JP2022546699A - 核酸を細胞に送達するための組成物および方法 - Google Patents

核酸を細胞に送達するための組成物および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022546699A
JP2022546699A JP2022513157A JP2022513157A JP2022546699A JP 2022546699 A JP2022546699 A JP 2022546699A JP 2022513157 A JP2022513157 A JP 2022513157A JP 2022513157 A JP2022513157 A JP 2022513157A JP 2022546699 A JP2022546699 A JP 2022546699A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
cells
seq
composition
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022513157A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021042060A5 (ja
Inventor
エリアス キジャーノ，
ピーター グレイザー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yale University
Original Assignee
Yale University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2019/048953 external-priority patent/WO2020047344A1/en
Priority claimed from PCT/US2019/048962 external-priority patent/WO2020047353A1/en
Application filed by Yale University filed Critical Yale University
Publication of JP2022546699A publication Critical patent/JP2022546699A/ja
Publication of JPWO2021042060A5 publication Critical patent/JPWO2021042060A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

核酸カーゴを細胞内に送達するための組成物およびその使用方法が提供される。本組成物は、通常、（ａ）３Ｅ１０モノクローナル抗体またはその抗原結合、細胞膜透過性フラグメント；一価、二価、または多価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；またはダイアボディ；またはそのヒト化形態もしくはバリアント、および（ｂ）例えば、ポリペプチドをコードする核酸、機能性核酸、機能性核酸をコードする核酸、またはそれらの組合せを含む核酸カーゴを含む。要素（ａ）と（ｂ）は通常、非共有結合して複合体を形成する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｏ Ｃｅｌｌｓ」という表題で２０１９年１２月５日に米国特許商標庁に出願された米国特許仮出願第６２／９４４，２８１号、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｄｏｎｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ」という表題で２０１９年８月３０日に特許協力条約の米国受理官庁に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８９５３号、および「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔｒｉｐｌｅｘ Ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ」という表題で２０１９年８月３０日に特許協力条約の米国受理官庁に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８９６２号の利益および優先権を主張する。米国特許仮出願第６２／９４４，２８１号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８９５３号、米国特許仮出願第６２／７２５，９２０号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８９６２号、米国特許仮出願第６２／７２５，８５２号はそれぞれ参照によりその全体が具体的に組み込まれている。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＣＡ１９７５７４の下で政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列リストの参照
２０２０年８月３１日に作成され、サイズが１５４，７０１バイトの「ＹＵ＿７５０３＿３＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルとして提出された配列リストは、米国特許法施行規則３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、一般に、限定されるものではないが、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの遺伝子治療および遺伝子編集を含む用途のための、核酸の細胞内送達の分野に関する。
発明の背景
遺伝子治療には、遺伝性疾患または癌などの後天性疾患に対する遺伝子置換やノックダウンからワクチン接種まで、多岐にわたるさまざまな用途が含まれる。ウイルスベクターと合成リポソームは、今日の多くの用途で選択される媒体として浮上しているが、どちらにも生産の複雑さ、限られた包装容量、および好ましくない免疫学的特徴をはじめとする制限とリスクがあり、それが遺伝子治療の用途を制限し、予防的遺伝子治療の可能性を妨げている（Ｓｅｏｗ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１７（５）：７６７－７７７（２００９））。
ヌクレオチドのインビボ取り込みおよび分布は細胞および組織において観察されている（Ｈｕａｎｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５５８（１－３）：６９－７３（２００４））。さらに、例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が吸入されると内因性界面活性剤（肺細胞より産生される脂質）に結合し、さらなるキャリア脂質を必要とせずに肺細胞に取り込まれることを示したが（Ｎｙｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：７２１－７２５（１９９７））、小型の核酸はＴ２４膀胱癌組織培養細胞に取り込まれる（Ｍａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，８：４１５－４２６（１９９８））ため、特にインビボ用途のための核酸トランスフェクション技術の改良がなお必要である。ＡＡＶ９は、今もなおヒトにおいて通常使用されるウイルスベクターであり、２００３年に発見された（Ｒｏｂｂｉｎｓ、「Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｉｏｎｅｅｒ ｓａｙｓ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｉｓ ｂｅｈｉｎｄ－ａｎｄ ｔｈａｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ｅｍｂａｒｒａｓｓｉｎｇ」、Ｓｔａｔ、２０１９年１１月）。
Ｓｅｏｗ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１７（５）：７６７－７７７（２００９） Ｈｕａｎｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５５８（１－３）：６９－７３（２００４） Ｎｙｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：７２１－７２５（１９９７） Ｍａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，８：４１５－４２６（１９９８）
したがって、本発明の目的は、細胞への核酸の送達を改善するための組成物およびその使用方法を提供することである。
発明の概要
核酸カーゴを細胞内に送達するための組成物およびその使用方法が提供される。組成物は、通常、（ａ）３Ｅ１０モノクローナル抗体またはその細胞膜透過性フラグメント；一価、二価、または多価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；またはダイアボディ；またはそのヒト化形態もしくはバリアント、および（ｂ）例えば、ポリペプチドをコードする核酸、機能性核酸、機能性核酸をコードする核酸、またはそれらの組合せを含む核酸カーゴを含む。要素（ａ）と（ｂ）は通常、非共有結合して複合体を形成する。ＤＮＡに加えて、３Ｅ１０はＲＮＡ、ＰＮＡ、および他の核酸に結合すると考えられている。
例示的な３Ｅ１０抗体ならびにそのフラグメントおよび融合タンパク質には、（ｉ）配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つのＣＤＲと配列番号７～１１、１４、または５３～５８のいずれか１つのＣＤＲの組合せ；（ｉｉ）配列番号１５～２３、４２、および４３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと配列番号２４～３０、４４、および４５から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲの組合せ；（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヒト化形態；（ｉｖ）配列番号１または２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号７または８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖の組合せ；（ｖ）ヒト化形態または（ｉｖ）；あるいは（ｖｉ）配列番号３～６、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号９～１１または５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖の組合せを有するものが含まれる。
一部の実施形態では、抗体ならびにそのフラグメントおよび融合タンパク質は、３Ｅ１０重鎖アミノ酸配列のＤ３１またはＮ３１に対応するアミノ酸残基を有するＣＤＲ１重鎖バリアントまたはアルギニン（Ｒ）もしくはリジン（Ｌ）で置換されたそのＣＤＲである。
一部の実施形態では、抗体ならびにそのフラグメントおよび融合タンパク質には、配列番号９２もしくは９３の核酸結合ポケット、または核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せなどに結合する能力が同じであるか改善されているそのバリアントが含まれる。
また、３Ｅ１０重鎖アミノ酸配列のＤ３１またはＮ３１に対応するアミノ酸残基を有するＣＤＲ１重鎖バリアントまたはアルギニン（Ｒ）もしくはリジン（Ｌ）で置換されたそのＣＤＲ１を含む結合タンパク質自体、ならびに配列番号９２もしくは９３の核酸結合ポケット、または核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せなどに結合する能力が同じであるか改善されているそのバリアントを有する結合タンパク質自体が提供される。
一部の実施形態では、抗体またはフラグメントまたは融合タンパク質は二重特異性であり得、例えば、目的の細胞型、組織、または臓器を標的にする結合配列を含むことができる。
核酸カーゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、限定されるものではないがＰＮＡを含む修飾核酸またはそれらの組合せで構成され得る。核酸カーゴは、通常、機能性カーゴ、例えば機能性核酸（例えば、抑制性ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはベクター、例えば、発現ベクターなどである。ベクターを含む核酸カーゴには、発現制御配列に作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードする核酸配列が含まれ得る。ベクターは、例えば、プラスミドであり得る。通常、カーゴは、例えば、ゲノムＤＮＡをランダムに剪断したり断片化することはない。
一部の実施形態では、カーゴは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、またはそれらの組合せをコードする核酸を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、カーゴは、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする核酸を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、カーゴは、機能性核酸、例えばアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、ＲＮＡｉ、または外部ガイド配列、またはそれをコードする核酸構築物などである。
カーゴは、複数の単一の核酸分子、または複数の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの異なる核酸分子を含むか、またはそれらからなることができる。一部の実施形態では、カーゴの核酸分子は、約１～約２５，０００の間の核酸塩基長の核酸分子を含むか、またはそれからなる。カーゴは、一本鎖核酸、二本鎖核酸、またはそれらの組合せであり得る。
この複合体と薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物も提供される。一部の実施形態では、複合体は、ポリマーナノ粒子に封入されている。標的化部分、細胞膜透過性ペプチド、またはそれらの組合せは、ナノ粒子に直接的または間接的に、会合、連結、コンジュゲート、あるいは他の方法で結合させることができる。
細胞を、単独でまたはナノ粒子に封入した有効量の複合体と接触させることにより、細胞内に核酸カーゴを送達する方法も提供される。接触は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行われ得る。一部の実施形態では、有効量のエクスビボ処置細胞は、例えば、疾患または障害の１またはそれより多くの症状を処置する有効量で、それを必要とする対象に投与される。
一部の実施形態では、接触は、それを必要とする対象への投与の後にインビボで行われる。対象は、遺伝性障害または癌などの疾患または障害を有し得る。組成物は、例えば注射または注入によって、対象の疾患または障害の１またはそれより多くの症状を減少させる有効量で対象に投与することができる。
組成物および方法の用途も提供され、それには、限定されるものではないが、遺伝子治療およびＣＡＲ Ｔ細胞の製造／形成／治療が含まれる。
図１Ａ～１Ｃは、対照（１Ａ）と、ＰＮＡの単独（１Ｂ）および３Ｅ１０と１時間混合した場合（１Ｃ）の取り込みを示す散布図である。図１Ｄは、図１Ａ～１Ｃのデータを数値化した棒グラフである。 同上。
図２Ａ～２Ｃは、対照（２Ａ）と、ＰＮＡの単独（２Ｂ）および３Ｅ１０と２４時間混合した場合（２Ｃ）の取り込みを示す散布図である。図２Ｄは、図２Ａ～２Ｃのデータを数値化した棒グラフである。 同上。
図３Ａ～３Ｃは、対照（３Ａ）と、ｓｉＲＮＡの単独（３Ｂ）および３Ｅ１０と２４時間混合した場合（３Ｃ）の取り込みを示す散布図である。図３Ｄは、図３Ａ～３Ｃのデータを数値化した棒グラフである。 同上。
図４Ａ～４Ｈは、対照（４Ａ）と、ｍＲＮＡの単独（４Ｂ）および３Ｅ１０とさまざまな濃度で２４時間混合した場合（４Ｃ～４Ｈ）の取り込みを示す散布図である。図４Ｉは、図４Ａ～４Ｈのデータを数値化した棒グラフである。 同上。 同上。 同上。 同上。
図５Ａ～５Ｈは、対照（５Ａ）と、ｍＲＮＡの単独（５Ｂ）および３Ｅ１０とさまざまな濃度で１時間混合した場合（５Ｃ～５Ｈ）の取り込みを示す散布図である。図５Ｉは、図５Ａ～５Ｈのデータを数値化した棒グラフである。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６は、３Ｅ１０との混合から７２時間後、および細胞との２４時間のインキュベーション後のＧＦＰレポータープラスミドＤＮＡの細胞発現を示す一連の画像である。
図７Ａは、マウスに全身注射する前に、室温で１５分間、３Ｅ１０の用量を増やして混合した（０．２５、０．５、および１ｍｇ）蛍光標識ｓｉＲＮＡの腫瘍における蓄積を示す棒グラフである。図７Ｂは、マウスに全身注射する前に、１ｍｇの３Ｅ１０または０．１ｍｇのＤ３１Ｎバリアント３Ｅ１０と、室温で１５分間混合した蛍光標識ｓｉＲＮＡの腫瘍における蓄積を示す棒グラフである。すべての腫瘍は注射の２４時間後に分析した。
図８は、３Ｅ１０を介したマウス筋肉（ＩＭ）へのｍＲＮＡ（バイオルミネセンス（光子／秒））の送達を経時的（筋肉内注射後の日数）に示す折れ線グラフである。
図９Ａおよび９Ｂは、注射の２４時間後にＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により画像化した、対照（図９Ａ）および筋肉にＩＶ注射された３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎの分布（図９Ｂ）を示す画像である。図９Ｃは、ＩＶＩＳ画像の蛍光を数値化した棒グラフである。 同上。
図１０は、ＶｉｖｏＴａｇ６８０で標識した３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎをマウス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）への１００μｇまたは２００μｇの静脈内注射の２４時間後の、組織への３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎの用量依存的体内分布のＩＶＩＳ画像の蛍光を数値化した棒グラフである。
図１１Ａおよび１１Ｂは、注射の２４時間後にＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって画像化した、対照（図１１Ａ）および同系結腸腫瘍（ＣＴ２６）（図１１Ｂ）にＩＶ注射した３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎの分布を示す画像である。図１１Ｃは、ＩＶＩＳ画像の蛍光を数値化した棒グラフである。 同上。
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、注射の２４時間後にＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって画像化した、対照（図１２Ａ）およびＩＶ注射した裸の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（図１２Ｂ）および３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎ＋ｓｓＤＮＡ（図１２Ｃ）同系結腸腫瘍（ＣＴ２６）の分布を示す画像である。図１２Ｄは、ＩＶＩＳ画像の蛍光を数値化した棒グラフである。
図１３は、ＲＩＧ－Ｉの３Ｅ１０を介した送達および刺激を示す棒グラフである。
図１４Ａは、３Ｅ１０、その推定核酸結合ポケット（ＮＡＢ１）の分子モデリング、およびその中のアミノ酸変異によって誘発される予測される構造変化の説明図である。図１４Ｂは、ＮＡＢ１アミノ酸残基を点状のドットで強調表示した３Ｅ１０－ｓｃＦｖ（Ｐｙｍｏｌ）の分子モデリングの説明図である。 同上。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書において使用する場合、「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、本明細書において使用する場合、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨおよびＶＬが互いに結合してＦｖを形成するための）リンカーによって連結された、単一ポリペプチド鎖に軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単鎖可変フラグメントを意味する。ＶＬ領域とＶＨ領域は、親抗体に由来していてもよいし、化学的にまたは組換えによって合成されていてもよい。
本明細書において使用する場合、「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのかかるドメインを、抗体が広く共有するドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）と区別することを意図している。可変領域には、その残基が抗原結合に関与する「超可変領域」が含まれる。超可変領域には、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（すなわち、通常、軽鎖可変ドメインのおよそ２４～３４残基（Ｌ１）、５０～５６残基（Ｌ２）および８９～９７残基（Ｌ３）と重鎖可変ドメインのおよそ２７～３５残基（Ｈ１）、５０～６５残基（Ｈ２）および９５～１０２残基（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））ならびに／または「超可変ループ」の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの２６～３２残基（Ｌ１）、５０～５２残基（Ｌ２）および９１～９６残基（Ｌ３）と、重鎖可変ドメインの２６～３２残基（Ｈ１）、５３～５５残基（Ｈ２）および９６～１０１残基（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）が含まれる。
本明細書において使用する場合、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書で定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、標的抗原に結合する天然または合成の抗体を指す。この用語にはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が含まれる。無傷の免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、それらの免疫グロブリン分子の結合タンパク質、フラグメント、およびポリマー、ならびに標的抗原に結合する免疫グロブリン分子のヒトもしくはヒト化バージョンも含まれる。
本明細書において使用する場合、「細胞膜透過性抗体」という用語は、生きている哺乳動物細胞の細胞質および／または核に輸送される免疫グロブリンタンパク質、そのフラグメント、バリアント、またはそれに基づく融合タンパク質を指す。「細胞膜透過性抗ＤＮＡ抗体」は、ＤＮＡ（例えば、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡ）に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、キャリアまたはコンジュゲートの助けを借りずに細胞の細胞質に輸送される。他の実施形態では、抗体は、細胞膜透過性ペプチドなどの細胞膜透過性部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、細胞膜透過性抗体は、キャリアもしくはコンジュゲートとともに、またはキャリアもしくはコンジュゲート無しで核内に輸送される。
無傷の免疫グロブリン分子に加えて、免疫グロブリン分子のフラグメント、結合タンパク質、およびポリマー、免疫グロブリンの１より多くの種、クラス、サブクラス、例えばヒトまたはヒト化抗体などの配列を含むキメラ抗体、ならびにＤＮＡに特異的に結合する免疫グロブリンの少なくともイディオタイプを含む組み換えタンパク質も、「抗体」という用語に含まれる。抗体は、本明細書に記載されるインビトロアッセイを使用して、または類似の方法によってその望ましい活性について試験することができ、その後、既知の臨床試験方法に従ってそのインビボ治療活性が試験される。
本明細書において使用する場合、「バリアント」という用語は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが、重要な特性を保持しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、参照ポリペプチドとバリアントの配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるように、差異は制限されている。バリアントと参照ポリペプチドは、１またはそれより多くの修飾（例えば、置換、付加、および／または欠失）によりアミノ酸配列が異なる場合がある。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされているものであっても、そうでないものであってもよい。ポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するものであってもよいし、天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。
本開示のポリペプチドの構造に修飾および変更を加え、それでも該ポリペプチドと同様の特徴（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する分子を得ることができる。例えば、特定のアミノ酸は、活性を明らかに失うことなく、配列内の他のアミノ酸に置き換えることができる。ポリペプチドの生物学的機能的活性を定義するのはポリペプチドの相互作用能力および性質であるため、特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列中で行うことができ、それにもかかわらず同様の活性をもつポリペプチドを得ることができる。
このような変更を行う場合、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮することができる。相互作用的生物学的機能をポリぺプチドに付与する際のアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性は、当技術分野で一般的に理解されている。特定のアミノ酸は、同様のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換することができ、それでも同様の生物学的活性をもつポリペプチドが得られることが知られている。各アミノ酸には、その疎水性と電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。これらの指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸塩（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）である。
アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、結果として得られるポリペプチドの二次構造を定義し、それが次に、ポリペプチドと他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原、および補因子などとの相互作用を定義すると考えられている。あるアミノ酸を、同様のハイドロパシー指標を有する別のアミノ酸で置換しても、機能的に同等のポリペプチドを得ることができることは当技術分野で公知である。そのような変化では、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに特に好ましい。
同様のアミノ酸の置換は、特にそれによって作成された生物学的機能が同等のポリペプチドまたはペプチドが免疫学的実施形態での使用を意図している場合に、親水性に基づいて行うこともできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタムニン（ｇｌｕｔａｍｎｉｎｅ）（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（－０．５±１）；トレオニン（－０．４）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。あるアミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換しても、生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができることは理解される。そのような変化では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに特に好ましい。
上で概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述のさまざまな特徴を考慮に入れる例示的置換は、当業者に周知であり、それには以下が含まれる（元の残基：例示的置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）。したがって、本開示の実施形態は、上記のようなポリペプチドの機能的または生物学的同等物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、目的のポリペプチドに対して約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するバリアントを含むことができる。
本明細書において使用する場合、「配列同一性パーセント（％）」という用語は、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性パーセントを最大にした後に、参照核酸配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の割合として定義される。配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内であるさまざまな方法で達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターは、既知の方法によって決定することができる。
本明細書の目的のために、所与の核酸配列Ｄに対する所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃ（あるいは、所与の核酸配列Ｄに対して特定の配列同一性％を有するかまたは含む所与の配列Ｃとして表現することもできる）の配列同一性％は、次のように計算される：
１００×分数Ｗ／Ｚ、
ここで、Ｗは、配列アラインメントプログラムがそのプログラムのＣとＤのアラインメントで同一の一致とスコア付けしたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄのヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣとＤの配列同一性の割合は、ＤとＣの配列同一性の割合と等しくないことが理解されよう。
本明細書において使用する場合、「特異的に結合する」という用語は、抗体がその同族抗原（例えば、ＤＮＡ）に結合するが、他の抗原には有意に結合しないことを指す。そのような条件下での抗体の標的への特異的結合は、抗体を標的に対するその特異性で選択することを必要とする。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、多様なイムノアッセイ形式が用いられてよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用されている。特異的な免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。好ましくは、抗体は、その第２の分子との親和性定数（Ｋａ）が約１０５ｍｏｌ－１より大きい（例えば、１０６ｍｏｌ－１、１０７ｍｏｌ－１、１０８ｍｏｌ－１、１０９ｍｏｌ－１、１０１０ｍｏｌ－１、１０１１ｍｏｌ－１、および１０１２ｍｏｌ－１またはそれより多くの）抗原に「特異的に結合する」。
本明細書において使用する場合、「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、集団内の個々の抗体が、少量の抗体分子で存在している場合がある、起こり得る自然発生の突然変異を除いて同一である抗体の集団から得られる抗体を指す。
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、投与の標的である任意の個人を意味する。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒトであり得る。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。
本明細書において使用する場合、「有効量」という用語は、使用される組成物の量が、疾患または障害の１またはそれより多くの原因または症状を寛解させるのに十分な量であることを意味する。このような寛解には、削減または変更のみが必要であり、必ずしも除去は必要ではない。正確な投与量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康等）、処置する疾患または障害、ならびに投与経路および投与する薬剤の薬物動態などの多様な要因に応じて変動する。
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容され得る」という用語は、生物学的にまたはその他の点で望ましくない材料ではない材料を指す。すなわち、その材料は、対象に望ましくない生物学的効果を引き起こすこともなく、その材料が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な方法で相互作用することもなく対象に投与され得る。
本明細書において使用する場合、「キャリア」または「賦形剤」という用語は、１またはそれより多くの有効成分が組み合わされている製剤中の有機または無機の構成成分であり、天然または合成の不活性成分を指す。キャリアまたは賦形剤は、当業者によく知られているように、有効成分の分解を最小限に抑え、対象における有害な副作用を最小限に抑えるように自然に選択されるであろう。
本明細書において使用する場合、「処置する」という用語は、疾患、病態、または障害を治癒、寛解、安定化、または予防することを目的とした患者の医学的管理を指す。この用語には、積極的な処置、すなわち、疾患、病態、または障害の改善に特に向けられる処置が含まれ、原因処置、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の原因の除去に向けられる処置も含まれる。その上、この用語には、緩和的処置、すなわち、疾患、病態、または障害の治癒よりも症状の軽減のために設計された処置；予防的処置、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的もしくは完全に抑制することに向けられる処置；および、支持的処置、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の改善に向けられる別の特定の治療を補充するために用いられる処置が含まれる。
本明細書において使用する場合、「標的化部分」は、粒子または分子を選択された細胞または組織型上の受容体部位に方向づけることができ、付着分子として機能することができ、または別の分子を結合または付着させるように機能する物質である。本明細書において使用する場合、「方向づける」とは、分子を選択された細胞または組織型に優先的に付着させることを指す。これは、以下で説明するように、細胞材料、分子、または薬物を方向づけるために使用することができる。
本明細書において使用する場合、「抑制する」または「減少させる」という用語は、活性、応答、症状、疾患、またはその他の生物学的パラメーターを減少させることを意味する。これには、限定されるものではないが、活性、応答、症状、または疾患の完全切除が含まれ得る。また、これには、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、症状、または疾患の１０％の減少も含まれる場合がある。したがって、この減少は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の減少であり得る。
本明細書において使用する場合、「融合タンパク質」は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されたペプチド結合を介して２またはそれより多くのポリペプチドを連結することによって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学的カップリングによって形成してもよいし、単一の隣接する融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現させてもよい。一本鎖融合タンパク質は、単一の隣接するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、分子生物学の従来の技術を使用して、２つの遺伝子をフレーム内で単一の核酸配列に結合させ、次に融合タンパク質が生成される条件下で適切な宿主細胞でその核酸を発現させることにより調製することができる。
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内にある各個別の値を個別に言及する簡単な方法として機能することを単に意図するものであり、各個別の値は、それが本明細書で個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。
「約」という用語の使用は、およそ＋／－１０％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を記述することを意図する；他の実施形態では、値は、およそ＋／－５％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を変動することがある；他の実施形態では、値は、およそ＋／－２％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を変動することがある；他の実施形態では、値は、およそ＋／－１％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を変動することがある。上記の範囲は、文脈によって明確にされることが意図され、それ以上の制限は暗示されていない。
本明細書に記載されるすべての方法は、別段の指示がない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で記載されるありとあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば、「など」）の使用は、単に本実施形態をよりよく解明することを意図しており、別段の請求がない限り、本実施形態の範囲に制限を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すと解釈されるべきではない。
ＩＩ．組成物
３Ｅ１０抗体は、細胞膜を越えて細胞質および核に核酸を送達するのに役立つことが発見された。したがって、３Ｅ１０を使用して核酸構築物の送達を増強するための組成物および方法が提供される。通常、有効量の３Ｅ１０抗体を、細胞への送達が望まれる核酸と接触させる。通常、３Ｅ１０と核酸カーゴが複合体を形成するのに十分な時間、接触させる。複合体は、核酸カーゴが細胞に送達されるのに十分な時間、細胞と接触させる。カーゴは、細胞が抗体の不在下で核酸カーゴと接触した場合よりも、大量に、高品質に（例えば、無傷、機能的等）、または高速で、またはそれらの組合せで蓄積される可能性がある。抗体が送達手段として機能するため、送達システムは通常は非ウイルス性である。
Ａ．３Ｅ１０抗体
本明細書では一般に「３Ｅ１０」または「３Ｅ１０抗体」と呼ばれているが、本明細において開示される、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｔｒ－ｓｃＦｖ、およびその他の単鎖可変フラグメントなどの抗原結合フラグメント、バリアント、および融合タンパク質を含むフラグメントおよび結合タンパク質、ならびに他の細胞膜透過性核酸輸送分子がこの表現に包含されることも、本明細書に開示される組成物および方法での使用のために明示的に提供されることが理解されよう。したがって、抗体および他の結合タンパク質は、本明細書において細胞膜透過性とも呼ばれる。
好ましい実施形態では、３Ｅ１０抗体は、キャリアまたはコンジュゲートの助けを借りずに細胞の細胞質および／または核に輸送される。例えば、細胞毒性効果を持たずにインビボで哺乳類細胞の核に輸送されるモノクローナル抗体３Ｅ１０およびその活性フラグメントが、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｗｅｉｓｂａｒｔへの米国特許第４，８１２，３９７号および同第７，１８９，３９６号に開示されている。
一部の実施形態では、この抗体は、Ｒａｄ５１に結合し、かつ／または抑制する可能性がある。例えば、Ｔｕｒｃｈｉｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４５（２０）：１１７８２－１１７９９（２０１７）、ＷＯ２０２０／０４７３４４号、およびＷＯ２０２０／０４７３５３号に記載の抗体を参照されたい。これらの各々は参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれている。
組成物および方法で使用することができる抗体には、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、無傷の抗体）、そのフラグメント、および、少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含む合成タンパク質が含まれる。可変ドメインは、抗体ごとに配列が異なり、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に使用される。しかし、可変性は、通常、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは通常、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、これらのＦＲ領域は主にβシート構造を採用し、３つのＣＤＲによって繋がっている。これらのＣＤＲは、βシート構造を繋ぐループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって非常に近接して保持され、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。そのため、抗体は通常、ＤＮＡ結合を維持するため、および／またはＤＮＡ修復を妨害するために必要なＣＤＲを少なくとも含む。
３Ｅ１０抗体は通常、３Ｅ１０と同じまたは異なる１つまたは複数のエピトープに結合するモノクローナル３Ｅ１０、またはそのバリアント、誘導体、フラグメント、融合体、もしくはヒト化形態である。
モノクローナル抗体３Ｅ１０を産生するハイブリドーマ細胞株のブダペスト条約の条件に従う寄託は、２０００年９月６日に受領され、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０－２２０９，ＵＳＡによって受け入れられ、特許寄託番号ＰＴＡ－２４３９が付与された。
したがって、この抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を有する可能性がある。この抗体はモノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有することができる。抗体は、３Ｅ１０の単鎖可変フラグメント、またはそのバリアント、例えば、保存的バリアントであり得る。例えば、この抗体は、３Ｅ１０の単鎖可変フラグメント（３Ｅ１０ Ｆｖ）、またはそのバリアントであり得る。
１．３Ｅ１０配列
モノクローナル抗体３Ｅ１０のアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。例えば、３Ｅ１０重鎖および軽鎖の配列が以下に提供される。ここで、一重の下線は、Ｋａｂａｔシステムに従って特定されたＣＤＲ領域を示し、配列番号１２～１４のイタリック体は可変領域を示し、二重の下線はシグナルペプチドを示す。ＩＭＧＴシステムに従うＣＤＲも提供されている。
ａ．３Ｅ１０重鎖
一部の実施形態では、３Ｅ１０の重鎖可変領域は：
Figure 2022546699000001
 （配列番号１；Ｚａｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７２：５１３～５２０（１９９４）；ＧＥＮＢＡＮＫ：Ｌ１６９８１．１－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｌ－ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ；およびＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６５６７９．１－ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ｐａｒｔｉａｌ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］）である。
一部の実施形態では、３Ｅ１０重鎖は、次のように表される
Figure 2022546699000002
Figure 2022546699000003
野生型配列に変異を組み込む３Ｅ１０抗体のバリアントも、例えば、Ｚａｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７（５）：２０８２－８（１９９６）に開示されるように、当技術分野で公知である。例えば、３Ｅ１０の重鎖可変領域のアミノ酸位置３１は、抗体およびそのフラグメントが核を透過してＤＮＡに結合する能力に影響力があることが決定されている（配列番号１、２および１３の太字）。ＣＤＲ１のＤ３１Ｎ変異（配列番号２および１３の太字）は、元の抗体よりもはるかに高い効率で核を透過しＤＮＡに結合する（Ｚａｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７２：５１３－５２０（１９９４），Ｗｅｉｓｂａｒｔら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．，１１，５３９－５４６（１９９８）；Ｗｅｉｓｂａｒｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２５，１８６７－１８７３（２００４））。一部の実施形態では、抗体は、Ｄ３１Ｎ置換を有する。
一部の実施形態では、３Ｅ１０の重鎖可変領域の好ましいバリアントのアミノ酸配列は、
Figure 2022546699000004
 である。
一部の実施形態では、３Ｅ１０重鎖は、次のように表される
Figure 2022546699000005
一部の実施形態では、配列番号１または２のＣ末端のセリンは、３Ｅ１０重鎖可変領域には存在しないか、または例えばアラニンで置換されている。
Ｋａｂａｔにより特定される相補性決定領域（ＣＤＲ）は、上記に下線を引いて示されており、それにはＣＤＲ Ｈ１．１（元の配列）：ＤＹＧＭＨ（配列番号１５）；ＣＤＲ Ｈ１．２（Ｄ３１Ｎ変異を含む）：ＮＹＧＭＨ（配列番号１６）；ＣＤＲ Ｈ２．１：YISSGSSTIYYADTVKG（配列番号１７）；ＣＤＲ Ｈ３．１：RGLLLDY（配列番号１８）が含まれる。
ＫａｂａｔのＣＤＲ Ｈ２．１のバリアントには、YISSGSSTIYYADSVKG（配列番号１９）およびYISSSSSTIYYADSVKG（配列番号４２）が含まれる。
追加的または代替的に、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をＩＭＧＴシステムに従って定義することができる。ＩＭＧＴシステムにより特定される相補性決定領域（ＣＤＲ）には、ＣＤＲ Ｈ１．３（元の配列）：GFTFSDYG（配列番号２０）；ＣＤＲ Ｈ１．４（Ｄ３１Ｎ変異を含む）：GFTFSNYG（配列番号２１）；ＣＤＲ Ｈ２．２：ISSGSSTI（配列番号２２）およびバリアントISSSSSTI（配列番号４３）；ＣＤＲ Ｈ３．２：ARRGLLLDY（配列番号２３）が含まれる。
ｂ．３Ｅ１０軽鎖
一部の実施形態では、３Ｅ１０の軽鎖可変領域は、
Figure 2022546699000006
 である。
３Ｅ１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
Figure 2022546699000007
 でもあり得る。
一部の実施形態では、３Ｅ１０軽鎖は、次のように表される。
Figure 2022546699000008
Figure 2022546699000009
その他の３Ｅ１０軽鎖配列は当技術分野で公知である。例えば、Ｚａｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５；１５４（４）：１９８７－９４（１９９５）；ＧＥＮＢＡＮＫ：Ｌ１６９８１．１－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｌ－ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６５６８１．１－ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ｐａｒｔｉａｌ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］）を参照されたい。
Ｋａｂａｔにより特定される相補性決定領域（ＣＤＲ）は、下線を引いて示されており、それには、ＣＤＲ Ｌ１．１：RASKSVSTSSYSYMH（配列番号２４）；ＣＤＲ Ｌ２．１：YASYLES（配列番号２５）；ＣＤＲ Ｌ３．１：QHSREFPWT（配列番号２６）が含まれる。
ＫａｂａｔのＣＤＲ Ｌ１．１のバリアントには、RASKSVSTSSYSYLA（配列番号２７）およびRASKTVSTSSYSYMH（配列番号４４）が含まれる。
ＫａｂａｔのＣＤＲ Ｌ２．１のバリアントは、YASYLQS（配列番号２８）である。
追加的または代替的に、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をＩＭＧＴシステムに従って定義することができる。ＩＭＧＴシステムによって特定される相補性決定領域（ＣＤＲ）には、ＣＤＲ Ｌ１．２KSVSTSSYSY（配列番号２９）およびバリアントKTVSTSSYSY（配列番号４５）；ＣＤＲ Ｌ２．２：ＹＡＳ（配列番号３０）；ＣＤＲ Ｌ３．２：QHSREFPWT（配列番号２６）が含まれる。
一部の実施形態では、配列番号７または８の配列のＣ末端は、３Ｅ１０軽鎖可変領域のアルギニンをさらに含む。
２．ヒト化３Ｅ１０
一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１またはそれより多くのアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、通常は「インポート」可変ドメインから取得される。抗体ヒト化技術は、一般に、抗体分子の１またはそれより多くのポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の使用を伴う。
例示的な３Ｅ１０ヒト化配列は、ＷＯ２０１５／１０６２９０号、ＷＯ２０１６／０３３３２４号、ＷＯ２０１９／０１８４２６号、およびＷＯ／２０１９／０１８４２８号において考察され、以下に提供される。
ａ．ヒト化３Ｅ１０重鎖可変領域
一部の実施形態では、ヒト化３Ｅ１０重鎖可変ドメインには、以下が含まれる。
Figure 2022546699000010
Figure 2022546699000011
 ｂ．ヒト化３Ｅ１０軽鎖可変領域
一部の実施形態では、ヒト化３Ｅ１０軽鎖可変ドメインには、以下が含まれる
Figure 2022546699000012
Figure 2022546699000013
 ｃ．細胞透過および核局在化
開示される組成物および方法は、通常、細胞、および必要に応じて核に浸透する能力を維持する抗体を利用する。
自己抗体による細胞内在化の機構は多様である。静電相互作用またはＦｃＲを介したエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれるものもあれば、細胞表面のミオシンまたはカルレティキュリンとの結合に基づく機構を利用し、その後エンドサイトーシスを行うものもある（Ｙｉｎｇ－Ｃｈｙｉら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８，３１７８－３１９０（２００８），Ｙａｎａｓｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００，２５－３１（１９９７））。３Ｅ１０はＦｃ非依存性の機構で細胞を透過するが（Ｆｃを欠く３Ｅ１０フラグメントが細胞を透過する能力によって証明される）、ヌクレオシド輸送体ＥＮＴ２の存在を伴う（Ｗｅｉｓｂａｒｔら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２０２２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１２０２２．（２０１５）、Ｚａｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７、２０８２－２０８８（１９９６）、Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２、２０７９０－２０７９３（２００７））。したがって、一部の実施形態では、開示される組成物および方法で利用される抗体は、Ｆｃ非依存性の機構で細胞を透過するが、ヌクレオシド輸送体ＥＮＴ２の存在を伴う抗体である。
ＤＮＡに結合する能力を妨げる３Ｅ１０の変異は、抗体を核に透過できなくする可能性がある。したがって、通常は、開示される抗体のバリアントおよびヒト化形態は、核酸、特にＤＮＡに結合する能力を維持している。その上、３Ｅ１０ ｓｃＦｖは、ＥＮＴ２依存的に生細胞および核に透過可能であり、ＥＮＴ２欠損細胞では取り込み効率が損なわれることが以前に示されている（Ｈａｎｓｅｎ、ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２、２０７９０－２０７９３（２００７））。したがって、一部の実施形態では、開示される抗体のバリアントおよびヒト化形態は、ＥＮＴ依存的、好ましくはＥＮＴ２依存的に細胞核に浸透する能力を維持する。
国際公開第２０１９／１５２８０６号および国際公開第２０１９／１５２８０８号で考察されるように、一部のヒト化３Ｅ１０バリアントは、元のマウス３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）ｄｉ－ｓｃＦｖよりも効率的に細胞核を透過することが見出されたが、他のバリアントは、核を透過する能力が失われたことが見出された。特に、バリアント１０と１３は、マウス抗体と比較して核を非常によく透過した。
ヒト化３Ｅ１０ ＶＬにおける潜在的な二分核定位シグナル（ＮＬＳ）が特定されており、以下の配列の一部または全部が含まれている可能性がある：
Figure 2022546699000014
例示的なコンセンサスＮＬＳは、
Figure 2022546699000015
 （ここで（Ｘ）は、任意の残基であるが、優先的には塩基性残基（ＲまたはＫ）である）（配列番号９１）または配列番号５３に対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有するそのバリアントであるか、またはそれを含むことができる。
したがって、一部の実施形態では、特に核輸入が重要である場合、開示される抗体には、細胞の核内に移行することができる配列番号８８～９１のいずれか１つの配列、またはそのフラグメントおよびバリアント（例えば、配列番号８８～９１のいずれか１つと７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性）が含まれてよい。
ＮＬＳの存在は、３Ｅ１０が核輸入経路を介して核膜を通過する可能性があることを示している。一部の実施形態では、ＮＬＳは、輸入経路の１またはそれより多くのメンバーと相互作用することにより、輸入を改善する。したがって、一部の実施形態では、ＮＬＳは、インポーチン－β、インポーチン－β／インポーチン－αヘテロダイマー、またはそれらの組合せに結合することができる。
３．核酸結合
開示される組成物および方法は、通常、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せなどの核酸に結合する能力を維持する抗体を利用する。
以下の例は、３Ｅ１０および追加の３Ｅ１０バリアントの分子モデリングを示している。３Ｅ１０（Ｐｙｍｏｌ）の分子モデリングにより、推定核酸結合ポケット（ＮＡＢ１）が明らかになり（例えば、図１４Ａおよび１４Ｂ参照）、以下の配列に下線を引いて示した。
ＷＴ重鎖ｓｃＦｖ配列
Figure 2022546699000016
 軽鎖ｓｃＦｖ配列
Figure 2022546699000017
一部の実施形態では、開示される抗体には、下線が引かれたＮＡＢ１配列の一部または全部が含まれる。一部の実施形態では、抗体には、核酸に結合する能力が変更されたバリアント配列が含まれる。一部の実施形態では、ＮＡＢ１における変異（例えば、置換、挿入、および／または欠失）は、抗体とＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせなどの核酸との結合を改善する。一部の実施形態では、変異は保存的置換である。一部の実施形態では、変異はＮＡＢ１ポケットのカチオン電荷を増加させる。
本明細書で考察され例証されたように、ＣＤＲ１の残基３１のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させると、この残基のカチオン電荷が増大し、インビボでの核酸結合および送達が増強された（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎ）。
追加の例示的なバリアントには、ＣＤＲ１の残基３１のアスパラギン酸のアルギニンへの変異（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｒ）（モデリングはカチオン電荷の拡大を示す）、またはリジンの変異（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｋ）（モデリングは電荷の向きの変化を示す）が含まれる。したがって、一部の実施形態では、３Ｅ１０結合タンパク質には、Ｄ３１ＲまたはＤ３１Ｋの置換が含まれる。
３Ｅ１０のＤ３１またはＮ３１に対応する残基を有する本明細書に開示されるすべての配列は、そのＤ３１ＲまたはＤ３１ＫまたはＮ３１ＲまたはＮ３１Ｋ置換とともに明示的に開示されている。
３Ｅ１０（Ｐｙｍｏｌ）の分子モデリングにより、推定核酸結合ポケット（ＮＡＢ１）が明らかになった（図１４Ａ～１４Ｂ）。ＣＤＲ１の残基３１のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異により、この残基のカチオン電荷が増大し、インビボでの核酸結合および送達が増強された（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎ）。
ＣＤＲ１の残基３１のアスパラギン酸をアルギニン（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｒ）に変異させると、カチオン電荷がさらに増大し、リジン（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｋ）に変異させると電荷の方向が変化した（図１４Ａ）。
分子モデリングから予測されたＮＡＢ１アミノ酸は、上記の重鎖および軽鎖配列に下線が引かれている。図１４Ｂは、ＮＡＢ１アミノ酸残基を点状のドットで示した３Ｅ１０－ｓｃＦｖ（Ｐｙｍｏｌ）の分子モデリングを示す説明図である。
４．フラグメント、バリアント、および融合タンパク質
抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０またはそのヒト化形態の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１１または４６～５８のいずれか、または配列番号１２～１４のいずれかの重鎖および／または軽鎖）を含む抗体フラグメントまたは融合タンパク質で構成され得る。
抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０、またはそのバリアントもしくはヒト化形態の１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である１またはそれより多くのＣＤＲ（例えば、配列番号１～１１または４６～５８、または配列番号１２～１４、または配列番号１５～３０または４２～４５のいずれかの１つまたは複数のＣＤＲ）を含む抗体フラグメントまたは融合タンパク質で構成され得る。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質比較によって決定することができる。一部の実施形態では、抗体には、上記の好ましい可変ドメインのＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つすべてが含まれる。
好ましくは、抗体には、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の各々の１つと、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の各々の１つの組合せが含まれる。
３Ｅ１０の軽鎖可変配列の予測される相補性決定領域（ＣＤＲ）は上記に提供されている。ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＡＡ６５６８１．１－ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ｐａｒｔｉａｌ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］およびＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ３４０５１．１－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｋａｐｐａ－ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ Ｖ－ｒｅｇｉｏｎも参照されたい。３Ｅ１０の重鎖可変配列の予測される相補性決定領域（ＣＤＲ）は上記に提供されている。例えば、Ｚａｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７２：５１３－５２０（１９９４），ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＡ６５６７９．１．Ｚａｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（４），１９８７－１９９４（１９９５）およびＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１６９８２．１－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｒｅａｇｒｒａｎｇｅｄ Ｈ－ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓも参照されたい。
したがって、一部の実施形態では、細胞膜透過性抗体は、配列番号１もしくは２のＣＤＲ、または重鎖および軽鎖可変領域全体、または配列番号１２もしくは１３の重鎖領域；またはそのヒト化形態と、配列番号７もしくは８、または配列番号１４の軽鎖領域；またはそのヒト化形態の組合せを含む。一部の実施形態では、細胞膜透過性抗体は、配列番号３、４、５、もしくは６のＣＤＲ、または重鎖および軽鎖可変領域全体と、配列番号９、１０、もしくは１１の組合せを含む。一部の実施形態では、細胞膜透過性抗体は、配列番号４６～４８または５０～５２のいずれか１つのＣＤＲ、または重鎖および軽鎖可変領域全体と、配列番号５３～５８のいずれか１つの組合せを含む。
３Ｅ１０のＤ３１またはＮ３１に対応する残基を有する本明細書に開示されるすべての配列は、そのＤ３１ＲまたはＤ３１ＫまたはＮ３１ＲまたはＮ３１Ｋ置換とともに明示的に開示されている。したがって、一部の実施形態では、３Ｅ１０結合タンパク質は、３Ｅ１０重鎖の残基３１に対応するアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）で置換されている、前述のまたは以下の配列のいずれかのバリアントである。
生物活性を有する抗体のフラグメントも含まれる。フラグメントは、他の配列に結合しているか否かにかかわらず、フラグメントの活性が、非修飾抗体または抗体フラグメントと比較してあまり変更されていないかまたは損なわれていないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含む。
本開示の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生にも技術を適合させることができる。単鎖抗体の産生のための方法は、当業者に周知である。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して重鎖と軽鎖の可変ドメインを融合し、それにより単一分子上の抗原結合部位を再構成することによって作成することができる。一方の可変ドメインのＣ末端が１５～２５アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して他方の可変ドメインのＮ末端に繋がれている単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、抗原結合または結合特異性を大きく破壊することなく開発されている。リンカーは、重鎖と軽鎖が適切な立体構造の配向で結合できるように選択される。
抗ＤＮＡ抗体は、治療の可能性を高めるために修飾することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞膜透過性抗ＤＮＡ抗体を、標的細胞の細胞質および／または核内の第２の治療標的に特異的な別の抗体にコンジュゲートさせる。例えば、細胞膜透過性抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０ Ｆｖおよび第２の治療標的に特異的に結合するモノクローナル抗体の単鎖可変フラグメントを含む融合タンパク質であり得る。他の実施形態では、細胞膜透過性抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０の第１の重鎖および第１の軽鎖と、第２の治療標的に特異的に結合するモノクローナル抗体の第２の重鎖および第２の軽鎖とを有する二重特異性抗体である。
３Ｅ１０の第１の重鎖および第１の軽鎖と、第２の標的に特異的に結合するモノクローナル抗体の第２の重鎖および第２の軽鎖とを有する二重特異性抗体およびその他の結合タンパク質は、Ｗｅｉｓｂａｒｔら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１１（１０）：２１６９－７３（２０１２）、およびＷｅｉｓｂａｒｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２５：１１１３－８（２００４）、および米国特許出願第２０１３／０２６６５７０号において考察されており、これらは参照によりその全体が具体的に組み込まれている。一部の実施形態では、第２の標的は、標的細胞型、組織、臓器等に特異的である。したがって、第２の重鎖および第２の軽鎖は、複合体を標的細胞型、組織、臓器に標的化する標的化部分として役立ち得る。一部の実施形態では、第２の重鎖および第２の軽鎖は、造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、または任意の他の好ましい細胞型を、例えば、好ましい細胞型で発現する受容体またはリガンドを標的化することによって標的化する。一部の実施形態では、第２の重鎖および第２の軽鎖は、胸腺、脾臓、または癌細胞を標的化する。
一部の実施形態、特にＴ細胞をインビボで標的化するための実施形態、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで産生するための実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ７、またはＣＤ８などの免疫細胞またはＴ細胞マーカーを標的化することができる。例えば、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ３ ＦａｂフラグメントはどちらもインビボでＴ細胞を標的化するために使用されてきた（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，１０（１１）（２０１８）．ｐｉｉ：ｅ９１５８．ｄｏｉ：１０．１５２５２／ｅｍｍｍ．２０１８０９１５８．、Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２（８）：８１３－８２０（２０１７）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１７．５７）。したがって、一部の実施形態では、３Ｅ１０抗体または抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、その一部がＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、または別の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）マーカー、あるいは胸腺、脾臓、または肝臓などの特定の組織のマーカーに特異的に結合し得る二重特異性抗体である。
二価の単鎖可変フラグメント（ｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって操作することができる。これは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域を持つ単一のペプチド鎖を生成してタンデムｓｃＦｖを生成することによって実行することができる。また、ｓｃＦｖは、２つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎ、ｓｃＦｖをダイマー化させるリンカーペプチド（約５アミノ酸）を用いて設計することもできる。この型はダイアボディとして公知である。ダイアボディは、解離定数が対応するｓｃＦｖよりも最大４０倍低いことが示されており、これは標的に対する親和性が非常に高いことを意味している。さらに短いリンカー（１個または２個のアミノ酸）は、三量体（トライアボディまたはトリボディ）の形成を引き起こす。テトラボディも作製されている。これらは、その標的に対してダイアボディよりもさらに高い親和性を示す。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０の２またはそれより多くの連結された単鎖可変フラグメント（例えば、３Ｅ１０ ｄｉ－ｓｃＦｖ、３Ｅ１０ ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、またはその保存的バリアントを含むことがある。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、ダイアボディまたはトリアボディ（例えば、３Ｅ１０ダイアボディ、３Ｅ１０トリアボディ）である。３Ｅ１０の単一のおよび２またはそれより多くの連結された単鎖可変フラグメントの配列は、ＷＯ２０１７／２１８８２５号およびＷＯ２０１６／０３３３２１号に記載されている。
抗体の機能は、抗体またはそのフラグメントを治療薬と結合させることにより強化することができる。抗体またはフラグメントと治療薬とのそのような結合は、抗体または抗体フラグメントと治療薬とを含む、免疫複合体を作製することによって、または融合タンパク質を作製することによって、あるいは抗体またはフラグメントを、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）に連結することによって、達成することができる。
組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子工学によって作製されたタンパク質である。これには通常、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、ライゲーションまたはオーバーラップ伸長ＰＣＲによって第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をインフレームで付加することが含まれる。その後、ＤＮＡ配列は単一のタンパク質として細胞に発現する。このタンパク質は、両方の元のタンパク質の全配列を含むように操作することも、どちらかの一部だけを含むように操作することもできる。２つの実体がタンパク質の場合、リンカー（または「スペーサー」）ペプチドも加えられることが多く、それによりタンパク質が独立して折り畳まれて期待通りに挙動する可能性が高くなる。
一部の実施形態では、細胞膜透過性抗体は、その半減期を変更するように修飾される。一部の実施形態では、抗体の半減期を増加させて、抗体が循環中または処置部位に長期間存在するようにすることが望ましい。例えば、循環中または長期間処置される部位で抗体の力価を維持することが望ましいことがある。他の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体の半減期は、潜在的な副作用を減少させるために短縮される。３Ｅ１０Ｆｖなどの抗体フラグメントは、全長抗体よりも半減期が短い場合がある。半減期を変更するその他の方法が公知であり、記載の方法で使用することができる。例えば、抗体は、例えば、Ｘｔｅｎｄ（商標）抗体半減期延長技術（Ｘｅｎｃｏｒ、カリフォルニア州モンロビア）を使用して、半減期を延長するＦｃバリアントを用いて操作することができる。
ａ．リンカー
本明細書において「リンカー」という用語には、限定されるものではないが、ペプチドリンカーが含まれる。ペプチドリンカーは、可変領域によるエピトープの結合を妨げない限り、どのようなサイズであってもよい。一部の実施形態では、リンカーには、１またはそれより多くのグリシンおよび／またはセリンアミノ酸残基が含まれる。一価の単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、１つの可変ドメインのＣ末端が、通常、１５～２５アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して他の可変ドメインのＮ末端に繋がれている。リンカーは、重鎖と軽鎖が適切な立体構造の配向で結合できるように選択される。ダイアボディ、トライアボディ等のリンカーは、通常、上述のように一価のｓｃＦｖのリンカーよりも短いリンカーを含む。二価、三価、およびその他の多価ｓｃＦｖには、通常、３個またはそれより多くのリンカーが含まれる。リンカーは、長さおよび／またはアミノ酸組成が同じであっても異なっていてもよい。そのため、リンカーの数、１または複数のリンカーの組成、および１または複数のリンカーの長さは、当技術分野で公知のように、ｓｃＦｖの所望の原子価に基づいて決定することができる。１または複数のリンカーは、二価、三価、およびその他の多価ｓｃＦｖの形成を可能にするか、またはその形成を促進することができる。
例えば、リンカーは、４～８個のアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態では、リンカーには、アミノ酸配列GQSSRSS（配列番号３１）が含まれる。もう一つの実施形態では、リンカーには、１５～２０個のアミノ酸、例えば、１８個のアミノ酸が含まれる。特定の実施形態では、リンカーには、アミノ酸配列GQSSRSSSGGGSSGGGGS（配列番号３２）が含まれる。その他の可動性リンカーとしては、限定されるものではないが、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３３）、Ａｌａ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３４）、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）２（配列番号３５）および（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）４（配列番号３６）、および（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（配列番号３７）が挙げられる。
他の例示的なリンカーとしては、例えば、
RADAAPGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号５９）およびASTKGPSVFPLAPLESSGS（配列番号６０）が挙げられる。
ｂ．例示的な抗ＤＮＡ ｓｃＦｖ配列
モノ－、ジ－、およびトリ－ｓｃＦｖを含む例示的なマウス３Ｅ１０ ｓｃＦｖ配列は、ＷＯ２０１６／０３３３２１号、ＷＯ２０１７／２１８８２５号、ＷＯ２０１９／０１８４２６号、およびＷＯ２０１９／０１８４２８号に開示され、以下に提供される。開示される組成物および方法で用いるための細胞膜透過性抗体には、例示的なｓｃＦｖ、ならびにそのフラグメントおよびバリアントが含まれる。
ｓｃＦｖ ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 2022546699000018
配列番号３８を参照したＳｃＦｖタンパク質ドメインの注釈
● ＡＧＩＨ配列は溶解度を高める（配列番号３８のアミノ酸１～４）
● Ｖｋ可変領域（配列番号３８のアミノ酸５～１１５）
● 軽鎖ＣＨ１の最初の（６ａａ）（配列番号３８のアミノ酸１１６～１２１）
●（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号３８のアミノ酸１２２～１３６）
● ＶＨ可変領域（配列番号３８のアミノ酸１３７～２５２）
● Ｍｙｃタグ（配列番号３８のアミノ酸２５３～２６８）
● Ｈｉｓ６タグ（配列番号３８のアミノ酸２６９～２７４）
３Ｅ１０ ｄｉ－ｓｃＦｖ（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列
ｄｉ－ｓｃＦｖ ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）は、３Ｅ１０の２倍の重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖の３１位のアスパラギン酸がアスパラギンに変異しているｄｉ－単鎖可変フラグメントである。ｄｉ－ｓｃＦｖ ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 2022546699000019
配列番号３９を参照したｄｉ－ＳｃＦｖタンパク質ドメインの注釈
● ＡＧＩＨ配列は溶解度を高める（配列番号３９のアミノ酸１～４）
● Ｖｋ可変領域（配列番号３９のアミノ酸５～１１５）
● 軽鎖ＣＨ１の最初の（６ａａ）（配列番号３９のアミノ酸１１６～１２１）
●（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号３９のアミノ酸１２２～１３６）
● ＶＨ可変領域（配列番号３９のアミノ酸１３７～２５２）
● ヒトＩｇＧ ＣＨ１の最初の１３アミノ酸からなるＦｖフラグメント間のリンカー（配列番号３９のアミノ酸２５３～２６５）
● Ｓｗｉｖｅｌ配列（配列番号３９のアミノ酸２６６～２７１）
● Ｖｋ可変領域（配列番号３９のアミノ酸２７２～３８２）
● 軽鎖ＣＨ１の最初の（６ａａ）（配列番号３９のアミノ酸３８３～３８８）
●（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号３９のアミノ酸３８９～４０３）
● ＶＨ可変領域（配列番号３９のアミノ酸４０４～５１９）
● Ｍｙｃタグ（配列番号３９のアミノ酸５２０～５３５）
● Ｈｉｓ６タグ（配列番号３９のアミノ酸５３６～５４１）
ｔｒｉ－ｓｃＦｖのアミノ酸配列
Ｔｒｉ－ｓｃＦｖ ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）は、３１０Ｅの３倍の重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖の３１位のアスパラギン酸がアスパラギンに変異しているｔｒｉ－単鎖可変フラグメントである。ｔｒｉ－ｓｃＦｖ ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 2022546699000020
Figure 2022546699000021
配列番号４０を参照したｔｒｉ－ＳｃＦｖタンパク質ドメインの注釈
● ＡＧＩＨ配列は溶解度を高める（配列番号４０のアミノ酸１～４）
● Ｖｋ可変領域（配列番号４０のアミノ酸５～１１５）
● 軽鎖ＣＨ１の最初の（６ａａ）（配列番号４０のアミノ酸１１６～１２１）
●（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号４０のアミノ酸１２２～１３６）
● ＶＨ可変領域（配列番号４０のアミノ酸１３７～２５２）
● ヒトＩｇＧ ＣＨ１の最初の１３アミノ酸からなるＦｖフラグメント間のリンカー（配列番号４０のアミノ酸２５３～２６５）
● Ｓｗｉｖｅｌ配列（配列番号４０のアミノ酸２６６～２７１）
● Ｖｋ可変領域（配列番号４０のアミノ酸２７２～３８２）
● 軽鎖ＣＨ１の最初の（６ａａ）（配列番号４０のアミノ酸３８３～３８８）
●（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号４０のアミノ酸３８９～４０３）
● ＶＨ可変領域（配列番号４０のアミノ酸４０４～５１９）
● ヒトＩｇＧ ＣＨ１の最初の１３アミノ酸からなるＦｖフラグメント間のリンカー（配列番号４０のアミノ酸５２０～５３２）
● Ｓｗｉｖｅｌ配列（配列番号４０のアミノ酸５３３～５３８）
● Ｖｋ可変領域（配列番号４０のアミノ酸５３９～６４９）
● 軽鎖ＣＨ１の最初の（６ａａ）（配列番号４０のアミノ酸６５０～６５５）
●（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号４０のアミノ酸６５６～６７０）
● ＶＨ可変領域（配列番号４０のアミノ酸６７１～７８６）
● Ｍｙｃタグ（配列番号４０のアミノ酸７８７～８０２）
● Ｈｉｓ６タグ（配列番号４０のアミノ酸８０３～８０８）
ＷＯ２０１６／０３３３２１号およびＮｏｂｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５（１１）：２２８５－２２９１（２０１５）は、ｄｉ－ｓｃＦｖおよびｔｒｉ－ｓｃＦｖがそれらの一価の対応物と比較していくつかの改善および追加の活性を有することを示している。例示的な融合タンパク質の各々の異なるドメインに対応する部分配列も上に提供される。当業者は、例示的な融合タンパク質またはそのドメインを利用して、上記でより詳細に論じられた融合タンパク質を構築することができることを理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ｄｉ－ｓｃＦｖには、ＶＨ可変ドメイン（例えば、配列番号３９のアミノ酸４０４～５１９、またはその機能的バリアントもしくはフラグメント）に連結されたＶｋ可変領域（例えば、配列番号３９のアミノ酸２７２～３８２、またはその機能的バリアントもしくはフラグメント）を含む第２のｓｃＦｖに連結された、ＶＨ可変ドメイン（例えば、配列番号３９のアミノ酸１３７～２５２、またはその機能的バリアントもしくはフラグメント）に連結されたＶｋ可変領域（例えば、配列番号３９のアミノ酸５～１１５、またはその機能的バリアントもしくはフラグメント）を含む第１のｓｃＦｖが含まれる。一部の実施形態では、ｔｒｉ－ｓｃＦｖには、ＶＨ可変ドメイン（例えば、配列番号４０のアミノ酸６７１～７８６、またはその機能的バリアントもしくはフラグメント）に連結されたＶｋ可変領域（例えば、配列番号４０のアミノ酸５３９～６４９、またはその機能的バリアントもしくはフラグメント）を含む第３のｓｃＦｖドメインに連結されたｄｉ－ｓｃＦｖが含まれる。
Ｖｋ可変領域は、例えば、リンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）を、単独でまたは軽鎖ＣＨ１の（６ａａ）（配列番号３９のアミノ酸１１６～１２１）と組み合わせて用いることによってＶＨ可変ドメインに連結することができる。他の適したリンカーは上記で考察されており、当技術分野で公知である。ｓｃＦｖは、リンカー（例えば、配列番号３９のヒトＩｇＧ ＣＨ１の最初の１３アミノ酸（２５３～２６５））を、単独でまたはｓｗｉｖｅｌ配列（例えば、配列番号３９のアミノ酸２６６～２７１）と組み合わせて用いることによって連結することができる。他の適したリンカーは上記で考察されており、当技術分野で公知である。
そのため、ｄｉ－ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸５～５１９を含むことができる。ｔｒｉ－ｓｃＦｖは、配列番号４０のアミノ酸５～７８６を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質には追加のドメインが含まれる。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質には、溶解度を増強する配列（例えば、配列番号３９のアミノ酸１～４）が含まれる。そのため、一部の実施形態では、ｄｉ－ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸１～５１９を含むことができる。ｔｒｉ－ｓｃＦｖは、配列番号４０のアミノ酸１～７８６を含むことができる。一部の実施形態では、その融合タンパク質には、融合タンパク質の精製、単離、捕獲、特定、分離等を増強する１またはそれより多くのドメインが含まれる。例示的なドメインには、例えば、Ｍｙｃタグ（例えば、配列番号３９のアミノ酸５２０～５３５）および／またはＨｉｓタグ（例えば、配列番号３９のアミノ酸５３６～５４１）が含まれる。そのため、一部の実施形態では、ｄｉ－ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むことができる。ｔｒｉ－ｓｃＦｖは、配列番号４０のアミノ酸配列を含むことができる。他の置換可能なドメインおよび追加のドメインは上記でより詳細に考察されている。
例示的な３Ｅ１０ヒト化Ｆｖ配列は、ＷＯ２０１６／０３３３２４号で考察されている：
Figure 2022546699000022
例示的な３Ｅ１０ヒト化ｄｉ－ｓｃＦｖ配列は、ＷＯ２０１９／０１８４２６号およびＷＯ２０１９／０１８４２８号において考察され、以下を含む：
Figure 2022546699000023
Figure 2022546699000024
Figure 2022546699000025
Figure 2022546699000026
Figure 2022546699000027
Figure 2022546699000028
 ｃ．追加の配列
抗ＤＮＡ抗原結合タンパク質、抗体、フラグメント、および融合タンパク質の構築に使用してよい追加の配列には、限定されるものではないが、以下が含まれる
Figure 2022546699000029
Figure 2022546699000030
Figure 2022546699000031
 Ｂ．カーゴ
本明細書に提供される方法で使用されるように、３Ｅ１０は、通常、核酸カーゴとの複合体で細胞に接触させる。抗体または結合タンパク質と核酸カーゴの間の相互作用は非共有結合である。
核酸カーゴは一本鎖または二本鎖であり得る。核酸カーゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類似体、またはそれらの組み合わせであり得るか、あるいはそれらを含むことができる。以下でより詳細に考察されるように、核酸類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。そのような修飾は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善することができる。
核酸カーゴは、通常、ひとたび細胞に送達されると生物学的に活性である薬剤であるかまたはそれをコードするという意味で機能的である。例示的なカーゴは、以下でより詳細に考察されているが、例えば、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば発現構築物およびベクターなど）、ｓｉＲＮＡなどの抑制核酸、または抑制核酸をコードする核酸（例えば発現構築物およびベクターなど）が含まれる。
開示される組成物は、複数の単一の核酸カーゴ分子を含むことができる。一部の実施形態では、組成物は、複数の多重度（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）の異なる核酸分子を含む。
一部の実施形態では、カーゴ分子の長さは、０．００１、０．０１、１、１０、１００、１，０００、１０，０００、および／または１００，０００キロベースである。
一部の実施形態では、例えば、カーゴは、０．００１ｋｂ～１００ｋｂの間、または０．００１ｋｂｋｂ～５０ｋｂの間、または０．００１ｋｂｋｂ～２５ｋｂの間、または０．００１ｋｂ～１２．５ｋｂの間、または０．００１ｋｂ～１０ｋｂの間、または０．００１ｋｂ～８ｋｂの間、または０．００１ｋｂ～５ｋｂ、または０．００１ｋｂ～２．５ｋｂの間、または０．００１ｋｂ～１ｋｂの間、または０．０１ｋｂ～１００ｋｂの間、または０．０１ｋｂｋｂ～５０ｋｂの間、または０．０１ｋｂｋｂ～２５ｋｂの間、または０．０１ｋｂ～１２．５ｋｂの間、または０．０１ｋｂ～１０ｋｂの間、または０．０１ｋｂ～８ｋｂの間、または０．０１ｋｂ～５ｋｂ、または０．０１ｋｂ～２．５ｋｂの間、または０．０１ｋｂ～１ｋｂの間、または０．１ｋｂ～１００ｋｂの間、または０．１ｋｂｋｂ～５０ｋｂの間、または０．１ｋｂｋｂ～２５ｋｂの間、または０．１ｋｂ～１２．５ｋｂの間、または０．１ｋｂ～１０ｋｂの間、または０．１ｋｂ～８ｋｂの間、または０．１ｋｂ～５ｋｂ、または０．１ｋｂ～２．５ｋｂの間、または０．１ｋｂ～１ｋｂの間、または１ｋｂ～１００ｋｂの間、または１ｋｂｋｂ～５０ｋｂの間、または１ｋｂｋｂ～２５ｋｂの間、または１ｋｂ～１２．５ｋｂの間、または１ｋｂ～１０ｋｂの間、または１ｋｂ～８ｋｂの間、または１ｋｂ～５ｋｂ、または１ｋｂ～２．５ｋｂの間（それぞれ両端を含む）であってよい。
一部の実施形態では、例えば、カーゴは、０．２ｋｂ～１０ｋｂの間、または０．２ｋｂ～５ｋｂの間、または０．２ｋｂ～２．５ｋｂの間、または０．２ｋｂ～１ｋｂの間、または０．２ｋｂ～０．５ｋｂの間、または０．２ｋｂ～０．２５ｋｂの間、または０．５ｋｂ～１０ｋｂの間、または０．５ｋｂ～５ｋｂの間、または１ｋｂ～５ｋｂの間、または１ｋｂ～３ｋｂの間、または２ｋｂ～１０ｋｂの間、または３ｋｂ～５ｋｂの間であってよい。
特定の用途の場合、核酸カーゴは、例えば、前述の範囲（両端含む）の１つに含まれる１またはそれより多くの別個の長さであってよく、それぞれの具体的な値は明示的に開示されることが理解されよう。例えば、サイズは、単一のヌクレオチドまたは核酸塩基と同じくらい小さくすることができる。例示的な用途では、カーゴは、ｃＧＡＭＰのような環状ジヌクレオチドであり、ＳＴＩＮＧアゴニストである。他の実施形態では、カーゴは短いオリゴマーである。例えば、８ｍｅｒ程度の短いオリゴマーは、アンチセンスまたはスプライススイッチングに使用することができる。それよりも少し長いもの（例えば、１８～２０ｍｅｒ）は、遺伝子編集に使用することができる。
１．カーゴの形態
核酸カーゴは核酸であり、単離された核酸組成物であり得る。本明細書において使用する場合、「単離された核酸」とは、哺乳動物ゲノムに存在する他の核酸分子から分離されている核酸を指し、それには、通常、哺乳動物ゲノムの核酸の片側または両側に隣接する核酸を含む。核酸に関して本明細書において使用される「単離」という用語には、天然に存在しない核酸配列との組合せも含まれる。なぜなら、そのような天然に存在しない配列は自然界には存在せず、天然に存在するゲノムにおいて直接隣接する配列がないためである。
単離された核酸は、例えば、天然に存在するゲノムにおいて、通常、ＤＮＡ分子にすぐ隣接して見出される核酸配列の１つが除去されているかまたは存在しないのであれば、そのＤＮＡ分子であり得る。したがって、単離された核酸には、限定されるものではないが、他の配列とは独立した別個の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸、あるいはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処置によって生成されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡが含まれる。さらに、単離された核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの操作された核酸を含めることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー内の他の数百から数百万の核酸の中に存在する核酸、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライスは、単離された核酸とは見なされない。
ポリペプチドをコードする核酸配列には、ゲノム配列が含まれる。また、エクソンが削除されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列も開示されている。ポリペプチドをコードする他の核酸配列、例えば、上記で特定したアミノ酸配列、およびそのフラグメントおよびバリアントを含むポリペプチドも開示される。ポリペプチドをコードする核酸は、選択した発現宿主での発現のために最適化されていてもよい。コドンは、核酸配列の由来する生物と発現宿主との間のコドン使用頻度の違いを説明するために、同じアミノ酸をコードする代替コドンに置換されていてもよい。このように、核酸は、発現宿主の好むコドンを使用して合成されていてもよい。
核酸は、センスまたはアンチセンス配向であり得るか、または、例えば、ポリペプチドをコードする参照配列と相補的であり得る。
ａ．ベクター
カーゴは、ベクター、例えば、１つまたは複数のポリペプチドおよび／または１つまたは複数の機能性核酸をコードするベクターであり得る。上記のような核酸は、細胞で発現させるためにベクターに挿入することができる。本明細書において使用する場合、「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントを挿入して、その挿入されたセグメントが複製されるようにしたレプリコン、例えばプラスミド、ファージ、ウイルスまたはコスミドなどである。ベクターは、発現ベクターであり得る。「発現ベクター」は、１またはそれより多くの発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
ベクター中の核酸は、１またはそれより多くの発現制御配列に作動可能に連結することができる。例えば、発現制御配列が目的のコード配列の発現を効果的に制御するように、制御配列を遺伝子構築物に組み込むことができる。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、ＤＮＡ分子の、通常、転写が開始されるポイントの上流１００ヌクレオチド以内（一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近）の領域からなる発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの１～約５０ヌクレオチド下流に位置させる必要がある。エンハンサーは、時間、場所、およびレベルの点から発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは転写部位からさまざまな距離に位置する場合に機能することができる。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流に位置することもできる。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写することができ、次にそれをコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳することができる場合に、細胞内で発現制御配列に「作動可能に連結」され、「制御下にある」という。
適した発現ベクターとしては、限定されるものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミド、コスミド、およびウイルスベクターが挙げられる。多数のベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州マディソン）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド）などの企業から市販されている。
一部の実施形態では、カーゴは細胞内に送達され、染色体外にとどまる。一部の実施形態では、カーゴは、宿主細胞に導入され、宿主細胞のゲノムに統合される。以下でより詳細に考察されるように、この組成物は、遺伝子治療の方法で使用することができる。遺伝子治療の方法は、細胞の遺伝子型を変更するポリヌクレオチドを細胞に導入することを含むことができる。ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子組換えを介して内在性遺伝子を修正、置換、あるいは変更することができる。方法は、欠陥遺伝子、異種遺伝子、またはオリゴヌクレオチドなどの小型核酸分子の置換コピー全体の導入を含むことができる。例えば、修正遺伝子を宿主のゲノム内の非特異的な位置に導入することができる。
一部の実施形態では、カーゴはベクターである。遺伝子配列と適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築する方法は、当技術分野で周知である。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。発現ベクターは、一般に、挿入されたコード配列の翻訳および／または転写のための調節配列および必要なエレメントを含んでおり、それは例えば、目的のポリヌクレオチドであり得る。コード配列は、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結することができる。バイオテクノロジーで使用されるプロモーターは、意図する遺伝子発現の制御の型に応じてさまざまな型がある。それらは、一般に、構成的プロモーター、組織特異的または発達段階特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および合成プロモーターに分けることができる。
例えば、一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のプロモーターまたは他の調節要素に作動可能に連結される。したがって、カーゴは、発現ベクターなどのベクターであり得る。原核生物または真核生物系での発現のためのポリヌクレオチドの操作は、組換え発現の当業者に一般に公知の技術によって実施されてよい。発現ベクターは、通常、１またはそれより多くのプロモーターの制御下で、開示される組成物の１つを含む。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くためには、リーディングフレームの翻訳開始部位の５’末端を、一般に選択したプロモーターの「下流」（すなわち、３’）の約１～５０ヌクレオチドの間に配置する。「上流」プロモーターは、挿入したＤＮＡの転写を刺激し、コードされた組換えタンパク質または機能性核酸の発現を促進する。これが、ここで使用される文脈での「組換え発現」の意味である。
多様な宿主発現系においてタンパク質またはペプチドまたは機能性核酸の発現を達成するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築する多くの標準的な技術が利用可能である。
哺乳動物細胞で用いるための発現ベクターには、通常、複製起点（必要に応じて）、発現させる遺伝子の前に位置するプロモーターと、必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列が含まれる。複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源に由来し得るような外因性起源を含むようにベクターを構築することによって提供されてもよいし、宿主細胞の染色体複製機構によって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合、後者で十分である場合が多い。
プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム（例、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するものであってよい。さらに、そのような制御配列が宿主細胞系に適合しているのであれば、通常は所望の遺伝子配列に付随するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、望ましい場合がある。
多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、どちらもＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるために有用である。ウイルス複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に向かって伸びる約２５０ｂｐの配列が含まれている場合は、より小さいまたは大きいＳＶ４０フラグメントも使用されてよい。
アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列に連結されてよい。次に、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入されてよい。ウイルスゲノムを非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入することにより、感染した宿主でタンパク質を発現でき、生存可能な組換えウイルスが得られる。
開示される組成物の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルをさらに提供する必要があり得る。当業者は容易にこの必要性を判断し、必要なシグナルを提供できるであろう。挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム（またはインフェーズ）でなければならないことは周知である。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然と合成の多様な起源のものであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントまたは転写ターミネーターを含めることによって増強することができる。
真核生物での発現では、元のクローン化されたセグメント内にポリアデニル化部位が含まれていない場合、転写単位に適切なポリアデニル化部位を組み込むことも一般的に望まれるであろう。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終結の前の位置のタンパク質の終結部位の約３０から２０００ヌクレオチド「下流」に配置される。
組換えタンパク質の長期間、高収率の生産には、安定した発現が好ましい。例えば、タンパク質をコードする構築物を安定的に発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択可能マーカーによって制御されるベクターで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を濃縮培地で１～２日間、その後選択培地に切り替えて増殖させてよい。組換えプラスミドの選択可能なマーカーにより、選択に対する耐性が付与され、細胞はプラスミドを染色体に安定して組み込み、増殖して病巣を形成し、次にこれをクローン化して細胞株に増殖させることができる。
ｂ．ｍＲＮＡ
カーゴはｍＲＮＡであり得る。
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用されてよい。例えば、ＲＮＡは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを有することができる。３’ＵＴＲの長さは、例えば、１００ヌクレオチドより大きくなり得る。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、１００～５０００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、０～３０００ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、限定されるものではないが、ＵＴＲのさまざまな領域にアニールするＰＣＲ用のプライマーの設計をはじめとするさまざまな方法で変更することができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたＲＮＡの送達後に最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲの長さを変更することができる。
５’および３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の遺伝子に内在しないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワードプライマーおよびリバースプライマーに組み込むことによるか、または鋳型の他の修飾によって付加することができる。目的の遺伝子に内在しないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を変更するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵに富むエレメントは、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。そのため、当技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、内在性遺伝子のコザック配列を含む。あるいは、上記のように目的の遺伝子に内在しない５’ＵＴＲをＰＣＲで付加する場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列を再設計することもできる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのＲＮＡに必要であるものではないと思われる。多くのｍＲＮＡのコザック配列の必要条件は、当技術分野で公知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスに由来することができる。他の実施形態では、様々なヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲで使用して、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端のキャップ、３’ポリ（ａ）テール、またはそれらの組合せを有し、それらが細胞内でのリボソーム結合、翻訳開始および安定性ｍＲＮＡを決定する。
５’キャップはＲＮＡ分子に安定性をもたらす。５’キャップは、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ類似体であってよく、これらはすべて市販されている。５’キャップは、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１））またはその他の適した類似体であってもよい。５’キャップは、当技術分野で公知の技術を使用して組み込むことができる（Ｃｏｕｇｏｔら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８－９６６（２００５））。
ＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含むことができる。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、任意のウイルス、染色体、または人工的に設計された配列であってよい。
一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、１００～５０００の間のアデノシンである。
ポリＡセグメントは、ＰＣＲ中に、１００ＴテールなどのポリＴテール（サイズは例えば、５０～５０００Ｔであり得る）を含むリバースプライマーを使用することによって、またはＰＣＲ後に、限定されるものではないが、ＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えをはじめとする任意の他の方法によって、作製することができる。ポリ（Ａ）テールもＲＮＡに安定性をもたらし、ＲＮＡの分解を低減する。ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、インビトロ転写後に追加的または代替的に伸長することができる。
さらに、３’末端に異なる化学基を付着させると、ｍＲＮＡの安定性を高めることができる。そのような付着には、修飾された／人工のヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含めることができる。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体はＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。適したＡＴＰ類似体には、限定されるものではないが、コルジオシピンおよび８－アザアデノシンが含まれる。
２．カーゴの配列
ａ．目的のポリペプチド
カーゴは、１またはそれより多くのタンパク質をコードすることができる。カーゴは、モノシストロニックまたはポリシストロニックであり得るポリヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは多重遺伝子性である。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡまたはベクターなどの発現構築物であり得る。
カーゴは、１またはそれより多くの目的のポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドは任意のポリペプチドであり得る。例えば、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、生物に治療効果または予防効果を提供するポリペプチドか、または生物の疾患または障害を診断するために使用することができるポリペプチドであり得る。例えば、癌、自己免疫障害、寄生虫、ウイルス、細菌、真菌または他の感染症の処置の場合、発現させる１または複数のポリヌクレオチドは、免疫系の細胞に対するリガンドまたは受容体として機能するポリペプチドをコードし得るか、または生物の免疫系を刺激または抑制するように機能することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、生物において欠損しているポリヌクレオチドを補充するかまたは置換する。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジストロフィン、ユートロフィン、またはそれらの組合せをコードする。そのような組成物は、ジストロフィー、特に筋ジストロフィー、例えば、デュシエンヌ型筋ジストロフィーの対象を処置するために有効な量で投与されてよい。
別の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗原、例えば、ワクチン製剤および関連する方法において利用することができる抗原をコードする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１または複数のウイルス抗原、例えば、１または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスおよびそれに関連するウイルス感染症および疾患（ＣＯＶＩＤ１９を含む）に対する保護および処置のための組成物およびその使用方法が提供される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、選択可能なマーカー、例えば、薬剤耐性選択可能マーカーなどの真核細胞において効果的な選択マーカーを含む。この選択可能なマーカー遺伝子は、選択培地で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要な因子をコードすることができる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、カナマイシン、ゲンタマイシン、ゼオシン、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または培地から与えられない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、通常、宿主細胞に存在しないかまたは発現しない遺伝子である。レポーター遺伝子は、通常、表現型の変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は、Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２、４２１（１９８８）に記載されている。好ましいレポーター遺伝子には、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が含まれる。
ｂ．機能性核酸
カーゴは、機能性核酸であり得るか、または機能性核酸をコードすることができる。機能性核酸は、標的分子との結合や特定の反応の触媒など、特定の機能を有する核酸分子である。以下でより詳細に考察されるように、機能性核酸分子は、以下の限定されないカテゴリー：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ＲＮＡｉ、および外部ガイド配列、および環状ジヌクレオチドに分類することができる。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定の活性のエフェクター、抑制剤、モジュレーター、および刺激剤として作用することができ、または機能性核酸分子は他の分子とは独立した新規活性を有することができる。
機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖などの高分子と相互作用することができる。したがって、機能性核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと相互作用することができ、またはそれらはポリペプチド自体と相互作用することができる。機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計されている場合が多い。他の状況では、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子の配列相同性に基づくものではなく、むしろ特異的認識が行われることを可能にする三次構造の形成に基づくものである。
そのため、組成物は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現を低下させるように設計された１またはそれより多くの機能性核酸を含むことができる。例えば、機能性核酸またはポリペプチドは、ｍＲＮＡの発現または翻訳を標的とし、低下させるかまたは抑制するように、あるいは、タンパク質の発現を低下させるかまたは抑制し、活性を低下させ、または分解を増加させるように設計することができる。一部の実施形態では、組成物は、機能性核酸のインビボ発現に適したベクターを含む。
ｉ．アンチセンス
機能性核酸はアンチセンス分子であり得るか、またはアンチセンス分子をコードすることができる。アンチセンス分子は、標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）または非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）な塩基対形成のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮアーゼＨに媒介されるＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解によって、標的分子の破壊を促進するように設計されている。あるいは、アンチセンス分子は、転写や複製など、標的分子で通常行われることになる処理機能を中断するように設計されている。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的の分子の最もアクセスしやすい領域を見つけることによって、アンチセンス効率を最適化するための多数の方法がある。例示的な方法には、インビトロ選択実験と、ＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するＤＮＡ修飾研究が含まれる。アンチセンス分子は、１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。
ｉｉ．ＲＮＡ干渉
一部の実施形態では、機能性核酸は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子サイレンシングを誘導する。遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって非常に特異的な方法で効果的にサイレンシングすることもできる。このサイレンシングは、最初に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の追加によって観察された（Ｆｉｒｅら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６－１１；Ｎａｐｏｌｉら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９－８９；Ｈａｎｎｏｎ，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４－５１）。ｄｓＲＮＡは、細胞に入ると、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒによって切断され、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、長さ２１～２３ヌクレオチドの二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８－２００；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３－６；Ｈａｍｍｏｎｄら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３－６）。ＡＴＰ依存性の段階において、ｓｉＲＮＡは、一般にＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知であり、ｓｉＲＮＡを標的のＲＮＡ配列に導くマルチサブユニットタンパク質複合体に統合される（Ｎｙｋａｎｅｎら、（２００１）Ｃｅｌｌ，１０７：３０９－２１）。ある時点でｓｉＲＮＡ二重鎖がほどけ、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したまま、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせによって相補的なｍＲＮＡ配列の分解を指示すると思われる（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５６３－７４）。しかし、ｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡの効果またはそれらの使用効果はいかなる種類の機構にも限定されない。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それによって遺伝子発現を減少させ、または抑制さえすることのできる二本鎖ＲＮＡである。一例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡなどの相同ＲＮＡ分子の特異的分解を引き起こす。例えば、ＷＯ０２／４４３２１号は、３’オーバーハング末端と塩基対を形成すると、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡを作製する方法は参照により本明細書に組み込まれる。
配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって生成されるｓｉＲＮＡを模倣する合成低分子二本鎖ＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞で達成され得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４ ４９８）（Ｕｉ－Ｔｅｉら、（２０００）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４７９：７９－８２）。ｓｉＲＮＡは、化学的にまたはインビトロで合成されるか、または細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡとなる低分子二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者としては、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（マサチューセッツ州アッシュランド）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（コロラド州ラファイエット）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（エスバースバーグ、ドイツ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（コロラド州ボールダー）、およびＱｉａｇｅｎ（ベント、オランダ）が挙げられる。また、ｓｉＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用して、インビトロで合成することもできる。
ベクターからのｓｉＲＮＡの生成は、より一般的には、低分子ヘアピンＲＮアーゼ（ｓｈＲＮＡ）の転写によって行われる。ｓｈＲＮＡを含むベクターを生産するためのキットは、例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キットおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターなどが利用可能である。
一部の実施形態では、機能性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、組成物は機能性核酸を発現するベクターを含む。
ｉｉｉ．アプタマー
機能性核酸はアプタマーであり得るか、またはアプタマーをコードすることができる。アプタマーは、標的分子と、好ましくは特定の方法で相互作用する分子である。通常、アプタマーは、長さが１５～５０塩基に及ぶ小型の核酸であり、ステムループまたはＧカルテットなどの定義された二次および三次構造に折り畳まれる。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリンなどの小分子だけでなく、逆転写酵素およびトロンビンなどの大分子にも結合することができる。アプタマーは、標的分子からのＫｄが１０－１２Ｍ未満と、非常に強固に結合することができる。アプタマーは、１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い特異度で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と分子上の１つの位置だけが異なる別の分子との結合親和性において１０，０００倍より多くの差があるアプタマーが単離されている。アプタマーは、標的分子とのＫｄが、バックグラウンドの結合分子とのＫｄよりも少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍低いことが好ましい。ポリペプチドなどの分子の比較を行う場合、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。
ｉｖ．リボザイム
機能性核酸はリボザイムあり得るか、またはリボザイムをコードすることができる。リボザイムは、分子内または分子間で化学反応を触媒できる核酸分子である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒するリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイムなど、天然の系に存在するリボザイムをベースにした種類が多数ある。また、天然の系には存在しないが、特定の反応を新規に触媒するように操作されたリボザイムもいくつか存在する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡの基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡの基質を切断する。リボザイムは通常、標的基質の認識および結合とそれに続く切断によって核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合、主に標準的または非標準的な塩基対の相互作用に基づいている。標的の基質の認識は標的の基質配列に基づいているため、この性質により、リボザイムは核酸の標的特異的切断に特に適した候補となる。
ｖ．外部ガイド配列
機能性核酸は外部ガイド配列であり得るか、または外部ガイド配列をコードすることができる。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子に結合して複合体を形成する分子であり、その複合体をＲＮアーゼＰが認識し、次に標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計することができる。ＲＮアーゼＰは、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。細菌のＲＮアーゼＰは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、事実上どんなＲＮＡ配列も切断するために、補充され得る。同様に、真核生物のＥＧＳ／ＲＮアーゼＰ指向性のＲＮＡ切断を利用して、真核細胞内の所望の標的を切断することができる。多様な異なる標的分子の切断を容易にするＥＧＳ分子の作製および使用方法の代表的な例は、当技術分野で公知である。
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、およびアプタマーなどの機能性核酸のインビボ発現のためのベクターを作製および使用する方法は、当技術分野で公知である。
ｖｉ．環状ジヌクレオチド
機能性核酸は環状ジヌクレオチドであり得るか、または環状ジヌクレオチドをコードすることができる。環状ジヌクレオチドはＳＴＩＮＧアダプタータンパク質に直接結合し、ＩＦＮ－βを産生する（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．，５１（２）：２２６－３５（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１３．０５．０２２．）。いくつかの標準的および非標準的なジヌクレオチドが当技術分野で公知であり、それには、限定されるものではないが、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃＡＩＭＰ（ＣＬ５９２）、ｃＡＩＭＰ Ｄｉｆｌｕｏｒ（ＣＬ６１４）、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２ Ｄｉｆｌｕｏｒ（Ｒｐ／Ｓｐ）（ＣＬ６５６）、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ／Ｓｐ）、３’３’－ｃＧＡＭＰフッ素化、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰフッ素化、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰフッ素化、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＩＭＰ、ＤＭＸＡＡが挙げられる。
ｖｉｉ．免疫刺激性オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、機能性核酸は、オリゴヌクレオチドリガンドであり得るか、またはオリゴヌクレオチドリガンドをコードすることができる。例としては、限定されるものではないが、パターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンドが挙げられる。
ＰＲＲの例には、自然免疫応答の開始に役割を果たし、後のより抗原特異的な適応免疫応答にも影響を及ぼすシグナル伝達分子のＴｏｌｌ様ファミリーが挙げられる。そのため、このオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）などのＴｏｌｌ様ファミリーシグナル伝達分子のリガンドとして役立ち得る。
例えば、非メチル化ＣｐＧ部位は、ヒトの形質細胞様樹状細胞およびＢ細胞のＴＬＲ９によって検出することができる（Ｚａｉｄａら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７６（５）：２１２３－２１２９，（２００８））。そのため、オリゴヌクレオチドの配列は、１またはそれより多くの非メチル化シトシン－グアニン（ＣＧまたはＣｐＧ、同義的に使用される）ジヌクレオチドモチーフを含むことができる。「ｐ」はＤＮＡのホスホジエステル骨格を指すが、一部の実施形態では、ＣＧを含むオリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えばホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有することができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、隣接して配置されるか、または介在する１または複数のヌクレオチドによって分離される、１より多くのＣＧジヌクレオチドを含むことができる。１または複数のＣｐＧモチーフは、オリゴヌクレオチド配列の内部に存在することができる。多数のヌクレオチド配列が、１または複数のＣＧジヌクレオチドの数と位置、ならびにＣＧダイマーに隣接する正確な塩基配列を変化させてＴＬＲ９を刺激する。
通常、ＣＧ ＯＤＮは、その配列、二次構造、およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への影響に基づいて分類される。５つのクラスは、クラスＡ（タイプＤ）、クラスＢ（タイプＫ）、クラスＣ、クラスＰ、およびクラスＳである（Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｊ＆Ｋｒｉｅｇ，ＡＭ，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ６１（３）：１９５－２０４（２００９）、参照により本明細書に援用される）。ＣＧ ＯＤＮは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮαなど）の産生を刺激し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導することができる。一部のクラスのＯＤＮは、間接的なサイトカインシグナル伝達を介したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の強力な活性化因子でもある。一部のクラスは、ヒトＢ細胞および単球成熟の強力な刺激剤である（Ｗｅｉｎｅｒ，ＧＬ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４（２０）：１０８３３－７（１９９７）；Ｄａｌｐｋｅ，ＡＨ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０６（１）：１０２－１２（２００２）；Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ，Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．１６４（３）：１６１７－２（２０００）、これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される）。
他のＰＲＲ Ｔｏｌｌ様受容体には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、低分子二本鎖ＲＮＡをそれぞれ認識するＴＬＲ３およびＴＬＲ７、ならびに、細胞質のＲＮＡ感知受容体として最もよく知られている、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体、すなわちＲＩＧ－Ｉおよびメラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）などが含まれる。
ＲＩＧ－Ｉ（レチノイン酸誘導性タンパク質１、Ｄｄｘ５８としても公知）およびＭＤＡ－５（メラノーマ分化関連遺伝子５、Ｉｆｉｈ１またはＨｅｌｉｃａｒｄとしても公知）は、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーに属する細胞質ＲＮＡヘリカーゼであり、宿主の抗ウイルス応答に重要である。
ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ－５は、ＲＮＡウイルスの複製中間体である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を感知し、ミトコンドリアの抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＭＡＶＳ（ＩＰＳ－１、ＶＩＳＡ、またはＣａｒｄｉｆとしても公知）を介してシグナルを伝達し、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）の生成をもたらす。
ＲＩＧ－Ｉは、自己ＲＮＡとの識別を容易にする２つの重要な特徴である、キャップされていない５’－二リン酸／三リン酸末端と短い平滑末端の二本鎖部分を示すウイルスＲＮＡを検出する。ＭＤＡ－５生理学的リガンドの特徴はまだ完全には明らかになっていない。しかし、ＲＩＧ－ＩとＭＤＡ－５はｄｓＲＮＡの長さに対して異なる依存性を示すことが認められている：ＲＩＧ－Ｉは短いｄｓＲＮＡに選択的に結合し、ＭＤＡ－５は長いｄｓＲＮＡに選択的に結合する。これと一致して、ＲＩＧ－ＩとＭＤＡ－５は、合成ｄｓＲＮＡ類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ）に、異なる長さの好みで結合する。
ある状況下では、ＲＩＧ－ＩはｄｓＤＮＡを間接的に感知することもできる。ウイルスのｄｓＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって５’－三リン酸部分を持つｄｓＲＮＡに転写されることができる。したがって、Ｂ型ＤＮＡの合成類似体であるポリ（ｄＡ：ｄＴ）は、別のＲＩＧ－Ｉのリガンドを構成する。
例示的なＲＩＧ－Ｉリガンドには、限定されるものではないが、ＲＩＧ－Ｉの特異的アゴニストである５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ；ＲＩＧ－Ｉの特異的アゴニストである３ｐ－ｈｐＲＮＡ；ポリ（Ｉ：Ｃ）のサイズに応じてＲＩＧ－Ｉおよび／またはＭＤＡ－５により認識されるポリ（Ｉ：Ｃ）／ＬｙｏＶｅｃ複合体；ＲＩＧ－Ｉにより間接的に認識されるポリ（ｄＡ：ｄＴ）／ＬｙｏＶｅｃ複合体が含まれる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、またはＲＩＧ－Ｉ様受容体、またはそれらの組み合わせの機能的リガンドを含む。
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの例、およびそれらを作製する方法は当技術分野で公知であり、市販されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄｅｒａ、Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．５（１）：８７－９３（２０１１）を参照されたい。
３．カーゴの構成
開示される核酸カーゴは、複素環塩基（核酸塩基）、複素環塩基に結合した糖部分、および糖部分のヒドロキシル官能基をエステル化するリン酸部分を通常含むＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドであり得るか、またはそれらを含むことができる。主要な天然に存在するヌクレオチドには、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンが複素環塩基として、そしてホスホジエステル結合によって連結されたリボースまたはデオキシリボース糖が含まれる。
一部の実施形態では、カーゴは、ＤＮＡまたはＲＮＡの対応物と比較して、安定性、半減期、または標的受容体に対する特異性もしくは親和性を改善するように化学的修飾されたヌクレオチド類似体を含むか、またはそれらで構成される。化学修飾には、核酸塩基、糖部分、ヌクレオチド結合、またはそれらの組み合わせの化学修飾が含まれる。本明細書において「修飾ヌクレオチド」または「化学的修飾ヌクレオチド」は、１またはそれより多くの複素環塩基、糖部分またはリン酸部分の構成要素の化学修飾を有するヌクレオチドを定義する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドの電荷は、同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、減少している。例えば、オリゴヌクレオチドは、低い負電荷、電荷なし、または正電荷を有することができる。
通常、ヌクレオシド類似体は、標準ポリヌクレオチド塩基へのワトソン・クリック塩基対形成によって水素結合が可能な塩基を支持し、類似体骨格は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間で配列特異的な様式でそのような水素結合を可能にする方法で塩基を提示する。一部の実施形態では、類似体は、実質的に帯電していないリン含有骨格を有する。
ａ．複素環塩基
主要な天然に存在するヌクレオチドには、複素環塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンが含まれる。カーゴには、それらの核酸塩基構成要素への化学修飾を含めることができる。複素環塩基または複素環塩基類似体の化学修飾は、標的配列に結合する際の結合親和性または安定性を高めるために効果的である場合がある。化学的に修飾された複素環塩基には、限定されるものではないが、イノシン、５－（１－プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５－（１－プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５－メチルシトシン、８－オキソ－アデニン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５および２－アミノ－５－（２’－デオキシ－．β．－Ｄ－リボフラノシル）ピリジン（２－アミノピリジン）、およびさまざまなピロロ－およびピラゾロピリミジン誘導体が含まれる。
ｂ．糖修飾
カーゴには、糖部分または糖部分類似体が修飾されたヌクレオチドも含めることができる。糖部分の修飾には、限定されるものではないが、２’－Ｏ－アミノエトキシ（ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）、２’－Ｏ－アモニオエチル（ａｍｏｎｉｏｅｔｈｙｌ）（２’－ＯＡＥ）、２’－Ｏ－メトキシ、２’－Ｏ－メチル、２－グアニドエチル（２’－ＯＧＥ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン（ＬＮＡ）、２’－Ｏ－（メトキシエチル）（２’－ＯＭＥ）および２’－Ｏ－（Ｎ－（メチル）アセトアミド）（２’－ＯＭＡ）が含まれる。２’－Ｏ－アミノエチル糖部分の置換は、中性ｐＨでプロトン化され、したがってＴＦＯと標的二重鎖との間の電荷反発を抑制するため、特に好ましい。この修飾により、リボースまたはデキシリボース（ｄｅｘｙｒｉｂｏｓｅ）のＣ３’－エンドコンフォメーションが安定化され、二重鎖のプリン鎖のｉ－１リン酸との架橋も形成される。
一部の実施形態では、核酸は、モルホリノオリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、通常、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに効果的なプリンまたはピリミジン塩基対合部分を含有する、さらに２つのモルホリノモノマーで構成され、これらは、１つのモノマーのモルホリノ窒素と隣接するモノマーの５’環外炭素を連結する１～３原子長のリン含有結合によって連結されている。プリンまたはピリミジンの塩基対合部分は、通常、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号に詳述されている。
通常モルホリノベースのサブユニットの重要な特性には、通常、以下が含まれる：安定した非荷電骨格の結合によってオリゴマー形態で連結される能力；形成されたポリマーが、たとえ１０～１４塩基程度の短いオリゴマーであっても、高いＴｍで、標的ＲＮＡを含む相補塩基標的核酸とハイブリダイズすることができるように、ヌクレオチド塩基（例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシルまたはイノシン）を支持する能力；オリゴマーが哺乳動物細胞に活発に輸送される能力；および、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖がＲＮアーゼ分解に抵抗する能力。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、上記のように、非荷電結合によって連結された塩基対合部分を有するモルホリノベースのサブユニットを用いる。
ｃ．ヌクレオチド間結合
オリゴヌクレオチドは、２つのヌクレオシド部分間の化学結合を指すヌクレオチド間結合によって繋がれている。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのリン酸骨格への修飾は、結合親和性または安定性オリゴヌクレオチドを増加させるか、またはオリゴヌクレオチドヌクレアーゼ消化の感受性を低下させる可能性がある。限定されるものではないが、ジエチルエチレンジアミド（ＤＥＥＤ）またはジメチルアミノプロピルアミン（ＤＭＡＰ）を含むカチオン修飾は、オリゴヌクレオチドと標的との間の静電反発を低下させるため、特に有用である可能性がある。また、リン酸骨格の修飾には、ホスホジエステル結合の非架橋酸素の１つを硫黄原子で置換することが含まれてもよい。この置換により、ホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエートヌクレオシド間結合が作成される。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、インビボでより安定であることが示されている。
電荷の低下した修飾ヌクレオチドの例には、上述のように、アキラルおよび非荷電のサブユニット間結合を有するリン酸塩類似体などの修飾ヌクレオチド間結合（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ、Ｅ．Ｐ．ら、Ｏｒｇａｎｉｃ．Ｃｈｅｍ．，５２：４２０２，（１９８７））、およびアキラルなサブユニット間結合を有する非荷電のモルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号参照）が挙げられる。一部のヌクレオチド間結合類似体には、モルホリデート、アセタール、およびポリアミド結合複素環が含まれる。
もう一つの実施形態では、カーゴはロックド核酸で構成されている。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，８（１）：１－７（２００１）参照）。ＬＮＡはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも安定したハイブリッドをＤＮＡと形成し、これはペプチド核酸（ＰＮＡ）／ＤＮＡハイブリッドと同様の特性をもつ。そのため、ＬＮＡは、ＰＮＡ分子と同じように使用することができる。ＬＮＡの結合効率は、一部の実施形態では、正電荷をそれに加えることによって増加させることができる。ＬＮＡの作製には、市販の核酸合成機および標準的なホスホルアミダイト化学が使用される。
一部の実施形態では、カーゴはペプチド核酸で構成されている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格全体がＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位の繰り返しで置き換えられ、ホスホジエステル結合が、通常、ペプチド結合で置き換えられた合成ＤＮＡ模倣物である。さまざまな複素環塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結されている。ＰＮＡは、従来のＤＮＡオリゴヌクレオチドに類似した複素環塩基の間隔を維持するが、アキラルな中性荷電分子である。ペプチド核酸は、ペプチド核酸モノマーで構成される。
その他の骨格修飾には、ペプチドおよびアミノ酸のバリエーションと修飾が含まれる。したがって、ＰＮＡなどのオリゴヌクレオチドの骨格構成要素は、ペプチド結合であってもよいし、またはその代わりに、非ペプチドペプチド結合であってもよい。例としては、アセチルキャップ、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（本明細書ではＯ－リンカーと呼ばれる）などのアミノスペーサー、リジンなどのアミノ酸（ＰＮＡで正電荷が望ましい場合に特に有用である）などが挙げられる。ＰＮＡの化学的構築の方法は周知である。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号および同第５，７８６，５７１号を参照されたい。
カーゴは、必要に応じて、安定性、および／またはその標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めるために、いずれかまたは両方の末端に１またはそれより多くの末端残基または修飾を含む。一般的に使用される正に帯電した部分には、アミノ酸のリジンおよびアルギニンが含まれるが、他の正に帯電した部分も有用であり得る。カーゴはさらに、プロピルアミン基を使用して分解を防ぐためにエンドキャップされるように修飾されてもよい。３’または５’のオリゴヌクレオチドをキャッピングするための手順は、当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。
Ｃ．医薬組成物
組成物は、薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせて治療的に使用することができる。
３Ｅ１０抗体と複合体を形成した核酸カーゴを含む組成物は、好ましくは、適した製薬キャリアと組み合わせて治療用途に用いられる。そのような組成物には、有効量の組成物、および薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤が含まれる。
組成物は、適した製薬キャリアで局部、局所または全身に投与するための製剤であってよい。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７５）には、典型的なキャリアおよび調製方法が開示されている。また、複合体は、細胞を標的とするために、生分解性または非生分解性ポリマーまたはタンパク質またはリポソームで形成された適した生体適合性粒子に封入されてもよい。そのような系は当業者に周知である。一部の実施形態では、複合体は、ナノ粒子に封入されている。
注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは多用量型容器で、必要に応じて防腐剤を添加して提示されてよい。組成物は、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液および乳濁液などの形態をとることができ、特定の実施形態では、対象の血液と等張性であり得る。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、ゴマ油、ココナッツ油、ラッカセイ油、ピーナッツ油などの植物油、鉱油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、あるいは合成モノまたはジ－グリセリドを含む固定油である。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または生理食塩水や緩衝培地を含む懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、１，３－ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養素補充剤、および電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）が含まれる。材料は、溶液、エマルジョン、または懸濁液（例えば、粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれたもの）であってよい。通常、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容され得る塩が製剤中に使用される。トレハロースは、通常、１～５％の量で医薬組成物に添加されてよい。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８であり、より好ましくは約７～約７．５である。
医薬組成物には、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、および界面活性剤が含まれてよい。キャリア製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出すことができる。当業者であれば、過度の実験に頼ることなく、組成物の調製および製剤化のためのさまざまなパラメーターを容易に決定することができる。
組成物は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に作製する（すなわち、「噴霧する」）こともできる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、および空気などの加圧された許容され得る推進剤に入れることができる。吸入による投与の場合、化合物は、適した推進剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーを提示する形態で送達される。
一部の実施形態では、薬学的に許容され得るキャリアと、塩、キャリア、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート剤、防腐剤、可溶化剤、または安定化剤などの配合成分が含まれる。
核酸は、細胞への取り込みを改善するために、コレステロール、ならびにＣ３２官能基をもつラウリン酸およびリトコール酸誘導体のような親油性基とコンジュゲートされていてよい。例えば、コレステロールは、ｓｉＲＮＡの取り込みと血清安定性を高めることがインビトロ（Ｌｏｒｅｎｚら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１４（１９）：４９７５－４９７７（２００４））およびインビボ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ，４３２（７０１４）：１７３－１７８（２００４））で実証されている。さらに、ステロイド結合オリゴヌクレオチドがＬＤＬなどの血流中の異なるリポタンパク質に結合することにより、完全性が保護され、生体内分布が促進されることが示されている（Ｒｕｍｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９（１１）：１４０７－１４１６（２０００））。細胞への取り込みを増加させるために上記の核酸に結合するかまたはコンジュゲートすることができるその他の基としては、アクリジン誘導体；ソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビンなどの架橋剤；人工エンドヌクレアーゼ；ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン－Ｆｅ（ＩＩ）などの金属錯体；アルキル化部分；アルカリホスファターゼなどのヌクレアーゼ；末端トランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性キャリア；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；放射性マーカー；非放射性マーカー；炭水化物；およびポリリジンまたは他のポリアミンが含まれる。Ｌｅｖｙらへの米国特許第６，９１９，２０８号も、送達を強化するための方法を記載している。これらの医薬製剤は、それ自体公知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、水簸、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥工程によって製造されてもよい。
さらなるキャリアには、複合体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が挙げられ、そのマトリックスは、成形された粒子、例えばフィルム、リポソーム、または微粒子などの形態である。移植は、埋め込み可能な薬物送達システム、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバ、コレステロールマトリックス、ポリマーシステム、例えば、マトリックス侵食および／または拡散システム、ならびに非ポリマーシステムを挿入することを含む。吸入には、吸入器内の組成物とエアロゾルを、単独で、または吸収させることができるキャリアに付着させて投与することが含まれる。全身投与の場合、組成物はリポソームに封入されていることが好ましい場合がある。
組成物は、血管または尿道カテーテルなどの侵襲的デバイスを使用して、さらに、薬物送達能力を有し、拡張デバイスとして構成されたステントまたはステントグラフトなどの介入デバイスを使用して、薬剤および／またはヌクレオチド送達システムの組織特異的取り込みを可能にする方法で送達されてよい。
製剤は、生体侵食性インプラントを使用して、拡散によるかまたはポリマーマトリックスの分解によって送達されてよい。特定の実施形態では、製剤の投与は、特定の期間、例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月または数年にわたって、組成物への連続的な曝露をもたらすように設計されてよい。これは、例えば、製剤の反復投与によって、または反復投与されなくても組成物が長期間にわたって送達される徐放性または制御放出送達システムによって達成されてよい。
その他の適した送達システムには、時間放出型、遅延放出型、持続放出型、または制御放出型の送達システムが含まれる。このようなシステムは、多くの場合、反復投与を回避し、対象と医師の利便性を向上させることができる。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらには、例えば、ポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、および／またはこれらの組合せなどのポリマーに基づくシステムが含まれる。核酸を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。その他の例としては、コレステロールなどのステロール、コレステロールエステル、および、モノ－、ジ－およびトリグリセリドなどの脂肪酸または中性脂肪を含む脂質ベースの非ポリマーシステム；ヒドロゲル放出システム；リポソームベースのシステム；リン脂質ベースのシステム；サイラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来のバインダーおよび賦形剤を用いる圧縮錠剤；あるいは部分的に融合したインプラントが含まれる。製剤は、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、高分子リザーバ、コレステロールマトリックス、またはポリマーシステムであってよい。一部の実施形態では、システムは、例えば、複合体を含有する製剤の拡散または侵食／分解速度の制御を通して、組成物の持続もしくは制御放出が起こることを可能することができる。
複合体には、核酸カーゴおよび抗体が含まれ、それらの組成物は、肺または粘膜投与用に処方することができる。投与には、肺、鼻、経口（舌下、頬側）、膣、または直腸の粘膜への組成物の送達が含まれ得る。本明細書で使用されるエアロゾルという用語は、推進剤を使用して生成されるかどうかにかかわらず、溶液または懸濁液になり得る粒子の微細なミストの調製物を指す。エアロゾルは、超音波処理または高圧処理などの標準的な技術を使用して作製することができる。
上気道を介した投与の場合、製剤は、溶液、例えば水または（緩衝化または非緩衝化）等張生理食塩水に、または懸濁液として、鼻腔内投与の場合は液滴またはスプレーとして、製剤化することができる。好ましくは、そのような溶液または懸濁液は、鼻分泌物に対して等張であり、ほぼ同じｐＨであり、例えば、約ｐＨ４．０～約ｐＨ７．４、またはｐＨ６．０～ｐＨ７．０の範囲である。緩衝液は生理学的に適合したものであるべきであり、単に例としてリン酸緩衝液が挙げられる。
複合体は、粒子送達ビヒクルを使用して標的の細胞に送達されることができる。ナノ粒子は、通常、５００ｎｍから０．５ｎｍ未満の範囲の粒子を指し、好ましくは、５０から５００ｎｍの間の直径を有し、より好ましくは、５０から３００ｎｍの間の直径を有する。ポリマー粒子の細胞内在化は、そのサイズに非常に依存し、ナノ粒子のポリマー粒子は、マイクロ粒子のポリマー粒子よりもはるかに高い効率で細胞に内在化される。例えば、Ｄｅｓａｉらは、直径１００ｎｍのナノ粒子は、直径１μＭのマイクロ粒子と比較して、培養されたＣａｃｏ－２細胞に約２．５倍多く取り込まれることを実証した（Ｄｅｓａｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：１５６８－７３（１９９７））。ナノ粒子はまた、インビボで組織の奥深くまで拡散する能力も高い。
一部の実施形態では、送達ビヒクルはデンドリマーである。
好ましい生分解性ポリマーの例としては、ポリ（ヒドロキシ酸）などの加水分解によって分解する合成ポリマー、例えば、乳酸とグリコール酸のポリマーおよびコポリマー、他の分解性ポリエステル、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（ブチック酸（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、およびポリ（アミン－コ－エステル）ポリマー、例えばＺｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１１：８２－９０（２０１２）および国際公開第２０１３／０８２５２９号、米国特許出願公開第２０１４／０３４２００３号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６１３７５号に記載されているものなどが挙げられる。
一部の実施形態、特にＴ細胞をインビボで標的化するための実施形態、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで産生するための実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ７、またはＣＤ８などの免疫細胞またはＴ細胞マーカー、または肝臓などの標的組織のマーカーを標的化することができる。例えば、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ３ ＦａｂフラグメントはどちらもインビボでＴ細胞を標的化するために使用されてきた（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，１０（１１）（２０１８）．ｐｉｉ：ｅ９１５８．ｄｏｉ：１０．１５２５２／ｅｍｍｍ．２０１８０９１５８．、Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２（８）：８１３－８２０（２０１７）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１７．５７）。したがって、一部の実施形態では、粒子または他の送達ビヒクルには、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、または別の免疫細胞（例えばＴ細胞）マーカーに特異的な、あるいは胸腺、脾臓、または肝臓などの特定の組織に対するマーカーに特異的な標的化部分が含まれる。この結合部分は、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。
標的化部分は、ナノ粒子またはその他の送達ビヒクルに直接的または間接的に会合、連結、コンジュゲート、あるいは他の方法で結合させることができる。標的化分子は、標的化された細胞の表面上の受容体または他の分子に結合するタンパク質、ペプチド、核酸分子、糖類または多糖類であり得る。グラフトへの結合の特異性の程度および結合力は、標的分子の選択によって調節することができる。
部分の例には、例えば、特定の細胞への分子の送達を提供する標的化部分、例えば、造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞または他の好ましい細胞型に対する抗体、ならびに好ましい細胞型に発現した受容体およびリガンドが含まれる。好ましくは、この部分は、造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞を標的とする。細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）を標的とする分子の例には、グリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）およびコラーゲンが含まれる。一実施形態では、ポリマー粒子の外面は、選択された細胞または組織と粒子が相互作用する能力を高めるように修飾される場合がある。標的分子とコンジュゲートしたアダプターエレメントが粒子に挿入されている上記の方法が好ましい。しかし、もう一つの実施形態では、カルボキシ末端を有するポリマーマイクロ粒子またはナノ粒子の外面は、遊離アミン末端を有する標的化分子に連結されていてもよい。
高分子マイクロおよびナノ粒子に結合するその他の有用なリガンドには、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）が含まれる。ＰＡＭＰは、細胞または組織の表面にあるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を標的化したり、細胞または組織の内部でシグナルを伝達し、それによって取り込みを増加させる可能性がある。粒子表面に結合したかまたは共封入されたＰＡＭＰとしては、以下が含まれ得る：非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ（細菌）、二本鎖ＲＮＡ（ウイルス）、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒｒｉｄｅ）（細菌）、ペプチドグリカン（細菌）、リポアラビノマンナン（ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎｉｎ）（細菌）、ザイモサン（酵母）、ＭＡＬＰ－２などのマイコプラズマリポタンパク質（細菌）、フラゲリン（細菌）ポリ（イノシン－シチジル）酸（細菌）、リポテイコ酸（細菌）またはイミダゾキノリン（合成）。
もう一つの実施形態では、粒子の外面は、マンノースアミンを用いて処置し、それにより、粒子の外面をマンノシル化することができる。この処置により、粒子は抗原提示細胞表面のマンノース受容体で標的細胞または組織に結合することができる。あるいは、Ｆｃ部分（Ｆｃ受容体を標的化する）、熱ショックタンパク質部分（ＨＳＰ受容体）、ホスファチジルセリン（スカベンジャー受容体）、およびリポ多糖（ＬＰＳ）を含む免疫グロブリン分子との表面結合が、細胞または組織上の追加の受容体標的である。
マイクロ粒子およびナノ粒子に共有結合して、それらをムチンおよび粘膜細胞層に標的特異的にすることができるレクチン。
標的化部分の選択は、ナノ粒子組成物の投与方法および標的化される細胞または組織に依存することになる。標的分子は、一般に、細胞または組織に対する粒子の結合親和性を増加させるか、あるいはナノ粒子を臓器内の特定の組織または組織内の特定の細胞型に標的化することができる。一部の実施形態では、標的化部分は、胸腺、脾臓、または癌細胞を標的化する。
純粋または部分的に精製された形態のムチンの天然成分のいずれかを粒子に共有結合させると、ビーズと腸の界面の表面張力が低下し、ムチン層のビーズの溶解度が増加する。余分なペンダントカルボン酸側基、例えば、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸を含有するポリアミノ酸の付着は、生体接着性を増加させる。１５，０００～５０，０００ｋＤａの分子量範囲のポリアミノ酸を使用すると、粒子の表面に付着した１２０～４２５アミノ酸残基の鎖が得られる。ポリアミノ鎖は、ムチン鎖の鎖の絡み合いによって、およびカルボン酸の電荷の増加によって、生体接着を高める。
ＩＩＩ．使用方法
３Ｅ１０を使用して核酸構築物の送達を増強するための方法が提供される。通常、有効量の３Ｅ１０抗体を、まず、細胞への送達が望まれる核酸カーゴと接触させる。例えば、核酸カーゴと抗体が複合体を形成するのに十分な時間、核酸カーゴと抗体を溶液中で混合することができる。次に、混合物を細胞に接触させる。他の実施形態では、細胞を含むか、そうでなければ細胞を浸している溶液にカーゴと抗体を加え、細胞の存在下で複合体を形成させる。複合体は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞と接触させることができる。したがって、一部の実施形態では、複合体の溶液は、培養中の細胞に添加されるか、または処置するべき動物に注射される。
この抗体は、核酸を細胞核内に送達するのを助け、次に、ドナーＤＮＡによる遺伝子編集を促進することができるＲＡＤ５１経路の機能を変化させると考えられている。このアプローチには、核酸カーゴの設計に配列の制限はない。処置は、例えば、抗体と核酸カーゴの混合物の単純なＩＶ投与によるそれを必要とする対象への投与であり得る。
組成物および方法は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡまたは他の修飾された核酸、またはそれらの組合せから形成される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの異なる核酸構築物を含むことができる。
組成物の有効量または治療有効量は、疾患または障害の１またはそれより多くの症状を処置、抑制、または軽減するために十分な投与量、あるいは、望ましい薬理学的および／または生理学的効果、例えば、疾患または障害の根底にある１またはそれより多くの病態生理学的機構の低減、抑制、または逆転を提供するために十分な投与量であり得る。
また、有効量は、抗体の不在下でのカーゴの投与と比較して、核酸カーゴの送達の速度、量、および／または質を増加させるのに有効な量でもあり得る。組成物の製剤は、投与様式に適合するように作られている。薬学的に許容され得るキャリアは、一部分、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複合体を含有する医薬組成物の幅広い種類の適した製剤が存在する。正確な投与量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康、臨床症状等）などの多様な要因によって異なることになる。
組成物は、１日に１回、２回、または３回；週に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回；月に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回、標的細胞に投与するか、そうでなければ他の方法で接触させることができる。例えば、一部の実施形態では、組成物は、２日もしくは３日おきに、または平均して週に約２～約４回投与される。したがって、一部の実施形態では、組成物は、２またはそれより多くの別個の処置を含む投与レジメンの一部として投与される。
投与レジメンには、２回またはそれより多くの投与間で投与量が変わらない維持レジメン、２回またはそれより多くの投与間で投与量が増加する漸増レジメン、２回またはそれより多くの投与間で投与量が減少する漸減レジメン、またはそれらの組み合わせが含まれる。
一部の実施形態では、最初の用量は低用量であってよい。用量の増加は、満足のいく生化学的または臨床応答に達するまで継続することができる。臨床応答は、処置されている疾患または障害、および／または望ましい結果によって異なる。一部の実施形態では、投与量は、好ましくは望ましくない毒性も誘発することなく治療効果が確認されるまで、またはその許容できる程度の高量まで、増加させることができる。次に、投与量を維持するか、または維持量まで着実に減らすことができる。これらの方法は、治療の投与レベル、投与頻度、または期間を標準化、最適化、またはカスタマイズするために使用することができる。
一般に、投与前に、特にインビボ投与の場合、抗体および核酸は、室温で一定期間混合される。一部の実施形態では、複合体形成の時間は、例えば、１分～３０分、または１０分～２０（それぞれ両端を含む）の範囲であり、好ましい複合体形成時間は約１５分である。抗体の用量は、０．０００１ｍｇ～１ｍｇ（それぞれ両端を含む）の範囲であり得、好ましい用量は約０．１ｍｇである。核酸の用量は、０．００１μｇ～１００μｇ（両端を含む）の範囲であり得、好ましい用量は１０μｇである。下記のインビボデータ（例えば、図６Ｂ）は、０．１ｍｇの３Ｅ１０、１０μｇのｍＲＮＡを使用し、１５分間複合体形成を行って作成された。
以下の例は、ＤＮＡカーゴが、より一般的に複数の組織に送達され、腫瘍に限定されない場合が多い一方で、ＲＮＡ送達は腫瘍組織に対してより選択的である場合が多いことを示し得る。したがって、一部の実施形態では、ＲＮＡカーゴは（例えば、単独で）、癌細胞または他の腫瘍組織に選択的に送達され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡカーゴのより広い分布が望まれる場合には、ＲＮＡをＤＮＡ（例えば、キャリアＤＮＡ）と混合して、非癌／腫瘍組織への送達を促進することができる。キャリアＤＮＡは、例えば、プラスミドＤＮＡまたは低分子量ＤＮＡ（例えばサケ精子由来）であってよい。一部の実施形態では、キャリアＤＮＡは非コードＤＮＡである。キャリアＤＮＡは、一本鎖または二本鎖またはそれらの組合せであってよい。一部の実施形態では、キャリアＤＮＡは、長さが１～１０、１～１００、１～１，０００、または１～１０，０００ヌクレオチド、またはその任意の下位範囲または整数、またはそれらの組合せを有する核酸で構成されている。通常、キャリアＤＮＡは抗体にコンジュゲートしていないか、あるいは共有結合していない。通常、キャリアＤＮＡは、カーゴ核酸（例えば、ＲＮＡ）および抗体と共インキュベートされ、それらとの複合体として同時送達される。一部の実施形態では、キャリアＤＮＡは非コードＤＮＡである。
Ａ．インビトロおよびエクスビボでの方法
インビトロおよびエクスビボでの方法の場合、細胞は通常、培養中に組成物と接触する。エクスビボでの方法の場合、細胞を対象から単離し、エクスビボで組成物と接触させて、１または複数のカーゴ核酸を含有する細胞を生成することができる。好ましい実施形態では、細胞は、処置する対象または同質遺伝子的な宿主から単離される。標的細胞は、組成物と接触する前に対象から取り出すことができる。
Ｂ．インビボでの方法
一部の実施形態では、核酸カーゴの細胞へのインビボ送達は、対象の疾患または障害の遺伝子編集および／または処置に使用される。通常、抗体－核酸カーゴを含む組成物は、インビボ治療のために対象に直接投与することができる。
一般に、抗体、オリゴヌクレオチドおよび関連分子を含む化合物を投与する方法は、当技術分野で周知である。特に、核酸治療にすでに使用されている投与経路は、現在使用されている製剤とともに、上記のドナーオリゴヌクレオチドのための好ましい投与経路および製剤を提供する。好ましくは、組成物は動物に注射または注入される。
組成物は、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、羊水内、筋肉内、皮下、または局所（舌下、直腸、鼻腔内、肺、直腸粘膜、および膣）、および経口（舌下、頬側）をはじめとする多くの経路によって投与することができる。
一部の実施形態では、組成物は、鼻腔内投与または経口吸入などの肺送達用に製剤化される。製剤の投与は、複合体がそれらの標的に到達することを可能にする任意の許容され得る方法によって達成されてよい。投与は、処置されている症状に応じて、局所的（すなわち、特定の領域、生理学的系、組織、臓器、または細胞型）であってもよいし、全身的であってもよい。インビボ送達のための組成物および方法は、ＷＯ２０１７／１４３０４２号にも考察されている。
この方法はまた、有効量の抗体－核酸複合体組成物を、胚または胎児、あるいはその妊娠中の母親にインビボで投与することも含み得る。一部の方法では、組成物は、臍静脈または臍帯静脈などの静脈または動脈、あるいは胚または胎児の羊膜嚢に組成物を注射および／または注入することによって子宮内に送達される。例えば、Ｒｉｃｃｉａｒｄｉら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８ Ｊｕｎ ２６；９（１）：２４８１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４８９４－２、およびＷＯ２０１８／１８７４９３号を参照されたい。
Ｃ．用途
目的のポリペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸カーゴ、例えば、ｍＲＮＡ、機能性核酸、ＤＮＡ発現構築物、ベクター等は、細胞内のポリペプチドの発現または抑制のために、３Ｅ１０抗体を使用して細胞に送達することができる。組成物および方法は、さまざまな異なる用途に使用することができる。限定されない例としては、ＣＲＩＳＰＲおよびｇＲＮＡ発現ベクター＋／－編集ＤＮＡ、大型のＤＮＡ（プラスミドおよび発現ベクター）の送達、遺伝子置換および遺伝子治療、例えばインビボまたはエクスビボでＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するため、およびインビボまたはエクスビボでＣＡＲ－Ｔ細胞の産生を単純化するためのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの送達、ｓｉＲＮＡの送達、ｍＲＮＡの送達等が挙げられる。遺伝子治療／遺伝子編集および免疫調節、特にキメラ抗原受容体Ｔ細胞産生に関する例示的な用途を以下に考察する。
１．遺伝子治療および編集
一部の実施形態では、組成物は遺伝子編集に使用される。例えば、この方法は、単一遺伝子の変異に起因する遺伝的欠損、障害および疾患を処置するために、例えば、点変異に起因する遺伝的欠損、障害および疾患を修正するために特に有用であり得る。標的遺伝子が遺伝性障害の原因となる変異を含んでいる場合、この方法を、標的遺伝子のＤＮＡ配列を正常に回復させることのできる変異原性修復に使用することができる。標的配列は、遺伝子のコードＤＮＡ配列内、またはイントロン内にある可能性がある。また、標的配列は、プロモーター配列またはエンハンサー配列をはじめとする標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内にある可能性もある。
本明細書の方法では、複合体と接触させた細胞を対象に投与することができる。対象は、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、またはリソソーム蓄積症などの疾患または障害を有していてよい。そのような実施形態では、遺伝子修飾、遺伝子置換、遺伝子付加、またはそれらの組合せは、対象の疾患または障害の１またはそれより多くの症状を軽減する有効量で起こり得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡカーゴは、ヌクレアーゼをコードする核酸、ドナーオリゴヌクレオチドまたはドナーオリゴヌクレオチドをコードする核酸、またはそれらの組合せを含む。
ａ．遺伝子編集ヌクレアーゼ
核酸カーゴには、標的細胞のゲノムで一本鎖または二本鎖切断を誘発する１つまたは複数のエレメントをコードするもの、および、必要に応じて、好ましくはドナーオリゴヌクレオチドなどの他のエレメント、および／または、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合にはｇＲＮＡなどの系の他のエレメントと組み合わせてコードするものが含まれる。組成物は、例えば、標的遺伝子の発現を低下させるかまたは他の点で修飾するために使用することができる。
ｉ．鎖切断誘導エレメント
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
一部の実施形態では、核酸カーゴは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集組成物の１またはそれより多くのエレメント、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集組成物の１またはそれより多くのエレメントをコードする核酸、またはそれらの組合せを含む。本明細書において使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集組成物とは、哺乳動物対象においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を実行するために必要なＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントを指す。以下でより詳細に考察されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集組成物は、通常、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ（またはガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡとも呼ばれるそのキメラ）およびＣａｓ９などのＣａｓ酵素をコードする１またはそれより多くの核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集組成物は、必要に応じて、標的部位（例えば、Ｃａｓ９により誘導される一本鎖または二本鎖切断部位）にあるかまたはそれに隣接する標的細胞のゲノムに組み換えることのできるドナーポリヌクレオチドを含むことができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物で使用するための遺伝子編集（特定の遺伝子のサイレンシング、強化または変更）として使用するために適応している（例えば、Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）およびＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－２１（２０１２）参照）。ｃａｓ遺伝子と特別に設計されたＣＲＩＳＰＲを含む必要なエレメントを細胞にトランスフェクトすることにより、生物のゲノムを任意の望ましい位置で切断し、修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用したゲノム編集で用いる組成物を調製する方法は、ＷＯ２０１３／１７６７７２号およびＷＯ２０１４／０１８４２３号に詳細に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
本明細書に開示される送達方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの多数のバリエーションとともに使用するのに適している。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するかまたはその活性を方向付ける転写物およびその他のエレメントを総称したものであり、それには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分のｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの状況下で「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡのプロセシングされたダイレクトリピート部分を含む）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの状況下で「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物が含まれる。ガイド配列に作動可能に連結された１またはそれより多くのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（例えば、ダイレクトリピート－スペーサー－ダイレクトリピート）は、プロセシング前にはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）またはヌクレアーゼによるプロセシング後にはｃｒＲＮＡとも呼ばれ得る。
以下でより詳細に考察されるように、一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは連結され、キメラｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成し、ハイブリッドでは成熟ｃｒＲＮＡが合成ステムループを介して部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合され、Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）およびＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－２１（２０１２））に記載されるように、天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。単一の融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物は、本明細書において、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ（またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））とも呼ばれる。ｓｇＲＮＡ内では、ｃｒＲＮＡ部分は、「標的配列」と識別されることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡは「スキャフォールド」と呼ばれることが多い。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１またはそれより多くのエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１またはそれより多くのエレメントは、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。
一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサーとも呼ばれる）を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の文脈において、「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、そこでは標的配列とガイド配列のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質内に位置する。
標的核酸において、各プロトスペーサーは、その認識が個々のＣＲＩＳＰＲシステムに特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に関連付けられている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列ＮＧＧである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列ＮＮＡＧＡＡＷである。ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡの間のヘテロ二重鎖形成を介してプロトスペーサーと必要なＰＡＭからなるＤＮＡ標的にＣａｓを方向づける。
通常、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの状況では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列とハイブリダイズし、１またはそれより多くのＣａｓ部分と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成により、標的配列内のまたはその付近（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれより多くの塩基対内）の一方または両方の鎖が切断される。また、ｔｒａｃｒ配列の全部または一部も、ガイド配列に作動可能に連結されているｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全部または一部へのハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。
望ましいＤＮＡ標的配列が特定されれば、専門家が適した標的部位を決定するのに役立つ多くのリソースが利用可能である。例えば、ヒトのエクソンの４０％以上を標的とする、生物情報学的に生成された約１９０，０００の潜在的なｓｇＲＮＡのリストをはじめとする、標的部位を選択し、その部位でのニックまたは二本鎖切断に影響を及ぼす関連ｓｇＲＮＡを設計する際に専門家を支援するための多数の公開リソースが、利用可能である。また、科学者が幅広い種でＣＲＩＳＰＲ標的部位を発見し、適切なｃｒＲＮＡ配列を生成するのに役立つように設計されたツールである、ｃｒｉｓｐｒ．ｕ－ｐｓｕｄ．ｆｒ／も参照されたい。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１またはそれより多くのエレメントの発現を推進する１またはそれより多くのベクターを標的細胞に導入し、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が１またはそれより多くの標的部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するようにする。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現した２またはそれより多くのエレメントを、単一のベクターにおいて、１またはそれより多くの追加のベクターと組み合わせて、最初のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの成分を提供してもよい。単一のベクターに組み合わされたＣＲＩＳＰＲシステムエレメントは、第２のエレメントに対して５’（「上流」）または３’（「下流」）に位置する１つのエレメントなど、任意の適した方向に配置されてよい。１つのエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同じまたは反対の鎖に位置していてもよく、同じまたは反対の方向に配向させることができる。一部の実施形態では、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、および１またはそれより多くのガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（必要に応じてガイド配列に作動可能に連結されている）、ならびに１またはそれより多くのイントロン配列に埋め込まれたｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロンに、２またはそれより多くの配列が少なくとも１つのイントロンに、またはすべての配列が単一のイントロンにある）をコードする転写物の発現を推進する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、同じプロモーターから発現する。
一部の実施形態では、ベクターには、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）などの１またはそれより多くの挿入部位が含まれる。一部の実施形態では、１またはそれより多くの挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの挿入部位）は、１またはそれより多くのベクターの１またはそれより多くの配列エレメントの上流および／または下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流に、そして必要に応じてｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に作動可能に連結された調節エレメントの下流に挿入部位を含み、それにより、ガイド配列が挿入部位に挿入された後の発現時にガイド配列はＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を真核細胞内の標的配列に指示する。一部の実施形態では、ベクターは、２またはそれより多くの挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位でガイド配列の挿入が可能になるように、２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の間に位置している。そのような配置では、２またはそれより多くのガイド配列は、シングルガイド配列の２またはそれより多くのコピー、２またはそれより多くの異なるガイド配列、またはこれらの組合せを含むことができる。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化することができる。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多くのガイド配列を含むことができる。一部の実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのそのようなガイド配列含有ベクターが提供され、必要に応じて細胞に送達され得る。
一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の限定されない例としては、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても公知）、ＣａｓｌＯ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、そのホモログ、またはその改変型が挙げられる。一部の実施形態では、未修飾のＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９などのＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の補体内などの標的配列の位置で一方または両方の鎖の切断を指示する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれより多くの塩基対内で一方または両方の鎖の切断を指示する。
一部の実施形態では、ベクターは、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸塩からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにするその他の変異の例としては、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２またはそれより多くの触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を変異させて、すべてのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く変異Ｃａｓ９を生成することができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ変異は、１またはそれより多くのＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ変異と組み合わされて、すべてのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素が生成される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異した酵素のＤＮＡ切断活性がその非変異型に対して約２５％、１０％、５％＞、１％＞、０．１％＞、０．０１％未満、またはそれよりも低い場合にすべてのＤＮＡ切断活性を実質的に欠いているとみなされる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞での発現に最適化されたコドンである。真核細胞は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含む哺乳動物などの特定の生物のものまたはそれに由来するものであり得る。一般に、コドン最適化とは、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれより多くのコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を修飾するプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する場合が多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。
選択されたｔＲＮＡが細胞内で優勢であることは、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば「コドン使用頻度データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は多くの方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列を最適化するコドンのためのコンピューターアルゴリズム、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）も利用可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１またはそれより多くのコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれより多くの、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンに一致する。
一部の実施形態では、ベクターは、１またはそれより多くの核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。１より多くのＮＬＳが存在する場合、１つのＮＬＳが、１より多くのコピーにも存在し、かつ／あるいは、１またはそれより多くのコピーに存在する１またはそれより多くの他のＮＬＳと組み合わせても存在することができるように、それぞれは他とは独立して選択されてよい。一部の実施形態では、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０以内のアミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸である場合に、ＮＬＳはＮ末端またはＣ末端の近くにあるとみなされる。
一般に、１またはそれより多くのＮＬＳは、真核細胞の核で検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積を推進するのに十分な強度を備えている。一般に、核局在化活性の強さは、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用する特定の１または複数のＮＬＳ、またはこれらの要因の組み合わせに由来し得る。
核内の蓄積の検出は、任意の適した技法で実行されてよい。例えば、細胞内の位置を、例えば核の位置を検出するための手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）と組み合わせて可視化することができるように、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させてもよい。細胞核は細胞から単離されてもよく、その内容物は、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイなどのタンパク質を検出するための任意の適切なプロセスによって分析されてもよい。核内の蓄積は、ＣＲＩＳＰＲ酵素または複合体に曝露されていない対照、または１またはそれより多くのＮＬＳを欠くＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較した、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の影響についてのアッセイ（例えば、標的配列でのＤＮＡ切断または変異についてのアッセイ、あるいはＣＲＩＳＰＲ複合体形成および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける遺伝子発現活性の変化についてのアッセイ）などによって、間接的に決定されてもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１またはそれより多くのエレメントは、Ｃａｓ９などの誘導性Ｃａｓが含まれ得る誘導性プロモーターの制御下にある。
Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）は、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（またはＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ）の異種発現により、哺乳動物の染色体の標的切断を達成することができることを報告した。そのため、本明細書に開示される方法で利用されるＣＲＩＳＰＲシステムと、したがってカーゴ核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含み得るＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントをコードする１またはそれより多くのベクターを含み得るベクターシステムであり、ここで、ポリヌクレオチド配列は、（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズできるガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、および（ｃ）ｔｒａｃｒ配列；ならびに、必要に応じて少なくとも１つまたはそれより多くの核局在化配列を含み得るＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。エレメント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３の方向に配置することができ、成分ＩおよびＩＩは、システムの同じまたは異なるベクター上に位置している。転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列はＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列の配列特異的結合を指示する。そして、ＣＲＩＳＰＲ複合体は（１）標的配列にハイブリダイズしたガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、さらに異種機能ドメインをコードする。一部の実施形態では、１またはそれより多くのベクターは、適したＣａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９もコードする。異なる遺伝的エレメントは、同じプロモーターの制御下であっても、異なるプロモーターの制御下であってもよい。
詳細は、設計されたさまざまなＣＲＩＳＰＲシステムによって異なる可能性があるが、全体的な方法論は類似している。ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＤＮＡ配列（利用可能な多くのオンラインツールの１つを使用して特定）を標的化することに関心のある専門家であれば、標的配列を含む短いＤＮＡフラグメントをガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入することができる。ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（約２０ヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つの形態（スキャフォールド）ならびに適したプロモーターおよび真核細胞で適切にプロセシングするために必要なエレメントを含む。そのようなベクターは、市販されている（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ参照）。システムの多くは、アニーリングされて二本鎖ＤＮＡを形成し、次にｓｇＲＮＡ発現プラスミドにクローン化されるカスタムの相補的オリゴに依存している。トランスフェクトされた細胞で同じまたは別々のプラスミドからｓｇＲＮＡと適切なＣａｓ酵素を共発現させると、所望の標的部位で（Ｃａｓ酵素の活性に応じて）一本鎖または二本鎖の切断が生じる。
ｉｉ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
一部の実施形態では、標的細胞のゲノムで一本鎖または二本鎖の切断を誘導するエレメントは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする１つまたは複数の核酸構築物である。したがって、核酸カーゴはＺＦＮをコードすることができる。
ＺＦＮは、通常、切断ドメインに連結されたジンクフィンガータンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である。最も一般的な切断ドメインは、ＩＩＳ型酵素のＦｏｋｌである。Ｆｏｋ１は、一方の鎖の認識部位から９ヌクレオチド、もう一方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６、１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら、Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）：４２７５－４２７９；Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２７６４－２７６８（１９９３）；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：８８３－８８７（１９９４ａ）；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２（１９９４ｂ）を参照されたい。１またはそれより多くのこれらの酵素（またはその酵素的機能フラグメント）は、切断ドメインの供給源として使用することができる。
原則として、目的のゲノム位置を標的にするように設計することができるＤＮＡ結合ドメインは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーのタンデムアレイであり得、その各々は、一般に標的ＤＮＡ配列の３～４ヌクレオチドを認識する。Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ドメインは、一般構造：Ｐｈｅ（時にはＴｙｒ）－Ｃｙｓ－（２～４アミノ酸）－Ｃｙｓ－（３アミノ酸）－Ｐｈｅ（時にはＴｙｒ）－（５アミノ酸）－Ｌｅｕ－（２アミノ酸）－Ｈｉｓ－（３アミノ酸）－Ｈｉｓを有する。複数のフィンガーを連結することにより（数は変動する：公開された研究ではモノマーあたり３～６本のフィンガーが使用されている）、ＺＦＮペアを１８～３６ヌクレオチド長のゲノム配列に結合するように設計することができる。
工学的手法には、限定されるものではないが、合理的設計およびさまざまな型の経験的選択手法が含まれる。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１またはそれより多くのアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、米国特許第６、１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，６１０，５１２号；同第６，７４６，８３８号；同第６，８６６，９９７号；同第７，０６７，６１７号；米国特許出願公開第２００２／０１６５３５６号；同第２００４／０１９７８９２号；同第２００７／０１５４９８９号；同第２００７／０２１３２６９号；および国際特許出願公開第ＷＯ９８／５３０５９号およびＷＯ２００３／０１６４９６号を参照されたい。
ｉｉｉ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
一部の実施形態では、標的細胞のゲノムで一本鎖または二本鎖の切断を誘導するエレメントは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする１つまたは複数の核酸構築物である。したがって、核酸カーゴはＴＡＬＥＮをコードすることができる。
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮに似た全体的な構造を有するが、主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインが、植物病原菌の転写因子であるＴＡＬエフェクタータンパク質に由来することである。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、それぞれ長さ約３４残基のアミノ酸リピートのタンデムアレイである。リピートは互いに非常に似ており、通常、それらは主に２つの位置（アミノ酸１２および１３、リピート可変二残基（ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）、またはＲＶＤと呼ばれる）で異なっている。各ＲＶＤは、４つの可能なヌクレオチドの１つに優先的に結合することを指定する。つまり、各ＴＡＬＥＮリピートは単一の塩基対に結合するが、ＮＮ ＲＶＤはグアニンに加えてアデニンに結合することを意味する。ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合は、ジンクフィンガータンパク質の結合に比べて機構的にあまり解明されていないが、それらの一見単純に見えるコードは、操作されたヌクレアーゼの設計に非常に有益であることが証明されることがあり得る。ＴＡＬＥＮは、ダイマーとしても切断し、比較的長い標的配列を有し（これまでに報告された最短のものはモノマーあたり１３ヌクレオチドに結合する）、結合部位間のスペーサーの長さについてＺＦＮほど厳しく要件が無いようである。モノマーおよびダイマーのＴＡＬＥＮは、１０より多くの、１４より多くの、２０より多くの、または２４より多くのリピートを含むことができる。
ＴＡＬを特定の核酸に結合するように操作する方法は、Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１－１１（２０１１）に記載されている。米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号は、ＴＡＬエフェクターおよびそれらを使用してＤＮＡを修飾する方法を開示している。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：１４３（２０１１）は、ＴＡＬトランケーションバリアントをＦｏｋｌヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することにより、部位特異的ヌクレアーゼ構造用のＴＡＬＥＮを作製することを報告した。得られたＴＡＬＥＮは、不死化したヒト細胞で遺伝子修飾を誘導することが示された。ＴＡＬＥ結合ドメインの一般的な設計原理は、例えば、ＷＯ２０１１／０７２２４６号に見出すことができる。
ｂ．ドナーポリヌクレオチド
本明細書に記載のゲノム編集システムのヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して、標的ＤＮＡに一本鎖または二本鎖切断を生成する。二本鎖切断は、２つの方法：非相同末端結合、および相同性指向修復、のいずれかで細胞によって修復されることができる。非相同端末結合（ＮＨＥＪ）では、二本鎖切断は、切断端を互いに直接ライゲーションすることによって修復される。そのため、新たな核酸材料が部位に挿入されることはないが、一部の核酸材料は失われ、欠失をもたらす可能性がある。相同性指向修復（ＨＤＲ）では、切断された標的ＤＮＡ配列と相同性をもつドナーポリヌクレオチドが、切断された標的ＤＮＡ配列の修復のための鋳型として使用され、その結果、遺伝情報がドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへ伝達される。そのため、新しい核酸材料をその部位に挿入／コピーすることができる。
したがって、一部の実施形態では、核酸カーゴは、ドナーポリヌクレオチドであるかまたはドナーポリヌクレオチドを含む。ＮＨＥＪおよび／または相同性指向修復による標的ＤＮＡの修飾を使用して、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子標識、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異等を誘発することができる。
したがって、ゲノム編集組成物によるＤＮＡの切断を使用して、標的ＤＮＡ配列を切断することによって、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を削除し、外因的に提供されるドナーポリヌクレオチドの不在下で細胞が配列を修復できるようにすることができる。あるいは、ゲノム編集組成物が、標的ＤＮＡ配列と相同性をもつ少なくともセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列を含む場合、これらの方法を、標的ＤＮＡ配列への核酸材料の付加、すなわち、挿入または置換（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等をコードする核酸の「ノックイン」）、タグの付加（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）、血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）の付加、遺伝子への調節配列の付加（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在性シグナル等）、核酸配列の修飾（例えば、変異の導入）などに使用することができる。そのため、この組成物は、例えば、遺伝子治療で使用されるような部位特異的、すなわち、「標的化された」方法、例えば遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子標識等で、ＤＮＡを修飾するために使用することができる。
ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列に挿入することが望ましい用途では、挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に提供される。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナーオリゴヌクレオチド」は、切断部位に挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、通常、切断部位のゲノム配列と十分な相同性、例えば、切断部位に隣接するヌクレオチド配列との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を、例えば、切断部位の約５０塩基以下、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内、または切断部位に直接隣接して有しており、相同性を有するゲノム配列との間で相同性指向修復をサポートする。ドナー配列は、通常、それが置き換えるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性指向修復をサポートするために十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に対して少なくとも１つまたはそれより多くの一塩基の変化、挿入、欠失、逆位または再配列を含むことがある。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同性指向修復により、標的領域で非相同配列が挿入されるように、相同性のある２つの領域に隣接する非相同配列を含む。
２．免疫調節
ａ．ＣＡＲ Ｔ細胞
開示される組成物および方法は、免疫受容体、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などのキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）を発現するリンパ球を調製する状況において特に有用である。人工免疫受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）としても公知であり、本明細書で称される）は、選択された特異性を細胞に移植する、操作された受容体である。以下でより詳細に考察されるように、考察される方法に従って修飾された細胞は、癌、感染症、炎症、および自己免疫疾患の処置のための様々な免疫治療において利用することができる。
特に好ましい実施形態では、キメラ抗原受容体カーゴをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡは、リンパ球などの免疫細胞に送達される。
カーゴは、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで免疫細胞に送達することができる。好ましい実施形態では、カーゴはｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、コストの削減、製造の容易さ、副作用の減少（例えば、サイトカインストーム、神経毒性、移植片対宿主病等）の１またはそれ以上を可能にすることができる。特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞治療を必要とする対象から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が採取され、本明細書に開示される組成物および方法を用いて１またはそれより多くのＣＡＲ Ｔ細胞構築物をコードするｍＲＮＡが採取した細胞に送達され、細胞が対象に戻される。一部の実施形態では、最初に細胞を採取してから対象に戻すまでのプロセスは、１週間またはそれ未満、例えば、１、２、３、４、５、６、または７日である。特定の実施形態では、最初に細胞を採取してから対象に戻すまでのプロセスは、１日または２日で、または１日未満で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３時間で行われる。
キメラ抗原受容体の設計及び開発のための戦略は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる、Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ；２５７（１）：．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３１（３５ｐａｇｅｓ）、ならびにＤｏｔｔｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（５）：８９９－８９０（２０１４），Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：３８６－９３（２０１３），Ｃｈａｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６５（５）：２００１－８（２００５），Ｊｅｎｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２５７（１）：１２７－１４４（２０１４），Ｅａｔｏｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：５２７－３５（２００２），Ｂａｒｒｅｔｔら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ．，６５：３３３－３４７（２０１４），Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９５６３０４，１３ ｐａｇｅｓ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１０／９５６３０４；および米国特許出願公開第２０１５／００１７１２０号、同第２０１５／０２８３１７８号、同第２０１５／０２９０２４４号、同第２０１４／００５０７０９号、および同第２０１３／００７１４１４号に概説されている。
ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性とＴ細胞の溶解能力および自己複製を組み合わせており、従来のＴ細胞に比べていくつか利点がある（Ｒａｍｏｓ ａｎｄ Ｄｏｔｔｉ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，１１：８５５－８７３（２０１１），Ｃｕｒｒａｎら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，１４：４０５－４１５（２０１２），Ｍａｈｅｒ，ＩＳＲＮ Ｏｎｃｏｌ．２０１２：２７８０９３（２０１２））。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）とは独立に、癌細胞を認識し、殺傷する。したがって、標的細胞の認識は、腫瘍がＭＨＣに制限されるＴ細胞認識を回避する一部の機構、例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子のダウンレギュレーションおよび欠陥のある抗原処理の影響を受けない。
キメラ免疫受容体は、１９８０年代に最初に開発され、元来、モノクローナル抗体の可変（抗原結合）領域とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよびβ鎖の定常領域を含んでいた（Ｋｕｗａｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９：９６０－９６８（１９８７））。１９９３年に、この設計は、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）由来のエクトドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣＤ３－ζに由来するシグナル伝達ドメインを有するエンドドメインを含むように変更された。その後のＣＡＲは、一般に、共刺激シグナル伝達エンドドメインを備えた同様の構造設計に従っている。したがって、本明細書の方法で利用されるＣＡＲ構築物は、抗原結合ドメインまたはエクトドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、エンドドメイン、およびそれらの組み合わせを含むことができる。
一部の実施形態では、エクトドメインはｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの親和性は、ＣＡＲ機能を予測する（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９（１２）：３１５３－６４（２０１３）、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３：７６４７－７６５３（２００４））。抗原結合およびその後の活性化は、可動性リンカー配列をＣＡＲに付加することによっても修飾することができ、これにより、２つの異なる抗原を認識することができる２つの別個のｓｃＦｖの発現が可能になる（Ｇｒａｄａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２：ｅ１０５（２０１３））（タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）とも呼ばれる）。タンデムＣＡＲＳは、抗原の発現量が少ない癌を個別に殺傷する際に効果が高い場合があり、単一の抗原喪失バリアントによる腫瘍免疫回避のリスクを低下させる場合もある。その他のエクトドメインには、ＩＬ１３Ｒα２（Ｋａｈｌｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：９１６０－９１６６（２００４），Ｂｒｏｗｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８（８）：２１９９－２０９（２０１２），Ｋｏｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８：５９４９－５９６０（２０１２）、ＮＫＧ２Ｄ－リガンドおよびＣＤ７０受容体、ペプチドリガンド（例えば、Ｔ１Ｅペプチドリガンド）、およびいわゆる「ユニバーサル・エクトドメイン」（例えば、ビオチン化モノクローナル抗体と接触した標的を認識するように設計されたアビジンエクトドメイン、またはＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体と接触した標的を認識するように設計されたＦＩＴＣ特異的ｓｃＦｖ（Ｚｈａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ，１０６：１５４４－１５５１（２００５），Ｂａｒｂｅｒら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，３６：１３１８－１３２８（２００８），Ｓｈａｆｆｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１１７：４３０４－４３１４（２０１１），Ｄａｖｉｅｓら、Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，１８：５６５－５７６（２０１２），Ｕｒｂａｎｓｋａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７２：１８４４－１８５２（２０１２），Ｔａｍａｄａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８：６４３６－６４４５（２０１２））が含まれる。
一部の実施形態では、ＣＡＲにはヒンジ領域が含まれる。エクトドメインはＣＡＲの特異性にとって重要であるが、エクトドメインと膜貫通ドメイン（ヒンジ領域）を繋ぐ配列も、ＣＡＲの長さおよび柔軟性に違いを生じさせることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能に影響を及ぼす可能性がある。ヒンジは、例えば、ＩｇＧ１などの免疫グロブリンに由来するＣＨ２ＣＨ３ヒンジ、またはそのフラグメントを含むことができる。例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋら（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９（１２）：３１５３－６４（２０１３））は、第３世代ＲＯＲ１特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞のエフェクター機能に対するＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ［２２９アミノ酸（ＡＡ）］、ＣＨ３ヒンジ（１１９ＡＡ）、および短いヒンジ（１２ＡＡ）の影響を比較し、「短いヒンジ」ＣＡＲを発現するＴ細胞が優れた抗腫瘍活性を有することを見出した一方で、他の研究者は、ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジが第１世代のＣＤ３０特異的ＣＡＲのエピトープ認識を損なうことを見出した（Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１０６７－１０７５（２０００））。
ヒンジ（またはヒンジドメインがない場合にはエクトドメイン）とシグナル伝達エンドドメインの間には、通常、膜貫通ドメインがあり、最も一般的には、ＣＤ３－ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８分子に由来する。ヒンジと同様に、膜貫通ドメインもＣＡＲ－Ｔ細胞エフェクター機能に影響を与えることができる。
抗原が認識されると、ＣＡＲエンドドメインは活性化および共刺激シグナルをＴ細胞に伝達する。Ｔ細胞の活性化は、細胞質ドメインに存在する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のＴＣＲ複合体の細胞質ＣＤ３－ζドメインへのリン酸化に依存している（Ｉｒｖｉｎｇら、Ｃｅｌｌ，６４：８９１－９０１（１９９１））。ＣＡＲエンドドメイン（ｅｎｄｏｍａｉｎｓ）の大半は、ＣＤ３－ζに由来する活性化ドメインを含むが、ＩｇＥ－γドメインのＦｃ受容体などのＩＴＡＭ含有ドメインを含み得るものもある（Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１８２－１８７（２００１））。
ＣＡＲを発現する細胞の標的特異性は、抗体／エクトドメインが認識する抗原によって決定される。開示される組成物および方法は、任意の抗原を標的とする構築物、およびその構築物を発現する細胞を作製するために使用され得る。免疫療法、特に癌免疫療法の状況において、多数の抗原、およびそれらを標的化するのに適したエクトドメインは周知である。ネイティブＴＣＲとは異なり、ｓｃＦｖベースのＣＡＲの大半は、細胞のＭＨＣによって処理および提示される内部抗原ではなく、細胞表面に発現する標的抗原を認識するが、ＣＡＲには、炭水化物および糖脂質を含むタンパク質エピトープ以外の構造を認識することができ（Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ；２５７（１）：．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３１（３５ｐａｇｅｓ））、したがって、潜在的な標的抗原のプールが増加するという従来のＴＣＲよりも優れた利点がある。好ましい標的には、癌細胞またはその周囲の間質でのみ発現する抗原（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１５：５３２３－５３３７（２００９））、例えば神経膠腫細胞に特異的なＥＧＦＲのスプライスバリアント（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（Ｓａｍｐｓｏｎら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０（５）：２６７－７５（２００８））が含まれる。しかし、ヒト抗原はこの要件を満たしており、標的抗原の大半が正常細胞で低レベルで発現するか（例えば、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、ＨＥＲ２）、および／または系統に制限される方法で発現する（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０）。
好ましい標的、およびそれらを標的化するＣＡＲは当技術分野で公知である（例えば、Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ；２５７（１）：．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３１（３５ｐａｇｅｓ）参照）。例えば、血液悪性腫瘍のＣＡＲ標的としては、限定されるものではないが、ＣＤ１９（例えば、Ｂ細胞）（Ｓａｖｏｌｄｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１２１：１８２２－１８２６（２０１１），Ｃｏｏｐｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１０５：１６２２－１６３１（２００５）；Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１０），Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７０９－２７２０（２０１２），Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７：Ｓ１５７（２００９），Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．，９：２７９－２８６（２００３），Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｂｌｏｏｄ，１１８：４８１７－４８２８（２０１１），Ｐｏｒｔｅｒら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６５：７２５－７３３（２０１１），Ｋａｌｏｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，３：９５ｒａ７３（２０１１），Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，５：１７７ｒａ３８（２０１３），Ｇｒｕｐｐら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２０１３））；ＣＤ２０（例えば、Ｂ細胞）（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１０），Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ，１１２：２２６１－２２７１（２００８），Ｗａｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１８：７１２－７２５（２００７），Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，９：５７７－５８６（２００４），Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，４：７５－８３（１９９８））；ＣＤ２２（例えば、Ｂ細胞）（（Ｈａｓｏら、Ｂｌｏｏｄ，１２１：１１６５－１１７４（２０１３））；ＣＤ３０（例えば、Ｂ細胞）（Ｄｉ Ｓｔａｓｉら、Ｂｌｏｏｄ，１１３：６３９２－６４０２（２００９），Ｓａｖｏｌｄｏら、Ｂｌｏｏｄ，１１０：２６２０－２６３０（２００７），Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：１１１６－１１１９（１９９８））；；ＣＤ３３（例えば、骨髄）（（Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：２７９１－２７９７（１９９８））；ＣＤ７０（例えば、Ｂ細胞／Ｔ細胞）（Ｓｈａｆｆｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１１７：４３０４－４３１４（２０１１））；ＣＤ１２３（例えば、骨髄）（Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉら、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１６１：３８９－４０１（２０１３））；Ｋａｐｐａ（例えば、Ｂ細胞）（Ｖｅｒａら、Ｂｌｏｏｄ，１０８：３８９０－３８９７（２００６））；Ｌｅｗｉｓ Ｙ（例えば、骨髄）（Ｐｅｉｎｅｒｔら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１７：６７８－６８６（２０１０），Ｒｉｔｃｈｉｅら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１３））；ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、骨髄）（Ｂａｒｂｅｒら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，３６：１３１８～１３２８（２００８）、Ｌｅｈｎｅｒら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，７：ｅ３１２１０（２０１２）、Ｓｏｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：２９５～３０５（２０１３）、Ｓｐｅａｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：６３８９～６３９８（２０１２））；ＲＯＲ１（例えば、Ｂ細胞）（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１３））が挙げられる。
固形腫瘍のＣＡＲ標的としては、限定されるものではないが、Ｂ７Ｈ３（例えば、肉腫、神経膠腫）（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ，２２：２０９－２１８（２００３））；ＣＡＩＸ（例えば、腎臓）（Ｌａｍｅｒｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２４：ｅ２０－ｅ２２．（２００６）），Ｗｅｉｊｔｅｎｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，７７：１８１－１８７（１９９８））；ＣＤ４４ ｖ６／ｖ７（例えば、子宮頚部）（Ｈｅｋｅｌｅら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６８：２３２－２３８（１９９６）），Ｄａｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５４：５１－６０（２００５）；ＣＤ１７１（例えば、神経芽細胞腫）（Ｐａｒｋら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１５：８２５－８３３（２００７））；ＣＥＡ（例えば、結腸）（Ｎｏｌａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５：３９２８－３９４１（１９９９））；ＥＧＦＲｖＩＩＩ（例えば、神経膠腫）（Ｂｕｌｌａｉｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．（２００９），Ｍｏｒｇａｎら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２３：１０４３－１０５３（２０１２））；ＥＧＰ２（例えば、癌腫）（Ｍｅｉｅｒら、Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ．，６５：７５６－７６３（２０１１），Ｒｅｎ－Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５１：４１７－４２３（２００２））；ＥＧＰ４０（例えば、結腸）（Ｄａｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：２８４－２９１（２０００）；ＥｐｈＡ２（例えば、神経膠腫、肺）（Ｃｈｏｗら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２１：６２９－６３７（２０１３））；ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）（例えば、乳房、肺、前立腺、神経膠腫）（Ｚｈａｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：５５６３－５５７４（２００９），Ｍｏｒｇａｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１８：８４３－８５１（２０１０），Ｐｉｎｔｈｕｓら、１１４：１７７４－１７８１（２００４），Ｔｅｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５：６９９－７０８（２００４），Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：６５７７－６５８２（１９９３），Ａｈｍｅｄら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１７：１７７９－１７８７（２００９），Ａｈｍｅｄら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１６：４７４－４８５（２０１０），Ｍｏｒｉｔｚら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：４３１８－４３２２（１９９４））；ＥｒｂＢ受容体ファミリー（例えば、乳房、肺、前立腺、神経膠腫）（Ｄａｖｉｅｓら、Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，１８：５６５－５７６（２０１２））；ＥｒｂＢ３／４（例えば、乳房、卵巣）（Ｍｕｎｉａｐｐａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１２８－１３４（２０００），Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２：１００１－１００８（１９９６））；ＨＬＡ－Ａ１／ＭＡＧＥ１（例えば、メラノーマ）（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８：１６０１－１６０８（２００１），Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：７８５３－７８５８（２００５））；ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－１（例えば、肉腫、メラノーマ）（Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０：３８６－３９５（２０１３））；ＦＲ－α（例えば、卵巣）（Ｈｗｕら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７８：３６１－３６６（１９９３），Ｋｅｒｓｈａｗら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：１２２１－１２２７（２００２），Ｋｅｒｓｈａｗら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：６１０６－６１１５（２００６），Ｈｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：３３６９－３３７３（１９９５））；ＦＡＰ（例えば、癌関連線維芽細胞）（Ｋａｋａｒｌａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１３））；ＦＡＲ（例えば、横紋筋肉腫）（Ｇａｔｔｅｎｌｏｈｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６：２４－２８（２００６））；ＧＤ２（例えば、神経芽細胞腫、肉腫、メラノーマ）（Ｐｕｌｅら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１４：１２６４－１２７０（２００８），Ｌｏｕｉｓら、Ｂｌｏｏｄ，１１８：６０５０－６０５６（２０１１），Ｒｏｓｓｉｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，９４：２２８－２３６（２００１））；ＧＤ３（例えば、メラノーマ、肺癌）（Ｙｕｎら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．，２：４４９－４５９（２０００））；ＨＭＷ－ＭＡＡ（例えば、メラノーマ）（Ｂｕｒｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７０：３０２７－３０３３（２０１０））；ＩＬ１１Ｒα（例えば、骨肉腫）（Ｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７２：２７１－２８１（２０１２））；ＩＬ１３Ｒα２（例えば、神経膠腫）（Ｋａｈｌｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：９１６０－９１６６（２００４），Ｂｒｏｗｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２），Ｋｏｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８：５９４９－５９６０（２０１２），Ｙａｇｈｏｕｂｉら、Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ．，６：５３－５８（２００９））；Ｌｅｗｉｓ Ｙ（例えば、乳房／卵巣／膵臓）（Ｐｅｉｎｅｒｔら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１７：６７８－６８６（２０１０），Ｗｅｓｔｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：１９０５１－１９０５６（２００５），Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：４０１－４０７（１９９８））；Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（例えば、中皮腫、乳房、膵臓）（Ｌａｎｉｔｉｓら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０：６３３－６４３（２０１２），Ｍｏｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１７：４７１９－４７３０（２０１１））；Ｍｕｅ１（例えば、卵巣、乳房、前立腺）（Ｗｉｌｋｉｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０：４９０１－４９０９（２００８））；ＮＣＡＭ（例えば、神経芽細胞腫、結腸直腸）（Ｇｉｌｈａｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２５：１３９－１５１（２００２））；ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、卵巣、肉腫（ｓａｃｏｍａ））（Ｂａｒｂｅｒら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，３６：１３１８－１３２８（２００８），Ｌｅｈｎｅｒら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３１２１０（２０１２），Ｓｏｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：２９５－３０５（２０１３），Ｓｐｅａｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８８：６３８９－６３９８（２０１２））；ＰＳＣＡ（例えば、前立腺、膵臓）（Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７：１１２１－１１３１（２００７），Ｋａｔａｒｉら、ＨＰＢ，１３：６４３－６５０（２０１１））；ＰＳＭＡ（例えば、前立腺）（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：７０－７５（２００２），Ｇｏｎｇら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．，１：１２３－１２７（１９９９））；ＴＡＧ７２（例えば、結腸）（Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１３：１１６３－１１７０（１９９７），ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１６５－１７３（１９９９））；ＶＥＧＦＲ－２（例えば、腫瘍血管系）（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０：３９５３－３９６８（２０１０），Ｎｉｅｄｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：７００９－７０１４（２００２））が挙げられる。
ｂ．代謝安定性
一部の実施形態では、細胞の（例えば、ＣＡＲ細胞の）代謝安定性は、インビボで制限されている、まさに成長因子を作製する能力を細胞が備えることによって改善される。一部の実施形態では、ＢＣＬ－ＸＬなどの抗アポトーシス因子をコードする核酸カーゴを、細胞に一過性に送達する。巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ＸＬ、またはＢＣＬ２様１アイソフォーム１）は、ミトコンドリアの膜貫通タンパク質である。これはＢｃｌ－２ファミリーのタンパク質のメンバーであり、カスパーゼの活性化を導くシトクロムｃなどのミトコンドリア内容物の放出を防ぐことにより、内因性アポトーシス経路で生存促進タンパク質として働く。ＢＣＬ－ＸＬをコードするアミノ酸配列と核酸配列の両方が当技術分野で公知であり、それには、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０７８１７（Ｂ２ＣＬ１＿ＨＵＭＡＮ）、アイソフォームＢｃｌ－Ｘ（Ｌ）（識別子：Ｑ０７８１７－１）（アミノ酸配列）；ＥＮＡ｜Ｕ７２３９８｜Ｕ７２３９８．１ Ｈｕｍａｎ Ｂｃｌ－ｘ ｂｅｔａ（ｂｃｌ－ｘ）ｇｅｎｅ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ（ゲノム核酸配列）；ＥＮＡ｜Ｚ２３１１５｜Ｚ２３１１５．１ Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｂｃｌ－ＸＬ ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ核酸配列）が含まれる。
一部の実施形態では、核酸カーゴ（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃａｒｇｏ）は、ＩＬ－２などの増殖誘導因子をコードしている。ＩＬ－２をコードするアミノ酸配列および核酸配列はいずれも当技術分野で公知であり、それには、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ６０５６８（ＩＬ２＿ＨＵＭＡＮ）（アミノ酸配列）；ＥＮＡ｜Ｘ００６９５｜Ｘ００６９５．１ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（ＩＬ－２）ｇｅｎｅ ａｎｄ ５’－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（遺伝子核酸配列）；およびＥＮＡ｜Ｖ００５６４｜Ｖ００５６４．１ Ｈｕｍａｎ ｍＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（ＩＬ－２）（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ核酸配列）が含まれる。
しかし、分泌されたＩＬ－２の産生はまた、リンパ腫およびＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激し、メモリーＴ細胞の形成を損なうという望ましくない副作用をもたらす可能性がある（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：１２３８－１２４３（２００５））。さらに、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）で処置した患者にＩＬ－２を使用すると、毒性が増加した（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９：４９６－５１０（２００８））。この可能性を回避するために、ＩＬ－２に加えて、またはＩＬ－２の代わりに、核酸カーゴは、外因性サイトカインに依存しない、細胞固有のＳＴＡＴ５サイトカインシグナルを付与するＩＬ－７Ｒα／ＣＤ１２７に繋がれたインターロイキン－７（ＩＬ－７）で構成されるものなどのキメラγｃサイトカイン受容体（ＣγＣＲ）をコードすることができる（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５６：１－１１（２０１３））。この設計は、ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２細胞質鎖をＩＬ－７Ｒα／ＣＤ１２７の細胞質鎖と交換してＳｈｃ活性を高めることができるモジュール式である。構築物は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の野生型ＩＬ－２シグナル伝達を模倣しており（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５６：１－１１（２０１３））、そのため、望ましくない副作用なくＩＬ－２ ｍＲＮＡと同様に作用するはずである。
さらに、あるいは他の抗アポトーシス分子およびサイトカインを用いて、細胞の生存率をネイティブな状態で維持することもできる。例示的な因子には、限定されるものではないが、以下が含まれる：
骨髄系細胞白血病１（ＭＣＬ－１）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０７８２０（ＭＣＬ１＿ＨＵＭＡＮ）（アミノ酸配列）；ＥＮＡ｜ＡＦ１４７７４２｜ＡＦ１４７７４２．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＬ１）ｇｅｎｅ，ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ（ゲノム核酸配列）；
抗アポトーシス因子であるＥＮＡ｜ＡＦ１１８１２４｜ＡＦ１１８１２４．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ１（ＭＣＬ１）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ核酸配列））；
ＩＬ－７（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１３２３２（ＩＬ７＿ＨＵＭＡＮ）（アミノ酸配列）；ＥＮＡ｜ＥＦ０６４７２１｜ＥＦ０６４７２１．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ７（ＩＬ７）ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（ゲノム核酸配列）；Ｔ細胞の生存および発達に重要なＥＮＡ｜Ｊ０４１５６｜Ｊ０４１５６．１ Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ７（ＩＬ－７）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ核酸配列）、および
ＩＬ－１５（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０９３３（ＩＬ１５＿ＨＵＭＡＮ）（アミノ酸配列）；ＥＮＡ｜Ｘ９１２３３｜Ｘ９１２３３．１ Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ＩＬ１５ ｇｅｎｅ（ゲノム核酸配列）；ＴおよびＮＫ細胞の生存を促進するＥＮＡ｜Ｕ１４４０７｜Ｕ１４４０７．１ Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ核酸配列））（Ｏｐｆｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４２６：６７１－６７６（２００３）；Ｍｅａｚｚａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８６１９２０，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／８６１９２０（２０１１）；Ｍｉｃｈａｕｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３３：３８２－３９０（２０１０））。これらのサイトカインｍＲＮＡは、独立に、またはＢＣＬ－ＸＬ、ＩＬ－２、および／またはＣγＣＲ ｍＲＮＡと組み合わせて使用することができる。したがって、一部の実施形態では、ＭＣＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの組合せをコードするｍＲＮＡが細胞に送達される。
ｃ．抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）
一部の実施形態では、Ｔ細胞治療は、一部の癌の処置に長期的な有効性と治癒の可能性を示したＣＡＲ細胞に送達されるが、それらの使用は、ドナーリンパ球注入後の移植片対宿主病を連想させる非癌性組織への損傷によって制限されている。開示される組成物および方法はいずれも、非特異的免疫抑制（例えば、免疫応答を抑制するために、Ｔ細胞に細胞増殖抑制または細胞毒性効果を発揮する高用量コルチコステロイド治療）、不可逆的なＴ細胞除去（例えば、いわゆる自殺遺伝子工学戦略）、またはそれらの組合せと組み合わせて使用することができる。しかし、一部の好ましい実施形態では、オフターゲット効果は、ＣＡＲ細胞に抑制性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）をコードする構築物を導入することにより低減される。腫瘍組織と標的外組織の両方に特異性を持つＴ細胞は、Ｔ細胞に導入された抗原特異的ｉＣＡＲを使用して標的外組織を保護することによって腫瘍だけに限定することができる（Ｆｅｄｏｒｏｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５：２１５ｒａ１７２（２０１３））。ｉＣＡＲは、強力な急性抑制性シグナル伝達ドメインと組み合わせた表面抗原認識ドメインを含み、活性化受容体（例えば、ＣＡＲ）の同時結合にもかかわらずＴ細胞の応答性を制限することができる。好ましい実施形態では、ｉＣＡＲは、抗原認識時のＴ細胞機能を特異的に抑制する膜貫通領域を介して免疫抑制性受容体（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦβ受容体ドミナントネガティブ類似体等）のシグナル伝達ドメインに融合した抑制性抗原に特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ＣＡＲ細胞が抑制性抗原を発現しない細胞（例えば、癌細胞）に遭遇すると、ｉＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、ＣＡＲの標的抗原に対してＣＡＲ誘導応答を開始することができる。ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１のいずれかの抑制性シグナル伝達ドメインを持つＰＳＭＡに特異的なｓｃＦｖを使用するＤＮＡ ｉ ＣＡＲは、（Ｆｅｄｏｒｏｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５：２１５ｒａ１７２（２０１３））で考察されている。
設計上の考慮点には、ＰＤ－１がＣＴＬＡ－４よりも強力な抑制剤であったこと、ＣＴＬＡ－４はＹ１６５Ｇ変異体を使用しない限り細胞質局在性を示したこと、およびｉＣＡＲ発現量が重要であるという知見が含まれる。
ｉＣＡＲは、細胞型に特異的な表面分子に対して設計することができる。一部の実施形態では、ｉＣＡＲは、特定の組織または細胞型に対するＴ細胞、ＮＫ細胞、または他の免疫細胞の反応性を防ぐように設計されている。
ｄ．内因性抑制性シグナル伝達の低減
一部の実施形態では、１またはそれより多くの抗原の発現を防ぐために細胞を再プログラムする核酸カーゴと細胞とを接触させる。例えば、一部の実施形態では、核酸カーゴは、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１などの抗原をコードするｍＲＮＡの発現を防ぐ干渉ＲＮＡであるかまたはそれをコードする。この方法は、ユニバーサル・ドナー細胞を調製するために使用することができる。同種異系抗原の発現を変化させるために使用されるＲＮＡは、単独で使用してもよいし、標的細胞の脱分化をもたらすＲＮＡと組み合わせて使用してもよい。
上記の項では、標的上／腫瘍外での細胞毒性を制限するために、人工ｉＣＡＲにおいて、例えばＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１からの抑制性シグナル伝達ドメインを利用した組成物および方法を提供しているが、追加的または代替的に、ＣＡＲ細胞における内因性抑制性シグナル伝達の発現を減少させ、ＣＡＲ細胞が敵対的な腫瘍微小環境の抑制性シグナルに耐性を持つようにすることにより、ＣＡＲ細胞の腫瘍上でのエフェクター効率を全体的に高めることができる。
ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１は、活性化と機能のさまざまな段階でＴ細胞を抑制する。ＣＴＬＡ－４は、自己抗原に対するＴ細胞応答を調節する。これは、ノックアウトマウスが、特定の抗原に曝露されずに、非常に活性の高い組織浸潤Ｔ細胞に起因する臓器障害を自発的に発症するためである（Ｔｉｖｏｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：５４１－５４７（１９９５）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：９８５－９８８（１９９５））。興味深いことに、Ｔｒｅｇ細胞におけるＣＴＬＡ－４の条件付きノックアウトは、グローバルノックアウトを再現し、それがＴｒｅｇ内で正常に機能していることを示している（Ｗｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：２７１－２７５（２００８））。対照的に、ＰＤ－Ｌ１ノックアウトマウスは自己免疫を起こしやすいが、正常な臓器に大量の炎症細胞の浸潤が自然に生じることはなく、その主な生理機能が、誘導可能な方法で、進行中の組織炎症の負のフィードバック制御を媒介することであることを示している（Ｄｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０：３２７－３３６（２００４））。実際、「適応抵抗性」仮説によれば、ほとんどの腫瘍は、ＣＡＲＴ細胞をはじめとするエフェクターＴ細胞よって放出される重要なサイトカインであるＩＦＮγに応答してＰＤ－Ｌ１をアップレギュレートする（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：５１５－５４８（２００５）；Ｃａｒｒｅｎｏら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０：２９－５３（２００２）；Ｃｈｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２５：３３８４－３３９１（２０１５）；Ｋｅｉｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２６：６７７－７０４（２００８）；Ｐｅｎｔｃｈｅｖａ－Ｈｏａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２９：６７－８７（２００９））。次に、ＰＤ－Ｌ１は、抑制性シグナルをＴ細胞に送達し、その増殖、サイトカインおよびパーフォリンの産生を減少させる（Ｂｕｔｔｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２７：１１１－１２２（２００７）；Ｃｈｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４：３３６－３４７（２００４）；Ｐａｒｋら、Ｂｌｏｏｄ，１１６：１２９１－１２９８（２０１０）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：４９２－４９９（２０１１）；Ｚｏｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８：４６７－４７７（２００８））。さらに、癌細胞でのＴ細胞からＢ７－Ｈ１を介した逆のシグナル伝達は、Ｆａｓ－Ｌシグナル伝達に対抗する抗アポトーシス作用を誘導する（Ａｚｕｍａら、Ｂｌｏｏｄ，１１１：３６３５－３６４３（２００８））。Ａｚｕｍａら、Ｂｌｏｏｄ，１１１：３６３５－３６４３（２００８）
癌細胞によるＢ７－Ｈ１のアップレギュレーションと、その発現と癌の進行および臨床転帰不良との関連を考慮すると（Ｆｌｉｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３０：２５１－２６０（２００７）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１：１４１－１５１（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３４４：２４５－２６７（２０１１））、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４経路に拮抗する抗体は、固形腫瘍、特にメラノーマで劇的な有効性を示し、この２つの組合せはさらに多くの活性を示している。抗ＣＴＬＡ－４抗体であるイピリムマブは、主にＴｒｅｇ細胞の抑制により、腫瘍へのＴ細胞浸潤の増加と腫瘍内ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比の増加により、転移性メラノーマの全生存期間を改善する（Ｈａｍｉｄら、Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，９：２０４（２０１１）；Ｒｉｂａｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａｎ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：６２６７－６２７６（２００９）；Ｔｗｙｍａｎ－Ｓａｉｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ，５２０：３７３－３７７（２０１５））。抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブは、転移性メラノーマの全体の奏功率が３０～４０％であり（Ｒｏｂｅｒｔら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７２：３２０－３３０（２０１５）；Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３２：１０２０－１０３０（２０１４））、転移性腎癌、非小細胞肺癌および再発ホジキンリンパ腫をはじめとするその他の固形腫瘍の初期臨床試験でも同様の所見が見られる（Ａｎｓｅｌｌら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７２：３１１－３１９（２０１５）；Ｂｒａｈｍｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２８：３１６７－３１７５（２０１０）；Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３６６：２４４３－２４５４（２０１２））。マウスメラノーマモデルにおける抗ＣＴＬＡ－４抗体への耐性は、ＰＤ－Ｌ１８１のアップレギュレーションによるものであるため、イピリムマブとニボルマブの両方の組み合わせは、マウスモデルとヒト患者の両方でさらなる有効性を示す（Ｌａｒｋｉｎら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７３：２３－３４（２０１５）；Ｓｐｒａｎｇｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ，２，３，ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５１－１４２６－２－３（２０１４）；Ｙｕら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａｎ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：６０１９－６０２８（２０１０））。チェックポイント阻害経路の重要性を考えると、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４阻害はブレーキを解除し、キメラ抗原受容体はアクセルペダルを踏み込むと考えられている。重要なことに、一時的な送達は、これらの細胞が将来の自己免疫疾患を引き起こさないように、一時的にブレーキを解除するためにのみ利用できる。
ｉ．ＣＲＩＳＰＲｉ
永続的なゲノム修飾ならびにＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などの抑制性シグナルの不活性化を回避するために、ｄＣＡＳ９ ＣＲＩＳＰＲｉシステム（Ｌａｒｓｏｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，８：２１８０－２１９６（２０１３））を利用することができる。酵素的に不活性なｄＣＡＳ９－ＫＲＡＢ－抑制ドメイン、融合タンパク質、および抑制性シグナル伝達タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦβ受容体ドミナントネガティブ類似体等）に対するｓｇＲＮＡをコードする核酸は、ＣＡＲ細胞に同時送達することができる。１つまたは複数のｓｇＲＮＡを利用することができる。ｓｇＲＮＡは、近位プロモーター領域およびコード領域（非鋳型鎖）を標的とするように設計することができる。別のアプローチでは、電気穿孔して発現させるための低分子ＲＮＡである、単一成分Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲシステムが利用される（Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８（２０１５））。前述のＲＮＡ成分はいずれも、ベクター、例えばプラスミドなどのＤＮＡ発現構築物にコードされる得る。したがって、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せはいずれも核酸カーゴとして機能することができる。
イピリムマブによるＣＴＬＡ－４の広範な抑制は自己免疫後遺症を引き起こすが、これらの副作用はＣＡＲ細胞への喪失とｍＲＮＡ送達の一過性の性質を制限することによって減少すると考えられている。抑制機能は、やがて回復する。
ｉｉ．抑制性ＲＮＡ
細胞に送達され得る核酸カーゴは、抑制性シグナル伝達分子ｍＲＮＡの発現または翻訳を標的化し、低減または抑制するように；あるいは抑制性シグナル伝達分子タンパク質の発現を減少または抑制し、その活性を低下させ、またはその分解を増加させるように設計された機能性核酸またはポリペプチドであるか、またはそれをコードすることができる。適切な技術には、限定されるものではないが、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ等が含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、抑制性シグナル伝達を減少させるアンタゴニストポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦβ受容体ドミナントネガティブ類似体等の発現を単独でまたは組み合わせて減少させるかまたはサイレンシングするのに適した機能的ＲＮＡであるかまたはそれをコードするカーゴを細胞に送達することができる。
一部の実施形態では、カーゴは、バイオアベイラビリティを低下させるか、あるいはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦβ受容体ドミナントネガティブ類似体、または免疫抑制経路の別のタンパク質のアンタゴニストまたは他の負の制御因子または抑制剤として機能するポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。タンパク質は、パラ分泌、内分泌、または自己分泌であってよい。それは細胞内部で細胞を調節することができる。それは分泌され、発現細胞および／または他の（例えば、近隣）細胞を調節することができる。それは、発現細胞および／または他の細胞を調節する膜貫通タンパク質であり得る。タンパク質は、融合タンパク質、例えば、Ｉｇ融合タンパク質であり得る。
ｅ．アポトーシス促進因子
アポトーシス経路を活性化および再活性化するための組成物および方法も提供される。一部の実施形態では、核酸は、内因性アポトーシス経路を活性化、再活性化、または他の点で増強または増加させる因子または薬剤であるか、またはそれをコードする。好ましくは、この因子は、癌（例えば、腫瘍）細胞における内因性アポトーシス経路を活性化、再活性化、または他の点で増強し、より好ましくは、癌細胞に特異的であるかまたは標的化されている。
一部の実施形態では、細胞は、抗アポトーシス因子または増殖促進因子、例えば上記で考察されたものあるいは当技術分野で公知のものなどの送達の後には、未処理細胞よりも誘導されたアポトーシスに対する耐性が高いかまたは感受性が低い。アポトーシス促進因子は、例えば、処置されたＴ細胞と比較して未処置細胞でアポトーシスを誘導または増加させることができ、好ましくは、癌細胞に対して選択的である。レジメンは、癌細胞に対して、１つは細胞攻撃でありもう１つは分子攻撃である二面攻撃をもたらす。
内因性アポトーシス経路は、ＢＣＬ－２ファミリーのメンバーを標的とすることにより、活性化、再活性化、または他の点で増強することができる。ＢＣＬ－２ファミリーメンバーは、機能およびＢｃｌ－２相同（ＢＨ）ドメインに基づいて３つのサブグループ：マルチドメイン抗アポトーシス性（例えば、ＢＣＬ－２またはＢＣＬ－ＸＬ）、マルチドメインアポトーシス促進性（例えば、ＢＡＸおよびＢＡＫ）、およびＢＨ３のみのアポトーシス促進性（例えば、ＢＩＭ）タンパク質、に分類される。ＢＩＭなどのＢＨ３のみのサブグループのメンバーは、細胞全体に位置する死の番人として機能し、細胞傷害のさまざまな生理学的および病理学的シグナルを、ミトコンドリアに位置する中心的なアポトーシス機構に伝達する態勢を整えている（Ｄａｎｉａｌら、Ｃｅｌｌ，１１６：２０５－２１９（２００４））。
一部の実施形態では、アポトーシス促進因子は、アポトーシス促進性ＢＨ３模倣物である。さまざまなアポトーシス促進性ＢＨ３模倣物は、ＢＩＭの本来のアポトーシス促進活性をシミュレートし、アポトーシス経路の複数のポイントを操作する機能を提供することができる。例えば、ＢＩＭ ＳＡＨＢ（ＢＣＬ－２ドメインの安定化αヘリックス）、ＡＢＴ－７３７およびＡＢＴ－１９９は、アポトーシス促進性ＢＨ３のみのヘリカルドメインと、抗アポトーシスタンパク質のＢＨ１、ＢＨ２およびＢＨ３ドメインの合流により形成された疎水性の溝との間の相互作用の構造研究により設計されたアポトーシス促進性ＢＨ３模倣物である（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら、Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７－６８１（２００５））。
Ｄ．標的細胞
一部の実施形態では、１またはそれより多くの特定の細胞型または組織が、開示される複合体の標的である。標的細胞は、インビトロ、エクスビボまたは対象内（すなわち、インビボ）であり得る。本明細書で考察される用途は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実行され得る。エクスビボでの用途の場合、細胞を収集または単離し、培養で処置することができる。エクスビボで処置された細胞は、それを必要とする対象に治療上有効な量で投与することができる。インビボでの用途の場合、カーゴは、標的細胞に、例えば、組成物の循環、局所送達等に基づいて受動的に送達されることができ、または、例えば、追加の細胞、組織、臓器特異的標的化部分を用いて能動的に標的化することができる。したがって、一部の実施形態では、カーゴは、他の細胞を排除して標的細胞に送達される。一部の実施形態では、カーゴは、標的細胞および非標的細胞に送達される。
標的細胞は、所望の処置および治療、ならびに核酸カーゴの意図される効果に基づいて専門家によって選択され得る。例えば、核酸カーゴが細胞死を誘発することを意図している場合、標的細胞は癌細胞であり得る。核酸カーゴがゲノムの変化を誘発することを意図している場合、標的細胞は幹細胞であり得る。核酸カーゴがキメラ抗原受容体をコードしている場合、標的細胞は免疫細胞であり得る。
３Ｅ１０ ｓｃＦｖは、ＥＮＴ２依存的に細胞核に透過可能であり、ＥＮＴ２欠損細胞では核への取り込み効率が大きく損なわれることが以前に示されている（Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，２０７９０－２０７９３（２００７））。ＥＮＴ２（ＳＬＣ２９Ａ２）は、プリンとピリミジンのヌクレオシドおよび核酸塩基の輸送に関与するナトリウム非依存性の輸送体であり、ＥＮＴ１よりもニトロベンジルメルカプトプリンリボシド（ＮＢＭＰＲ）に対する感受性が低い。
一部の実施形態では、標的細胞はＥＮＴ２をその血漿メンバー、その核膜、または両方で発現する。ＥＮＴ２の発現は比較的広範に分布しているが、組織および細胞型によって量が異なる。これは、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺および腎臓で確認されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９９７．３２８（Ｐｔ ３）：ｐ．７３９－４３，Ｃｒａｗｆｏｒｄら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８．２７３（９）：ｐ．５２８８－９３）。他の輸送体と比較して、ＥＮＴ２は、骨格筋でのｍＲＮＡ発現が最も高いものの１つである（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ，２００４．４４７（５）：ｐ．７３５－４３，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７．２９３（５）：ｐ．Ｒ１８０９－２２）。したがって、一部の実施形態では、標的細胞は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、腎臓、または骨格筋である。ＥＮＴ２が骨格筋で高発現されるため、開示される組成物および方法は、核酸カーゴをこれらの細胞に送達するのに特に効果的であり得、さらに／あるいは、より低いレベルのＥＮＴ２を発現する他の細胞と比較して、高レベルのカーゴがこれらの細胞に送達され得る。
追加の限定されない例示的な標的細胞を以下で考察する。
１．前駆細胞と幹細胞
細胞は、造血前駆細胞または幹細胞であり得る。一部の実施形態では、特に遺伝子編集および遺伝子治療に関するものでは、標的細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。ＣＤ３４＋細胞などの造血幹細胞（ＨＳＣ）は、赤血球をはじめとするすべての血液細胞型を生じさせる多能性幹細胞である。
幹細胞は、当業者によって単離および濃縮され得る。ＣＤ３４＋およびその他の細胞のそのような単離および濃縮のための方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９６５，２０４号；同第４，７１４，６８０号；同第５，０６１，６２０号；同第５，６４３，７４１号；同第５，６７７，１３６号；同第５，７１６，８２７号；同第５，７５０，３９７号および同第５，７５９，７９３号に開示されている。本明細書において使用する場合、造血前駆細胞および幹細胞の濃縮された組成物の文脈で、「濃縮された」とは、望ましい要素（例えば、造血前駆細胞および幹細胞）の割合が、細胞の天然源に見られる割合よりも高いことを示す。細胞の組成は、細胞の天然源よりも少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは１０、１００、２００または１０００桁濃縮されていてもよい。
ヒトにおいて、ＣＤ３４＋細胞は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）などの造血成長因子を、骨髄腔から末梢循環への造血幹細胞の移動を引き起こすのに十分な量で皮下にまたは静脈内にドナーに注射することによってもたらされるサイトカイン動員の後に、臍帯血、骨髄または血液から回収することができる。初めは、骨髄細胞は、骨髄の任意の適した供給源、例えば脛骨、大腿骨、脊柱、およびその他の骨腔などから入手してよい。骨髄を分離するために、適切な溶液を使用して骨を洗い流してよく、この溶液は、一般に約５～２５ｍＭの低濃度の許容され得る緩衝液とともに、ウシ胎児血清または他の天然に存在する因子を便利に補充した平衡塩類溶液となる。便利な緩衝液には、Ｈｅｐｅｓ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。
細胞は、ポジティブおよびネガティブ選択技術によって選択することができる。細胞は、造血前駆細胞または幹細胞表面抗原、例えばＣＤ３４に結合する市販の抗体を使用して、当業者に公知の方法を使用して選択することができる。例えば、抗体を、磁気ビーズに結合させ、免疫原性手順を利用して所望の細胞型を回復してよい。他の技術は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の使用を含む。ＣＤ３４抗原は、白血病でない個体の造血系内の前駆細胞に見出され、モノクローナル抗体ＭＹ－１０によって認識される（すなわち、ＣＤ３４抗原を発現する）細胞集団に発現し、骨髄移植用の幹細胞の分離に使用することができる。アメリカ培養細胞系統保存機関（メリーランド州ロックビル）にＨＢ－８４８３として寄託されたＭＹ－１０は、抗ＨＰＣＡ１として市販されている。さらに、ヒト骨髄から分化した「専用」細胞のネガティブ選択を利用して、実質的にあらゆる所望の細胞マーカーに対して選択することができる。例えば、前駆細胞または幹細胞、最も好ましくはＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３－、ＣＤ７－、ＣＤ８－、ＣＤ１０－、ＣＤ１４－、ＣＤ１５－、ＣＤ１９－、ＣＤ２０－、ＣＤ３３－、クラスＩＩ ＨＬＡ＋およびＴｈｙ－１＋のいずれかであると特徴づけることができる。
前駆細胞または幹細胞が単離されると、それらを任意の適した培地で成長することによって増殖させてよい。例えば、前駆細胞または幹細胞は、因子の分泌に関連する骨髄または肝臓から得られるものなどの間質細胞由来の馴化培地、または幹細胞の増殖を支持する細胞表面因子を含む培地で成長させることができる。間質細胞は、望ましくない細胞を除去するための適切なモノクローナル抗体を用いて造血細胞から取り除いてよい。
単離された細胞をエクスビボで抗体と核酸カーゴの複合体と接触させる。カーゴが送達された細胞は、修飾された細胞と呼ばれ得る。複合体の溶液は、単に培養中の細胞に添加してもよい。Ｓ期の細胞を同期させることが望ましい場合がある。例えば、二重チミジンブロックによって培養細胞を同期するための方法は、当技術分野で公知である（Ｚｉｅｌｋｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：１０７－１２１（１９７４））。
修飾された細胞は、対象に投与する前に培養中で維持または増殖させることができる。培養条件は、細胞型に応じて一般に当技術分野で公知である。特にＣＤ３４＋を維持するための条件はよく研究されており、いくつかの適した方法が利用可能である。エクスビボでの多能性造血細胞増殖への一般的なアプローチは、インターロイキン－３などの早期作用性サイトカインの存在下で精製された前駆細胞または幹細胞を培養することである。また、造血前駆細胞をエクスビボで維持するための栄養培地に、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ；すなわち、ｆｌｔ３遺伝子産物のリガンド）の組合せを含めることが、原始的な（すなわち、比較的分化していない）ヒト造血前駆細胞をインビトロで増殖するのに有用であることと、それらの細胞がＳＣＩＤ－ｈｕマウスで生着することが可能であることも示された（Ｌｕｅｎｓら、１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：１２０６－１２１５）。他の既知の方法では、細胞は、マウスプロラクチン様タンパク質Ｅ（ｍＰＬＰ－Ｅ）またはマウスプロラクチン様タンパク質Ｆ（ｍＰＩＰ－Ｆ；集合的にｍＰＬＰ－Ｅ／ＩＦ）を含む栄養培地で（例えば、数分、数時間、または３、６、９、１３、またはそれより多くの日間）エクスビボで維持することができる（米国特許第６，２６１，８４１号）。他の適した細胞培養および増殖方法も同様に使用することができることは理解されよう。細胞は、米国特許第５，９４５，３３７号に記載されるように無血清培地で成長させることもできる。
もう一つの実施形態では、修飾された造血幹細胞は、当技術分野で周知の方法を使用して対象に投与する前に、インターロイキンと成長因子の特定の組合せを使用してエクスビボでＣＤ４＋細胞培養に分化する。細胞は、単離された造血幹細胞の元の集団と比較して、エクスビボで大量に、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２０倍の細胞に増殖させてもよい。
別の実施形態では、細胞は、脱分化した体細胞であり得る。体細胞は、造血前駆細胞になるように誘導することができる、多能性幹様細胞になるように再プログラムすることができる。次に、造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して上記のような組成物で処置することができる。再プログラムされ得る代表的な体細胞には、限定されるものではないが、線維芽細胞、脂肪細胞、および筋細胞が含まれる。誘導幹様細胞からの造血前駆細胞は、マウスで首尾よく開発された（Ｈａｎｎａ、Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９２０－１９２３（２００７））。
誘導された幹様細胞から造血前駆細胞を生成するために、体細胞を宿主から採取する。好ましい実施形態では、体細胞は自己線維芽細胞である。細胞を培養し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃ転写因子をコードするベクターで形質導入する。形質導入された細胞は培養され、胚性幹細胞（ＥＳ）の形態と、限定されるものではないが、ＡＰ、ＳＳＥＡ１、およびＮａｎｏｇをはじめとするＥＳ細胞マーカーについてスクリーニングされる。形質導入されたＥＳ細胞は培養され、誘導されて、誘導された幹様細胞を生成する。次に、細胞をＣＤ４１およびｃ－ｋｉｔマーカー（初期造血前駆細胞マーカー）、ならびに骨髄および赤血球分化のマーカーについてスクリーニングする。
次に、修飾された造血幹細胞または、例えば、誘導された造血前駆細胞をはじめとする修飾された細胞が、対象に導入される。細胞の送達は、さまざまな方法を使用して実施する（ａｆｆｅｃｔｅｄ）ことができ、最も好ましくは、注入による静脈内投与、ならびに骨膜、骨髄および／または皮下部位への直接デポー注射が含まれる。
修飾された細胞を投与される対象は、細胞の生着を強化するための骨髄のコンディショニングのために処置されてよい。レシピエントは、細胞の投与前の放射線または化学療法による処置を用いて、生着を強化するように処置されてよい。投与すると、細胞は一般に生着するのに一定期間を必要とする。造血幹細胞または前駆細胞の有意な生着を達成するには、通常、数週間から数ヶ月かかる。
修飾された造血幹細胞の高い生着率は、有意な予防効果または治療効果を達成するために必要ではない場合もある。生着した細胞は、生着後、時間の経過とともに増殖して、修飾された細胞の割合を増加させると考えられている。場合によっては、予防効果または治療効果を得るために必要な修飾された造血幹細胞の生着は、ごく少数または少ない割合となると考えられている。
好ましい実施形態では、対象に投与される細胞は、自家、例えば、対象に由来するか、または同質遺伝子的である。
２．胚
一部の実施形態では、組成物および方法は、インビトロで胚細胞にカーゴを送達するために使用することができる。この方法は、通常、インビトロで胚を有効量の抗体－カーゴＤＮＡと接触させて、胚へのカーゴの形質導入を改善することを含む。胚は、単一の細胞接合子であってよいが、受精前および受精中の雄および雌の配偶子、ならびに、接合子だけでなく桑実胚および芽細胞も含む、２、４、８、または１６個の細胞を有する胚の処置も提供される。一部の実施形態では、胚は、体外受精中または受精後の培養０～６日目に組成物と接触させる。
接触は、胚を浸す液体培地に組成物を加えることであってよい。例えば、組成物を胚の培地に直接ピペットで移し、その後、それらを胚に取り込ませることができる。
３．免疫細胞
一部の実施形態では、標的細胞は、１またはそれより多くの種類の免疫細胞である。例えば、免疫調節およびＣＡＲに基づく治療のために、さまざまな種類の細胞を利用するか、あるいは標的化することができる。好ましい標的化された／操作されたＴ細胞は、腫瘍および養子治療の目標に応じてさまざまであり得る。エフェクターＴ細胞は、高レベルのエフェクターサイトカインを分泌し、インビトロで腫瘍標的を効果的に殺傷するために、一般的に好ましい（Ｂａｒｒｅｔｔら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ．，６５：３３３－３４７（２０１４）。ＣＡＲを介して強い細胞毒性をもつ２つの補完的なリンパ球集団は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を使用すると、抑制性Ｔ－ｒｅｇ細胞の存在が増加し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性が弱まる。再プログラムされたＣＤ８＋Ｔ細胞はリンパ節での活性化を必要とせずに腫瘍細胞に直接作用するように事前に活性化されているため、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサポートは必須ではない。
さらに、ナイーブＴ細胞（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２５：３２３－３８８（１９７７））、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：２９４－３０５（２００８））、Ｔｈ１７細胞（Ｐａｕｌｏｓら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２：５５－７８（２０１０））、およびＴ幹メモリー細胞（Ｔ ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７：１２９０－１２９７（２０１２））の注入はすべて、例えばその高い複製能力のために、特定の用途で特定の利点があり得るという証拠がある。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）も、その抗原特異性のために特定の利点を有し、本明細書に開示される送達戦略で使用され得る。
時にはＣＡＲ細胞、ＣＡＲ免疫細胞、およびＣＡＲＴ細胞（またはＣＡＲ Ｔ細胞）と呼ばれることもあるが、本明細書に開示されるＣＡＲおよびその他の送達戦略は、他の細胞型、特に本明細書で考察されるもの（例えば、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、マクロファージ等）および他所にも記載されているものを含む、異なる型の免疫細胞でも実行することができることが理解されよう（例えば、Ｂａｒｒｅｔｔら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ．，６５：３３３－３４７（２０１４）参照）。
４．癌細胞および腫瘍
一部の実施形態では、標的細胞は癌細胞である。そのような実施形態では、腫瘍治療を含む、癌の状況において有用であり得る処置方法が提供される。以下の例は、ＤＮＡカーゴが、より一般的に複数の組織に送達され、腫瘍に限定されない場合が多い一方で、ＲＮＡ送達は腫瘍組織に対してより選択的である場合が多いことを示し得る。したがって、一部の実施形態では、癌細胞が標的細胞である場合、カーゴはＲＮＡ（例えば、ＲＮＡのみ）で構成されていてもよい。
癌細胞に送達され得るカーゴとしては、限定されるものではないが、１またはそれより多くのアポトーシス促進因子、免疫原性因子、または腫瘍抑制因子の発現用の構築物；遺伝子編集組成物、癌遺伝子を標的化する抑制性核酸；ならびに本明細書および他所で考察されるその他の戦略が挙げられる。一部の実施形態では、カーゴは、アポトーシス促進因子、または細胞に対する免疫応答を増加させる免疫原性因子をコードするｍＲＮＡである。他の実施形態では、カーゴは、癌遺伝子またはその他の癌を引き起こす転写物の発現を減少させるｓｉＲＮＡである。
成熟した動物では、通常、ほとんどの臓器や組織で細胞の再生と細胞死のバランスが保たれている。体内のさまざまな種類の成熟細胞には、一定の寿命がある。これらの細胞が死ぬと、さまざまな種類の幹細胞の増殖および分化によって新しい細胞が生成される。通常の状況下では、新しい細胞の産生は、特定の種類の細胞の数が一定に保たれるように調節されている。しかし、時折、通常の成長制御機構に反応しなくなった細胞が発生する。これらの細胞は細胞のクローンを生じ、それはかなりの大きさに増殖して腫瘍または新生物を産生し得る。無限に増殖できず、健康な周囲組織に広範囲に浸潤しない腫瘍は良性である。増殖を続け、次第に浸潤性になる腫瘍は悪性である。癌という用語は、特に悪性腫瘍を指す。制御されない増殖に加えて、悪性腫瘍は転移を示す。このプロセスでは、癌性細胞の小さなクラスターが腫瘍から外れ、血管やリンパ管に侵入して他の組織に運ばれ、そこで増殖を続ける。このように、ある部位の原発腫瘍は、別の部位で二次腫瘍を引き起こすことができる。
本明細書に記載される組成物および方法は、対象腫瘍の増殖を遅延または抑制すること、腫瘍の増殖またはサイズを縮小すること、腫瘍の転移を抑制または低減すること、および／あるいは腫瘍の発生または増殖に関連する症状を抑制または低減することによって、良性または悪性の腫瘍を有する対象を処置するために有用であり得る。
処置され得る悪性腫瘍は、本明細書では腫瘍が由来する組織の胚起源に従って分類される。癌腫は、皮膚または内臓および腺の上皮内層などの内胚葉または外胚葉組織から発生する腫瘍である。開示される組成物は、癌腫を処置する際に特に有効である。発生頻度の低い肉腫は、骨、脂肪、および軟骨などの中胚葉結合組織に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病は単一細胞として増殖し、リンパ腫は腫瘍塊として増殖する傾向がある。悪性腫瘍は、体の多くの臓器または組織に現れて、癌を確立することがある。
提供される組成物および方法で処置することのできる癌の種類としては、限定されるものではないが、骨、膀胱、脳、乳房、子宮頚部、結腸直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭（ｎａｓｏｐｈａｒａｎｇｅａｌ）、膵臓、前立腺、皮膚、胃、および子宮の、多発性骨髄腫、腺癌および肉腫などの血管の癌などの癌が挙げられる。一部の実施形態では、開示される組成物は、複数の癌型を同時に処置するために使用される。また、この組成物は、複数の部位での転移または腫瘍を処置するためも使用することができる。
開示された組成物および方法は、以下の番号付けされたパラグラフを通じてさらに理解することができる。
１．
（ａ）３Ｅ１０モノクローナル抗体、その細胞膜透過性フラグメント；一価、二価、または多価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；またはダイアボディ；またはそのヒト化形態もしくはバリアント、および
（ｂ）ポリペプチド、機能性核酸、機能性核酸をコードする核酸、またはその組合せをコードする核酸を含む核酸カーゴ
を含むかまたはそれからなる組成物。
２．（ａ）が、
（ｉ）配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つのＣＤＲと、配列番号７～１１、１４、または５３～５８のいずれか１つのＣＤＲとの組合せ；
（ｉｉ）配列番号１５～２３、４２、または４３のいずれかから選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４～３０、４４、または４５のいずれかから選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲの組合せ；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヒト化形態；
（ｉｖ）配列番号１または２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７または８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ；
（ｖ）ヒト化形態または（ｉｖ）；あるいは
（ｖｉ）配列番号３～６、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９～１１または５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ
を含む、パラグラフ１に記載の組成物。
３．（ａ）が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を含む、パラグラフ１または２に記載の組成物。
４．（ａ）が、モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有する組換え抗体である、パラグラフ１～３のいずれか１項に記載の組成物。
５．
（ａ）以下の
（ｉ）配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つのＣＤＲと、配列番号７～１１、１４、または５３～５８のいずれか１つのＣＤＲとの組合せ；
（ｉｉ）配列番号１５～２３、４２、または４３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４～３０、４４、または４５から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲの組合せ；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヒト化形態；
（ｉｖ）配列番号１または２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７または８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ；
（ｖ）ヒト化形態または（ｉｖ）；あるいは
（ｖｉ）配列番号３～６、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９～１１または５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ、
を含む結合タンパク質と、
（ｂ）ポリペプチド、機能性核酸、機能性核酸をコードする核酸、またはその組合せをコードする核酸を含む核酸カーゴ
を含むかまたはそれからなる組成物。
６．（ａ）が、二重特異性である、パラグラフ１～５のいずれか１項に記載の組成物。
７．（ａ）が、目的の細胞型を標的とする、パラグラフ６に記載の組成物。
８．（ａ）と（ｂ）が非共有結合的に連結している、パラグラフ１～７のいずれか１項に記載の組成物。
９．（ａ）と（ｂ）が複合体になっている、パラグラフ１～８のいずれか１項に記載の組成物。
１０．（ｂ）が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたは他の修飾された核酸、または核酸類似体、またはその組合せを含む、パラグラフ１～９のいずれか１項に記載の組成物。
１１．（ｂ）が、ｍＲＮＡを含む、パラグラフ１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
１２．（ｂ）が、ベクターを含む、パラグラフ１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
１３．ベクターが、発現制御配列に作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、パラグラフ１２に記載の組成物。
１４．ベクターがプラスミドである、パラグラフ１３に記載の組成物。
１５．（ｂ）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、またはその組合せをコードする核酸を含む、パラグラフ１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
１６．（ｂ）が、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする核酸を含む、パラグラフ１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
１７．（ｂ）が、機能性核酸を含む、パラグラフ１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
１８．（ｂ）が、機能性核酸をコードする核酸を含む、パラグラフ１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
１９．機能性核酸が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ＲＮＡｉ、または外部ガイド配列である、パラグラフ１７または１８に記載の組成物。
２０．（ｂ）が、複数の単一核酸分子を含む、パラグラフ１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
２１．（ｂ）が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの異なる核酸分子を複数含む、パラグラフ１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
２２．（ｂ）が、長さ約１～２５，０００核酸塩基の間の核酸分子を含むかまたはそれからなる、パラグラフ１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
２３．（ｂ）が、一本鎖核酸、二本鎖核酸、またはその組合せを含むかまたはそれからなる、パラグラフ１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
２４．キャリアＤＮＡをさらに含む、パラグラフ１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
２５．キャリアＤＮＡが、非コードＤＮＡである、パラグラフ２４に記載の組成物。
２６．（ｂ）が、ＲＮＡで構成される、パラグラフ２４または２５に記載の組成物。
２７．パラグラフ１～２６のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
２８．（ａ）と（ｂ）の複合体を封入するポリマーナノ粒子をさらに含む、パラグラフ２７に記載の組成物。
２９．標的化部分、細胞膜透過性ペプチド、またはそれらの組合せが、ナノ粒子に直接的または間接的に、会合、連結、コンジュゲート、あるいは他の方法で結合されている、パラグラフ２８に記載の組成物。
３０．細胞を有効量のパラグラフ１～２９のいずれか１項に記載の組成物に接触させることを含む、核酸カーゴを細胞に送達する方法。
３１．接触がエクスビボで行われる、パラグラフ３０に記載の方法。
３２．細胞が、造血幹細胞、またはＴ細胞である、パラグラフ３１に記載の方法。
３３．細胞をそれを必要とする対象に投与することをさらに含む、パラグラフ３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．細胞が、疾患または障害の１またはそれより多くの症状を処置するために有効な量で対象に投与される、パラグラフ３３に記載の方法。
３５．接触が、それを必要とする対象への投与の後にインビボで行われる、パラグラフ３０に記載の方法。
３６．対象が疾患または障害を有する、パラグラフ３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．疾患または障害が、遺伝性障害、癌、または感染症もしくは感染性疾患である、パラグラフ３６に記載の方法。
３８．（ｂ）が、対象の疾患または障害の１またはそれより多くの症状を軽減するために有効な量で対象の細胞に送達される、パラグラフ３６または３７に記載の方法。
３９．細胞との接触の前に、（ａ）と（ｂ）の複合体を形成するために有効な時間および適した温度で（ａ）と（ｂ）をインキュベートおよび／または混合することを含む、パラグラフ１～２９のいずれか１項に記載の組成物を作製する方法。
４０．（ａ）と（ｂ）を、約１分～約３０分、約１０分～約２０分、または約１５分、必要に応じて室温または３７℃でインキュベートおよび／または混合することを含む、パラグラフ１～２９のいずれか１項に記載の組成物を作製する方法。
４１．３Ｅ１０モノクローナル抗体、その細胞膜透過性フラグメント；一価、二価、または多価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；またはダイアボディ；またはそのヒト化形態もしくはバリアントが、配列番号９２もしくは９３の核酸結合ポケットまたは核酸に結合する能力が同じまたは改善されたそのバリアントを含む、パラグラフ１～４０のいずれか１項に記載の組成物または方法。
４２．重鎖アミノ酸配列またはそのＣＤＲのＤ３１またはＮ３１に対応するアミノ酸残基がＲで置換されている、パラグラフ１～４１のいずれか１項に記載の組成物または方法。
４３．重鎖アミノ酸配列またはそのＣＤＲのＤ３１またはＮ３１に対応するアミノ酸残基がＬで置換されている、パラグラフ１～４２のいずれか１項に記載の組成物または方法。
４４．
（ｉ）配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つのＣＤＲのバリアントと、配列番号７～１１、１４、または５３～５８のいずれか１つのＣＤＲの組合せ；
（ｉｉ）配列番号１５～２３、４２、または４３から選択される第２、および第３の重鎖ＣＤＲと組み合わせた第１の重鎖ＣＤＲのバリアントと、配列番号２４～３０、４４、または４５から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲとの組合せ；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヒト化形態；
（ｉｖ）配列番号１または２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７または８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ；
（ｖ）ヒト化形態または（ｉｖ）；あるいは
（ｖｉ）配列番号３～６、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９～１１または５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ
を含み、
Ｄ３１またはＮ３１に対応するアミノ酸残基が、ＲまたはＬで置換されている、結合タンパク質。
４５．配列番号９２もしくは９３の核酸結合ポケット、または核酸に結合する能力が同じまたは改善されたそのバリアントを含む、パラグラフ４４に記載の結合タンパク質。
以下の実験に関して、Ｄ３１Ｎバリアントであると記載されている場合を除いて（例えば実施例４）、標準の３Ｅ１０配列を使用した。標準の３Ｅ１０とＤ３１Ｎバリアントの両方は、全長抗体として使用した。
実施例１：３Ｅ１０は、１時間後にＰＮＡの細胞取り込みを増加させる。
材料および方法
ＰＮＡのみ（１ｎｍｏｌｅ）（ＭＷ＝９９８４．３９；２９ヌクレオチド長）、または、３Ｅ１０（０．７５ｍｇ）と複合体を形成したＰＮＡを、室温で５分間混合した。次に、２００，０００個のＫ５６２細胞を、無血清培地中の３Ｅ１０の懸濁液またはＰＮＡのみに添加した。さらなる無血清培地を添加して、最終容量を５００ｕｌとした。細胞とともに３７℃で１時間インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＮＡは、蛍光色素であるテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）との結合によって標識した。
結果
結果は、フローサイトメトリーのドットプロットに示される（図１Ａ～１Ｃ）。％取り込みを数値化した（図１Ｄ）。
結果は、３Ｅ１０と混合するとＰＮＡの取り込みが増加することを示す。
実施例２：３Ｅ１０は、２４時間後にＰＮＡの細胞取り込みを増加させる。
材料および方法
ＰＮＡのみ（１ｎｍｏｌｅ）（ＭＷ＝９９８４．３９；２９ヌクレオチド長）、または、３Ｅ１０（０．７５ｍｇ）と複合体を形成したＰＮＡを、室温で５分間混合した。次に、２００，０００個のＫ５６２細胞を、無血清培地中の３Ｅ１０の懸濁液またはＰＮＡのみに添加した。さらなる無血清培地を添加して、最終容量を５００ｕｌとした。細胞とともに３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリーによって分析した。
２０，０００個のＵ２ＯＳ細胞を８ウェルのチャンバースライドに播種し、２４時間接着させた。その後、細胞をＰＮＡのみ（１ｎｍｏｌｅ）、または３Ｅ１０と複合体を形成したＰＮＡ（１０ｕＭ）で処置した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＮＡまたは３Ｅ１０と混合したＰＮＡをＰＢＳで洗浄してから固定および核染色を行った。その後、ＰＮＡの取り込みをフローサイトメトリーで数値化し、蛍光顕微鏡を使用して画像化した。ＰＮＡは、蛍光色素であるテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）との結合によって標識した。
結果
結果は、フローサイトメトリーのドットプロットに示される（図２Ａ～２Ｃ）。％取り込みを数値化した（図２Ｄ）。
結果は、３Ｅ１０と混合するとＰＮＡの取り込みが増加することを示す。
蛍光顕微鏡は、明確なピンクの色合いの生成によって明らかな核内ＤＮＡ（青色のＤＡＰＩ）とＰＮＡ（赤色のＴａｍｒａ）の共局在性を示した。
実施例３：３Ｅ１０は、２４時間後にｓｉＲＮＡの細胞取り込みを増加させる。
材料および方法
標識したｓｉＲＮＡ（フルオレセインアミダイト、ＦＡＭへの付着による）（１ｎｍｏｌｅ）、または３Ｅ１０と複合体を形成したｓｉＲＮＡ（０．７５ｍｇ）を、室温で５分間混合した。次に、２００，０００個のＫ５６２細胞を、無血清培地中の３Ｅ１０の懸濁液またはｓｉＲＮＡのみに添加した。さらなる無血清培地を添加して、最終容量を５００ｕｌとした。細胞とともに３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリーによって分析した。
結果
結果は、フローサイトメトリーのドットプロットに示される（図３Ａ～３Ｃ）。％取り込みを数値化した（図３Ｄ）。
結果は、３Ｅ１０と混合するとｓｉＲＮＡの細胞取り込みが増加することを示す。
実施例４：３Ｅ１０は、２４時間後にｍＲＮＡの細胞取り込みを増加させる。
材料および方法
標識したｍＲＮＡ（シアニン５、Ｃｙ５への付着による）（２ｕｇ）のみ、または３Ｅ１０と複合体を形成した標識ｍＲＮＡ（２．５、５、および１０ｕＭ）を、室温で５分間混合した。３Ｅ１０とｍＲＮＡの懸濁液、またはｍＲＮＡのみの懸濁液を、無血清培地中の２００，０００個のＫ５６２細胞に添加した。さらなる無血清培地を添加して、最終容量を５００ｕｌとした。細胞とともに３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリーによって分析した。
結果
結果は、フローサイトメトリーのドットプロットに示される（図４Ａ～４Ｈ）。％取り込みを数値化した（図４Ｉ）。
結果は、３Ｅ１０と混合するとｍＲＮＡの取り込みが増加することを示す。
３Ｅ１０のＤ３１ＮバリアントによるｍＲＮＡの送達が、ｍＲＮＡの細胞取り込みの最高レベルをもたらしたことに注目されたい。
蛍光顕微鏡は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターをコードする、同じＣｙ５標識ｍＲＮＡの翻訳後に、Ｕ２ＯＳ細胞において機能的なＧＦＰの発現を示した。
実施例５：３Ｅ１０は、１時間後にｍＲＮＡの細胞取り込みを増加させる。
材料および方法
標識したｍＲＮＡ（Ｃｙ５）（２ｕｇ）または３Ｅ１０のＤ３１Ｎバリアントと複合体を形成した標識ｍＲＮＡ（０．１～１０ｕＭ）を、室温で５分間混合した。３Ｅ１０とｍＲＮＡの懸濁液、またはｍＲＮＡのみの懸濁液を、無血清培地中の２００，０００個のＫ５６２細胞に添加した。さらなる無血清培地を添加して、最終容量を５００ｕｌとした。細胞とともに３７℃で１時間インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリーによって分析した。
結果
結果は、フローサイトメトリーのドットプロットに示される（図５Ａ～５Ｈ）。％取り込みを数値化した（図５Ｉ）。
実施例６：３Ｅ１０は、プラスミドＤＮＡの細胞取り込みを増加させる。
材料および方法
ＧＦＰレポータープラスミドＤＮＡ（２５０ｕｇ）を、３Ｅ１０（１０ｕＭ）と室温で５分間複合体を形成させた。３Ｅ１０とプラスミドＤＮＡの懸濁液、またはプラスミドＤＮＡのみの懸濁液を、無血清培地中の２００，０００個のＫ５６２細胞に添加した。さらなる無血清培地を添加して、最終容量を５００ｕｌとした。細胞とともに３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した。最初の処置から７２時間後、細胞を画像化し、ＧＦＰ発現について解析した。
結果
結果は、緑色蛍光で測定されるように、３Ｅ１０とプラスミドＤＮＡを組み合わせると、ＧＦＰプラスミドが細胞にしっかりと取り込まれたことを示しており、ＧＦＰ構築物の取り込みと機能的発現を示している。プラスミドＤＮＡのみを使用した場合は、取り込みも緑色蛍光も見られなかった。（図６）。
実施例７：３Ｅ１０はインビボでｍＲＮＡ送達を媒介する
材料および方法
ＧＦＰをコードする１０ｕｇのｍＲＮＡと０．１ｍｇの３Ｅ１０を室温で１５分間混合した。３Ｅ１０と複合体を形成したｍＲＮＡを、１００ｍｍ３のＥＭＴ６脇腹腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに全身注射した。処置の２０時間後に、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳイメージングを用いてｍＲＮＡ発現（ＧＦＰ）を解析した。
結果
３Ｅ１０を媒介するｍＲＮＡの送達は、腫瘍でＧＦＰ発現を全く生じなかった、自由に注入されたｍＲＮＡと比較して、腫瘍で有意に高いレベルのＧＦＰ発現をもたらした。いずれの処置でも調べた、肝臓、脾臓、心臓、および腎臓をはじめとする正常な組織では、ＧＦＰの検出可能な発現は見られなかった。これらの結果は、機能的な翻訳および発現を伴う、ｍＲＮＡの腫瘍へのしっかりとした送達を示している。
実施例８：３Ｅ１０はインビボでｓｉＲＮＡ送達を媒介する
材料および方法
４０ｕｇの蛍光標識したｓｉＲＮＡと、増加させた用量の３Ｅ１０（０．２５、０．５、および１ｍｇ）を室温で１５分間混合した。３Ｅ１０と複合体を形成したｓｉＲＮＡを、１００ｍｍ３のＥＭＴ６脇腹腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに全身注射した。処置の２０時間後に、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳイメージングを用いてｓｉＲＮＡ送達を解析した。
４０ｕｇの蛍光標識したｓｉＲＮＡと、１ｍｇの３Ｅ１０または０．１ ｍｇの３Ｅ１０のＤ３１Ｎバリアントを室温で１５分間混合した。３Ｅ１０と複合体を形成したｓｉＲＮＡを、１００ｍｍ３のＥＭＴ６脇腹腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに全身注射した。処置の２０時間後に、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳイメージングを用いてｓｉＲＮＡ送達を解析した。
結果
図７Ａに示すように、３Ｅ１０の用量を増加させると、腫瘍におけるｓｉＲＮＡの蓄積が増加する。
図７Ｂに示すように、Ｄ３１Ｎ ３Ｅ１０の１０分の１の低い用量は、３Ｅ１０と同様のレベルのｓｉＲＮＡ送達をもたらした。
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書で引用された刊行物およびそれらが引用されている資料は、参照により具体的に組み込まれる。
実施例９：キャリアＤＮＡはｍＲＮＡを非腫瘍組織に増強する
材料および方法
２ｕｇの蛍光標識したｍＲＮＡと２０ｕｇの３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎを、キャリアＤＮＡあり（５ｕｇ）、またはなしで、室温で１５分間混合した。３Ｅ１０と複合体を形成したｍＲＮＡを、Ｅ１５．５で胎児に注入した。処置の２４～４８時間後、胎児を採取し、ＩＶＩＳイメージングを用いてｍＲＮＡ送達を解析した。
結果
キャリアＤＮＡがない場合、ｍＲＮＡと複合体を形成した３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎは、２４時間で胎児から速やかに排出された。しかし、キャリアＤＮＡを付加することにより、４８時間で胎児の複数の組織において検出可能なｍＲＮＡシグナルが得られた。
上記の例は、ＤＮＡカーゴの送達が、より一般的に複数の組織に対するものであり、腫瘍に限定されない場合が多い一方で、ＲＮＡの送達は腫瘍組織に対してより選択的である場合が多いことを示し得る。
実施例１０：ｍＲＮＡと複合体を形成した３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）とキャリアＤＮＡは、持続的なレベルのタンパク質発現をもたらす。
材料および方法
１０ｕｇのルシフェラーゼｍＲＮＡおよび１０ｕｇの一本鎖キャリアＤＮＡ（６０ｎｔｓ）を、１００ｕｇの３Ｅ１０（ＷＴ）または３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）と室温で１５分間混合した。３Ｅ１０と複合体を形成したｍＲＮＡを、各マウスの右大腿四頭筋に筋肉内注射した（ＩＭ）。ルシフェラーゼの発現を６日間にわたってモニターした。
結果
図８に見られるように、ｍＲＮＡおよびキャリアＤＮＡと複合体を形成した３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）の投与は、持続的なレベルのルシフェラーゼ発現がをもたらしたが、ｍＲＮＡおよびキャリアＤＮＡと複合体を形成した３Ｅ１０（ＷＴ）は、バックグラウンドより多くの感知できるシグナルを生成できなかった。
実施例１１：ＩＶ注射された３Ｅ１０のインビボ分布。
ＩＶ注射された３Ｅ１０の筋肉への分布を調べた。マウスに、ＶｉｖｏＴａｇ６８０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識した２００μｇの３Ｅ１０、ＷＴまたはＤ３１Ｎを静脈内注射した。注射の４時間後、筋肉を採取し、ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって画像化した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＩＶＩＳ画像の数値化は、３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎは、３Ｅ１０－ＷＴと比較して、筋肉への高い分布を達成することを示す（図９Ｃ）。
３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎの組織への用量依存的体内分布を調べた。マウスに、ＶｉｖｏＴａｇ６８０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識した１００μｇまたは２００μｇの３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎを静脈内注射した。注射の２４時間後、組織を採取し、ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって画像化した。組織分布の数値化により、筋肉への蓄積では用量依存的な２倍の増加が示され、肝臓を含む複数の組織での比例した増加ではなかった（図１０）。
３Ｅ１０の腫瘍への分布。側腹部に同系結腸腫瘍（ＣＴ２６）を有するマウスに、ＶｉｖｏＴａｇ６８０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識した２００μｇの３Ｅ１０、ＷＴまたはＤ３１Ｎを静脈内注射した。注射の２４時間後、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって画像化した（図１１Ａ～１１Ｂ）。組織分布の数値化により、３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎは、３Ｅ１０－ＷＴと比較して腫瘍での蓄積が多いことが示された（図１１Ｃ）。
３Ｅ１０と非共有結合したｓｓＤＮＡの分布を調べた。側腹部に同系結腸腫瘍（ＣＴ２６）を有するマウスに、４０ｕｇの標識ｓｓＤＮＡ（ＩＲ６８０）と混合した２００ｕｇの３Ｅ１０、ＷＴまたはＤ３１Ｎを静脈内注射した。注射の２４時間後、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって画像化した（図１２Ａ～１２Ｃ）。組織分布の数値化により、３Ｅ１０－Ｄ３１ＮによるｓｓＤＮＡの送達は、３Ｅ１０－ＷＴと比較して高い腫瘍蓄積をもたらすことが示された（図１２Ｄ）。
実施例１２：３Ｅ１０に媒介されるＲＩＧ－Ｉリガンドの送達、およびＲＩＧ－Ｉ活性の刺激。
材料および方法
ＲＩＧ－Ｉレポーター細胞（ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ ＲＩＧ－Ｉ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をウェルあたり５０，０００細胞で播種し、ＲＩＧ－Ｉリガンド（１ｕｇ）または３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎと複合体を形成したリガンド（２０ｕｇ）で処置した。このアッセイは、インターフェロンの誘導があると活性化するルシフェラーゼレポーターを持つ細胞株を使用する。
結果
すべての場合において、ＲＩＧ－ＩリガンドだけではＩＦＮ－γ分泌を刺激しなかった。しかし、３Ｅ１０－Ｄ３１ＮによるＲＩＧ－リガンドの送達は、対照より多くのＩＦＮ－γ分泌を刺激し、低分子量と高分子量（ＬＭＷおよびＨＭＷ）の両方のポリ（Ｉ：Ｃ）で最も高い分泌が観察された。
実施例１３：３Ｅ１０およびその操作されたバリアントの分子モデリング。
ＷＴ重鎖ｓｃＦｖ配列
Figure 2022546699000032
 軽鎖ｓｃＦｖ配列
Figure 2022546699000033
３Ｅ１０（Ｐｙｍｏｌ）の分子モデリングにより、推定核酸結合ポケット（ＮＡＢ１）が明らかになった（図１４Ａ～１４Ｂ）。ＣＤＲ１の残基３１のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異により、この残基のカチオン電荷が増大し、インビボでの核酸結合および送達が増強された（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｎ）。
ＣＤＲ１の残基３１のアスパラギン酸をアルギニン（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｒ）に変異させると、カチオン電荷がさらに増大し、リジン（３Ｅ１０－Ｄ３１Ｋ）に変異させると電荷の方向が変化した（図１４Ａ）。
分子モデリングから予測されたＮＡＢ１アミノ酸は、上記の重鎖および軽鎖配列に下線が引かれている。図１４Ｂは、ＮＡＢ１アミノ酸残基を点状のドットで示した３Ｅ１０－ｓｃＦｖ（Ｐｙｍｏｌ）の分子モデリングを示す説明図である。
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認できるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (45)

  1. （ａ）３Ｅ１０モノクローナル抗体、その細胞膜透過性フラグメント；一価、二価、もしくは多価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；もしくはダイアボディ；またはそのヒト化形態もしくはバリアント、および
    （ｂ）ポリペプチドをコードする核酸、機能性核酸、機能性核酸をコードする核酸、またはその組合せを含む核酸カーゴ
    を含むかまたはそれからなる組成物。
  2. （ａ）が、
    （ｉ）配列番号７～１１、１４、もしくは５３～５８のいずれか１つの前記ＣＤＲと組合せた、配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、もしくは５０～５２のいずれか１つのＣＤＲ；
    （ｉｉ）配列番号２４～３０、４４、もしくは４５のいずれかから選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲと組合せた、配列番号１５～２３、４２、もしくは４３のいずれかから選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲ；
    （ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のヒト化形態；
    （ｉｖ）配列番号７もしくは８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖と組合せた、配列番号１もしくは２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖；
    （ｖ）ヒト化形態もしくは（ｉｖ）；または
    （ｖｉ）配列番号９～１１もしくは５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖と組合せた、配列番号３～６、４６～４８、もしくは５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖
    を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. （ａ）が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. （ａ）が、モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有する組換え抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. （ａ）以下の
    （ｉ）配列番号７～１１、１４、もしくは５３～５８のいずれか１つの前記ＣＤＲと組合せた、配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、もしくは５０～５２のいずれか１つのＣＤＲ；
    （ｉｉ）配列番号２４～３０、４４、もしくは４５から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲと組合せた、配列番号１５～２３、４２、もしくは４３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、；
    （ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のヒト化形態；
    （ｉｖ）配列番号７もしくは８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖と組合せた、配列番号１もしくは２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖；
    （ｖ）ヒト化形態もしくは（ｉｖ）；または
    （ｖｉ）配列番号９～１１もしくは５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖と組合せた、配列番号３～６、４６～４８、もしくは５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖
    を含む結合タンパク質と、
    （ｂ）ポリペプチドをコードする核酸、機能性核酸、機能性核酸をコードする核酸、またはその組合せを含む核酸カーゴ
    を含む組成物。
  6. （ａ）が、二重特異性である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. （ａ）が、目的の細胞型を標的とする、請求項６に記載の組成物。
  8. （ａ）と（ｂ）が非共有結合的に連結している、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. （ａ）と（ｂ）が複合体になっている、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. （ｂ）が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡもしくは他の修飾された核酸、または核酸類似体、またはその組合せを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. （ｂ）が、ｍＲＮＡを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. （ｂ）が、ベクターを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記ベクターが、発現制御配列に作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記ベクターがプラスミドである、請求項１３に記載の組成物。
  15. （ｂ）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸、ｇＲＮＡ、またはその組合せを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. （ｂ）が、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. （ｂ）が、機能性核酸を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. （ｂ）が、機能性核酸をコードする核酸を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記機能性核酸が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ＲＮＡｉ、または外部ガイド配列である、請求項１７または１８に記載の組成物。
  20. （ｂ）が、複数の単一核酸分子を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. （ｂ）が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの異なる核酸分子を複数含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  22. （ｂ）が、長さ約１～２５，０００核酸塩基の間の核酸分子を含むかまたはそれからなる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. （ｂ）が、一本鎖核酸、二本鎖核酸、またはその組合せを含むかまたはそれからなる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. キャリアＤＮＡをさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記キャリアＤＮＡが、非コードＤＮＡである、請求項２４に記載の組成物。
  26. （ｂ）が、ＲＮＡで構成される、請求項２４または２５に記載の組成物。
  27. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
  28. （ａ）と（ｂ）の複合体を封入するポリマーナノ粒子をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
  29. 標的化部分、細胞膜透過性ペプチド、またはそれらの組合せが、前記ナノ粒子に直接的もしくは間接的に、会合、連結、コンジュゲート、または他の方法で結合されている、請求項２８に記載の組成物。
  30. 核酸カーゴを細胞に送達する方法であって、前記細胞を有効量の請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物に接触させることを含む、方法。
  31. 前記接触がエクスビボで行われる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記細胞が、造血幹細胞、またはＴ細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞をそれを必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記細胞が、疾患または障害の１またはそれより多くの症状を処置するために有効な量で前記対象に投与される、請求項３３に記載の方法。
  35. それを必要とする対象への投与の後に、前記接触がインビボで行われる、請求項３０に記載の方法。
  36. 前記対象が疾患または障害を有する、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記疾患または障害が、遺伝性障害、癌、または感染症もしくは感染性疾患である、請求項３６に記載の方法。
  38. （ｂ）が、前記対象の前記疾患または障害の１またはそれより多くの症状を軽減するために有効な量で前記対象の細胞に送達される、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 細胞との接触の前に、（ａ）と（ｂ）の複合体を形成するために有効な時間および適した温度で（ａ）と（ｂ）をインキュベートおよび／または混合することを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物を作製する方法。
  40. （ａ）と（ｂ）を、約１分～約３０分、約１０分～約２０分、または約１５分、必要に応じて室温または３７℃でインキュベートおよび／または混合することを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物を作製する方法。
  41. ３Ｅ１０モノクローナル抗体、その細胞膜透過性フラグメント；一価、二価、もしくは多価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；またはダイアボディ；またはそのヒト化形態もしくはバリアントが、配列番号９２もしくは９３の核酸結合ポケットまたは核酸に結合する能力が同じまたは改善されたそのバリアントを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の組成物または方法。
  42. 重鎖アミノ酸配列またはそのＣＤＲのＤ３１またはＮ３１に対応する前記アミノ酸残基がＲで置換されている、請求項１～４１のいずれか１項に記載の組成物または方法。
  43. 重鎖アミノ酸配列またはそのＣＤＲのＤ３１またはＮ３１に対応する前記アミノ酸残基がＬで置換されている、請求項１～４２のいずれか１項に記載の組成物または方法。
  44. （ｉ）配列番号７～１１、１４、または５３～５８のいずれか１つの前記ＣＤＲと組合せた、配列番号１～６、１２、１３、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つのＣＤＲのバリアント；
    （ｉｉ）配列番号２４～３０、４４、または４５から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲと組合せた、配列番号１５～２３、４２、または４３から選択される前記第２、および第３の重鎖ＣＤＲと組み合わせた前記第１の重鎖ＣＤＲのバリアント；
    （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヒト化形態；
    （ｉｖ）配列番号７または８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖と組合せた、配列番号１または２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖；
    （ｖ）ヒト化形態または（ｉｖ）；または
    （ｖｉ）配列番号９～１１または５３～５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖と組合せた、配列番号３～６、４６～４８、または５０～５２のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖
    を含み、
    Ｄ３１またはＮ３１に対応する前記アミノ酸残基が、ＲまたはＬで置換されている、結合タンパク質。
  45. 配列番号９２もしくは９３の前記核酸結合ポケット、または核酸に結合する能力が同じまたは改善されたそのバリアントを含む、請求項４４に記載の結合タンパク質。
JP2022513157A 2019-08-30 2020-08-31 核酸を細胞に送達するための組成物および方法 Pending JP2022546699A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
USPCT/US2019/048953 2019-08-30
USPCT/US2019/048962 2019-08-30
PCT/US2019/048953 WO2020047344A1 (en) 2018-08-31 2019-08-30 Compositions and methods for enhancing donor oligonucleotide-based gene editing
PCT/US2019/048962 WO2020047353A1 (en) 2018-08-31 2019-08-30 Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
US201962944281P 2019-12-05 2019-12-05
US62/944,281 2019-12-05
PCT/US2020/048823 WO2021042060A1 (en) 2019-08-30 2020-08-31 Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022546699A true JP2022546699A (ja) 2022-11-07
JPWO2021042060A5 JPWO2021042060A5 (ja) 2023-09-08

Family

ID=74684750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022513157A Pending JP2022546699A (ja) 2019-08-30 2020-08-31 核酸を細胞に送達するための組成物および方法

Country Status (10)

Country Link
US (5) US20230227583A1 (ja)
EP (1) EP4021496A1 (ja)
JP (1) JP2022546699A (ja)
KR (1) KR20220101073A (ja)
CN (1) CN115151275A (ja)
AU (1) AU2020336992A1 (ja)
CA (1) CA3149421A1 (ja)
IL (1) IL290862A (ja)
MX (1) MX2022002342A (ja)
WO (1) WO2021042060A1 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020336992A1 (en) 2019-08-30 2022-04-14 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
IL301014A (en) * 2020-08-31 2023-05-01 Univ Yale Compositions and methods for administering nucleic acids to cells
CN117295753A (zh) * 2020-12-04 2023-12-26 基那奥生物公司 用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
WO2022187543A1 (en) * 2021-03-03 2022-09-09 Yale University Compositions and methods for treating skeletal muscle disease
WO2022246510A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 Transmab Pty Ltd Improved immunoglobulin i
AU2022302143A1 (en) * 2021-07-02 2024-01-18 Venugopalareddy BOMMIREDDYVENKATA Compositions and methods for treating cancers
WO2023283342A2 (en) * 2021-07-08 2023-01-12 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oligonucleotides and viral untranslated region (utr) for increasing expression of target genes and proteins
AU2022340804A1 (en) * 2021-08-31 2024-03-21 Gennao Bio, Inc. Compositions and methods for treating cancers
WO2023168401A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for treating disease

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4714680B1 (en) 1984-02-06 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Human stem cells
US4965204A (en) 1984-02-06 1990-10-23 The Johns Hopkins University Human stem cells and monoclonal antibodies
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
EP0215942B1 (en) 1985-03-15 1995-07-12 Antivirals Inc. Polynucleotide assay reagent and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4812397A (en) 1987-02-10 1989-03-14 The Regents Of The University Of California MAB-anti-DNA related to nephritis
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
WO1997032602A1 (en) 1996-03-08 1997-09-12 The Regents Of The University Of California DELIVERY SYSTEM USING mAb 3E10 AND MUTANTS AND/OR FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF
US5945337A (en) 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
US5786571A (en) 1997-05-09 1998-07-28 Lexmark International, Inc. Wrapped temperature sensing assembly
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
AU5886000A (en) 1999-06-25 2001-01-31 Northwestern University Compositions, kits, and methods for modulating survival and differentiation of multi-potential hematopoietic progenitor cells
US6919208B2 (en) 2000-05-22 2005-07-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for enhancing the delivery of a nucleic acid to a cell
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US7067617B2 (en) 2001-02-21 2006-06-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
US20040197892A1 (en) 2001-04-04 2004-10-07 Michael Moore Composition binding polypeptides
EP1421177A4 (en) 2001-08-20 2006-06-07 Scripps Research Inst ZINC FINGER FASTENING DOMAINS FOR CNN
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
EP1963499A4 (en) 2005-11-28 2009-04-08 Scripps Research Inst ZINCFINGER BINDING DOMAIN FOR TNN
US20070154989A1 (en) 2006-01-03 2007-07-05 The Scripps Research Institute Zinc finger domains specifically binding agc
CN1986792A (zh) * 2006-12-14 2007-06-27 方炳良 致病细胞的外来抗原标记方法
EP2109625A4 (en) 2007-01-22 2011-06-08 Univ California USE OF ANTIBODY CONJUGATES
ES2630057T3 (es) * 2009-06-15 2017-08-17 Valerion Therapeutics, Llc Métodos y composiciones para el tratamiento de la miopatía miotubular usando polipéptidos quiméricos que comprenden polipéptidos de miotubularina 1 (mtm1)
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
EP2694555B1 (en) * 2011-04-01 2019-07-10 Yale University Cell-penetrating anti-dna antibodies and uses thereof to inhibit dna repair
NZ616405A (en) 2011-04-08 2015-11-27 Baylor College Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
US9272043B2 (en) 2011-12-02 2016-03-01 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
WO2013138662A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 4S3 Bioscience, Inc. Antisense conjugates for decreasing expression of dmpk
US9283272B2 (en) 2012-03-30 2016-03-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Targeting intracellular target-binding determinants with intracellular antibodies
US9732146B2 (en) 2012-03-30 2017-08-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Antibody-mediated transduction of heat shock proteins into living cells
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
US20150290244A1 (en) 2012-07-13 2015-10-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of cart19 to deplete normal b cells to induce tolerance
EP2877213B1 (en) 2012-07-25 2020-12-02 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
EP2981551B1 (en) * 2013-02-20 2020-06-03 Valerion Therapeutics, LLC Methods and compositions for treatment of pompe disease
WO2014201378A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-pk il -2 and adoptive cell therapy
US10221250B2 (en) * 2014-01-13 2019-03-05 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties
WO2015134607A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Yale University Cell penetrating anti-guanosine antibody based therapy for cancers with ras mutations
MY191608A (en) 2014-04-07 2022-07-01 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
US10202591B2 (en) * 2014-06-13 2019-02-12 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of glycogen storage diseases and glycogen metabolism disorders
CA2995673A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties for treatment of cancer
EP3194450A1 (en) 2014-08-28 2017-07-26 Yale University Multivalent fragments of antibody 3e10 and methods of use thereof
WO2016081621A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Yale University Formulations for targeted release of agents under low ph conditions and methods of use thereof
WO2017015101A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
US20190119357A1 (en) * 2015-07-23 2019-04-25 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
EP3416976A2 (en) 2016-02-16 2018-12-26 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
MA45328A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
US11590242B2 (en) 2016-06-15 2023-02-28 Yale University Antibody-mediated autocatalytic, targeted delivery of nanocarriers to tumors
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
JP2020527355A (ja) 2017-07-17 2020-09-10 ニュークリアス・セラピューティクス・ピーティーワイ・リミテッド 結合タンパク質１
JP7395483B2 (ja) * 2017-10-16 2023-12-11 アーディジェン， エルエルシー ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子
WO2019152808A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Yale University Compositions and methods for inhibition of nuclear-penetrating antibodies
US20210054102A1 (en) 2018-02-01 2021-02-25 Yale University Compositions and methods for enhancing nuclear translocation
JP2022500009A (ja) 2018-08-31 2022-01-04 イェール ユニバーシティーYale University ドナーオリゴヌクレオチドベースの遺伝子編集を亢進するための組成物および方法
WO2020047353A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Yale University Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
FI20186112A1 (en) 2018-12-19 2020-06-20 Actim Oy SYSTEM AND METHOD FOR ANALYZING THE RESULT OF THE CARE SITE TEST
AU2020336992A1 (en) 2019-08-30 2022-04-14 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
CN111218458B (zh) 2020-02-27 2020-11-20 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230093460A1 (en) 2023-03-23
CN115151275A (zh) 2022-10-04
MX2022002342A (es) 2022-06-14
CA3149421A1 (en) 2021-03-04
US20230227583A1 (en) 2023-07-20
KR20220101073A (ko) 2022-07-19
US20230085308A1 (en) 2023-03-16
US20230093888A1 (en) 2023-03-30
IL290862A (en) 2022-04-01
AU2020336992A1 (en) 2022-04-14
WO2021042060A1 (en) 2021-03-04
US11872286B2 (en) 2024-01-16
US11850284B2 (en) 2023-12-26
US20230032060A1 (en) 2023-02-02
EP4021496A1 (en) 2022-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11872286B2 (en) Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
ES2782125T3 (es) Método para generar linfocitos T compatibles para trasplante alogénico
JP6980659B2 (ja) 抗シアリルｔｎキメラ抗原受容体
JP2019047801A (ja) Ｒｎａガイドｃａｓヌクレアーゼ系を用いることによって免疫療法のためにｔ細胞を操作するための方法
CA3081456A1 (en) Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy
US20230348855A1 (en) Reducing fratricide of immune cells expressing nkg2d-based receptors
JP2024500303A (ja) 細胞への核酸の送達のための組成物及び方法
CN113396216A (zh) 用于改进的免疫疗法的组合基因靶标
US20230137729A1 (en) Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of cblb in t cells for immunotherapy
US20230265214A1 (en) Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
JP2023502780A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の活性化及び増殖方法
WO2018149358A1 (zh) 靶向il-13ra2的抗体及其应用
CN117295753A (zh) 用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
WO2024081736A2 (en) Compositions and methods of using cell-penetrating antibodies
NZ787266A (en) Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230831

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230831