从病毒中作为片段获得，该片段还包含SV40病毒复制起点。也可以使用更小或更大的SV40片段，条件是包含从HindIII位点向位于病毒复制起点的BglI位点延伸的大约250bp序列。
在腺病毒用作表达载体的情况下，编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区域)将产生一种重组病毒，该病毒是存活的并且能够在受感染的宿主中表达蛋白质。
对于所公开的组合物的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。可能还需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这种需要并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同框(或同相)以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，包括天然的和合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件或转录终止子来提高表达效率。
在真核表达中，如果原始克隆片段中不包含适当的多聚腺苷酸化位点，通常还希望将适当的多聚腺苷酸化位点引入转录单元中。通常，聚A添加位点位于蛋白终止位点“下游”约30至2000个核苷酸处，位于转录终止之前的位置。
对于重组蛋白的长期、高产率生产，优选稳定表达。例如可以工程化稳定表达编码蛋白的构建体的细胞系。不是使用包含病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和选择标记控制的载体转化。在引入外源DNA后，工程化细胞可以允许在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长形成集落，然后可以将其克隆并扩增成细胞系。
b.mRNA
货物可以是mRNA。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。例如，RNA可以具有5’和3’UTR。例如，3’UTR的长度可以超过 100个核苷酸。在一些实施方式中，3’UTR序列是100至5000个核苷酸之间。在一些实施方式中，5’UTR长度在0至3000个核苷酸之间。可以通过不同的方法改变要添加到编码区的5’和3’UTR序列的长度，包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的用于PCR的引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以修改在递送转录的RNA后实现最佳翻译效率所需的5’和3’UTR长度。
5’和3’UTR可以是目标基因的天然存在的内源性5’和3’UTR。或者，可以通过将UTR序列整合到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加对目标基因不是内源的UTR序列。使用对目标基因非内源的UTR序列可能可用于改进RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，可以根据本领域熟知的UTR的特性选择或设计3’UTR，以增加转录RNA的稳定性。
在一些实施方式中，5’UTR包含内源基因的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加对目标基因而言不是内源的5’UTR时，可以通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并非对于所有RNA 都需要其来实现高效翻译。很多mRNA对Kozak序列的要求是本领域公知的。在其他实施方式中，5’UTR可以来源于RNA病毒，其 RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物可用于3’或5’UTR以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
在一些实施方式中，mRNA在5’端具有帽、3’聚(A)尾或其组合，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。
5’帽提供了RNA分子的稳定性。5'帽例如可以是 m7G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')A、G(5')ppp(5')G或G(5')ppp(5')A帽类似物，这些都是市售可得的。5’帽也可以是抗反向帽类似物 (ARCA)(Stepinski等，RNA,7:1468-95(2001))或任何其他适宜类似物。可以使用本领域公知的技术引入5’帽(Cougot等，Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等，RNA,7:1468-95 (2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966 (2005))。
RNA还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其启动不依赖帽的核糖体与mRNA结合并促进翻译的启动。
通常，poly(A)尾的长度与转录RNA的稳定性正相关。在一个实施方式中，poly(A)尾在100至5000个腺苷之间。
可以在PCR期间通过使用含有polyT尾的反向引物，如100T 尾(尺寸可以是，例如，50-5000T)，或在PCR之后通过任何其他方法产生polyA区段，包括但不限于，DNA连接或体外重组。Poly(A) 尾还为RNA提供稳定性并减少其降解。RNA的Poly(A)尾可以在体外转录后使用poly(A)聚合酶，如E.coli polyA聚合酶(E-PAP)另外或替代地进行延伸。
此外，将不同化学基团附接到3’端可以增加mRNA稳定性。此类附接可以包含修饰/人工核苷酸、适体和其他化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物引入poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。适宜的ATP类似物包括但不限于虫草素和8-氮杂腺苷。
2.货物的序列
a.目标多肽
货物可以编码一种或多种蛋白。货物可以是可为单顺反子或多顺反子的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸是多基因的。多核苷酸可以是例如mRNA或表达构建体，如载体。
货物可以编码一种或多种目标多肽。多肽可以是任何多肽。例如，由多核苷酸编码的多肽可以是对生物体提供治疗或预防作用或可用于诊断生物体中的疾病或病症的多肽。例如，为治疗癌症、自身免疫性疾病、寄生虫、病毒、细菌、真菌或其他感染，待表达的多核苷酸可编码多肽，所述多肽可作为免疫系统细胞的配体或受体，或可用于刺激或抑制生物体的免疫系统。
在一些实施方式中，多核苷酸补充或替代生物体内有缺陷的多核苷酸。
在特定实施方式中，多核苷酸编码肌营养不良蛋白(dystrophin)、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)或其组合。此类组合物可以有效量施用以治疗患有营养不良(特别是，肌营养不良，例如，杜兴氏肌营养不良)的受试者。
在另一个特定实施方式中，多核苷酸编码抗原，例如，可用于疫苗制剂和相关方法的抗原。在一个特定实施方式中，多核苷酸编码病毒抗原，例如，SARS-CoV-2抗原。因此，提供了用于预防和治疗SARS-CoV-2病毒和病毒感染以及与此相关的疾病(包括 COVID19)的组合物及其使用方法。
在一些实施方式中，多核苷酸包含选择标记，例如，在真核细胞中有效的选择标记，如药物抗性选择标记。这种选择标记基因可以编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或生长所必需的因子。典型的选择基因编码赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤、卡那霉素、庆大霉素、博莱霉素(Zeocin) 或四环素)抗性的蛋白，补充营养缺陷或提供培养基中截留的关键营养素。
在一些实施方式中，多核苷酸包含报告基因。报告基因通常是在宿主细胞中不存在或者不表达的基因。报告基因通常编码提供某些表型变化或酶特性的蛋白。此类基因的实例提供在Weising等， Ann.Rev.Genetics,22,421(1988)中。优选的报告基因包括葡萄糖醛酸酶(GUS)基因和GFP基因。
b.功能性核酸
货物可以是或编码功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，如结合靶分子或催化特定反应。如下文更详细讨论的，功能性核酸分子可以分为以下非限制性类别：反义分子、siRNA、 miRNA、适体、核酶、RNAi和外部指导序列，以及环状二核苷酸。功能性核酸分子可以充当靶分子所具有的特定活性的效应物、抑制剂、调节剂和刺激物，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其他分子的从头活性。
功能性核酸分子可以与任何大分子如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链相互作用。因此，功能性核酸可以与靶多肽的mRNA或基因组DNA相互作用，或者其可以与多肽本身相互作用。通常，将功能性核酸设计为基于靶分子和功能性核酸分子之间的序列同源性与其他核酸相互作用。在其他情况下，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许特异性识别发生的三级结构的形成。
因此，组合物可以包含一种或多种设计用于降低基因或其基因产物表达的功能性核酸。例如，可以设计功能性核酸或多肽以靶向并减少或抑制mRNA的表达或翻译；或减少或抑制蛋白质的表达、降低活性或增加蛋白质的降解。在一些实施方式中，组合物包含适于体内表达功能性核酸的载体。
i.反义
功能性核酸可以是或编码反义分子。将反义分子设计成通过标准或非标准碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用设计为通过例如RNA酶H介导的RNA-DNA杂合体降解促进靶分子的破坏。或者，将反义分子设计为中断通常发生在靶分子上的加工功能，如转录或复制。可以根据靶分子的序列设计反义分子。有很多可以通过寻找靶分子最容易接近的区域来优化反义效率的方法。示例性方法包括体外选择实验以及使用DMS和DEPC的 DNA修饰研究。优选的是，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶分子。
ii.RNA干扰
在一些实施方式中，功能性核酸通过RNA干扰诱导基因沉默。基因表达也可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异性的方式有效沉默。这种沉默最初是在添加双链RNA(dsRNA)时观察到的(Fire 等，(1998)Nature,391:806-11；Napoli等，(1990)Plant Cell 2:279-89；Hannon,(2002)Nature,418:244-51)。一旦dsRNA进入细胞，其被 RNA酶III样酶Dicer切割成双链小干扰RNA(siRNA)，长度为 21-23个核苷酸，在3’末端包含2个核苷酸的突出端(Elbashir等， (2001)Genes Dev.,15:188-200；Bernstein等，(2001)Nature, 409:363-6；Hammond等，(2000)Nature,404:293-6)。在ATP依赖性的步骤中，siRNA变成整合到多亚基蛋白复合物中，通常称为RNAi 诱导沉默复合物(RISC)，该复合物将siRNA指导至靶RNA序列(Nykanen等，(2001)Cell,107:309-21)。在一些时候，siRNA双链体解开，且反义链似乎仍然与RISC结合，并通过内切酶和外切酶的组合指导互补mRNA序列的降解(Martinez等，(2002)Cell, 110:563-74)。然而，iRNA或siRNA的作用或其用途不限于任何类型的机制。
短干扰RNA(siRNA)是一种双链RNA，其可诱导序列特异性的转录后基因沉默，从而降低或甚至抑制基因表达。在一个实例中， siRNA触发在siRNA和靶RNA之间的序列同一性区域内的同源 RNA分子(如mRNA)的特异性降解。例如，WO 02/44321公开了当与3’突出端碱基配对时能够序列特异性降解靶mRNA的siRNA，其通过引用并入本文以用于这些siRNA的制备方法。
序列特异性基因沉默可以使用合成短双链RNA在哺乳动物中实现，所述合成短双链RNA模拟通过酶dicer产生的siRNA(Elbashir 等，(2001)Nature,411:494 498)(Ui-Tei等，(2000)FEBS Lett 479:79-82)。siRNA可以是化学合成的或体外合成的，或可以是在细胞内加工成siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)的结果。合成 siRNA通常使用算法和传统的DNA/RNA合成仪进行设计。供应商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、 Dharmacon(Lafayette,Colorado)、Glen Research(Sterling,Virginia)、 MWB Biotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colorado) 和Qiagen(Vento,The Netherlands)。也可以使用如Ambion的
Figure BDA0003624229800000481
siRNA构建试剂盒等的试剂盒在体外合成siRNA。
从载体产生siRNA更常见的是通过短发夹RNA酶(shRNA)的转录来完成。用于产生具有shRNA的载体的试剂盒是可获得的，比如，例如，Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen 的BLOCK-ITTM可诱导RNAi质粒和慢病毒载体。
在一些实施方式中，功能性核酸是siRNA、shRNA、miRNA。在一些实施方式中，组合物包含表达功能性核酸的载体。
iii.适体
功能性核酸可以是或编码适体。适体是与靶分子相互作用的分子，优选以特异性方式相互作用。通常，适体是长度范围为15-50 个碱基的小核酸，其折叠成确定的二级和三级结构，如茎环或G-四联体。适体可以结合小分子，如ATP和茶碱，以及大分子，如逆转录酶和凝血酶。适体可以小于10-12M的Kd与靶分子紧密结合。优选的是，适体以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。适体可以以非常高的特异性水平结合靶分子。例如，已经分离出在靶分子和仅在分子上的一个位置上不同的另一个分子之间的结合亲和性差异大于10,000倍的适体。优选的是，适体与靶分子的Kd比与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。当对分子如多肽进行比较时，优选的是背景分子是不同的多肽。
iv.核酶
功能性核酸可以是或编码核酶。核酶是能够在分子内或分子间催化化学反应的核酸分子。优选的是，核酶催化分子间反应。有很多不同类型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶类型的反应，这些反应基于天然系统中发现的核酶，如锤头状核酶。还有许多在自然系统中不存在的核酶，而是其工程化以从头催化特定反应。优选的核酶切割RNA或DNA底物，更优选切割RNA底物。核酶通常通过靶底物的识别和结合以及随后的切割来切割核酸底物。这种识别通常主要基于标准或非标准碱基对相互作用。这种性质使得核酶成为核酸的靶特异性切割的特别好的候选物，因为靶底物的识别是基于靶底物序列的。
v.外部指导序列
功能性核酸可以是或编码外部指导序列。外部指导序列(EGS) 是与靶核酸分子结合形成复合物的分子，该复合物被RNA酶P识别，然后切割靶分子。EGS可以设计特异性靶向所选的RNA分子。 RNA酶P有助于加工细胞内的转移RNA(tRNA)。通过使用EGS，可以募集细菌RNA酶P以切割几乎任何RNA序列，该EGS导致靶 RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物。类似地，真核EGS/RNA酶P 指导的RNA切割可用于切割真核细胞内的所需靶点。如何制备和使用EGS分子以促进多种不同靶分子的切割的代表性实例是本领域公知的。
制备和使用用于体内表达功能性核酸如反义寡核苷酸、siRNA、 shRNA、miRNA、EGS、核酶和适体的载体的方法是本领域公知的。
vi.环状二核苷酸
功能性核酸可以是或编码环状二核苷酸。环状二核苷酸直接与 STING衔接子蛋白结合，导致产生IFN-β(Zhang等，Mol Cell., 51(2):226-35(2013).doi:10.1016/j.molcel.2013.05.022.)。几种标准和非标准二核苷酸是本领域公知的，包括但不限于2'3'-cGAMP、 2'3'-cGAMP、3'3'-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、cAIMP(CL592)、二氟cAIMP(CL614)、二氟cAIM(PS)2(Rp/Sp)(CL656)、 2’2’-cGAMP、2’3’-cGAM(PS)2(Rp/Sp)、氟化3'3'-cGAMP、氟化 c-di-AMP、2'3'-c-di-AMP、2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)、 2'3'-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)、氟化c-di-GMP、2’3’-c-di-GMP、c-di-IMP、 DMXAA。
vii.免疫刺激性寡核苷酸
在一些实施方式中，功能性核酸可以是或编码寡核苷酸配体。实例包括但不限于模式识别受体(PRR)配体。
PRR的实例包括Toll样信号分子家族，其在先天免疫应答的启动中发挥作用，并且还影响后期和更多的抗原特异性适应性免疫应答。因此，寡核苷酸可以作为Toll样家族信号分子的配体，如Toll 样受体(TLR9)。
例如，通过人类浆细胞样树突状细胞和B细胞上的TLR9可检测到未甲基化的CpG位点(Zaida等，Infection and Immunity, 76(5):2123-2129,(2008))。因此，寡核苷酸的序列可以包含一个或多个未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤(CG或CpG，可互换使用)二核苷酸基序。“p”指DNA的磷酸二酯骨架，然而，在一些实施方式中，包含CG的寡核苷酸可以具有修饰的骨架，例如硫代磷酸酯(PS) 骨架。
在一些实施方式中，寡核苷酸可以含有一个以上CG二核苷酸，这些CG二核苷酸连续排列或由插入的核苷酸隔开。CpG基序可以在寡核苷酸序列的内部。很多核苷酸序列通过CG二核苷酸的数量和位置以及CG二聚体翼侧的精确碱基序列的变化来刺激TLR9。
通常，CG ODN根据其序列、二级结构和对人外周血单核细胞(PBMC)的影响进行分类。五类为A类(D型)、B类(K型)、 C类、P类和S类(Vollmer,J&Krieg,AM,Advanced drugdelivery reviews 61(3):195–204(2009)，通过引用并入本文)。CG ODN可以刺激I型干扰素(例如，IFNα)产生并诱导树突状细胞(DC)的成熟。一些种类的ODN也是通过间接细胞因子信号转导的自然杀伤 (NK)细胞的强激活剂。一些种类是人B细胞和单核细胞成熟的强刺激剂(Weiner,GL,PNAS USA 94(20):10833-7(1997)；Dalpke,AH, Immunology 106(1):102-12(2002)；Hartmann,G,J of Immun. 164(3):1617-2(2000)，其每一个通过引用并入本文)。
其他PRR Toll样受体包括TLR3和TLR7，其可以分别识别双链 RNA、单链和短双链RNA，以及视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体，即RIG-I和黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)，其中最有名的是细胞溶质中的RNA感应受体。
RIG-I(视黄酸诱导蛋白1，也称为Ddx58)和MDA-5(黑色素瘤分化相关基因5，也称为Ifih1或Helicard)是属于RIG-I样受体 (RLR)家族的胞质RNA解旋酶，其对宿主抗病毒应答至关重要。
RIG-I和MDA-5感知双链RNA(dsRNA)，一种RNA病毒的复制中间体，并通过线粒体抗病毒信号转导蛋白MAVS(也称为 IPS-1、VISA或Cardif)发出信号，从而产生I型干扰素(IFN-α和 IFN-β)。
RIG-I检测呈现出不加帽的5’-二/三磷酸末端和短的平端双链部分的病毒RNA，这两个基本特征有助于与自身RNA相区分。MDA-5 生理配体的特征尚未完全表征。然而，众所周知，RIG-I和MDA-5 对dsRNA的长度表现出不同的依赖性：RIG-I选择性结合短dsRNA，而MDA-5选择性结合长dsRNA。与此一致，RIG-I和MDA-5以不同长度偏好结合Poly(I:C)，一种合成的dsRNA类似物。
在一些情况下，RIG-I也可以间接感知dsDNA。病毒dsDNA可以通过RNA聚合酶III转录成具有5’-三磷酸部分的dsRNA。因此 Poly(dA:dT)，一种B型DNA的合成类似物，构成了另一种RIG-I 配体。
示例性RIG-I配体包括但不限于5'ppp-dsRNA，一种RIG-I的特异性激动剂；3p-hpRNA，一种RIG-I的特异性激动剂；根据poly(I:C) 尺寸由RIG-I和/或MDA-5识别的Poly(I:C)/LyoVec复合物；由RIG-I 间接识别的Poly(dA:dT)/LyoVec复合物。
在一些实施方式中，寡核苷酸含有针对TLR3、TLR7、TLR8、 TLR9或RIG-I样受体或其组合的功能性配体。
免疫刺激性寡核苷酸的实例及其制备方法是本领域公知的并且是可商购的，参见例如，Bodera,P.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov.5(1):87-93(2011)，通过引用并入本文。
3.货物的组成
所公开的核酸货物可以是或包含DNA或RNA核苷酸，其通常包含杂环碱基(核酸碱基)、与杂环碱基连接的糖部分和酯化糖部分的羟基官能团的磷酸部分。主要的天然存在核苷酸包括作为杂环碱基的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，以及通过磷酸二酯键连接的核糖或脱氧核糖。
在一些实施方式中，货物包括或由核苷酸类似物构成，这些核苷酸类似物经过化学修饰以相对于DNA或RNA对应物提高靶受体的稳定性、半衰期或特异性或亲和性。化学修饰包括核碱基、糖部分、核苷酸键或其组合的化学修饰。如本文所用，“修饰的核苷酸”或“化学修饰的核苷酸”定义了具有杂环碱基、糖部分或磷酸酯部分成分中的一种或多种的化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，与具有相同核碱基序列的DNA或RNA相比，修饰核苷酸的电荷减少。例如，寡核苷酸可以具有低负电荷、无电荷或正电荷。
通常，核苷类似物支持能够通过Watson-Crick碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键的碱基，其中类似物骨架以允许在寡核苷酸类似物分子和标准多核苷酸(例如，单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式进行这种氢键键合的方式呈现碱基。在一些实施方式中，类似物具有基本上不带电的含磷骨架。
a.杂环碱基
主要的天然存在的核苷酸包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤作为杂环碱基。货物可以包括对其核碱基成分的化学修饰。杂环碱基或杂环碱基类似物的化学修饰可有效增加结合靶序列的结合亲和性或稳定性。化学修饰的杂环碱基包括但不限于肌苷、 5-(1-丙炔基)尿嘧啶(pU)、5-(1-丙炔基)胞嘧啶(pC)、5-甲基胞嘧啶、8-氧代腺嘌呤、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5和2-氨基-5-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)吡啶(2-氨基吡啶)，以及各种吡咯并和吡唑并嘧啶衍生物。
b.糖修饰
货物还可以包含具有修饰的糖部分或糖部分类似物的核苷酸。糖部分修饰包括但不限于2’-O-氨基乙氧基、2’-O-氨基乙基 (2’-OAE)、2’-O-甲氧基、2’-O-甲基、2-胍基乙基(2’-OGE)、 2’-O,4’-C-亚甲基(LNA)、2’-O-(甲氧基乙基)(2’-OME)和2’-O-(N-(甲基)乙酰氨基)(2’-OMA)。2’-O-氨基乙基糖部分取代是特别优选的，因为其在中性pH下被质子化，且因此抑制了TFO和靶双链体之间的电荷排斥。这种修饰稳定了核糖或右旋核糖的C3’-内构象，并且还与双链体的嘌呤链中的i-1磷酸形成了桥。
在一些实施方式中，核酸是吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸通常由另外两个含有嘌呤或嘧啶碱基配对部分的吗啉代单体构成，这些部分可通过碱基特异性氢键有效地结合到多核苷酸中的碱基，其通过一到三个原子长的含磷键连接在一起，将一个单体的吗啉代氮连接到相邻单体的5’环外碳上。嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。吗啉代寡聚物的合成、结构和结合特征详见美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、 5,034,506、5,166,315、5,521,063和5,506,337。
基于吗啉的亚基的重要性质通常包括：通过稳定的、不带电荷的骨架键以寡聚形式连接的能力；支持核苷酸碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或肌苷)的能力，使得形成的聚合物可以与具有高Tm的互补碱基靶核酸(包括靶RNA)杂交，甚至与短至10-14个碱基的寡聚物杂交；寡聚物被主动转运到哺乳动物细胞中的能力；以及寡聚物：RNA异双链体抵抗RNA酶降解的能力。
在一些实施方式中，如上所述，寡核苷酸使用带有碱基配对部分的基于吗啉代的亚基，通过不带电荷的键连接。
c.核苷酸间连接
寡核苷酸通过核苷酸间键连接，该键是指两个核苷部分之间的化学连接。对DNA或RNA寡核苷酸的磷酸酯骨架的修饰可以增加寡核苷酸的结合亲和性或稳定性，或降低寡核苷酸核酸酶消化的敏感性。阳离子修饰，包括但不限于二乙基-乙二胺(DEED)或二甲基-氨基丙胺(DMAP)，由于减少了寡核苷酸和靶标之间的静电排斥，可能特别有用。磷酸酯骨架的修饰还可以包括硫原子取代磷酸二酯键中的非桥连氧之一。这种取代产生代替磷酸二酯键的硫代磷酸酯核苷间键。已显示含有硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸在体内更稳定。
具有减少电荷的修饰核苷酸的实例包括修饰的核苷酸间键，如具有非手性和不带电荷的亚基间键的磷酸类似物(例如，Sterchak,E. P.等，Organic.Chem.,52:4202,(1987))，以及具有非手性亚基间键的不带电吗啉基聚合物(参见，例如，美国专利号5,034,506)，如上文所讨论的。一些核苷酸间键类似物包括morpholidate、乙缩醛和聚酰胺连接的杂环。
在另一个实施方式中，货物由锁核酸构成。锁核酸(LNA)是修饰的RNA核苷酸(参见，例如，Braasch等，Chem.Biol.,8(1):1-7 (2001))。LNA与DNA形成杂合体，其比DNA/DNA杂合体更稳定，这一性质类似于肽核酸(PNA)/DNA杂合体。因此，LNA可以像 PNA分子一样使用。在一些实施方式中，LNA结合效率可以通过向其添加正电荷来提高。市售核酸合成仪和标准亚磷酰胺化学用于制备LNA。
在一些实施方式中，货物由肽核酸构成。肽核酸(PNA)是合成的DNA模拟物，其中寡核苷酸的磷酸酯骨架被重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元完全取代，且磷酸二酯键通常被肽键取代。各种杂环碱基通过亚甲基羰基键与骨架相连。PNA保持杂环碱基的间距，类似于传统的DNA寡核苷酸，但其是非手性和带中性电荷的分子。肽核酸由肽核酸单体构成。
其他骨架修饰包括肽和氨基酸变化和修饰。因此，寡核苷酸如 PNA的骨架成分可以是肽连接，或者，其可以是非肽肽连接。实例包括乙酰帽、氨基间隔物如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(本文称为O-接头)、氨基酸如赖氨酸在PNA中需要正电荷时特别有用，等等。PNA 的化学组装方法是众所周知的。参见，例如，美国专利号5,539,082、 5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,736,336、5,773,571和5,786,571。
货物任选地包含一个或多个末端残基或在任一末端或两个末端的修饰以增加寡核苷酸对其靶点的稳定性和/或亲和性。常用的带正电荷的部分包含氨基酸赖氨酸和精氨酸，尽管其他带正电荷的部分也可能有用。可以使用丙胺基团进一步修饰货物以进行封端而防止降解。用于3’或5’加帽寡核苷酸的步骤是本领域众所周知的。
在一些实施方式中，核酸可以是单链或双链的。
C.药物组合物
组合物可以与药学上可接受的载体组合用于治疗。
包含与3E10抗体复合的核酸货物的组合物优选与适宜的药物载体组合用于治疗用途。此类组合物包含有效量的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
组合物可以是在适宜的药物载体中用于外部(topically)、局部性(locally)或全身施用的制剂。E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版(MarkPublishing Company,1975) 公开了典型的载体和制备方法。复合物也可以被包封在由可生物降解或不可生物降解的聚合物或蛋白质或脂质体形成的合适的生物相容性颗粒中，以靶向细胞。此类系统对于本领域技术人员是众所周知的。在一些实施方式中，复合物被包封在纳米颗粒中。
注射用制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，任选地添加有防腐剂。组合物可以采取如无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液的形式，在某些实施方式中，这些组合物可以与受试者的血液等渗。非水溶剂的实例是聚丙二醇；聚乙二醇；植物油，如橄榄油、芝麻油、椰子油、花生油、花生油、矿物油；可注射的有机酯，如油酸乙酯；或非挥发油，包含合成的甘油单酯或甘油二酯。水性载体包含水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包含盐水和缓冲介质。胃肠外媒剂包含氯化钠溶液、1,3-丁二醇、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏油或非挥发油。静脉内媒剂包含流体和营养补充剂以及电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。这些材料可以在溶液、乳液或悬浮液中(例如，并入颗粒、脂质体或细胞中)。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使制剂是等渗的。通常1-5％的量的海藻糖可以被添加到药物组合物中。溶液的pH优选地为约5到约8，并且更优选地约7到约7.5。
药物组合物可以包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和表面活性剂。可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa中找到载体制剂。本领域技术人员可以容易地确定用于制备和调配组合物的各种参数，而无需过度实验。
单独地或与其他合适的组分组合的组合物也可以制成气溶胶制剂(即，这些组合物可以被“雾化”)以通过吸入施用。气溶胶制剂可以放置到加压的可接受的推进剂(如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气和空气)中。为了通过吸入进行施用，使用合适的推进剂，从加压包或喷雾器以气溶胶喷雾呈现的形式递送化合物。
在一些实施方式中，包含具有制剂成分(如盐、载体、缓冲剂、乳化剂、稀释剂、赋形剂、螯合剂、防腐剂、增溶剂或稳定剂)的药学上可接受的载体。
核酸可以与具有C32官能团的亲脂性基团(如胆固醇以及月桂酸和石胆酸衍生物)缀合，以改善细胞摄取。例如，已证明胆固醇在体外(Lorenz等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,14(19):4975-4977 (2004))和体内(Soutschek等，Nature,432(7014):173-178(2004)) 增强siRNA的摄取和血清稳定性。另外，已经显示类固醇缀合的寡核苷酸与血流中的不同脂蛋白(如LDL)的结合保护完整性并促进生物分布(Rump等，Biochem.Pharmacol.,59(11):1407-1416(2000))。可以与上述化合物连接或缀合以增加细胞摄取的其他基团包含：吖啶衍生物；交联剂，如补骨脂素衍生物、叠氮苯酰甲基、原黄素和叠氮基原黄素；人工核酸内切酶；金属络合物，如EDTA-Fe(II)和卟啉-Fe(II)；烷基化部分；核酸酶，如碱性磷酸酶；末端转移酶；抗体酶；胆甾醇基部分；亲脂性载体；肽缀合物；长链醇；磷酸酯；放射性标志物；非放射性标志物；碳水化合物；以及聚赖氨酸或其他多胺。Levy等人的美国专利号6,919,208还描述了用于增强型递送的方法。这些药物制剂可以以本身已知的方式进行制备，例如借助于常规混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。
另外的载体包含持续释放制剂，如含有复合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质为成形颗粒形式，例如膜、脂质体或微颗粒。植入包含插入可植入的药物递送系统，例如微球体、水凝胶、聚合物储库、胆固醇基质、聚合物系统，例如基质侵蚀和/或扩散系统和非聚合物系统。吸入包含在吸入器中单独地或与可以吸收的载体附接的气溶胶一起施用组合物。对于全身施用，可以优选的是将组合物包封在脂质体中。
可以使用侵入性装置(如血管导管或导尿管)和使用介入装置 (如具有药物递送能力并被配置为扩张装置或支架移植物的支架) 以实现组织特异性药剂摄取和/或核苷酸递送系统的方式递送组合物。
可以使用可生物蚀解的植入物通过扩散或通过聚合物基质的降解来递送制剂。在某些实施方式中，制剂的施用可以被设计成在某个时间段(例如，数小时、数天、数周、数月或数年)内顺序暴露于组合物。这可以通过例如重复施用制剂或通过持续或控制释放递送系统来完成，在该系统中，在不重复施用的情况下在延长的时间段内递送组合物。
其他合适的递送系统包含定时释放、延迟释放、持续释放或控释递送系统。在许多情况下，此类系统可以避免重复施用，从而增加对受试者和医生的便利性。很多类型的释放递送系统对本领域普通技术人员来说是可用且已知的。这些系统包含例如基于聚合物的系统，如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酸酐、聚己内酯、共聚草酸、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和/或这些的组合。例如美国专利号 5,075,109中描述了前述含核酸的聚合物的微胶囊。其他实例包含：基于脂质的非聚合物系统，该脂质包含固醇(如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸)或中性脂肪(如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)；水凝胶释放系统；基于脂质体的系统；基于磷脂的系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；或部分融合的植入物。制剂可以是例如微球体、水凝胶、聚合物储库、胆固醇基质或聚合物系统。在一些实施方式中，系统可以例如通过控制含有复合物的制剂的扩散或侵蚀/降解速率来允许组合物持续或受控释放。
可以配制包含核酸货物和抗体及其组合的复合物以供肺或粘膜施用。施用可以包含将组合物递送到肺、鼻、口腔(舌下、颊)、阴道或直肠粘膜。如本文所使用的，术语“气溶胶”是指颗粒的细小喷雾的任何制剂，其可以呈溶液或悬浮液，不论其是否使用推进剂来产生。可以使用标准技术(如超声处理或高压处理)产生气溶胶。
为了通过上呼吸道施用，可以将制剂配制成溶液(例如，水或等渗盐水)、缓冲的或非缓冲的，或作为悬浮液，以便以滴剂或喷雾剂的形式鼻内施用。优选地，此类溶液或悬浮液相对于鼻分泌物是等渗的并且具有大致相同的pH，例如在约pH 4.0到约pH 7.4或 pH6.0到pH 7.0的范围内。缓冲液应该是生理相容的，并且仅举例来说，包含磷酸盐缓冲液。
可以使用颗粒递送媒剂将复合物递送到靶细胞。纳米颗粒通常是指在介于500nm到小于0.5nm之间的范围内，优选地直径介于 50与500nm之间，更优选地直径介于50与300nm之间的颗粒。聚合物颗粒的细胞内化高度取决于其大小，其中纳米微粒聚合物颗粒被细胞内化的效率比微粒聚合物颗粒高得多。例如，Desai等人已证明，与直径为1μM的微颗粒相比，被培养的Caco-2细胞摄取的直径为100nm的纳米颗粒约多2.5倍(Desai等，Pharm.Res.,14:1568-73 (1997))。纳米颗粒还具有在体内更深地扩散到组织中的更大能力。
在一些实施方式中，递送媒剂是树枝状聚合物。
优选的可生物降解的聚合物的实例包含通过水解降解的合成聚合物(如多(羟基酸)，如乳酸和乙醇酸的聚合物和共聚物)、其他可降解的聚酯、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(己内酯)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(丙交酯-共-己内酯)和聚(胺 -共-酯)聚合物，如Zhou等，Nature Materials,11:82-90(2012)和WO 2013/082529、美国公开申请号2014/0342003号及 PCT/US2015/061375中描述的那些。
在一些实施方式中，特别是用于在体内靶向T细胞的那些，例如，用于体内产生CART细胞、免疫细胞或T细胞标志物，如CD3、 CD7或CD8或者靶组织如肝脏的标志物，可以被靶向。例如，抗 CD8抗体和抗CD3 Fab片段均已被用于在体内靶向T细胞(Pfeiffer 等，EMBOMol Med.,10(11)(2018).pii:e9158.doi: 10.15252/emmm.201809158.，Smith等，NatNanotechnol., 12(8):813-820(2017).doi:10.1038/nnano.2017.57)。因此，在一些实施方式中，颗粒或其他递送媒剂包括对CD3、CD7、CD8或另一种免疫细胞(例如，T细胞)标志物或特定组织如胸腺、脾脏或肝脏的标志物具有特异性的靶向部分。结合部分可以是例如抗体或其抗原结合片段。
靶向部分可以与纳米颗粒或其其他递送媒剂缔合、连接、缀合或以其他方式直接或间接地附接。靶向分子可以是与靶向细胞的表面上的受体或其他分子结合的蛋白、肽、核酸分子、糖或多糖。可以通过选择靶向分子来调节与移植物结合的特异性程度和亲合力。
部分的实例包含例如靶向部分，这些靶向部分提供分子到特异性细胞的递送，例如针对造血干细胞、CD34+细胞、T细胞或任何其他优选细胞类型以及在优选的细胞类型上表达的受体和配体的抗体。优选地，这些部分靶向造血干细胞。靶向细胞外基质(“ECM”) 的分子的实例包含糖胺聚糖(“GAG”)和胶原蛋白。在一个实施方式中，可以修饰聚合物颗粒的外表面以增强颗粒与所选细胞或组织相互作用的能力。如上所述的方法是优选的，其中将与靶向分子缀合的衔接元件插入到颗粒中。然而，在另一个实施方式中，具有羧基末端的聚合物微颗粒或纳米颗粒的外表面可以与具有游离胺末端的靶向分子连接。
附接到聚合物微颗粒和纳米颗粒的其他有用的配体包含病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP靶向细胞或组织的表面上的Toll 样受体(TLR)，或在内部向细胞或组织发出信号，由此潜在地增加摄取。与颗粒表面缀合或共包封的PAMP可以包含：未甲基化的CpGDNA(细菌)、双链RNA(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、脂阿拉伯甘露聚糖(细菌)、酵母聚糖(酵母)、支原体脂蛋白如MALP-2(细菌)、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌苷-胞苷)酸(细菌)、脂磷壁酸(细菌)或咪唑并喹啉(合成的)。
在另一个实施方式中，颗粒的外表面可以使用甘露糖胺处理，由此使颗粒的外表面甘露糖基化。此处理可能使颗粒在抗原呈递细胞表面上的甘露糖受体处与靶细胞或组织结合。可替代地，与含有 Fc部分(靶向Fc受体)、热休克蛋白部分(HSP受体)、磷脂酰丝氨酸(清道夫受体)和脂多糖(LPS)的免疫球蛋白分子的表面缀合是细胞或组织上的另外的受体靶标。
凝集素可以共价附接到微颗粒和纳米颗粒以使其对粘蛋白和粘膜细胞层具有靶特异性。
靶向部分的选择将取决于纳米颗粒组合物的施用方法和要靶向的细胞或组织。靶向分子通常可以增加颗粒对细胞或组织的结合亲和性，或者可以将纳米颗粒靶向到器官中的特定组织或组织中的特定细胞类型。在一些实施方式中，靶向部分靶向胸腺、脾脏或癌细胞。
粘蛋白的天然组分中的任何天然组分以纯或部分纯化的形式共价附接到颗粒将降低珠-肠界面的表面张力，并且增加珠在粘蛋白层中的溶解度。含有额外的侧羧酸侧基的聚氨基酸(例如，聚天冬氨酸和聚谷氨酸)的附接增加了生物粘附性。使用分子量范围为15,000 到50,000kDa的聚氨基酸产生附接到颗粒表面的120到425个氨基酸残基的链。聚氨基链通过粘蛋白链中的链缠结以及增加的羧基电荷来提高生物粘附力。
III.使用方法
提供了使用3E10以增强核酸构建体递送的方法。通常，有效量的3E10抗体首先与需要递送到细胞中的核酸货物接触。例如，核酸货物和抗体可以在溶液中混合足够的时间以使核酸货物和抗体形成复合物。接下来，将混合物与细胞接触。在其他实施方式中，将货物和抗体添加到含有或另外浸泡细胞的溶液中，并在细胞存在下形成复合物。复合物可以在体外、离体或体内与细胞接触。因此，在一些实施方式中，将复合物溶液添加到培养的细胞中或注射到待治疗的动物体内。
据信抗体有助于将核酸递送到细胞核中，然后改变可以促进供体DNA进行基因编辑的RAD51途径的功能。该方法对核酸货物的设计没有序列限制。例如，治疗可以通过简单的IV施用将抗体和核酸货物的混合物施用至有需要的受试者。
组合物和方法可以包括由RNA、DNA、PNA或其他修饰的核酸或其组合形成的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的核酸构建体。
组合物的有效量或治疗有效量可以是足以治疗、抑制或减轻疾病或病症的一种或多种症状或以其他方式提供期望的药理学和/或生理学效应，例如，降低、抑制或逆转作为疾病或病症的原因的病理生理学机制中的一种或多种的剂量。
有效量也可以是相对于在不存在抗体的情况下施用货物而言有效增加核酸货物的递送速率、数量和/或质量的量。对组合物进行配制以适应施用模式。药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及通过用于施用组合物的特定方法来确定。因此，存在多种含有复合物的药物组合物的合适制剂。精确剂量将根据各种因素而变化，如受试者相关的变量(例如，年龄、免疫系统健康状况、临床症状等)。
可以每天一次、两次或三次；每周一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次；每月一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次施用组合物或以其他方式使其与靶细胞接触。例如，在一些实施方式中，每两天或三天或每周平均约2到约4次施用组合物。因此，在一些实施方式中，组合物作为包括两种或更多种单独治疗的剂量方案的一部分施用。
剂量方案包括维持方案，其中在两次或更多次施用之间剂量保持相同，递增方案，其中在两次或更多次施用之间剂量增加，递减方案，其中在两次或更多次施用之间剂量减少，或者其组合。
在一些实施方式中，第一剂可以是低剂量。可以继续渐增剂量直至达到令人满意的生化或临床响应。临床响应将取决于所治疗的疾病或病症，和/或所需结果。在一些实施方式中，剂量可以增加直至鉴定出治疗效果，优选地也不会引起不希望的毒性或其可接受的高量。接下来，可以维持或稳定地减少剂量直至维持剂量。这些方法可以用于标准化、优化或定制治疗的剂量水平、剂量频率或持续时间。
通常，在施用之前，特别是对于体内施用，将抗体和核酸在室温下混合一段时间。在一些实施方式中，复合时间的范围从例如1 分钟到30分钟，或10分钟到20分钟，包括各端点，优选的复合时间为约15分钟。抗体剂量可以在从0.0001mg至1mg范围内，包括各端点，优选的剂量为约0.1mg。核酸剂量的范围可以从约0.001μg 至100μg，包括端点，优选的剂量为10μg。下面的体内数据(例如，图6B)是使用0.1mg 3E10、10μg mRNA并复合15分钟产生的。
下面的实例可能表明，DNA货物可以更普遍地递送到多个组织，而不仅限于肿瘤，而RNA递送可能对肿瘤组织更具选择性。因此，在一些实施方式中，RNA货物(例如，单独的)可以选择性递送至癌细胞或其他肿瘤组织。在一些实施方式中，当需要更广泛地分布 RNA货物时，可以将RNA与DNA(例如，载体DNA)混合以促进向非癌/肿瘤组织的递送。载体DNA可以是，例如，质粒DNA或者来自例如鲑鱼精子的低分子量DNA。在一些实施方式中，载体DNA是非编码DNA。载体DNA可以是单链或双链的或其组合。在一些实施方式中，载体DNA由长度为1-10、1-100、1-1,000或1-10,000 个核苷酸或其任何子范围或整数或其组合的核酸构成。通常，载体 DNA不与抗体缀合或以其他方式共价附接。通常，载体DNA与货物核酸(例如，RNA)和抗体共同孵育，并作为复合物与其共同递送。在一些实施方式中，载体DNA是非编码DNA。
A.体外和离体方法
对于体外和离体方法，细胞通常在培养时与组合物接触。对于离体方法，细胞可以从受试者分离并与组合物离体接触以产生含有货物核酸的细胞。在优选实施方式中，细胞是从待治疗受试者或从同基因宿主中分离的。可以在与组合物接触之前从受试者中除去靶细胞。
B.体内方法
在一些实施方式中，将核酸货物体内递送至细胞用于基因编辑和/或治疗受试者的疾病或病症。可以将通常包含抗体-核酸货物的组合物直接施用于受试者用于体内疗法。
通常，施用化合物(包括抗体、寡核苷酸和相关分子)的方法是本领域众所周知的。特别地，已经用于核酸治疗的施用途径以及当前使用的制剂为上述供体寡核苷酸提供了优选的施用途径和制剂。优选地，将组合物注射或输注进入动物中。
组合物可以通过多种途径施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、羊膜内、肌内、皮下或局部(舌下、直肠、鼻内、肺、直肠粘膜和阴道)以及口服(舌下、口腔)。
在一些实施方式中，将组合物配制用于肺部递送，如鼻内施用或口腔吸入。可以通过允许复合物到达其靶点的任何可接受的方法来完成制剂的施用。根据所治疗的病况，施用可以是局部的(即，施用至特定区域、生理系统、组织、器官或细胞类型)或全身性的。用于体内递送的组合物和方法也在WO 2017/143042中讨论。
该方法还可以包括在体内将有效量的抗体-核酸复合物组合物施用于胚胎或胎儿或其妊娠母体。在一些方法中，通过将组合物注射和/或输注入静脉或动脉，如卵黄静脉或脐静脉，或注入胚胎或胎儿的羊膜囊中，将组合物在子宫内递送。参见，例如，Ricciardi等，Nat Commun.2018Jun 26；9(1):2481.doi: 10.1038/s41467-018-04894-2，和WO 2018/187493。
C.应用
可以使用3E10抗体将编码目的多肽或功能性核酸的核酸货物 (例如，mRNA、功能性核酸、DNA表达构建体、载体等)递送到细胞中，以表达或抑制细胞中的多肽。组合物和方法可以用于一系列不同的应用。非限制性实例包括CRISPR和gRNA表达载体+/-编辑DNA、大DNA(质粒和表达载体)的递送、基因替代和基因疗法、 DNA和/或RNA的递送例如以在体内或离体产生CAR-T细胞和简化体内或离体产生CAR-T细胞、siRNA的递送、mRNA的递送等。下面讨论与基因疗法/基因编辑和免疫调节相关的示例性应用，特别是嵌合抗原受体T细胞的产生。
1.基因疗法和基因编辑
在一些实施方式中，组合物用于基因编辑。
例如，该方法可特别适用于治疗由单基因突变引起的遗传缺陷、病症和疾病，例如，以校正由点突变引起的遗传缺陷、病症和疾病。如果靶基因包含导致遗传障碍的突变，则该方法可用于诱变修复，其可将靶基因的DNA序列恢复至正常。靶序列可以在基因的编码DNA序列内或内含子内。靶序列也可以在调控靶基因表达的DNA 序列内，包括启动子或增强子序列。
在本文的方法中，可以向受试者施用已经与复合物接触的细胞。受试者可能患有疾病或病症，如血友病、肌营养不良症、球蛋白病、囊性纤维化、着色性干皮病或溶酶体贮积症。在此类实施方式中，基因修饰、基因替代、基因添加或其组合可以以有效量发生以减轻受试者的疾病或病症的一种或多种症状。
在一些实施方式中，DNA货物包括编码核酸酶的核酸、供体寡核苷酸或编码供体寡核苷酸的核酸或其组合。
a.基因编辑核酸酶
核酸货物包括编码在靶细胞基因组中诱导单链或双链断裂的一个或多个元件的那些，并且任选地但优选地与其他元件如供体寡核苷酸和/或特别是在CRISPR/Cas的情况下，系统的其他元件，如 gRNA组合。组合物可以用于例如降低或以其他方式改变靶基因的表达。
i.链断裂诱导元件CRISPR/Cas
在一些实施方式中，核酸货物包括CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物的一种或多种元件、编码CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物的一种或多种元件的核酸或其组合。如本文所用，CRISPR/Cas 介导的基因组编辑组合物指在哺乳动物受试者中进行CRISPR/Cas 介导的基因组编辑所需的CRISPR系统的元件。如在下文中更详细讨论的，CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物通常包含一种或多种编码crRNA、tracrRNA(或其嵌合体，也称为指导RNA或单一指导 RNA)和Cas酶(如Cas9)的核酸。CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物可以任选地包含供体多核苷酸，所述供体多核苷酸可以在靶位点(例如，由Cas9诱导的单链断裂或双链断裂的位点)处或附近重组到靶细胞的基因组中。
CRISPR/Cas系统已被适应用作用于真核生物的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)(参见，例如，Cong,Science, 15:339(6121):819–823(2013)和Jinek等，Science,337(6096):816-21 (2012))。通过用包括cas基因和专门设计的CRISPR的所需元件转染细胞，可以在任何所需位置处切割和修饰生物体的基因组。在WO 2013/176772和WO 2014/018423中详细描述了使用CRISPR/Cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法，其全部内容通过引用专门并入本文。
本文公开的递送方法适用于CRISPR/Cas系统的多种变体。
一般而言，“CRISPR系统”统指参与表达或指导CRISPR相关 (“Cas”)基因活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分 tracrRNA)、tracr-mate序列(包含在内源性CRISPR系统背景下的“同向重复”和tracrRNA处理的部分同向重复)、指导序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为“间隔区”)或者来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。与指导序列可操作地连接的一个或多个tracr mate序列(例如，同向重复-间隔区-同向重复)也可以称为 pre-crRNA(pre-CRISPRRNA)(加工前)或crRNA(由核酸酶加工后)。
如在下文中更详细讨论的，在一些实施方式中，tracrRNA和 crRNA连接并形成嵌合crRNA-tracrRNA杂合体，其中成熟crRNA 通过合成茎环与部分tracrRNA融合以模拟天然crRNA:tracrRNA双链体，如在Cong,Science,15:339(6121):819–823(2013)和Jinek等，Science,337(6096):816-21(2012)中所描述的。单一融合的 crRNA-tracrRNA构建体在本文中也称为指导RNA或gRNA(或单一指导RNA(sgRNA))。在sgRNA中，可以将crRNA部分识别为“靶序列”，而tracrRNA通常称为“支架”。
在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、 II型或III型CRISPR系统。在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于特定生物体，包括内源性CRISPR系统，如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。
一般而言，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列的位点处形成 CRISPR复合物的元件(在内源性CRISPR系统的背景下也称为前间隔区)。在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”指将指导序列设计为具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以是任何多核苷酸，如DNA或 RNA多核苷酸。在一些实施方式中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
在靶核酸中，每个前间隔区与前间隔区相邻基序(PAM)相关联，其识别对单个CRISPR系统具有特异性。在化脓性链球菌 CRISPR/Cas系统中，PAM是核苷酸序列NGG。在嗜热链球菌 CRISPR/Cas系统中，PAM是核苷酸序列，是NNAGAAW。TracrRNA 双链体通过crRNA的间隔区和前间隔区DNA之间的异源双链体形成将Cas指导至由前间隔区和必需的PAM组成的DNA靶标。
通常，在内源性CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包括与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在靶序列中或附近(例如，在距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、20、50个或更多个碱基对内)切割一条或两条链。Tracr序列的全部或一部分也可以形成CRISPR复合物的部分，如通过与可操作地连接到指导序列的tracr mate序列的全部或一部分杂交。
一旦鉴定了所需的DNA靶序列，就有很多资源可用于帮助操作者确定适宜的靶位点。例如，很多公共资源(包括生物信息学生成的约190,000个潜在sgRNA的列表，其靶向超过40％的人类外显子) 是可得的以帮助操作者选择靶位点和设计相关sgRNA，从而影响该位点的缺口或双链断裂。也参见，crispr.u-psud.fr/，设计为帮助科学家在广泛的物种中找到CRISPR靶向位点并生成适当的crRNA序列的工具。
在一些实施方式中，将驱动CRISPR系统的一种或多种元件表达的一种或多种载体引入靶细胞中，使得CRISPR系统元件的表达指导在一个或多个靶位点形成CRISPR复合物。例如，Cas酶、与 tracr-mate序列连接的指导序列和tracr序列能够各自可操作地连接至单独载体上的单独调控元件。或者，从相同或不同调控元件表达的两个或更多个元件可以组合在单一载体中，其中一个或多个另外的载体提供未包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。组合在单一载体中的CRISPR系统元件可以以任何适宜方向排列，如一个元件位于相对于第二元件的5’(“上游”)或相对于第二元件的3’ (“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的相同或相反的链上，并且定向在相同或相反的方向上。在一些实施方式中，单一启动子驱动编码CRISPR酶及指导序列、tracr mate 序列(任选地可操作地连接至指导序列)和嵌入一个或多个内含子序列中的tracr序列中的一个或多个(例如，各自在不同内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或全部在单一启动子中)的转录物的表达。在一些实施方式中，CRISPR酶、指导序列、tracr mate 序列和tracr序列可操作地连接至同一启动子并从同一启动子表达。
在一些实施方式中，载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方式中，一个或多个插入位点(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10个或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施方式中，载体包含在tracr mate 序列上游以及任选地在与tracr mate序列可操作地连接的调控元件的下游的插入位点，以使得在将指导序列插入到插入位点中之后以及在表达后，指导序列指导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施方式中，载体包含两个或更多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr mate序列之间，以允许在每个位点处插入指导序列。在这样的排列中，两个或更多个指导序列可以包含单个指导序列的两个或更多个拷贝、两个或更多个不同指导序列或者这些的组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的对应靶序列。例如，单一载体可以包含大约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20个指导序列。在一些实施方式中，可以提供大约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个这样的含有指导序列的载体，并且任选地递送至细胞。
在一些实施方式中，载体包含可操作地连接至编码CRISPR酶 (如Cas蛋白)的酶编码序列的调控元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、 Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、 Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、 CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或者其修饰的形式。在一些实施方式中，未修饰的CRISPR 酶具有DNA切割活性，如Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶指导在靶序列的位置处切割一条或两条链，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内。在一些实施方式中，CRISPR酶指导从靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内切割一条或两条链。
在一些实施方式中，载体编码相对于相应野生型酶突变的 CRISPR酶，以使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。例如，来自化脓性链球菌Cas9的 RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单链)。使Cas9成为切口酶的突变的其他实例包括但不限于H840A、N854A和N863A。作为另一个实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和 RuvC III)可以被突变以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的突变 Cas9。在一些实施方式中，D10A突变与H840A、N854A或N863A 突变中的一种或多种组合以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的 Cas9酶。在一些实施方式中，当突变酶的DNA切割活性相对于其非突变形式小于约25％、10％、5％>、1％>、0.1％>、0.01％或更低时，认为CRISPR酶基本上缺乏所有DNA切割活性。
在一些实施方式中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞如真核细胞中表达。真核细胞可以是属于或来源于特定生物体的那些，如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、犬或非人灵长类。一般而言，密码子优化指修饰核酸序列以增强在目标宿主细胞中表达的过程，其通过使用更频繁或最频繁用于宿主细胞基因中同时保持天然氨基酸序列的密码子替代天然序列的至少一个密码子(例如，大约或超过约1、2、3、4、5、10、15、 20、25、50个或更多个密码子)。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA) 的翻译效率又被认为特别取决于被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。
细胞中所选tRNA的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中实现最佳基因表达。密码子使用表是容易获得的，例如，在“密码子使用数据库”中，这些表可以通过多种方式进行调整。参见Nakamura,Y.等，Nucl.Acids Res.,28:292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法，例如Gene Forge(Aptagen； Jacobus,PA)，也是可获得的。在一些实施方式中，在编码CRISPR 酶的序列中的一个或多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、 20、25、50个或更多个或者全部密码子)对应于对特定氨基酸的最常用密码子。
在一些实施方式中，载体编码包含一个或多个核定位序列(NLS) 的CRISPR酶。当存在多于一个NLS时，每个NLS可以独立于其他 NLS选择，以使得单一NLS可以以多于一个拷贝存在和/或与以一个或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合。在一些实施方式中，当NLS的最近氨基酸在从N端或C端起沿多肽链的大约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个氨基范围内时，认为NLS靠近N端或C端。
一般而言，一个或多个NLS具有足够的强度以驱动可检测量的 CRISPR酶在真核细胞的细胞核中累积。一般而言，核定位活性的强度可能源自CRISPR酶中NLS的数量、使用的特定NLS或这些因素的组合。
可以通过任何适宜技术来检测核中的累积。例如，可检测的标志物可以与CRISPR酶融合，以使得可以将细胞内的位置可视化，如与用于检测细胞核的位置的方法结合(例如，对细胞核特异的染色，如DAPI)。细胞核也可以从细胞中分离，然后可以通过任何适宜的检测蛋白的方法来分析其内容物，如免疫组织化学、蛋白质印迹或酶活性测定。如与未暴露于CRISPR酶或复合物或者暴露于缺乏该一个或多个NLS的CRISPR酶的对照相比，也可以间接确定细胞核中的累积，例如通过对CRISPR复合物形成的影响的测定(例如，靶序列处的DNA切割或突变的测定，或受CRISPR复合物形成和/或CRISPR酶活性影响的基因表达活性改变的测定)。
在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件在诱导型启动子控制下，其可以包括诱导型Cas，如Cas9。
Cong,Science,15:339(6121):819–823(2013)报道了Cas9、 tracrRNA、pre-crRNA(或Cas9和sgRNA)的异源表达可以实现哺乳动物染色体的靶向切割。因此，在本文公开的方法中使用的 CRISPR系统以及因此的货物核酸是一种载体系统，其可以包含一个或多个编码CRISPR系统元件的载体，所述元件可以包含与 CRISPR/Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列可操作地连接的第一调控元件，其中所述核苷酸序列包含(a)能够与真核细胞中的靶序列杂交的指导序列，(b)tracr mate序列和(c)tracr序列；以及与编码CRISPR酶的酶编码序列可操作地连接的第二调控元件，所述CRISPR酶可以任选地包含至少一个或多个核定位序列。元件 (a)、(b)和(c)可以以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于系统的相同或不同载体上，其中当转录时，tracr mate序列与tracr序列杂交，并且指导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合，并且其中CRISPR复合物可以包含CRISPR酶，所述CRISPR酶与(1)与靶序列杂交的指导序列和(2)与tracr序列杂交的tracr mate序列复合，其中编码CRISPR酶的酶编码序列进一步编码异源功能性结构域。在一些实施方式中，一个或多个载体还编码适宜的 Cas酶，例如，Cas9。不同基因元件可以受相同或不同启动子的控制。
尽管在不同的工程化的CRISPR系统中细节可能会有所不同，但总体方法是相似的。有兴趣使用CRISPR技术靶向DNA序列(使用很多可用的在线工具之一鉴定)的操作者可以将包含靶序列的短 DNA片段插入到指导RNA表达质粒中。sgRNA表达质粒包含靶序列(约20个核苷酸)、tracr序列(支架)形式以及适宜启动子和在真核细胞中正确加工所需的元件。此类载体是可商购的(参见，例如，Addgene)。很多系统依赖于定制的互补寡核苷酸，这些寡核苷酸经过退火形成双链DNA，然后克隆到sgRNA表达质粒中。在转染细胞中，来自相同或单独质粒的sgRNA和适当的Cas酶的共同表达导致所需靶位点的单链或双链断裂(取决于Cas酶的活性)。
ii.锌指核酸酶
在一些实施方式中，在靶细胞基因组中诱导单链或双链断裂的元件是核苷酸构建体或编码锌指核酸酶(ZFN)的构建体。因此，核酸货物可以编码ZFN。
ZFN通常是融合蛋白，其包含来源于与切割结构域连接的锌指蛋白的DNA结合结构域。最常见的切割结构域是IIS型酶Fokl。Fok1 催化DNA的双链切割，在一条链上距其识别位点9个核苷酸和在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处。参见，例如，美国专利号 5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等，Proc.,Natl.Acad.Sci. USA 89(1992):4275-4279；Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2764-2768(1993)；Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:883-887 (1994a)；Kim等，J.Biol.Chem.269:31,978-31,982(1994b)。一种或多种这些酶(或其酶促功能性片段)可用作切割结构域的来源。
原则上，可以设计为靶向任何目标基因组位置的DNA结合结构域可以是Cys2His2锌指的串联阵列，其中每个锌指通常识别靶DNA 序列中的三到四个核苷酸。Cys2His2结构域具有一般结构：Phe(有时是Tyr)-Cys(2至4个氨基酸)-Cys-(3个氨基酸)-Phe(有时是Tyr)-(5个氨基酸)-Leu-(2个氨基酸)-His-(3个氨基酸)-His。通过将多个指(数量不同：在已发表的研究中，每个单体使用三到六个指)，可以将ZFN对设计为与18-36个核苷酸长的基因组序列结合。
工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的经验选择方法。合理设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。参见，例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；6,534,261； 6,610,512；6,746,838；6,866,997；7,067,617；美国公开的申请号 2002/0165356；2004/0197892；2007/0154989；2007/0213269；和国际专利申请公开号WO 98/53059和WO 2003/016496。
iii.转录激活因子样效应核酸酶
在一些实施方式中，在靶细胞基因组中诱导单链或双链断裂的元件是核酸构建体或编码转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)的构建体。因此，核酸货物可以编码TALEN。
TALEN具有与ZFN相似的整体架构，主要区别在于DNA结合结构域来自TAL效应蛋白，即来自植物病原菌的转录因子。TALEN 的DNA结合结构域是氨基酸重复序列的串联阵列，每个重复序列长约34个残基。重复序列彼此非常相似；通常其主要在两个位置上不同(氨基酸12和13，称为重复可变双残基，或RVD)。每个RVD 指定优先结合四种可能的核苷酸之一，这意味着每个TALEN重复结合单碱基对，尽管已知NN RVD除了鸟嘌呤之外还结合腺嘌呤。TAL 效应DNA结合在机制上不如锌指蛋白理解得那么好，但其看似更简单的编码可能证明对工程化核酸酶设计非常有益。TALEN也切割为二聚体，具有相对较长的靶序列(迄今为止报道的最短者结合每个单体13个核苷酸)，并且似乎对结合位点之间的间隔物长度的要求不如ZFN严格。单体和二聚体TALEN可以包含超过10个、超过14 个、超过20个或超过24个重复。
在Cermak等，Nucl.Acids Res.1-11(2011)中描述了工程化TAL 结合特定核酸的方法。美国公开的申请号2011/0145940，其公开了 TAL效应物以及使用其修饰DNA的方法。Miller等，Nature Biotechnol 29:143(2011)报道了通过将TAL截短变体连接到FokI核酸酶的催化结构域来制备用于位点特异性核酸酶结构的TALEN。证明所得的TALEN在永生化人类细胞中诱导基因修饰。TALE结合结构域的一般设计原则可以参见，例如，WO 2011/072246。
b.供体多核苷酸
本文所述的基因组编辑系统的核酸酶活性切割靶DNA以在靶 DNA中产生单链或双链断裂。细胞可以通过以下两种方式之一修复双链断裂：非同源末端连接和同源定向修复。在非同源末端连接 (NHEJ)中，双链断裂通过将断裂末端彼此直接连接来修复。这样，没有新的核酸材料插入该位点中，尽管一些核酸材料可能丢失，导致缺失。在同源定向修复(HDR)中，将与切割的靶DNA序列具有同源性的供体多核苷酸用作修复切割的靶DNA序列的模板，导致遗传信息从供体多核苷酸转移到靶DNA。这样，可以将新的核酸材料插入/复制到该位点中。
因此，在一些实施方式中，核酸货物是或包含供体多核苷酸。由于NHEJ和/或同源定向修复导致的对靶DNA的修饰可用于诱导基因校正、基因替代、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、基因突变等。
因此，基因组编辑组合物对DNA的切割可用于通过切割靶DNA 序列并允许细胞在不存在外源提供的供体多核苷酸的情况下修复序列来从靶DNA序列中删除核酸材料。或者，如果基因组编辑组合物包含供体多核苷酸序列，所述供体多核苷酸序列至少包含与靶DNA序列同源的片段，则可以将该方法用于向靶DNA序列添加(即，插入或替代)核酸材料(例如，“敲入”编码蛋白的核酸、siRNA、 miRNA等)，添加标签(例如，6xHis、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白；黄色荧光蛋白等)、血凝素(HA)、FLAG等)，向基因添加调控序列(例如，启动子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入序列(IRES)、2A肽、起始密码子、终止密码子、剪接信号、定位信号等)，修饰核酸序列(例如，引入突变)等等。这样，组合物可用于以位点特异性(即，“靶向”)方式修饰DNA，例如基因敲除、基因敲入、基因编辑、基因标记等，如例如用于基因疗法。
在需要将多核苷酸序列插入靶DNA序列的应用中，还向细胞提供包含待插入的供体序列的多核苷酸。“供体序列”或“供体多核苷酸”或“供体寡核苷酸”指待插入切割位点的核酸序列。供体多核苷酸通常在切割位点包含与基因组序列足够的同源性，例如，与切割位点翼侧的核苷酸序列具有70％、80％、85％、90％、95％或100％同源性，例如，在切割位点约50个或更少碱基内，例如，约30个碱基内、约15个碱基内、约10个碱基内、约5个碱基内或紧邻切割位点，以支持其与其具有同源性的基因组序列之间的同源定向修复。供体序列通常与其替代的基因组序列不相同。相反，供体序列可以包含相对于基因组序列的至少一个或多个单碱基改变、插入、缺失、倒位或重排，只要存在足够的同源性以支持同源定向修复即可。在一些实施方式中，供体序列包含翼侧为两个同源区的非同源序列，以使得靶DNA区和两个翼侧序列之间的同源定向修复导致靶区域处非同源序列的插入。
2.免疫调节
a.CAR T细胞
所公开的组合物和方法特别适用于制备表达免疫受体的淋巴细胞，特别是嵌合免疫受体(CIR)，如嵌合抗原受体(CAR)的情况。人工免疫受体(在本文中也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体、嵌合抗原受体(CAR)和嵌合免疫受体(CIR))是工程化受体，其将选定的特异性移植到细胞上。如在下文中更详细讨论的，根据所讨论的方法修饰的细胞可用于治疗癌症、感染、炎症和自身免疫性疾病的多种免疫疗法中。
在特别优选的实施方式中，将编码嵌合抗原受体货物的mRNA 或DNA递送至免疫细胞，如淋巴细胞。
可以在体内、离体或体外将货物递送至免疫细胞。在优选实施方式中，货物是mRNA，其可以允许以下一种或多种：降低成本、易于制造、减少副作用(例如，细胞因子风暴、神经毒性、移植物抗宿主病等)。在特定实施方式中，从需要CAR T细胞疗法的受试者中收获免疫细胞(例如，T细胞)，将本文公开的组合物和方法用于将编码一种或多种CAR T细胞构建体的mRNA递送到收获的细胞中，并将所述细胞返回到所述受试者。在一些实施方式中，从最初收获细胞到将其返回给受试者的过程需要1周或更短时间，例如，1、 2、3、4、5、6或7天。在特定实施方式中，从最初收获细胞到将其返回给受试者的过程在1或2天内完成，或在少于1天内，例如，1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22或23小时。
嵌合抗原受体的设计和开发策略综述在Dotti等，Immunol Rev. 2014年1月；257(1):.doi:10.1111/imr.12131(35页)，其全部内容通过引用具体并入本文，以及Dotti,Molecular Therapy,22(5):899-890 (2014)，Karlsson等，Cancer Gene Therapy,20:386-93(2013)，Charo 等，Cancer Res.,65(5):2001-8(2005)，Jensen等，Immunol Rev.,257(1): 127–144(2014)，Eaton等，Gene Therapy,9:527-35(2002)，Barrett 等，Annu RevMed.,65:333–347(2014)，Cartellieri等，Journal of Biomedicine and Biotechnology,2010卷，文章号956304，13页 doi:10.1155/2010/956304；以及美国公开的申请号2015/0017120、 2015/0283178、2015/0290244、2014/0050709和2013/0071414。
CAR将单克隆抗体的抗原结合特性与T细胞的裂解能力和自我更新能力相结合，且与传统T细胞相比具有多项优势(Ramos和Dotti, Expert Opin Biol Ther.,11:855–873(2011)，Curran等，J Gene Med., 14:405–415(2012)，Maher,ISRN Oncol.2012:278093(2012))。CAR-T 细胞独立于主要组织相容性复合物(MHC)识别和杀死癌细胞。因此，靶细胞识别不受肿瘤逃避MHC限制性T细胞识别的某些机制的影响，例如人类白细胞抗原(HLA)I类分子的下调和缺陷的抗原加工。
嵌合免疫受体最初是在1980年代开发的，且最初包括单克隆抗体的可变(抗原结合)区和T细胞受体(TCR)α和β链的恒定区 (Kuwana等，Biochem Biophys Res Commun.,149:960–968(1987))。在1993年，将该设计修订为包含胞外域，来自单克隆抗体重链和轻链的抗原结合区的单链可变片段(scFv)、跨膜结构域域以及具有来自CD3-ζ的信号传导结构域的胞内域。后来的CAR通常遵循类似结构设计，具有共刺激信号转导胞内域。因此，本文方法中使用的 CAR构建体可以包含抗原结合结构域或胞外域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内域及其组合。
在一些实施方式中，胞内域是scFv。ScFv的亲和性预测CAR 功能(Hudecek等，ClinCancer Res.,19(12):3153-64(2013)， Chmielewski等，J Immunol.,173:7647–7653(2004))。抗原结合和随后的激活也可以通过在CAR中添加柔性接头序列来修饰，其允许表达可识别两种不同抗原的两个不同scFv(Grada等，Mol Ther Nucleic Acids,2:e105(2013))(称为串联CAR(TanCAR))。串联CAR可更有效地杀死单独表达低水平的每种抗原的癌症，并且还可以降低由单一抗原丢失变体引起的肿瘤免疫逃逸风险。其他胞外域包括IL13Rα2(Kahlon等，Cancer Res.,64:9160–9166(2004)，Brown等， Clin Cancer Res.,18(8):2199-209(2012)，Kong等，Clin Cancer Res., 18:5949–5960(2012))，NKG2D配体和CD70受体、肽配体(例如， T1E肽配体)和所谓的“通用胞外域”(例如，设计用于识别已与生物素化的单克隆抗体接触的靶点的抗生物素蛋白胞外域，或设计用于识别已与FITC标记的单克隆抗体接触的靶点的FITC特异性 scFv)(Zhang等，Blood,106:1544–1551(2005)，Barber等，Exp Hematol.,36:1318–1328(2008),Shaffer等，Blood,117:4304–4314(2011)，Davies等，Mol Med.,18:565–576(2012)，Urbanska等，Cancer Res.,72:1844–1852(2012)，Tamada等，Clin Cancer Res.,18:6436–6445 (2012))。
在一些实施方式中，CAR包含铰链区。尽管胞外域对CAR特异性很重要，但将胞外域连接到跨膜结构域的序列(铰链区)也可以通过产生CAR的长度和柔性的差异来影响CAR-T细胞功能。铰链可以包括，例如，来源于免疫球蛋白如IgG1的CH2CH3铰链或其片段。例如，Hudecek等，(Hudecek等，Clin Cancer Res.,19(12):3153-64 (2013))比较了CH2-CH3铰链[229个氨基酸(AA)]、CH3铰链(119 个AA)和短铰链(12个AA)对表达第三代ROR1特异性CAR的T 细胞的效应子功能的影响，并且发现表达“短铰链”CAR的T细胞具有优异的抗肿瘤活性，而其他研究人员发现CH2-CH3铰链损害了第一代CD30特异性CAR的表位识别(Hombach等，Gene Ther., 7:1067–1075(2000))。
在铰链(如果没有铰链结构域，则为胞外域)和信号转导胞内域之间通常存在跨膜结构域，最通常来源于CD3-ζ、CD4、CD8或 CD28分子。像铰链一样，跨膜结构域也可以影响CAR-T细胞效应子功能。
在抗原识别后，CAR胞内域将激活并将共刺激信号传递给T细胞。T细胞激活依赖于胞质结构域中存在的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)磷酸化为TCR复合物的胞质CD3-ζ结构域(Irving 等，Cell,64:891–901(1991))。尽管大多数CAR胞内域包含来源于CD3-ζ的激活结构域，但其他可包含含有ITAM的结构域，如针对 IgE-γ结构域的Fc受体(Haynes等，J Immunol.,166:182–187(2001))。
表达CAR的细胞的靶特异性由抗体/胞外域识别的抗原决定。所公开的组合物和方法可用于产生靶向任何抗原的构建体和表达所述构建体的细胞。在免疫疗法，特别是癌症免疫疗法的背景下，很多抗原和用于靶向其的适宜的胞外域是众所周知的。与天然TCR不同，大多数基于scFv的CAR识别细胞表面表达的靶抗原，而不是由细胞的MHC加工和呈递的内部抗原，然而，CAR具有优于经典TCR 的优势，在于其可以识别蛋白质表位以外的结构，包括碳水化合物和糖脂，Dotti等，Immunol Rev.2014年1月；257(1):. doi:10.1111/imr.12131(35页)，因此增加潜在靶抗原库。优选的靶标包括仅在癌细胞或其周围基质上表达的抗原(Cheever等，Clin Cancer Res.,15:5323–5337(2009))，如EGFR的剪接变体(EGFRvIII)，其对胶质瘤细胞具有特异性(Sampson等，Semin Immunol., 20(5):267-75(2008))。然而，人抗原满足这一要求，并且大多数靶抗原在正常细胞上(例如，GD2、CAIX、HER2)和/或以谱系限制的方式(例如，CD19、CD20)低水平表达。
优选的靶标和靶向其的CAR在本领域中是公知的(参见例如， Dotti等，ImmunolRev.2014 1月257(1):.doi:10.1111/imr.12131(35 页))。例如，用于血液系统恶性肿瘤的CAR靶点包括但不限于 CD19(例如，B细胞)(Savoldo等，J Clin Invest.,121:1822-1826(2011)，Cooper等，Blood,105:1622-1631(2005)；Jensen等，Biol Blood MarrowTransplant(2010)，Kochenderfer等，Blood,119:2709-2720 (2012)，Brentjens等，Molecular Therapy,17:S157(2009)，Brentjens 等，Nat Med.,9:279-286(2003)，Brentjens等，Blood,118:4817-4828 (2011)，Porter等，N Engl J Med.,365:725-733(2011)，Kalos等，Sci Transl Med.,3:95ra73(2011)，Brentjens等，Sci Transl Med.,5:177ra38 (2013)，Grupp等，N Engl J Med(2013))；CD20(例如，B细胞) (Jensen等，BiolBlood Marrow Transplant(2010)，Till等，Blood, 112:2261-2271(2008)，Wang等，HumGene Ther.,18:712-725(2007)， Wang等，Mol Ther.,9:577-586(2004)，Jensen等，BiolBlood Marrow Transplant,4:75-83(1998))；CD22(例如，B细胞)(Haso等，Blood, 121:1165-1174(2013))；CD30(例如，B细胞)(Di Stasi等，Blood, 113:6392-6402(2009)，Savoldo等，Blood,110:2620-2630(2007)， Hombach等，Cancer Res.,58:1116-1119(1998))；CD33(例如，髓系)(Finney等，J Immunol.,161:2791-2797(1998))；CD70(例如， B细胞/T细胞)(Shaffer等，Blood,117:4304-4314(2011))；CD123 (例如，髓系)(Tettamanti等，Br J Haematol.,161:389-401(2013))； Kappa(例如，B细胞)(Vera等，Blood,108:3890-3897(2006))； Lewis Y(例如，髓系)(Peinert等，Gene Ther.,17:678-686(2010)，Ritchie等，Mol Ther.(2013))；NKG2D配体(例如，髓系)(Barber 等，Exp Hematol.,36:1318-1328(2008)，Lehner等，PLoS One., 7:e31210(2012)，Song等，Hum Gene Ther.,24:295-305(2013)，Spear 等，J Immunol.188:6389-6398(2012))；ROR1(例如，B细胞)(Hudecek 等，Clin Cancer Res.(2013))。
用于实体瘤的CAR靶点包括但不限于B7H3(例如，肉瘤，胶质瘤)(Cheung等，HybridHybridomics,22:209–218(2003))；CAIX (例如，肾)(Lamers等，J Clin Oncol.,24:e20–e22.(2006)，Weijtens 等，Int J Cancer,77:181–187(1998))；CD44 v6/v7(例如，宫颈)(Hekele等，Int J Cancer,68:232-238(1996)，Dall等，Cancer Immunol Immunother,54:51-60(2005))；CD171(例如，神经母细胞瘤)(Park 等，Mol Ther.,15:825-833(2007))；CEA(例如，结肠)(Nolan等， Clin Cancer Res.,5:3928-3941(1999))；EGFRvIII(例如，胶质瘤) (Bullain等，J Neurooncol.(2009)，Morgan等，Hum Gene Ther., 23:1043-1053(2012))；EGP2(例如，癌瘤)(Meier等，Magn Reson Med.,65:756-763(2011)，Ren-Heidenreich等，Cancer Immunol Immunother.,51:417-423(2002))；EGP40(例如，结肠)(Daly等， Cancer Gene Ther.,7:284-291(2000)；EphA2(例如，胶质瘤，肺) (Chow等，MolTher.,21:629-637(2013))；ErbB2(HER2)(例如，乳腺、肺、前列腺、胶质瘤)(Zhao等，JImmunol.,183:5563-5574 (2009)，Morgan等，Mol Ther.,18:843-851(2010)，Pinthus等，114:1774-1781(2004)，Teng等，Hum Gene Ther.,15:699-708(2004)，Stancovski等，JImmunol.,151:6577-6582(1993)，Ahmed等，Mol Ther., 17:1779-1787(2009)，Ahmed等，Clin Cancer Res.,16:474-485(2010)， Moritz等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,91:4318-4322(1994))；ErbB 受体家族(例如，乳腺、肺、前列腺、胶质瘤)(Davies等，Mol Med.,18:565-576(2012))；ErbB3/4(例如，乳腺、卵巢)(Muniappan 等，Cancer Gene Ther.,7:128-134(2000)，Altenschmidt等，Clin Cancer Res.,2:1001-1008(1996))；HLA-A1/MAGE1(例如，黑色素瘤) (Willemsen等，Gene Ther.,8:1601-1608(2001)，Willemsen等，JImmunol.,174:7853-7858(2005))；HLA-A2/NY-ESO-1(例如，肉瘤，黑色素瘤)(Schuberth等，Gene Ther.,20:386-395(2013))；FR-ɑ (例如，卵巢)(Hwu等，J Exp Med.,178:361-366(1993)，Kershaw 等，Nat Biotechnol.,20:1221-1227(2002)，Kershaw等，Clin CancerRes.,12:6106-6115(2006)，Hwu等，Cancer Res.,55:3369-3373 (1995))；FAP(例如，与成纤维细胞相关的癌症)(Kakarla等， Mol Ther.(2013))；FAR(例如，横纹肌肉瘤)(Gattenlohner等， Cancer Res.,66:24-28(2006))；GD2(例如，神经母细胞瘤、肉瘤、黑色素瘤)(Pule等，Nat Med.,14:1264-1270(2008)，Louis等，Blood, 118:6050-6056(2011)，Rossig等，Int J Cancer.,94:228-236(2001))； GD3(例如，黑色素瘤、肺癌)(Yun等，Neoplasia.,2:449-459(2000))； HMW-MAA(例如，黑色素瘤)(Burns等，Cancer Res.,70:3027-3033 (2010))；IL11Rɑ(例如，骨肉瘤)(Huang等，Cancer Res.,72:271-281 (2012))；IL13Rɑ2(例如，胶质瘤)(Kahlon等，Cancer Res., 64:9160-9166(2004)，Brown等，ClinCancer Res.(2012)，Kong等， Clin Cancer Res.,18:5949-5960(2012)，Yaghoubi等，NatClin Pract Oncol.,6:53-58(2009))；Lewis Y(例如，乳腺/卵巢/胰腺)(Peinert 等，GeneTher.,17:678-686(2010)，Westwood等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,102:19051-19056(2005)，Mezzanzanica等，Cancer Gene Ther., 5:401-407(1998))；间皮素(例如，间皮瘤、乳腺、胰腺)(Lanitis 等，Mol Ther.,20:633-643(2012)，Moon等，Clin Cancer Res., 17:4719-4730(2011))；Mue1(例如，卵巢、乳腺、前列腺)(Wilkie 等，J Immunol.,180:4901-4909(2008))；NCAM(例如，神经母细胞瘤、结直肠)(Gilham等，J Immunother.,25:139-151(2002))； NKG2D配体(例如，卵巢、肉瘤)(Barber等，Exp Hematol., 36:1318-1328(2008)，Lehner等，PLoS One,7:e31210(2012)，Song 等，Gene Ther.,24:295-305(2013)，Spear等，J Immunol., 188:6389-6398(2012))；PSCA(例如，前列腺、胰腺)(Morgenroth 等，Prostate,67:1121-1131(2007)，Katari等，HPB,13:643-650 (2011))；PSMA(例如，前列腺)(Maher等，Nat Biotechnol.,20:70-75 (2002)，Gong等，Neoplasia.,1:123-127(1999))；TAG72(例如，结肠)(Hombach等，Gastroenterology,113:1163-1170(1997)， McGuinness等，Hum Gene Ther.,10:165-173(1999))；VEGFR-2(例如，肿瘤脉管系统)(J ClinInvest.,120:3953-3968(2010)，Niederman 等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,99:7009-7014(2002))。
b.代谢稳定性
在一些实施方式中，细胞(例如，CAR细胞)的代谢稳定性通过赋予其产生体内限制性的特定生长因子的能力而得到改善。在一些实施方式中，将编码抗凋亡因子如BCL-XL的核酸货物瞬时递送至细胞。B细胞淋巴瘤-特大(Bcl-XL，或BCL2-样1亚型1)是线粒体中的跨膜蛋白。其是Bcl-2蛋白家族成员，且通过阻止线粒体内含物(如细胞色素c)的释放(这导致半胱天冬酶激活)用作内在凋亡途径中的促存活蛋白。编码BCL-XL的氨基酸和核苷酸序列都是本领域公知的，并且包括，例如，UniProtKB-Q07817 (B2CL1_HUMAN)、亚型Bcl-X(L)(标识符：Q07817-1)(氨基酸序列)；ENA|U72398|U72398.1人Bcl-xβ(bcl-x)基因，完整cds (基因组核酸序列)；ENA|Z23115|Z23115.1人bcl-XL mRNA (mRNA/cDNA核酸序列)。
在一些实施方式中，核酸货物编码增殖诱导因子，如IL-2。编码IL-2的氨基酸和核酸序列是本领域公知的，并且包括，例如，UniProtKB-P60568(IL2_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|X00695|X00695.1人白介素-2(IL-2)基因和5’-翼侧区(基因核酸序列)；和ENA|V00564|V00564.1编码白介素-2(IL-2)的人 mRNA(mRNA/cDNA核酸序列)。
然而，分泌型IL-2的产生可能具有也刺激淋巴瘤和Treg细胞增殖并损害记忆T细胞形成的不良副作用(Zhang等，Nature Medicine, 11:1238-1243(2005))。此外，在接受肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗的患者中使用IL-2导致毒性增加(Heemskerk等，Human GeneTherapy,19:496-510(2008))。为避免这种可能性，除了或替代IL-2，核酸货物可以编码嵌合的γc细胞因子受体(CγCR)，如由与 IL-7Rα/CD127栓系的白介素-7(IL-7)构成的一种，其提供不依赖于外源性细胞因子的、细胞内在的、STAT5细胞因子信号(Hunter 等，Molecular Immunology,56:1-11(2013))。该设计是模块化的，因为IL-2Rβ/CD122胞质链可以交换为IL-7Rα/CD127的链，以增强 Shc活性。该构建体模拟人CD8+T细胞中的野生型IL-2信号传导 (Hunter等，Molecular Immunology,56:1-11(2013))，并且因此应该与IL-2mRNA类似地工作，而不会产生不需要的副作用。
另外或替代地，其他抗凋亡分子和细胞因子可用于在天然状态下保持细胞活力。示例性因子包括但不限于：
髓细胞白血病1(MCL-1)(例如，UniProtKB-Q07820 (MCL1_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|AF147742|AF147742.1 人髓细胞分化蛋白(MCL1)基因，启动子和完整cds(基因组核酸序列)；ENA|AF118124|AF118124.1人髓细胞白血病序列1(MCL1) mRNA，完整cds(mRNA/cDNA核酸序列))，其是抗凋亡因子；
IL-7(例如，UniProtKB-P13232(IL7_HUMAN)(氨基酸序列)； ENA|EF064721|EF064721.1人白介素7(IL7)基因，完整cds(基因组核酸序列)；ENA|J04156|J04156.1人白介素7(IL-7)mRNA，完整cds(mRNA/cDNA核酸序列)，其对于T细胞存活和发育是重要的，和
IL-15(例如，UniProtKB-P40933(IL15_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|X91233|X91233.1人IL15基因(基因组核酸序列)； ENA|U14407|U14407.1人白介素15(IL15)mRNA，完整cds (mRNA/cDNA核酸序列))，其促进T细胞和NK细胞存活(Opferman 等，Nature,426:671-676(2003)；Meazza等，Journal of Biomedicine& Biotechnology,861920,doi:10.1155/2011/861920(2011)；Michaud等， Journal of Immunotherapy,33:382-390(2010))。这些细胞因子mRNA 可以单独使用，也可以与BCL-XL、IL-2和/或CγCR mRNA组合使用。因此，在一些实施方式中，将编码MCL-1、IL-7、IL-15或其组合的mRNA递送至细胞。
c.抑制性CAR(iCAR)
在一些实施方式中，将T细胞疗法递送至已显示出治疗一些癌症的长期疗效和治愈潜力的CAR细胞，然而，其使用受到对非癌组织的损害的限制，这让人联想到供体淋巴细胞输注后的移植物抗宿主病。任何公开的组合物和方法可以与非特异性免疫抑制(例如，高剂量皮质类固醇疗法，其对T细胞发挥细胞抑制或细胞毒性作用以抑制免疫应答)、不可逆的T细胞消除(例如，所谓的自杀基因工程化策略)或其组合来组合。然而，在一些优选实施方式中，通过向CAR细胞中引入编码抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的构建体来减少脱靶效应。对肿瘤和脱靶组织具有特异性的T细胞可以仅通过使用引入T细胞中的抗原特异性iCAR以保护脱靶组织而限制于肿瘤(Fedorov等，Science Translational Medicine,5:215ra172(2013))。 iCAR可以包含表面抗原识别结构域和强力的急性抑制信号传导结构域组合，以限制T细胞的反应性，尽管激活受体(例如，CAR) 同时参与。在优选实施方式中，iCAR包含对抑制性抗原特异性的单链可变片段(scFv)，其通过跨膜区融合至免疫抑制性受体(例如，CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、 TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物等)的信号传导结构域，所述跨膜区在抗原识别后特异性抑制T细胞功能。一旦CAR细胞遇到不表达抑制性抗原的细胞(例如，癌细胞)，iCAR转导的T细胞可对 CAR的靶抗原产生CAR诱导的应答。在Fedorov等，Science Translational Medicine,5:215ra172(2013)中讨论了使用具有CTLA-4 或PD-1抑制性信号传导结构域的PSMA特异性的scFv的DNA iCAR。
设计考虑包括观察到PD-1是比CTLA-4更强的抑制剂，除非使用Y165G突变体，否则CTLA-4表现出胞质定位，并且iCAR表达水平很重要。
iCAR可以针对细胞类型特定的表面分子进行设计。在一些实施方式中，将iCAR设计为防止T细胞、NK细胞或其他免疫细胞对某些组织或细胞类型的反应性。
d.降低内源性抑制性信号传导
在一些实施方式中，使细胞与重编程细胞以防止一种或多种抗原表达的核酸货物接触。例如，在一些实施方式中，核酸货物是或编码干扰RNA，其阻止编码抗原如CTLA-4或PD-1的mRNA表达。该方法可用于制备通用供体细胞。用于改变同种异体抗原表达的 RNA可以单独使用或与导致靶细胞去分化的RNA组合使用。
尽管以上部分提供了利用抑制性信号传导结构域(例如，来自人工iCAR中的CTLA-4或PD-1)的组合物和方法，以限制中靶/脱肿瘤的细胞毒性，另外或替代地，可以通过降低CAR细胞中内源性抑制信号传导的表达来提高整体CAR细胞的对肿瘤效应子效率，从而使CAR细胞对敌对肿瘤微环境的抑制信号产生抗性。
CTLA-4和PD-1在激活和功能的不同阶段抑制T细胞。CTLA-4 调节T细胞对自身抗原的反应，因为敲除小鼠由于高活性的组织浸润性T细胞在没有特定抗原暴露的情况下自发地发展器官损伤 (Tivol等，Immunity,3:541-547(1995)；Waterhouse等，Science, 270:985-988(1995))。有趣的是，Treg细胞中CTLA-4的条件性敲除重演了全局敲除，表明其通常在Treg内发挥作用(Wing等，Science, 322:271-275(2008))。相比之下，PD-L1基因敲除小鼠具有自身免疫倾向，但不会自发产生正常器官的大量炎症细胞浸润，表明其主要生理功能是以可诱导的方式介导对正在进行的组织炎症的负反馈控制(Dong等，Immunity,20:327-336(2004))。事实上，根据“适应性抗性”假设，大多数肿瘤响应于IFNγ上调PD-L1；其是由效应 T细胞(包括CART细胞)释放的关键细胞因子(Greenwald等，Annu Rev Immunol,23:515-548(2005)；Carreno等，Annu Rev Immunol, 20:29-53(2002)；Chen等，TheJournal of Clinical Investigation, 125:3384-3391(2015)；Keir等，Annu RevImmunol,26:677-704(2008)； Pentcheva-Hoang等，Immunological Reviews,229:67-87(2009))。然后，PD-L1向T细胞递送抑制性信号，以减少其增殖、以及细胞因子和穿孔素产生(Butte等，Immunity,27:111-122(2007)；Chen等， Immunology,4:336-347(2004)；Park等，Blood,116:1291-1298(2010)； Wherry等，Nat Immunol,12:492-499(2011)；Zou等，Immunology, 8:467-477(2008))。此外，T细胞通过癌细胞上的B7-H1的反向信号传导诱导抗凋亡作用，其抵消Fas-L信号传导(Azuma等，Blood, 111:3635-3643(2008))。
鉴于癌细胞对B7-H1的上调及其表达与癌症进展和不良临床结果的关联(Flies等，Journal of Immunotherapy,30:251-260(2007)； Nishimura等，Immunity,11:141-151(1999)；Wang等，Curr Top Microbiol Immunol,344:245-267(2011))，拮抗PD-1和CTLA-4途径的抗体已在实体瘤，尤其是黑色素瘤中显示出显著的功效，两者的组合显示出甚至更高的活性。抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab) 主要通过Treg细胞的抑制，利用增加的肿瘤中T细胞浸润到和增加的肿瘤内CD8+：Treg比率来提高转移性黑色素瘤的总体存活率(Hamid等，J Transl Med,9:204(2011)；Ribas等，Clinical Cancer Research:AnOfficial Journal of the American Association for Cancer Research,15:6267-6276(2009)；Twyman-Saint等，Nature,520:373-377 (2015))。抗PD-1抗体纳武单抗(nivolumab)在转移性黑色素瘤中的总体响应率为30-40％(Robert等，The New EnglandJournal of Medicine,372:320-330(2015)；Topalian等，J Clin Oncol,32:1020-1030(2014))，在其他实体瘤(包括转移性肾癌、非小细胞肺癌和复发性霍奇金氏淋巴瘤)的早期临床试验中也有类似发现(Ansell等，The New England Journal of Medicine,372:311-319(2015)；Brahmer等，J Clin Oncol,28:3167-3175(2010)；Topalian等，The NewEngland Journal of Medicine,366:2443-2454(2012))。由于在小鼠黑色素瘤模型中对抗CTLA-4抗体的耐药性是由于PD-L181的上调，因而伊匹单抗和纳武单抗的组合在小鼠模型和人类患者中均显示出进一步的功效(Larkin等，The New England Journal ofMedicine,373:23-34 (2015)；Spranger等，J Immunother Cancer,2,3, doi:10.1186/2051-1426-2-3(2014)；Yu等，Clinical Cancer Research: An Official Journal of theAmerican Association for Cancer Research, 16:6019-6028(2010))。鉴于检查点抑制途径的重要性，据信 PD-1/CTLA-4抑制将释放制动，而嵌合抗原受体将推动油门踏板。重要的是，瞬时递送可用于仅瞬时释放制动，使得这些细胞不导致未来的自身免疫性疾病。
i.CRISPRi
为避免永久性基因组修饰和抑制性信号(如PD-1和CTLA-4) 的失活，可以利用dCAS9 CRISPRi系统(Larson等，Nat Protoc, 8:2180-2196(2013))。编码酶促失活的dCAS9-KRAB抑制结构域、融合蛋白和对抑制性信号转导蛋白(例如，CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物等)的sgRNA的核酸可以共同递送到CAR细胞中。可以使用一个或多个sgRNA。可以将sgRNA设计为靶向近端启动子区和编码区(非模板链)。替代的方法利用单组分Cpf1 CRISPR系统，其是较小的RNA，用于电穿孔和表达(Zetsche等，Cell, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038(2015))。任何前述RNA组分也可以由DNA表达构建体编码，如载体，例如质粒。因此，可以将RNA、 DNA或其组合作为核酸货物。
尽管使用伊匹单抗对CTLA-4的广泛抑制会导致自身免疫后遗症，但据信这些副作用将通过将损失限制于CAR细胞和mRNA递送的瞬时性质来减少。抑制性功能将会及时恢复。
ii.抑制性RNA
可递送至细胞的核酸货物可以是或编码功能性核酸或多肽，其被设计为靶向并减少或抑制抑制性信号传导分子mRNA的表达或翻译；或者降低或抑制抑制性信号传导分子蛋白的表达、降低活性或增加其降解。适宜的技术包括但不限于反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、三链体形成分子、RNAi等。在一些实施方式中，mRNA 编码减少抑制性信号传导的拮抗多肽。
在一些实施方式中，是或编码适用于减少或沉默CTLA-4、PD-1、 LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物等的表达的功能性RNA的货物可以单独或组合递送至细胞。
在一些实施方式中，货物是编码多肽的RNA或DNA，所述多肽降低生物利用度，或者作为CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、 BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物或者免疫抑制途径中的另一种蛋白的拮抗剂或其他负向调节剂或抑制剂。蛋白质可以是旁分泌的、内分泌的或自分泌的。其可以在细胞内调控细胞。其可以被分泌并调控表达细胞和/或其他(例如，相邻的) 细胞。其可以是调控表达细胞和/或其他细胞的跨膜蛋白。蛋白可以是融合蛋白，例如Ig融合蛋白。
e.促凋亡因子
还提供了用于激活和重激活凋亡途径的组合物和方法。在一些实施方式中，核酸是或编码激活、再激活或以其他方式增强或增加内在凋亡途径的因子或药剂。优选地，该因子激活、再激活或以其他方式增强癌症(例如，肿瘤)细胞中的内在凋亡途径，并且更优选地对癌细胞具有特异性或靶向癌细胞。
在一些实施方式中，在递送抗凋亡因子或促增殖因子(如上文讨论的或本领域公知的那些)后，细胞比未处理的细胞对诱导的凋亡更具抗性或敏感性更低。促凋亡因子可以在例如未处理的细胞中相对于处理的T细胞诱导或增加凋亡，并且优选地对癌细胞具有选择性。该方案导致针对癌细胞的两面攻击，一个是细胞的和一个是分子的。
通过靶向BCL-2家族成员，可以激活、重新激活或以其他方式增强内在的细胞凋亡途径。BCL-2家族成员根据功能和Bcl-2同源 (BH)结构域分为三个亚组：多结构域抗凋亡(例如，BCL-2或 BCL-XL)、多结构域促凋亡(例如，BAX和BAK)和仅BH3促凋亡(例如，BIM)蛋白。仅BH3亚组的成员，如BIM，充当位于整个细胞中的死亡哨兵，准备将细胞损伤的各种生理和病理信号传递到位于线粒体的核心凋亡机制(Danial等，Cell,116:205-219(2004))。
在一些实施方式中，促凋亡因子是促凋亡BH3模拟物。各种促凋亡BH3模拟物可以模拟BIM的天然促凋亡活性，并提供操纵凋亡途径多个点的能力。例如，BIM SAHB(BCL-2结构域的稳定化α螺旋)、ABT-737和ABT-199是促凋亡BH3模拟物，其通过对促凋亡仅BH3螺旋结构域与通过抗凋亡蛋白的BH1、BH2和BH3结构域汇合形成的疏水沟之间相互作用的结构研究来设计(Oltersdorf等， Nature,435:677-681(2005))。
D.靶细胞
在一些实施方式中，一种或多种特定细胞类型或组织是所公开复合物的靶标。靶细胞可以在体外、离体或在受试者中(即，在体内)。本文讨论的应用可以在体外、离体或体内进行。对于离体应用，可以在培养中收集或分离以及处理细胞。离体处理的细胞可以治疗有效量施用于有需要的受试者。对于体内应用，货物可以被动递送至靶细胞，例如，基于组合物的循环、局部递送等，或者可以主动靶向，例如，使用另外的细胞、组织、器官特异性靶向部分。因此，在一些实施方式中，将货物递送至靶细胞以排除其他细胞。在一些实施方式中，将货物递送至靶细胞和非靶细胞。
操作者可以根据所需的治疗和治疗方法以及核酸货物的预期效果来选择靶细胞。例如，当核酸货物旨在诱导细胞死亡时，靶细胞可以是癌细胞；当核酸货物旨在诱导基因组改变时，靶细胞可以是干细胞；当核酸货物编码嵌合抗原受体时，靶细胞可以是免疫细胞。
3E10 scFv此前已被证明能够以ENT2依赖性方式穿透到细胞核中，在ENT2缺陷细胞中核摄取效率大大受损(Hansen等，J Biol Chem 282,20790-20793(2007))。ENT2(SLC29A2)是一种不依赖钠的转运蛋白，其参与嘌呤和嘧啶核苷和核碱基的转运，且对硝基苄基巯基嘌呤核糖苷(NBMPR)的敏感性低于ENT1。
在一些实施方式中，靶细胞在其质膜、其核膜或者这两者上表达ENT2。ENT2的表达相对普遍，但在组织和细胞类型之间的丰度不同。其已在脑、心脏、胎盘、胸腺、胰腺、前列腺和肾脏中得到证实(Griffiths等，Biochem J,1997.328(Pt 3):p.739-43，Crawford 等，JBiol Chem,1998.273(9):p.5288-93)。相对于其他转运蛋白， ENT2在骨骼肌中具有最高mRNA表达之一(Baldwin等，Pflugers Arch,2004.447(5):p.735-43，Govindarajan等，Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol,2007.293(5):p.R1809-22)。因此，在一些实施方式中，靶细胞是脑、心脏、胎盘、胸腺、胰腺、前列腺、肾脏或骨骼肌。由于骨骼肌中ENT2的高表达，所公开的组合物和方法对于将核酸货物递送至这些细胞可能特别有效，和/或与表达较低水平 ENT2的其他细胞相比，可以将较高水平的货物输送到这些细胞。
下面讨论另外的、非限制性的示例性靶细胞。
1.祖细胞和干细胞
细胞可以是造血祖细胞或干细胞。在一些实施方式中，特别是那些与基因编辑和基因治疗相关的，靶细胞是CD34+造血干细胞。造血干细胞(HSC)，如CD34+细胞是多能干细胞，其产生包括红细胞在内的所有血细胞类型。
干细胞可以由本领域技术人员分离和富集。用于CD34+和其他细胞的这种分离和富集的方法是本领域公知的，并且公开在例如美国专利号4,965,204；4,714,680；5,061,620；5,643,741；5,677,136； 5,716,827；5,750,397和5,759,793中。如本文在富含造血祖细胞和干细胞的组合物的上下文中使用的，“富集”表示所需元素(例如，造血祖细胞和干细胞)的比例高于细胞天然来源中发现的比例。细胞的组合物可以比细胞的天然来源富集至少一个数量级，优选两个或三个数量级，更优选10、100、200或1000个数量级。
在人类中，CD34+细胞可以从脐带血、骨髓或者在通过内以足以引起造血干细胞从骨髓腔进入外周循环的量向供体皮下或静脉注射造血生长因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)进行细胞因子动员后从血液中回收。最初，骨髓细胞可以从任何适宜的骨髓来源获得，例如，胫骨、股骨、脊柱和其他骨腔。为了分离骨髓，可以使用适当的溶液冲洗骨，该溶液是平衡盐溶液，其方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，其与低浓度(通常约为5至25mM)折可接受的缓冲剂结合。常规缓冲剂包括Hepes、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。
可以通过正向和负向选择技术对细胞进行选择。可以使用与造血祖细胞或干细胞表面抗原(例如，CD34)结合的市售抗体，使用本领域技术人员公知的方法来选择细胞。例如，抗体可以与磁珠缀合且免疫原程序可以用于回收所需细胞类型。其他技术涉及使用荧光激活细胞分选(FACS)。存在于非白血病个体的造血系统内的祖细胞上的CD34抗原在被单克隆抗体My-10识别(即，表达CD34 抗原)的细胞群上表达，并且可用于分离干细胞用于骨髓移植。My-10 作为HB-8483保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)，其可作为抗HPCA 1商购获得。此外，可以利用来自人骨髓的分化和“专用”细胞的负向选择，以针对基本上任何所需的细胞标志物进行选择。例如，可以将祖细胞或干细胞(最优选CD34+细胞)表征为CD3-、CD7-、CD8-、CD10-、CD14-、CD15-、CD19-、CD20-、 CD33-、II类HLA+和Thy-1+的任一个。
一旦分离了祖细胞或干细胞，其可以通过在任何合适的培养基中生长来繁殖。例如，祖细胞或干细胞可以在来自基质细胞的条件培养基中生长，如可以从与分泌因子相关的骨髓或肝脏获得的那些，或者在包含支持干细胞增殖的细胞表面因子的培养基中生长。基质细胞可以使用适宜单克隆抗体去除造血细胞，以去除不需要的细胞。
分离的细胞与抗体和核酸货物复合物离体接触。可以将已向其递送货物的细胞称为修饰的细胞。可以简单地将复合物溶液添加到培养中的细胞。同步细胞在S期可能是所需的。用于同步培养细胞的方法，例如，通过双胸苷阻断，是本领域公知的(Zielke等，MethodsCell Biol.,8:107-121(1974))。
在向受试者施用之前，可以在培养物中维持或扩增修饰的细胞。取决于细胞类型，培养条件在本领域中通常是公知的。特别是对维持CD34+的条件进行了充分研究，并且有几种适宜的方法可供使用。离体多潜能造血细胞扩增的常用方法是在如白细胞介素3的早期作用细胞因子存在的情况下培养纯化的祖细胞或干细胞。还表明，在用于离体维持造血祖细胞的营养培养基中，包括血小板生成素 (TPO)、干细胞因子(SCF)和flt3配体(Flt-3L；即flt3基因产物的配体)的组合可用于在体外扩增原始(即，相对未分化的)人类造血祖细胞，并且这些细胞能够移植到SCID-hu小鼠中(Luens 等，1998,Blood 91:1206-1215)。在其他已知方法中，细胞可以在包含鼠催乳素样蛋白E(mPLP-E)或鼠催乳素样蛋白F(mPIP-F；统称为mPLP-E/IF)的营养培养基中离体维持(例如，几分钟、几小时或者3、6、9、13或更多天)(美国专利号6,261,841)。将意识到的是，也可以使用其他适宜的细胞培养和扩增方法。细胞也可以在无血清培养基中生长，如在美国专利号5,945,337中所描述的。
在另一个实施方式中，在使用本领域熟知的方法施用于受试者之前，使用白细胞介素和生长因子的特定组合将修饰的造血干细胞离体分化成CD4+细胞培养物。与分离的造血干细胞的原始群相比，细胞可以大量离体扩增，优选至少5倍，更优选至少10倍，甚至更优选至少20倍的细胞扩增。
在另一个实施方式中，细胞可以是去分化的体细胞。体细胞可以重新编程成为多能干细胞样细胞，这些细胞可以被诱导成为造血祖细胞。然后可以用如上文关于CD34+细胞所述的组合物处理造血祖细胞。可重编程的代表性体细胞包括但不限于成纤维细胞、脂肪细胞和肌肉细胞。已在小鼠体内成功开发了来自诱导干细胞样细胞的造血祖细胞(Hanna,J.等，Science,318:1920-1923(2007))。
为了从诱导干细胞样细胞产生造血祖细胞，从宿主中收获体细胞。在优选实施方式中，体细胞是自体成纤维细胞。培养细胞和用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子的载体转导。培养转导的细胞并筛选胚胎干细胞(ES)形态和ES细胞标志物，包括但不限于 AP、SSEA1和Nanog。培养转导的ES细胞和诱导以产生诱导的干细胞样细胞。然后筛选细胞的CD41和c-kit标志物(早期造血祖细胞标志物)以及骨髓和红细胞分化的标志物。
然后将修饰的造血干细胞或修饰的细胞(包括例如诱导的造血祖细胞)引入受试者中。可以使用各种方法来影响细胞的递送，并且最优选地包括通过输注进行静脉内施用以及直接贮库注射到骨膜、骨髓和/或皮下部位。
接受修饰细胞的受试者可以接受骨髓调理治疗以增强细胞的移植。可以在施用细胞之前使用放射或化学治疗处理接受体以增强植入。在施用后，细胞通常需要一段时间才能植入。实现造血干细胞或祖细胞的显著植入通常需要数周至数月。
可能不需要高百分比的修饰造血干细胞植入来达到显著的预防或治疗效果。据信，细胞在植入后随着时间扩增以增加修饰细胞的百分比。据信，在某些情况下，仅需要植入少量或小百分比的修饰造血干细胞来提供预防或治疗效果。
在优选实施方式中，待向受试者施用的细胞是自体的(例如，来源于受试者)或同基因的。
2.胚胎
在一些实施方式中，组合物和方法可用于在体外将货物递送至胚胎细胞。该方法通常包括在体外使胚胎与有效量的抗体-货物DNA 接触以改善货物转导到胚胎中。胚胎可以是单细胞受精卵，然而，还提供了在受精前和受精过程中对雄性和雌性配子，具有2、4、8或16个细胞的胚胎，不仅包括受精卵，还提供了桑椹胚和胚细胞的处理。在一些实施方式中，在体外受精期间或之后的第0-6天培养使胚胎与组合物接触。
接触可以是将组合物添加到浸浴胚胎的液体培养基中。例如，可以将组合物直接移液到胚胎培养基中，然后其被胚胎吸收。
3.免疫细胞
在一些实施方式中，靶细胞是一种或多种类型的免疫细胞。例如，可以利用不同类型的细胞或以其他方式靶向用于免疫调节和基于CAR的疗法。优选的靶向/工程化T细胞可能因肿瘤和过继疗法的目的而变化。效应T细胞通常是优选的，因为其分泌高水平的效应细胞因子，并且是体外肿瘤靶标的有效杀灭者(Barrett等，Annu Rev Med.,65:333–347(2014))。两个具有稳健的CAR介导的细胞毒性的互补淋巴细胞群是CD3-CD56+NK细胞和CD3+CD8+T细胞。将 CD8+T细胞与CD4+辅助T细胞一起使用导致抑制性T-reg细胞的存在增加并抑制CD8+T细胞的细胞毒性。由于重编程的CD8+T细胞是预先激活的使得其直接作用于肿瘤细胞而不需要在淋巴结中激活，因而CD4+T细胞的支持不是必需的。
此外，有证据表明，幼稚T细胞(Rosenberg,等，Adv.Cancer Res., 25:323–388(1977))、中央记忆T细胞(TCM细胞)(Berger,等， J.Clin.Invest.,118:294–305(2008))、Th17细胞(Paulos等，Sci.Transl. Med.,2:55–78(2010))和T记忆干细胞(Gattinoni等，Nat.Med., 17:1290–1297(2012))的输注在某些应用中可能都具有某些优势，例如，由于其高复制能力。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)由于其抗原特异性也具有某些优势，并且可以用于本文公开的递送策略。
虽然有时称为CAR细胞、CAR免疫细胞和CART细胞(或CAR T细胞)，将意识到的是，本文公开的CAR和其他递送策略也可以在其他细胞类型中，特别是不同类型的免疫细胞中进行，包括本文讨论的那些(例如，淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、B细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞等)并且在别处描述(参见，例如， Barrett等，Annu Rev Med.,65:333–347(2014))。
4.癌细胞和肿瘤
在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在此类实施方式中，提供了可能在癌症背景下有用的治疗方法，包括肿瘤疗法。下面的实例可能表明，DNA货物可以更普遍地递送到多个组织，而不仅限于肿瘤，而RNA递送可能对肿瘤组织更具选择性。因此，在一些实施方式中，当癌细胞是靶细胞时，货物可能由RNA(例如，单独的RNA) 构成。
可以递送至癌细胞的货物包括但不限于用于表达一种或多种促凋亡因子、免疫原性因子或肿瘤抑制因子的构建体；基因编辑组合物，靶向癌基因的抑制性核酸；以及本文和其他地方讨论的其他策略。在一些实施方式中，货物是编码促凋亡因子或免疫原性因子的mRNA，其增加对细胞的免疫应答。在其他实施方式中，货物是 siRNA，其降低癌基因或其他致癌转录物的表达。
在成熟动物中，大多数器官和组织中的细胞更新和细胞死亡之间通常保持平衡。体内各种类型成熟细胞有给定的寿命；随着这些细胞的死亡，通过各种类型干细胞的增殖和分化产生新的细胞。在正常情况下，新细胞的产生受到如此调控，以至于任何特定类型的细胞的数量保持恒定。不过，偶尔会出现不再对正常生长控制机制作出反应的细胞。这些细胞产生可以扩增到相当大的细胞克隆，从而产生肿瘤或赘生物。不能无限生长且不广泛侵入健康的周围组织的肿瘤是良性的。继续生长并逐渐侵袭的肿瘤是恶性的。术语癌症特指恶性肿瘤。除了不受控制的生长外，恶性肿瘤还表现出转移。在这个过程中，小簇癌细胞从肿瘤中脱落，侵入血管或淋巴管，并被带到其他组织，在那里其继续增殖。以这种方式，一个部位的原发性肿瘤可以在另一个部位产生继发性肿瘤。
本文所述的组合物和方法可用于通过延迟或抑制受试者中肿瘤的生长、减少肿瘤的生长或尺寸、抑制或减少肿瘤的转移和/或抑制或减轻与肿瘤发展或生长相关的症状来治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者。
可以治疗的恶性肿瘤在本文中根据肿瘤来源组织的胚胎起源进行分类。癌瘤是起源于内胚层或外胚层组织的肿瘤，如皮肤或内脏器官和腺体的上皮衬里。所公开的组合物在治疗癌瘤中特别有效。较少出现的肉瘤来源于中胚层结缔组织，如骨骼、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病作为单细胞增殖，而淋巴瘤倾向于作为肿瘤块生长。恶性肿瘤可能出现在身体的很多器官或组织上，从而形成癌症。
可用所提供的组合物和方法治疗的癌症类型包括但不限于癌症如血管癌，如多发性骨髓瘤、腺癌和肉瘤，包括骨癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌和子宫癌。在一些实施方式中，所公开的组合物用于同时治疗多种癌症类型。组合物还可以用于治疗多个部位的转移或肿瘤。
通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的组合物和方法。
1.一种组合物，其包含或由以下组成
(a)3E10单克隆抗体，其细胞穿透片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或者双体抗体；或其人源化形式或变体，和
(b)核酸货物，其包含编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
2.根据段落1所述的组合物，其中(a)包含：
(i)SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中任一个的CDR 与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中任一个的CDR的组合；
(ii)选自SEQ ID NO:15-23、42或43中任何的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQID NO:24-30、44或45中任何的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:1或2中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:7或8包含至少 85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；
(v)(iv)的人源化形式；或者
(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、46-48或50-52中任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11 或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合。
3.根据段落1或段落2所述的组合物，其中(a)包括与由ATCC 登录号PTA 2439杂交瘤产生的单克隆抗体3E10相同或不同的表位特异性。
4.根据段落1-3中任一项所述的组合物，其中(a)是重组抗体，所述重组抗体具有单克隆抗体3E10的互补位。
5.一种组合物，其包含
(a)结合蛋白，其包含
(i)SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中任一个的CDR 与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中任一个的CDR的组合；
(ii)选自SEQ ID NO:15-23、42或43中的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQ IDNO:24-30、44或45中的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:1或2中任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:7或8包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；
(v)(iv)的人源化形式；或者
(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、46-48或50-52中任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11 或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合，和
(b)核酸货物，其包含编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
6.根据段落1-5中任一项所述的组合物，其中(a)是双特异性的。
7.根据段落6所述的组合物，其中(a)靶向目标细胞类型。
8.根据段落1-7中任一项所述的组合物，其中(a)和(b)是非共价连接的。
9.根据段落1-8中任一项所述的组合物，其中(a)和(b)在复合物中。
10.根据段落1-9中任一项所述的组合物，其中(b)包含DNA、 RNA、PNA或其他修饰的核酸、或核酸类似物、或其组合。
11.根据段落1-10中任一项所述的组合物，其中(b)包含mRNA。
12.根据段落1-11中任一项所述的组合物，其中(b)包含载体。
13.根据段落12所述的组合物，其中所述载体包含与表达控制序列可操作地连接的编码目标多肽的核酸序列。
14.根据段落13所述的组合物，其中所述载体是质粒。
15.根据段落1-14中任一项所述的组合物，其中(b)包含编码 Cas核酸内切酶、gRNA或其组合的核酸。
16.根据段落1-15中任一项所述的组合物，其中(b)包含编码嵌合抗原受体多肽的核酸。
17.根据段落1-16中任一项所述的组合物，其中(b)包含功能性核酸。
18.根据段落1-17中任一项所述的组合物，其中(b)包含编码功能性核酸的核酸。
19.根据段落17或段落18所述的组合物，其中所述功能性核酸是反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、RNAi或外部指导序列。
20.根据段落1-19中任一项所述的组合物，其中(b)包含多个单一核酸分子。
21.根据段落1-19中任一项所述的组合物，其中(b)包含多个2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同核酸分子。
22.根据段落1-21中任一项所述的组合物，其中(b)包含或由长度为约1至25,000个核碱基之间的核酸分子组成。
23.根据段落1-22中任一项所述的组合物，其中(b)包含或由单链核酸、双链核酸或其组合组成。
24.根据段落1-23中任一项所述的组合物，其还包含载体DNA。
25.根据段落24所述的组合物，其中所述载体DNA是非编码 DNA。
26.根据段落24或段落25所述的组合物，其中(b)是由RNA 构成。
27.一种药物组合物，其包含段落1-26中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。
28.根据段落27所述的组合物，其还包含包封(a)和(b)的复合物的聚合物纳米颗粒。
29.根据段落28所述的组合物，其中靶向部分、细胞穿透肽或其组合与所述纳米颗粒结合、连接、缀合或以其他方式直接或间接附接。
30.一种向细胞递送核酸货物的方法，其包括将所述细胞与有效量的段落1-29中任一项所述的组合物接触。
31.根据段落30所述的方法，其中所述接触离体发生。
32.根据段落31所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞或T 细胞。
33.根据段落30-32中任一项所述的方法，其还包括向有需要的受试者施用所述细胞。
34.根据段落33所述的方法，其中所述细胞以有效量向所述受试者施用以治疗疾病或病症的一个或多个症状。
35.根据段落30所述的方法，其中在向有需要的受试者施用后，所述接触在体内发生。
36.根据段落33-35中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。
37.根据段落36所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传病症、癌症或者感染或感染性疾病。
38.根据段落36或段落37所述的方法，其中(b)是以有效量递送至所述受试者的细胞以减少所述受试者的所述疾病或病症的一个或多个症状。
39.一种制备段落1-29中任一项所述的组合物的方法，其包括在与细胞接触之前，将(a)和(b)在适宜温度下孵育和/或混合有效量的时间以形成(a)和(b)的复合物。
40.一种制备段落1-29中任一项所述的组合物的方法，其包括将(a)和(b)孵育和/或混合约1min至约30min、约10min至约 20min或约15min，任选地在室温或37摄氏度下。
41.段落1-40中任一项所述的组合物或方法，其中3E10单克隆抗体，其细胞穿透片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或者双体抗体；或其人源化形式或变体包含SEQID NO:92或93的核酸结合口袋，或与其核酸结合能力相同或提高的变体。
42.段落1-41中任一项所述的组合物或方法，其中对应于重链氨基酸序列或其CDR的D31或N31的氨基酸残基被R取代。
43.段落1-42中任一项所述的组合物或方法，其中对应于重链氨基酸序列或其CDR的D31或N31的氨基酸残基被L取代。
44.一种结合蛋白，其包含
(i)SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中任一个的CDR 的变体与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中任一个的CDR的组合；
(ii)第一重链CDR的变体与选自SEQ ID NO:15-23、42或43 的第二和第三重链CDR的组合与选自SEQ ID NO:24-30、44或45 的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:1或2中任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:7或8包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；
(v)(iv)的人源化形式；或者
(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、46-48或50-52中任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11 或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合，
其中对应于D31或N31的氨基酸残基被R或L取代。
45.根据段落44所述的结合蛋白，其包含SEQ ID NO:92或93 的核酸结合口袋，或与其核酸结合能力相同或提高的变体。
实施例
关于以下实验，除了其中注明为D31N变体以外(例如，实施例4)，使用标准3E10序列。标准3E10和D31N变体都作为全长抗体使用。
实施例1：3E10在1小时后增加PNA的细胞摄取
材料和方法
在室温下，将单独的PNA(1nmole)(MW＝9984.39；长度为 29个核苷酸)或者与3E10(0.75mg)复合的PNA混合5分钟。然后，将200,000个K562细胞添加到在无血清培养基中的3E10，或单独PNA的悬浮液中。添加另外的无血清培养基至终体积500ul。将细胞在37℃下孵育1hr后，将细胞离心并用PBS洗涤三次，随后用流式细胞术进行分析。通过连接到荧光染料四甲基罗丹明(TAMRA) 对PNA进行标记。
结果
结果显示在流式细胞术的点图中(图1A-1C)。对摄取％进行了量化(图1D)。
结果表明，当与3E10混合时，PNA的摄取增加。
实施例2：3E10在24小时后增加PNA的细胞摄取
材料和方法
在室温下，将单独的PNA(1nmole)(MW＝9984.39；长度为 29个核苷酸)或者与3E10(0.75mg)复合的PNA混合5分钟。然后，将200,000个K562细胞添加到在无血清培养基中的3E10，或单独PNA的悬浮液中。添加另外的无血清培养基至终体积500ul。将细胞在37℃下孵育24hr后，将细胞离心并用PBS洗涤三次，随后用流式细胞术进行分析。
将20,000个U2OS细胞接种在8孔室载玻片上，并使其贴壁24 小时。随后，用单独的PNA(1nmole)或与3E10(10uM)复合的 PNA处理细胞。在37℃下孵育24hr后，用PBS洗涤PNA或与3E10 混合的PNA，然后固定和核染色。随后通过流式细胞术对PNA摄取进行量化，并使用荧光显微镜进行成像。通过连接到荧光染料四甲基罗丹明(TAMRA)对PNA进行标记。
结果
结果显示在流式细胞术的点图中(图2A-2C)。对摄取％进行了量化(图2D)。
结果表明，当与3E10混合时，PNA的摄取增加。
荧光显微镜显示了核DNA(蓝色的DAPI)和PNA(红色的 Tamra)共定位，其被产生的明显的粉红色色调所证明。
实施例3：3E10在24小时后增加siRNA的细胞摄取
材料和方法
在室温下，将标记的siRNA(通过附接至荧光色亚酰胺，FAM) (1nmole)或者与3E10(0.75mg)复合的siRNA混合5分钟。然后，将200,000个K562细胞添加到在无血清培养基中的3E10，或单独siRNA的悬浮液中。添加另外的无血清培养基至终体积500ul。将细胞在37℃下孵育24hr后，将细胞离心并用PBS洗涤三次，随后用流式细胞术进行分析。
结果
结果显示在流式细胞术的点图中(图3A-3C)。对摄取％进行了量化(图3D)。
结果表明，当与3E10混合时，siRNA的细胞摄取增加。
实施例4：3E10在24小时后增加mRNA的细胞摄取
材料和方法
在室温下，将单独的标记mRNA(通过附接至cyanine 5，Cy5) (2ug)或者与3E10(2.5、5和10uM)复合的标记mRNA混合5 分钟。将3E10加mRNA或单独的mRNA的悬浮液添加到在无血清培养基中的200,000个K562细胞中。添加另外的无血清培养基至终体积500ul。将细胞在37℃下孵育24hr后，将细胞离心并用PBS 洗涤三次，随后用流式细胞术进行分析。
结果
结果显示在流式细胞术的点图中(图4A-4H)。对摄取％进行了量化(图4I)。
结果表明，当与3E10混合时，mRNA的细胞摄取增加。
值的注意的是，通过3E10的D31N变体递送mRNA导致最高水平的mRNA细胞摄取。
荧光显微镜显示了在相同Cy5标记的mRNA的翻译后在U2OS 细胞中功能性GFP的表达，所述mRNA编码绿色荧光蛋白(GFP) 报告体。
实施例5：3E10在1小时后增加mRNA的细胞摄取
材料和方法
在室温下，将标记mRNA(Cy5)(2ug)或者与3E10的D31N 变体(0.1-10uM)复合的标记mRNA混合5分钟。将3E10加mRNA 或单独的mRNA的悬浮液添加到在无血清培养基中的200,000个 K562细胞。添加另外的无血清培养基至终体积500ul。将细胞在37 ℃下孵育1hr后，将细胞离心并用PBS洗涤三次，随后用流式细胞术进行分析。
结果
结果显示在流式细胞术的点图中(图5A-5H)。对摄取％进行了量化(图5I)。
实施例6：3E10增加质粒DNA的细胞摄取
材料和方法
在室温下，将GFP报告质粒DNA(250ug)与3E10(10uM) 复合5分钟。将3E10加质粒DNA或单独的质粒DNA的悬浮液添加到在无血清培养基中的200,000个K562细胞。添加另外的无血清培养基至终体积500ul。将细胞在37℃下孵育24hr后，将细胞离心并用PBS洗涤三次。初始处理后72小时，对细胞进行成像并分析GFP 表达。
结果
结果表明，当3E10与质粒DNA组合时，GFP质粒被细胞强烈摄取，如通过绿色荧光所测量的，表明GFP构建体的摄取和功能性表达。当使用单独的质粒DNA时，没有看到摄取或绿色荧光(图6)。
实施例7：3E10在体内介导mRNA递送
材料和方法
在室温下将10ug编码GFP的mRNA与0.1mg 3E10混合15分钟。将与3E10复合的mRNA全身注射到BALB/c小鼠，所述小鼠携带测量为100mm3的EMT6肋腹部肿瘤。治疗后20小时，收获肿瘤并使用IVIS成像分析mRNA表达(GFP)。
结果
与游离注射的mRNA相比，3E10介导的mRNA递送导致肿瘤中GFP表达水平显著提高，游离注射的mRNA在肿瘤中没有产生任何GFP表达。在使用任何治疗的检查的任何正常组织中都没有可检测的GFP表达，包括肝脏、脾脏、心脏和肾脏。结果表明，mRNA 稳定递送到肿瘤中，具有功能性翻译和表达。
实施例8：3E10在体内介导siRNA递送
材料和方法
将40ug荧光标记的siRNA与增加剂量的3E10(0.25、0.5和1 mg)在室温下混合15分钟。将与3E10复合的siRNA全身注射到 BALB/c小鼠，所述小鼠携带测量为100mm3的EMT6肋腹部肿瘤。治疗后20小时，收获肿瘤并使用IVIS成像分析siRNA递送。
将40ug荧光标记的siRNA与1mg 3E10或0.1mg 3E10的D31N 变体在室温下混合15分钟。将与3E10复合的siRNA全身注射到 BALB/c小鼠，所述小鼠携带测量100mm3的EMT6肋腹部肿瘤。治疗后20小时，收获肿瘤并使用IVIS成像分析siRNA递送。
结果
如图7A所示，增加3E10的剂量导致siRNA在肿瘤中的更高累积。
如图7B所示，低10倍剂量的D31N 3E10导致与3E10相似水平的siRNA递送。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与所公开的发明所属领域的技术人员的通常理解具有相同含义。本文引用的出版物及其引用的材料通过引用具体并入。
实施例9：载体DNA增强至非肿瘤组织的mRNA
材料和方法
在室温下，将2ug荧光标记的mRNA与具有或不具有载体DNA (5ug)的20ug 3E10-D31N混合15分钟。在E15.5时将与3E10复合的mRNA注射到胎儿。处理后24-48小时，收获胎儿并使用IVIS 成像分析mRNA递送。
结果
在没有载体DNA的情况下，与mRNA复合的3E10-D31N在24 小时从胎儿中迅速清除。然而，载体DNA的添加导致48小时胎儿多个组织中可检测的mRNA信号。
上面的实施例可能表明，DNA货物递送可能更普遍地适用于多种组织，而不仅限于肿瘤，而RNA递送可能对肿瘤组织更具选择性。实施例10：与mRNA和载体DNA复合的3E10(D31N)导致持续水平的蛋质表达
材料和方法
在室温下，将10ug荧光素酶mRNA和10ug单链载体DNA(60 nts)与100ug 3E10(WT)或3E10(D31N)混合15分钟。将与3E10 复合的mRNA肌内(IM)注射到每只小鼠的右股四头肌中。在6天内监测荧光素酶表达。
结果
如图8中所示，施用与mRNA和载体DNA复合的3E10(D31N) 导致持续水平的荧光素酶表达，而与mRNA和载体DNA复合的3E10 (WT)未能产生任何高于背景的明显信号。
实施例11：IV注射的3E10的体内分布
研究了IV注射的3E10向肌肉的分布。用VivoTag680(Perkin Elmer)标记的200μg3E10((WT或D31N)静脉内注射小鼠。注射后四小时，收获肌肉并通过IVIS(Perkin Elmer)成像(图9A和图9B)。IVIS图像的量化表明，与3E10-WT相比，3E10-D31N向肌肉的分布更高(图9C)。
研究了3E10-D31N在组织中的剂量依赖性生物分布。向小鼠静脉注射100μg或200μg用VivoTag680(Perkin Elmer)标记的 3E10-D31N。注射后24小时，收获组织并通过IVIS(Perkin Elmer) 成像。组织分布的量化表明肌肉累积呈剂量依赖性的两倍增加，而包括肝脏的多个组织没有相称的增加(图10)。
3E10向肿瘤的分布。用VivoTag680(Perkin Elmer)标记的200 μg 3E10(WT或D31N)静脉内注射携带肋腹部同基因结肠肿瘤(CT26)的小鼠。注射后24小时，收获肿瘤并通过IVIS(Perkin Elmer)成像(图11A-图11B)。肿瘤分布的量化表明，与3E10-WT 相比，3E10-D31N在肿瘤中具有更高的累积(图11C)。
研究了与3E10非共价结合的ssDNA的分布。将200ug的3E10 (WT或D31N)(与40ug的标记ssDNA(IR680)混合)静脉内注射携带肋腹部同基因结肠肿瘤(CT26)的小鼠。注射后24小时，收获肿瘤并通过IVIS(Perkin Elmer)成像(图12A-图12B)。组织分布的量化表明，与3E10-WT相比，通过3E10-D31N递送ssDNA导致更高的肿瘤累积(图12D)。
实施例12：3E10介导的RIG-I配体的递送，以及RIG-I活性的刺激
材料和方法
以每孔50,000个细胞接种RIG-I报告细胞(HEK-Lucia RIG-I, Invivogen)，并用RIG-I配体(1ug)或与3E10-D31N(20ug)复合的配体处理。该测定使用具有荧光素酶报告基因的细胞系，该报告基因在干扰素诱导时被激活。
结果
在所有情况下，单独的RIG-I配体不刺激IFN-γ分泌。然而，用 3E10-D31N递送RIG配体刺激了高于对照的IFN-γ分泌，对于低分子量和高分子量(LMW和HMW)的poly(I:C)观察到的分泌量最高。
实施例13：3E10及其工程化变体的分子建模
WT重链scFv序列
E VQLVESGGGL VKPGGSRKLS CAASGFTFSD YGMHWVRQAP EKGLEWVAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTIS RDNAKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCARRGL LLDYWGQGTT LTVS(SEQ ID NO:92) 轻链scFv序列
D IVLTQSPASL AVSLGQRATI SCRASKSVST SSYSYMHWYQ QKPGQPPKLL IKYASYLESGVPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYY CQHSREFPWT FGGGTKLEIK RADAAPGGGG
SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:93)
3E10的分子建模(Pymol)揭示了推定的核酸结合口袋(NAB1) (图14A-14B)。CDR1的第31位残基天冬氨酸突变为天冬酰胺增加了该残基的阳离子电荷并增强了体内核酸结合和递送 (3E10-D31N)。
在CDR1的残基31处天冬氨酸突变为精氨酸(3E10-D31R)，进一步扩大了阳离子电荷，而突变为赖氨酸(3E10-D31K)改变了电荷方向(图14A)。
从分子建模预测的NAB1氨基酸在上面的重链和轻链序列中已加下划线。图14B是显示具有NAB1氨基酸残基的3E10-scFv的分子建模(Pymol)的图示，其中NAB1氨基酸残基以点状点示出。
所属领域的技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文描述的本发明的具体实施方式的很多等同方案。此类等同方案旨在被以下权利要求涵盖。
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Figure IDA0003624229840000841

Claims (45)

1.一种组合物，其包含或由以下组成
(a)3E10单克隆抗体，其细胞穿透片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或者双体抗体；或其人源化形式或变体，和
(b)核酸货物，其包含编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中(a)包含：
(i)SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中的任一个的CDR与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中的任一个的CDR的组合；
(ii)选自SEQ ID NO:15-23、42或43中的任何的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQID NO:24-30、44或45中的任何的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:1或2中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:7或8包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；
(v)(iv)的人源化形式；或者
(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、46-48或50-52中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中(a)包括与由ATCC登录号PTA 2439杂交瘤产生的单克隆抗体3E10相同或不同的表位特异性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中(a)是重组抗体，所述重组抗体具有单克隆抗体3E10的互补位。
5.一种组合物，其包含
(a)结合蛋白，其包含
(i)SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中的任一个的CDR与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中的任一个的CDR的组合；
(ii)选自SEQ ID NO:15-23、42或43的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQ ID NO:24-30、44或45的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:1或2中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:7或8包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；
(v)(iv)的人源化形式；或者
(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、46-48或50-52中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合，和
(b)核酸货物，其包含编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中(a)是双特异性的。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中(a)靶向目标细胞类型。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中(a)和(b)是非共价连接的。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中(a)和(b)在复合物中。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中(b)包含DNA、RNA、PNA或其他修饰的核酸、或核酸类似物、或其组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中(b)包含mRNA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中(b)包含载体。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述载体包含与表达控制序列可操作地连接的编码目标多肽的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述载体是质粒。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中(b)包含编码Cas核酸内切酶、gRNA或其组合的核酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中(b)包含编码嵌合抗原受体多肽的核酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中(b)包含功能性核酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中(b)包含编码功能性核酸的核酸。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的组合物，其中所述功能性核酸是反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、RNAi或外部指导序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中(b)包含多个单一核酸分子。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中(b)包含多个2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同核酸分子。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中(b)包含或由长度为约1至25,000个核碱基的核酸分子组成。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中(b)包含或由单链核酸、双链核酸或其组合组成。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的组合物，其还包含载体DNA。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述载体DNA是非编码DNA。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中(b)是由RNA构成。
27.一种药物组合物，其包含权利要求1-26中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，其还包含包封(a)和(b)的复合物的聚合物纳米颗粒。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中靶向部分、细胞穿透肽或其组合与所述纳米颗粒结合、连接、缀合或以其他方式直接或间接附接。
30.一种向细胞递送核酸货物的方法，其包括将所述细胞与有效量的权利要求1-29中任一项所述的组合物接触。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述接触离体发生。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞或T细胞。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其还包括向有需要的受试者施用所述细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞以有效量向所述受试者施用以治疗疾病或病症的一个或多个症状。
35.根据权利要求30所述的方法，其中在向有需要的受试者施用后，在体内发生所述接触。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传病症、癌症或者感染或感染性疾病。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中(b)是以有效量递送至所述受试者的细胞中以减少所述受试者的所述疾病或病症的一个或多个症状。
39.一种制备权利要求1-29中任一项所述的组合物的方法，其包括在与细胞接触之前，将(a)和(b)在适宜温度下孵育和/或混合有效量的时间以形成(a)和(b)的复合物。
40.一种制备权利要求1-29中任一项所述的组合物的方法，其包括将(a)和(b)孵育和/或混合约1min至约30min、约10min至约20min或约15min，任选地在室温或37摄氏度下。
41.权利要求1-40中任一项所述的组合物或方法，其中3E10单克隆抗体，其细胞穿透片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或者双体抗体；或其人源化形式或变体包含SEQID NO:92或93的核酸结合口袋，或与核酸结合能力相同或提高的其变体。
42.权利要求1-41中任一项所述的组合物或方法，其中对应于重链氨基酸序列或其CDR的D31或N31的氨基酸残基被R取代。
43.权利要求1-42中任一项所述的组合物或方法，其中对应于重链氨基酸序列或其CDR的D31或N31的氨基酸残基被L取代。
44.一种结合蛋白，其包含
(i)SEQ ID NO:1-6、12、13、46-48或50-52中的任一个的CDR的变体与SEQ ID NO:7-11、14或53-58中的任一个的CDR的组合；
(ii)第一重链CDR的变体与选自SEQ ID NO:15-23、42或43的第二和第三重链CDR的组合，与选自SEQ ID NO:24-30、44或45的第一、第二和第三轻链CDR组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:1或2中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:7或8包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；
(v)(iv)的人源化形式；或者
(vi)包括与SEQ ID NO:3-6、46-48或50-52中的任一个包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与包括与SEQ ID NO:9-11或53-58包含至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合，
其中对应于D31或N31的氨基酸残基被R或L取代。
45.根据权利要求44所述的结合蛋白，其包含SEQ ID NO:92或93的核酸结合口袋，或与核酸结合能力相同或提高的其变体。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020336992A1 (en) 2019-08-30 2022-04-14 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
IL301014A (en) * 2020-08-31 2023-05-01 Univ Yale Compositions and methods for administering nucleic acids to cells
CN117295753A (zh) * 2020-12-04 2023-12-26 基那奥生物公司 用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
WO2022187543A1 (en) * 2021-03-03 2022-09-09 Yale University Compositions and methods for treating skeletal muscle disease
WO2022246510A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 Transmab Pty Ltd Improved immunoglobulin i
AU2022302143A1 (en) * 2021-07-02 2024-01-18 Venugopalareddy BOMMIREDDYVENKATA Compositions and methods for treating cancers
WO2023283342A2 (en) * 2021-07-08 2023-01-12 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oligonucleotides and viral untranslated region (utr) for increasing expression of target genes and proteins
AU2022340804A1 (en) * 2021-08-31 2024-03-21 Gennao Bio, Inc. Compositions and methods for treating cancers
WO2023168401A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for treating disease

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4714680B1 (en) 1984-02-06 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Human stem cells
US4965204A (en) 1984-02-06 1990-10-23 The Johns Hopkins University Human stem cells and monoclonal antibodies
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
EP0215942B1 (en) 1985-03-15 1995-07-12 Antivirals Inc. Polynucleotide assay reagent and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4812397A (en) 1987-02-10 1989-03-14 The Regents Of The University Of California MAB-anti-DNA related to nephritis
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
WO1997032602A1 (en) 1996-03-08 1997-09-12 The Regents Of The University Of California DELIVERY SYSTEM USING mAb 3E10 AND MUTANTS AND/OR FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF
US5945337A (en) 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
US5786571A (en) 1997-05-09 1998-07-28 Lexmark International, Inc. Wrapped temperature sensing assembly
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
AU5886000A (en) 1999-06-25 2001-01-31 Northwestern University Compositions, kits, and methods for modulating survival and differentiation of multi-potential hematopoietic progenitor cells
US6919208B2 (en) 2000-05-22 2005-07-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for enhancing the delivery of a nucleic acid to a cell
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US7067617B2 (en) 2001-02-21 2006-06-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
US20040197892A1 (en) 2001-04-04 2004-10-07 Michael Moore Composition binding polypeptides
EP1421177A4 (en) 2001-08-20 2006-06-07 Scripps Research Inst ZINC FINGER FASTENING DOMAINS FOR CNN
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
EP1963499A4 (en) 2005-11-28 2009-04-08 Scripps Research Inst ZINCFINGER BINDING DOMAIN FOR TNN
US20070154989A1 (en) 2006-01-03 2007-07-05 The Scripps Research Institute Zinc finger domains specifically binding agc
CN1986792A (zh) * 2006-12-14 2007-06-27 方炳良 致病细胞的外来抗原标记方法
EP2109625A4 (en) 2007-01-22 2011-06-08 Univ California USE OF ANTIBODY CONJUGATES
ES2630057T3 (es) * 2009-06-15 2017-08-17 Valerion Therapeutics, Llc Métodos y composiciones para el tratamiento de la miopatía miotubular usando polipéptidos quiméricos que comprenden polipéptidos de miotubularina 1 (mtm1)
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
EP2694555B1 (en) * 2011-04-01 2019-07-10 Yale University Cell-penetrating anti-dna antibodies and uses thereof to inhibit dna repair
NZ616405A (en) 2011-04-08 2015-11-27 Baylor College Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
US9272043B2 (en) 2011-12-02 2016-03-01 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
WO2013138662A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 4S3 Bioscience, Inc. Antisense conjugates for decreasing expression of dmpk
US9283272B2 (en) 2012-03-30 2016-03-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Targeting intracellular target-binding determinants with intracellular antibodies
US9732146B2 (en) 2012-03-30 2017-08-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Antibody-mediated transduction of heat shock proteins into living cells
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
US20150290244A1 (en) 2012-07-13 2015-10-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of cart19 to deplete normal b cells to induce tolerance
EP2877213B1 (en) 2012-07-25 2020-12-02 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
EP2981551B1 (en) * 2013-02-20 2020-06-03 Valerion Therapeutics, LLC Methods and compositions for treatment of pompe disease
WO2014201378A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-pk il -2 and adoptive cell therapy
US10221250B2 (en) * 2014-01-13 2019-03-05 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties
WO2015134607A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Yale University Cell penetrating anti-guanosine antibody based therapy for cancers with ras mutations
MY191608A (en) 2014-04-07 2022-07-01 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
US10202591B2 (en) * 2014-06-13 2019-02-12 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of glycogen storage diseases and glycogen metabolism disorders
CA2995673A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties for treatment of cancer
EP3194450A1 (en) 2014-08-28 2017-07-26 Yale University Multivalent fragments of antibody 3e10 and methods of use thereof
WO2016081621A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Yale University Formulations for targeted release of agents under low ph conditions and methods of use thereof
WO2017015101A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
US20190119357A1 (en) * 2015-07-23 2019-04-25 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
EP3416976A2 (en) 2016-02-16 2018-12-26 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
MA45328A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
US11590242B2 (en) 2016-06-15 2023-02-28 Yale University Antibody-mediated autocatalytic, targeted delivery of nanocarriers to tumors
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
JP2020527355A (ja) 2017-07-17 2020-09-10 ニュークリアス・セラピューティクス・ピーティーワイ・リミテッド 結合タンパク質１
JP7395483B2 (ja) * 2017-10-16 2023-12-11 アーディジェン， エルエルシー ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子
WO2019152808A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Yale University Compositions and methods for inhibition of nuclear-penetrating antibodies
US20210054102A1 (en) 2018-02-01 2021-02-25 Yale University Compositions and methods for enhancing nuclear translocation
JP2022500009A (ja) 2018-08-31 2022-01-04 イェール ユニバーシティーYale University ドナーオリゴヌクレオチドベースの遺伝子編集を亢進するための組成物および方法
WO2020047353A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Yale University Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
FI20186112A1 (en) 2018-12-19 2020-06-20 Actim Oy SYSTEM AND METHOD FOR ANALYZING THE RESULT OF THE CARE SITE TEST
AU2020336992A1 (en) 2019-08-30 2022-04-14 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
CN111218458B (zh) 2020-02-27 2020-11-20 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230093460A1 (en) 2023-03-23
MX2022002342A (es) 2022-06-14
CA3149421A1 (en) 2021-03-04
US20230227583A1 (en) 2023-07-20
KR20220101073A (ko) 2022-07-19
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US20230093888A1 (en) 2023-03-30
IL290862A (en) 2022-04-01
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