KR20220101073A - 핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20220101073A
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엘리아스 퀴자노
피터 글라저
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예일 유니버시티
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Abstract

핵산 카고를 세포 내로 전달하기 위한 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다. 조성물은 전형적으로 (a) 3E10 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합, 세포 투과 단편; 1가, 2가 또는 다가 단일 사슬 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 인간화 형태 또는 그의 변이체, 및 (b) 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 기능성 핵산, 기능성 핵산을 코딩하는 핵산, 또는 그의 조합을 포함하는 핵산 카고를 포함한다. 요소 (a) 및 (b)는 일반적으로 비공유적으로 연결되어 복합체를 형성한다.

Description

핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 5일에 미국 특허상표청에 제출된 " 핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법 "이라는 제목의 미국 가출원 번호 62/944,281, "공여자 올리고뉴클레오티드 기반 유전자 편집을 향상시키기 위한 조성물 및 방법"이라는 명칭으로, 2019년8월 30일에 미국특허상표청에 제출된 국제 출원 번호 PCT/US2019/048953의 이익과 우선권을 주장한다. 미국 가출원 번호 62/944,281, 국제출원 번호 PCT/US2019/048953, 미국 가출원 번호 62/725,920, 국제출원 번호 PCT/US2019/048962, 미국 가출원 번호 62/725,852가 전체 내용이 참조로 각각 구체적으로 포함된다.
연방 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원에서 수여한 CA197574에 따라 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본발명에 대한 특정 권리를 가진다.
서열 목록에 대한 참조
2020년 8월 31일에 생성되고 크기가 154,701바이트인 "YU_7503_3_ST25"라는 텍스트 파일로 제출된 서열 목록은 37 C.F.R. ㄷ 1.52(e)(5)에 따라 참조로 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 시험관내, 생체외 및 생체내 유전자 요법 및 유전자 편집을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적용을 위한 핵산의 세포내 전달 분야에 관한 것이다.
유전자 요법은 암과 같은 유전적 또는 후천적 질병에 대한 유전자 대체 및 녹다운(knockdown)에서 백신 접종에 이르는 다양한 응용 분야를 포함한다. 바이러스 벡터와 합성 리포솜은 오늘날 많은 응용 분야에서 선택되는 매개체로 등장했지만, 둘 다 생산의 복잡성, 제한된 포장 용량, 불리한 면역학적 기능을 포함하여 유전자 치료 응용을 제한하고 예방 유전자 치료의 가능성을 억제하는 제한과 위험이 있다 (Seow and Wood, Mol Ther. 17(5): 767-777 (2009).
세포 및 조직에서 뉴클레오티드의 생체내 흡수 및 분포가 관찰되었다(Huang, et al., FEBS Lett., 558(1-3):69-73 (2004)). 또한, 예를 들어 Nyce, 등은. 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)가 흡입 시 내인성 계면활성제(폐 세포에 의해 생성된 지질)에 결합하고 추가 담체 지질이 필요 없이 폐 세포에 의해 흡수된다는 것을 보여주었다(Nyce, et al., Nature, 385:721-725). (1997)), 작은 핵산은 T24 방광암 조직 배양 세포로 흡수되지만(Ma, et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:415-426 (1998)), 개선된 핵산, 특히 생체 내 적용을 위한 형질감염 기술에 대한 요구가 여전히 존재한다. 여전히 사람에게 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터인 AAV9는 2003년에 발견되었다(Robbins, "Gene therapy pioneer says the field is behind - and that delivery technology is embarrassing," Stat, November, 2019).
본 발명의 목적은 핵산의 세포 내로의 개선된 전달을 위한 조성물 및 그의 사용 방법을 제공하는 것이다.
핵산 카고(cargo)를 세포 내로 전달하기 위한 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다. 조성물은 전형적으로 (a) 3E10 모노클로날 항체 또는 그의 세포 투과 단편; 1가, 2가 또는 다가 단일 사슬 가변 단편(scFv); 또는 디아바디(diabody); 또는 인간화 형태 또는 그의 변이체, 및 (b) 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 기능성 핵산, 기능성 핵산을 코딩하는 핵산, 또는 그의 조합을 포함하는 핵산 카고;를 포함한다. 요소 (a) 및 (b)는 일반적으로 비공유적으로 연결되어 복합체를 형성한다. DNA에 추가로 3E10은 RNA, PNA 및 기타 핵산에 결합하는 것으로 믿어진다.
예시적인 3E10 항체 및 이의 단편 및 융합 단백질은 (i) SEQ ID NO: 7-11, 14, 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된 SEQ ID NO: 1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR; (ii) SEQ ID NO: 24 내지 30, 44 및 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, SEQ ID NO: 15 내지 23, 42 및 43으로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR; (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태; (iv) SEQ ID NO:7 또는 8에 대해 적어도 85%의 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO:1 또는 2 중 어느 하나에 대해 적어도 85%의 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; (v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는 (vi) SEQ ID NO: 3-6, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 중쇄 SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85%의 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, SEQ ID NO: 3-6, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 를 가지는 것들을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체 및 그의 단편 및 융합 단백질은 아르기닌(R) 또는 리신(L)으로 치환된 3E10 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기를 갖는 CDR1 중쇄 변이체이다.
일부 실시예에서, 항체 및 그의 단편 및 융합 단백질은 SEQ ID NO: 92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 그의 변이체를, 핵산, 예컨대 DNA, RNA, 또는 이들의 조합에 결합되는 동일하거나 개선된 능력과 함께 포함한다.
또한, SEQ ID NOS:92 또는 93의 핵산 결합 포켓을 갖는 결합 단백질 자체, 또는 DNA, RNA 또는 이들의 조합과 같은 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 이의 변이체 뿐만 아니라 3E10 중쇄 아미노산 서열의 D31 또는 N31 또는 아르기닌(R) 또는 라이신(L)으로 치환된 이의 CDR1에 대응하는 아미노산 잔기를 갖는 CDR1 중쇄 변이체를 포함하는 결합 단백질 자체가 제공된다.
일부 실시예에서, 항체 또는 단편 또는 융합 단백질은 이중 특이적일 수 있고, 예를 들어 관심 있는 세포 유형, 조직 또는 기관을 표적으로 하는 결합 서열을 포함할 수 있다.
핵산 카고는 DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 변형된 핵산으로 구성될 수 있다. 핵산 카고는 일반적으로 기능성 핵산(예: 억제 RNA), mRNA 또는 벡터, 예를 들어 발현 벡터와 같은 기능성 카고이다. 벡터를 포함하는 핵산 카고는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 일반적으로 카고는 예를 들어 무작위로 전단되거나 단편화된 게놈 DNA가 아니다.
일부 실시예에서, 카고는 Cas 엔도뉴클레아제, gRNA, 또는 이들의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시예에서, 카고는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시예에서, 카고는 안티센스 분자, siRNA, 마이크로RNA(miRNA), 앱타머, 리보자임, RNAi, 또는 외부 가이드 서열과 같은 기능성 핵산, 또는 이를 코딩하는 핵산 구조물(nucleic acid construct)이다.
카고는 복수의 단일 핵산 분자, 또는 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 핵산 분자를 포함하거나 구성할 수 있다. 일부 실시예에서, 카고의 핵산 분자는 길이가 약 1 내지 약 25,000개의 핵염기 사이의 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진다. 카고는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 또는 이들의 조합일 수 있다.
복합체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시예에서, 복합체는 중합체성 나노입자에 캡슐화된다. 표적화 모이어티, 세포-침투 펩티드, 또는 이들의 조합은 나노입자와 회합되거나, 연결되거나, 접합되거나, 그렇지 않으면 나노입자에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
유효량의 복합체를 단독으로 또는 나노입자에 캡슐화된 세포와 접촉시켜 핵산 카고를 세포 내로 전달하는 방법이 또한 제공된다. 접촉은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 발생할 수 있다. 일부 실시예에서, 생체외 처리된 세포의 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 유효량으로 투여된다.
일부 실시예에서, 접촉은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한 후 생체내에서 발생한다. 대상은 유전적 장애 또는 암과 같은 질병 또는 장애를 가질 수 있다. 조성물은 예를 들어 주사 또는 주입에 의해 대상체에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키는 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
조성물 및 방법의 적용이 또한 제공되며, 이에 제한되지는 않지만 유전자 요법 및 CAR T 세포 제조/형성/요법이 포함된다.
도 1a-1c는 대조군(1a) 및 단독(1b) 및 1시간 동안 3E10과 혼합될 때(1c) PNA의 흡수를 보여주는 산점도이다. 도 1d는 도 1a-1c의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 2a-2c는 대조군(2a) 및 단독(2b) 및 24시간 동안 3E10과 혼합될 때(2c) PNA의 흡수를 보여주는 산점도이다. 도 2d는 도 2a-2c의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 3a-3c는 대조군(3a) 및 단독(3b) 및 24시간 동안 3E10과 혼합된 경우(3c) siRNA의 흡수를 보여주는 산점도이다. 도 3d는 도 3a-3c의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 4a-4H는 대조군(4a) 및 mRNA의 흡수를 단독으로(4b), 24시간 동안 3E10과 다양한 농도로 혼합할 때(4c-4h)를 보여주는 산점도이다. 도 4i는 도 4a-4h의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 5a-5h는 대조군(5a) 및 mRNA의 흡수를 나타내는 산점도이며 단독일 때(5b) 및 다양한 농도에서 3E10과 1시간 동안 혼합될 때(5c-5h). 도 5I는 도 5a-5h의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 6은 3E10과의 혼합물 72시간 후 및 세포와의 인큐베이션 24시간 후 GFP 리포터 플라스미드 DNA의 세포 발현을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 7a는 마우스에 전신 주사하기 전에 실온에서 15분 동안 증가하는 용량의 3E10(0.25, 0.5, 및 1 mg)과 혼합된 형광 표지된 siRNA의 종양에서의 축적을 보여주는 막대 그래프이다. 도 7B는 마우스에 전신 주사하기 전에 실온에서 15분 동안 1 mg 3E10 또는 0.1 mg D31N 변이체 3E10과 혼합된 형광 표지된 siRNA의 종양에서의 축적을 나타내는 막대 그래프이다. 모든 종양은 주사 후 24시간에 분석되었다.
도 8은 시간 경과에 따른 마우스 근육(IM)으로의 mRNA(생물발광(광자/초))의 3E10 매개 전달을 보여주는 선 그래프이다(IM 주사 후 일수).
도 9a 및 9b는 주사 후 24시간에 IVIS(Perkin Elmer)에 의해 영상화된 IV 주사된 3E10-D31N의 근육으로의 대조군(도 9a) 및 분포(도 9b)를 보여주는 이미지이다. 도 9C는 IVIS 이미지에서 형광을 정량화한 막대 그래프이다.
도 10은 VivoTag680으로 표지된 3E10-D31N을 마우스(Perkin Elmer)에 100㎍ 또는 200㎍ 정맥내 주사한 후 24시간 후 조직으로의 3E10-D31N의 용량 의존적 생체 분포의 IVIS 이미지에서 형광을 정량화한 막대 그래프이다.
도 11a 및 11b는 주사 24시간 후에 IVIS(Perkin Elmer)에 의해 영상화된, 대조군(도 11a) 및 동계 결장 종양(CT26)에 대한 IV 주사된 3E10-D31N의 분포(도 11b)를 보여주는 이미지이다. 도 11c는 IVIS 이미지에서 형광성을 정량화한 막대 그래프이다.
도 12a, 12b 및 12c는 대조군(도 12a) 및 IV 주사된 나체 단일 가닥 DNA(ssDNA)(도 12b) 및 3E10-D31N + ssDNA(도 12c) 동계 결장 종양(CT26)의 분포를 나타내는 이미지이다. 주입 24시간 후 IVIS(Perkin Elmer)에 의해 이미지화되었다. 도 12d는 IVIS 이미지에서 형광성을 정량화한 막대 그래프이다.
도 13은 RIG-I의 3E10-매개 전달 및 자극을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14a는 3E10의 분자 모델링, 이의 추정 핵산 결합 포켓(NAB1), 및 그 안의 아미노산 돌연변이에 의해 유도된 예측된 구조적 변화의 예시이다. 도 14b는 점으로 강조된 NAB1 아미노산 잔기를 갖는 3E10-scFv(Pymol)의 분자 모델링의 예시이다.
I. 정의
본 출원에 사용된 용어 "단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 scFv가 항원 결합을 위해(즉, 단일 폴리펩티드 사슬의 VH 및 VL이 서로 결합하여 Fv를 형성하기 위함) 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 링커에 의해 결합된 단일 폴리펩티드 사슬의 경쇄 가변영역(VL) 및 중쇄가변 영역(VH)을 포함하는 단쇄 가변 절편을 의미한다. VL 및 VH는 모 항체로부터 유래될 수 있거나 화학적으로 또는 재조합적으로 합성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가변 영역"은 면역글로불린의 이러한 도메인을 항체에 의해 광범위하게 공유되는 도메인(예: 항체 Fc 도메인)과 구별하도록 의도된다. 가변 영역은 그 잔기가 항원 결합을 담당하는 "초가변 영역"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉, 일반적으로 경쇄 가변성 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 대략 잔기 27-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3), Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service , National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"의 잔기(즉, 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3), Chothia 및 Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917 ).
본원에 사용된 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 표적 항원에 결합하는 천연 또는 합성 항체를 지칭한다. 이 용어는 다클론 및 단클론 항체를 포함한다. 온전한 면역글로불린 분자 외에도 "항체"라는 용어에는 이러한 면역글로불린 분자의 결합 단백질, 단편 및 중합체, 그리고 표적 항원에 결합하는 면역글로불린 분자의 인간 또는 인간화 버전도 포함된다.
본원에 사용된 용어 "세포 투과 항체"는 살아있는 포유동물 세포의 세포질 및/또는 핵으로 수송되는 면역글로불린 단백질, 그의 단편, 변이체, 또는 이에 기초한 융합 단백질을 지칭한다. "세포 투과성 항-DNA 항체"는 DNA(예: 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 DNA)에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 담체 또는 접합체의 도움 없이 세포의 세포질 내로 수송된다. 다른 구체예에서, 항체는 세포 투과성 펩티드와 같은 세포 투과성 모이어티(moiety)에 접합된다. 일부 실시양태에서, 세포-침투 항체는 담체 또는 접합체와 함께 또는 없이 핵에서 수송된다.
온전한 면역글로불린 분자 외에도 "항체"라는 용어에는 면역글로불린 분자의 단편, 결합 단백질 및 중합체, 인간 또는 인간화 항체와 같은 면역글로불린의 하나 이상의 종, 클래스 또는 하위 클래스의 서열을 포함하는 키메라 항체가 포함된다. 및 적어도 DNA에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 이디오타입을 포함하는 재조합 단백질. 항체는 본원에 기재된 시험관내 검정을 사용하여 원하는 활성에 대해 시험하거나 유사한 방법에 의해 시험할 수 있고, 그 후 생체내 치료 활성은 공지된 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"(variant)는 참조(reference) 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 다르지만 필수적인 특성을 유지하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 다른 참조 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다르다. 일반적으로, 참조 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 차이가 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 변형(예: 치환, 부가 및/또는 결실)에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화된 것일 수도 있고 아닐 수도 있다. 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드의 구조에서 변형 및 변화가 이루어질 수 있으며, 여전히 폴리펩티드와 유사한 특성(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)을 갖는 분자를 얻을 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 활성의 현저한 손실 없이 서열의 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 그 폴리펩티드의 생물학적 기능적 활성을 정의하는 것은 폴리펩티드의 상호작용 능력과 성질이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩티드 서열에서 이루어질 수 있고 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
이러한 변경을 수행할 때 아미노산의 수치요법 지수를 고려할 수 있다. 폴리펩티드에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다. 특정 아미노산은 유사한 수치요법 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 대체될 수 있으며 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 생성하는 것으로 알려져 있다. 각 아미노산은 소수성과 전하 특성을 기반으로 수치요법 지수를 지정했다. 해당 지수는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성된 폴리펩티드의 2차 구조를 결정하고, 이는 차례로 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 및 보조인자와 같은 다른 분자와 폴리펩티드의 상호작용을 정의하는 것으로 믿어진다. 아미노산은 유사한 수치요법 지수(hydropathic index)를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 얻을 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화에 있어서, 수치요법 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내가 특히 바람직하고, ±0.5 이내가 더욱 특히 바람직하다.
유사 아미노산의 치환은 또한 친수성에 기초하여 이루어질 수 있으며, 특히 이에 의해 생성된 생물학적 기능적 등가 폴리펩티드 또는 펩티드가 면역학적 실시양태에서 사용하도록 의도되는 경우에 그러하다. 다음 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르트산염(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루탐닌(+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5 ± 1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적으로 등가물, 특히 면역학적으로 등가인 폴리펩티드를 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내가 특히 바람직하며, ±0.5 이내가 더욱 특히 바람직하다.
위에서 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 다양한 전술한 특성을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며 (오지지널 잔기: 예시적인 치환): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) 및 (Val: Ile , 레우). 따라서, 본 개시내용의 실시양태는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 기능적 또는 생물학적 등가물을 고려한다. 특히, 폴리펩티드들의 실시예들은 관심(interest) 폴리펩티드에 대한 약, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가진 변이체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "퍼센트(%) 서열 동일성"이라는 용어는 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위한 간격을 도입한 후, 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원의 목적을 위해, 주어진 뉴클레오티드 또는 주어진 핵산 서열 D(대안적으로 주어진 서열 D에 대한, 그와 함께 또는 그에 대한 특정 % 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 서열 C로서 표현될 수 있음)에 대한 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성은 다음과 같이 계산된다:
분수 W/Z의 100배,
여기서 W는 해당 프로그램의 C 및 D 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 일치로 스코어링된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, 여기서 Z는 D의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 수이다. 서열 C의 길이가 서열 D의 길이와 같지 않은 경우, C에서 D에 대한 % 서열 동일성은 D에서 C에 대한 % 서열 동일성과 동일하지 않을 것이다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 항체가 그의 동족 항원(예를 들어, DNA)에 결합하지만 다른 항원에는 유의하게 결합하지 않는 것을 지칭한다. 이러한 조건 하에서 표적에 대한 항체의 특이적 결합은 표적에 대한 항체의 특이성을 위해 선택되는 항체를 필요로 한다. 다양한 면역분석 형식을 사용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석법은 단백질과 특이적으로 면역반응성인 모노클로날 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다. 특정 면역반응성을 결정하는데 사용될 수 있는 면역분석 형식 및 조건에 대한 설명은 예를 들어 Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York을 참조. 바람직하게는, 항체는 두번째 분자를 가진 약 105 mol-1 보다 더 큰 친화도 상수(Ka) (예: 106 mol-1, 107 mol-1, 108 mol-1, 109 mol-1, 1010 mol-1, 1011 mol-1, 1012 mol-1 또는 그 이상)로 항원에 "특이적으로 결합"한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "MAb"는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 즉, 집단 내의 개별 항체는 소규모에 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 항체 분자의 하위 집합이다.
본 명세서에 사용된 용어 "피험자"는 투여의 대상이 되는 모든 개인을 의미한다. 대상은 척추동물, 예를 들어 포유동물일 수 있다. 따라서 주체는 인간일 수 있다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 사용된 조성물의 양이 질병 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 개선하기에 충분한 양임을 의미한다. 그러한 개선은 반드시 제거가 아닌 감소 또는 변경만을 필요로 한다. 정확한 투여량은 피험자 의존적 변수(예: 연령, 면역 체계 건강 등), 투여중의 약제의 투여 경로 및 약동학 뿐만 아니라 치료되는 질병 또는 장애와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질을 지칭한다. 즉, 물질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 그것이 포함된 약학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 활성 성분이 조합된 제제 내의 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 불활성 성분을 지칭한다. 담체 또는 부형제는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 불리한 부작용을 최소화하기 위해 자연적으로 선택될 것이며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다"는 질병, 병리학적 상태 또는 장애를 치료, 개선, 안정화 또는 예방할 의도로 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 위한 치료를 포함하며, 원인 치료, 즉 관련 질병의 원인, 병적 상태 또는 장애의 제거를 위한 치료도 포함한다. 무질서. 또한 이 용어에는 완화적 치료, 즉 질병, 병적 상태 또는 장애의 치유가 아니라 증상의 완화를 위해 고안된 치료; 예방 치료, 즉 관련 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하는 치료; 및 지지적 치료, 즉 관련 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 지향하는 또 다른 특정 요법을 보완하기 위해 사용되는 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 "표적화 모이어티"(targeting moiety)는 입자 또는 분자를 선택된 세포 또는 조직 유형의 수용체 부위로 안내할 수 있거나, 부착 분자로 작용하거나, 다른 분자를 커플링 또는 부착시키는 작용을 할 수 있는 물질이다. 본원에 사용된 "직접"(direct)은 분자가 선택된 세포 또는 조직 유형에 우선적으로 부착되도록 하는 것을 의미한다. 이것은 아래에서 논의되는 바와 같이 세포 물질, 분자 또는 약물을 지시하는 데 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "감소시키다"는 활성, 반응, 상태, 질병, 또는 기타 생물학적 파라미터를 감소시키는 것을 의미한다. 여기에는 활동, 반응, 상태 또는 질병의 완전한 절제가 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 이것은 또한 예를 들어 네이티브 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 상태 또는 질병의 10% 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "융합 단백질"은 하나의 폴리펩티드의 아미노 말단과 다른 폴리펩티드의 카르복실 말단 사이에 형성된 펩티드 결합을 통해 2개 이상의 폴리펩티드가 연결되어 형성된 폴리펩티드를 의미한다. 융합 단백질은 구성 폴리펩티드의 화학적 커플링에 의해 형성될 수 있거나 단일 인접 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열로부터 단일 폴리펩티드로 발현될 수 있다. 단일 사슬 융합 단백질은 단일 인접 폴리펩티드 골격을 갖는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 분자 생물학의 통상적인 기술을 사용하여 프레임 내의 두 유전자를 단일 핵산 서열로 결합한 다음 융합 단백질이 생성되는 조건 하에 적절한 숙주 세포에서 핵산을 발현하도록 제조할 수 있다.
본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로서 역할을 하도록 의도되며, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다.
"약"이라는 용어의 사용은 대략적인 범위에서 명시된 값보다 높거나 낮은 값을 설명하기 위한 것이다. +/- 10%; 다른 실시예에서 값은 약 100% 범위에서 명시된 값보다 높거나 낮은 값의 범위일 수 있다. +/- 5%; 다른 실시예에서 값은 약 100% 범위에서 명시된 값보다 높거나 낮은 값의 범위일 수 있다. +/- 2%; 다른 실시예에서 값은 약 100% 범위에서 명시된 값보다 높거나 낮은 값의 범위일 수 있다. +/- 1%. 앞의 범위는 문맥에 따라 명확하게 하기 위한 것이며 더 이상의 제한은 암시되지 않는다.
여기에 설명된 모든 방법은 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예: "~와 같은")의 사용은 단지 실시예를 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 실시예의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
Ⅱ. 조성물
3E10 항체가 원형질막을 가로질러 세포질과 핵으로 핵산을 전달하는 데 도움이 된다는 것이 발견되었다. 따라서, 핵산 작제물의 전달을 향상시키기 위해 3E10을 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 전형적으로 유효량의 3E10 항체는 세포 내로의 전달이 바람직한 핵산과 접촉된다. 일반적으로 접촉은 3E10과 핵산 화물이 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 발생한다. 복합체는 핵산 화물이 세포 내로 전달되기에 충분한 시간 동안 세포와 접촉된다. 카고는 항체가 없는 상태에서 세포가 핵산 카고와 접촉한 경우보다 더 많은 양, 더 높은 품질(예: 더 온전한, 기능적 등), 또는 더 빠른 속도 또는 이들의 조합으로 축적될 수 있다. 항체가 전달 수단의 역할을 하기 때문에 전달 시스템은 일반적으로 비바이러스성이다.
A. 3E10 항체
본원에서 일반적으로 "3E10" 또는 "3E10 항체"로 지칭되지만, 항원-결합 단편, 변이체, 및 scFv, di-scFv, tr-scFv 및 기타와 같은 융합 단백질을 포함하는 단편 및 결합 단백질이 단일 사슬 가변 단편, 및 본원에 개시된 다른 세포-관통 핵산 수송 분자는 또한 본원에 개시된 조성물 및 방법에서의 사용을 위해 명시적으로 제공되는 문구에 의해 포함된다. 따라서, 항체 및 기타 결합 단백질은 또한 본원에서 세포 투과성으로 지칭된다.
바람직한 실시양태에서, 3E10 항체는 담체 또는 접합체의 도움 없이 세포질 및/또는 세포의 핵으로 수송된다. 예를 들어, 세포독성 효과 없이 포유동물 세포의 핵으로 생체내 수송되는 모노클로날 항체 3E10 및 그의 활성 단편은 Richard Weisbart의 미국 특허 번호 4,812,397 및 7,189,396에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 Rad51에 결합 및/또는 억제할 수 있다. 예를 들어 Turchick, et al., Nucleic Acids Res., 45(20): 11782-11799 (2017), WO 2020/047344, 및 WO 2020/047353에 기재된 항체를 참조하십시오. 여기에서 전체적으로.
조성물 및 방법에 사용될 수 있는 항체는 임의의 부류의 전체 면역글로불린(즉, 온전한 항체), 이의 단편, 및 항체의 적어도 항원 결합 가변 도메인을 함유하는 합성 단백질을 포함한다. 가변 도메인은 항체마다 서열이 다르며 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나 가변성은 일반적으로 항체의 가변 영역을 통해 고르게 분포되지 않는다. 이는 일반적으로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분을 프레임워크(FR)라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 주로 베타 시트 구성을 채택하고, 루프 연결을 형성하고 일부 경우에는 베타 시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 의해 밀접하게 함께 유지되고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다. 따라서, 항체는 일반적으로 DNA 결합을 유지하고/하거나 DNA 복구를 방해하는 데 필요한 적어도 CDR을 포함한다.
3E10 항체는 전형적으로 모노클로날 3E10, 또는 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프(들)에 결합하는 이의 변이체, 유도체, 단편, 융합체 또는 인간화 형태이다.
단일클론 항체 3E10을 생산하는 하이브리도마 세포주의 부다페스트 조약 조건에 따른 기탁이 2000년 9월 6일에 접수되었으며, ATCC(American Type Culture Collection), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209에 의해 수락되었다. , USA, 특허 기탁 번호 PTA-2439.
따라서, 항체는 ATCC No. PTA 2439 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프 특이성을 가질 수 있다. 항체는 모노클로날 항체 3E10의 파라토프를 가질 수 있다. 항체는 3E10의 단일 사슬 가변 단편, 또는 이의 변이체, 예를 들어 보존적 변이체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 3E10(3E10 Fv)의 단일 사슬 가변 단편, 또는 그의 변이체일 수 있다.
1. 3E10 시퀀스
모노클로날 항체 3E10의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 3E10 중쇄 및 경쇄의 서열이 아래에 제공되며, 여기서 단일 밑줄은 Kabat 시스템에 따라 확인된 CDR 영역을 나타내고, SEQ ID NO: 12-14에서 기울임꼴은 가변 영역을 나타내고 이중 밑줄은 신호 펩티드를 나타낸다. IMGT 시스템에 따른 CDR도 제공된다.
일부 실시양태에서, 3E10의 중쇄 가변 영역은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:1; Zack, et al., Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994); GenBank: L16981.1 - Mouse Ig rearranged L-chain gene, partial cds; and GenBank: AAA65679.1 - immunoglobulin heavy chain, partial [Mus musculus]).
일부 실시양태에서, 3E10 중쇄는 다음과 같이 표현된다.
MGWSCIILFLVATATGVHS EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS D YGMH WVRQAPEKGLEWVA YISSGSSTIYYADTVKG RFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAR RGLLLDY WGQGTTLTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (3E10 WT Heavy Chain; SEQ ID NO:12).
돌연변이를 야생형 서열에 통합하는 3E10 항체의 변이체는 또한 예를 들어 문헌(Zack, et al., J. Immunol., 157(5):2082-8 (1996))에 개시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 3E10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 위치 31은 핵을 침투하고 DNA에 결합하는 항체 및 이의 단편의 능력에 영향을 미치는 것으로 결정되었다(SEQ ID NOS: 1, 2 및 13에서 굵게 표시됨). CDR1의 D31N 돌연변이(SEQ ID NOS:2 및 13에서 굵게 표시됨)는 핵을 관통하여 원래의 항체보다 훨씬 더 큰 효율로 DNA에 결합한다(Zack, et al., Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994), Weisbart, et al., J. Autoimmun., 11, 539-546(1998); Weisbart, Int. J. Oncol., 25, 1867-1873(2004)). 일부 실시양태에서, 항체는 D31N 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 3E10의 중쇄 가변 영역의 바람직한 변이체에 대한 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS N YGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:2).
일부 실시양태에서, 3E10 중쇄는 다음과 같이 표현된다:
MGWSCIILFLVATATGVHS EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS N YGMH WVRQAPEKGLEWVA YISSGSSTIYYADTVKG RFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAR RGLLLDY WGQGTTLTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (3E10 D31N Variant Heavy Chain; SEQ ID NO:13).
일부 실시양태에서, SEQ ID NO 1 또는 2의 C-말단 세린은 3E10 중쇄 가변 영역에서 부재하거나, 예를 들어 알라닌으로 치환된다.
Kabat에 의해 확인된 상보성 결정 영역(CDR)은 위에 밑줄로 표시되며 CDR H1.1(오리지널 서열): DYGMH(SEQ ID NO: 15); CDR H1.2(D31N 돌연변이 포함): NYGMH(SEQ ID NO: 16); CDR H2.1: YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO: 17); CDR H3.1: RGLLLDY(SEQ ID NO: 18).
Kabat CDR H2.1의 변이체에는 YISSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 19) 및 YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 42)가 포함된다.
추가로, 또는 대안적으로, 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)은 IMGT 시스템에 따라 정의될 수 있다. IMGT 시스템에 의해 확인된 상보성 결정 영역(CDR)에는 CDR H1.3(오리지널 서열): GFTFSDYG(SEQ ID NO: 20); CDR H1.4(D31N 돌연변이 포함): GFTFSNYG(SEQ ID NO: 21); CDR H2.2: ISSGSSTI(SEQ ID NO: 22) 및 변이체 ISSSSSTI(SEQ ID NO: 43); CDR H3.2: ARRGLLLDY(SEQ ID NO: 23).
b. 3E10 경쇄
일부 실시양태에서, 3E10의 경쇄 가변 영역은 다음과 같다:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 7).
3E10의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 또한 다음과 같을 수 있다:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFHLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLELK(SEQ ID NO: 8).
일부 실시양태에서, 3E10 경쇄는 다음과 같이 표현된다:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (3E10 WT 경쇄; SEQ ID NO : 14)
다른 3E10 경쇄 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Zack, et al., J. Immunol., 15;154(4):1987-94 (1995); GenBank: L16981.1 - Mouse Ig rearranged L-chain gene, partial cds; GenBank: AAA65681.1 - immunoglobulin light chain, partial [Mus musculus])..
Kabat에 의해 확인된 상보성 결정 영역(CDR)은 밑줄로 표시되며, CDR L1.1: RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO: 24); CDR L2.1: YASYLES(SEQ ID NO: 25); CDR L3.1: QHSREFPWT(SEQ ID NO: 26).
Kabat CDR L1.1의 변이체에는 RASKSVSTSSYSYLA(SEQ ID NO: 27) 및 RASKTVSTSSYSYMH(SEQ ID NO: 44)가 포함된다.
Kabat CDR L2.1의 변이체는 YASYLQS(SEQ ID NO: 28)이다.
추가로, 또는 대안적으로, 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)은 IMGT 시스템에 따라 정의될 수 있다. IMGT 시스템에 의해 확인된 상보성 결정 영역(CDR)은 CDR L1.2 KSVSTSSYSY(SEQ ID NO: 29) 및 변이체 KTVSTSSYSY(SEQ ID NO: 45)를 포함하고; CDR L2.2: YAS(SEQ ID NO: 30); CDR L3.2: QHSREFPWT(SEQ ID NO: 26).
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 7 또는 8의 서열의 C-말단 말단은 3E10 경쇄 가변 영역에 아르기닌을 추가로 포함한다.
2. 인간화 3E10
일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "가져오기" 잔기라고 하며, 이는 일반적으로 "가져오기" 가변 도메인에서 가져온다. 항체 인간화 기술은 일반적으로 항체 분자의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 DNA 서열을 조작하기 위해 재조합 DNA 기술의 사용을 포함한다.
예시적인 3E10 인간화 서열은 WO 2015/106290, WO 2016/033324, WO 2019/018426, 및 WO/2019/018428에서 논의되고 하기에 제공된다.
a. 인간화 3E10 중쇄 가변 영역
일부 실시양태에서, 인간화 3E10 중쇄 가변 도메인은 다음을 포함한다:
EVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (hVH1, SEQ ID NO:3), 또는
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSS (hVH2, SEQ ID NO:4), 또는
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTLVTVSS (hVH3, SEQ ID NO:5), 또는
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEYVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKRGLLLDYWGQGTLVTVSS (hVH4, SEQ ID NO:6), 또는
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 2, 6 및 10, SEQ ID NO:46), 또는
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 3, 7 및 11, SEQ ID NO:47), 또는
EVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 4, 8 및 12, SEQ ID NO:48), 또는
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 13, 16 및 19, SEQ ID NO:50), 또는
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 14 및 17, SEQ ID NO:51), 또는
EVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 15 및 18, SEQ ID NO:52).
b. 인간화 3E10 경쇄 가변 영역
일부 실시양태에서, 인간화 3E10 경쇄 가변 도메인은 다음을 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYLAWYQQKPEKAPKLLIKYASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGAGTKLELK (hVL1, SEQ ID NO:9), 또는
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPEKAPKLLIKYASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHSREFPWTFGAGTKLELK (hVL2, SEQ ID NO:10), 또는
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (hVL3, SEQ ID NO:11)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIK (변이체 2, 3 및 4, SEQ ID NO:53)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 6, 7 및 8, SEQ ID NO:54)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 10, 11 and 12, SEQ ID NO:55)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIK (변이체 13, 14 및 15, SEQ ID NO:56)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 16, 17 및 18, SEQ ID NO:57)
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변형 19, SEQ ID NO:58)
c. 세포 침투 및 핵 국소화
개시된 조성물 및 방법은 전형적으로 세포, 및 임의로 핵을 침투하는 능력을 유지하는 항체를 이용한다.
자가항체에 의한 세포 내재화의 기전은 다양하다. 일부는 정전기적 상호작용 또는 FcR-매개 세포내이입을 통해 세포로 흡수되는 반면, 다른 일부는 세포 표면 미오신 또는 칼레티쿨린과의 결합에 기초한 메커니즘을 활용한 후 세포내이입이 뒤따른다(Ying-Chyi et al., Eur J Immunol 38, 3178-3190 (2008) , Yanase et al., J Clin Invest 100, 25-31 (1997)). 3E10은 Fc-독립적 메커니즘으로 세포를 침투하지만(Fc가 없는 3E10 단편이 세포를 침투하는 능력에 의해 입증됨) 뉴클레오사이드 수송체 ENT2의 존재를 포함한다(Weisbart et al., Sci Rep 5:12022. doi: 10.1038/srep12022). (2015), Zack et al., J Immunol 157, 2082-2088 (1996), Hansen et al., J Biol Chem 282, 20790-20793 (2007)). 따라서, 일부 실시양태에서, 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 항체는 Fc-비의존적 기전으로 세포를 침투하지만 뉴클레오시드 수송체 ENT2의 존재를 수반하는 항체이다.
DNA에 결합하는 능력을 방해하는 3E10의 돌연변이는 항체를 핵 침투가 불가능하게 만들 수 있다. 따라서, 전형적으로 항체의 개시된 변이체 및 인간화 형태는 핵산, 특히 DNA에 결합하는 능력을 유지한다. 또한, 3E10 scFv는 이전에 ENT2-결핍 세포에서 손상된 흡수 효율과 함께 ENT2 의존적 방식으로 살아있는 세포 및 핵산으로 침투할 수 있는 것으로 나타났다(Hansen, et al., J. Biol. Chem. 282, 20790 -20793(2007)). 따라서, 일부 실시양태에서, 항체의 개시된 변이체 및 인간화 형태는 ENT-의존성, 바람직하게는 ENT2-의존성 방식으로 세포 핵으로 침투하는 능력을 유지한다.
WO 2019/152806 및 WO 2019/152808에서 논의된 바와 같이 일부 인간화 3E10 변이체는 오리지널의 뮤린 3E10(D31N) di-scFv보다 세포 핵을 더 효율적으로 침투하는 것으로 밝혀진 반면, 다른 변이체는 핵 침투 능력을 상실한 것으로 밝혀졌다. 특히, 변이체 10 및 13은 뮤린 항체에 비해 핵을 매우 잘 침투하였다.
인간화 3E10 VL에서 잠재적인 이분자 핵 국소화 신호(NLS)가 확인되었으며 다음 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
RASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY(SEQ ID NO: 88);
RASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY(SEQ ID NO: 89); 또는
RVTITCRASKSSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKL(SEQ ID NO: 90).
예시적인 합의 NLS는 (X)RASKTVSTSSYSYMHWYQKPGQPPKLL(X)KY(여기서, (X)는 임의의 잔기이지만, 우선적으로는 염기성 잔기(R 또는 K)(SEQ ID NO: 91) 또는 SEQ ID NO:53에 대한 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성를 갖는 이의 변이체를 포함하거나 다음을 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 특히 핵 도입이 중요한 경우, 개시된 항체는 서열 88-91 중 어느 하나의 서열, 또는 세포의 핵 내로 전위될 수 있는 그의 단편 및 변이체 (예를 들어, SEQ ID NO: 88-91 중 어느 하나와 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 아미노산 서열 동일성)을 포함할 수 있다.
NLS의 존재는 3E10이 핵 수입 경로를 통해 핵 봉투를 넘을 수 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, NLS는 수입 경로의 하나 이상의 구성원과 상호작용함으로써 수입을 개선한다. 따라서, 일부 실시양태에서, NLS는 임포틴-β, 임포틴-β/임포틴-α 이종이량체, 또는 이들의 조합에 결합할 수 있다.
3. 핵산 결합
개시된 조성물 및 방법은 전형적으로 DNA, RNA, 또는 이들의 조합과 같은 핵산에 결합하는 능력을 유지하는 항체를 이용한다.
아래의 예는 3E10 및 추가 3E10 변이체의 분자 모델링을 보여준다. 3E10(Pymol)의 분자 모델링은 추정되는 핵산 결합 포켓(NAB1)을 나타내었고(예를 들어, 도 14a 및 14b 참조), 아래 서열에 밑줄을 긋는 것으로 예시되어 있다.
WT HEAVY CHAIN scFv SEQUENCE
E VQLVESGGGL VKPGGSRKLS CAASGFTFSD YGMHWVRQAP EKGLEWVAYI SSGSSTIYYA DTVKGRFTIS RDNAKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCARRGL LLDYWGQGTT LTVS (SEQ ID NO:92)
LIGHT CHAIN scFv SEQUENCE
D IVLTQSPASL AVSLGQRATI SCRASKSVST SSYSYMHWYQ QKPGQPPKLL IKYASYLESG VPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYY CQHSREFPWT FGGGTKLEIK RADAAPGGGG SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:93)
일부 실시양태에서, 개시된 항체는 밑줄 친 NAB1 서열의 일부 또는 전부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 핵산에 결합하는 변경된 능력을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NAB1에서의 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입 및/또는 결실)는 DNA, RNA 또는 이들의 조합과 같은 핵산에 대한 항체의 결합을 개선한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 보존적 치환이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 NAB1 포켓의 양이온 전하를 증가시킨다.
본원에서 논의되고 예시된 바와 같이, CDR1의 잔기 31에서 아스파라긴으로의 아스파라긴산의 돌연변이는 이 잔기의 양이온 전하를 증가시키고 생체내(3E10-D31N) 핵산 결합 및 전달을 향상시켰다.
추가의 예시적인 변이체는 CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아르기닌으로의 돌연변이(3E10-D31R)를 포함하며, 이는 모델링이 양이온 전하의 확장을 나타내거나, 모델링이 전하 배향의 변화를 나타내는 라이신(3E10-D31K)을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3E10 결합 단백질은 D31R 또는 D31K 치환을 포함한다.
3E10 D31 또는 N31에 상응하는 잔기를 갖는 본원에 개시된 모든 서열은 그 내부에 D31R 또는 D31K 또는 N31R 또는 N31K 치환으로 명시적으로 개시되어 있다.
3E10(Pymol)의 분자 모델링은 추정되는 핵산 결합 포켓(NAB1)을 드러냈다(도 14a-14b). CDR1의 잔기 31에서 아스파라긴으로의 아스파라긴산의 돌연변이는 이 잔기의 양이온 전하를 증가시키고 생체내 핵산 결합 및 전달을 향상시켰다(3E10-D31N).
아르기닌(3E10-D31R)으로의 CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 돌연변이는 양이온 전하를 추가로 확장한 반면, 라이신(3E10-D31K)으로의 돌연변이는 전하 배향을 변경시켰다(도 14a).
분자 모델링에서 예측된 NAB1 아미노산은 위의 중쇄 및 경쇄 서열에 밑줄이 그어져 있다. 도 14b는 점으로 예시된 NAB1 아미노산 잔기를 갖는 3E10-scFv(Pymol)의 분자 모델링을 보여주는 예시이다.
4. 단편, 변이체 및 융합 단백질
항-DNA 항체는 3E10의 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열 또는 그의 인간화 형태에 대하여, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 항체 단편 또는 융합 단백질로 구성될 수 있다(예를 들어, SEQ ID NOS:1-11 또는 46-58, 또는 SEQ ID NOS:12-14 중 임의의 중쇄 및/또는 경쇄).
항-DNA 항체는 3E10의 CDR(s)의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 인간화 형태에 대하여, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 하나 또는 하나 이상의 CDR(s)를 포함하는 항체 단편 또는 융합 단백질로 구성될 수 있다(예를 들어, SEQ ID NOS:1-11 또는 46-58, 또는 SEQ ID NOS:12-14 또는 SEQ ID NOS:15-30 또는 42-45 중 CDR(s)).
2개의 아미노산 서열의 동일성 백분율의 결정은 BLAST 단백질 비교에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 바람직한 가변 도메인의 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두를 포함한다.
바람직하게는, 항체는 각각의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나와 조합된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나를 포함한다.
3E10에 대한 경쇄 가변 서열의 예측된 상보성 결정 영역(CDR)이 위에 제공되어 있다.
또한, 예를 들어, Zack, et al., Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994), GenBank Accession number AAA65679.1. Zach, et al., J. Immunol. 154 (4), 1987-1994 (1995) 및 GenBank: L16982.1 - Mouse Ig reagrranged H-chain gene, partial cds를 참조하라.
따라서, 일부 실시양태에서, 세포 투과 항체는 SEQ ID NO: 1 또는 2, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 12 또는 13의 중쇄 영역; 또는 SEQ ID NO 7 또는 8, 또는 SEQ ID NO 14의 경쇄 영역과 조합된 그의 인간화 형태; 또는 그의 인간화 형태의 CDRs을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 투과 항체는 SEQ ID NO 9, 10 또는 11과 조합된 SEQ ID NO 3, 4, 5 또는 6의 CDR, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 함유한다. 일부 실시양태에서, 세포 투과 항체는 SEQ ID NO 53-58 중 어느 하나와 조합하여 SEQ ID NO 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 함유한다.
3E10 D31 또는 N31에 상응하는 잔기를 갖는 본원에 개시된 모든 서열은 내부에 D31R 또는 D31K 또는 N31R 또는 N31K 치환과 함께 명시적으로 개시되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3E10 결합 단백질은 3E10 중쇄의 잔기 31에 상응하는 아미노산 잔기가 아르기닌(R) 또는 리신(K)으로 치환된 임의의 상기 또는 하기 서열의 변이체이다.
또한 생물학적 활성을 갖는 항체 단편이 포함된다. 단편의 활성이 비변형 항체 또는 항체와 비교하여 현저하게 변경되거나 손상되지 않는 한, 다른 서열에 부착되었는지 여부에 관계없이 단편에는 삽입, 결실, 치환 또는 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 기타 선택된 변형이 포함된다. 파편.
기술은 또한 본 개시내용의 항원성 단백질에 특이적인 단일쇄 항체의 생산을 위해 조정될 수 있다. 단일 사슬 항체의 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단일 사슬 항체는 짧은 펩티드 링커를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합함으로써 생성될 수 있으며, 이로써 단일 분자 상의 항원 결합 부위를 재구성할 수 있다. 하나의 가변 도메인의 C-말단이 15 내지 25개의 아미노산 펩티드 또는 링커를 통해 다른 가변 도메인의 N-말단에 연결된 단일 사슬 항체 가변 단편(scFvs)은 항원 결합을 현저하게 방해하지 않고 개발되었다. 바인딩의 특이성. 링커는 중쇄와 경쇄가 적절한 형태 배향으로 함께 결합하도록 선택된다.
항-DNA 항체는 치료 가능성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포 투과성 항-DNA 항체는 표적 세포의 세포질 및/또는 핵에서 제2 치료 표적에 특이적인 또 다른 항체에 접합된다. 예를 들어, 세포 투과성 항-DNA 항체는 3E10 Fv 및 제2 치료 표적에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 가변 단편을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포-침투 항-DNA 항체는 3E10으로부터의 제1 중쇄 및 제1 경쇄 및 제2 치료 표적에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 갖는 이중특이적 항체이다.
3E10으로부터의 제1 중쇄 및 제1 경쇄 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 갖는 이중특이적 항체 및 기타 결합 단백질은 Weisbart, et al., Mol. Cancer Ther., 11(10):2169-73 (2012), and Weisbart, et al., Int. J. Oncology, 25:1113-8 (2004), 및 미국 특허 출원 번호 2013/0266570에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 참고로 구체적으로 포함된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적은 표적 세포 유형, 조직, 기관 등에 특이적이다. 따라서 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 표적 세포 유형, 조직, 기관에 복합체를 표적화하는 표적화 모이어티로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 예를 들어 바람직한 세포 유형 상에서 발현된 수용체 또는 리간드를 표적화함으로써 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, T 세포 또는 임의의 다른 바람직한 세포 유형을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 흉선, 비장 또는 암 세포를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 특히 생체내 T 세포 표적화를 위한 것, 예를 들어 CAR T 세포의 생체내 생산을 위한 면역 세포 또는 T 세포 마커, 예컨대 CD3, CD7, 또는 CD8이 표적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD8 항체 및 항-CD3 Fab 단편은 모두 생체내에서 T 세포를 표적화하는 데 사용되었다(Pfeiffer, et al., EMBO Mol Med., 10(11) (2018). pii: e9158. doi: 10.15252)/emmm.201809158., Smith, et al., Nat Nanotechnol., 12(8):813-820 (2017). doi: 10.1038/nnano.2017.57). 따라서, 일부 실시양태에서, 3E10 항체 또는 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 CD3, CD7, CD8, 또는 다른 면역 세포(예를 들어, T 세포) 마커, 또는 흉선, 비장 또는 간과 같은 특정 조직의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체 부분이다.
2가 단일 사슬 가변 단편(di-scFv)은 2개의 scFv를 연결하여 조작할 수 있다. 이것은 2개의 VH 및 2개의 VL 영역이 있는 단일 펩티드 사슬을 생성하여 탠덤 scFv를 생성함으로써 수행할 수 있다. ScFv는 또한 두 개의 가변 영역이 함께 접히기에는 너무 짧은(약 5개의 아미노산) 링커 펩티드로 설계되어 scFv가 이량체화되도록 할 수 있다. 이 유형을 디아바디라고 한다. 디아바디는 해리 상수가 해당 scFv보다 최대 40배 낮은 것으로 나타났다. 더 짧은 링커(1개 또는 2개의 아미노산)는 삼량체(트리바디 또는 트리바디)를 형성한다. 테트라바디도 생산되었다. 그들은 디아바디보다 표적에 훨씬 더 높은 친화력을 보이다. 일부 실시양태에서, 항-DNA 항체는 3E10의 2개 이상의 연결된 단일 사슬 가변 단편 (예를 들어, 3E10 di-scFv, 3E10 tri-scFv), 또는 그의 보존적 변이체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-DNA 항체는 디아바디 또는 트리아바디(예를 들어, 3E10 디아바디, 3E10 트리아바디)이다. 3E10의 단일 및 2개 이상의 연결된 단일 사슬 가변 단편에 대한 서열은 WO 2017/218825 및 WO 2016/033321에 제공되어 있다.
항체의 기능은 항체 또는 이의 단편을 치료제와 커플링함으로써 향상될 수 있다. 치료제와 항체 또는 단편의 이러한 커플링은 면역접합체를 제조하거나 융합 단백질을 제조함으로써, 또는 항체 또는 단편을 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는 DNA 또는 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 핵산에 연결함으로써 달성될 수 있다.
재조합 융합 단백질은 융합 유전자의 유전 공학을 통해 생성된 단백질이다. 이것은 일반적으로 첫 번째 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에서 정지 코돈을 제거한 다음 결찰 또는 중첩 확장 PCR을 통해 프레임 내 두 번째 단백질의 cDNA 서열을 추가하는 것을 포함한다. 그런 다음 DNA 시퀀스는 단일 단백질로 세포에 의해 표현된다. 단백질은 두 오리지널 단백질의 전체 서열을 포함하거나 둘 중 일부만 포함하도록 조작될 수 있다. 두 개체가 단백질인 경우 링커(또는 "스페이서") 펩티드도 추가되어 단백질이 독립적으로 접히고 예상대로 행동할 가능성이 더 높아진다.
일부 실시양태에서, 세포 투과 항체는 그의 반감기를 변경하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 항체가 더 긴 기간 동안 순환계 또는 치료 부위에 존재하도록 항체의 반감기를 증가시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 순환계 또는 장기간 동안 치료될 위치에서 항체의 역가를 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-DNA 항체의 반감기는 잠재적인 부작용을 감소시키기 위해 감소된다. 3E10Fv와 같은 항체 단편은 전체 크기 항체보다 반감기가 더 짧을 수 있다. 반감기를 변경하는 다른 방법이 알려져 있으며 설명된 방법에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체는 예를 들어 Xtend™ 항체 반감기 연장 기술(Xencor, Monrovia, CA)을 사용하여 반감기를 연장하는 Fc 변이체로 조작될 수 있다.
a. 링커
본원에 사용된 용어 "링커"는 펩티드 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 펩티드 링커는 가변 영역에 의한 에피토프의 결합을 방해하지 않는 한 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 글리신 및/또는 세린 아미노산 잔기를 포함한다. 한 가변 도메인의 C-말단이 일반적으로 15 내지 25개 아미노산 펩티드 또는 링커를 통해 다른 가변 도메인의 N-말단에 연결된 1가 단일 사슬 항체 가변 단편(scFv). 링커는 중쇄와 경쇄가 적절한 형태 배향으로 함께 결합하도록 선택된다. 디아바디, 트리아바디 등의 링커는 일반적으로 위에서 논의한 바와 같이 1가 scFv의 링커보다 더 짧은 링커를 포함한다. 2가, 3가 및 기타 다가 scFv는 일반적으로 3개 이상의 링커를 포함한다. 링커는 길이 및/또는 아미노산 조성이 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 링커의 수, 링커(들)의 조성, 및 링커(들)의 길이는 당업계에 공지된 바와 같이 scFv의 원하는 원자가에 기초하여 결정될 수 있다. 링커(들)는 2가, 3가 및 기타 다가 scFv의 형성을 허용하거나 유도할 수 있다.
예를 들어, 링커는 4-8개의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GQSSRSS(SEQ ID NO 31)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 15-20개의 아미노산, 예를 들어 18개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GQSSRSSSGGGSSGGGGS(SEQ ID NO 32)를 포함한다. 다른 유연한 링커는 다음의 아미노산 서열이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다: Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO:33), Ala-Ser, Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:34), (Gly4-Ser)2 (SEQ ID NO:35) 및 (Gly4-Ser)4 (SEQ ID NO:36), 및 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO:37).
다른 예시적인 링커는 예를 들어, RADAAPGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:59) 및 ASTKGPSVFPLAPLESSGS(SEQ ID NO:60)를 포함한다.
b. 예시적인 항-DNA scFv 서열
모노-, 디- 및 트리-scFv를 포함하는 예시적인 뮤린 3E10 scFv 서열은 WO 2016/033321, WO 2017/218825, WO 2019/018426, 및 WO/2019/018428에 개시되어 있고, 하기에 제공된다. 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포 투과 항체는 예시적인 scFv, 및 그의 단편 및 변이체를 포함한다.
scFv 3E10(D31N)의 아미노산 서열은,
AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO:38)이다.
SEQ ID NO:38에 대한 scFv 단백질 도메인의 주석
- AGIH 서열은 용해도를 증가시킨다(SEQ ID NO:38의 아미노산 1-4).
- Vk 가변 영역(SEQ ID NO:38의 아미노산 5-115)
- 경쇄 CH1의 초기(6 aa)(SEQ ID NO:38의 아미노산 116-121)
- (GGGGS)3(SEQ ID NO:37) 링커(SEQ ID NO:38의 아미노산 122-136)
- VH 가변 영역(SEQ ID NO : 38의 아미노산 137-252)
- Myc 태그(아미노산 253-268 SEQ ID NO:38)
- His 6 태그(SEQ ID NO : 38의 아미노산 269-274)
3E10 di-scFv(D31N)의 아미노산 서열
Di-scFv 3E10(D31N)은 3E10의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 2배를 포함하고 중쇄의 31번 위치에 있는 아스파르트산이 아스파라긴으로 돌연변이된 이중-단쇄 가변 단편이다.
di-scFv 3E10(D31N)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO:39).
SEQ ID NO:39에 대한 di-scFv 단백질 도메인의 주석
- AGIH 서열은 용해도를 증가시킨다(SEQ ID NO:39의 아미노산 1-4)
- Vk 가변 영역(SEQ ID NO:39의 아미노산 5-115)
- 경쇄 CH1의 초기(6aa)(SEQ ID NO:39의 아미노산 116-121)
- (GGGGS)3(SEQ ID NO:37) 링커(SEQ ID NO:39의 아미노산 122-136)
- VH 가변 영역(SEQ ID NO : 39의 아미노산 137-252)
- 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산으로 구성된 Fv 단편 사이의 링커(SEQ ID NO : 39의 아미노산 253-265)
- 스위블 시퀀스(SEQ ID NO:39의 아미노산 266-271)
- Vk 가변 영역(SEQ ID NO:39의 아미노산 272-382)
- 경쇄 CH1의 초기(6aa)(SEQ ID NO:39의 아미노산 383-388)
- (GGGGS)3(SEQ ID NO:37) 링커(SEQ ID NO:39의 아미노산 389-403)
- VH 가변 영역(SEQ ID NO:39의 아미노산 404-519)
- Myc 태그(SEQ ID NO : 39의 아미노산 520-535)
- His 6 태그(SEQ ID NO:39의 아미노산 536-541)
tri-scFv의 아미노산 서열
Tri-scFv 3E10(D31N)은 310E의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 3배를 포함하고 중쇄의 위치 31에 있는 아스파르트산이 아스파라긴으로 돌연변이된 삼중 단일쇄 가변 단편이다. tri-scFv 3E10(D31N)의 아미노산 서열은 다음과 같다.
AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO:40).
SEQ ID NO:40에 대한 tri-scFv 단백질 도메인의 주석
- AGIH 서열은 용해도를 증가시킨다(SEQ ID NO:40의 아미노산 1-4)
- Vk 가변 영역(SEQ ID NO:40의 아미노산 5-115)
- 경쇄 CH1의 초기(6aa)(SEQ ID NO:40의 아미노산 116-121)
- (GGGGS)3(SEQ ID NO:37) 링커(SEQ ID NO:40의 아미노산 122-136)
- VH 가변 영역(SEQ ID NO:40의 아미노산 137-252)
- 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산으로 구성된 Fv 단편 사이의 링커(SEQ ID NO : 40의 아미노산 253-265)
- 스위블 시퀀스(SEQ ID NO:40의 아미노산 266-271)
- Vk 가변 영역(SEQ ID NO:40의 아미노산 272-382)
- 경쇄 CH1의 초기(6aa)(SEQ ID NO:40의 아미노산 383-388)
- (GGGGS)3(SEQ ID NO:37) 링커(SEQ ID NO:40의 아미노산 389-403)
- VH 가변 영역(SEQ ID NO:40의 아미노산 404-519)
- 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산으로 구성된 Fv 단편 사이의 링커(SEQ ID NO : 40의 아미노산 520-532)
- 스위블 시퀀스(SEQ ID NO:40의 아미노산 533-538)
- Vk 가변 영역(SEQ ID NO:40의 아미노산 539-649)
- 경쇄 CH1의 초기(6aa)(SEQ ID NO:40의 아미노산 650-655)
- (GGGGS)3(SEQ ID NO:37) 링커(SEQ ID NO:40의 아미노산 656-670)
- VH 가변 영역(SEQ ID NO:40의 아미노산 671-786)
- Myc 태그(SEQ ID NO : 40의 아미노산 787-802)
- His 6 태그(SEQ ID NO : 40의 아미노산 803-808)
WO 2016/033321 및 Noble, et al., Cancer Research, 75(11):2285-2291 (2015)는 di-scFv 및 tri-scFv가 이들의 1가 대응물에 비해 일부 개선되고 추가 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 각각의 예시적인 융합 단백질의 상이한 도메인에 상응하는 서브서열은 또한 위에 제공된다. 당업자는 예시적인 융합 단백질, 또는 이의 도메인이 상기에서 보다 상세하게 논의된 융합 단백질을 구성하는데 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, di-scFv는 VH 가변 도메인에 연결된 Vk 가변 영역(예를 들어, 서열식별번호: 39의 아미노산 5-115, 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편)을 포함하는 제1 scFv를 포함한다. Vk 가변 영역을 포함하는 제2 scFv에 연결된 (예를 들어, 서열식별번호: 39의 아미노산 137-252, 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편), 또는 VH 가변 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:39의 아미노산 404-519, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)에 연결된 기능적 변이체 또는 이의 단편). 일부 실시양태에서, tri-scFv는 Vk 가변 영역(예를 들어, SEQ ID NO:40의 아미노산 539-649, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)을 포함하는 제3 scFv 도메인에 연결된 di-scFv를 포함하고, VH 가변 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:40의 아미노산 671-786, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편).
Vk 가변 영역은 예를 들어 링커(예를 들어, (GGGGS)3(SEQ ID NO : 37), 단독으로 또는 경쇄 CH1(아미노산 SEQ ID NO:39의 116-121).다른 적합한 링커는 위에서 논의되고 당업계에 공지되어 있다.scFv는 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 39), 단독으로 또는 스위블 서열(예를 들어, SEQ ID NO:39의 아미노산 266-271)과 조합되어 있다.다른 적합한 링커는 상기 논의되고 당업계에 공지되어 있다.
따라서, di-scFv는 SEQ ID NO:39의 아미노산 5-519를 포함할 수 있다. tri-scFv는 SEQ ID NO:40의 아미노산 5-786을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 추가 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 용해도를 향상시키는 서열(예를 들어, 서열식별번호: 39의 아미노산 1-4)을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, di-scFv는 서열 39의 아미노산 1-519를 포함할 수 있다. tri-scFv는 SEQ ID NO:40의 아미노산 1-786을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 정제, 단리, 포획, 확인, 분리 등을 향상시키는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예시적인 도메인은 예를 들어 Myc 태그(예를 들어, 서열식별번호: 39의 아미노산 520-535) 및/또는 His 태그(예를 들어, 서열식별번호: 39의 아미노산 536-541)를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, di-scFv는 서열 39의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. tri-scFv는 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 대체 가능한 도메인 및 추가 도메인은 위에서 더 자세히 논의된다.
예시적인 3E10 인간화 Fv 서열은 WO 2016/033324에서 논의된다:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEYVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKRGLLLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 41).
예시적인 3E10 인간화 di-scFv 서열은 WO 2019/018426 및 WO/2019/018428에서 논의되고, 다음을 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 2, SEQ ID NO : 61) DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 3, SEQ ID NO : 62), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 4, SEQ ID NO : 63), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQ GTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 6, SEQ ID NO : 64), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 7, SEQ ID NO : 65), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 8, SEQ ID NO : 66),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 10, SEQ ID NO : 67), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 11, SEQ ID NO : 68), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 12, SEQ ID NO : 69),
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 13, SEQ ID NO : 70),
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 14, SEQ ID NO : 71), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 15, SEQ ID NO : 72), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 16, SEQ ID NO : 73), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWT FGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS(변형 17, SEQ ID NO),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 18, SEQ ID NO:75), 및
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변형 19, SEQ ID NO:76).
C. 추가 시퀀스
항-DNA 항원 결합 단백질, 항체, 단편 및 융합 단백질의 구성에 사용될 수 있는 추가 서열에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (L2345A의 IgG1/L235A 중쇄 전장 서열, SEQ ID NO : 77),
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(IgG1 중쇄 불변영역 1, SEQ ID NO : 78),
EPKSCDKTHTCP(IgG1 힌지 영역, SEQ ID NO : 79),
PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(IgG1 L2345A/L235A 중쇄 불변영역 2: SEQ ID NO : 80),
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1 중쇄 불변영역 3, SEQ ID NO : 81),
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (N297D의 IgG1 중쇄 전장 서열, SEQ ID NO : 82),
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(IgG1 N297D 중쇄 불변영역 2, SEQ ID NO : 83),
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (L2345A의 IgG1 / L235A / N297D 중쇄 전장 서열, SEQ ID NO : 84),
PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(IgG1 L2345A/L235A/N297D 중쇄 불변영역 2 SEQ ID NO : 86),
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO : 86, 비변형 중쇄 불변영역 2) 및
DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDY (비변형 중쇄 불변영역 2, SEQ ID NO : 86)
B. 카고(cargo)
본원에 제공된 방법에 사용된 바와 같이, 3E10은 전형적으로 핵산 카고와 복합체를 형성하는 세포와 접촉된다. 항체 또는 결합 단백질과 핵산 카고 간의 상호작용은 비공유적이다.
핵산 카고는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 카고는 DNA, RNA, 핵산 유사체, 또는 이들의 조합일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 핵산 유사체는 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 핵산의 안정성, 혼성화 또는 용해도를 개선할 수 있다.
핵산 카고는 일반적으로 세포 내로 전달되면 생물학적으로 활성인 제제이거나 이를 암호화한다는 의미에서 기능적이다. 예시적인 카고는 아래에서 더 자세히 논의되지만, 예를 들어, 발현 구성체 및 벡터, siRNA와 같은 억제 핵산, 또는 예를 들어, 예를 들어 발현 구조 및 벡터.
개시된 조성물은 복수의 단일 핵산 카고 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 다수의 다중도(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10개 이상)의 상이한 핵산 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 카고 분자는 킬로염기 길이가 0.001, 0.01, 1, 10, 100, 1,000, 10,000, 및/또는 100,000이다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 카고는 0.001kb 내지 100kb, 또는 0.001kb 내지 50kb, 또는 0.001kb 내지 25kb, 또는 0.001kb 내지 12.5kb, 또는 0.001kb 내지 12.5kb일 수 있다. , 또는 0.001kb와 8kb, 또는 0.001kb와 5kb, 또는 0.001kb와 2.5kb, 또는 0.001kb와 1kb, 또는 0.01kb와 100kb, 또는 0.01kb, 또는 0.01kb와 0.01kb와 25kb 사이, 또는 0.01kb와 12.5kb 사이, 또는 0.01kb와 10kb 사이, 또는 0.01kb와 8kb 사이, 또는 0.01kb와 5kb 사이, 또는 0.01kb와 2.5kb 사이, kb와 1kb, 또는 0.1kb와 100kb, 또는 0.1kb와 50kb, 또는 0.1kb와 25kb, 또는 0.1kb와 12.5kb, 또는 0.1kb와 10kb, 또는 0.1 kb와 8kb, 또는 0.1kb와 5kb, 또는 0.1kb와 2.5kb, 또는 0.1kb와 1kb, 또는 1kb와 100kb, 또는 1kb와 50kb, 또는 1kb kb 및 25kb, 또는 1kb와 12.5kb, 또는 1kb와 10kb, 또는 그 사이 1kb와 8kb, 1kb와 5kb, 또는 1kb와 2.5kb 사이(각각 포함).
일부 실시양태에서, 예를 들어, 카고는 0.2kb 내지 10kb, 또는 0.2kb 내지 5kb, 또는 0.2kb 내지 2.5kb, 또는 0.2kb 내지 1kb, 또는 0.2kb 내지 0.5kb, 또는 0.2kb와 0.25kb 사이, 또는 0.5kb와 10kb 사이, 또는 0.5kb와 5kb 사이, 또는 1kb와 5kb 사이, 또는 1kb와 3kb 사이, 또는 2kb와 10kb 사이, 또는 3 kb 및 5kb 사이 일 수 있다.
특정 적용을 위해 핵산 카고는 예를 들어 상기 범위(포함) 중 하나에 속하는 하나 이상의 개별 길이일 수 있으며, 각각에 대한 특정 값은 명시적으로 개시되어 있다. 예를 들어, 크기는 단일 뉴클레오티드 또는 핵염기만큼 작을 수 있다. 예시적인 적용에서 카고는 STING 작용제인 cGAMP와 같은 고리형 디뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 카고는 짧은 올리고머이다. 예를 들어, 안티센스 또는 스플라이스 스위칭에 8-mer만큼 짧은 올리고머를 사용할 수 있다. 약간 더 긴 것(예: 18-20mer)을 유전자 편집에 사용할 수 있다.
a. 벡터
카고는 벡터, 예를 들어 폴리펩티드(들) 및/또는 기능적 핵산(들)을 인코딩하는 벡터일 수 있다. 위에서 설명한 것과 같은 핵산은 세포에서 발현하기 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "벡터"는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드와 같은 복제물이며, 삽입된 단편의 복제를 야기하기 위해 또 다른 DNA 단편이 삽입될 수 있다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터이고, "발현 조절 서열"은 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하고 조절하는 DNA 서열이다.
벡터의 핵산은 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 제어 서열은 발현 제어 서열이 목적 코딩 서열의 발현을 효과적으로 제어하도록 유전자 작제물에 통합될 수 있다. 발현 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 영역을 포함한다. 프로모터는 일반적으로 전사가 시작되는 지점(일반적으로 RNA 중합효소 II의 개시 부위 근처)의 상류에서 100개 뉴클레오티드 이내의 DNA 분자 영역으로 구성된 발현 조절 서열이다. 프로모터의 제어 하에 코딩 서열을 가져오기 위해, 프로모터의 다운스트림 1개 내지 약 50개 뉴클레오티드 사이에 폴리펩티드의 번역 판독 프레임의 번역 개시 부위를 위치시키는 것이 필요하다. 인핸서는 시간, 위치 및 수준 측면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리 인핸서는 전사 부위에서 다양한 거리에 위치할 때 기능할 수 있다. 인핸서는 또한 전사 개시 부위의 다운스트림에 위치할 수 있다. 암호화 서열은 RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA로 전사할 수 있을 때 세포에서 발현 조절 서열의 "작동 가능하게 연결"되고 "제어 하에" 있으며, 이는 그 다음 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역될 수 있다.
적합한 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 및 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 헤르페스 바이러스, 거대 세포 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다수의 벡터 및 발현 시스템은 Novagen(Madison, WI), Clontech(Palo Alto, CA), Stratagene(La Jolla, CA) 및 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad, CA)와 같은 회사에서 상업적으로 입수할 수 있다.
일부 실시양태에서, 카고는 세포 내로 전달되고 염색체외 상태로 유지된다. 일부 실시양태에서, 카고는 숙주 세포 내로 도입되고 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 조성물은 유전자 치료 방법에 사용될 수 있다. 유전자 요법의 방법은 세포의 유전자형을 변경하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 도입은 유전자 재조합을 통해 내인성 유전자를 수정, 대체 또는 달리 변경할 수 있다. 방법에는 결함이 있는 유전자, 이종 유전자, 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 작은 핵산 분자의 전체 대체 사본의 도입이 포함될 수 있다. 예를 들어, 수정 유전자는 숙주 게놈 내의 비특이적 위치에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 카고는 벡터이다. 유전자 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 발현 벡터를 구성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법에는 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합이 포함된다. 발현 벡터는 일반적으로 예를 들어 목적 폴리뉴클레오티드일 수 있는 삽입된 코딩 서열의 번역 및/또는 전사를 위한 조절 서열 및 필수 요소를 함유한다. 코딩 서열은 원하는 유전자 산물의 발현 조절을 돕기 위해 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 생명 공학에서 사용되는 프로모터는 의도하는 유전자 발현 제어 유형에 따라 다양한 유형이 있다. 그들은 일반적으로 구성적 프로모터, 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 프로모터, 유도성 프로모터 및 합성 프로모터로 나눌 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 목적 폴리뉴클레오티드는 프로모터 또는 당업계에 공지된 다른 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 따라서 카고는 발현 벡터와 같은 벡터가 될 수 있다. 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에서 발현을 위한 폴리뉴클레오티드의 조작은 재조합 발현의 숙련가에게 일반적으로 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 개시된 조성물 중 하나를 포함한다. 프로모터의 "제어 하에" 코딩 서열을 가져오기 위해, 판독 프레임의 번역 개시 부위의 5' 말단을 일반적으로 선택된 프로모터의 "하류"(즉, 3')의 약 1 내지 50개 뉴클레오티드 사이에 위치시킨다. "상류" 프로모터는 삽입된 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 재조합 단백질 또는 기능적 핵산의 발현을 촉진한다. 이것은 여기에서 사용된 문맥에서 "재조합 표현"의 의미이다.
다양한 숙주-발현 시스템에서 단백질 또는 펩티드 또는 기능적 핵산 발현을 달성하기 위해 적절한 핵산 및 전사/번역 제어 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성하기 위해 많은 표준 기술이 이용가능하다.
포유동물 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 복제 기점(필요한 경우), 발현될 유전자 앞에 위치하는 프로모터, 필요한 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함한다. 복제 기점은 SV40 또는 기타 바이러스(예: 폴리오마, 아데노, VSV, BPV) 공급원에서 유래할 수 있는 것과 같은 외인성 기점을 포함하도록 벡터를 구성하거나 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 염색체 복제 메커니즘. 벡터가 숙주 세포 염색체에 통합되면 후자로 충분한다.
프로모터는 포유동물 세포의 게놈(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래될 수 있다. 또한, 그러한 조절 서열이 숙주 세포 시스템과 양립할 수 있다면, 원하는 유전자 서열과 일반적으로 연관된 프로모터 또는 조절 서열을 이용하는 것이 또한 가능하고 바람직할 수 있다.
다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 사용될 수 있으며, 예를 들어 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40(SV40)에서 유래한다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 SV40 바이러스 복제 기원을 포함하는 단편으로 바이러스로부터 쉽게 얻어지기 때문에 유용한다. HindIII 부위에서 바이러스 복제 기점에 위치한 BglI 부위 쪽으로 확장되는 약 250bp 서열이 포함된다면 더 작거나 더 큰 SV40 단편을 사용할 수도 있다.
아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼자 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예: 영역 E1 또는 E3)에 삽입하면 감염 숙주에서 생존 가능하고 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성된다.
개시된 조성물의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 제어 신호가 추가로 제공되어야 할 수 있다. 당업자는 이러한 필요성을 쉽게 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 프레임 내(또는 같은 상)이어야 한다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두에서 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소 또는 전사 종결자를 포함함으로써 향상될 수 있다.
진핵생물 발현에서, 원래의 클로닝된 세그먼트 내에 포함되지 않은 경우 적절한 폴리아데닐화 부위를 전사 단위에 일반적으로 통합하기를 원할 것이다. 전형적으로, 폴리 A 부가 부위는 전사 종결 전 위치에서 단백질의 종결 부위 "하류"에 약 30 내지 2000개의 뉴클레오티드가 위치한다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해서는 안정적인 발현이 바람직한다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 구축물을 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예: 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 조절되는 벡터로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후 조작된 세포를 농축 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 다음 선택 배지로 전환할 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 초점을 형성하도록 하며, 이는 차례로 복제되고 세포주로 확장될 수 있다.
b. mRNA
카고는 mRNA일 수 있다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 가진 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA는 5' 및 3' UTR을 가질 수 있다. 3' UTR의 길이는 예를 들어 100개 뉴클레오티드를 초과할 수 있다. 일부 실시양태에서 3' UTR 서열은 100 내지 5000개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 3000개 뉴클레오티드이다. 코딩 영역에 추가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 다른 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머를 설계하는 것을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 전달 후 최적의 번역 효율을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 수정할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 목적 유전자에 대해 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 목적 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머에 통합함으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 추가될 수 있다. 목적 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 수정하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU가 풍부한 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 잘 알려진 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유한다. 또는, 원하는 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 위에서 설명한 바와 같이 PCR에 의해 추가되는 경우, 5' UTR 서열을 추가하여 공통 Kozak 서열을 재설계할 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하는 데 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 Kozak 서열에 대한 요건은 당업계에 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 실시양태에서 다양한 뉴클레오티드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용되어 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해할 수 있다.
일부 실시양태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역 개시 및 안정성 mRNA를 결정하는 5' 말단, 3' 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합에 캡을 갖는다.
5'캡은 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 5' 캡은 예를 들어 m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')A, G(5')ppp(5')G 또는 G(5')일 수 있다.)ppp(5')캡 유사체, 모두 상업적으로 이용 가능한다. 5' 캡은 또한 역방향 캡 유사체(ARCA)(Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)) 또는 임의의 다른 적합한 유사체일 수 있다. 5' 캡은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 통합될 수 있다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95( 2001), Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 포함할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역 개시를 촉진하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다.
일반적으로 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개의 아데노신이다.
polyA 세그먼트는 100T 테일(크기는 예를 들어, 50-5000T일 수 있음)와 같은 polyT 테일을 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안, 또는 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합. 폴리(A) 테일은 또한 RNA에 안정성을 제공하고 분해를 줄이다. RNA의 폴리(A) 테일은 추가로 또는 대안적으로 대장균 폴리A 폴리머라제(E-PAP)와 같은 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사 후에 확장될 수 있다.
또한 3' 말단에 다른 화학 그룹을 부착하면 mRNA 안정성이 증가할 수 있다. 이러한 부착은 변형/인공 뉴클레오티드, 앱타머 및 기타 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 테일에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 더욱 증가시킬 수 있다. 적합한 ATP 유사체에는 코르디오시핀 및 8-아자아데노신이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
2. 카고의 시퀀스
a. 목적 폴리펩티드
카고는 하나 이상의 단백질을 암호화할 수 있다. 카고는 모노시스트론 또는 폴리시스트론일 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다중유전자이다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 mRNA 또는 벡터와 같은 발현 구성물일 수 있다.
카고는 하나 이상의 목적 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 유기체에 치료 또는 예방 효과를 제공하거나 유기체에서 질병 또는 장애를 진단하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 암, 자가면역 장애, 기생충, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기타 감염의 치료를 위해, 발현될 폴리뉴클레오티드(들)는 면역계의 세포에 대한 리간드 또는 수용체로서 기능하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나, 유기체의 면역 체계를 자극하거나 억제하는 기능.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 유기체에 결함이 있는 폴리뉴클레오티드를 보충하거나 대체한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 디스트로핀, 유트로핀, 또는 이들의 조합을 코딩한다. 이러한 조성물은 이영양증, 특히 근이영양증, 예를 들어 뒤센(Duchenne) 근이영양증으로부터 대상체를 치료하기 위한 유효량으로 투여될 수 있다.
또 다른 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항원, 예를 들어 백신 제제 및 관련 방법에서 이용될 수 있는 항원을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 항원(들), 예를 들어 SARS-CoV-2 항원(들)을 코딩한다. 따라서, SARS-CoV-2 바이러스 및 COVID19를 포함하는 이와 관련된 바이러스 감염 및 질병에 대한 보호 및 치료를 위한 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 선택가능 마커, 예를 들어, 약물 내성 선택 마커와 같은 진핵 세포에서 효과적인 선택가능 마커를 포함한다. 이 선택 마커 유전자는 선택 배양 배지에서 성장한 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 인자를 코딩할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 카나마이신, 젠타마이신, 제오신 또는 테트라사이클린과 같은 항생제 또는 기타 독소에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하고 영양요구성 결핍을 보완하거나 배지에서 보류된 중요한 영양소를 공급한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자는 일반적으로 숙주 세포에 존재하지 않거나 발현되지 않는 유전자이다. 리포터 유전자는 일반적으로 일부 표현형 변화 또는 효소적 특성을 제공하는 단백질을 암호화한다. 이러한 유전자의 예는 Weising et al. 앤. Rev. Genetics, 22, 421(1988). 바람직한 리포터 유전자는 글루쿠로니다제(GUS) 유전자 및 GFP 유전자를 포함한다.
b. 기능성 핵산
카고는 기능적 핵산이거나 이를 암호화할 수 있다. 기능적 핵산은 표적 분자에 결합하거나 특정 반응을 촉매하는 것과 같은 특정 기능을 갖는 핵산 분자이다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 기능적 핵산 분자는 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, RNAi 및 외부 가이드 서열, 및 고리형 디뉴클레오티드와 같은 비제한적인 범주로 나눌 수 있다. 기능적 핵산 분자는 표적 분자가 소유한 특정 활성의 이펙터, 억제제, 조절제 및 자극제로 작용할 수 있거나, 기능적 핵산 분자는 다른 분자와 독립적으로 새로운 활성을 가질 수 있다.
기능적 핵산 분자는 DNA, RNA, 폴리펩티드 또는 탄수카고 사슬과 같은 거대분자와 상호작용할 수 있다. 따라서, 기능적 핵산은 표적 폴리펩티드의 mRNA 또는 게놈 DNA와 상호작용할 수 있거나 폴리펩티드 자체와 상호작용할 수 있다. 종종 기능적 핵산은 표적 분자와 기능적 핵산 분자 사이의 서열 상동성을 기반으로 다른 핵산과 상호작용하도록 설계된다. 다른 상황에서, 기능적 핵산 분자와 표적 분자 사이의 특이적 인식은 기능적 핵산 분자와 표적 분자 사이의 서열 상동성을 기반으로 하는 것이 아니라 특이적 인식의 발생을 허용하는 3차 구조의 형성을 기반으로 한다.
따라서, 조성물은 유전자, 또는 이의 유전자 생성물의 발현을 감소시키도록 설계된 하나 이상의 기능적 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기능적 핵산 또는 폴리펩티드는 mRNA의 발현 또는 번역을 표적화하고 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있고; 또는 발현을 감소 또는 억제하거나, 활성을 감소시키거나, 단백질의 분해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 조성물은 기능적 핵산의 생체내 발현에 적합한 벡터를 포함한다.
i. 안티센스
기능적 핵산은 안티센스 분자이거나 이를 암호화할 수 있다. 안티센스 분자는 표준 또는 비표준 염기 쌍을 통해 표적 핵산 분자와 상호 작용하도록 설계되었다. 안티센스 분자와 표적 분자의 상호작용은 예를 들어 RNAse H 매개 RNA-DNA 하이브리드 분해를 통해 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 설계되었다. 대안적으로 안티센스 분자는 전사 또는 복제와 같이 표적 분자에서 정상적으로 일어나는 처리 기능을 방해하도록 설계된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근 가능한 영역을 찾아 안티센스 효율을 최적화하기 위한 수많은 방법이 있다. 예시적인 방법은 DMS 및 DEPC를 사용한 시험관내 선택 실험 및 DNA 변형 연구를 포함한다. 안티센스 분자는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 이하의 해리 상수(Kd)로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다.
ii. RNA 간섭
일부 실시양태에서, 기능성 핵산은 RNA 간섭을 통해 유전자 침묵을 유도한다. 유전자 발현은 또한 RNA 간섭(RNAi)을 통해 매우 특정한 방식으로 효과적으로 침묵될 수 있다. 이러한 침묵은 원래 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 첨가로 관찰되었다(Fire, et al.(1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al.(1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51). dsRNA가 세포에 들어가면 RNase III 유사 효소인 Dicer에 의해 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부를 포함하는 길이가 21-23개의 뉴클레오티드인 이중 가닥 소형 간섭 RNA(siRNA)로 절단된다(Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200, Bernstein 등 (2001) Nature, 409:363-6, Hammond 등 (2000) Nature, 404:293-6). ATP 의존성 단계에서 siRNA는 일반적으로 RNAi 유도 침묵 복합체(RISC)로 알려진 다중 소단위 단백질 복합체로 통합되어 siRNA를 표적 RNA 서열로 안내한다(Nykanen, et al.(2001) Cell, 107:309-21). 어느 시점에서 siRNA 이중가닥이 풀리고 안티센스 가닥이 RISC에 결합된 채로 남아 있고 엔도 및 엑소뉴클레아제의 조합에 의해 상보적 mRNA 서열의 분해를 지시하는 것으로 보이다(Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74 ). 그러나, iRNA 또는 siRNA의 효과 또는 사용은 어떤 유형의 메커니즘에도 제한되지 않는다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 서열 특이적 전사 후 유전자 침묵을 유도하여 유전자 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA이다. 한 예에서, siRNA는 siRNA와 표적 RNA 사이의 서열 동일성 영역 내에서 mRNA와 같은 상동 RNA 분자의 특이적 분해를 촉발한다. 예를 들어, WO 02/44321은 3' 돌출 말단과 염기쌍을 이루는 경우 표적 mRNA의 서열 특이적 분해가 가능한 siRNA를 개시하고 있으며, 이들 siRNA의 제조 방법에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 특이적 유전자 침묵은 효소 다이서에 의해 생성된 siRNA를 모방하는 합성, 짧은 이중 가닥 RNA를 사용하여 포유동물 세포에서 달성될 수 있다(Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494 498)(Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82). siRNA는 화학적으로 또는 시험관 내에서 합성될 수 있거나 세포 내부에서 siRNA로 처리되는 짧은 이중 가닥 헤어핀 유사 RNA(shRNA)의 결과일 수 있다. 합성 siRNA는 일반적으로 알고리즘과 기존 DNA/RNA 합성기를 사용하여 설계된다. 공급업체로는 Ambion(텍사스 오스틴), ChemGenes(매사추세츠주 Ashland), Dharmacon(콜로라도 라파예트), Glen Research(버지니아 스털링), MWB Biotech(독일 Esbersberg), Proligo(콜로라도 볼더) 및 Qiagen(Vento)이 있다. , 네덜란드). siRNA는 Ambion의 SILENCERㄾ siRNA 구성 키트와 같은 키트를 사용하여 시험관 내에서 합성할 수도 있다.
벡터로부터 siRNA의 생산은 더 일반적으로 짧은 헤어핀 RNAse(shRNA)의 전사를 통해 수행된다. Imgenex의 GENESUPPRESSOR™ 구성 키트 및 Invitrogen의 BLOCK-IT™ 유도성 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터와 같은 shRNA가 있는 벡터 생산용 키트를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능적 핵산은 siRNA, shRNA, miRNA이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 기능성 핵산을 발현하는 벡터를 포함한다.
iii. 압타머
기능적 핵산은 앱타머이거나 이를 인코딩할 수 있다. 압타머는 표적 분자, 바람직하게는 특정한 방식으로 상호작용하는 분자이다. 일반적으로 압타머는 스템 루프 또는 G-쿼텟과 같은 정의된 2차 및 3차 구조로 접히는 15-50개 염기 길이 범위의 작은 핵산이다. 압타머는 ATP 및 오필린과 같은 작은 분자뿐만 아니라 역전사효소 및 트롬빈과 같은 큰 분자에도 결합할 수 있다. 압타머는 10-12 M 미만의 표적 분자로부터의 Kd로 매우 단단히 결합할 수 있다. 압타머는 10-6,10-8, 10-10 또는 10-12미만의 Kd로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하고,
. 압타머는 표적 분자에 매우 높은 특이도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 표적 분자와 분자의 단일 위치에서만 다른 다른 분자 간의 결합 친화도 차이가 10,000배 이상인 앱타머가 분리되었다. 앱타머는 배경 결합 분자를 갖는 Kd보다 적어도 10, 100, 1000, 10,000, 또는 100,000배 더 낮은 표적 분자를 갖는 Kd를 갖는 것이 바람직하다. 폴리펩티드와 같은 분자에 대한 비교를 수행할 때 배경 분자는 다른 폴리펩티드인 것이 바람직한다.
iv. 리보자임
기능적 핵산은 리보자임이거나 이를 인코딩할 수 있다. 리보자임은 분자내 또는 분자간 화학 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임이 분자간 반응을 촉매하는 것이 바람직하다. 망치머리 리보자임과 같은 자연계에서 발견되는 리보자임을 기반으로 하는 뉴클레아제 또는 핵산 중합효소 유형 반응을 촉매하는 다양한 유형의 리보자임이 있다. 또한 자연계에는 없지만 특정 반응을 새롭게 촉매하도록 설계된 리보자임이 많이 있다. 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하고, 보다 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 일반적으로 표적 기질의 인식 및 결합을 통해 핵산 기질을 절단하고 후속 절단을 수반한다. 이 인식은 주로 표준 또는 비표준 염기쌍 상호작용을 기반으로 한다. 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열을 기반으로 하기 때문에 이러한 특성은 리보자임을 핵산의 표적 특이적 절단에 특히 좋은 후보로 만든다.
v. 외부 가이드 시퀀스
기능적 핵산은 외부 가이드 서열이거나 이를 인코딩할 수 있다. 외부 가이드 서열(EGS)은 표적 핵산 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 분자이며, 이는 RNase P에 의해 인식되어 표적 분자를 절단한다. EGS는 선택한 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 설계할 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 전달 RNA(tRNA)를 처리하는 데 도움이 된다. 박테리아 RNAse P는 표적 RNA:EGS 복합체가 천연 tRNA 기질을 모방하도록 하는 EGS를 사용하여 거의 모든 RNA 서열을 절단하도록 모집될 수 있다. 유사하게, 진핵생물 EGS/RNAse P-유도 RNA 절단은 진핵생물 세포 내에서 원하는 표적을 절단하기 위해 이용될 수 있다. 다양한 상이한 표적 분자의 절단을 용이하게 하기 위해 EGS 분자를 만들고 사용하는 방법의 대표적인 예는 당업계에 공지되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, EGS, 리보자임 및 앱타머와 같은 기능적 핵산의 생체내 발현을 위한 벡터의 제조 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다.
vi. 고리형 디뉴클레오티드
기능적 핵산은 고리형 디뉴클레오티드일 수 있거나 이를 암호화할 수 있다. 고리형 디뉴클레오티드는 STING 어댑터 단백질에 직접 결합하여 IFN-■의 생성을 초래한다(Zhang, et al., Mol Cell., 51(2):226-35 (2013). doi: 10.1016/j.molcel.2013.05). 022.). 몇 가지 표준 및 비표준 디뉴클레오티드가 당업계에 알려져 있으며, 2'3'-cGAMP, 2'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-AMP, c-di를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. -GMP, cAIMP(CL592), cAIMP 디플루오르(CL614), cAIM(PS)2 디플루오르(Rp/Sp)(CL656), 2'2'-cGAMP, 2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp), 3'3'-cGAMP 불소화, c-di-AMP 불소화, 2'3'-c-di-AMP, 2'3'-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp), 2'3'-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp), c-di-GMP 불소화, 2'3'-c-di-GMP, c-di-IMP, DMXAA.
vii. 면역자극성 올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 기능성 핵산은 올리고뉴클레오티드 리간드이거나 이를 코딩할 수 있다. 예에는 패턴 인식 수용체(PRR) 리간드가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
PRR의 예에는 선천성 면역 반응의 개시에 역할을 하고 또한 이후 및 보다 항원 특이적 적응 면역 반응에 영향을 미치는 신호 분자의 Toll-유사 패밀리가 포함된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 Toll-유사 수용체 9(TLR9)와 같은 Toll-유사 패밀리 신호전달 분자에 대한 리간드 역할을 할 수 있다.
예를 들어, 메틸화되지 않은 CpG 부위는 형질세포양 수지상 세포 및 인간의 B 세포에서 TLR9에 의해 검출될 수 있다(Zaida, et al., Infection and Immunity, 76(5):2123-2129, (2008)). 따라서, 올리고뉴클레오티드의 서열은 하나 이상의 비메틸화 시토신-구아닌(CG 또는 CpG, 상호교환가능하게 사용됨) 디뉴클레오티드 모티프를 포함할 수 있다. 'p'는 DNA의 포스포디에스테르 백본을 말하지만, 일부 실시양태에서 CG를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 변형된 백본, 예를 들어 포스포로티오에이트(PS) 백본을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 연속적으로 배열되거나 개재 뉴클레오타이드(들)에 의해 분리된 하나 초과의 CG 디뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. CpG 모티프(들)는 올리고뉴클레오티드 서열의 내부에 있을 수 있다. 수많은 뉴클레오타이드 서열은 CG 다이머에 인접하는 정확한 염기 서열뿐만 아니라 CG 디뉴클레오타이드(들)의 수와 위치의 변화로 TLR9를 자극한다.
일반적으로 CG ODN은 서열, 2차 구조 및 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 미치는 영향에 따라 분류된다. 5개의 클래스는 클래스 A(유형 D), 클래스 B(유형 K), 클래스 C, 클래스 P 및 클래스 S이다(Vollmer, J & Krieg, AM, Advanced drug delivery review 61(3): 195-204 (2009) ), 참조로 여기에 포함됨). CG ODN은 I형 인터페론(예: IFNα)의 생성을 자극하고 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도할 수 있다. ODN의 일부 클래스는 간접적인 사이토카인 신호 전달을 통해 자연 살해(NK) 세포의 강력한 활성제이기도 한다. 일부 부류는 인간 B 세포 및 단핵구 성숙의 강력한 자극제이다(Weiner, GL, PNAS USA 94(20): 10833-7(1997); Dalpke, AH, Immunology 106(1): 102-12(2002); Hartmann, G, J of Immun. 164(3):1617-2 (2000), 각각은 본원에 참고로 포함됨).
다른 PRR Toll-유사 수용체에는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 및 짧은 이중 가닥 RNA를 각각 인식할 수 있는 TLR3 및 TLR7, 및 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I) 유사 수용체, 즉 RIG-가 포함된다. I 및 흑색종 분화 관련 유전자 5(MDA5)는 세포질에서 RNA 감지 수용체로 가장 잘 알려져 있다.
RIG-I(레티노산 유도성 단백질 1, Ddx58이라고도 함) 및 MDA-5(흑색종 분화 관련 유전자 5, Ifih1 또는 Helicard라고도 함)는 RIG-I 유사에 속하는 세포질 RNA 헬리카제이다. 수용체(RLR) 패밀리이며 숙주 항바이러스 반응에 중요한다.
RIG-I 및 MDA-5는 RNA 바이러스의 복제 중간체인 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 감지하고 미토콘드리아 항바이러스 신호 전달 단백질 MAVS(IPS-1, VISA 또는 Cardif라고도 함)를 통해 신호를 보내 다음 타입-I 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)의 생산을 유도한다.
RIG-I는 캡핑되지 않은 5'-디/트리포스페이트 말단 및 짧고 뭉툭한 말단 이중 가닥 물약을 나타내는 바이러스 RNA를 검출하는데, 이는 self-RNA와의 구별을 용이하게 하는 두 가지 필수 기능이다. MDA-5 생리학적 리간드의 특징은 아직 완전히 특성화되지 않았다. 그러나 RIG-I와 MDA-5는 dsRNA의 길이에 대해 다른 의존성을 나타낸다는 것이 인정된다. RIG-I는 짧은 dsRNA에 선택적으로 결합하는 반면 MDA-5는 긴 dsRNA에 선택적으로 결합한다. 이와 일관되게 RIG-I 및 MDA-5는 합성 dsRNA 유사체인 Poly(I:C)에 서로 다른 길이 선호도로 결합한다.
어떤 상황에서는 RIG-I가 dsDNA를 간접적으로 감지할 수도 있다. 바이러스성 dsDNA는 RNA 중합효소 III에 의해 5'-삼인산 부분이 있는 dsRNA로 전사될 수 있다. 따라서 B형 DNA의 합성 유사체인 폴리(dA:dT)는 또 다른 RIG-I 리간드를 구성한다.
예시적인 RIG-I 리간드는 RIG-I의 특이적 작용제인 5'ppp-dsRNA; RIG-I의 특정 작용제인 3p-hpRNA; Poly(I:C)의 크기에 따라 RIG-I 및/또는 MDA-5에 의해 인식되는 Poly(I:C)/LyoVec 복합체; RIG-I에서 간접적으로 인식하는 Poly(dA:dT)/LyoVec 복합체.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, 또는 RIG-I-유사 수용체, 또는 이들의 조합에 대한 기능적 리간드를 함유한다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 예, 및 이를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, Bodera, P. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 5(1):87-93 (2011)).
3. 카고의 구성
개시된 핵산 카고는 전형적으로 헤테로사이클릭 염기(핵산 염기), 헤테로사이클릭 염기에 부착된 당 모이어티, 및 당 모이어티의 하이드록실 기능을 에스테르화하는 포스페이트 모이어티를 포함하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드이거나 이를 포함할 수 있다. 주요 자연 발생 뉴클레오티드에는 헤테로고리 염기로서 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌, 포스포디에스테르 결합으로 연결된 리보스 또는 데옥시리보스 당이 포함된다.
일부 실시양태에서, 카고는 DNA 또는 RNA 대응물에 비해 표적 수용체에 대한 안정성, 반감기, 또는 특이성 또는 친화성을 개선하기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함하거나 이로 구성된다. 화학적 변형에는 핵염기, 당 모이어티, 뉴클레오티드 연결, 또는 이들의 조합의 화학적 변형이 포함된다. 본원에 사용된 '변형된 뉴클레오타이드' 또는 "화학적으로 변형된 뉴클레오타이드"는 헤테로사이클릭 염기, 당 모이어티 또는 포스페이트 모이어티 구성요소 중 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 정의한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드의 전하는 동일한 핵염기 서열의 DNA 또는 RNA와 비교하여 감소된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 낮은 음전하, 무전하 또는 양전하를 가질 수 있다.
전형적으로, 뉴클레오시드 유사체는 표준 폴리뉴클레오티드 염기에 대한 Watson-Crick 염기 쌍에 의해 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하며, 여기서 유사체 백본은 올리고뉴클레오티드 유사체 분자와 염기 사이의 서열 특이적 방식으로 그러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시한다. 표준 폴리뉴클레오티드(예: 단일 가닥 RNA 또는 단일 가닥 DNA). 일부 실시양태에서, 유사체는 실질적으로 전하를 띠지 않는 인 함유 백본을 갖는다.
a. 헤테로고리 염기
주요 자연 발생 뉴클레오티드는 헤테로사이클릭 염기로서 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌을 포함한다. 카고에는 핵염기 성분에 대한 화학적 변형이 포함될 수 있다. 헤테로사이클릭 염기 또는 헤테로사이클릭 염기 유사체의 화학적 변형은 표적 서열에 대한 결합 친화도 또는 안정성을 증가시키는 데 효과적일 수 있다. 화학적으로 변형된 헤테로사이클릭 염기에는 이노신, 5-(1-프로피닐) 우라실(pU), 5-(1-프로피닐) 시토신(pC), 5-메틸시토신, 8-옥소-아데닌, 슈도시토신, 슈도이소시토신, 5 및 2-아미노-5-(2'-데옥시-.베타.-D-리보푸라노실)피리딘(2-아미노피리딘), 및 다양한 피롤로- 및 피라졸로피리미딘 유도체가 포함되지만 이에 국한되지 않는다..
b. 당 수정
카고는 또한 변형된 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체가 있는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 당 모이어티 변형은 2'-O-아미노에톡시, 2'-O-아모니오에틸(2'-OAE), 2'-O-메톡시, 2'-O-메틸, 2-구아니도에틸(2'-OGE), 2'-O,4'-C-메틸렌(LNA), 2'-O-(메톡시에틸)(2'-OME) 및 2'-O-(N-(메틸)아세트아미도)(2'-OMA). 2'-O-아미노에틸 당 모이어티 치환은 중성 pH에서 양성자화되어 TFO와 표적 이중체 사이의 전하 반발을 억제하기 때문에 특히 바람직한다. 이 변형은 리보스 또는 덱시리보스의 C3'-엔도 형태를 안정화하고 또한 이중체의 퓨린 가닥에서 i-1 포스페이트와 다리를 형성한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 모르폴리노 올리고뉴클레오티드이다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 1개에서 3개의 원자를 포함하는 인 함유 결합에 의해 함께 연결된 폴리뉴클레오티드의 염기에 염기 특이적 수소 결합에 의해 결합하는 데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분을 함유하는 2개 이상의 모르폴리노 단량체로 구성된다. 긴, 한 단량체의 모르폴리노 질소를 인접한 단량체의 5' 고리 외환 탄소에 연결한다. 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분은 일반적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조 및 결합 특성은 미국 특허 번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,3063, 및
모르폴리노 기반 서브유닛의 중요한 특성은 일반적으로 다음을 포함한다: 안정하고 전하를 띠지 않는 백본 연결에 의해 올리고머 형태로 연결되는 능력 뉴클레오티드 염기(예: 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 우라실 또는 이노신)를 지지하여 형성된 중합체가 표적 RNA를 비롯한 상보적 염기 표적 핵산과 높은 Tm으로 혼성화할 수 있는 능력, 심지어 올리고머가 짧은 경우에도 10-14개 염기로; 올리고머가 포유동물 세포 내로 능동적으로 수송되는 능력; 및 RNAse 분해에 저항하는 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 능력.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 상기 기재된 바와 같이 비하전 연결에 의해 연결된 염기쌍 모이어티를 보유하는 모르폴리노 기반 서브유닛을 사용한다.
c. 뉴클레오타이드간 연결
올리고뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오시드 모이어티 사이의 화학적 연결을 나타내는 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결된다. DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 백본에 대한 변형은 결합 친화도 또는 안정성 올리고뉴클레오타이드를 증가시키거나 올리고뉴클레오타이드 뉴클레아제 소화의 감수성을 감소시킬 수 있다. 디에틸-에틸렌디아미드(DEED) 또는 디메틸-아미노프로필아민(DMAP)을 포함하나 이에 제한되지 않는 양이온성 변형은 올리고뉴클레오티드와 표적 사이의 정전기 반발 감소로 인해 특히 유용할 수 있다. 포스페이트 백본의 변형은 또한 포스포디에스테르 결합에서 비-가교 산소 중 하나에 대한 황 원자의 치환을 포함할 수 있다. 이 치환은 포스포디에스테르 연결 대신에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 생성한다. 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 보다 안정한 것으로 나타났다.
전하가 감소된 변형된 뉴클레오타이드의 예는 비하전 및 비하전 서브유닛간 연결을 갖는 포스페이트 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결(예: Sterchak, EP et al., Organic. Chem., 52:4202, (1987)), 및 비하전 모르폴리노 기반을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 비키랄 소단위간 연결을 갖는 중합체(예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호 참조). 일부 뉴클레오티드간 연결 유사체에는 모르폴리데이트, 아세탈 및 폴리아미드 연결 헤테로사이클이 포함된다.
다른 구체예에서, 카고는 잠금 핵산으로 구성된다. 잠금 핵산(LNA)은 변형된 RNA 뉴클레오티드이다(예를 들어, Braasch, et al., Chem. Biol., 8(1):1-7 (2001) 참조). LNA는 펩티드 핵산(PNA)/DNA 하이브리드와 유사한 특성인 DNA/DNA 하이브리드보다 더 안정적인 DNA와 하이브리드를 형성한다. 따라서 LNA는 PNA 분자처럼 사용할 수 있다. LNA 결합 효율은 일부 실시양태에서 이에 양전하를 추가함으로써 증가될 수 있다. 상업용 핵산 합성기와 표준 포스포라미다이트 화학이 LNA를 만드는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 카고는 펩티드 핵산으로 구성된다. 펩티드 핵산(PNA)은 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 백본이 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 반복함으로써 완전히 대체되고 포스포디에스테르 결합이 일반적으로 펩티드 결합으로 대체되는 합성 DNA 모방체이다. 다양한 헤테로사이클릭 염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 백본에 연결된다. PNA는 기존의 DNA 올리고뉴클레오티드와 유사하지만 비키랄 및 중성으로 하전된 분자인 헤테로사이클릭 염기의 간격을 유지한다. 펩티드 핵산은 펩티드 핵산 단량체로 구성된다.
다른 백본 변형에는 펩티드 및 아미노산 변형 및 변형이 포함된다. 따라서, PNA와 같은 올리고뉴클레오타이드의 백본 구성성분은 펩티드 연결일 수 있거나, 또는 대안적으로 비-펩티드 펩티드 연결일 수 있다. 예로는 아세틸 캡, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산과 같은 아미노 스페이서(본원에서 O-링커로 지칭됨), 라이신과 같은 아미노산이 PNA에서 양전하가 필요한 경우 특히 유용한다. PNA의 화학적 조립 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 및 5,786,571을 참조하십시오.
카고는 선택적으로 안정성 및/또는 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키기 위해 한쪽 또는 양쪽 말단에 하나 이상의 말단 잔기 또는 변형을 포함한다. 일반적으로 사용되는 양으로 하전된 모이어티에는 아미노산 라이신 및 아르기닌이 포함되지만 다른 양으로 하전된 모이어티도 유용할 수 있다. 프로필아민 그룹을 사용하여 분해를 방지하기 위해 말단 캡핑이 되도록 카고를 추가로 수정할 수 있다. 3' 또는 5' 캡핑 올리고뉴클레오티드에 대한 절차는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
C. 약제학적 조성물
조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다.
3E10 항체와 복합체화된 핵산 카고를 포함하는 조성물은 바람직하게는 적합한 약제학적 담체와 조합하여 치료 용도로 사용된다. 이러한 조성물은 유효량의 조성물, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다.
조성물은 적합한 약제학적 담체에서 국소적으로, 국부적으로 또는 전신적으로 투여하기 위한 제형일 수 있다. E. W. Martin의 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition(Mark Publishing Company, 1975)은 전형적인 담체 및 제조 방법을 개시한다. 복합체는 또한 세포 표적화를 위해 생분해성 또는 비-생분해성 중합체 또는 단백질 또는 리포솜으로 형성된 적절한 생체적합성 입자로 캡슐화될 수 있다. 이러한 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 복합체는 나노입자에 캡슐화된다.
주사용 제제는 선택적으로 방부제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다중 투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 특정 실시양태에서 대상체의 혈액과 등장성일 수 있는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있다. 비수성 용매의 예로는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 참기름, 코코넛 오일, 아라키스 오일, 땅콩 오일, 미네랄 오일, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르 또는 합성 모노 또는 디-를 포함하는 고정 오일이 있다. 글리세리드. 수성 담체에는 물, 알코올/수성 용액, 염수 및 완충 매질을 포함한 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 1,3-부탄디올, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예: Ringer's dextrose 기반)가 포함된다. 물질은 용액, 에멀젼 또는 현탁액(예: 입자, 리포솜 또는 세포에 혼입됨)일 수 있다. 전형적으로, 약제학적으로 허용되는 염의 적절한 양은 제형이 등장성이 되도록 하기 위해 제형에 사용된다. 트레할로오스는 전형적으로 1-5%의 양으로 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다.
약제학적 조성물은 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 및 표면 활성제를 포함할 수 있다. 담체 제형은 펜실베니아주 이스턴에 소재한 Mack Publishing Co.의 Remington's Pharmaceutical Sciences에서 찾을 수 있다. 당업자는 과도한 실험에 의지하지 않고 조성물을 제조하고 제형화하기 위한 다양한 매개변수를 쉽게 결정할 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여 또한 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제형으로 제조될 수 있다(즉, "분무화"될 수 있음). 에어로졸 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 및 공기와 같은 가압 가능한 추진제에 넣을 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적절한 추진제를 사용하여 가압 팩 또는 분무기에서 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
일부 실시양태에서, 염, 담체, 완충제, 유화제, 희석제, 부형제, 킬레이트화제, 보존제, 가용화제 또는 안정화제와 같은 제제 성분과 함께 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
핵산은 세포 흡수를 개선하기 위해 C32 기능을 갖는 콜레스테롤 및 라우르산 및 리토콜산 유도체와 같은 친유성 그룹에 접합될 수 있다. 예를 들어, 콜레스테롤은 시험관내(Lorenz, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14(19):4975-4977 (2004)) 및 생체내(Soutschek)의 siRNA의 흡수 및 혈청 안정성을 향상시키는 것으로 입증되었다. , et al., Nature, 432(7014):173-178(2004)). 또한, LDL과 같은 혈류의 다른 지단백질에 대한 스테로이드 접합된 올리고뉴클레오티드의 결합은 무결성을 보호하고 생체분포를 촉진하는 것으로 나타났다(Rump, et al., Biochem. Pharmacol., 59(11):1407-1416( 2000)). 세포 흡수를 증가시키기 위해 전술한 핵산에 부착되거나 접합될 수 있는 다른 그룹에는 아크리딘 유도체; 소랄렌 유도체, 아지도페나실, 프로플라빈, 아지도프로플라빈 등의 가교제; 인공 엔도뉴클레아제; EDTA-Fe(II) 및 포르피린-Fe(II)와 같은 금속 착물; 알킬화 모이어티; 알칼리성 포스파타제와 같은 뉴클레아제; 말단 전이효소; 압자임; 콜레스테릴 모이어티; 친유성 담체; 펩티드 접합체; 장쇄 알코올; 인산 에스테르; 방사성 표지자; 비방사성 마커; 탄수화물; 및 폴리리신 또는 기타 폴리아민을 포함한다. Levy 등의 미국 특허 번호 6,919,208은 또한 향상된 전달 방법을 설명한다. 이러한 약제학적 제형은 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 부양, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다.
추가 담체에는 복합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출 제제가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형 입자, 예를 들어 필름, 리포솜 또는 마이크로입자의 형태이다. 이식은 이식 가능한 약물 전달 시스템, 예를 들어, 미소구체, 하이드로겔, 고분자 저장소, 콜레스테롤 매트릭스, 고분자 시스템, 예를 들어 매트릭스 침식 및/또는 확산 시스템 및 비고분자 시스템을 삽입하는 것을 포함한다. 흡입은 단독으로 또는 흡수될 수 있는 담체에 부착된 흡입기에서 에어로졸과 함께 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 전신 투여의 경우, 조성물이 리포솜에 캡슐화되는 것이 바람직할 수 있다.
조성물은 혈관 또는 요도 카테터와 같은 침습적 장치를 사용하고 약물 전달 능력을 갖고 또는 스텐트 이식편과 같은 확장 장치로 구성된 스텐트와 같은 중재 장치를 사용하여 작용제 및/또는 뉴클레오티드 전달 시스템의 조직 특이적 흡수를 가능하게 하는 방식으로 전달될 수 있다.
제형은 확산을 통해 또는 중합체 매트릭스의 분해를 통해 생분해성 임플란트를 사용하여 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제의 투여는 특정 기간, 예를 들어, 몇 시간, 며칠, 몇 주, 몇 달 또는 몇 년에 걸쳐 조성물에 순차적으로 노출되도록 설계될 수 있다. 이는 예를 들어 제형의 반복 투여에 의해 또는 조성물이 반복 투여 없이 장기간에 걸쳐 전달되는 지속 또는 제어 방출 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.
적절한 다른 전달 시스템은 시간-방출, 지연 방출, 지속 방출 또는 제어 방출 전달 시스템을 포함한다. 이러한 시스템은 많은 경우에 반복 투여를 피할 수 있어 피험자와 의사의 편의성을 높일 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 예를 들어 폴리락트산 및/또는 폴리글리콜산, 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 코폴리옥살레이트, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산 및/또는 이들의 조합과 같은 중합체 기반 시스템이 포함된다. 핵산을 함유하는 전술한 중합체의 마이크로캡슐은 예를 들어 미국 특허 제5,075,109호에 기재되어 있다. 다른 예로는 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르와 같은 스테롤 및 모노-, 디- 및 트리글리세리드와 같은 중성 지방 또는 중성 지방을 포함하는 지질 기반 비폴리머 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 리포솜 기반 시스템; 인지질 기반 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 또는 부분적으로 융합된 임플란트. 제형은 예를 들어 미소구체, 히드로겔, 중합체 저장소, 콜레스테롤 매트릭스, 또는 중합체 시스템일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 예를 들어 복합체를 함유하는 제제의 확산 또는 침식/분해 속도의 제어를 통해 조성물의 지속 또는 제어 방출이 발생하도록 할 수 있다.
복합체는 핵산 카고 및 항체를 포함하고, 이들의 조성물은 폐 또는 점막 투여용으로 제형화될 수 있다. 투여는 폐, 비강, 구강(설하, 협측), 질 또는 직장 점막으로의 조성물의 전달을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 에어로졸이라는 용어는 추진제를 사용하여 생성되었는지 여부에 관계없이 용액 또는 현탁액 상태일 수 있는 미세한 입자 미스트의 제조를 의미한다. 에어로졸은 초음파 처리 또는 고압 처리와 같은 표준 기술을 사용하여 생성할 수 있다.
상기도를 통한 투여의 경우, 제형은 용액, 예를 들어 완충 또는 비완충 염수 또는 등장 식염수로 제형화되거나, 비강내 투여를 위한 현탁액으로서 점적 또는 스프레이로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 용액 또는 현탁액은 비강 분비물에 대해 등장성이며, 예를 들어 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.4 또는 pH 6.0 내지 pH 7.0 범위의 거의 동일한 pH이다. 완충액은 생리학적으로 적합해야 하며 단순히 예를 들어 인산염 완충액을 포함해야 한다.
복합체는 입자 전달 비히클을 사용하여 표적 세포에 전달할 수 있다. 나노입자는 일반적으로 500 nm 내지 0.5 nm 미만 범위의 입자, 바람직하게는 50 내지 500 nm, 보다 바람직하게는 50 내지 300 nm의 직경을 갖는 입자를 지칭한다. 고분자 입자의 세포 내재화는 크기에 크게 의존하며, 나노입자 고분자 입자는 미세입자 고분자 입자보다 훨씬 높은 효율로 세포에 내면화된다. 예를 들어, Desai, et al. 직경이 100 nm인 나노입자는 직경이 1 ㅅM인 마이크로입자와 비교하여 배양된 Caco-2 세포에 의해 약 2.5배 더 많이 흡수된다는 것을 입증했다(Desai, et al., Pharm. Res., 14:1568- 73(1997)). 나노 입자는 또한 생체 내 조직으로 더 깊숙이 확산되는 더 큰 능력을 가지고 있다.
일부 실시양태에서, 전달 비히클은 덴드리머이다.
바람직한 생분해성 중합체의 예는 가수분해에 의해 분해되는 합성 중합체, 예를 들어 폴리(히드록시산), 예를 들어 락트산 및 글리콜산의 중합체 및 공중합체, 기타 분해성 폴리에스테르, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리( 부틱산), 폴리(발레르산), 폴리(카프로락톤), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 및 폴리(아민-코-에스테르) 폴리머, 예를 들어 Zhou, et al. , Nature Materials, 11:82-90 (2012) 및 WO 2013/082529, 미국 공개 출원 번호 2014/0342003, 및 PCT/US2015/061375.
일부 실시양태에서, 특히 생체내 T 세포를 표적화하기 위한 것, 예를 들어 CAR T 세포, 면역 세포 또는 T 세포 마커, 예를 들어 CD3, CD7 또는 CD8, 또는 표적 조직의 마커, 예를 들어 간을 생체내 생성하기 위한 것 , 타겟팅할 수 있다. 예를 들어, 항-CD8 항체 및 항-CD3 Fab 단편은 모두 생체내에서 T 세포를 표적화하는 데 사용되었다(Pfeiffer, et al., EMBO Mol Med., 10(11) (2018). pii: e9158. doi: 10.15252)/emmm.201809158., Smith, et al., Nat Nanotechnol., 12(8):813-820 (2017). doi: 10.1038/nnano.2017.57). 따라서, 일부 실시양태에서, 입자 또는 다른 전달 비히클은 CD3, CD7, CD8, 또는 다른 면역 세포(예를 들어, T 세포) 마커에 특이적인 표적화 모이어티, 또는 흉선, 비장, 또는 간. 결합 모이어티는 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
표적화 모이어티는 나노입자 또는 이의 다른 전달 비히클과 회합되거나, 연결되거나, 접합되거나, 그렇지 않으면 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 표적 분자는 표적 세포 표면의 수용체 또는 다른 분자에 결합하는 단백질, 펩티드, 핵산 분자, 당류 또는 다당류일 수 있다. 표적 분자의 선택을 통해 이식편에 대한 특이성 및 결합력을 조절할 수 있다.
모이어티의 예는 예를 들어 특정 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, T 세포 또는 임의의 다른 바람직한 세포 유형에 대한 항체에 대한 분자의 전달을 제공하는 표적화 모이어티, 뿐만 아니라 에 발현된 수용체 및 리간드를 포함한다. 선호하는 세포 유형. 바람직하게는, 모이어티는 조혈 줄기 세포를 표적으로 한다. 세포외 기질("ECM")을 표적으로 하는 분자의 예는 글리코사미노글리칸("GAG") 및 콜라겐을 포함한다. 한 실시양태에서, 중합체 입자의 외부 표면은 선택된 세포 또는 조직과 상호작용하는 입자의 능력을 향상시키도록 변형될 수 있다. 표적화 분자에 접합된 어댑터 요소가 입자에 삽입되는 전술한 방법이 바람직하다. 그러나, 또 다른 실시양태에서, 카르복시 말단을 갖는 중합체 마이크로- 또는 나노입자의 외부 표면은 유리 아민 말단을 갖는 표적 분자에 연결될 수 있다.
고분자 마이크로 및 나노 입자에 부착된 다른 유용한 리간드에는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)이 포함된다. PAMP는 세포 또는 조직 표면의 TLR(Toll-like Receptor)을 표적으로 하거나 내부적으로 세포 또는 조직에 신호를 보내 잠재적으로 흡수를 증가시킨다. 입자 표면에 접합되거나 공동 캡슐화된 PAMP에는 메틸화되지 않은 CpG DNA(박테리아), 이중 가닥 RNA(바이러스), 지질다당류(박테리아), 펩티도글리칸(박테리아), 리포아라비노만닌(박테리아), 자이모산(효모), 마이코플라즈마 지단백질이 포함될 수 있다. 예를 들어 MALP-2(박테리아), 플라젤린(박테리아) 폴리(이노신-시티딜)산(박테리아), 리포테이코산(박테리아) 또는 이미다조퀴놀린(합성).
다른 구체예에서, 입자의 외부 표면은 만노스 아민을 사용하여 처리되어 입자의 외부 표면을 만노실화시킬 수 있다. 이 처리는 입자가 항원 제시 세포 표면의 만노스 수용체에서 표적 세포 또는 조직에 결합하도록 할 수 있다. 대안적으로, Fc 부분(표적화 Fc 수용체), 열 충격 단백질 부분(HSP 수용체), 포스파티딜세린(스캐빈저 수용체) 및 지질다당류(LPS)를 포함하는 면역글로불린 분자와의 표면 접합은 세포 또는 조직에 대한 추가 수용체 표적이다.
마이크로 및 나노 입자에 공유 결합되어 뮤신 및 점막 세포층에 특이적 표적이 될 수 있는 렉틴.
표적화 모이어티의 선택은 나노입자 조성물 및 표적화될 세포 또는 조직의 투여 방법에 의존할 것이다. 표적화 분자는 일반적으로 세포 또는 조직에 대한 입자의 결합 친화도를 증가시킬 수 있거나, 나노입자를 기관의 특정 조직 또는 조직의 특정 세포 유형에 표적화할 수 있다. . 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 흉선, 비장 또는 암 세포를 표적화한다
순수하거나 부분적으로 정제된 형태의 뮤신의 천연 성분을 입자에 공유 결합하면 비드-장 계면의 표면 장력이 감소하고 뮤신 층에서 비드의 용해도가 증가한다. 폴리아스파르트산 및 폴리글루탐산과 같은 추가 펜던트 카르복실산 측기를 함유하는 폴리아미노산의 부착은 생체접착성을 증가시킨다. 15,000~50,000kDa 분자량 범위의 폴리아미노산을 사용하면 입자 표면에 부착된 120~425개 아미노산 잔기의 사슬이 생성된다. 폴리아미노 사슬은 증가된 카르복실 전하뿐만 아니라 점액 가닥의 사슬 얽힘을 통해 생체 접착력을 증가시킨다.
III. 사용 방법
핵산 작제물의 전달을 향상시키기 위해 3E10을 사용하는 방법이 제공된다. 일반적으로 유효량의 3E10 항체는 먼저 세포로의 전달이 원하는 핵산 카고와 접촉된다. 예를 들어, 핵산 카고와 항체는 핵산 카고와 항체가 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 용액에서 혼합될 수 있다. 다음으로 혼합물은 세포와 접촉된다. 다른 구체예에서, 카고 및 항체는 세포를 함유하거나 그렇지 않으면 목욕하는 용액에 첨가되고, 복합체는 세포의 존재 하에 형성된다. 복합체는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포와 접촉될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 복합체의 용액은 배양된 세포에 첨가되거나 치료될 동물에 주입된다.
항체는 핵산을 세포 핵으로 전달하는 데 도움이 되며, 그런 다음 기증자 DNA에 의한 유전자 편집을 촉진할 수 있는 RAD51 경로의 기능을 변경하는 것으로 여겨진다. 접근 방식은 핵산 화물의 설계에 서열 제한이 없다. 치료는 예를 들어 항체와 핵산 화물의 혼합물을 간단한 IV 투여에 의해 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것일 수 있다.
조성물 및 방법은 RNA, DNA, PNA 또는 기타 변형된 핵산, 또는 이들의 조합으로 형성된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 핵산 구축물을 포함할 수 있다.
조성물의 유효량 또는 치료 유효량은 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 억제 또는 완화하거나, 그렇지 않으면 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과, 예를 들어, 질병 또는 장애의 기저에 깔린 하나 이상의 병태생리학적 기전을 억제하거나 역전시키는 것.
유효량은 또한 항체의 부재하에 카고의 투여에 비해 핵산 카고의 전달 속도, 양 및/또는 품질을 증가시키는 데 효과적인 양일 수 있다. 조성물의 제형은 투여 방식에 맞게 만들어진다. 약제학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 복합체를 함유하는 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다. 정확한 투여량은 피험자 의존적 변수(예: 연령, 면역 체계 건강, 임상 증상 등)와 같은 다양한 요인에 따라 달라진다.
조성물은 1일 1회, 2회 또는 3회 투여되거나 그렇지 않으면 표적 세포와 접촉될 수 있고; 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일주일에 일곱 번, 한 달에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 번. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 2 또는 3일마다, 또는 약 1주일에 평균 약 2 내지 약 4회 투여된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 2개 이상의 개별 치료를 포함하는 투여 요법의 일부로서 투여된다.
투여 요법은 2회 이상의 투여 사이에 투여량이 동일하게 유지되는 유지 요법, 2회 이상의 투여 사이에서 투여량이 증가하는 단계적 증량 요법, 2회 이상의 투여 사이에서 투여량이 감소하는 단계적 축소 요법, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 용량은 저용량일 수 있다. 만족스러운 생화학적 또는 임상적 반응에 도달할 때까지 용량 증량을 계속할 수 있다. 임상 반응은 치료되는 질병 또는 장애 및/또는 원하는 결과에 따라 달라진다. 일부 실시양태에서, 바람직하게는 바람직하지 않은 독성 또는 그의 허용 가능한 많은 양을 유도하지 않고 치료 효과가 확인될 때까지 투여량이 증가할 수 있다. 다음으로, 복용량을 유지하거나 유지 복용량으로 꾸준히 줄일 수 있다. 이 방법은 투여량 수준, 투여 빈도 또는 요법 기간을 표준화, 최적화 또는 맞춤화하는 데 사용할 수 있다.
일반적으로, 특히 생체내 투여의 경우 투여 전에 항체와 핵산을 실온에서 일정 시간 혼합한다. 일부 실시양태에서, 착화 시간은 예를 들어 각각 포함하는 1분 내지 30분, 또는 10분 내지 20분의 범위이며, 바람직한 착화 시간은 약 15분이다. 항체 용량은 각각 0.0001 mg 내지 1 mg의 범위일 수 있으며, 바람직한 용량은 약 0.1 mg이다. 핵산 용량은 0.001 ㅅg에서 100 ㅅg까지이며, 10 ㅅg가 권장된다. 아래의 생체 내 데이터(예: 그림 6B)는 0.1mg 3E10, 10μg의 mRNA를 사용하여 생성되었으며 15분 동안 복합화되었다.
아래의 예는 DNA 카고가 종양에 국한되지 않고 여러 조직에 보다 일반적으로 전달될 수 있는 반면 RNA 전달은 종양 조직에 대해 보다 선택적일 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, RNA 카고(예를 들어, 단독)는 암 세포 또는 다른 종양 조직에 선택적으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 카고의 더 넓은 분포가 요망되는 경우, RNA는 비-암/종양 조직으로의 전달을 용이하게 하기 위해 DNA(예를 들어, 운반체 DNA)와 혼합될 수 있다. 운반체 DNA는 예를 들어 연어 정자로부터 유래한 플라스미드 DNA 또는 저분자량일 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체 DNA는 비-코딩 DNA이다. 캐리어 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체 DNA는 길이가 1-10, 1-100, 1-1,000, 또는 1-10,000개의 뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 하위 범위 또는 정수, 또는 그의 조합을 갖는 핵산으로 구성된다. 일반적으로 운반체 DNA는 접합되지 않거나 항체에 공유적으로 부착되지 않는다. 일반적으로 캐리어 DNA는 카고 핵산(예: RNA) 및 항체와 함께 인큐베이션되고 이들과 복합체로 공동 전달된다. 일부 실시양태에서, 담체 DNA는 비-코딩 DNA이다.
A. 시험관내 및 생체외 방법
시험관내 및 생체외 방법의 경우, 세포는 전형적으로 배양 중에 조성물과 접촉된다. 생체외 방법의 경우, 세포를 대상체로부터 단리하고 생체외 조성물과 접촉시켜 카고 핵산(들)을 함유하는 세포를 생성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 치료될 대상체로부터 또는 동계 숙주로부터 단리된다. 표적 세포는 조성물과 접촉하기 전에 대상체로부터 제거될 수 있다.
B. 생체내 방법
일부 실시양태에서, 세포로의 핵산 카고의 생체내 전달은 대상체의 질환 또는 장애의 유전자 편집 및/또는 치료를 위해 사용된다. 전형적으로 항체-핵산 카고를 포함하는 조성물은 생체내 요법을 위해 대상체에게 직접 투여될 수 있다.
일반적으로, 항체, 올리고뉴클레오티드 및 관련 분자를 포함하는 화합물을 투여하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 특히, 현재 사용 중인 제제와 함께 핵산 치료제에 이미 사용 중인 투여 경로는 상기 기재된 공여자 올리고뉴클레오티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제제를 제공한다. 바람직하게는 조성물은 동물에 주사 또는 주입된다.
조성물은 정맥내, 복강내, 양막내, 근육내, 피하 또는 국소(설하, 직장, 비강내, 폐, 직장 점막 및 질) 및 경구(설하, 협측).
일부 실시양태에서, 조성물은 비강내 투여 또는 경구 흡입과 같은 폐 전달을 위해 제제화된다. 제형의 투여는 복합체가 그들의 표적에 도달하도록 허용하는 임의의 허용가능한 방법에 의해 달성될 수 있다. 투여는 치료되는 상태에 따라 국소화되거나(즉, 특정 영역, 생리학적 시스템, 조직, 기관 또는 세포 유형에) 전신적일 수 있다. 생체내 전달을 위한 조성물 및 방법은 또한 WO 2017/143042에서 논의된다.
상기 방법은 또한 생체내에서 유효량의 항체-핵산 복합체 조성물을 배 또는 태아 또는 그의 임산부에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 조성물은 정맥 또는 동맥, 예컨대 난황 정맥 또는 제대 정맥, 또는 배 또는 태아의 양막에 조성물을 주사 및/또는 주입함으로써 자궁 내로 전달된다. 예를 들어, Ricciardi, et al., Nat Commun. 2018년 6월 26일;9(1):2481. doi: 10.1038/s41467-018-04894-2, 및 WO 2018/187493.
다. 신청
관심 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산 카고, 예를 들어 mRNA, 기능적 핵산, DNA 발현 구축물, 벡터 등은 다음의 발현 또는 억제를 위해 3E10 항체를 사용하여 세포로 전달될 수 있다 세포에 있는 폴리펩티드. 조성물 및 방법은 다양한 응용 분야에 걸쳐 사용될 수 있다. 비제한적인 예에는 CRISPR 및 gRNA 발현 벡터 +/- DNA 편집, 큰 DNA(플라스미드 및 발현 벡터)의 전달, 유전자 대체 및 유전자 요법, 예를 들어 CAR-T 세포를 생성하기 위한 DNA 및/또는 RNA의 전달이 포함된다. 생체 내 또는 생체 외 및 생체 내 또는 생체 외 CAR-T 세포 생산을 단순화하기 위해 siRNA의 전달, mRNA의 전달 등. 유전자 치료/유전자 편집 및 면역 조절, 특히 키메라 항원 수용체 T 세포 생산과 관련된 예시적인 적용은 아래에서 논의됨.
1. 유전자 치료 및 편집
일부 실시양태에서, 조성물은 유전자 편집에 사용된다. 예를 들어, 상기 방법은 단일 유전자의 돌연변이로 인한 유전적 결함, 장애 및 질병을 치료하는 데 특히 유용할 수 있으며, 예를 들어 점 돌연변이에 의해 유발되는 유전적 결함, 장애 및 질병을 교정할 수 있다. 표적 유전자가 유전적 장애의 원인이 되는 돌연변이를 포함하는 경우, 그 방법은 표적 유전자의 DNA 서열을 정상으로 회복시킬 수 있는 돌연변이 유발 복구에 사용될 수 있다. 표적 서열은 유전자의 코딩 DNA 서열 내에 또는 인트론 내에 있을 수 있다. 표적 서열은 또한 프로모터 또는 인핸서 서열을 포함하여 표적 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열 내에 있을 수 있다.
본원의 방법에서, 복합체와 접촉된 세포는 대상체에게 투여될 수 있다. 피험자는 혈우병, 근이영양증, 글로빈병증, 낭포성 섬유증, 색소성 건조증 또는 리소좀 축적 질환과 같은 질병 또는 장애를 가질 수 있다. 이러한 실시양태에서, 유전자 변형, 유전자 대체, 유전자 추가, 또는 이들의 조합은 대상체에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키는 유효량으로 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 카고는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 공여자 올리고뉴클레오티드 또는 공여자 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다.
a. 유전자 편집 뉴클레아제
핵산 카고에는 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 파손을 유도하는 요소 또는 요소들을 암호화하는 것들이 포함되며, 선택적으로, 그러나 바람직하게는 공여자 올리고뉴클레오티드 및/또는 특히 CRISPR의 경우 다른 요소와 조합하여 사용하는 것이 바람직한다. /Cas, gRNA와 같은 시스템의 다른 요소. 조성물은 예를 들어 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 달리 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
나. 가닥 파손 유도 요소
크리스퍼/카스
일부 실시양태에서, 핵산 카고는 CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물의 하나 이상의 요소, CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물의 하나 이상의 요소를 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물은 포유동물 대상체에서 CRISPR/Cas-매개 게놈 편집을 수행하는 데 필요한 CRISPR 시스템의 요소를 지칭한다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물은 일반적으로 crRNA, tracrRNA(또는 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA라고도 하는 이의 키메라) 및 Cas 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산, 예를 들어 캐스9. CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물은 표적 부위(예를 들어, Cas9에 의해 유도된 단일 또는 이중 스탠드 파손 부위)에서 또는 이에 인접하여 표적 세포의 게놈으로 재조합될 수 있는 공여자 폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물에서 사용하기 위한 유전자 편집(특정 유전자의 억제, 강화 또는 변경)으로 사용하도록 조정되었다(예: Cong, Science, 15:339(6121):819-823(2013) 및 Jinek, et al., Science, 337(6096):816-21(2012)). cas 유전자와 특별히 설계된 CRISPR을 포함하는 필수 요소로 세포를 형질감염시킴으로써 유기체의 게놈을 원하는 위치에서 절단하고 수정할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 게놈 편집에 사용하기 위한 조성물을 제조하는 방법은 WO 2013/176772 및 WO 2014/018423에 상세히 기재되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.
본원에 개시된 전달 방법은 CRISPR/Cas 시스템에 대한 다양한 변형과 함께 사용하기에 적합하다.
일반적으로 "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자, tracr(트랜스 활성화 CRISPR) 서열을 인코딩하는 서열을 포함하여 CRISPR 관련("Cas") 유전자의 발현 또는 활성 지시에 관여하는 전사체 및 기타 요소를 총칭한다. (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복" 및 tracrRNA 처리 부분 직접 반복 포함), 가이드 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"), 또는 CRISPR 유전자좌의 다른 서열 및 전사체. 가이드 서열(예를 들어, 직접 반복부-스페이서-직접 반복부)에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 tracr 메이트 서열은 처리 전 pre-crRNA(pre-CRISPR RNA) 또는 뉴클레아제에 의한 처리 후 crRNA로도 지칭될 수 있다.
아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, tracrRNA 및 crRNA는 연결되어 키메라 crRNA-tracrRNA 하이브리드를 형성하고, 여기서 성숙한 crRNA는 설명된 천연 crRNA:tracrRNA 이중체를 모방하기 위해 합성 줄기 루프를 통해 부분 tracrRNA에 융합된다. Cong, Science, 15:339(6121):819-823(2013) 및 Jinek, et al., Science, 337(6096):816-21(2012)). 단일 융합된 crRNA-tracrRNA 작제물은 또한 본원에서 가이드 RNA 또는 gRNA(또는 단일-가이드 RNA(sgRNA))로 지칭된다. sgRNA 내에서 crRNA 부분은 '표적 서열'로 식별될 수 있으며 tracrRNA는 종종 '스캐폴드'라고 한다.
일부 실시양태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 유형 I, 유형 II 또는 유형 III CRISPR 시스템에서 파생된다. 일부 실시양태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 Streptococcus pyogenes와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다.
일반적으로 CRISPR 시스템은 표적 서열(내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 프로토스페이서라고도 함) 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. CRISPR 복합체 형성과 관련하여, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 말하며, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다.
표적 핵산에서 각 프로토스페이서는 개별 CRISPR 시스템에 특이적인 인식을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)와 연관된다. Streptococcus pyogenes CRISPR/Cas 시스템에서 PAM은 뉴클레오티드 서열 NGG이다. Streptococcus thermophiles CRISPR/Cas 시스템에서 PAM은 뉴클레오티드 서열이 NNAGAAW이다. tracrRNA 이중체는 crRNA의 스페이서 영역과 프로토스페이서 DNA 사이의 이종이중체 형성을 통해 프로토스페이서 및 필수 PAM으로 구성된 DNA 표적으로 Cas를 지시한다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열 포함)의 형성은 (예를 들어, 표적 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍. tracr 서열의 전부 또는 일부는 또한 예를 들어 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 대한 혼성화에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다.
원하는 DNA 표적 서열이 확인되면 의사가 적절한 표적 부위를 결정하는 데 도움이 되는 많은 리소스가 있다. 예를 들어, 인간 엑손의 40% 이상을 표적으로 하는 약 190,000개의 잠재적인 sgRNA의 생물정보학적으로 생성된 목록을 포함하여 수많은 공공 자원을 사용하여 의사가 표적 부위를 선택하고 nick 또는 이중 가닥 파손에 영향을 미치도록 관련 sgRNA를 설계할 수 있다. 사이트. 과학자들이 광범위한 종에서 CRISPR 표적 부위를 찾고 적절한 crRNA 서열을 생성하는 데 도움이 되도록 설계된 도구인 crispr.u-psud.fr/도 참조하십시오.
일부 실시양태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터는 CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 표적 세포 내로 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-mate 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터에서 별도의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 요소 중 둘 이상이 단일 벡터에 결합될 수 있으며, 하나 이상의 추가 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성요소를 제공한다. 단일 벡터에 결합된 CRISPR 시스템 요소는 제2 요소(의 "업스트림")에 대해 5'에 위치하거나 ("다운스트림")에 대해 3'에 위치한 하나의 요소와 같은 임의의 적절한 방향으로 배열될 수 있다. 한 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 동일 또는 반대 가닥에 위치할 수 있고, 동일 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소 및 하나 이상의 가이드 서열, tracr 메이트 서열(선택적으로 가이드 서열에 작동가능하게 연결됨), 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 매립된 tracr 서열( 예를 들어, 서로 다른 인트론에 각각, 적어도 하나의 인트론에 둘 이상 또는 단일 인트론에 모두 있음). 일부 실시양태에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열, 및 tracr 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되고 그로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열("클로닝 부위"로도 지칭됨)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입 부위 이상)는 의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 시퀀스 요소. 일부 실시양태에서, 벡터는 tracr 메이트 서열의 상류, 및 임의로 tracr 메이트 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소의 하류에 삽입 부위를 포함하여, 삽입 부위 내로 가이드 서열의 삽입 및 발현시 가이드 서열이 진핵 세포의 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 2개 이상의 삽입 부위를 포함하고, 각각의 삽입 부위는 각 부위에 가이드 서열의 삽입을 허용하도록 2개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치한다. 이러한 배열에서, 2개 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열의 2개 이상의 카피, 2개 이상의 상이한 가이드 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 구축물은 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있고, 임의로 세포에 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csxl2로도 알려짐), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csxl0, Csxfl, Csx Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 버전. 일부 실시양태에서, 비변형 CRISPR 효소는 Cas9와 같은 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보체 내와 같은 표적 서열의 위치에서 가닥 중 하나 또는 둘 모두의 절단을 지시한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 효소는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터의 또는 그 이상의 염기쌍.
일부 실시양태에서, 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥 중 하나 또는 둘 모두를 절단하는 능력이 부족하도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 코딩한다. 예를 들어, S. pyogenes에서 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를 두 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 닉카제로 전환한다(단일 가닥 절단). Cas9를 닉카제로 만드는 돌연변이의 다른 예에는 H840A, N854A 및 N863A가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 추가 예로서, Cas9의 2개 이상의 촉매 도메인(RuvC I, RuvC II 및 RuvC III)은 돌연변이되어 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas9를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, D10A 돌연변이는 H840A, N854A 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 조합되어 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 Cas9 효소를 생성한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 효소는 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 또는 돌연변이되지 않은 형태와 관련하여 더 낮다.
일부 실시양태에서, CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 인간이 아닌 영장류를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이들로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 초과, 15, 20, 25, 50 또는 그 이상의 코돈)은 천연 아미노산 서열을 유지하면서 그 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하거나 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 갖는 천연 서열. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 보이다. 코돈 편향(유기체 간 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA) 번역의 효율성과 상관관계가 있으며, 이는 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성과 특정 개체의 가용성에 달려 있다고 믿어진다. 전달 RNA(tRNA) 분자.
세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 테이블은 예를 들어 "코돈 사용 데이터베이스"에서 쉽게 사용할 수 있으며 이러한 테이블은 다양한 방식으로 조정할 수 있다. Nakamura, Y., et al., Nucl. Acids Res., 28:292(2000). 특정 숙주 세포, 예를 들어 Gene Forge(Aptagen; Jacobus, PA)에서 발현을 위한 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘도 이용 가능한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 효소를 코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 가장 빈번하게 특정 아미노산에 사용되는 코돈.
일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하는 CRISPR 효소를 인코딩한다. 하나보다 많은 NLS가 존재할 때, 각각은 다른 것들과 독립적으로 선택될 수 있어, 단일 NLS가 하나 이상의 카피에 및/또는 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합되어 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, NLS의 가장 가까운 아미노산이 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 이내일 때 NLS는 N- 또는 C-말단 근처에서 고려된다. , 또는 N- 또는 C-말단에서 폴리펩티드 사슬을 따라 더 많은 아미노산.
일반적으로, 하나 이상의 NLS는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양으로 CRISPR 효소의 축적을 유도하기에 충분한 강도를 갖는다. 일반적으로 핵 국소화 활성의 강도는 CRISPR 효소의 NLS 수, 사용된 특정 NLS 또는 이러한 요인의 조합에서 파생될 수 있다.
핵내 축적의 검출은 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 핵의 위치를 검출하기 위한 수단(예를 들어, DAPI와 같은 핵에 특이적인 얼룩)과 조합하여 세포 내의 위치가 시각화될 수 있도록 검출 가능한 마커가 CRISPR 효소에 융합될 수 있다. ). 세포 핵은 또한 세포로부터 단리될 수 있으며, 그 내용은 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 효소 활성 분석과 같은 단백질 검출을 위한 임의의 적절한 프로세스에 의해 분석될 수 있다. 핵 내 축적은 CRISPR 복합체 형성 효과에 대한 분석(예: 표적 서열에서 DNA 절단 또는 돌연변이에 대한 분석, 또는 CRISPR 복합체 형성 및/또는 또는 CRISPR 효소 활성), CRISPR 효소 또는 복합체에 노출되지 않거나 하나 이상의 NLS가 결여된 CRISPR 효소에 노출된 대조군과 비교.
일부 실시양태에서, CRISPR 시스템의 요소 중 하나 이상은 Cas9와 같은 유도성 Cas를 포함할 수 있는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013)은 Cas9, tracrRNA, pre-crRNA(또는 Cas9 및 sgRNA)의 이종 발현이 포유류 염색체의 표적 절단을 달성할 수 있다고 보고했다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법에 이용되는 CRISPR 시스템, 따라서 카고 핵산은 CRISPR/Cas 시스템에 작동 가능하게 연결된 제1 조절 요소를 포함할 수 있는 CRISPR 시스템의 요소를 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 벡터 시스템이다. (a) 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열, (b) tracr 메이트 서열, 및 (c) tracr 서열을 포함하는 키메라 RNA(chiRNA) 폴리뉴클레오티드 서열; 및 선택적으로 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함할 수 있는 CRISPR 효소를 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함한다. 요소 (a), (b) 및 (c)는 5'에서 3 방향으로 배열될 수 있으며, 여기서 성분 I 및 II는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, 전사될 때 tracr 메이트 서열은 tracr 서열 및 가이드 서열은 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하고, 여기서 CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열에 혼성화된 가이드 서열, 및 (2)와 복합체화된 CRISPR 효소를 포함할 수 있다. tracr 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열, 여기서 CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열은 이종 기능적 도메인을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 벡터 중 하나 이상은 또한 적합한 Cas 효소, 예를 들어 Cas9를 코딩한다. 상이한 유전 요소는 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
엔지니어링된 CRISPR 시스템에 따라 세부 사항이 다를 수 있지만 전체 방법론은 유사한다. CRISPR 기술을 사용하여 DNA 서열을 표적화하는 데 관심이 있는 의사(많은 온라인 도구 중 하나를 사용하여 식별)는 표적 서열을 포함하는 짧은 DNA 단편을 가이드 RNA 발현 플라스미드에 삽입할 수 있다. sgRNA 발현 플라스미드는 표적 서열(약 20개의 뉴클레오티드), tracrRNA 서열의 형태(스캐폴드), 적절한 프로모터 및 진핵 세포에서 적절한 처리에 필요한 요소를 포함한다. 이러한 벡터는 상업적으로 이용 가능한다(예: Addgene 참조). 많은 시스템은 어닐링되어 이중 가닥 DNA를 형성한 다음 sgRNA 발현 플라스미드에 복제되는 맞춤형 상보적 올리고에 의존한다. 형질감염된 세포에서 동일하거나 별도의 플라스미드로부터 sgRNA 및 적절한 Cas 효소의 동시 발현은 원하는 표적 부위에서 단일 또는 이중 가닥 파손(Cas 효소의 활성에 따라 다름)을 초래한다.
ii. 아연 핑거 뉴클레아제
일부 실시양태에서, 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 파손을 유도하는 요소는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 코딩하는 핵산 구축물 또는 구축물이다. 따라서 핵산 카고는 ZFN을 인코딩할 수 있다.
ZFN은 전형적으로 절단 도메인에 연결된 아연-핑거 단백질로부터 유래된 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 가장 일반적인 절단 도메인은 유형 IIS 효소 Fokl이다. Fok1은 한 가닥의 인식 부위에서 9개의 뉴클레오타이드와 다른 가닥의 인지 부위에서 13개의 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, U.S. Pat. 제5,356,802호; 5,436, 150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 Li et al. Proc., Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992):4275-4279; Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2764-2768 (1993); Kim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:883-887 (1994a); Kim et al. J. Biol. Chem. 269:31 ,978-31,982 (1994b). 이들 효소(또는 이의 효소적으로 기능적인 단편) 중 하나 이상은 절단 도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
원칙적으로 관심 있는 모든 게놈 위치를 표적으로 하도록 설계될 수 있는 DNA 결합 도메인은 Cys2His2 징크 핑거의 직렬 배열일 수 있으며, 각각은 일반적으로 표적 DNA 서열에서 3~4개의 뉴클레오티드를 인식한다. Cys2His2 도메인은 일반적인 구조를 가지고 있다: Phe(때로는 Tyr)-Cys-(2-4개 아미노산)-Cys-(3개 아미노산)-Phe(때로는 Tyr)-(5개 아미노산)-Leu-(2개 아미노산 )-His-(3개의 아미노산)-His. 여러 핑거를 함께 연결함으로써(수는 다양한다: 발표된 연구에서 단량체당 3-6개의 핑거가 사용되었다) ZFN 쌍은 18-36개 뉴클레오티드 길이의 게놈 서열에 결합하도록 설계할 수 있다.
엔지니어링 방법에는 합리적인 설계 및 다양한 유형의 경험적 선택 방법이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 합리적인 디자인은 예를 들어 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오티드 서열 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중항에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 또는 4중항 시퀀스. 예를 들어, U.S. Pat. 제6,140,081호; 6,453,242; 6,534,261; 6,610,512; 6,746,838; 6,866,997; 7,067,617; 미국 공개 출원 번호 2002/0165356; 2004/0197892; 2007/0154989; 2007/0213269; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/53059 및 WO 2003/016496.
iii. 전사 활성제 유사
이펙터 뉴클레아제
일부 실시양태에서, 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 파손을 유도하는 요소는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)를 코딩하는 핵산 구축물 또는 구축물이다. 따라서, 핵산 카고는 TALEN을 인코딩할 수 있다.
TALEN은 ZFN과 유사한 전체 구조를 가지고 있으며, 주된 차이점은 DNA 결합 도메인이 식물 병원성 박테리아의 전사 인자인 TAL 이펙터 단백질에서 유래한다는 점이다. TALEN의 DNA-결합 도메인은 각각 약 34개 잔기 길이의 아미노산 반복의 직렬 배열이다. 반복은 서로 매우 유사한다. 일반적으로 이들은 주로 두 위치(아미노산 12 및 13, 반복 가변 잔기 또는 RVD라고 함)에서 다르다. 각 RVD는 4개의 가능한 뉴클레오티드 중 하나에 우선적으로 결합하도록 지정한다. 즉, NN RVD는 구아닌 외에 아데닌에도 결합하는 것으로 알려져 있지만 각 TALEN 반복은 단일 염기 쌍에 결합한다. TAL 이펙터 DNA 결합은 징크 핑거 단백질보다 기계적으로 잘 이해되지 않지만 겉보기에 더 간단한 코드는 조작된 뉴클레아제 설계에 매우 유용할 수 있다. TALEN은 또한 이량체로 절단되고 비교적 긴 표적 서열(지금까지 보고된 가장 짧은 것은 단량체당 13개의 뉴클레오티드에 결합함)을 가지며 결합 부위 사이의 스페이서 길이에 대해 ZFN보다 덜 엄격한 요건을 갖는 것으로 보이다. 단량체 및 이량체 TALEN은 10개 초과, 14개 초과, 20개 초과 또는 24개 초과의 반복을 포함할 수 있다.
특정 핵산에 결합하도록 TAL을 조작하는 방법은 문헌[Cermak, et al, Nucl. 산 해상도 1-11(2011). 미국 공개 출원 번호 2011/0145940, TAL 이펙터 및 DNA를 변형하기 위해 이들을 사용하는 방법을 개시한다. Miller et al. Nature Biotechnol 29:143(2011)은 TAL 절단 변이체를 Fokl 뉴클레아제의 촉매 도메인에 연결함으로써 부위 특이적 뉴클레아제 구조를 위한 TALEN을 만드는 것을 보고했다. 생성된 TALEN은 불멸화된 인간 세포에서 유전자 변형을 유도하는 것으로 나타났다. TALE 결합 도메인에 대한 일반적인 설계 원칙은 예를 들어 WO 2011/072246에서 찾을 수 있다.
비. 공여자 폴리뉴클레오티드
본원에 기술된 게놈 편집 시스템의 뉴클레아제 활성은 표적 DNA를 절단하여 표적 DNA에서 단일 또는 이중 가닥 파손을 생성한다. 이중 가닥 파손은 두 가지 방법 중 하나로 세포에 의해 복구될 수 있다: 비상동 말단 연결 및 상동성 지정 복구. 비상동 말단 접합(NHEJ)에서 이중 가닥 파손은 파손 말단을 서로 직접 결찰하여 수리한다. 따라서 일부 핵산 물질이 손실되어 삭제될 수 있지만 새로운 핵산 물질이 해당 부위에 삽입되지 않는다. 상동성 지정 복구(HDR)에서 절단된 표적 DNA 서열과 상동성을 갖는 공여체 폴리뉴클레오티드는 절단된 표적 DNA 서열의 복구를 위한 주형으로 사용되며, 그 결과 공여자 폴리뉴클레오티드에서 표적 DNA로 유전 정보가 전달된다. 이와 같이, 새로운 핵산 물질이 해당 부위에 삽입/복사될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 핵산 카고는 공여자 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. NHEJ 및/또는 상동성 지정 복구로 인한 표적 DNA의 변형은 유전자 수정, 유전자 교체, 유전자 태깅, 이식유전자 삽입, 뉴클레오티드 결실, 유전자 파괴, 유전자 돌연변이 등을 유도하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 게놈 편집 조성물에 의한 DNA의 절단은 표적 DNA 서열을 절단하고 세포가 외인성 제공 공여자 폴리뉴클레오티드의 부재 하에 서열을 복구하도록 함으로써 표적 DNA 서열로부터 핵산 물질을 결실시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 게놈 편집 조성물이 표적 DNA 서열과 상동성을 갖는 적어도 하나의 세그먼트를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 방법은 표적 DNA 서열(예를 들어, , 단백질, siRNA, miRNA 등을 암호화하는 핵산을 "노크 인"하거나, 태그(예: 6xHis, 형광성 단백질(예: 녹색 형광성 단백질, 황색 형광성 단백질, 등), 헤마글루티닌(HA), FLAG 등), 조절 서열을 유전자에 추가하기 위해(예: 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 서열(IRES), 2A 펩티드, 시작 코돈, 정지 코돈, 스플라이스 신호 , 국재화 신호 등), 핵산 서열을 변형(예를 들어, 돌연변이 도입) 등. 이와 같이, 조성물은 DNA를 부위 특이적, 즉 "표적화된" 방식으로, 예를 들어 유전자 녹아웃, 유전자 녹인, 유전자 편집, 유전자 태깅 등에 사용되는 방식으로 변형하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 치료.
폴리뉴클레오티드 서열을 표적 DNA 서열에 삽입하는 것이 바람직한 적용에서, 삽입될 도너 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 세포에 제공된다. "공여자 서열" 또는 "공여자 폴리뉴클레오티드" 또는 "공여자 올리고뉴클레오티드"는 절단 부위에 삽입되는 핵산 서열을 의미한다. 공여자 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 절단 부위의 게놈 서열에 대한 충분한 상동성, 예를 들어, 절단 부위에 인접하는 뉴클레오타이드 서열과의 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 상동성을, 예를 들어 약 절단 부위의 50개 이하의 염기, 예를 들어, 약 30개 염기 이내, 약 15개 염기 이내, 약 10개 염기 이내, 약 5개 염기 이내, 또는 절단 부위의 바로 옆에 위치하여 절단 부위와 게놈 서열 사이의 상동성 지향적 복구를 지원 상동성을 지닌다. 공여자 서열은 일반적으로 대체하는 게놈 서열과 동일하지 않는다. 오히려, 공여체 서열은 상동성-지향 수선을 뒷받침하기에 충분한 상동성이 존재하는 한, 게놈 서열과 관련하여 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 역전 또는 재배열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 상동성의 2개 영역이 플랭킹된 비-상동성 서열을 포함하여, 표적 DNA 영역과 2개의 플랭킹 서열 사이의 상동성 지향적 수선이 표적 영역에서 비-상동성 서열의 삽입을 초래한다.
2. 면역조절
a. CAR T 세포
개시된 조성물 및 방법은 면역 수용체, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 면역 수용체(CIR)를 발현하는 림프구를 제조하는 맥락에서 특히 유용하다. 인공 면역 수용체(본 명세서에서 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 키메라 면역 수용체(CIR)라고도 함)는 세포에 선택된 특이성을 이식하는 조작된 수용체이다. 논의된 방법에 따라 변형된 세포는 암, 감염, 염증 및 자가면역 질환의 치료를 위한 다양한 면역 요법에서 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이 이용될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 카고를 코딩하는 mRNA 또는 DNA는 림프구와 같은 면역 세포에 전달된다.
화물은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 면역 세포로 전달될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화물은 비용 감소, 제조 용이성, 부작용 감소(예를 들어, 사이토카인 폭풍, 신경독성, 이식편 대 숙주 질환 등) 중 하나 이상을 허용할 수 있는 mRNA이다. 특정 실시양태에서, 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 CAR T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터 수확되고, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 하나 이상의 CAR T 세포 구축물을 코딩하는 mRNA를 수확된 세포 내로 전달하기 위해 사용되며, 세포는 피험자에게 반환된다. 일부 실시양태에서, 초기에 세포를 수확하는 것부터 대상체에게 반환하는 것까지의 과정은 1주 이하, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일이 걸린다. 특정 실시양태에서, 세포를 초기에 수확하는 것부터 이를 대상체에게 반환하는 것까지의 과정은 1 또는 2일, 또는 1일 미만, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간.
키메라 항원 수용체의 설계 및 개발을 위한 전략은 Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 January; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131(35페이지)(이는 그 전체가 본원에 참조로 구체적으로 포함됨), 뿐만 아니라 Dotti, Molecular Therapy, 22(5):899-890(2014), Karlsson, et al., Cancer Gene Therapy, 20:386-93 (2013), Charo, et al., Cancer Res., 65(5):2001-8 (2005), Jensen, et al., Immunol Rev., 257(1): 127-144(2014), Eaton, et al., Gene Therapy, 9:527-35(2002), Barrett, et al., Annu Rev Med., 65: 333-347(2014), Cartellieri, et al. , Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2010, Article ID 956304, 13페이지 doi:10.1155/2010/956304; 및 미국 공개 출원 번호 2015/0017120, 2015/0283178, 2015/0290244, 2014/0050709, 및 2013/0071414.
CAR은 단일클론 항체의 항원 결합 특성과 T 세포의 용해 능력 및 자가 재생을 결합하고 기존의 T 세포에 비해 몇 가지 장점이 있다(Ramos and Dotti, Expert Opin Biol Ther., 11:855-873 (2011), Curran , et al., J Gene Med., 14:405-415(2012), Maher, ISRN Oncol. 2012:278093(2012)). CAR-T 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 독립적으로 암세포를 인식하고 죽이다. 따라서 표적 세포 인식은 예를 들어 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자의 하향 조절 및 결함 있는 항원 처리와 같이 종양이 MHC 제한 T 세포 인식을 회피하는 일부 메커니즘의 영향을 받지 않는다.
키메라 면역 수용체는 1980년대에 처음 개발되었으며 원래 단일클론 항체의 가변(항원 결합) 영역과 T-세포 수용체(TCR) α 및 β 사슬의 불변 영역을 포함했다(Kuwana, et al., Biochem Biophys Res Commun., 149:960-968(1987)). 1993년에 이 디자인은 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 엑토도메인, 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 모두의 항원 결합 영역, 막횡단 도메인 및 CD3에서 유래한 신호전달 도메인이 있는 엔도도메인을 포함하도록 수정되었다. -ζ. 이후의 CAR은 일반적으로 공동 자극 신호 전달 엔도도메인과 함께 유사한 구조 설계를 따랐다. 따라서, 본원의 방법에서 이용되는 CAR 작제물은 항원 결합 도메인 또는 엑토도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 엔도도메인, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서 엑토도메인은 scFv이다. scFv의 친화도는 CAR 기능을 예측한다(Hudecek, et al., Clin Cancer Res., 19(12):3153-64 (2013), Chmielewski, et al., J Immunol., 173:7647-7653 (2004)). ). 항원 결합 및 후속 활성화는 또한 CAR에 가요성 링커 서열을 추가함으로써 변형될 수 있으며, 이는 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있는 2개의 별개의 scFv의 발현을 허용한다(Grada, et al., Mol Ther Nucleic Acids, 2:e105 (2013) )) (탠덤 CAR(TanCAR)이라고 함). 탠덤 CARS는 개별적으로 낮은 수준의 각 항원을 발현하는 암을 죽이는 데 더 효과적일 수 있으며 단일 항원 손실 변이체로 인한 종양 면역 탈출의 위험을 줄일 수도 있다. 다른 엑토도메인은 IL13Rα2(Kahlon, et al., Cancer Res., 64:9160-9166 (2004), Brown, et al., Clin Cancer Res., 18(8):2199-209 (2012), Kong, et al. al., Clin Cancer Res., 18:5949-5960 (2012), NKG2D-리간드 및 CD70 수용체, 펩티드 리간드(예: T1E 펩티드 리간드), 및 소위 "보편적 엑토도메인"(예: 비오틴화된 단일클론 항체와 접촉된 표적, 또는 FITC 표지된 단일클론 항체와 접촉된 표적을 인식하도록 설계된 FITC 특이적 scFv(Zhang, et al., Blood, 106:1544-1551 (2005), Barber, et al., al., Exp Hematol., 36:1318-1328(2008), Shaffer, et al., Blood, 117:4304-4314(2011), Davies, et al., Mol Med., 18:565-576(2012) ), Urbanska, et al., Cancer Res., 72:1844-1852(2012), Tamada, et al., Clin Cancer Res., 18:6436-6445(2012)).
일부 실시양태에서, CAR은 힌지 영역을 포함한다. 엑토도메인이 CAR 특이성에 중요하지만, 엑토도메인을 막횡단 도메인(힌지 영역)에 연결하는 서열은 CAR의 길이와 유연성의 차이를 생성함으로써 CAR-T-세포 기능에도 영향을 미칠 수 있다. 힌지는 예를 들어, IgG1과 같은 면역글로불린으로부터 유래된 CH2CH3 힌지, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, Hudecek et al. (Hudecek, et al., Clin Cancer Res., 19(12):3153-64 (2013))은 CH2-CH3 힌지[229 아미노산(AA)], CH3 힌지(119 AA)의 영향을 비교하고, 3세대 ROR1-특이적 CAR을 발현하는 T 세포의 이펙터 기능에 대한 짧은 힌지(12AA)를 발견하고 '짧은 힌지' CAR을 발현하는 T 세포가 우수한 항종양 활성을 가짐을 발견한 반면, 다른 조사자들은 CH2-CH3 힌지가 a의 에피토프 인식을 손상시킨다는 것을 발견했다. 1세대 CD30-특이적 CAR(Hombach, et al., Gene Ther., 7:1067-1075 (2000)).
힌지(또는 힌지 도메인이 없는 경우 엑토도메인)와 신호전달 엔도도메인 사이에는 일반적으로 막횡단 도메인이 있으며, 가장 일반적으로 CD3-ζ, CD4, CD8 또는 CD28 분자에서 유래한다. 경첩과 마찬가지로 막횡단 도메인도 CAR-T 세포 효과기 기능에 영향을 미칠 수 있다.
항원 인식 시 CAR 엔도도메인은 T 세포에 활성화 및 공동자극 신호를 전달한다. T-세포 활성화는 TCR 복합체의 세포질 CD3-ζ 도메인에 대한 세포질 도메인에 존재하는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)의 인산화에 의존한다(Irving, et al., Cell, 64:891-901 (1991) )). 대부분의 CAR 엔도메인이 CD3-ζ에서 유래된 활성화 도메인을 포함하지만 다른 도메인에는 IgE-γ 도메인에 대한 Fc 수용체와 같은 ITAM 포함 도메인이 포함될 수 있다(Haynes, et al., J Immunol., 166:182-187( 2001)).
CAR을 발현하는 세포의 표적 특이성은 항체/엑토도메인에 의해 인식되는 항원에 의해 결정된다. 개시된 조성물 및 방법은 임의의 항원을 표적으로 하는 작제물, 및 작제물을 발현하는 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 면역요법, 특히 암 면역요법의 맥락에서, 수많은 항원 및 이들을 표적화하기 위한 적합한 엑토도메인이 잘 알려져 있다. 대부분의 scFv 기반 CAR은 네이티브 TCR과 달리 세포의 MHC에 의해 처리되고 제시되는 내부 항원보다는 세포 표면에 발현된 표적 항원을 인식하지만, CAR은 기존 TCR에 비해 구조를 인식할 수 있다는 장점이 있다. 탄수화물 및 당지질을 포함하는 단백질 에피토프 이외의 Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 January ; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 페이지) 따라서 잠재적인 표적 항원의 풀을 증가시킨다. 바람직한 표적은 EGFR의 스플라이스 변이체(EGFRvIII)와 같은 암세포 또는 주변 기질에서만 발현되는 항원을 포함한다(Cheever, et al., Clin Cancer Res., 15:5323-5337 (2009)). 신경교종 세포에 특이적이다(Sampson, et al., Semin Immunol., 20(5):267-75 (2008)). 그러나 인간 항원은 이 요건을 충족하며 대부분의 표적 항원은 정상 세포(예: GD2, CAIX, HER2)에서 낮은 수준으로 및/또는 계통 제한 방식(예: CD19, CD20)으로 발현된다.
바람직한 표적, 및 이를 표적으로 하는 CAR은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 January ; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 페이지) 참조). 예를 들어 , 혈액 악성종양에 대한 CAR 표적은 CD19(예: B-세포)(Savoldo, et al., J Clin Invest., 121:1822-1826(2011), Cooper, et al., Blood, 105:1622-1631(2005), Jensen, et al., Biol Blood Marrow Transplant(2010), Kochenderfer, et al., Blood, 119:2709-2720(2012), Brentjens, et al., Molecular Therapy , 17:S157(2009), Brentjens, et al., Nat Med., 9:279-286(2003), Brentjens, et al., Blood, 118:4817-4828(2011), Porter, et al., N Engl J Med., 365:725-733(2011), Kalos, et al., Sci Transl Med., 3:95ra73(2011), Brentjens, et al., Sci Transl Med., 5:177ra38(2013) , Grupp, et al., N Engl J Med(2013)), CD20(예: B-세포)(Jensen, et al., Biol Blood Marrow Transplant(2010), Till, et al., Blood, 112:2261) -2271(2008), Wang 등, Hum Gene Ther., 18:712-725(2007), Wang 등, Mol Ther., 9:577-586 (2004), Jensen, et al., Biol Blood Marrow Transplant, 4:75-83 (1998)); CD22(예를 들어, B-세포)(Haso, et al., Blood, 121:1165-1174 (2013)); CD30(예를 들어, B-세포)(Di Stasi, et al., Blood, 113:6392-6402(2009), Savoldo, et al., Blood, 110:2620-2630(2007), Hombach, et al., Cancer Res., 58:1116-1119(1998)); CD33(예를 들어, Myeloid)(Finney, et al., J Immunol., 161:2791-2797(1998)); CD70(예를 들어, B-세포/T-세포)(Shaffer, et al., Blood, 117:4304-4314 (2011)); CD123(예를 들어, 골수성)(Tettamanti, et al., Br J Haematol., 161:389-401(2013)); 카파(예를 들어, B-세포)(Vera, et al., Blood, 108:3890-3897(2006)); Lewis Y(예를 들어, Myeloid)(Peinert, et al., Gene Ther., 17:678-686(2010), Ritchie, et al., Mol Ther.(2013)); NKG2D 리간드(예: Myeloid)(Barber, et al., Exp Hematol., 36:1318-1328(2008), Lehner, et al., PLoS One., 7:e31210(2012), Song, et al., Hum Gene Ther., 24:295-305 (2013), Spear, et al., J Immunol. 188:6389-6398 (2012)); ROR1(예: B-세포)(Hudecek, et al., Clin Cancer Res. (2013)).
고형 종양에 대한 CAR 표적에는 B7H3(예: 육종, 신경아교종)(Cheung, et al., Hybrid Hybridomics, 22:209-218 (2003)); CAIX(예: 신장)(Lamers, et al., J Clin Oncol., 24:e20-e22. (2006)), Weijtens, et al., Int J Cancer, 77:181-187(1998)); CD44 v6/v7(예: 자궁경부)(Hekele, et al., Int J Cancer, 68:232-238 (1996)), Dall, et al., Cancer Immunol Immunother, 54:51-60 (2005); CD171(예를 들어, 신경모세포종)(Park, et al., Mol Ther., 15:825-833 (2007)); CEA(예를 들어, 결장)(Nolan, et al., Clin Cancer Res., 5:3928-3941 (1999)); EGFRvIII(예를 들어, 신경교종)(Bullain, et al., J Neurooncol. (2009), Morgan, et al., Hum Gene Ther., 23:1043-1053 (2012)); EGP2(예를 들어, 암종)(Meier, et al., Magn Reson Med., 65:756-763 (2011), Ren-Heidenreich, et al., Cancer Immunol Immunother., 51:417-423 (2002)); EGP40(예: 결장)(Daly, et al., Cancer Gene Ther., 7:284-291(2000)); EphA2(예: 신경교종, 폐)(Chow, et al., Mol Ther., 21:629- 637(2013)), ErbB2(HER2)(예를 들어, 유방, 폐, 전립선, 신경교종)(Zhao, et al., J Immunol., 183:5563-5574(2009), Morgan, et al., Mol Ther. , 18:843-851 (2010), Pinthus, et al., 114:1774-1781 (2004), Teng, et al., Hum Gene Ther., 15:699-708 (2004), Stancovski, et al. , J Immunol., 151:6577-6582 (1993), Ahmed, et al., Mol Ther., 17:1779-1787 (2009), Ahmed, et al., Clin Cancer Res., 16:474-485( 2010), Moritz, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91:4318-4322(1994)) ErbB 수용체 패밀리(예: 유방, 폐, 전립선, 신경교종)(Davies, et al., Mol Med., 18:565-576(2012)) ErbB3/4(예: 유방, 난소)(Muniappan, et al., Cancer Gene Ther., 7:128-134 (2000), Altenschmidt, et al., Clin Cancer Res ., 2:1001-1008(1996)), HLA-A1/MAGE1(예: 흑색종)(Willemsen, et al., Gene Ther., 8:1601-1608(2001), Willemsen, et al., J Immunol ., 174:7853-7858(2005)), HLA-A2/NY -ESO-1(예를 들어, 육종, 흑색종)(Schuberth, et al., Gene Ther., 20:386-395 (2013)); FR-α(예: 난소)(Hwu, et al., J Exp Med., 178:361-366(1993), Kershaw, et al., Nat Biotechnol., 20:1221-1227(2002), Kershaw, et al., Clin Cancer Res., 12:6106-6115 (2006), Hwu, et al., Cancer Res., 55:3369-3373 (1995)); FAP(예를 들어, 암 관련 섬유아세포)(Kakarla, et al., Mol Ther. (2013)); FAR(예를 들어, 횡문근육종)(Gattenlohner, et al., Cancer Res., 66:24-28 (2006)); GD2(예를 들어, 신경모세포종, 육종, 흑색종)(Pule, et al., Nat Med., 14:1264-1270 (2008), Louis, et al., Blood, 118:6050-6056 (2011), Rossig, et al. al., Int J Cancer., 94:228-236 (2001)); GD3(예를 들어, 흑색종, 폐암)(Yun, et al., Neoplasia., 2:449-459 (2000)); HMW-MAA(예를 들어, 흑색종)(Burns, et al., Cancer Res., 70:3027-3033 (2010)); IL11Rα(예를 들어, 골육종)(Huang, et al., Cancer Res., 72:271-281 (2012)); IL13Rα2(예를 들어, 신경교종)(Kahlon, et al., Cancer Res., 64:9160-9166 (2004), Brown, et al., Clin Cancer Res. (2012), Kong, et al., Clin Cancer Res. , 18:5949-5960 (2012), Yaghoubi, et al., Nat Clin Pract Oncol., 6:53-58 (2009)); Lewis Y(예: 유방/난소/췌장)(Peinert, et al., Gene Ther., 17:678-686(2010), Westwood, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 102:19051-19056(2005) ), Mezzanzanica, et al., Cancer Gene Ther., 5:401-407 (1998)); 메조텔린(예를 들어, 중피종, 유방, 췌장)(Lanitis, et al., Mol Ther., 20:633-643 (2012), Moon, et al., Clin Cancer Res., 17:4719-4730 (2011)) ; Mue1(예를 들어, 난소, 유방, 전립선)(Wilkie, et al., J Immunol., 180:4901-4909 (2008)); NCAM(예를 들어, 신경모세포종, 결장직장)(Gilham, et al., J Immunother., 25:139-151 (2002)); NKG2D 리간드(예: 난소, 육종)(Barber, et al., Exp Hematol., 36:1318-1328 (2008), Lehner, et al., PLoS One, 7:e31210 (2012), Song, et al. , Gene Ther., 24:295-305 (2013), Spear, et al., J Immunol., 188:6389-6398 (2012)); PSCA(예를 들어, 전립선, 췌장)(Morgenroth, et al., Prostate, 67:1121-1131 (2007), Katari, et al., HPB, 13:643-650 (2011)); PSMA(예를 들어, 전립선)(Maher, et al., Nat Biotechnol., 20:70-75 (2002), Gong, et al., Neoplasia., 1:123-127 (1999)); TAG72(예를 들어, 결장)(Hombach, et al., Gastroenterology, 113:1163-1170 (1997), McGuinness, et al., Hum Gene Ther., 10:165-173 (1999)); VEGFR-2(예를 들어, 종양 혈관계)(J Clin Invest., 120:3953-3968(2010), Niederman, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 99:7009-7014(2002)).
b. 대사 안정성
일부 실시양태에서, 세포(예를 들어, CAR 세포) 대사 안정성은 생체 내에서 제한되는 바로 그 성장 인자를 만드는 능력을 세포에 제공함으로써 개선된다. 일부 실시양태에서, BCL-XL과 같은 항-아폽토시스 인자를 코딩하는 핵산 카고는 일시적으로 세포에 전달된다. B 세포 림프종 초대형(Bcl-XL 또는 BCL2-유사 1 동형 1)은 미토콘드리아의 막관통 단백질이다. 이것은 Bcl-2 단백질 계열의 구성원이며 caspase 활성화로 이어질 시토크롬 c와 같은 미토콘드리아 내용물의 방출을 방지함으로써 고유 세포자멸사 경로에서 생존을 위한 단백질로 작용한다. BCL-XL을 암호화하는 아미노산 및 핵산 서열은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 UniProtKB - Q07817(B2CL1_HUMAN), Isoform Bcl-X(L)(식별자: Q07817-1)(아미노산 서열); ENA|U72398|U72398.1 인간 Bcl-x 베타(bcl-x) 유전자, 완전한 cds(게놈 핵산 서열); ENA|Z23115|Z23115.1 H.sapiens bcl-XL mRNA(mRNA/cDNA 핵산 서열).
일부 실시양태에서, 핵산 카고는 IL-2와 같은 증식 유도 인자를 코딩한다. IL-2를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 UniProtKB - P60568(IL2_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|X00695|X00695.1 인간 인터루킨-2(IL-2) 유전자 및 5'-플랭킹 영역(유전자 핵산 서열); 및 ENA|V00564|V00564.1 인터루킨-2(IL-2)를 인코딩하는 인간 mRNA(mRNA/cDNA 핵산 서열).
그러나 분비된 IL-2의 생성은 림프종 및 Treg 세포의 증식을 자극하고 기억 T 세포의 형성을 손상시키는 원치 않는 부작용을 가질 수 있다(Zhang, et al., Nature Medicine, 11:1238-1243 (2005)). 또한, 종양 침윤 림프구(TIL)로 치료된 환자에서 IL-2를 사용하면 독성이 증가했다(Heemskerk, et al., Human Gene Therapy, 19:496-510 (2008)). 이러한 가능성을 피하기 위해 IL-2에 추가로 또는 대안으로 핵산 카고는 IL-7Rα/CD127에 연결된 인터루킨-7(IL-7)로 구성된 키메라 γc 사이토카인 수용체(CγCR)를 암호화할 수 있다. 외인성 사이토카인 독립적, 세포 고유, STAT5 사이토카인 신호(Hunter, et al., Molecular Immunology, 56:1-11 (2013)). IL-2Rβ/CD122 세포질 사슬이 Shc 활성을 향상시키기 위해 IL-7Rα/CD127의 세포질 사슬로 교환될 수 있다는 점에서 이 디자인은 모듈식이다. 작제물은 인간 CD8+ T 세포에서 야생형 IL-2 신호전달을 모방하고(Hunter, et al., Molecular Immunology, 56:1-11 (2013)), 따라서 원치 않는 없이 IL-2 mRNA와 유사하게 작동해야 한다. 부작용에.
추가로 및 대안적으로 다른 항아폽토시스 분자 및 사이토카인을 사용하여 천연 상태에서 세포 생존력을 보존할 수 있다. 예시적인 요소에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
골수 세포 백혈병 1(MCL-1)(예: UniProtKB - Q07820(MCL1_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|AF147742|AF147742.1 호모 사피엔스 골수 세포 분화 단백질(MCL1) 유전자, 프로모터 및 완전 cds(게놈 핵산) ENA|AF118124|AF118124.1 항아폽토시스 인자인 호모 사피엔스 골수 세포 백혈병 서열 1(MCL1) mRNA, 완전한 cds.(mRNA/cDNA 핵산 서열));
IL-7(예: UniProtKB - P13232(IL7_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|EF064721|EF064721.1 Homo sapiens interleukin 7(IL7) 유전자, 완전한 cds.(게놈 핵산 서열); ENA|J04156.|J0415 1 인간 인터루킨 7(IL-7) mRNA, T 세포 생존 및 발달에 중요한 완전한 CD(mRNA/cDNA 핵산 서열), 및
IL-15(예: UniProtKB - P40933(IL15_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|X91233|X91233.1 H.sapiens IL15 유전자(게놈 핵산 서열); ENA|U14407|U14407.1 인간 인터루킨) 15(IL T 및 NK 세포 생존을 촉진하는 mRNA, 완전한 cds.(mRNA/cDNA 핵산 서열))(Opferman, et al., Nature, 426: 671-676 (2003); Meazza, et al., Journal of Biomedicine & Biotechnology , 861920, doi:10.1155/2011/861920 (2011); Michaud, et al., Journal of Immunotherapy, 33:382-390 (2010)). 이러한 사이토카인 mRNA는 독립적으로 또는 BCL-XL, IL-2 및/또는 CγCR mRNA와 조합하여 사용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, MCL-1, IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합을 코딩하는 mRNA가 세포에 전달된다.
c. 억제 CAR(iCAR)
일부 실시양태에서, T 세포 요법은 일부 암의 치료에 대한 장기간 효능 및 치유 가능성을 입증한 CAR 세포에 전달되지만, 그의 사용은 이식편 대 숙주를 연상시키는 비암성 조직에 대한 손상에 의해 제한된다 기증자 림프구 주입 후 질병. 개시된 조성물 및 방법 중 임의의 것은 비특이적 면역억제(예를 들어, 면역 반응을 억제하기 위해 T 세포에 세포증식억제 또는 세포독성 효과를 발휘하는 고용량 코르티코스테로이드 요법), 비가역적 T 세포 제거(예를 들어, 소위 자살 유전자 공학 전략), 또는 이들의 조합. 그러나, 일부 바람직한 실시양태에서, 표적외 효과는 억제 키메라 항원 수용체(iCAR)를 코딩하는 작제물을 CAR 세포에 도입함으로써 감소된다. 종양 및 표적 외 조직 모두에 대해 특이성을 갖는 T 세포는 표적 외 조직을 보호하기 위해 T 세포에 도입된 항원 특이적 iCAR을 사용함으로써만 종양으로 제한될 수 있다(Fedorov, et al., Science Translational Medicine, 5: 215ra172(2013)). iCAR은 활성화 수용체(예: CAR)의 동시 결합에도 불구하고 T 세포 반응성을 제한하기 위해 강력한 급성 억제 신호전달 도메인과 조합된 표면 항원 인식 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, iCAR은 면역억제 수용체(예를 들어, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244))의 신호전달 도메인에 융합된 억제 항원에 특이적인 단일쇄 가변 단편(scFv), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우성 음성 유사체 등)이 막관통 영역을 통해 항원 인식 시 T 세포 기능을 특이적으로 억제한다. CAR 세포가 억제 항원을 발현하지 않는 세포(예: 암세포)를 만나면 iCAR 형질도입 T 세포는 CAR의 표적 항원에 대해 CAR 유도 반응을 일으킬 수 있다. CTLA-4 또는 PD-1의 억제 신호전달 도메인과 함께 PSMA에 특이적인 scFv를 사용하는 DNA iCAR은 (Fedorov, et al., Science Translational Medicine, 5:215ra172 (2013))에서 논의된다.
설계 고려 사항에는 PD-1이 CTLA-4보다 더 강력한 억제제이고, CTLA-4가 Y165G 돌연변이를 사용하지 않는 한 세포질 국소화를 나타내었으며, iCAR 발현 수준이 중요하다는 관찰이 포함된다.
iCAR은 세포 유형 특정 표면 분자에 대해 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서 iCAR은 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 T 세포, NK 세포, 또는 기타 면역 세포 반응성을 예방하도록 설계된다.
d. 내인성 억제 신호 감소
일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 항원의 발현을 방지하기 위해 세포를 재프로그래밍하는 핵산 카고와 접촉된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 핵산 카고는 CTLA-4 또는 PD-1과 같은 항원을 코딩하는 mRNA의 발현을 방지하는 간섭 RNA이거나 이를 코딩한다. 이 방법은 보편적인 기증자 세포를 준비하는 데 사용할 수 있다. 동종 항원의 발현을 변경하는 데 사용되는 RNA는 단독으로 또는 표적 세포의 역분화를 초래하는 RNA와 조합하여 사용할 수 있다.
위의 섹션은 표적상/종양외 세포독성을 제한하기 위해 인공 iCAR에서 예를 들어 CTLA-4 또는 PD-1의 억제 신호전달 도메인을 활용한 조성물 및 방법을 제공하지만, 추가로 또는 대안적으로 전체 CAR 세포 종양내 이펙터 효율은 CAR 세포가 적대적인 종양 미세 환경의 억제 신호에 내성을 갖도록 CAR 세포에서 내인성 억제 신호의 발현을 감소시킴으로써 증가된다.
CTLA-4 및 PD-1은 활성화 및 기능의 다른 단계에서 T 세포를 억제한다. CTLA-4는 자가 항원에 대한 T 세포 반응을 조절하는데, 이는 녹아웃 마우스가 특정 항원 노출 없이 고도로 활동적인 조직 침투 T 세포로 인해 자발적으로 기관 손상을 발생시키기 때문이다(Tivol, et al., Immunity, 3:541-547 (1995)); Waterhouse, et al., Science, 270:985-988 (1995)). 흥미롭게도, Treg 세포에서 CTLA-4의 조건부 녹아웃은 그것이 Treg 내에서 정상적으로 기능함을 나타내는 전체 녹아웃을 반복한다(Wing, et al., Science, 322:271-275 (2008)). 대조적으로, PD-L1 녹아웃 마우스는 자가면역 경향이 있지만 정상 기관의 대규모 염증 세포 침윤이 자발적으로 발생하지 않으며, 이는 주요 생리학적 기능이 유도 가능한 방식으로 진행 중인 조직 염증의 음성 피드백 제어를 매개하는 것임을 나타낸다(Dong, et al. ., Immunity, 20:327-336 (2004)). 실제로 "적응 저항성" 가설에 따르면 대부분의 종양은 IFNγ에 대한 반응으로 PD-L1을 상향 조절한다. CART 세포를 포함하는 효과기 T 세포에 의해 방출되는 주요 사이토카인(Greenwald, et al., Annu Rev Immunol, 23:515-548 (2005); Carreno, et al., Annu Rev Immunol, 20:29-53 (2002)); Chen, et al., Journal of Clinical Investigation, 125:3384-3391 (2015); Keir, et al., Annu Rev Immunol, 26:677-704 (2008); Pentcheva-Hoang, et al., Immunological Reviews , 229:67-87 (2009)). 그런 다음 PD-L1은 T 세포에 억제 신호를 전달하여 T 세포의 증식, 사이토카인 및 퍼포린 생성을 감소시킨다(Butte, et al., Immunity, 27:111-122 (2007); Chen, et al., Immunology, 4:336- 347(2004), Park, et al., Blood, 116:1291-1298(2010), Wherry, et al., Nat Immunol, 12:492-499(2011), Zou, et al., Immunology, 8: 467-477(2008)). 또한, 암세포에 대한 B7-H1을 통한 T 세포로부터의 역 신호전달은 Fas-L 신호전달에 대응하는 항-세포자멸사 효과를 유도한다(Azuma, et al., Blood, 111:3635-3643 (2008)). Azuma, et al., Blood, 111:3635-3643 (2008)
암 세포에 의한 B7-H1의 상향 조절 및 이의 발현과 암 진행 및 불량한 임상 결과의 연관성에 비추어(Flies, et al., Journal of Immunotherapy, 30:251-260 (2007); Nishimura, et al. al., Immunity, 11:141-151 (1999); Wang, et al., Curr Top Microbiol Immunol, 344:245-267 (2011)), PD-1 및 CTLA-4 경로에 길항하는 항체는 극적인 효능을 나타냈다. 고형 종양, 특히 흑색종에서 두 가지의 조합이 훨씬 더 많은 활동을 나타낸다. 항-CTLA-4 항체인 이필리무맙은 주로 Treg 세포의 억제를 통해 종양으로의 증가된 T 세포 침윤 및 증가된 종양내 CD8+:Treg 비율로 전이성 흑색종의 전체 생존을 개선한다(Hamid, et al., J Transl Med, 9: 204(2011), Ribas, et al., Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 15:6267-6276(2009), Twyman-Saint, et al., Nature, 520:373-377 (2015)). 항-PD-1 항체인 니볼루맙은 전이성 흑색종에서 30-40%의 전체 반응률을 나타낸다(Robert, et al., The New England Journal of Medicine, 372:320-330 (2015); Topalian, et al. ., J Clin Oncol, 32:1020-1030 (2014)), 전이성 신장암, 비-소세포 폐암 및 재발성 호지킨 림프종을 포함하는 다른 고형 종양에 대한 초기 단계 임상 시험에서 유사한 발견이 있다(Ansell, et al., New England Journal of Medicine, 372:311-319(2015), Brahmer 등, J Clin Oncol, 28:3167-3175(2010), Topalian 등, The New England Journal of Medicine, 366: 2443-2454(2012)). 마우스 흑색종 모델에서 항-CTLA-4 항체에 대한 내성이 PD-L181의 상향 조절로 인한 것이기 때문에, 이필리무맙과 니볼루맙의 조합은 마우스 모델과 인간 환자 모두에서 추가 효능을 입증한다(Larkin, et al., The New England Journal of Medicine, 373:23-34(2015), Spranger, et al., J Immunother Cancer, 2, 3, doi:10.1186/2051-1426-2-3(2014), Yu, et al., Clinical 암 연구: 미국 암 연구 협회 공식 저널, 16:6019-6028 (2010)). 체크포인트 억제 경로의 중요성을 감안할 때 PD-1/CTLA-4 억제는 브레이크를 해제하는 반면 키메라 항원 수용체는 가속 페달을 밟을 것이라고 믿어진다. 중요하게도, 일시적 전달은 이러한 세포가 미래의 자가면역 질환으로 이어지지 않도록 브레이크를 일시적으로 해제하는 데만 활용될 수 있다.
i. 크리스피
영구적인 게놈 변형 및 PD-1 및 CTLA-4와 같은 억제 신호의 비활성화를 피하기 위해 dCAS9 CRISPRi 시스템(Larson, et al., Nat Protoc, 8:2180-2196 (2013))을 사용할 수 있다. 효소적으로 비활성화된 dCAS9-KRAB-억제 도메인, 융합 단백질 및 억제 신호 전달 단백질에 대한 sgRNA(예: CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우성 음성 유사체 등)은 CAR 세포 내로 공동 전달될 수 있다. 하나 또는 여러 개의 sgRNA를 사용할 수 있다. sgRNA는 근위 프로모터 영역 및 코딩 영역(비주형 가닥)을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 대안적인 접근법은 전기천공 및 발현을 위한 더 작은 RNA인 단일 성분 Cpf1 CRISPR 시스템을 활용한다(Zetsche, et al., Cell, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038 (2015)). 전술한 RNA 성분 중 임의의 것은 또한 벡터, 예를 들어 플라스미드와 같은 DNA 발현 작제물에 의해 코딩될 수 있다. 따라서 RNA, DNA 또는 이들의 조합이 핵산 카고 역할을 할 수 있다.
이필리무맙으로 CTLA-4를 광범위하게 억제하면 자가면역 후유증이 발생하지만, 이러한 부작용은 CAR 세포에 대한 손실과 mRNA 전달의 일시적인 특성을 제한함으로써 감소될 것으로 믿어진다. 억제 기능은 시간이 지나면 회복된다.
ii. 억제 RNA
세포로 전달될 수 있는 핵산 카고는 억제 신호전달 분자 mRNA의 발현 또는 번역을 표적으로 하고 감소시키거나 억제하도록 설계된 기능적 핵산 또는 폴리펩티드이거나; 또는 발현을 감소시키거나 억제하거나, 활성을 감소시키거나, 억제 신호전달 분자 단백질의 분해를 증가시키기 위해. 적합한 기술은 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 압타머, 리보자임, 삼중체 형성 분자, RNAi 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, mRNA는 억제 신호전달을 감소시키는 길항제 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우성 발현을 감소시키거나 억제하는데 적합한 기능성 RNA이거나 이를 인코딩하는 카고 음성 유사체 등을 단독으로 또는 조합하여 세포에 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 카고는 생체이용률을 감소시키는 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 또는 DNA이거나 CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272)의 길항제 또는 기타 음성 조절인자 또는 억제제로서 작용한다. ), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우성 음성 유사체, 또는 면역 억제 경로의 다른 단백질. 단백질은 측분비, 내분비 또는 자가분비일 수 있다. 그것은 세포 내에서 세포를 조절할 수 있다. 이는 발현 세포 및/또는 다른(예를 들어, 이웃) 세포를 분비하고 조절할 수 있다. 이는 발현 세포 및/또는 다른 세포를 조절하는 막횡단 단백질일 수 있다. 단백질은 융합 단백질, 예를 들어 Ig 융합 단백질일 수 있다.
e. 세포자멸사 인자
세포자멸사 경로를 활성화 및 재활성화하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 고유 세포자멸사 경로를 활성화, 재활성화, 그렇지 않으면 향상 또는 증가시키는 인자 또는 작용제이거나 이를 코딩한다. 바람직하게는, 인자는 암(예를 들어, 종양) 세포에서 내재적 세포자멸사 경로를 활성화, 재활성화 또는 그렇지 않으면 향상시키고, 보다 바람직하게는 암 세포에 특이적이거나 표적화된다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 상기 논의되거나 달리 당업계에 공지된 항-아폽토시스 인자 또는 프로-증식 인자의 전달 후, 세포는 미처리 세포보다 유도된 아폽토시스에 대해 더 내성이거나 덜 민감하다. 프로-아폽토시스 인자는 예를 들어, 처리되지 않은 세포에서 처리된 T 세포에 비해 아폽토시스를 유도하거나 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 암 세포에 대해 선택적이다. 이 요법은 암세포에 대한 두 갈래의 공격, 즉 하나는 세포이고 다른 하나는 분자이다.
내재적 세포자멸사 경로는 BCL-2 계열 구성원을 표적으로 하여 활성화, 재활성화 또는 강화될 수 있다. BCL-2 계열 구성원은 기능 및 Bh(Bcl-2 Homology) 도메인에 따라 세 가지 하위 그룹으로 분류된다. BAK) 및 BH3-only pro-apoptotic(예: BIM) 단백질. BIM과 같은 BH3 전용 하위 그룹의 구성원은 세포 전체에 위치한 죽음의 감시 장치로 기능하며 세포 손상의 다양한 생리학적 및 병리학적 신호를 미토콘드리아에 위치한 핵심 세포자멸 기구에 전달할 준비가 되어 있다(Danial, et al. ., Cell, 116:205-219(2004)).
일부 실시양태에서, 프로-아폽토시스 인자는 프로-아폽토시스 BH3-모방체이다. 다양한 pro-apoptotic BH3-mimetics는 BIM의 고유 pro-apoptotic 활동을 시뮬레이션하고 apoptotic 경로의 여러 지점을 조작할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들어, BIM SAHB(Stabilized Alpha Helix of BCL-2 domains), ABT-737 및 ABT-199는 pro-apoptotic BH3-only helix domain과 the pro-apoptotic BH3-only helix domain 사이의 상호작용에 대한 구조적 연구에 의해 설계된 pro-apoptotic BH3-mimetics이다. 항-세포자멸사 단백질의 BH1, BH2 및 BH3 도메인의 합류에 의해 형성된 소수성 홈(Oltersdorf, et al., Nature, 435:677-681 (2005)).
D. 표적 세포
일부 실시양태에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 조직이 개시된 복합체의 표적이다. 표적 세포는 시험관내, 생체외 또는 대상체(즉, 생체내)에 있을 수 있다. 본 명세서에서 논의된 적용은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 생체 외 적용을 위해 세포를 수집하거나 분리하고 배양물에서 처리할 수 있다. 생체외 처리된 세포는 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 생체내 적용을 위해, 화물은 예를 들어 조성물의 순환, 국소 전달 등에 기초하여 수동적으로 표적 세포에 전달될 수 있거나, 예를 들어 추가의 세포, 조직, 기관 특이적 표적화 모이어티와 함께 능동적으로 표적화될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 화물은 다른 세포를 배제하고 표적 세포로 전달된다. 일부 실시양태에서, 화물은 표적 세포 및 비-표적 세포로 전달된다.
표적 세포는 원하는 치료 및 요법, 그리고 핵산 카고의 의도된 효과에 기초하여 의사가 선택할 수 있다. 예를 들어, 핵산 카고가 세포 사멸을 유도하려는 경우 표적 세포는 암세포일 수 있다. 핵산 카고가 게놈 변경을 유도하려는 경우 표적 세포는 줄기 세포일 수 있다. 핵산 카고가 키메라 항원 수용체를 코딩하는 경우 표적 세포는 면역 세포일 수 있다.
3E10 scFv는 이전에 ENT2-결핍 세포에서 크게 손상된 핵 흡수 효율과 함께 ENT2 의존적 방식으로 세포 핵으로 침투할 수 있는 것으로 나타났다(Hansen et al., J Biol Chem 282, 20790-20793 (2007)). ENT2(SLC29A2)는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오사이드 및 핵염기의 수송에 참여하는 나트륨 독립적 수송체이며 ENT1보다 니트로벤질메르캅토퓨린 리보사이드(NBMPR)에 덜 민감한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 그의 형질 구성원, 그의 핵막, 또는 둘 모두에서 ENT2를 발현한다. ENT2의 발현은 비교적 보편적이지만 조직과 세포 유형에 따라 다양한다. 뇌, 심장, 태반, 흉선, 췌장, 전립선 및 신장에서 확인되었다(Griffiths, et al., Biochem J, 1997. 328(Pt 3): p. 739-43, Crawford, et al., J Biol Chem, 1998. 273(9): p.5288-93). 다른 수송체와 비교하여, ENT2는 골격근에서 가장 높은 mRNA 발현 중 하나를 갖는다(Baldwin, et al., Pflugers Arch, 2004. 447(5): p. 735-43, Govindarajan, et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007. 293(5): R1809-22). 따라서, 일부 실시양태에서 표적 세포는 뇌, 심장, 태반, 흉선, 췌장, 전립선, 신장 또는 골격근이다. 골격근에 의한 ENT2의 높은 발현으로 인해, 개시된 조성물 및 방법은 핵산 카고를 이들 세포에 전달하는 데 특히 효과적일 수 있고/있거나 더 낮은 수준의 ENT2를 발현하는 다른 세포와 비교하여 더 높은 수준의 카고가 이들 세포에 전달될 수 있다. ENT2.
추가의 비제한적인 예시적인 표적 세포가 아래에서 논의된다.
1. 전구 세포와 줄기 세포
세포는 조혈 전구 세포 또는 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 특히 유전자 편집 및 유전자 요법과 관련된 표적 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다. CD34+ 세포와 같은 조혈 줄기 세포(HSC)는 적혈구를 포함한 모든 혈액 세포 유형을 생성하는 다능성 줄기 세포이다.
줄기 세포는 당해 분야의 숙련가가 단리하고 농축할 수 있다. CD34+ 및 기타 세포의 이러한 분리 및 농축 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 4,965,204; 4,714,680; 5,061,620; 5,643,741; 5,677,136; 5,716,827; 5,750,397 및 5,759,793. 조혈 전구 세포 및 줄기 세포가 풍부한 조성물과 관련하여 본원에 사용된 "풍부한"은 세포의 천연 공급원에서 발견되는 것보다 더 높은 바람직한 요소(예: 조혈 전구 및 줄기 세포)의 비율을 나타낸다. 세포의 조성은 세포의 천연 공급원에 비해 100배 이상, 바람직하게는 2배 또는 3배, 보다 바람직하게는 10, 100, 200 또는 1000배 농축될 수 있다.
인간에서 CD34+ 세포는 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구-단핵구 집락 자극 인자(GM- CSF), 조혈 줄기 세포를 골수 공간에서 말초 순환계로 이동시키기에 충분한 양으로 피하 또는 정맥내로 줄기 세포 인자(SCF). 초기에 골수 세포는 적절한 골수 공급원, 예를 들어, 골수에서 얻을 수 있다. 경골, 대퇴골, 척추 및 기타 골강. 골수를 분리하기 위해 적절한 용액을 사용하여 뼈를 세척할 수 있다. 이 용액은 균형 잡힌 염 용액으로, 일반적으로 다음의 낮은 농도에서 허용되는 완충액과 함께 소태아 혈청 또는 기타 자연 발생 인자로 편리하게 보충된다. 약 5 내지 25mM. 편리한 완충액에는 Hepes, 인산염 완충액, 젖산 완충액 등이 있다.
세포는 양성 및 음성 선택 기술로 선택할 수 있다. 세포는 조혈 전구 세포 또는 줄기 세포 표면 항원에 결합하는 시판되는 항체를 사용하여 선택할 수 있다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하는 CD34. 예를 들어, 항체는 원하는 세포 유형을 복구하는 데 사용되는 자기 비드 및 면역원성 절차에 접합될 수 있다. 다른 기술에는 형광 활성화 세포 분류(FACS)의 사용이 포함된다. 백혈병이 아닌 개인의 조혈계 내 전구 세포에서 발견되는 CD34 항원은 단일클론 항체 My-10에 의해 인식되는 세포 집단에서 발현되며(즉, CD34 항원을 발현함) 줄기를 분리하는 데 사용할 수 있다. 골수 이식용 세포. HB-8483으로 American Type Culture Collection(Rockville, Md.)에 기탁된 My-10은 항-HPCA 1로서 상업적으로 이용 가능한다. 또한, 인간 골수에서 분화 및 "전용" 세포의 음성 선택을 이용하여 선별할 수 있다. 실질적으로 임의의 원하는 세포 마커에 대해. 예를 들어, 전구 세포 또는 줄기 세포, 가장 바람직하게는 CD34+ 세포는 CD3-, CD7-, CD8-, CD10-, CD14-, CD15-, CD19-, CD20-, CD33-, 클래스 II HLA+ 중 임의의 것으로 특성화될 수 있다. 및 Thy-1+.
전구 세포 또는 줄기 세포가 분리되면 적절한 배지에서 증식하여 증식할 수 있다. 예를 들어, 전구 세포 또는 줄기 세포는 인자의 분비와 관련된 골수 또는 간에서 얻을 수 있는 것과 같은 기질 세포의 조절 배지에서, 또는 줄기 세포의 증식을 지원하는 세포 표면 인자를 포함하는 배지에서 성장할 수 있다. 간질 세포는 원하지 않는 세포를 제거하기 위해 적절한 모노클로날 항체를 사용하여 조혈 세포를 제거할 수 있다.
분리된 세포는 생체외에서 항체 및 핵산 화물 복합체와 접촉된다. 화물이 배송된 셀을 변형 셀이라고 할 수 있다. 복합체의 용액은 단순히 배양 세포에 첨가될 수 있다. S-단계에서 셀을 동기화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 이중 티미딘 블록에 의해 배양된 세포를 동기화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Zielke, et al., Methods Cell Biol., 8:107-121 (1974)).
변형된 세포는 대상체에 투여하기 전에 배양물에서 유지 또는 확장될 수 있다. 배양 조건은 일반적으로 세포 유형에 따라 당업계에 공지되어 있다. 특히 CD34+의 유지를 위한 조건이 잘 연구되었으며 몇 가지 적합한 방법을 사용할 수 있다. 생체 외 다중 가능성 조혈 세포 확장에 대한 일반적인 접근 방식은 인터루킨-3과 같은 초기 작용 사이토카인의 존재 하에 정제된 전구 세포 또는 줄기 세포를 배양하는 것이다. 또한 생체 외 조혈 전구 세포를 유지하기 위한 영양 배지에 트롬보포이에틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 flt3 리간드(Flt-3L, 즉, flt3 유전자 산물)은 시험관 내에서 원시(즉, 상대적으로 미분화된) 인간 조혈 전구 세포를 확장하는 데 유용했으며 이러한 세포는 SCID-hu 마우스에서 생착될 수 있었다(Luens et al., 1998, Blood 91:1206- 1215). 다른 공지된 방법에서, 세포는 뮤린 프로락틴-유사 단백질 E(mPLP-E) 또는 뮤린을 포함하는 영양 배지(예를 들어, 분, 시간 또는 3, 6, 9, 13일 이상)에서 생체외에서 유지될 수 있다. 프로락틴-유사 단백질 F(mPIP-F; 집합적으로 mPLP-E/IF)(미국 특허 번호 6,261,841). 다른 적절한 세포 배양 및 확장 방법이 또한 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 세포는 또한 미국 특허 제5,945,337호에 기재된 바와 같이 무혈청 배지에서 성장할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 변형된 조혈 줄기 세포는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 대상체에 투여하기 전에 인터루킨 및 성장 인자의 특이적 조합을 사용하여 생체외에서 CD4+ 세포 배양물로 분화된다. 세포는 생체외에서 단리된 조혈 줄기 세포의 원래 집단과 비교하여 세포의 많은 수, 바람직하게는 적어도 5배, 보다 바람직하게는 적어도 10배 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 20배 확장으로 확장될 수 있다. .
다른 구체예에서, 세포는 역분화 체세포일 수 있다. 체세포는 조혈 전구 세포가 되도록 유도될 수 있는 만능 줄기 유사 세포가 되도록 재프로그래밍될 수 있다. 그 다음, 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포와 관련하여 상기 기재된 바와 같은 조성물로 처리될 수 있다. 재프로그래밍될 수 있는 대표적인 체세포에는 섬유아세포, 지방세포 및 근육 세포가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 유도된 줄기-유사 세포로부터의 조혈 전구 세포는 마우스에서 성공적으로 개발되었다(Hanna, J. et al. Science, 318:1920-1923 (2007)).
유도된 줄기 유사 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하기 위해, 체세포는 숙주로부터 수확된다. 바람직한 구체예에서, 체세포는 자가 섬유아세포이다. 세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 인자를 인코딩하는 벡터로 배양되고 형질도입된다. 형질도입된 세포는 AP, SSEA1 및 Nanog를 포함하지만 이에 제한되지 않는 배아 줄기 세포(ES) 형태 및 ES 세포 마커에 대해 배양되고 스크리닝된다. 형질도입된 ES 세포는 배양되고 유도되어 유도된 줄기 유사 세포를 생성한다. 그런 다음 세포를 CD41 및 c-kit 마커(초기 조혈 전구 마커) 및 골수 및 적혈구 분화에 대한 마커에 대해 스크리닝한다.
변형된 조혈 줄기 세포 또는 예를 들어, 유도된 조혈 전구 세포를 포함하는 변형된 세포는 이어서 대상체에 도입된다. 세포의 전달은 다양한 방법을 사용하여 영향을 받을 수 있으며 가장 바람직하게는 골막, 골수 및/또는 피하 부위로의 직접 데포 주사 뿐만 아니라 주입에 의한 정맥내 투여를 포함한다.
변형된 세포를 수용하는 대상체는 세포의 생착을 향상시키기 위한 골수 컨디셔닝을 위해 치료될 수 있다. 수용자는 세포의 투여 전에 방사선 또는 화학요법 치료를 사용하여 생착을 향상시키기 위해 치료될 수 있다. 투여 시, 세포는 일반적으로 생착하는 데 일정 기간이 필요한다. 조혈 줄기 또는 전구 세포의 상당한 생착을 달성하는 데 일반적으로 몇 주에서 몇 달이 걸린다.
변형된 조혈모세포의 높은 비율의 생착은 상당한 예방 또는 치료 효과를 달성하는 데 필요하지 않을 수 있다. 생착된 세포는 변형된 세포의 백분율을 증가시키기 위해 생착 후 시간이 지남에 따라 확장될 것으로 믿어진다. 일부 경우에, 예방 또는 치료 효과를 제공하기 위해 변형된 조혈 줄기 세포의 단지 소수 또는 적은 비율의 생착이 필요할 것으로 믿어진다.
바람직한 실시양태에서, 대상체에 투여될 세포는 자가, 예를 들어, 자가 세포일 것이다. 주제에서 파생되거나 동계이다.
2. 배아
일부 실시양태에서, 조성물 및 방법을 사용하여 시험관 내에서 배아 세포에 화물을 전달할 수 있다. 이 방법은 일반적으로 시험관 내 배아를 유효량의 항체-화물 DNA와 접촉시켜 배아로의 화물 형질도입을 개선하는 것을 포함한다. 배아는 단일 세포 접합체일 수 있지만 수정 전 및 수정 동안의 남성 및 여성 배우자의 치료 및 2, 4, 8 또는 16개의 세포를 갖고 접합자 뿐만 아니라 상실배 및 배반포를 포함하는 배아도 제공된다. . 일부 실시양태에서, 배아는 시험관내 수정 동안 또는 이후 배양일 0-6에 조성물과 접촉된다.
접촉은 배아를 목욕시키는 액체 매질에 조성물을 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 배아 배양 배지로 직접 피펫팅될 수 있으며, 그 후 배아에 의해 흡수된다.
3. 면역 세포
일부 실시양태에서, 표적 세포는 하나 이상의 유형의 면역 세포이다. 예를 들어, 다른 유형의 세포가 이용되거나 면역화 및 CAR 기반 요법을 위해 표적화될 수 있다. 선호되는 표적화/조작된 T 세포는 종양 및 입양 요법의 목표에 따라 달라질 수 있다. 효과기 T 세포는 높은 수준의 효과기 사이토카인을 분비하고 시험관 내에서 종양 표적을 능숙하게 살해하기 때문에 일반적으로 선호된다(Barrett, et al., Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014). CAR 매개 세포독성은 CD3-CD56+ NK 세포 및 CD3+CD8+ T 세포이다. CD4+ 헬퍼 T 세포와 함께 CD8+ T 세포를 사용하면 억제 T-reg 세포의 존재가 증가하고 CD8+ T 세포 세포독성이 약화된다. 재프로그래밍된 CD8+ T 세포는 림프절에서 활성화할 필요 없이 종양 세포에 직접 작용하도록 사전 활성화되므로 CD4+ T 세포 지원은 필수적이지 않는다.
또한, 순진한 T 세포(Rosenberg, et al. Adv. Cancer Res., 25:323-388 (1977)), 중추 기억 T 세포(TCM 세포)(Berger, et al. J. Clin Invest., 118:294-305(2008)), Th17 세포(Paulos, et al., Sci. Transl. Med., 2:55-78 (2010)) 및 T 줄기 기억 세포(Gattinoni, et al. ., Nat. Med., 17:1290-1297 (2012)) 예를 들어 높은 복제 능력으로 인해 특정 응용 분야에서 모두 특정 이점을 가질 수 있다. 종양 침윤 림프구(TIL)는 또한 항원 특이성으로 인해 특정 이점을 가지며 본원에 개시된 전달 전략에 사용될 수 있다.
때때로 CAR 세포, CAR 면역 세포, 및 CART 세포(또는 CAR T 세포)로 지칭되지만, 본원에 개시된 CAR 및 기타 전달 전략은 또한 다른 세포 유형, 특히 상이한 유형의 본원에서 논의되고 다른 곳에서 설명된 것들을 포함하는 면역 세포(예를 들어, 림프구, 자연 살해 세포, 수지상 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 대식세포 등)(예를 들어, Barrett, et al., Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014)).
4. 암세포와 종양
일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 이러한 실시양태에서, 종양 요법을 비롯한 암과 관련하여 유용할 수 있는 치료 방법이 제공된다. 아래의 예는 DNA 카고가 종양에 국한되지 않고 여러 조직에 보다 일반적으로 전달될 수 있는 반면 RNA 전달은 종양 조직에 대해 보다 선택적일 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 암세포가 표적 세포인 경우, 카고는 RNA(예를 들어, RNA 단독)로 구성될 수 있다.
암 세포에 전달될 수 있는 화물에는 하나 이상의 세포자멸사 촉진 인자, 면역원성 인자 또는 종양 억제 인자의 발현을 위한 구성물; 유전자 편집 조성물, 종양 유전자를 표적으로 하는 억제 핵산; 여기와 다른 곳에서 논의된 다른 전략뿐만 아니라. 일부 실시양태에서, 카고는 세포에 대한 면역 반응 및 증가하는 세포자멸사 촉진 인자, 또는 면역원성 인자를 코딩하는 mRNA이다. 다른 구현예에서, 카고는 종양유전자 또는 다른 암 유발 전사체의 발현을 감소시키는 siRNA이다.
성숙한 동물에서 대부분의 기관과 조직에서 세포 재생과 세포 사멸 사이의 균형이 일반적으로 유지된다. 신체의 다양한 유형의 성숙한 세포에는 주어진 수명이 있다. 이들 세포가 죽으면서 다양한 줄기세포의 증식과 분화에 의해 새로운 세포가 생성된다. 정상적인 상황에서 새로운 세포의 생성은 특정 유형의 세포 수가 일정하게 유지되도록 조절된다. 그러나 때때로 정상적인 성장 조절 메커니즘에 더 이상 반응하지 않는 세포가 발생한다. 이 세포는 상당한 크기로 확장되어 종양이나 신생물을 생성할 수 있는 세포 클론을 생성한다. 무한 증식할 수 없고 건강한 주변 조직을 광범위하게 침범하지 않는 종양은 양성이다. 계속 성장하고 점진적으로 침습적인 종양은 악성이다. 암이라는 용어는 특히 악성 종양을 의미한다. 통제되지 않은 성장 외에도 악성 종양은 전이를 보이다. 이 과정에서 암 세포의 작은 덩어리가 종양에서 빠져 나와 혈액이나 림프관을 침범하고 다른 조직으로 옮겨져 계속 증식한다. 이런 식으로 한 부위의 원발성 종양이 다른 부위의 이차 종양을 유발할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 대상체에서 종양의 성장을 지연 또는 억제하고, 종양의 성장 또는 크기를 감소시키고, 종양의 전이를 억제 또는 감소시키고, 및/또는 종양 발달 또는 성장과 관련된 증상의 억제 또는 감소시켜, 대상체를 치료하는 데 유용할 수 있다.
치료될 수 있는 악성 종양은 종양이 유래된 조직의 배아 기원에 따라 본원에서 분류된다. 암종은 피부 또는 내부 장기 및 땀샘의 상피 내층과 같은 내배엽 또는 외배엽 조직에서 발생하는 종양이다. 개시된 조성물은 암종을 치료하는데 특히 효과적이다. 덜 자주 발생하는 육종은 뼈, 지방 및 연골과 같은 중배엽 결합 조직에서 파생된다. 백혈병과 림프종은 골수 조혈 세포의 악성 종양이다. 백혈병은 단일 세포로 증식하는 반면 림프종은 종양 덩어리로 증식하는 경향이 있다. 악성 종양은 암을 형성하기 위해 신체의 수많은 기관이나 조직에 나타날 수 있다.
제공된 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 암의 유형은 골, 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위 및 자궁 결장직장기의 다발성 골수종, 선암종 및 육종과 같은 혈관암과 같은 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 다수의 암 유형을 동시에 치료하는 데 사용된다. 조성물은 또한 여러 위치에서 전이 또는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
개시된 조성물 및 방법은 다음의 번호가 매겨진 항을 통해 추가로 이해될 수 있다.
1. (a) 3E10 모노클로날 항체, 이의 세포 투과성 단편; 1가, 2가 또는 다가 단일 사슬 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 그의 인간화 형태 또는 변이체;
(b) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 기능성 핵산, 기능성 핵산을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 카고;를 포함하거나 구성된 조성물.
2. 제1항에 있어서,
상기 (a)는 다음을 포함하는 조성물이고,
(i) SEQ ID NO: 7-11, 14, 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된 SEQ ID NO: 1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDRs;
(ii) SEQ ID NO: 24 내지 30, 44 또는 45중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된 SEQ ID NO: 15-23, 42, 또는 43 중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDRs;
(iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태;
(iv) SEQ ID NO: 7 또는 8과 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는
(vi) SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO:3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
3. 제1항 또는 제2항의 조성물로서, (a)는 ATCC 수탁 번호 PTA 2439 하이브리도마에 의해 생산된, 모노클로날 항체 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프 특이성을 포함하는, 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 조성물로서, (a)가 모노클로날 항체 3E10의 파라토프를 갖는 재조합 항체인 조성물.
5. (a) 결합 단백질이고, 다음을 포함하고,
(i) SEQ ID NO: 7-11, 14, 또는 53-58 중 어느 하나의 CDRs과 조합된 SEQ ID NO: 1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDRs;
(ii) SEQ ID NO: 24 내지 30, 44 또는 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDRs과 조합된, SEQ ID NO:15 내지 23, 42, 또는 43으로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDRs;
(iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태;
(iv) SEQ ID NO: 7 또는 8에 대해 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO: 1 또는 2에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는
(vi) SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 경쇄와 조합된, SEQ ID NO:3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
(b) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 기능성 핵산, 기능성 핵산을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 카고.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 조성물이고, (a)가 이중특이적인 조성물.
7. 제6항의 조성물로서, (a)는 목적 세포 유형을 표적화하는 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 조성물이고, (a)와 (b)가 비공유적으로 연결된 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 조성물이고, (a) 및 (b)가 복합체 내에 있는 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 DNA, RNA, PNA 또는 기타 변형된 핵산, 또는 핵산 유사체, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 mRNA를 포함하는 조성물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 벡터를 포함하는 조성물.
13. 제12항에 있어서, 벡터가 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 목적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
14. 제12항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)는 Cas 엔도뉴클레아제, gRNA, 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 기능성 핵산을 포함하는 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 조성물이고, (b) 기능적 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는, 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 조성물이고, 기능적 핵산이 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, RNAi, 또는 외부 가이드 서열인 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 복수의 단일 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
21. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 핵산 분자를 포함하는 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 길이가 약 1 내지 25,000개의 핵염기 사이의 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진 조성물.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 구성된 조성물.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 조성물이고, 캐리어 DNA를 추가로 포함하는 조성물.
25. 제24항에 있어서, 담체 DNA가 비-코딩 DNA인 조성물.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, (b)가 RNA로 구성된 조성물.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
28. 제27항에 있어서, (a) 및 (b)의 복합체를 캡슐화하는 중합체성 나노입자를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
29. 제28항에 있어서, 표적화 모이어티, 세포 투과 펩티드, 또는 이들의 조합은 나노입자와 회합되거나, 연결되거나, 접합되거나, 그렇지 않으면 나노입자에 직접 또는 간접적으로 부착되는 약제학적 조성물.
30. 세포를 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 핵산 카고를 세포에 전달하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 접촉이 생체외에서 일어나는 것인 방법.
32. 제31항에 있어서, 세포가 조혈 줄기 세포 또는 T 세포인 방법.
33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 세포가 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여되는 방법.
35. 제30항에 있어서, 접촉이 이를 필요로 하는 대상체에 투여 후 생체내에서 접촉이 일어나는 방법.
36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법이고, 대상체가 질병 또는 장애가 있는 방법.
37. 제36항에 있어서, 질병 또는 장애가 유전적 장애, 암, 또는 감염 또는 감염성 질병인 방법.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, (b)가 개체의 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키는 유효량으로 개체의 세포에 전달되는 방법.
39. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 만드는 방법이고, 세포와 접촉하기 전에 (a) 및 (b)의 복합체를 형성하기 위해 (a) 및 (b)를 유효량의 시간 동안 적절한 온도에서 인큐베이션 및/또는 혼합하는 것을 포함하는 조성물을 만드는 방법.
40. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 만드는 방법이고, 선택적으로 실온 또는 섭씨 37도에서 약 1분 내지 약 30분, 약 10분 내지 약 20분, 또는 약 15분 동안, (a) 및 (b)의 인큐베이션 및/또는 혼합하는 방법.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조성물 또는 방법이고, 3E10 모노클로날 항체, 이의 세포 투과 단편; 1가, 2가 또는 다가 단일 사슬 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 서열 92 또는 93의 핵산 결합 포켓을 포함하는 인간화 형태 또는 그의 변이체, 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 그의 변이체.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기가 R로 치환된 조성물 또는 방법.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기가 L로 치환된 조성물 또는 방법.
44. 결합 단백질이고,
(i) SEQ ID NO:7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된 SEQ ID NO:1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR의 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 24-30, 44, 또는 45에서 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR과 조합된, SEQ ID NOS:15-23, 42, 또는 43으로부터 선택된 제2 및 제3 중쇄 CDR과 조합된 제1 중쇄 CDR의 변이체;
(iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태;
(iv) SEQ ID NO: 7 또는 8에 대하여 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는
(vi) SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, SEQ ID NO:3-6, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;를 포함하고,
D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 R 또는 L로 치환된 결합 단백질.
45. 제44항에 있어서, SEQ ID NOS:92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 그의 변이체를 포함하는 결합 단백질.
실시예
아래 실험과 관련하여, D31N 변이체로 언급된 경우를 제외하고 표준 3E10 서열이 사용되었다(예를 들어, 실시예 4). 표준 3E10 및 D31N 변이체 모두 전장 항체로 사용되었다.
3E10은 1시간 후 PNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
PNA 단독(1 nmole)(MW=9984.39; 길이 29개 뉴클레오티드), 또는 3E10과 복합된 PNA(0.75 mg)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 그리고나서, 200,000개의 K562 세포를 무혈청 배지에서 3E10 또는 PNA 단독의 현탁액에 첨가하였다. 추가의 무혈청 배지를 500ul의 최종 부피로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 세포와 함께 배양한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 분석법(flow cytometry)으로 분석하였다. PNA는 형광 염료인 테트라메틸로다민(TAMRA)에 부착하여 표지되었다.
결과
결과는 유세포 분석 도트 플롯(도 1a-1c)에 나타나 있다. % 섭취를 정량화했다(도 1d).
결과는 3E10과 혼합될 때 PNA의 증가된 흡수를 보여준다.
3E10은 24시간 후 PNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
PNA 단독(1 nmole)(MW=9984.39; 길이 29개 뉴클레오티드), 또는 3E10과 복합된 PNA(0.75 mg)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 이어서, 200,000개의 K562 세포를 무혈청 배지에서 3E10 또는 PNA 단독의 현탁액에 첨가하였다. 추가의 무혈청 배지를 500ul의 최종 부피로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 동안 세포와 배양한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 분석법으로 분석하였다.
20,000개의 U2OS 세포를 8웰 챔버 슬라이드에 접종하고 24시간 동안 부착되도록 두었다. 이후에 세포를 PNA 단독(1 nmole) 또는 3E10과 복합된 PNA(10 uM)로 처리하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 3E10과 혼합된 PNA 또는 PNA를 PBS로 세척한 후 고정 및 핵 염색을 하였다. PNA 흡수는 이후 유세포 분석에 의해 정량화되고 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었다. PNA는 형광 염료인 테트라메틸로다민(TAMRA)에 부착하여 표지되었다.
결과
결과는 유세포 분석 도트 플롯에 나와 있다(도2a-2c). % 섭취를 정량화했다(도 2d).
결과는 3E10과 혼합될 때 PNA의 증가된 흡수를 보여준다.
형광현미경은 핵 DNA(파란색의 DAPI)와 PNA(빨간색의 Tamra)의 공동 국소화를 보여주었고 이는 뚜렷한 분홍색 색조의 생성으로 분명했다.
3E10은 24시간 후 siRNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
표지된 siRNA(플루오레세인 아미다이트, FAM에 대한 부착을 통해)(1 nmole), 또는 3E10(0.75 mg)과 복합된 siRNA를 실온에서 5분 동안 혼합했다. 그런 다음 200,000 K562 세포를 무혈청 배지에서 3E10 또는 siRNA 단독의 현탁액에 첨가했다. 추가의 무혈청 배지를 500ul의 최종 부피로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 동안 세포와 배양한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 분석법으로 분석하였다.
결과
결과는 유세포 분석 도트 플롯에 나와 있다(도3a-3c). % 흡수를 정량화했다(도 3d).
결과는 3E10과 혼합될 때 siRNA의 증가된 세포 흡수를 보여준다.
3E10은 24시간 후 mRNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
표지된 mRNA(시아닌 5, Cy5에 부착)(2ug) 단독 또는 3E10(2.5, 5 및 10uM)과 복합된 표지된 mRNA를 실온에서 5분 동안 혼합했다. 3E10 + mRNA 또는 mRNA 단독의 현탁액을 무혈청 배지에서 200,000 K562 세포에 첨가했다. 추가의 무혈청 배지를 500ul의 최종 부피로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 동안 세포와 배양한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 분석법으로 분석하였다.
결과
결과는 유세포 분석 도트 플롯에 나와 있다(도 4a-4H). % 섭취를 정량화했다(도 4i).
결과는 3E10과 혼합될 때 mRNA의 증가된 흡수를 보여준다.
3E10의 D31N 변이체에 의한 mRNA의 전달은 가장 높은 수준의 mRNA 세포 흡수를 초래했다.
형광 현미경은 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 인코딩하는 동일한 Cy5 표지된 mRNA의 번역 후 U2OS 세포에서 기능적인 GFP 발현을 보여주었다.
3E10은 1시간 후 mRNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
표지된 mRNA(Cy5)(2ug) 또는 3E10의 D31N 변이체(0.1-10uM)와 복합된 표지된 mRNA를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 3E10 + mRNA 또는 mRNA 단독의 현탁액을 무혈청 배지에서 200,000 K562 세포에 첨가했다. 추가의 무혈청 배지를 500ul의 최종 부피로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 분석법으로 분석하였다.
결과
결과는 유세포 분석 도트 플롯에 나와 있다(도 5a-5h). % 섭취를 정량화했다(도 5I).
실시예 6: 3E10은 플라스미드 DNA의 세포 흡수를 증가시킨다
재료 및 방법
GFP 리포터 플라스미드 DNA(250ug)를 실온에서 5분 동안 3E10(10uM)과 복합화했다. 3E10 플러스 플라스미드 DNA의 현탁액, 또는 플라스미드 DNA 단독을 무혈청 배지에서 200,000 K562 세포에 첨가하였다. 추가의 무혈청 배지를 500ul의 최종 부피로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 동안 세포를 배양한 후 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척하였다. 초기 처리 72시간 후, 세포를 이미지화하고 GFP 발현에 대해 분석하였다.
결과
결과는 3E10이 플라스미드 DNA와 결합되었을 때 GFP 플라스미드가 세포에 의해 강력하게 흡수되었음을 나타내며, 이는 GFP 구성물의 흡수 및 기능적 발현을 나타내는 녹색 형광으로 측정된다. 플라스미드 DNA만 사용한 경우에는 흡수 또는 녹색 형광이 나타나지 않았다. (도 6).
실시예 7: 3E10은 생체내 mRNA 전달을 매개한다
재료 및 방법
GFP를 암호화하는 mRNA 10ug을 실온에서 15분 동안 0.1mg의 3E10과 혼합하였다. 3E10에 복합체를 형성한 mRNA를 100 mm3로 측정되는 EMT6 옆구리 종양이 있는 BALB/c 마우스에 전신 주사하였다. 처리 20시간 후, 종양을 수확하고 IVIS 영상화를 사용하여 mRNA 발현(GFP)에 대해 분석하였다.
결과
mRNA의 3E10-매개 전달은 종양에서 어떠한 GFP 발현도 산출하지 않은 자유롭게 주사된 mRNA와 비교하여 종양에서 상당히 더 높은 수준의 GFP 발현을 초래하였다. 간, 비장, 심장 및 신장을 포함하여 어느 치료로도 조사된 정상 조직에서 GFP의 검출 가능한 발현은 없었다. 결과는 기능적 번역 및 발현과 함께 mRNA가 종양으로 강력하게 전달되었음을 나타낸다.
실시예 8: 3E10은 생체내 siRNA 전달을 매개한다
재료 및 방법
40 ug의 형광 표지된 siRNA를 실온에서 15분 동안 증가된 용량의 3E10(0.25, 0.5 및 1 mg)과 혼합했다. 3E10에 복합체를 형성한 siRNA를 100mm3 크기의 EMT6 옆구리 종양이 있는 BALB/c 마우스에 전신 주사했다. 처리 20시간 후, 종양을 수확하고 IVIS 영상화를 사용하여 siRNA 전달에 대해 분석했다.
40 ug의 형광 표지된 siRNA를 실온에서 15분 동안 1 mg 3E10 또는 0.1 mg 3E10의 D31N 변이체와 혼합했다. 3E10에 복합체를 형성한 siRNA를 100mm3 크기의 EMT6 옆구리 종양이 있는 BALB/c 마우스에 전신 주사했다. 처리 20시간 후, 종양을 수확하고 IVIS 영상화를 사용하여 siRNA 전달에 대해 분석했다.
결과
도 7a에 도시된 바와 같이, 3E10의 증가된 용량은 종양에서 siRNA의 더 높은 축적을 초래한다.
도 7B에 도시된 바와 같이, D31N 3E10의 10배 더 낮은 용량은 3E10과 유사한 수준의 siRNA 전달을 초래하였다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 인용된 간행물 및 그들이 인용된 자료는 참고로 구체적으로 포함된다.
실시예 9: 담체 DNA는 비종양 조직에 대한 mRNA를 향상시킨다
재료 및 방법
2 ug의 형광 표지된 mRNA를 실온에서 15분 동안 캐리어 DNA(5 ug)가 있거나 없는 20 ug의 3E10-D31N과 혼합했다. 3E10에 복합된 mRNA는 E15.5에서 태아에게 주입되었다. 치료 24-48시간 후, 태아를 수확하고 IVIS 영상화를 사용하여 mRNA 전달에 대해 분석했다.
결과
운반체 DNA가 없으면 mRNA와 복합체를 이루는 3E10-D31N은 24시간에 태아로부터 빠르게 제거되었다. 그러나 운반체 DNA의 추가는 48시간에 태아의 여러 조직에서 검출 가능한 mRNA 신호를 초래했다.
위의 예는 DNA 화물 전달이 종양에 국한되지 않고 여러 조직에 더 일반적일 수 있는 반면, RNA 전달은 종양 조직에 대해 더 선택적일 수 있음을 나타낼 수 있다.
실시예 10: mRNA 및 운반체 DNA와 복합된 3E10(D31N)은 단백질 발현 수준을 유지함
재료 및 방법
10 ug의 루시페라제 mRNA 및 10 ug의 단일 가닥 캐리어 DNA(60 nts)를 100 ug의 3E10(WT) 또는 3E10(D31N)과 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 3E10에 복합된 mRNA를 각 마우스의 오른쪽 대퇴사두근에 근육내(IM) 주사하였다. 루시페라제 발현을 6일에 걸쳐 모니터링했다.
결과
도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, mRNA 및 운반체 DNA와 복합된 3E10(D31N)의 투여는 루시페라제 발현 수준을 지속시켰지만, mRNA 및 운반체 DNA와 복합된 3E10(WT)은 배경 이상의 어떠한 감지할 수 있는 신호도 생성하지 못했다.
실시예 11: IV 주사된 3E10의 생체내 분포.
근육에 IV 주사된 3E10의 분포를 조사했다. VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 200㎍의 3E10, WT 또는 D31N을 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사 4시간 후, 근육을 수확하고 IVIS(Perkin Elmer)로 이미지화했다(도 9a 및 9b). IVIS 이미지의 정량화는 3E10-D31N이 3E10-WT와 비교할 때 근육에 더 높은 분포를 달성함을 보여준다(도 9C).
조직에 대한 3E10-D31N의 용량 의존적 생체 분포를 조사했다. VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 3E10-D31N 100μg 또는 200μg을 마우스에 정맥 주사했다. 주사 24시간 후, 조직을 수확하고 IVIS(Perkin Elmer)로 영상화했다. 조직 분포의 정량화는 간을 포함한 여러 조직에서 그에 상응하는 증가 없이 근육 축적의 용량 의존적 2배 증가를 보여주었다(도 10).
종양에 대한 3E10의 분포. 옆구리 동계 결장 종양(CT26)이 있는 마우스에 VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 200μg의 3E10, WT 또는 D31N을 정맥 주사했다. 주사 24시간 후, 종양을 수거하고 IVIS(Perkin Elmer)에 의해 영상화하였다(도 11a-11b). 종양 분포의 정량화는 3E10-WT와 비교할 때 3E10-D31N이 종양에서 더 높은 축적을 가짐을 입증하였다(도 11c).
3E10과 비공유적으로 연관된 ssDNA의 분포를 조사했다. 옆구리 동계 결장 종양(CT26)이 있는 마우스에 40ug의 표지된 ssDNA(IR680)와 혼합된 200ug의 3E10, WT 또는 D31N을 정맥내 주사했다. 주사 24시간 후, 종양을 수거하고 IVIS(Perkin Elmer)에 의해 영상화하였다(도 12(a)-12(c)). 조직 분포의 정량화는 3E10-D31N에 의한 ssDNA의 전달이 3E10-WT와 비교할 때 더 높은 종양 축적을 초래함을 입증하였다(도 12(d)).
실시예 12: 3E10은 RIG-I 리간드의 전달 및 RIG-I 활성의 자극을 매개한다.
재료 및 방법
RIG-I 리포터 세포(HEK-Lucia RIG-I, Invivogen)를 웰당 50,000개 세포로 시딩하고 RIG-I 리간드(1ug) 또는 3E10-D31N에 복합체화된 리간드(20ug)로 처리했다. 이 분석은 인터페론의 유도가 있을 때 활성화되는 루시퍼라제 리포터가 있는 세포주를 사용한다.
결과
모든 경우에, RIG-I 리간드 단독은 IFN-盾 분비를 자극하지 않았다. 그러나 3E10-D31N과 함께 RIG-리간드를 전달하면 대조군보다 IFN-盾 분비가 자극되었으며, 저분자량 및 고분자량(LMW 및 HMW) 모두에서 폴리(I:C)에서 가장 높은 분비가 관찰되었다.
실시예 13: 3E10 및 이의 조작된 변이체의 분자 모델링.
WT 중쇄 scFv 서열
E VQLVESGGGL VKPGGSRKLS CAASGFTFSD YGMHWVRQAP EKGLEWVAYI SSGSSTIYYA DTVKGRFTIS RDNAKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCARRGL LLDYWGQGTT LTVS(SEQ ID NO: 92)
경쇄 scFv 서열
D IVLTQSPASL AVSLGQRATI SCRASKSVST SSYSYMHWYQ QKPGQPPKLL IKYASYLESG VPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYY CQHSREFPWT FGGGTKLEIK RADAAPGGGG SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 93)
3E10(Pymol)의 분자 모델링은 추정되는 핵산 결합 포켓(NAB1)을 나타내었다(도 14a-14b). CDR1의 잔기 31에 있는 아스파라긴산을 아스파라긴으로 돌연변이시키면 이 잔기의 양이온 전하가 증가하고 생체 내에서 핵산 결합 및 전달이 향상되었다(3E10-D31N).
아르기닌(3E10-D31R)으로의 CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 돌연변이는 양이온 전하를 추가로 확장한 반면, 라이신(3E10-D31K)으로의 돌연변이는 전하 배향을 변경시켰다(도 14a).
분자 모델링에서 예측된 NAB1 아미노산은 위의 중쇄 및 경쇄 서열에 밑줄이 그어져 있다. 도 14b는 점으로 예시된 NAB1 아미노산 잔기를 갖는 3E10-scFv(Pymol)의 분자 모델링을 보여주는 예시이다.
당업자는 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> YALE UNIVERSITY QUIJANO, ELIAS GLAZER, PETER <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS TO CELLS <130> YU 7503 (3) <150> 62/944,281 <151> 2019-12-05 <150> PCT/US19/48953 <151> 2019-08-30 <150> PCT/US19/48962 <151> 2019-08-30 <160> 93 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr 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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 78 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 78 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 79 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 80 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 80 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 81 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 82 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 83 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 83 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 84 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 85 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 85 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 86 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 86 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 87 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 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Ile Lys Tyr 20 25 30 <210> 90 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 90 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 20 25 30 Leu <210> 91 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = any amino acid, but preferentially is a basic residue (R or K) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X = any amino acid, but preferentially is a basic residue (R or K) <400> 91 Xaa Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Xaa Lys Tyr 20 25 30 <210> 92 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 93 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 93 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser 130

Claims (45)

  1. 조성물이고,
    (a) 3E10 모노클로날 항체, 이의 세포 투과성 단편; 1가, 2가 또는 다가 단일 사슬 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 그의 인간화 형태 또는 변이체;
    (b) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 기능성 핵산, 기능성 핵산을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 카고;를 포함하거나 구성된 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a)는 다음을 포함하는 조성물이고,
    (i) SEQ ID NO: 7-11, 14, 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된 SEQ ID NO: 1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDRs;
    (ii) SEQ ID NO: 24 내지 30, 44 또는 45중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된 SEQ ID NO: 15-23, 42, 또는 43 중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDRs;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태;
    (iv) SEQ ID NO: 7 또는 8과 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    (v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는
    (vi) SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO:3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나에 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  3. 제1항 또는 제2항의 조성물로서, (a)는 ATCC 수탁 번호 PTA 2439 하이브리도마에 의해 생산된, 모노클로날 항체 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프 특이성을 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 조성물로서, (a)가 모노클로날 항체 3E10의 파라토프를 갖는 재조합 항체인 조성물.
  5. (a) 결합 단백질이고, 다음을 포함하고,
    (i) SEQ ID NO: 7-11, 14, 또는 53-58 중 어느 하나의 CDRs과 조합된 SEQ ID NO: 1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDRs;
    (ii) SEQ ID NO: 24 내지 30, 44 또는 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDRs과 조합된, SEQ ID NO:15 내지 23, 42, 또는 43으로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDRs;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태;
    (iv) SEQ ID NO: 7 또는 8에 대해 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO: 1 또는 2에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는
    (vi) SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 경쇄와 조합된, SEQ ID NO:3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 기능성 핵산, 기능성 핵산을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 카고.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 조성물이고, (a)가 이중특이적인 조성물.
  7. 제6항의 조성물로서, (a)는 목적 세포 유형을 표적화하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 조성물이고, (a)와 (b)가 비공유적으로 연결된 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 조성물이고, (a) 및 (b)가 복합체 내에 있는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 DNA, RNA, PNA 또는 기타 변형된 핵산, 또는 핵산 유사체, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 mRNA를 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 벡터를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 벡터가 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 목적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)는 Cas 엔도뉴클레아제, gRNA, 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 기능성 핵산을 포함하는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 조성물이고, (b) 기능적 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 조성물이고, 기능적 핵산이 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, RNAi, 또는 외부 가이드 서열인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 복수의 단일 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 길이가 약 1 내지 25,000개의 핵염기 사이의 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 조성물이고, (b)가 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 구성된 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 조성물이고, 캐리어 DNA를 추가로 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 담체 DNA가 비-코딩 DNA인 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, (b)가 RNA로 구성된 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, (a) 및 (b)의 복합체를 캡슐화하는 중합체성 나노입자를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 표적화 모이어티, 세포 투과 펩티드, 또는 이들의 조합은 나노입자와 회합되거나, 연결되거나, 접합되거나, 그렇지 않으면 나노입자에 직접 또는 간접적으로 부착되는 약제학적 조성물.
  30. 세포를 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 핵산 카고를 세포에 전달하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 접촉이 생체외에서 일어나는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 세포가 조혈 줄기 세포 또는 T 세포인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포가 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여되는 방법.
  35. 제30항에 있어서, 접촉이 이를 필요로 하는 대상체에 투여 후 생체내에서 접촉이 일어나는 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법이고, 대상체가 질병 또는 장애가 있는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 질병 또는 장애가 유전적 장애, 암, 또는 감염 또는 감염성 질병인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, (b)가 개체의 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키는 유효량으로 개체의 세포에 전달되는 방법.
  39. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 만드는 방법이고, 세포와 접촉하기 전에 (a) 및 (b)의 복합체를 형성하기 위해 (a) 및 (b)를 유효량의 시간 동안 적절한 온도에서 인큐베이션 및/또는 혼합하는 것을 포함하는 조성물을 만드는 방법.
  40. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 만드는 방법이고, 선택적으로 실온 또는 섭씨 37도에서 약 1분 내지 약 30분, 약 10분 내지 약 20분, 또는 약 15분 동안, (a) 및 (b)의 인큐베이션 및/또는 혼합하는 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조성물 또는 방법이고, 3E10 모노클로날 항체, 이의 세포 투과 단편; 1가, 2가 또는 다가 단일 사슬 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 서열 92 또는 93의 핵산 결합 포켓을 포함하는 인간화 형태 또는 그의 변이체, 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 그의 변이체.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기가 R로 치환된 조성물 또는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기가 L로 치환된 조성물 또는 방법.
  44. 결합 단백질이고,
    (i) SEQ ID NO:7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된 SEQ ID NO:1-6, 12, 13, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR의 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 24-30, 44, 또는 45에서 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR과 조합된, SEQ ID NOS:15-23, 42, 또는 43으로부터 선택된 제2 및 제3 중쇄 CDR과 조합된 제1 중쇄 CDR의 변이체;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태;
    (iv) SEQ ID NO: 7 또는 8에 대하여 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    (v) 인간화된 형태 또는 (iv); 또는
    (vi) SEQ ID NO:9-11 또는 53-58에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, SEQ ID NO:3-6, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;를 포함하고,
    D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 R 또는 L로 치환된 결합 단백질.
  45. 제44항에 있어서, SEQ ID NOS:92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 그의 변이체를 포함하는 결합 단백질.
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