ES2630057T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de la miopatía miotubular usando polipéptidos quiméricos que comprenden polipéptidos de miotubularina 1 (mtm1) - Google Patents

Métodos y composiciones para el tratamiento de la miopatía miotubular usando polipéptidos quiméricos que comprenden polipéptidos de miotubularina 1 (mtm1) Download PDF

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Abstract

Polipéptido quimérico que comprende: (i) un polipéptido de miotubularina (MTM1), o un fragmento del mismo y (ii) un grupo internalizante, donde el polipéptido quimérico tiene actividad fosfoinosítido fosfatasa; donde el grupo internalizante es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde el VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID Nº: 2, o una variante humanizada de la misma, y el VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID Nº: 4, o una variante humanizada de la misma de la misma.

Description

DESCRIPCION
Metodos y composiciones para el tratamiento de la miopatfa miotubular usando polipeptidos quimericos que comprenden polipeptidos de miotubularina 1 (mtml)
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La miopatfa miotubular (MTM) es un raro y grave trastorno muscular ligado al cromosoma X que se presenta con una incidencia estimada de 1 varon por cada 50 000 nacimientos. La miopatfa miotubular forma parte de una 10 categorfa de enfermedades a las que se denomina miopatfas centronucleares. Una caracterfstica esencial de las miopatfas centronucleares es que el nucleo se situa en el centro de muchas de las celulas musculares del individuo afectado, en lugar de en su posicion normal en los extremos de estas celulas. Aunque las miopatfas centronucleares comparten este signo caracterfstico, las diversas enfermedades tienen diferentes causas, afectan a diferentes poblaciones de pacientes y tienen una progresion y un pronostico de la enfermedad unicos.
15
La miopatfa miotubular es causada por una deficiencia de la protefna miotubularina 1 (MTM1), una fosfoinosftido fosfatasa (Bello AB et al., Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 14). En el nacimiento, los pacientes con MTM presentan hipotonfa severa y dificultad respiratoria y aquellos que sobreviven al periodo neonatal frecuentemente son total o parcialmente dependientes de soporte ventilatorio (Taylor GS et al., Proc Natl Acad Sci 20 USA. 2000 Aug 1;97(16):8910-5; Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5; Pierson CR et al., Neuromuscul Disord. 2007 July; 17(7): 562-568; Herman GE et al., THE JOURNAL OF PEDIATRICS VOLUME 134, NUMBER 2). Los pacientes con MTM exhiben retardo en las etapas del desarrollo motor y son susceptibles a sufrir complicaciones tales como la escoliosis, maloclusion, estenosis pilorica, esferocitosis y calculos biliares y renales, aunque el crecimiento lineal y la inteligencia son normales y la enfermedad sigue un curso no progresivo 25 (Herman GE et al., THE JOURNAL OF PEDIATRICS VOLUME 134, NUMBER 2). La estancia hospitalaria promedio de pacientes neonatales con MTM es de ~90 dfas. Sin embargo, los pacientes que sobreviven requeriran asistencia ventilatoria y atencion domiciliaria a largo plazo. El coste de los cuidados paliativos basicos, asf como los costes asociados al tratamiento de las complicaciones medicas que surgen con frecuencia en pacientes con MTM, suponen una carga personal y economica sustancial a los pacientes y familias. La patente US7189396 describe metodos de 30 transporte selectivo del anticuerpo monoclonal (mAb), 3E10, y fragmentos activos del mismo in vivo al nucleo de celulas de mamfferos sin efecto citotoxico.
RESUMEN DE LA INVENCION
35 Actualmente, no hay terapias para la MTM. El tratamiento se limita a la asistencia ventilatoria y otras formas de cuidado paliativo para intentar tratar las discapacidades asociadas a la enfermedad. La presente divulgacion proporciona metodos y composiciones para el tratamiento de la MTM.
La presente divulgacion proporciona polipeptidos quimericos que comprenden un polipeptido de miotubularina 40 (MTM1) o un fragmento bioactivo del mismo y un grupo internalizante, asf como composiciones que comprenden los polipeptidos quimericos en combinacion con un vehfculo farmaceutico. Tambien se describen constructos utiles para la produccion de tales polipeptidos quimericos. Ademas, la presente divulgacion da a conocer metodos de fabricacion de los polipeptidos quimericos y los constructos que los codifican. Adicionalmente, en el presente documento se describen metodos de uso de los polipeptidos quimericos, por ejemplo, para manipular la actividad 45 fosfatasa en una celula y como parte de un tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas a la mutacion o deficiencia de MTM1.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un polipeptido quimerico que comprende (i) un polipeptido de miotubularina (MTM1) o un fragmento bioactivo del mismo y (ii) un grupo internalizante. En ciertos aspectos, el 50 polipeptido quimerico tiene actividad fosfoinosftido fosfatasa. Es decir, el polipeptido quimerico tiene la capacidad de escindir o hidrolizar una molecula de fosoinosftido fosforilada. En ciertos aspectos, un sustrato para el polipeptido quimerico es el PI3 o PIP3. En ciertos aspectos, el grupo internalizante favorece el transporte de dicho polipeptido quimerico al interior de las celulas musculares. En otras palabras, el grupo internalizante ayuda al transito efectivo y eficiente del polipeptido quimerico a traves de las membranas celulares. En algunos aspectos, el grupo internalizante 55 transita a traves de las membranas celulares por medio de un transportador ENT2. En otras palabras, el grupo internalizante favorece el transporte del polipeptido quimerico a traves de las membranas celulares por medio de un transportador ENT2.
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 descrito en el presente documento comprende una secuencia de 60 aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1, o un fragmento bioactivo de la misma. En algunos
aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados por uno o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o un fragmento bioactivo de cualquiera de los anteriores). En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 5 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 representado por la SEC ID N°: 1. En ciertos aspectos, cualquiera de los polipeptidos MTM1 anteriores o siguientes descritos en el presente documento y para uso en un polipeptido quimerico ademas comprenden una o mas porciones de polipeptido que mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida en vivo, la captacion/administracion y/o la purificacion. En ciertos aspectos, cualquiera de los polipeptidos MTM1 anteriores o siguientes y/o polipeptidos quimericos pueden ademas incluir uno o mas epftopos 10 marcadores. Tales epftopos marcadores pueden estar unidos al polipeptido MTM1 y/o al grupo internalizante. Cuando esta presente mas de un epftopo marcador (por ejemplo, 2, 3, 4), los epftopos pueden ser iguales o diferentes.
En algunos aspectos, el grupo internalizante de cualquiera de los polipeptidos quimericos anteriores comprende un 15 anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En ciertos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que
comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %
identica a la SEC ID N°: 4. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de 20 union al antfgeno que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 2. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende: un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 4 y un dominio variable de cadena pesada (VH) que
25 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %
identica a la SEC ID N°: 2. La invencion contempla especfficamente grupos internalizantes basados en cualquier combinacion de las cadenas VH y VL anteriores, por ejemplo, un grupo internalizante que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 98 % identica a la SEC ID N°: 2 y una VL al menos un 96 % identica a la SEC ID N°: 4. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende una VH que comprende la 30 secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 2 y una VL que comprende la secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 4. Tal y como se detalla en el presente documento, los dominios VH y VL puede estar incluidos como parte de un anticuerpo de longitud completa o como parte de un fragmento, tal como un scFv. Asimismo, los dominios VH y VL pueden estar unidos mediante un conector o pueden estar unidos directamente. En cualquier caso, los dominios VH y VL pueden estar unidos en cualquier orientacion (por ejemplo, con el extremo N- 35 terminal del dominio VL al dominio VH o con el extremo N-terminal del dominio VH al dominio VL).
En ciertos aspectos, cualquiera de los polipeptidos quimericos anteriores se puede producir por conjugacion qufmica del polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos anteriores se pueden producir recombinantemente para conjugar recombinantemente el 40 polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. Por ejemplo, el polipeptido quimerico se puede producir usando un vector recombinante que codifica tanto el polipeptido MTM1 como el grupo internalizante. En algunos aspectos, el polipeptido quimerico se produce en una celula procariota o eucariota. Por ejemplo, la celula eucariota se puede seleccionar de entre una celula de levadura, una celula aviar, una celula de insecto o una celula de mamffero. Notese que para los aspectos en los que el polipeptido MTM1 esta conjugado 45 qufmicamente al grupo internalizante, la divulgacion contempla que el polipeptido MTM1 y/o el grupo internalizante se pueden producir recombinantemente.
En algunos aspectos, el polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo se pueden conjugar o unir (ya sea qufmicamente o recombinantemente) al grupo internalizante mediante un conector. En otros aspectos, el polipeptido 50 MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo se pueden conjugar o unir directamente al grupo internalizante. Por ejemplo, un polipeptido quimerico conjugado recombinantemente se puede producir como una fusion en el marco de la porcion MTM1 y la porcion del grupo internalizante. En ciertos aspectos, el conector puede ser un conector escindible. En cualquiera de los aspectos anteriores, el grupo internalizante se puede conjugar (directamente o por medio de un conector) al aminoacido N-terminal o C-terminal del polipeptido MTM1. En otros aspectos, el grupo 55 internalizante se puede conjugar (directamente o indirectamente) a un aminoacido interno del polipeptido MTM1. Notese que las dos porciones del constructo estan conjugadas/unidas entre sf. A menos que se especifique lo contrario, la descripcion del polipeptido quimerico como una conjugacion de la porcion MTM1 al grupo internalizante se usa de forma equivalente que una conjugacion del grupo internalizante a la porcion MTM1. En ciertos aspectos, un conector une una o mas porciones del grupo internalizante, tales como un dominio VH y VL de un anticuerpo. La 60 invencion contempla el uso de 0 conectores, 1 conector, 2 conectores y mas de dos conectores. Cuando se usa mas
de 1 conector, los conectores pueden ser iguales o diferentes.
En ciertos aspectos, cualquiera de los polipeptidos quimericos anteriores se puede formular como composiciones formuladas en un vetnculo farmaceuticamente aceptable. En ciertos aspectos, las composiciones se formulan para 5 administracion intravenosa.
En un aspecto relacionado, la invencion proporciona polipeptidos quimericos que comprenden la secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 11 o la secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 11, pero en ausencia de uno ambos epftopos marcadores. Tales polipeptidos quimericos, asf como cualquiera de los 10 polipeptidos quimericos descritos en el presente documento, se pueden usar en cualquiera de los metodos descritos en el presente documento.
En lo que respecta a los polipeptidos quimericos, la invencion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores y aspectos, asf como combinaciones con cualquiera de los aspectos descritos en la 15 descripcion detallada y los ejemplos. Ademas, cualquiera de los polipeptidos quimericos de la divulgacion puede usarse en cualquiera de los metodos descritos en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un constructo de acido nucleico, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo, conectado operativamente a 20 una secuencia de nucleotidos que codifica un grupo internalizante. En ciertos aspectos, el constructo de acido nucleico codifica un polipeptido quimerico que tiene actividad fosfoinosttido fosfatasa. En ciertos aspectos, el grupo internalizante se dirige a las celulas musculares para favorecer el transporte al interior de las celulas musculares. En otros aspectos, el grupo internalizante transita a traves de las membranas celulares por medio de un transportador ENT2.
25
En algunos aspectos, la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido MTM1 comprende una secuencia de nucleotidos al menos un 90% identica a la SEC iD N°: 5. En ciertos aspectos, la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de nucleotidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a una o mas de las SEC ID N°: 5, 7, o 9. En ciertos aspectos, la secuencia de 30 nucleotidos es una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido MTM1 que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, o 8. En ciertos aspectos, la secuencia de nucleotidos es una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido MTM1 que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la SEC ID N°: 1.
35
En ciertos aspectos, los constructos de acido nucleico tambien pueden comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un conector.
En ciertos aspectos, el grupo internalizante puede ser un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. 40
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende cualquiera de las composiciones de polipeptidos quimericos o constructos de acido nucleico anteriores y un vetnculo farmaceuticamente aceptable. En ciertos aspectos, la composicion tambien puede comprender un segundo agente que actua de forma adicional o sinergica para tratar la miopatfa miotubular, para tener un efecto bioactivo del MTM1 45 en las celulas, y/o para favorecer el transporte al interior de las celulas. El segundo agente puede ser, por ejemplo, una molecula pequena, un polipeptido, un anticuerpo, un oligonucleotido antisentido o una molecula de ARNip.
En lo que respecta a los constructos de acido nucleico, la invencion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de las formas de realizacion descritas 50 en la descripcion detallada y los ejemplos.
En aspectos adicionales, la presente divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de la miopatfa miotubular en un sujeto que necesita del mismo, que comprende la administracion al sujeto de una cantidad efectiva de cualquiera de los polipeptidos quimericos o constructos de acido nucleico anteriores. En ciertos aspectos, el metodo comprende 55 la administracion de un polipeptido quimerico, polipeptidos que comprenden: (I) un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo y (ii) un grupo internalizante que favorece el transporte de dicho polipeptido quimerico al interior de las celulas musculares. En ciertos aspectos, el polipeptido quimerico tiene actividad fosfoinosttido fosfatasa. En ciertos aspectos, el sujeto es un humano. En otros aspectos, el sujeto se selecciona de entre un raton, una rata o un primate no humano.
En algunos aspectos, el grupo internalizante transita a traves de las membranas celulares por medio de un transportador ENT2. En otras palabras, el grupo internalizante favorece el transporte al interior de las celulas por medio de un transportador eNT2. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En ciertas formas de realizacion, el grupo internalizante comprende un 5 anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del mismo.
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1, o un fragmento bioactivo de la misma. En algunos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un 10 polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados en una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o un fragmento bioactivo de cualquiera de los anteriores).
En algunos aspectos, cualquiera de los polipeptidos quimericos anteriores se puede formular con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
15
En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos para uso en el metodo reivindicado se pueden conjugar (por ejemplo, qufmicamente o recombinantemente) tal y como se describe en el presente documento.
En ciertos aspectos, cualquiera de los metodos anteriores tambien puede comprender una segunda terapia que 20 actue de forma adicional o sinergica para el tratamiento de la miopatfa miotubular. En algunos aspectos, la segunda terapia puede ser un farmaco para ayudar a aliviar uno o mas sfntomas de la miopatfa miotubular, o una terapia ffsica u otra terapia no farmacologica para tratar o ayudar a aliviar uno o mas sfntomas de la miopatfa miotubular. Las terapias no farmacologicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, la terapia ventilatoria, la terapia ocupacional, la acupuntura y los masajes.
25
En algunos aspectos, cualquiera de los polipeptidos quimericos anteriores se puede administrar por una via de administracion adecuada, por ejemplo, sistemicamente, localmente o intravenosamente. En ciertos aspectos, el polipeptido quimerico se administra intravenosamente por medio de inyeccion en bolo o infusion.
30 En lo que respecta a los metodos de tratamiento de la miopatfa miotubular, la divulgacion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de las formas de realizacion descritas en la descripcion detallada y los ejemplos.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo de liberacion in vitro de un polipeptido quimerico o 35 un constructo de acido nucleico en el interior de una celula por medio de un transportador equilibrador de nucleosidos (ENT2), que comprende la puesta en contacto de una celula con un polipeptido quimerico o un constructo de acido nucleico. En ciertos aspectos, el metodo comprende la puesta en contacto de una celula con un polipeptido quimerico, polipeptido quimerico que comprende un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo y un grupo internalizante que media el transporte a traves de una membrana celular por medio de un ENT2, 40 liberando de ese modo el polipeptido quimerico en el interior de la celula. En ciertos aspectos, la celula es una celula muscular.
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1, o un fragmento bioactivo de la misma. En algunas formas de realizacion, el polipeptido MTM1 45 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados en una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o un fragmento bioactivo de cualquiera de los anteriores).
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 puede ademas comprender una o mas porciones de polipeptido que 50 mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion y/o la purificacion. En otras formas de realizacion, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En otras formas de realizacion, el grupo internalizante comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del mismo.
55 En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos para uso en el metodo se pueden producir por conjugacion qufmica del polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En algunos aspectos, el polipeptido quimerico se puede producir recombinantemente para conjugar recombinantemente el polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En ciertas formas de realizacion, los polipeptidos quimericos para uso en el metodo reivindicado se pueden conjugar (por ejemplo, qufmicamente o 60 recombinantemente) tal y como se describe en el presente documento.
En lo que respecta a los metodos de liberacion de un polipeptido quimerico en el interior de una celula por medio de un transportador equilibrador de nucleosidos (ENT2), la divulgacion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de las formas de realizacion descritas 5 en la descripcion detallada y los ejemplos.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo de liberacion de un polipeptido quimerico en el interior de una celula muscular, que comprende la puesta en contacto de una celula muscular con un polipeptido quimerico o un constructo de acido nucleico. En ciertos aspectos, el metodo comprende la puesta en contacto de la 10 celula muscular con un polipeptido quimerico, polipeptido quimerico que comprende un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo y un grupo internalizante que favorece el transporte al interior de las celulas musculares, liberando de ese modo el polipeptido quimerico en el interior de la celula muscular. En ciertos aspectos, el grupo internalizante favorece el transporte por medio de un transportador equilibrador de nucleosidos (ENT2).
15 En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1, o un fragmento bioactivo de la misma. En algunos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados en una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o un fragmento bioactivo de los mismos).
20
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 puede ademas comprender una o mas porciones de polipeptido que mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion y/o la purificacion. En otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del 25 mismo.
En algunos aspectos, el polipeptido quimerico de cualquiera de los metodos anteriores se puede producir por conjugacion qmmica del polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En otros aspectos, el polipeptido quimerico se puede producir recombinantemente para conjugar de recombinantemente el 30 polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos para uso en el metodo reivindicado se pueden conjugar (por ejemplo, qmmicamente o recombinantemente) tal y como se describe en el presente documento.
En lo que respecta a los metodos de liberacion de un polipeptido quimerico en el interior de una celula por medio de 35 un transportador equilibrador de nucleosidos (ENT2), la invencion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de las formas de realizacion descritas en la descripcion detallada y los ejemplos.
En otros aspectos, la presente divulgacion proporciona un metodo de liberacion de un polipeptido en un sujeto con 40 necesidad del mismo, que comprende la administracion a un sujeto con necesidad del mismo de un polipeptido quimerico o un constructo de acido nucleico. En ciertos aspectos, el metodo comprende la administracion de un polipeptido quimerico, polipeptido quimerico que comprende un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo y un grupo internalizante que favorece el transporte al interior de las celulas musculares, liberando de ese modo el polipeptido quimerico en el interior de la celula muscular. En ciertos aspectos, el grupo internalizante 45 favorece el transporte por medio de un transportador ENT2.
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1, o un fragmento bioactivo de la misma. En algunas formas de realizacion, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica 50 a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados en una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o un fragmento bioactivo de los mismos).
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 puede ademas comprender una o mas porciones de polipeptido que mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion y/o la purificacion. En 55 otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del mismo.
En algunos aspectos, el polipeptido quimerico de cualquiera de los metodos anteriores se puede producir por 60 conjugacion qmmica del polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En otros
aspectos, el polipeptido quimerico se puede producir recombinantemente para conjugar de recombinantemente el polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos para uso en el metodo reivindicado se pueden conjugar (por ejemplo, qufmicamente o recombinantemente) tal y como se describe en el presente documento.
5
En ciertos aspectos, el sujeto de cualquiera de los metodos anteriores puede ser un humano. En algunos aspectos el metodo de suministro puede ser, por ejemplo, por via parenteral o intravenosa. En ciertos aspectos, el polipeptido quimerico se administra intravenosamente, por ejemplo, por medio de inyeccion en bolo o infusion.
10 En lo que respecta a los metodos de suministro de un polipeptido quimerico al interior de las celulas musculares, la invencion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de las formas de realizacion descritas en la descripcion detallada y los ejemplos.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para aumentar la bioactividad del MTM1 en una 15 celula muscular, que comprende la puesta en contacto de una celula muscular con un polipeptido quimerico, polipeptido quimerico que comprende un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo y un grupo internalizante que favorece el transporte al interior de las celulas musculares, aumentando de ese modo la bioactividad del MTM1 en la celula muscular. En ciertos aspectos, el grupo internalizante favorece el transporte por medio de un transportador ENT2.
20
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1, o un fragmento bioactivo de la misma. En algunos aspectos, el polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados en una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o 25 fragmentos bioactivos de cualquiera de los anteriores).
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 puede ademas comprender una o mas porciones de polipeptido que mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion y/o la purificacion. En otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En 30 otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del mismo.
En otros aspectos, el polipeptido quimerico para uso en cualquiera de los metodos anteriores se puede producir por conjugacion qufmica del polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En otros 35 aspectos, el polipeptido quimerico se puede producir recombinantemente para conjugar de recombinantemente el polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante.
En algunos aspectos, la bioactividad del MTM1 incluye, por ejemplo, actividad fosfoinosftido fosfatasa del MTM1, o asociacion del MTM1 con una protefna endosomal, o ambas. En ciertos aspectos, la actividad fosfoinosftido es al 40 menos el 50 % de la del MTM1 nativo, o al menos el 80 % de la de MTM1 nativo. En otros aspectos, la actividad fosfoinosftido es al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100% de la del MTM1 nativo. La bioactividad se puede evaluar en comparacion con la de un control.
En lo que respecta a los metodos de aumento de la bioactividad del MTM1 en las celulas, la invencion contempla 45 todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de las formas de realizacion descritas en la descripcion detallada y los ejemplos. Los metodos anteriores basados en la administracion de polipeptidos quimericos o en la puesta en contacto de las celulas con un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados por una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, 8, o 50 fragmentos bioactivos de cualquiera de los anteriores).
En ciertos aspectos, el polipeptido MTM1 puede ademas comprender una o mas porciones de polipeptido que mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion y/o la purificacion. En otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En 55 otros aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antfgeno del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal 3E10, o una variante del mismo que retenga la actividad de penetracion celular del 3E10, o un fragmento de union al antfgeno del 3E10, o dicha variante del 3E10. Adicionalmente, el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo puede ser un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno que se una al mismo epftopo que el 3E10, o un 60 anticuerpo o fragmento de union al antfgeno que tenga sustancialmente la misma actividad de penetracion celular
que el 3E10, o un fragmento de union al antfgeno del mismo. aspecto
En otros aspectos, el polipeptido quimerico para uso en cualquiera de los metodos anteriores se puede producir por conjugacion qufmica del polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante. En otros 5 aspectos, el polipeptido quimerico se puede producir recombinantemente para conjugar de recombinantemente el polipeptido MTM1, o un fragmento bioactivo del mismo, al grupo internalizante.
En algunos aspectos, la bioactividad del MTM1 incluye, por ejemplo, actividad fosfoinosftido fosfatasa del MTM1, o asociacion del MTM1 con una protefna endosomal, o ambas. En ciertos aspectos, la actividad fosfoinosftido es al 10 menos el 50 % de la del MTM1 nativo, o al menos el 80 % de la de MTM1 nativo. En otros aspectos, la actividad fosfoinosftido es al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100% de la del MTM1 nativo. La bioactividad se puede evaluar en comparacion con la de un control.
En lo que respecta a los metodos de aumento de la bioactividad del MTM1 en las celulas, la invencion contempla 15 todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, asf como combinaciones con cualquiera de los aspectos expuestos en la descripcion detallada y los ejemplos. Los metodos anteriores basados en la administracion de polipeptidos quimericos o en la puesta en contacto de celulas con polipeptidos quimericos se pueden realizar in vitro (por ejemplo, en celulas o cultivos) o in vivo (por ejemplo, en un paciente o modelo animal). En ciertos aspectos, el metodo es un metodo in vitro. En ciertos aspectos, el metodo es un metodo in vivo.
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En otros aspectos, la presente divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de cualquiera de los polipeptidos quimericos anteriores tal y como se describe en el presente documento. Ademas, la presente divulgacion contempla cualquier numero de combinaciones de los metodos y composiciones anteriores.
25 La divulgacion contempla todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores y aspectos, asf como combinaciones con cualquiera de los aspectos descritos en la descripcion detallada y los ejemplos.
BREVE DESCRIPCION DE LAS TABLAS
30 Tabla 1. Diseno experimental para evaluar la actividad fosfoinosftido fosfatasa, la asociacion endosomal y la secrecion de Fv3E10-GS3-hMTM1 conjugado geneticamente. Ciertos resultados pronosticados para los grupos de control se indican mediante “sf” o “no”, “?” indica resultados que se deben medir. "+" o "-" indica la presencia o ausencia de un compuesto concreto en la muestra. "*" indica que el pronostico esta basado en la suposicion de que las actividades fosfoinosftido fosfatasa seran funcion de la actividad endogena y dependiente del hMTM1.
35
Tabla 2. Diseno experimental para evaluar si Fv3E10-GS3-hMTM1 entra en las celulas por medio de transportadores ENT y se asocia con las protefnas endosomales. Veanse las anotaciones en la descripcion de la Tabla 1. "*" indica que la muestra ha inmunoprecipitado y se ha detectado mediante inmunoelectrotransferencia solo si ha inmunoprecipitado en la Tabla 1, grupos 10 a 18. "**" indica que la prediccion se basa en la suposicion de que el 40 conjugado genetico no tiene defectos de asociacion entre Vps34 y hMTM1.
Tabla 3. Plan de dosificacion in vivo para 3E10-MTM1 conjugado qufmicamente y geneticamente. La dosificacion planeada es de dos veces a la semana durante 20 semanas. La sangre y los tejidos se recogeran para inmunohistoqufmica (IHQ), tincion de hematoxilina y eosina (H&E) y aislamiento de protefnas.
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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Las protefnas de la familia MTM se dividen en dos categorfas basicas: los miembros de la familia que exhiben actividad fosfoinosftido fosfatasa y los miembros de la familia que se unen a fosfoinosftidos pero son catalfticamente 50 inactivos. El MTM1, cuyas mutaciones derivan en miopatfa miotubular, es catalfticamente activo y posee actividad fosfoinosftido fosfatasa. Algunos ejemplos de fosfoinosftidos que actuan como sustratos para el MTM1 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fosfatidilinositol 3-fosfato (PI(3)P), PI(4)P, PI(5)P, PI(3,4)P2, PI(4,5) P2, PI(3,5) P2, PI(3,4,5) P3, asf como compuestos fosfoinosftidos utiles para ensayos in vitro. En ciertos aspectos, el polipeptido quimerico es capaz de escindir o hidrolizar uno o mas de los fosfoinosftidos anteriores. En ciertas formas de 55 realizacion, el polipeptido quimerico es capaz de escindir o hidrolizar el PIP3.
La MTM1, asf como otras protefnas relacionadas con las MTM (MTMRs) se agrupan individualmente o en heterodfmeros en las vesfculas endocfticas en diferentes etapas del transporte subcelular. La MTM1 se asocia con la MTMR12 e interacciona con otras protefnas endosomales tales como la GTPasa Rab5 y la PI 3-quinasa hVps34 por 60 medio de la molecula adaptadora hVps15. Sin limitacion teorica, las actividades diferenciales de reclutamiento y
oposicion de la MTM1 PIP3 fosfatasa y la hVps34 PI-3 quinasa pueden coordinar la distribucion temporal en la membrana de PI y PIP3 que dirige los patrones de trafico intracelular de las vesfculas endocfticas. Aunque otras protefnas relacionadas con las MTM poseen actividad fosfoinosftido fosfatasa, su localizacion subcelular no es lo suficientemente superpuesta a la de la MTM1 como para que sean incapaces de compensar funcionalmente la 5 deficiencia de MTMl. La MTM1 se expresa de forma generalizada, aunque la ausencia de MTM1 en el musculo esqueletico solo se justifica para la fisiopatologfa de la MTM (Taylor GS et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Aug 1;97(16):8910-5; Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5), y sugiere que la actividad fofoinosftido fosfatasa de la MTM1 posee una funcion subcelular unica que es particularmente crucial para el funcionamiento normal del musculo esqueletico. Se cree que la MTM1 participa en el mantenimiento de la 10 arquitectura longitudinal y transversal del sistema de tubulos T y, de ese modo, los defectos en la organizacion de estas estructuras afectarfan al acoplamiento excitacion-contraccion y derivarfan en la subsiguiente debilidad muscular y atrofia caracterfsticas de la enfermedad (Bello AB et al., Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 14; Laporte J et al., HUMAN MUTATION 15:393.409 (2000); Herman GE et al., THE JOURNAL OF PEDIATRICS VOLUME 134,NUMBER 2; Weisbart RH et al., J Immunol. 2000 Jun 1;164(11):6020-6).
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En ciertos aspectos, la invencion proporciona conjugados de MTM1 (por ejemplo, polipeptidos quimericos que comprenden MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo) que se pueden usar para tratar afecciones asociadas a la deficiencia de MTM1, por ejemplo, la miopatfa miotubular. Los terminos "polipeptido," "peptido" y "protefna" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. Los terminos se 20 aplican a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacido es un mimetico qufmico artificial de un aminoacido presente naturalmente correspondiente, asf como a polfmeros de aminoacidos presentes naturalmente y polfmeros de aminoacidos no presentes naturalmente.
I. Polipeptidos MTM1
25
Tal y como se usan en el presente documento, los polipeptidos MTM1 incluyen diversas isoformas generadas mediante corte y empalme, variantes, protefnas de fusion y formas modificadas del polipeptido MTM1 de tipo salvaje. Tales isoformas, fragmentos bioactivos o variantes, protefnas de fusion y formas modificadas de los polipeptidos MTM1 tienen al menos una porcion de la secuencia de aminoacidos de identidad de secuencia substancial con la 30 protefna MTM1 nativa y retienen al menos una funcion de la protefna nativa MTM1. En ciertos aspectos, un fragmento bioactivo, variante, o protefna de fusion de un polipeptido MTM1 comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a un polipeptido MTM1 (tal como los polipeptidos MTM1 representados en una o mas de las SEC ID N°: 1, 6, y 8). Tal y como se usa en el presente documento, “fragmentos” se entiende que incluyen fragmentos bioactivos o variantes bioactivas que 35 exhiben “bioactividad” tal y como se describe en el presente documento. Es decir, los fragmentos bioactivos o variantes de MTM1 exhiben bioactividad que se puede medir y ensayar. Por ejemplo, los fragmentos bioactivos o variantes exhiben la misma, o sustancialmente la misma, bioactividad que la protefna MTM1 nativa (es decir, de tipo salvaje o normal), y tal bioactividad se puede evaluar mediante la capacidad del fragmento o variante para, por ejemplo, escindir o hidrolizar un sustrato fosfoinosftido endogeno conocido en la tecnica, o un sustrato fosfoinosftido 40 artificial para ensayos in vitro (es decir, una actividad fosfoinosftido fosfatasa), reclutar y asociarse con otras protefnas tales como, por ejemplo, la GTPasa Rab5, la PI 3-quinasa Vps34 o Vps15 (es decir, localizacion adecuada), o tratar la miopatfa miotubular. En el presente documento se describen los metodos de evaluacion de cualquiera de estos criterios. Tal y como se usa en el presente documento, “sustancialmente el/la/los/las mismo/a/os/as” se refiere a cualquier parametro (por ejemplo, la actividad) que es al menos el 70 % de un control 45 contra el que se mide el parametro. En ciertos aspectos, "sustancialmente el/la/los/las mismo/a/os/as" tambien se refiere a cualquier parametro (por ejemplo, la actividad) que es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 102 %, 105 %, o 110 % de un control contra el que se mide el parametro.
La estructura y los diversos motivos del polipeptido MTM1 se han caracterizado bien en la tecnica (vease, por 50 ejemplo, Laporte et al., 2003, Human Molecular Genetics, 12(2):R285-R292; Laporte et al., 2002, Journal of Cell Science 15:3105-3117; Lorenzo et al., 2006, 119:2953-2959). Por tanto, en ciertos aspectos, diversos fragmentos o variantes bioactivos de los polipeptidos MTM1 se pueden disenar e identificar mediante cribado de los polipeptidos fabricados, por ejemplo, recombinantemente a partir del correspondiente fragmento de acido nucleico que codifica un polipeptido MTM1. Por ejemplo, varios dominios de la MTM1 han demostrado ser importantes para su actividad 55 fosfatasa o localizacion. A modo ilustrativo, entre estos dominios se incluyen: la glucosiltransferasa, el activador GTPasa tipo Rab y las miotubularinas (GRAM; posiciones de aminoacidos 29-97 o superiores a 160 de la SEC ID N°: 1), dominio de reclutamiento inducido por Rac (RID; posiciones de aminoacidos 161-272 de la SEC ID N°: 1), homologfa PTP/DSP (posiciones de aminoacidos 273-471 de la SEC ID N°: 1; cistefna catalftica es el aminoacido 375 de la SEC ID N°: 1), dominio de interaccion SET (SID; posiciones de aminoacidos 435-486 de la SEC ID N°: 1). 60 En consecuencia, se puede construir cualquier combinacion de tales dominios para identificar fragmentos o variantes
de la MTM1 que exhiban la misma, o substancialmente la misma, bioactividad que la MTM1 nativa. Los fragmentos bioactivos adecuados se pueden usar para fabricar polipeptidos quimericos, y tales polipeptidos quimericos se pueden usar en cualquiera de los metodos descritos en el presente documento.
5 Los fragmentos ejemplares que se pueden usar como parte de un polipeptido quimerico incluyen, por ejemplo, aproximadamente los residuos 29-486 de la SEC ID N°: 1. Por consiguiente, en ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos comprenden los residuos 29-486 de la SEC ID N°: 1.
En ciertos aspectos, la porcion MTM1 del polipeptido quimerico corresponde a la secuencia de la MTM1 humana. 10 Por ejemplo, la porcion MTM1 del polipeptido quimerico comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 1.
Ademas, los fragmentos o variantes se pueden sintetizar qufmicamente usando tecnicas conocidas en la tecnica
tales como la sfntesis qufmica en fase solida f-Moc y t-Boc de Merrifield convencional. Los fragmentos o variantes se 15 pueden producir (recombinantemente o mediante sfntesis qufmica) y ensayar para identificar aquellos fragmentos o variantes que pueden funcionar tan bien como, o de forma sustancialmente similar a, la protefna MTM1 nativa, por ejemplo, ensayando su capacidad para escindir o hidrolizar un sustrato fosfoinosftido endogeno o un sustrato fosfoinosftido sintetico (es decir, actividad fosfoinosftido fosfatasa), reclutar y/o asociarse con otras protefnas tales como, por ejemplo, la GTPasa Rab5, la PI 3-quinasa hVps34 o hVps15 (es decir, localizacion adecuada), o tratar la 20 miopatfa miotubular.
En ciertos aspectos, la presente divulgacion contempla la modificacion de la estructura de un polipeptido MTM1 para propositos tales como mejorar la eficacia terapeutica o profilactica, o la estabilidad (por ejemplo, la semivida ex vivo y la resistencia a la degradacion proteolftica in vivo). Tales polipeptidos MTM1 tienen la misma o sustancialmente la 25 misma bioactividad que los polipeptidos MTM1 presentes naturalmente (es decir, nativos o tipo salvaje). Los
polipeptidos modificados se pueden producir, por ejemplo, por sustitucion, delecion o adicion de aminoacidos. Por
ejemplo, es razonable esperar, por ejemplo, que una sustitucion aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitucion similar de un aminoacido por un aminoacido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservadoras) no tendra un impacto importante 30 en la actividad biologica de la molecula resultante. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que estan relacionados por sus cadenas laterales.
Esta invencion ademas contempla la generacion de conjuntos de mutantes combinatoriales de un polipeptido MTM1, asf como mutantes por truncamiento, y es especialmente util para la identificacion de secuencias de variantes 35 bioactivas. Se pueden generar variantes obtenidas combinatorialmente que tengan una potencia selectiva en comparacion con un polipeptido MTM1 presente naturalmente. Del mismo modo, la mutagenesis puede dar lugar a variantes que tengan semividas intracelulares drasticamente diferentes de las del polipeptido MTM1 de tipo salvaje. Por ejemplo, la protefna alterada se puede hacer mas estable o menos estable a la degradacion proteolftica u otros procesos celulares que derivan en la destruccion o inactivacion de la protefna que nos interesa. Tales variantes se 40 pueden utilizar para alterar el nivel del polipeptido MTM1 mediante modulacion de su semivida. Hay muchas formas de generar la biblioteca de potenciales secuencias de variantes de MTM1, por ejemplo, a partir de la secuencia de un oligonucleotido degenerado. La sfntesis qufmica de una secuencia genetica degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automatico y, a continuacion, los genes sinteticos se pueden ligar a un gen adecuado para su expresion. El proposito de un conjunto degenerado de genes es proporcionar, en una mezcla, todas las 45 secuencias que codifican el grupo deseado de secuencias de polipeptidos potenciales. La sfntesis de oligonucleotidos es bien conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Tales tecnicas han sido empleadas en la evolucion dirigida de otras protefnas 50 (vease, por ejemplo, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; asf como las patentes: US5223409; US5198346; y US5096815.
Alternativamente, se pueden utilizar otras formas de mutagenesis para generar una biblioteca combinatorial. Por 55 ejemplo, se pueden generar variantes del polipeptido MTM1 y aislarlas de una biblioteca mediante cribado usando, por ejemplo, mutagenesis por escaneo de alanina y similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), mediante mutagenesis de escaneo del 60 conector (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et
al., (1982) Science 232:316); mediante mutagenesis por saturacion (Meyers et al., (1986) Science 232:613); mediante mutagenesis por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); o mediante mutagenesis aleatoria, mutagenesis qufmica incluida, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). La mutagenesis por escaneo del 5 conector, particularmente en un entorno combinatorial, es un atractivo metodo para la identificacion de formas truncadas (bioactivas) del polipeptido MTM1.
En la tecnica se conocen un amplio rango de tecnicas para el cribado de productos genicos de bibliotecas combinatoriales producidos mediante mutaciones y truncamientos puntuales, y, es mas, para el cribado de 10 genotecas de ADNc en busca de productos genicos que tienen una propiedad determinada. Generalmente, tales tecnicas seran adaptables para permitir el cribado rapido de las genotecas genicas mediante mutagenesis combinatorial de los polipeptidos MTM1. Habitualmente, las tecnicas mas ampliamente usadas para cribar genotecas genicas grandes comprenden el clonado de la genoteca genica en vectores de expresion replicables, la transformacion de las celulas adecuadas con la biblioteca de vectores resultante y la expresion de los genes 15 combinatoriales bajo condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilite el relativamente facil aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Cada uno de los ensayos ilustrativos descritos a continuacion son susceptibles de analisis de alto rendimiento, segun sea necesario, para cribar numeros altos de secuencias degeneradas creadas mediante tecnicas de mutagenesis combinatorial.
20 En ciertos aspectos, un polipeptido MTM1 puede incluir un peptido y un peptidomimetico. Tal y como se usa en el presente documento, el termino “peptidomimetico” incluye peptidos modificados qufmicamente y moleculas similares a los peptidos que contienen aminoacidos no presentes naturalmente, peptoides y similares. Los peptidomimeticos ofrecen diversas ventajas sobre los peptidos, entre las que se incluye una mayor estabilidad cuando se administran a un sujeto. Los metodos de identificacion de un peptidomimetico son bien conocidos en la tecnica e incluyen el 25 cribado de bases de datos que contienen bibliotecas de peptidomimeticos potenciales. Por ejemplo, la base de datos estructurales de Cambridge contiene una coleccion de mas de 300 000 compuestos que tienen estructuras cristalinas conocidas (Allen et al., Acta Crystallogr. Section B, 35:2331 (1979)). Cuando la estructura de una molecula diana no esta disponible, se puede generar una estructura usando, por ejemplo, el programa CONCORD (Rusinko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29:251 (1989)). Otra base de datos, el Directorio de Productos Qufmicos 30 Disponibles (Molecular Design Limited, Informations Systems; San Leandro Calif.), contiene aproximadamente 100 000 compuestos que estan disponibles en el mercado y tambien se puede buscar en ella para identificar peptidomimeticos potenciales de los polipeptidos MTM1.
En ciertos aspectos, un polipeptido MTM1 puede tambien comprender modificaciones postraduccionales. Las 35 modificaciones postraduccionales ejemplares de protefnas incluyen la fosforilacion, acetilacion, metilacion, ADP- ribosilacion, ubiquitinacion, glicosilacion, carbonilacion, sumoilacion, biotinilacion o la adicion de una cadena lateral de un polipeptido o de un grupo hidrofobo. Como resultado, los polipeptidos MTM1 modificados pueden contener elementos que no sean aminoacidos, tales como lfpidos, poli- o monosacaridos y fosfatos. Se pueden ensayar los efectos de tales elementos que no son aminoacidos sobre la funcionalidad de un polipeptido MTM1 en cuanto a su 40 actividad biologica, por ejemplo, su capacidad para tratar la miopatfa miotubular o su capacidad para escindir fosfoinosftidos (por ejemplo, PlP3). Dado que el polipeptido MTM1 nativo esta glicosilado, en ciertos aspectos, un polipeptido MTM1 usado en un polipeptido quimerico de acuerdo con la presente divulgacion esta glicosilado. En ciertos aspectos, el nivel y patron de glicosilacion son los mismos o sustancialmente los mismos que los del polipeptido MTM1 nativo. En otros aspectos, el nivel y/o patron de glicosilacion difiere de el del polipeptido MTM1 45 nativo (por ejemplo, esta subglicosilado, superglicosilado o no glicosilado).
En un aspecto especffico de la presente divulgacion, un polipeptido MTM1 se puede modificar con polfmeros no protefnicos. En un aspecto especffico, el polfmero es el polietilenglicol ("PEG"), el polipropilenglicol o polioxialquilenos, tal y como se describe en las patentes US4640835; US4496689; US4301144; US4670417; 50 US4791192 o US4179337. El PEG es un polfmero hidrosoluble bien conocido que se encuentra disponible en el mercado o se puede preparar mediante polimerizacion por apertura de anillo del etilenglicol de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138161).
55 En ciertos aspectos, los fragmentos o variantes del polipeptido MTM1 retendran preferentemente al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la actividad biologica asociada al polipeptido MTM1 nativo. En ciertos aspectos, los fragmentos o variantes del polipeptido MTM1 tienen una semivida (t1/2) mejorada en comparacion con la semivida de la protefna nativa. Para los aspectos en los que la semivida esta mejorada, la semivida de los fragmentos o variantes del MTM1 estara mejorada en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % o 500 %, o incluso en un 1000
% en comparacion con la semivida de la protefna MTM1 nativa. En algunos aspectos, la semivida de la protefna se determina in vitro, tal como en una solucion salina tamponada o en suero. En otros aspectos, la semivida de la protefna es una semivida in vivo, tal como la semivida de la protefna en el suero u otro fluido corporal de un animal.
5 En ciertos aspectos, un polipeptido MTM1 puede ser una protefna de fusion que ademas comprende uno o mas dominios de fusion. Entre los ejemplos bien conocidos de tales dominios de fusion se incluyen, pero no se limitan a, la polihistidina, Glu-Glu, la glutation-S-transferasa (GST), la tiorredoxina, la protefna A, la protefna G y una region constante de una cadena pesada de inmunoglobulina (Fc) y la protefna de union a maltosa (MBP), que son particularmente utiles para el aislamiento de las protefnas de fusion mediante cromatograffa de afinidad. Para los 10 propositos de la purificacion por afinidad, se usan matrices pertinentes para la cromatograffa de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutation, amilasa y nfquel o cobalto. Los dominios de fusion tambien incluyen “epftopos marcadores”, que normalmente son secuencias peptfdicas cortas para las que hay disponible un anticuerpo especffico. Entre los epftopos marcadores para los que hay anticuerpos monoclonales especfficos facilmente disponibles, se incluyen los epftopos FLAG, hemaglutinina (HA) del virus de la influenza y c-myc. En algunos casos, 15 los dominios de fusion tienen un sitio de escision por proteasa, tal como el factor Xa o trombina, que permite que la proteasa pertinente digiera parcialmente las protefnas de fusion y de ese modo libere las protefnas recombinantes a partir de las mismas. Entonces, las protefnas liberadas se pueden aislar del dominio de fusion mediante separacion cromatografica posterior. En ciertos aspectos, los polipeptidos MTM1 pueden contener una o mas modificaciones que son capaces de estabilizar los polipeptidos. Por ejemplo, tales modificaciones mejoran la semivida de los 20 polipeptidos in vitro, mejoran la semivida en circulacion de los polipeptidos o reducen la degradacion proteolftica de los polipeptidos. Se debe tener en cuenta que cualquier porcion de un polipeptido quimerico de la invencion puede ser marcada por epftopo de forma similar. En otras palabras, un epftopo marcador puede ser para el MTM1 y/o el grupo internalizante. Asimismo, los polipeptidos quimericos pueden comprender mas de un epftopo marcador, tal como 2 epftopos marcadores, o pueden incluir 0 epftopos marcadores.
25
En algunos aspectos, una protefna MTM1 puede ser una protefna de fusion con toda o una porcion de una region Fc de una inmunoglobulina. De forma similar, en ciertos aspectos, se puede usar toda o una porcion de una region Fc de una inmunoglobulina como conector para conectar una protefna MTM1 a un grupo internalizante. Como se sabe, cada region constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los 30 dominios se denominan consecutivamente como se indica a continuacion: CH1-bisagra-CH2-CH3(-CH4). Las secuencias de ADN de los dominios de cadena pesada tienen homologfa cruzada entre las clases de inmunoglobulinas, por ejemplo, el dominio CH2 de la IgG es homologo al dominio CH2 de la IgA e IgD, y al dominio CH3 de la IgM e IgE. Tal y como se usa en el presente documento, el termino “region Fc de inmunoglobulina” se entiende que significa la porcion terminal carboxilo de una region constante de una cadena de inmunoglobulina, 35 preferentemente la region constante de una cadena pesada de inmunoglobulina o una porcion de la misma. Por ejemplo, una region Fc de inmunoglobulina puede comprender 1) un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, o 5) una combinacion de dos o mas dominios y una region bisagra de inmunoglobulina. En un aspecto preferido, la region Fc de inmunoglobulina comprende al menos una region bisagra de inmunoglobulina, un dominio 40 CH2 y un dominio CH3 y, preferentemente, le falta el dominio CH1. En un aspecto, la clase de inmunoglobulina a partir de la cual se deriva la region constante de la cadena pesada es IgG (IgY) (Y subclases 1, 2, 3, o 4). Se pueden usar otras clases de inmunoglobulinas, IgA (Iga), IgD (Ig6), IgE (Ige) e IgM (Igp). La eleccion de las regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina se trata en detalle en las patentes US5541087, y US5726044. La eleccion de secuencias concretas de la region constante de la cadena pesada de inmunoglobulina de 45 determinadas clases y subclases de inmunoglobulinas para conseguir un resultado concreto se considera que entra dentro de las competencias del experto en la materia. La porcion del constructo de ADN que codifica la region Fc de la inmunoglobulina comprende preferentemente al menos una porcion de un dominio bisagra y, preferentemente, al menos una porcion de un dominio CH3 de Fc y o los dominios homologos de cualquiera de las IgA, IgD, IgE, o IgM. Ademas, se considera que la sustitucion o delecion de aminoacidos de las regiones constantes de la cadena pesada 50 de inmunoglobulina puede ser util en la practica de la invencion. Un ejemplo serfa la introduccion de sustituciones de aminoacidos en la region CH2 superior para crear una variante Fc con una afinidad reducida por los receptores de Fc (Cole et al. (1997) J. IMMUNOL. 159:3613). Cualquier experto en la materia puede preparar tales constructos usando tecnicas de biologfa molecular bien conocidas.
55 II. Grupos internalizantes
Tal y como se usa en el presente documento, el termino “grupo internalizante” se refiere a un grupo capaz de interaccionar con un tejido o tipo de celula diana para liberar la molecula adherida a la celula (es decir, penetrar en la celula deseada, transportarla a traves de la membrana celular). En ciertos aspectos, esta invencion se refiere a un 60 grupo internalizante que selectivamente, aunque no necesariamente de forma exclusiva, se dirige a y penetra en las
celulas musculares. En ciertos aspectos, el grupo internalizante tiene reactividad cruzada limitada y, por tanto, se dirige preferentemente a una celula o tipo de tejido concretos. En ciertos aspectos, entre los grupos internalizantes adecuados se incluyen, por ejemplo, los anticuerpos, los anticuerpos monoclonales o derivados o analogos de los mismos. Entre otros grupos internalizantes se incluyen, por ejemplo, los peptidos localizadores, las protefnas de 5 fusion, los receptores, los ligandos, los aptameros, los peptidomimeticos y cualquier miembro de un par de union especffico. En ciertos aspectos, el grupo internalizante media el transito a traves de las membranas celulares por medio de un transportador ENT2.
(a) Anticuerpos
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En ciertos aspectos, un grupo internalizante puede comprender un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal y un anticuerpo humanizado. Sin limitacion teorica, tal anticuerpo puede unirse a un antfgeno de un tejido diana y asf mediar la liberacion del polipeptido quimerico que nos ocupa al tejido diana (por ejemplo, el musculo). En algunos aspectos, los grupos internalizantes pueden comprender fragmentos de 15 anticuerpos, derivados o analogos de los mismos, incluyendo sin limitacion: fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos, asf como versiones multivalentes de los anteriores. Los grupos internalizantes multivalentes incluyen sin limitacion: anticuerpos monoespecfficos o biespecfficos, tales como fragmentos Fv estabilizados por puentes disulfuro, tandems scFv (fragmentos (scFv)2), fragmentos scFv de 20 diacuerpos, tricuerpos o tetracuerpos, que estan habitualmente unidos por enlaces covalentes o fragmentos scFv estabilizados de otra manera (es decir, estabilizados por cremallera o helice de leucina) y moleculas de receptores que interactuan naturalmente con una molecula diana deseada. En ciertos aspectos, los anticuerpos o variantes de los mismos, se pueden modificar para hacerlos menos inmunogenicos cuando se administran a un sujeto. Por ejemplo, si el sujeto es humano, el anticuerpo puede ser “humanizado”, donde la(s) region(es) que determinan la 25 complementariedad del anticuerpo derivado del hibridoma ha(n) sido transplantada(s) a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, tal y como se describe en Jones, P. et al. (1986), Nature, 321, 522-525 or Tempest et al. (1991), Biotechnology, 9, 266-273. Tambien se pueden usar ratones transgenicos u otros mamfferos para expresar anticuerpos humanizados. Tal humanizacion puede ser parcial o completa. En ciertos aspectos, aunque el anticuerpo sea un anticuerpo murino u otro anticuerpo no humano, su puntuacion de humanidad es suficiente y la 30 humanizacion no es necesaria. En otros aspectos mas, el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno es completamente humano.
En ciertos aspectos especfficos, el grupo internalizante comprende el anticuerpo monoclonal 3E10, un fragmento de union al antfgeno del mismo o un fragmento Fv de cadena sencilla del mismo. Tal y como se usa en el presente 35 documento, el termino “anticuerpos” se refiere a anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a una diana seleccionada. Se incluyen los Fv, scFv, Fab' y F(ab')2, los anticuerpos monoclonales y policlonales, los anticuerpos modificados por ingenierfa genetica y los anticuerpos sinteticos o semisinteticos producidos usando expresion en fago o tecnicas alternativas. Los anticuerpos monoclonales 3E10 se pueden reproducir recombinantemente o mediante un hibridoma depositado permanentemente en la American Type Culture 40 Collection (ATCC) bajo el numero de ingreso ATCC PTA-2439 (vease la patente US7189396). Otros anticuerpos adecuados adicionales tienen similar o sustancialmente la misma actividad de penetracion a traves de la membrana que el 3E10 y/o se unen al mismo epftopo que el 3E10 y/o tienen sustancialmente las mismas caracterfsticas de union al antfgeno que el 3E10.
45 El anticuerpo monoclonal 3E10 ha demostrado penetrar en las celulas sin toxicidad y ha atrafdo un considerable interes como medio de liberacion de protefnas y acidos nucleicos en el interior de los espacios citoplasmaticos o nucleares de los tejidos diana (Weisbart RH et al., J Autoimmun. 1998 Oct;11(5):539-46; Weisbart RH, et al. Mol Immunol. 2003 Mar;39(13):783-9; Zack DJ et al., J Immunol. 1996 Sep 1;157(5):2082-8.). Ademas, las secuencias VH y Vk del 3E10 son altamente homologas a los anticuerpos humanos, con puntuaciones z de humanidad 50 respectivas de 0,943 y - 0,880. Por tanto, se espera que el Fv3E10 induzca menos respuesta de anticuerpo que muchos otros anticuerpos humanizados homologados (Abhinandan KR et al., Mol. Biol. 2007 369, 852-862). Un fragmento Fv de cadena sencilla del 3E10 posee toda la capacidad de penetracion celular del anticuerpo monoclonal original, y protefnas tales como la catalasa, distrofina, HSP70 y p53 retienen su actividad tras su conjugacion al Fv3E10 (Hansen JE et al., Brain Res. 2006 May 9;1088(1):187-96; WeisbartRH et al., Cancer Lett. 2003 Jun 10; 55 195(2):211-9; Weisbart RH, et al., J Drug Target. 2005 Feb;13(2):81-7; Weisbart RH et al., J Immunol. 2000 Jun 1;164(11):6020-6; Hansen JE et al., J Biol Chem. 2007 Jul 20;282(29):20790-3). El 3E10 esta integrado en la estructura del anticuerpo presente en todos los mamfferos; una cadena pesada variable de raton y una cadena ligera kappa variable. El 3E10 consigue entrar en las celulas por medio del transportador de nucleotidos ENT2, del que estan particularmente enriquecidos el musculo esqueletico y las celulas cancerosas, y estudios in vitro han 60 demostrado que el 3E10 no es toxico. (Weisbart RH et al., Mol Immunol. 2003 Mar;39(13):783-9; Pennycooke M et
al., Biochem Biophys Res Commun. 2001 Jan 26;280(3):951-9). Dada la afinidad del 3E10 y los fragmentos del mismo por el musculo esqueletico y la capacidad de diversos conjugados de 3E10 y MTM1 para mantener sus respectivas actividades, una terapia recombinante 3E10-MTM1 (y otras variantes de conjugados descritas en el presente documento) representa un valioso enfoque al tratamiento de la MTM. Tal y como se describe en el presente 5 documento, un 3E10 recombinante o un fragmento o variante se pueden conjugar qufmicamente o geneticamente a MTM1 humana (hMTM1) y la actividad de cada conjugado se puede confirmar in vitro. Ademas, los conjugados purificados se pueden inyectar en ratones deficientes en MTM1 y se pueden examinar las mejoras en el fenotipo de la enfermedad, tal y como se describe en el presente documento.
10 El grupo internalizante tambien puede incluir mutantes de mAb 3E10, tales como variantes del 3E10 que retienen las mismas o sustancialmente las mismas caracterfsticas de penetracion celular que el mAb 3E10, asf como variantes modificadas mediante mutacion para mejorar la utilidad del mismo (por ejemplo, con capacidad mejorada para dirigirse a tipos de celulas especfficos, capacidad mejorada para penetrar a traves de la membrana celular, capacidad mejorada para localizar el ADN celular, afinidad de union mejorada y similares). Entre tales mutantes se 15 incluyen variantes donde se introducen una o mas sustituciones conservadoras en la cadena pesada, la cadena ligera y/o la(s) region(es) constante(s) del anticuerpo. Se han caracterizado numerosas variantes del mAb 3E10 en, por ejemplo, las patentes US7189396 y WO2008091911. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 99 %, o 100 % identica a la secuencia de aminoacidos del 3E10, o al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 99 %, o 20 100 % identica a la secuencia de aminoacidos de un Fv de cadena sencilla del 3E10 (por ejemplo, un Fv de cadena sencilla que comprende la SEC ID N°: 2 y la SEC ID N°: 4). En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un Fv de cadena sencilla del 3E10, y la secuencia de aminoacidos del dominio Vh es al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 2, y la secuencia de aminoacidos del dominio Vl es al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 4. La variante 3E10 o fragmento de la misma 25 retiene la funcion de un grupo internalizante.
En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 4. En ciertos aspectos, el grupo 30 internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 2. En ciertos aspectos, el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende: un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID 35 N°: 4 y un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la SEC ID N°: 2. La invencion contempla especfficamente grupos internalizantes basados en cualquier combinacion de las cadenas VH y VL anteriores, por ejemplo, un grupo internalizante que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 98 % identica a la SEC ID N°: 2 y una VL al menos un 96 % identica a la SEC ID N°: 4. En ciertos aspectos, el 40 grupo internalizante comprende una VH que comprende la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 2 y una VL que comprende la secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 4. Tal y como se detalla en el presente documento, los dominios VH y VL puede estar incluidos como parte de un anticuerpo de longitud completa o como parte de un fragmento, tal como un svFv. Asimismo, los dominios VH y VL pueden estar unidos mediante un conector o pueden estar unidos directamente. En cualquier caso, los dominios VH y VL pueden estar unidos en 45 cualquier orientacion (por ejemplo, con el extremo N-terminal del dominio VL al dominio Vh o con el extremo N- terminal del dominio VH al dominio VL).
Como reconocen facilmente los expertos en la materia, el mAb 3E10 alterado (por ejemplo, quimerico, humanizado, injertado con CDR, completamente humano, bifuncional, dfmeros de polipeptidos de un anticuerpo - es decir, una 50 asociacion de dos cadenas polipeptfdicas de un anticuerpo, tales como un brazo de un anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, o un fragmento Fab que comprende dominios de anticuerpo Vl, Vh, Cl y Ch1 , o un fragmento Fv que comprende un dominio Vl y un dominio Vh - anticuerpos de cadena sencilla - por ejemplo, un fragmento scFv que comprende un dominio Vl conectado a un dominio Vh mediante un conector, y similares) - tambien se puede producir mediante metodos bien conocidos en la tecnica. Tales anticuerpos tambien se 55 pueden producir mediante hibridoma, sfntesis qufmica o metodos recombinantes descritos, por ejemplo, en (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory 1988)). Asimismo, se pueden fabricar facilmente otros grupos internalizantes a base de anticuerpos e incluyen roedores, quimericos, humanizados, completamente humanos, etc.
La preparacion de anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, un fragmento Fv de cadena sencilla codificado por VH-conector-VL) es bien conocida en la tecnica. En particular, los metodos de produccion recombinante de fragmentos de anticuerpo mAb 3E10 asf como conjugados del mismo (por ejemplo, Fv3E10-GS3- hMTM1, tal y como se describe en el presente documento) se han descrito en WO 2008/091911. Ademas, los 5 metodos de generacion de fragmentos scFv de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica. El metodo ejemplar de la presente divulgacion usa un conector (GGGGS)3 (SEC ID N°: 3) para unir un dominio VL y VH del 3E10. Sin embargo, se entiende que tambien se pueden disenar otros conectores. Por ejemplo, entre los aminoacidos superficiales habituales de las regiones flexibles de las protefnas se incluyen Gly, Asn y Ser. Se espera que las permutaciones de secuencias de aminoacidos que contienen Gly, Asn y Ser satisfaran los criterios (por ejemplo, que 10 sean flexibles y con un caracter mfnimamente hidrofobo o cargado) para una secuencia de conector. Tambien se pueden usar en la secuencia del conector otros aminoacidos practicamente neutros, tales como Thr y Ala. En un aspecto especffico, se puede usar una longitud de secuencia de conector de aproximadamente 15 aminoacidos para proporcionar una separacion adecuada de dominios de protefnas funcionales, aunque tambien se pueden usar secuencias de conector mas largas o mas cortas. Asimismo, se entiende que, en ciertos aspectos, un polipeptido 15 quimerico puede incluir un conector adicional que una el grupo internalizante a la porcion del polipeptido MTM del polipeptido quimerico. Por tanto, en ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos pueden incluir mas de un conector, tal como dos conectores. Para aspectos en los que el polipeptido quimerico incluye mas de un conector, se entiende que los conectores se seleccionan independientemente y pueden ser el mismo o diferentes.
20 La preparacion de anticuerpos y fragmentos de los mismos tambien se puede realizar mediante un numero indefinido de metodos bien conocidos para general anticuerpos monoclonales. Habitualmente, estos metodos incluyen la etapa de inmunizacion de los animales, habitualmente ratones, con un inmunogeno deseado (por ejemplo, una molecula diana deseada o fragmento de la misma). Una vez que se han inmunizado los ratones, y preferentemente estimulado una o mas veces con el inmunogeno(s) deseado(s), se pueden preparar y cribar 25 hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de acuerdo con metodos bien conocidos (vease, por ejemplo, Kuby, Janis, Immunology, Third Edition, pp. 131-139, W.H. Freeman & Co. (1997), for a general overview of monoclonal antibody production). A lo largo de varias de las decadas pasadas, la produccion de anticuerpos ha llegado a ser extremadamente solida. Los metodos in vitro que combinan el reconocimiento de anticuerpos y tecnicas de expresion en fago permiten la amplificacion y seleccion de anticuerpos con capacidades de union muy 30 especfficas. Vease, por ejemplo, Holt, L. J. et al., "The Use of Recombinant Antibodies in Proteomics," Current Opinion in Biotechnology, 2000, 11:445-449. Habitualmente, estos metodos son mucho menos engorrosos que la preparacion de hibridomas mediante los metodos de preparacion de anticuerpos monoclonales tradicionales. En un aspecto, se puede usar la tecnologfa de expresion en fago para generar un grupo internalizante especffico para una molecula diana deseada. Se provoca una respuesta inmune a un inmunogeno seleccionado en un animal (tal como 35 un raton, conejo, cabra u otro animal) y la respuesta se estimula para expandir la poblacion de celulas B especfficas para el inmunogeno. Se afsla ARN mensajero de esas celulas B, u opcionalmente una poblacion de hibridomas monoclonales o policlonales. El ARNm se somete a transcripcion inversa mediante metodos conocidos usando o un cebador poli-A o cebador(es) especffico(s) para la inmunoglobulina murina, habitualmente especfficos para secuencias adyacentes a las cadenas Vh y Vl deseadas, para generar ADNc. Las cadenas Vh y Vl deseadas se 40 amplifican mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) habitualmente usando grupos de cebadores especfficos a Vh y Vl, y se ligan, separadas por un conector. Los grupos de cebadores especfficos para Vh y Vl estan disponibles en el mercado, por ejemplo, en Stratagene, Inc. de La Jolla, California. Se selecciona el producto conjunto VH-conector-VL (que codifica un fragmento scFv) y se amplifica mediante PCR. Los sitios de restriccion se introducen en los extremos del producto VH-conector-VL mediante PCR con cebadores que incluyen sitios de
45 restriccion y el fragmento scFv se inserta en un vector de expresion adecuado (habitualmente un plasmido) para ser
sometido a expresion en fago. Otros fragmentos, tales como un fragmento Fab' se pueden clonar en vectores de expresion en fago para su expresion superficial en partfculas de fago. El fago puede ser cualquier fago, tal como lambda, pero habitualmente es un fago filamentoso, tal como el fd y M13, habitualmente el M13. En ciertos aspectos, se fabrica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo recombinantemente. En otras palabras, una vez que se
50 conoce la secuencia del anticuerpo (por ejemplo, usando los metodos anteriormente descritos), el anticuerpo se
puede fabricar recombinantemente usando tecnicas estandar. Por tanto, otros anticuerpos y fragmentos de union al antfgeno relacionados con el 3E10 o con caracterfsticas similares de penetracion celular/transito se pueden identificar facilmente mediante cribado, por ejemplo, de una biblioteca de expresion en fago.
55 En ciertos aspectos, los grupos internalizantes se pueden modificar para hacerlos mas resistentes a la escision por proteasas. Por ejemplo, la estabilidad de un grupo internalizante que comprende un polipeptido se puede incrementar mediante sustitucion de uno o mas de los aminoacidos presentes naturalmente en la configuracion (L) por aminoacidos D. En diversos aspectos, al menos el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 80 %, 90 % o 100 % de los residuos de aminoacidos de un grupo internalizante pueden ser de la configuracion D. El cambio de aminoacidos L a 60 D neutraliza la capacidad de digestion de muchas de las peptidasas que se encuentran de forma generalizada en el
tracto digestivo. Alternativamente, se puede conseguir una mejora de la estabilidad de un grupo internalizante que comprende un enlace peptfdico mediante introduccion de modificaciones de las uniones peptfdicas tradicionales. Por ejemplo, la introduccion de un anillo cfclico en la cadena principal del polipeptido puede conferirle una mayor estabilidad para eludir el efecto de muchas enzimas proteolfticas que se sabe que digieren los polipeptidos en el 5 estomago u otros organos digestivos y en el suero. En otros aspectos mas, se puede conseguir la mejora de la estabilidad de un grupo internalizante mediante intercalacion de uno o mas aminoacidos dextrogiros (tales como, fenilalanina dextrogira o triptofano dextrogiro) entre los aminoacidos de un grupo internalizante. En aspectos ejemplares, tales modificaciones aumentan la resistencia a proteasas de un grupo internalizante sin afectar a la actividad o especificidad de la interaccion con una molecula diana deseada.
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(B) Peptidos localizadores
En ciertos aspectos, un grupo internalizante puede comprender un peptido localizador que dirige selectivamente el polipeptido MTM1 quimerico que nos ocupa a traves de una membrana celular y al interior de las celulas. En cierto 15 aspecto, un grupo internalizante puede comprender un peptido localizador que dirige selectivamente el polipeptido MTM1 quimerico en cuestion a un tejido diana (por ejemplo, el musculo). Por ejemplo, la liberacion de un polipeptido quimerico en el musculo puede ser mediada por un peptido localizador que comprende una secuencia de aminoacidos de ASSLNIA. En el documento WO 98/53804 se describen peptidos localizadores ejemplares adicionales. Entre los ejemplos adicionales de peptidos localizadores se incluyen el transactivador de transcripcion 20 del VIH (TAT) que comprende la secuencia de localizacion nuclear Tat48-60; el factor de transcripcion homeodominio de Antennapedia de Drosophila (por ejemplo, penetratina que comprende el homeodominio Antp43- 58 3a helice); peptidos de homoarginina (por ejemplo, Arg7 proteccion del agonista del peptido PKC-£ del corazon de ratas isquemicas); peptidos alfa-helicoidales; peptidos cationicos (protefnas cargadas "superpositivamente").
25 Adicionalmente, los peptidos localizadores para un tejido (u organo) diana se pueden identificar usando diversos metodos bien conocidos en la tecnica. Una vez identificado, en ciertos aspectos, se puede usar un peptido localizador que es selectivo para un tejido diana concreto.
Un metodo ejemplar es el metodo de expresion en fago in vivo. Especfficamente, se expresan secuencias de 30 peptidos aleatorios como peptidos de fusion con las protefnas superficiales del fago, y esta biblioteca de peptidos aleatorios se infunde en la circulacion sistemica. Tras su infusion en ratones huesped, se extraen los tejidos y organos diana, a continuacion, se afsla y se expande el fago, y se repite el proceso de inyeccion dos veces o mas. Cada ronda de inyeccion incluye, por defecto, un componente de seleccion negativo, ya que el virus inyectado tiene la oportunidad de unirse aleatoriamente a los tejidos o de unirse especfficamente a tejidos no diana. Las secuencias 35 del virus que se unen especfficamente a tejidos no diana se eliminaran rapidamente mediante el procedimiento de seleccion, mientras que el numero de fagos de union inespecffica disminuye con cada ronda de seleccion. Muchos laboratorios han identificado los peptidos localizadores selectivos para la vasculatura del cerebro, rinon, pulmon, piel, pancreas, intestino, utero, glandula adrenal, retina, musculo, prostata o tumores. Vease, por ejemplo, Samoylova et al., 1999, Muscle Nerve, 22:460; Pasqualini et al., 1996, Nature, 380:364; Koivunen et al., 1995, Biotechnology, 40 13:265; Pasqualini et al., 1995, J. Cell Biol., 130:1189; Pasqualini et al., 1996, Mole. Psych., 1:421, 423; Rajotte et al., 1998, J. Clin. Invest., 102:430; Rajotte et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:11593. Veanse, tambien, las patentes. US5622699; US6068829; US6174687; US6180084; US6232287; US6296832; US6303573; y US6306365.
III. Polipeptidos quimericos
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Los polipeptidos quimericos de la presente divulgacion se pueden fabricar de diversas maneras. En ciertos aspectos, el C-terminal de un polipeptido MTM1 se puede conectar al N-terminal de un grupo internalizante (por ejemplo, un anticuerpo o un peptido localizador). Alternativamente, el C-terminal de un grupo internalizante (por ejemplo, un anticuerpo o un peptido localizador) se puede conectar al N-terminal de un polipeptido MTM1. Por ejemplo, los 50 polipeptidos quimericos se pueden disenar para colocar el polipeptido MTM1 en el extremo carboxilo o amino terminal de la cadena pesada o ligera del mAb 3E10. En ciertos aspectos, entre las configuraciones potenciales se incluye el uso de porciones truncadas de secuencias de cadena ligera y pesada de un anticuerpo (por ejemplo, mAb 3E10) segun sea necesario para mantener la integridad funcional del polipeptido MTM1 adherido. Aun mas, el grupo internalizante se puede conectar a un residuo interno (no terminal) expuesto del MTM1 o a una variante del mismo. 55 En aspectos adicionales, se puede emplear cualquier combinacion de las configuraciones del grupo internalizante del MTM1, resultando de ese modo una proporcion MTM1:grupo internalizante superior a 1:1 (por ejemplo, dos moleculas de MTM1 a una de grupo internalizante).
El polipeptido MTM1 y el grupo internalizante se pueden conjugar directamente uno al otro. Alternativamente, se 60 pueden conectar uno al otro mediante una secuencia de conector, que separa el polipeptido MTM1 y el grupo
internalizante con una distancia suficiente para garantizar que cada dominio se pliegue adecuadamente para formar sus estructuras secundaria y terciaria. Las secuencias de conector preferidas (1) deben adoptar una conformacion extendida flexible, (2) no deben exhibir propension al desarrollo de una estructura secundaria ordenada que pueda interactuar con los dominios funcionales del polipeptido MTM1 o del grupo internalizante, y (3) deben tener un 5 caracter hidrofobo o cargado mfnimo, que pueda favorecer la interaccion con los dominios de la protefna funcional. Entre los aminoacidos superficiales habituales en las regiones flexibles de las protefnas se incluyen Gly, Asn y Ser. Se espera que las permutaciones de secuencias de aminoacidos que contienen Gly, Asn y Ser satisfaran los criterios anteriormente mencionados para una secuencia de conector. Tambien se pueden usar en la secuencia del conector otros aminoacidos practicamente neutros, tales como Thr y Ala. En un aspecto especffico, se puede usar 10 una longitud de secuencia de conector de aproximadamente 15 aminoacidos para proporcionar una separacion adecuada de dominios de protefnas funcionales, aunque tambien se pueden usar secuencias de conector mas largas o mas cortas. La longitud de la secuencia de conector que separa el polipeptido MTM1 y el grupo internalizante puede ser de 5 a 500 aminoacidos de longitud, o mas preferentemente de 5 a 100 aminoacidos de longitud. Preferentemente, la secuencia de conector es de aproximadamente 5-30 aminoacidos de longitud. En 15 aspectos preferidos, la secuencia de conector es de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoacidos, y resulta mas ventajosa de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoacidos. En otros aspectos, el conector que une el polipeptido MTM1 a un grupo internalizante puede ser un dominio constante de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio constante del mAb3E10 o toda o una porcion de una region Fc de otro anticuerpo). A modo de ejemplo, el conector que une el MTM1 con un grupo internalizante es GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID N°: 10). En 20 ciertos aspectos, el conector es un conector escindible. Tal y como se ha indicado anteriormente, el polipeptido quimerico puede incluir mas de un conector, tal como un conector que una el grupo internalizante al polipeptido MTM y un conector que una porciones del grupo internalizante entre si (por ejemplo, un conector que una un dominio VH y VL de un fragmento Fv de cadena sencilla). Cuando el polipeptido quimerico incluye mas de un conector, tal como dos conectores, los conectores se seleccionan independientemente y pueden ser el mismo o diferentes.
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En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos de la presente divulgacion se pueden generar usando reactivos y protocolos de entrecruzamiento bien conocidos. Por ejemplo, hay un gran numero de agentes de entrecruzamiento qufmico bien conocidos por los expertos en la materia y utiles para el entrecruzamiento del polipeptido MTM1 con un grupo internalizante (por ejemplo, un anticuerpo). Por ejemplo, los agentes de entrecruzamiento son agentes de 30 entrecruzamiento heterobifuncionales, que se pueden usar para conectar moleculas de forma gradual. Los agentes entrecruzadores heterobifuncionales ofrecen la capacidad de disenar mas metodos de acoplamiento mas especfficos para la conjugacion de protefnas, reduciendo de ese modo la incidencia de reacciones secundarias no deseadas tales como polfmeros de homoprotefnas. En la tecnica se conocen una amplia variedad de agentes entrecruzadores heterobifuncionales, entre los que se incluyen el 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo 35 (SMCC), el ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); el (4-yodoacetil)aminobenzoato de N- succinimidilo (SIAB), el 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), el clorhidrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-toluno (SMPT), el 3-(2- piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) y el 6-[3-(2-piridilditio)propionato]hexanoato de succinimidilo (LC- SPDP). Esos agentes de entrecruzamiento que tienen grupos N-hidroxisuccinimida se pueden obtener como 40 analogos de la N-hidroxisulfosuccinimida, que generalmente tienen mayor solubilidad en agua. Ademas, esos agentes de entrecruzamiento que tienen puentes disulfuro en la cadena de enlace se pueden sintetizar, en cambio, como derivados de alquilo para reducir asf la cantidad de escision del conector in vivo. Ademas de los agentes entrecruzadores heterobifuncionales, existe un determinado numero de otros agentes de entrecruzamiento entre los que se incluyen los agentes entrecruzadores homobifuncionales y fotoreactivos. El suberato de disuccinimidilo 45 (DSS), el bismaleimidohexano (BMH) y el dimetilpimelimidato.2 HCl (DMP) son ejemplos de agentes de entrecruzamiento homobifuncionales utiles, y el disulfuro de bis-[B-(4-azidosalicilamido)etilo] (BASED) y el 6(4'- azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato de N-succinimidilo (SANPAH) son ejemplos de agentes entrecruzadores fotoreactivos utiles para su uso en esta invencion. Para conocer un analisis reciente de las tecnicas de acoplamiento de protefnas, vease Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry. 1:2-12.
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Una clase particularmente util de agentes entrecruzadores heterobifuncionales, antes incluidos, contiene el grupo reactivo amina primaria, N-hidroxisuccinimida (NHS) o su analogo hidrosoluble N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo- NHS). Las aminas primarias (grupos epsilon de la lisina) a pH alcalino estan sin protonar y reaccionan por ataque nucleofilo sobre los esteres NHS o sulfo-NHS. Esta reaccion da como resultado la formacion de un enlace amida y la 55 liberacion del NHS o sulfo-NHS como subproducto. Otro grupo reactivo util como parte de un agente entrecruzador heterobifuncional es un grupo reactivo tiol. Entre los grupos reactivos tiol comunes se incluyen las maleimidas, los halogenos y los disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan especfficamente con los grupos sulfhidrilo (residuos de cistefna) en minutos, en condiciones neutras o ligeramente acidas (pH 6,5-7,5). Los halogenos (funciones yodoacetilo) reaccionan con los grupos -SH a pH fisiologicos. Ambos grupos reactivos dan como resultado la 60 formacion de enlaces tioeter estables. El tercer componente del agente entrecruzador heterobifuncional es el brazo
espaciador o puente. El puente es la estructura que conecta los dos extremos reactivos. El atributo mas aparente del puente es su efecto sobre el impedimento esterico. En algunos casos, un puente mas largo puede abarcar mas facilmente la distancia necesaria para conectar dos biomoleculas complejas.
5 La preparacion de conjugados de protefnas usando reactivos heterobifuncionales es un procedimiento de dos etapas que implica la reaccion de la amina y la reaccion del sulfhidrilo. Para la primera etapa, la reaccion de la amina, la protefna seleccionada debe contener una amina primaria. Esta puede ser una amina epsilon de lisina o una amina primaria alfa que se encuentra en el extremo N-terminal de la mayorfa de protefnas. La protefna no debe contener grupos sulfhidrilo libres. En los casos en los que las protefnas que se deben a conjugar contienen grupos sulfhidrilo 10 libres, una protefna se puede modificar de tal forma que todos los sulfhidrilos esten bloqueados usando, por ejemplo, N-etilmaleimida (vease Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263). Se puede usar el reactivo de Ellman para calcular la cantidad de grupos sulfhidrilo en una protefna concreta (vease, por ejemplo, Ellman et al. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 y Riddles et al. (1979) Anal. Biochem. 94:75).
15 En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos de la invencion se pueden producir mediante el uso de un sistema de transporte universal. Por ejemplo, un polipeptido MTM1 se puede conjugar a un vehfculo tal como una protefna A, poli-L-lisina, hex-histidina y similares. A continuacion, el vehfculo conjugado formara un complejo con un anticuerpo que actua como grupo internalizante. Se podrfa usar como vehfculo una pequena porcion de la molecula del vehfculo que es responsable de la union de la inmunoglobulina.
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En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos de la invencion se pueden producir usando tecnicas de qufmica proteica estandar tales como las descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) and Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992). Ademas, se dispone en el mercado de sintetizadores automatizados de peptidos (por ejemplo, Advanced ChemTech 25 Model 396; Milligen/Biosearch 9600). En cualquiera de los metodos anteriores de entrecruzamiento para la conjugacion qufmica del MTM1 a un grupo internalizante, se puede usar un dominio escindible o un conector escindible. La escision permitira la separacion del grupo internalizante y el polipeptido MTM1. Por ejemplo, despues de la penetracion de un polipeptido quimerico en una celula, la escision del conector escindible permitira la separacion del MTM1 del grupo internalizante.
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En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos de la presente divulgacion se pueden generar en forma de una protefna de fusion que contiene un polipeptido MTM1 y un grupo internalizante (por ejemplo, un anticuerpo o un peptido localizador), expresada en forma de una cadena polipeptfdica contigua. En el presente documento, se hacer referencia a tales polipeptidos quimericos como conjugados recombinantemente. En la preparacion de tales 35 protefnas de fusion, se construye un gen de fusion que comprende acidos nucleicos que codifican un polipeptido MTM1 y un grupo internalizante y, opcionalmente, una secuencia de peptido conector que distancia el polipeptido MTM1 del grupo internalizante. El uso de tecnicas de ADN recombinante para crear un gen de fusion, en el que el producto de traduccion es la protefna de fusion deseada, es bien conocido en la tecnica. Tanto la secuencia de codificacion de un gen como sus regiones reguladoras se pueden redisenar para cambiar las propiedades 40 funcionales de la protefna resultante, la cantidad de protefna fabricada o el tipo de celula en el que se produce la protefna. La secuencia de codificacion de un gen se puede alterar ampliamente, por ejemplo, mediante fusion de parte de ella con la secuencia de codificacion de un gen diferente para producir un gen hfbrido nuevo que codifique una protefna de fusion. En las siguientes solicitudes PCT se describen ejemplos de produccion de protefnas de fusion PCT/US87/02968, PCT/US89/03587 y PCT/US90/07335, asf como en Traunecker et al. (1989) Nature 339:68. 45 En esencia, la union de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipeptidos se lleva a cabo de acuerdo con tecnicas convencionales, empleando extremos romos y extremos cohesivos para la ligacion, digestion con enzima de restriccion para proporcionar los extremos adecuados, relleno de los extremos cohesivos de la forma adecuada, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una union no deseable y ligacion enzimatica. Alternativamente, el gen de fusion se puede sintetizar mediante tecnicas convencionales entre las que se incluyen 50 los sintetizadores automatizados de ADN. En otro metodo, la amplificacion por PCR de los fragmentos de gen se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que se pueden posteriormente anillar para generar una secuencia de gen quimerico (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Los polipeptidos quimericos codificados por el gen de fusion se pueden producir recombinantemente usando diversos sistemas de 55 expresion, como bien se sabe en la tecnica (vease tambien a continuacion).
Los polipeptidos quimericos conjugados recombinantemente incluyen aspectos en los que el polipeptido MTM1 esta conjugado al extremo N-terminal o C-terminal del grupo internalizante.
60 En algunos aspectos, la inmunogenicidad del polipeptido quimerico se puede reducir mediante identificacion de un
epftopo de celulas T candidato de una region de union que distancia el polipeptido quimerico y cambio de un aminoacido de la region de union, tal y como se describe en la patente US2003/0166877.
Los polipeptidos quimericos de la invencion tienen varios usos. Por ejemplo, los polipeptidos quimericos se pueden 5 usar para identificar ligandos del MTM1, tales como protefnas a las que se une endogenamente el MTM1 o sustratos para el MTM1. Los polipeptidos quimericos tambien se pueden usar para representar celulas del musculo esqueletico, tales como celulas del musculo esqueletico deficientes en MTM1 y para estudiar la localizacion subcelular del MTM1 en el tipo salvaje o celulas del musculo esqueletico deficientes en MTM1. Los polipeptidos quimericos tambien se pueden usar como parte de un metodo terapeutico para sustituir la protefna MTM1 en celulas 10 deficientes, en animales o en pacientes humanos. Los polipeptidos quimericos se pueden usar por si solos o como parte de un regimen terapeutico para el tratamiento de la miopatfa miotubular.
IV. Acidos nucleicos relacionados con el MTM1 y su expresion
15 En ciertos aspectos, la presente divulgacion usa acidos nucleicos para producir un polipeptido MTM1 (fragmentos bioactivos, variantes y fusiones del mismo incluidos). En ciertos aspectos especfficos, los acidos nucleicos pueden ademas comprender ADN que codifica un grupo internalizante (por ejemplo, un anticuerpo o un peptido localizador) para fabricar una protefna quimerica recombinante de la invencion. Nos referimos colectivamente a todos estos acidos nucleicos como acidos nucleicos MTM1.
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Los acidos nucleicos pueden ser moleculas de ADN o ARN monocatenarias o bicatenarias. En ciertos aspectos, la invencion se refiere a secuencias de acido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identicas a una region de una secuencia de nucleotidos MTM1 (por ejemplo, las SEC ID N°: 5, 7, y 9). En aspectos adicionales, las secuencias de acidos nucleicos MTM1 pueden ser aisladas, 25 recombinantes y/o fusionadas con una secuencia de nucleotido heterologo, o en una ADN genoteca.
En ciertos aspectos, los acidos nucleicos MTM1 tambien incluyen secuencias de nucleotidos que se hibridan en condiciones altamente rigurosas a cualquiera de las secuencias de nucleotidos MTM1 nativos anteriormente mencionadas o a secuencias complementarias de los mismos. Un experto en la materia entendera facilmente que 30 las condiciones de rigurosidad adecuadas para favorecer la hibridacion del ADN se pueden variar. Por ejemplo, uno podrfa realizar la hibridacion en 6,0 x cloruro sodico/citrato sodico (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentracion de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar de entre una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C a una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Ademas, la temperatura de la etapa de lavado se puede incrementar desde condiciones de baja 35 rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 °C. Se puede variar tanto la temperatura como la sal o se puede mantener la temperatura o la concentracion de sal constantes mientras se cambia la otra variable. En un aspecto, la invencion proporciona acidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 x SSC a temperatura ambiente seguida de 2 x SSC a temperatura ambiente.
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Tambien estan dentro del alcance de la divulgacion los acidos nucleicos aislados que difieren de los acidos nucleicos MTM1 nativos debido a una degeneracion del codigo genetico. Por ejemplo, varios aminoacidos se designan mediante mas de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoacido, o sinonimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinonimos de histidina) pueden dar como resultado mutaciones “silenciosas” que no afectan a la secuencia 45 de aminoacidos de la protefna. Sin embargo, se espera que entre las celulas de mamfferos existiran polimorfismos de la secuencia de ADN que llevan a cambios en las secuencias de aminoacidos de las protefnas que nos ocupan. Un experto en la materia apreciara que estas variaciones en uno o mas nucleotidos (hasta aproximadamente el 3-5 % de los nucleotidos) de los acidos nucleicos que codifican una protefna concreta pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variacion alelica natural. Todas y cada una de tales variaciones de nucleotidos y 50 polimorfismos de los aminoacidos resultantes se encuentran dentro del alcance de esta divulgacion.
En ciertos aspectos, los acidos nucleicos MTM1 recombinantes se pueden conectar operativamente a una o mas secuencias de nucleotidos reguladores en un constructo de expresion. Generalmente, las secuencias de nucleotidos reguladores seran apropiadas para una celula huesped usada para la expresion. En la tecnica se conocen 55 numerosos tipos de vectores de expresion apropiados y de secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de celulas huesped. Habitualmente, dichas una o mas secuencias de nucleotidos reguladores pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias lfder o senal, sitios de union ribosomal, secuencias de inicio y terminacion de la transcripcion, secuencias de inicio y terminacion de la traduccion y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores constitutivos o inducibles, tal y como se conocen en la tecnica, se contemplan en la 60 invencion. Los promotores pueden ser promotores presentes naturalmente o promotores hfbridos que combinan
elementos de mas de un promotor. Un constructo de expresion puede estar presente en una celula en un episoma, tal como un plasmido, o el constructo de expresion puede estar insertado en un cromosoma. En un aspecto preferido, el vector de expresion contiene un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de las celulas huesped transformadas. Los genes marcadores seleccionable son bien conocidos en la tecnica y variaran con la 5 celula huesped usada. En ciertos aspectos, esta invencion se refiere a un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido MTM1 y esta operativamente conectada a al menos una secuencia reguladora. La tecnica reconoce las secuencias reguladoras y estas se seleccionan para dirigir la expresion del polipeptido codificado. En consecuencia, el termino secuencia reguladora incluye los promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion. En Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in 10 Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990) se describen secuencias reguladoras ejemplares. Se debe entender que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se debe transformar y/o el tipo de protefna que se desea expresar. Asimismo, se debe considerar tambien el numero de copias del vector, la capacidad para controlar ese numero de copias y la expresion de cualquier otra protefna codificada por el vector, tal como los marcadores de resistencia a antibioticos.
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Esta invencion tambien se refiere a una celula huesped transfectada con un gen recombinante que codifica un polipeptido MTM1, un grupo internalizante o un polipeptido quimerico de la invencion. La celula huesped puede ser una celula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipeptido MTM1 o un polipeptido quimerico se pueden expresar en celulas bacterianas tales como las de E. coli, en celulas de insectos (por ejemplo, usando el sistema de expresion 20 basado en baculovirus), en levaduras o en celulas de mamfferos. Otras celulas huesped adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia.
La presente divulgacion ademas se refiere a los metodos de produccion de un polipeptido MTM1, un grupo internalizante y/o un polipeptido quimerico de la invencion. Por ejemplo, se puede cultivar una celula huesped 25 transfectada con un vector de expresion que codifica un polipeptido MTM1, un grupo internalizante, o un polipeptido quimerico en condiciones adecuadas para permitir que se produzca la expresion del polipeptido. El polipeptido se puede secretar y aislar a partir de una mezcla de celulas y medio que contenga los polipeptidos. Alternativamente, los polipeptidos pueden quedar retenidos en el citoplasma o en una fraccion de membrana y se pueden extraer las celulas, lisar y aislar la protefna. Un cultivo celular incluye las celulas huesped, el medio y otros subproductos. Los 30 medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la tecnica. Los polipeptidos se pueden aislar del medio del cultivo celular, de las celulas huesped o de ambos usando tecnicas de purificacion de protefnas bien conocidas en la tecnica, entre las que se incluyen la cromatograffa de intercambio ionico, la cromatograffa de filtracion en gel, la ultrafiltracion, la electroforesis y la purificacion por inmunoafinidad con anticuerpos especfficos para epftopos concretos de los polipeptidos (por ejemplo, un polipeptido MTM1). En un aspecto preferido, el 35 polipeptido es una protefna de fusion que contiene un dominio que facilita su purificacion.
Un acido nucleico MTM1 recombinante se puede producir mediante ligacion del gen clonado, o una porcion del mismo, en un vector adecuado para su expresion en celulas procariotas, celulas eucariotas (levaduras, aviares, de insectos o de mamfferos) o ambas. Entre los vehfculos de expresion para la produccion de un polipeptido 40 recombinante se incluyen los plasmidos y otros vectores. Por ejemplo, entre los vectores adecuados se incluyen los plasmidos de los tipos: plasmidos derivados del pBR322, plasmidos derivados del pEMBL, plasmidos derivados del pEX, plasmidos derivados del pBTac y plasmidos derivados del pUC para la expresion en celulas procariotas tales como las de E. coli. Los vectores de expresion en mamfferos preferidos contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagacion del vector en bacterias como una o mas unidades de transcripcion eucariotas que se 45 expresan en celulas eucariotas. Los vectores derivados del pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresion en mamfferos adecuados para la transfeccion de celulas eucariotas. Algunos de estos vectores estan modificados con secuencias de plasmidos bacterianos, tales como el pBR322, para facilitar la replicacion y la seleccion de la resistencia a farmacos tanto en celulas procariotas como eucariotas. Alternativamente, se pueden usar derivados de 50 virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus Epstein-Barr (pHEBo, derivado del pREP y p205) para la expresion transitoria de protefnas en celulas eucariotas. Los diversos metodos empleados en la preparacion de los plasmidos y en la transformacion de los organismos huesped son bien conocidos en la tecnica. Para consultar otros sistemas de expresion adecuados tanto para celulas procariotas como eucariotas, asf como procedimientos recombinantes generales, vease Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and 55 Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capftulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser conveniente expresar el polipeptido recombinante mediante el uso de un sistema de expresion basado en baculovirus. Entre los ejemplos de tales sistemas de expresion basados en baculovirus se incluyen los vectores derivados del pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), los vectores derivados del pAcUW (tales como pAcUW1), y los vectores derivados del pBlueBacs (tales como el (3-gal que contiene pBlueBac III).
Las tecnicas de fabricacion de genes de fusion son bien conocidas. En esencia, la union de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipeptidos se lleva a cabo de acuerdo con tecnicas convencionales, empleando extremos romos y extremos cohesivos para la ligacion, digestion con enzima de restriccion para proporcionar los extremos adecuados, relleno de los extremos cohesivos de la forma adecuada, tratamiento con 5 fosfatasa alcalina para evitar una union no deseable y ligacion enzimatica. En otro aspecto, el gen de fusion se puede sintetizar mediante tecnicas convencionales entre las que se incluyen los sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, la amplificacion por PCR de los fragmentos de gen se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que se pueden posteriormente anillar para generar una secuencia de gen quimerico (vease, por ejemplo, Current Protocols 10 in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
Se debe entender que los polipeptidos quimericos se pueden fabricar de numerosas formas. Por ejemplo, un polipeptido MTM1 y un grupo internalizante se pueden fabricar por separado, tal como recombinantemente en dos cultivos celulares independientes a partir de constructos de acido nucleico que codifican sus respectivas protefnas. 15 Una vez fabricados, las protefnas se pueden conjugar qufmicamente directamente o mediante un conector. A modo de otro ejemplo, el polipeptido quimerico se puede fabricar como una fusion conservando la pauta de lectura en la que el polipeptido quimerico completo, que opcionalmente incluye uno o mas conectores, se fabrica a partir de un constructo de acido nucleico que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica tanto el polipeptido MTM1 como el grupo internalizante.
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V. Metodos de tratamiento
En ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona metodos de tratamiento de afecciones asociadas a la deficiencia de la protefna miotubularina no funcional 1 (MTM1), tales como la miopatfa miotubular. Estos metodos 25 implican la administracion a un individuo en necesidad de la misma de una cantidad terapeuticamente efectiva de un polipeptido quimerico como los anteriormente descritos. Especfficamente, el metodo comprende la administracion de un polipeptido quimerico que comprende (a) un polipeptido de miotubularina (MTM1) o un fragmento bioactivo del mismo y (b) un grupo internalizante. En particular, el objetivo de estos metodos es el tratamiento terapeutico y profilactico de animales y, mas particularmente, humanos.
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La MTM es un raro y grave trastorno muscular ligado al cromosoma X que se presenta con una incidencia estimada de 1 varon por cada 50 000 nacimientos y es causada por una deficiencia de MTM1, una fosfoinosftido fosfatasa (Bello AB et al., Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 14). En el nacimiento, los pacientes con MTM presentan hipotonfa severa y dificultad respiratoria y aquellos que sobreviven al periodo neonatal frecuentemente 35 son total o parcialmente dependientes de soporte ventilatorio (Taylor GS et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Aug 1;97(16):8910-5; Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5; Pierson CR et al., Neuromuscul Disord. 2007 July; 17(7): 562-568; Herman GE et al., THE JOURNAL OF PEDIATRICS VOLUME 134, NUMBER 2). Los pacientes con MTM exhiben retardo en las etapas del desarrollo motor y son susceptibles a sufrir complicaciones tales como la escoliosis, maloclusion, estenosis pilorica, esferocitosis y calculos biliares y renales, 40 aunque el crecimiento lineal y la inteligencia son normales y la enfermedad sigue un curso no progresivo (Herman GE et al., THE JOURNAL OF PEDIATRICS VOLUME 134, NUMBER 2). Una complicacion adicional es que los pacientes con MTM son particularmente susceptibles a infecciones respiratorias graves e incluso mortales. Sin limitacion teorica, estas infecciones respiratorias pueden ser debidas a la disminucion de la capacidad de los individuos para producir y limpiar el moco, asf como al debilitamiento del tejido pulmonar provocado por el uso de 45 ventilacion a largo plazo. La estancia media hospitalaria de pacientes neonatales con mTm es de ~90 dfas, y la necesidad de asistencia ventilatoria y atencion domiciliaria a largo plazo, asf como los costes asociados a la gestion de las complicaciones medicas que surgen con frecuencia en pacientes con MTM, suponen una carga personal y economica sustancial para los pacientes y familias.
50 Las MTM son una familia de protefnas relacionadas que exhiben actividad fosfoinosftido fosfatasa o, alternativamente, se unen a fosfoinosftidos pero son catalfticamente inactivas. La MTM1, asf como otras protefnas relacionadas con las MTM (MTMRs) se agrupan individualmente o en heterodfmeros en las vesfculas endocfticas en diferentes etapas del transporte subcelular. La MTM1 se asocia con la MTMR12 e interacciona con otras protefnas endosomales tales como la GTPasa Rab5 y la PI 3-quinasa Vps34 mediante la molecula adaptadora Vps15. Las 55 actividades diferenciales de reclutamiento y oposicion de la MTM1 PIP3 fosfatasa y la Vsp34 PI-3 quinasa probablemente coordinan la distribucion temporal de la membrana de PI y PIP3 que dirige los patrones de trafico intracelular de las vesfculas endocfticas. Aunque otras protefnas relacionadas con las MTM poseen actividad PIP3 fosfatasa, su localizacion subcelular no es lo suficientemente superpuesta a la de la MTM1 como para que sean incapaces de compensar funcionalmente la deficiencia de MTM1. La MTM1 se expresa de forma generalizada, pero 60 la ausencia de MTM1 en el musculo esqueletico solo se justifica para la fisiopatologfa de la MTM (Taylor GS et al.,
Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 22;9(15):2223-9; Taylor GS et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Aug 1;97(16):8910-5; Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5), y sugiere que la actividad PIP3 fosfatasa de la MTM1 posee una funcion subcelular unica que es particularmente crucial para el funcionamiento normal del musculo esqueletico. Se espera que la MTM1 participe en el mantenimiento de la 5 arquitectura longitudinal y transversal del sistema de tubulos T y asf, los defectos en la organizacion de estas estructuras afectarfan al acoplamiento excitacion-contraccion y derivarfan en la subsiguiente debilidad muscular y atrofia caracterfsticas de la enfermedad (Bello AB et al., Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 14; Laporte J et al., HUMAN MUTATION 15:393.409 (2000); Herman GE et al., THE JOURNAL OF PEDIATRICS VOLUME 134,NUMBER 2).
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Dado que la identidad de los compartimentos endosomales concretos puede consistir en una relacion y distribucion de PI y sus formas fosforiladas definidas, no es probable que un enfoque terapeutico en el que bloques de Pi-3 quinasa y/o aumentos alternativos de PIP4 (tambien "PI(4)P"), PIP5 (tambien "PI(5)P") o PIP4,5 (tambien "PI(4,5)P2") impartan especificidad terapeutica alguna a la MTM. MTM1, MTMR1 y MTMR2 son las fosfoinosftido 15 fosfatasas relacionadas mas estrechamente y se expresan en el musculo esqueletico, esto sugiere que el aumento farmacologico de otras MTMR podrfa proporcionar un beneficio compensatorio a la MTM. Sin embargo, las localizaciones subcelulares de MTMR1, MTMR2 y MTM1 no se solapan lo suficiente (Lorenzo O et al., Journal of Cell Science 119, 2953-2959 2005) y la mutacion de la MTMR2 en la neuropatfa desmielinizante sensitivo-motora recesiva de tipo Charcot-Marie-Tooth tipo 4B (CMT4B) se presenta con manifestaciones patologicas y clfnicas muy 20 diferentes de las de la MTM. Por lo tanto, un aumento compensatorio de la MTMR2 u otras protefnas relacionadas con las MTM es probable que proporcione poca, si es que alguna, compensacion terapeutica a la deficiencia de MTM1. Las tecnologfas de rescate de ARNm basadas en la lectura del codon de terminacion pueden resultar efectivas para ~ el 20 % de los pacientes con MTM, aunque no hay indicios de que las tecnologfas basadas en el salto de exon sean utiles para ~ el 50% de los pacientes que poseen deleciones y mutaciones en el sitio de corte y 25 empalme (Laporte J et al., HUMAN MUTATION 15:393.409 (2000)). Un enfoque basado en la administracion de IGF, inhibicion de la miostatina o activacion de la AKT no corregirfa la deficiencia bioqufmica de MTM subyacente, pero podrfa contrarrestar cualquier senalizacion hipotrofica que pueda existir en la MTM.
Un enfoque que restaure la MTM1 al musculo esqueletico bien mediante genes, celulas madre o terapia intravenosa 30 recombinante es una estrategia terapeutica conveniente para la MTM. En ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona polipeptidos adecuados para su uso en metodos de tratamiento de la MTM. Los polipeptidos quimericos ejemplares comprenden (a) un polipeptido MTM1 o un fragmento bioactivo del mismo y (b) un grupo internalizante. En ciertos aspectos, el grupo internalizante dirige selectivamente el polipeptido quimerico a las celulas musculares y/o atraviesa las membranas celulares por medio del transportador eNT2.
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La liberacion intravenosa de MTM1 recombinante puede proporcionar la mayor flexibilidad de dosificacion con las menores barreras logfsticas al desarrollo. Por ejemplo, se puede valorar el efecto de la dosificacion de MTM1 intravenosa o retirar si un paciente concreto experimenta un efecto secundario.
40 La MTM1 es una enzima citoplasmatica y no posee un grupo internalizante muscular inherente, por lo tanto, la MTM1 se puede conjugar a una protefna permeable a las celulas para atravesar el sarcolema del musculo esqueletico y alcanzar los compartimentos citoplasmaticos adecuados. Como se ha demostrado que la MTM1 retiene la actividad PIP3 fosfatasa tras multiples fusiones genicas tales como la conjugacion genetica del extremo N y C-terminal a marcadores de purificacion tales como el GST y el 6-His (Kim SA et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 45 6, 4526-4531, February 8, 2002), y reporteros fluorescentes tales como la protefna roja y verde fluorescentes (Chaussade C et al., Molecular Endocrinology 17 (12): 2448-2460 2003), se espera que la MtM1 retenga la actividad tras la conjugacion qufmica y genetica a, por ejemplo, Fv3E10, un anticuerpo internalizante muscular de cadena sencilla. Adicionalmente, la hMTM1 mantiene la capacidad de localizacion de endosomas tempranos e inmunoprecipitacion de protefnas accesorias tales como la Vps15 y la Vps34 seguida de conjugacion genetica a los 50 marcadores de purificacion 6-His y GST (Taylor GS et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Aug 1;97(16):8910-5; Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067; Kim SA et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 6, 4526-4531, February 8, 2002), Green and Red Fluorescent Proteins (Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067; Chaussade C et al., Molecular Endocrinology 17 (12): 2448-2460 2003; Robinson FL et al., Trends in Cell Biology, 2006, 16(8): 403-412), y marcado con epftopo FLAG (Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067; Kim SA et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 6, 55 4526-4531, February 8, 2002). Por lo tanto, los conjugados qufmicos y geneticos de 3E10 y hMTM1 retendran la capacidad de penetracion celular, escision de PIP3 a PI y asociacion con protefnas endosomales.
Los terminos "tratamiento", "tratar" y similares, tal y como se usan en el presente documento, generalmente significan la obtencion de un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en 60 terminos de prevencion completa o parcial de una enfermedad, afeccion o sfntomas de las mismas, y/o puede ser
terapeutico en terminos de curacion completa o parcial de una enfermedad, afeccion y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad o afeccion. Tal y como se usa en el presente documento, "tratamiento" cubre cualquier tratamiento de una enfermedad o afeccion de un mamffero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevencion de que la enfermedad o afeccion se de en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o afeccion pero aun no 5 haya sido diagnosticado de tenerla; (b) inhibicion de la enfermedad o afeccion (por ejemplo, deteniendo su desarrollo); o (c) alivio de la enfermedad o afeccion (por ejemplo, provocando una regresion de la enfermedad o afeccion, mejorando uno o mas sfntomas). Por ejemplo, el "tratamiento" de la MTM abarca una reversion o cura completa de la enfermedad o cualquier rango de mejora de afecciones y/o efectos adversos atribuibles a la MTM. Simplemente a modo ilustrativo, el “tratamiento” de la MTM incluye una mejora de cualquiera de los siguientes 10 efectos asociados a la MTM o combinacion de los mismos: esperanza de vida corta, insuficiencia respiratoria (parcial o completa), bajo tono muscular, parpados cafdos, poca fuerza en los musculos proximales, poca fuerza en los musculos distales, debilidad facial con o sin debilidad del musculo del ojo, curvatura anomala de la columna, deformidades en las articulaciones y debilidad en los musculos que controlan el movimiento de los ojos (oftalmoplejia). La mejora de cualquiera de estas afecciones se puede evaluar facilmente de acuerdo con metodos y 15 tecnicas estandar conocidas en la tecnica. La poblacion de sujetos tratados mediante el metodo de la enfermedad incluye sujetos que padecen la enfermedad o afeccion no deseada, asf como sujetos en riesgo de desarrollar la enfermedad o afeccion.
El termino "dosis terapeuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significa una dosis que produce el efecto deseado 20 para el que se administra. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento y la determinara un experto en la materia usando tecnicas conocidas (vease, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
En ciertos aspectos, se pueden administrar uno o mas polipeptidos quimericos de la presente divulgacion, juntos 25 (simultaneamente) o en momentos diferentes (secuencialmente). Ademas, los polipeptidos quimericos de la presente divulgacion se pueden administrar en combinacion con uno o mas compuestos o terapias adicionales de tratamiento de la miopatfa miotubular o de tratamiento de trastornos neuromusculares en general. Por ejemplo, se pueden coadministrar uno o mas polipeptidos quimericos conjuntamente con uno o mas compuestos terapeuticos. La terapia combinada puede abarcar la administracion simultanea o alternativa. Ademas, la combinacion puede abarcar la 30 administracion aguda o cronica. Opcionalmente, el polipeptido quimerico de la presente divulgacion y compuestos adicionales actuan de forma aditiva o sinergica para el tratamiento de la miopatfa miotubular. A modo de ejemplo, el presente metodo se puede usar en combinacion con cualquiera de los metodos terapeuticos de la MTM descritos anteriormente (por ejemplo, incremento compensatorio de la MTMR2 u otras protefnas relacionadas con las MTM o tecnologfas de rescate del ARNm basadas en la lectura del codon de terminacion) para conseguir un efecto aditivo o 35 sinergico. Entre los compuestos adicionales que se pueden usar en terapias combinadas se incluyen, pero no se limitan a, moleculas pequenas, polipeptidos, anticuerpos, oligonucleotidos antisentido y moleculas de ARNip. Ademas, la terapia combinada tambien incluye los metodos descritos en el presente documento junto con otras terapias para la MTM (por ejemplo, terapia ffsica, soporte ventilatorio, terapia ocupacional, acupuntura, etc.). Dependiendo de la naturaleza de la terapia combinada, la administracion de los polipeptidos quimericos de la 40 invencion puede continuar mientras se esta administrando la otra terapia y/o a partir de entonces. La administracion de los polipeptidos quimericos se puede hacer en una dosis unica o en dosis multiples. En algunos casos, la administracion de los polipeptidos quimericos ha comenzado al menos varios dfas antes de la otra terapia, mientras que en otros casos, la administracion comienza o inmediatamente antes o a la vez que la administracion de la otra terapia.
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Independientemente de si el polipeptido quimerico se administra como terapia unica o conjunta, los metodos de tratamiento incluyen la administracion de una dosis unica o dosis multiples. Las dosis multiples incluyen la administracion del polipeptido quimerico a intervalos especificados, tales como diariamente, semanalmente, dos veces al mes, mensualmente, etc. Las dosis multiples incluyen un esquema de administracion en el que el 50 polipeptido quimerico se administra a intervalos especificados durante toda la vida del paciente.
VI. Terapia genica
Se pueden usar metodos de transferencia genica viral o no viral convencionales para introducir acidos nucleicos que 55 codifican polipeptidos de MTM1 en celulas de mamfferos o tejidos diana. Tales metodos se pueden usar para administrar acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la invencion (por ejemplo, MTM1, variantes del mismo incluidas) a celulas in vitro. En algunos aspectos, los acidos nucleicos que codifican los MTM1 se administran para terapias genicas in vivo o ex vivo. Los sistemas de liberacion del vector no virales incluyen plasmidos de ADN, acido nucleico desnudo y acido nucleico complejado con un vehfculo de transporte y liberacion tal como un liposoma. Los 60 sistemas de liberacion de vectores virales incluyen virus ADN y ARN que tienen genomas en estado episomal o
integrado tras su liberacion en la celula. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica.
Entre los metodos de liberacion no viral de acidos nucleicos que codifican los polipeptidos modificados por ingenierfa genetica de la invencion se incluyen la lipofeccion, microinyeccion, biolfstica, los virosomas, liposomas, 5 inmunoliposomas, conjugados polication o lfpidoiacido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y captacion de ADN potenciada por agentes. Los metodos de lipofeccion y los reactivos de lipofeccion son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Entre los lfpidos cationicos y neutros adecuados para un reconocimiento eficaz del receptor en la lipofeccion de polinucleotidos se incluyen los de Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. La liberacion se puede hacer en celulas (administracion ex vivo) o en tejidos diana (administracion in 10 vivo). La preparacion de complejos lfpidoiacido nucleico, incluyendo liposomas dirigidos tales como los complejos de inmunolfpidos, es bien conocida por un experto en la materia.
El uso de sistemas basados en ARN o ADN viral para la liberacion de acidos nucleicos que codifican MTM1 o sus variantes se beneficia de procedimientos muy evolucionados de internalizacion de un virus en celulas especfficas del 15 cuerpo y transito de la carga viral al nucleo. Los vectores virales se pueden administrar directamente a pacientes (in vivo) o se pueden usar para tratar celulas in vitro y administrar las celulas modificadas a pacientes (ex vivo). Entre los sistemas convencionales de liberacion de polipeptidos de la invencion basados en virus se podrfan incluir los vectores de transferencia genica basados en retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus herpes simplex. Actualmente, los vectores virales son el metodo mas eficaz y versatil de transferencia genica a celulas y
20 tejidos diana. La integracion en el genoma huesped es posible con los metodos de transferencia genica basados en
retrovirus, lentivirus y virus adeno-asociados y con frecuencia da como resultado la expresion a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficacias de transduccion en muchos tipos de celulas y tejidos diana diferentes.
25 El tropismo de un retrovirus se puede alterar mediante incorporacion de protefnas de envoltura extranas,
expandiendo asf la poblacion objetivo potencial de celulas diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales
que son capaces de transducir o infectar celulas que no se dividen y, habitualmente, producen tftulos virales altos. Por lo tanto, la seleccion de un sistema de transferencia genica retroviral dependera del tejido diana. Los vectores retrovirales comprenden repeticiones terminales largas de accion en cis con una capacidad de empaquetamiento de 30 hasta 6-10 kb de secuencia extrana. Las LTR de accion en cis mfnimas son suficientes para la replicacion y empaquetamiento de los vectores, que, a continuacion, se usan para integrar el gen terapeutico en la celula diana para proporcionar una expresion transgenica permanente. Entre los vectores retrovirales ampliamente usados se incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del gibon (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia simiesca (SW), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos, 35 todos ellos bien conocidos en la tecnica.
En aplicaciones en las que se prefiere la expresion transitoria de los polipeptidos de la invencion, habitualmente se usan sistemas adenovirales. Los vectores adenovirales presentan una eficacia de transduccion muy alta en muchos tipos de celulas y no requieren division celular. Con tales vectores se han obtenido tftulos y niveles de expresion 40 altos. Este vector se puede producir en grandes cantidades con un sistema relativamente sencillo. Los vectores basados en virus adeno-asociados ("AAV") tambien se usan para transducir celulas con acidos nucleicos diana, por ejemplo, en la produccion in vitro de acidos nucleicos y peptidos, y para los procedimientos de terapia genica in vivo y ex vivo. La construccion de vectores AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, entre ellas la patente US5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al.; Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 45 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
Los vectores basados en virus adeno-asociados recombinantes (rAAV) son un sistema alternativo prometedor de liberacion genica basado en el virus adeno-asociado tipo 2 parvovirus defectuoso y no patogeno. Todos los vectores derivan de un plasmido que retiene solo las repeticiones terminales invertidas AAV 145 bp que flanquean al casete 50 de expresion genica. La eficacia de transferencia genica y la estabilidad de la liberacion transgenica debido a la integracion en los genomas de la celula transducida son las caracterfsticas principales de este sistema de vectores.
Los vectores adenovirales recombinantes de replicacion defectuosa (Ad) se pueden disenar de tal forma que un transgen sustituya a los genes Ad E1a, E1b, y E3 y posteriormente el vector de replicacion defectuosa se propague 55 a celulas 293 humanas que suministran la funcion del gen delecionado en trans. Los vectores Ad pueden transducir multiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo las celulas diferenciadas que no se dividen tales como las que se encuentran en los tejidos del hfgado, rinon y sistema muscular. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad transportadora.
60 Las celulas empaquetadoras se usan para formar partfculas virales capaces de infectar una celula huesped. Entre
tales celulas se incluyen las celulas 293, que empaquetan adenovirus, y las celulas 42 o PA317, que empaquetan retrovirus. Normalmente, los vectores virales usados en terapia genica son generados por una lmea celular productora que empaqueta un vector acido nucleico en una partmula viral. Habitualmente, los vectores contienen las secuencias virales mmimas requeridas para el empaquetamiento y posterior integracion en un huesped, siendo las 5 otras secuencias virales sustituidas por un casete de expresion para la protema que se debe expresar. Las funciones virales perdidas son suministradas en trans por la lmea celular empaquetadora. Por ejemplo, los vectores AAV usados en terapia genica habitualmente solo poseen las secuencias ITR del genoma AAV necesarias para el empaquetamiento e integracion en el genoma huesped. El ADN viral se empaqueta en una lmea celular que contiene un plasmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, concretamente los genes rep y cap, pero no tiene 10 secuencias ITR. La lmea celular tambien se infecta con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar favorece la replicacion del vector AAV y la expresion de los genes AAV del plasmido auxiliar. El plasmido auxiliar no esta empaquetado en cantidades significativas debido a una falta de secuencias ITR. La contaminacion con adenovirus se puede reducir mediante, por ejemplo, tratamiento termico, al cual los adenovirus son mas sensibles que los AAV.
15 En muchas aplicaciones de terapia genica resulta conveniente que el vector de terapia genica se libere con un alto grado de especificidad en un tipo de tejido concreto. Habitualmente, un vector viral se modifica para que tenga especificidad por un tipo de celula dado mediante expresion de un ligando como una protema de fusion con una protema de revestimiento viral en la superficie exterior de los virus. El ligando se selecciona de forma que tenga afinidad por un receptor que se sabe que esta presente en el tipo de celula de interes. Este principio se puede 20 extender a otras parejas de virus que expresan una protema de fusion ligando y una celula diana que expresa un receptor. Por ejemplo, se puede disenar un fago filamentoso que presente fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, FAB o Fv) que tengan una afinidad de union espedfica por virtualmente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripcion anterior se aplica principalmente a los vectores virales, se pueden aplicar los mismos principios a los vectores no virales. Tales vectores se pueden disenar de forma que contengan secuencias de captacion espedficas 25 que se cree que favorecen la captacion por parte de celulas diana espedficas, tales como las celulas musculares.
Los vectores de terapia genica se pueden liberar in vivo mediante administracion a un paciente individual, mediante administracion sistemica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdermica o infusion intracraneal) o mediante aplicacion topica. Alternativamente, los vectores se pueden liberar en celulas ex vivo, tales 30 como las celulas explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de medula osea, biopsia tisular) o celulas madre hematopoyeticas de donante universal y posterior reimplantacion de las celulas en un paciente, normalmente despues de haber seleccionado las celulas que han incorporado el vector.
La transfeccion ex vivo para diagnostico, investigacion o terapia genica (por ejemplo, mediante reinfusion de las 35 celulas transfectadas al organismo huesped) es bien conocida por los expertos en la materia. Por ejemplo, las celulas se afslan del organismo en cuestion, se transfectan con un acido nucleico (gen o ADNc) que codifica, por ejemplo, MTM1 o sus variantes, y se reinfunden en el organismo en cuestion (por ejemplo, un paciente). Diversos tipos de celulas adecuadas para la transfeccion ex vivo son bien conocidas por los expertos en la materia.
40 En ciertos aspectos, se usan celulas madre en procedimientos ex vivo de transfeccion celular y terapia genica. La ventaja de usar celulas madre es que se pueden diferenciar para convertirse en otro tipo de celulas in vitro o se pueden introducir en un mamffero (tal como el donante de las celulas) donde se injertaran en la medula osea. Las celulas madre se afslan por transduccion y diferenciacion mediante metodos conocidos.
45 Tambien se pueden administrar directamente al organismo vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen acidos nucleicos terapeuticos para la transduccion de celulas in vivo. Alternativamente, se puede administrar ADN desnudo. La administracion se hace por cualquiera de las rutas normalmente usadas para la introduccion de una molecula en contacto final con celulas sangumeas o celulas de tejidos. Hay disponibles metodos de administracion de tales acidos nucleicos y son bien conocidos por los expertos en la materia y, aunque se puede 50 usar mas de una ruta para la administracion de una composicion en particular, una ruta concreta puede, con frecuencia, proporcionar una reaccion mas inmediata y mas eficaz que otra ruta.
Los vehmulos farmaceuticamente aceptables vienen determinados en parte por la composicion concreta que se va a administrar, asf como por el metodo concreto usado para administrar la composicion. En consecuencia, tal como se 55 describe en el presente documento, hay una amplia variedad de formulaciones de composiciones farmaceuticas adecuadas de la presente divulgacion.
VII. Metodos de administracion
60 Se conocen diversos sistemas de liberacion y se pueden usar para la administracion de los polipeptidos quimericos
de la invencion, por ejemplo, diversas formulaciones, encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar el compuesto y endocitosis mediada por receptor (vease, por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los metodos de introduccion pueden ser enterales o parenterales, entre los que se incluyen, pero no se limitan a, intradermico, transdermico, intramuscular, 5 intraperitoneal, intravenoso, subcutaneo, pulmonar, intranasal, intraocular, epidural y via oral. En aspectos particulares, la introduccion parenteral incluye la administracion intramuscular, subcutanea, intravenosa, intravascular e intrapericardial.
Los polipeptidos quimericos se pueden administrar por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, por infusion o 10 inyeccion en bolo, por absorcion a traves del revestimiento epitelial o mucocutaneo (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal o intestinal, etc.) y se pueden administrar de forma conjunta con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local. Tambien se puede emplear la administracion pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulacion con un agente aerosolizante.
15 En ciertos aspectos, puede ser conveniente la administracion de los polipeptidos quimericos de la invencion localmente en la zona que necesita tratamiento (por ejemplo, el musculo); esto se puede conseguir, por ejemplo, y no limitado a, mediante infusion local durante la cirugfa, aplicacion topica, por ejemplo, mediante inyeccion, mediante un cateter, o mediante un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, membranas incluidas, tales como membranas sialasticas, fibras o sustitutos de piel comerciales.
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En otros aspectos, los polipeptidos quimericos de la invencion se pueden liberar en una vesfcula, en particular un liposoma (vease Langer, 1990, Science 249:1527-1533). En otro aspecto mas, los polipeptidos quimericos de la invencion se pueden liberar en un sistema de liberacion controlada. En otro aspecto, se puede usar una bomba (vease Langer, 1990, supra). En otro aspecto, se pueden usar materiales polimericos (vease Howard et al., 1989, J. 25 Neurosurg. 71:105). En ciertos aspectos especfficos, los polipeptidos quimericos de la invencion se pueden liberar intravenosamente.
En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos se administran por infusion intravenosa. En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos se infunden durante un periodo de al menos 10, al menos 15, al menos 20 o al menos 30 30 minutos. En otros aspectos, los polipeptidos quimericos se infunden durante un periodo de al menos 60, 90 o 120 minutos. Independientemente del periodo de infusion, la invencion contempla que cada infusion es parte de un plan de tratamiento general en el que el polipeptido quimerico se administra de acuerdo con un programa regular (por ejemplo, semanalmente, mensualmente, etc.).
35 VIII. Composiciones farmaceuticas
En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos objeto de la presente divulgacion se pueden formulan con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Se pueden administrar uno o mas polipeptidos quimericos por si solos o como componentes de una formulacion farmaceutica (composicion). Los polipeptidos quimericos se pueden formular 40 para su administracion de cualquier forma conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria. Tambien pueden estar presentes en las composiciones agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como el lauril sulfato sodico, agentes desmoldeantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.
45 Entre las formulaciones de los polipeptidos quimericos que nos ocupan se incluyen aquellas adecuadas para su administracion oral, nasal, topica, parenteral, rectal y/o intravaginal. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un vehfculo para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del huesped que se vaya a tratar y del modo concreto 50 de administracion. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un vehfculo para producir una forma de dosificacion unica sera, generalmente, la cantidad de compuesto que produzca un efecto terapeutico.
En ciertos aspectos, entre los metodos de preparacion de estas formulaciones o composiciones se incluye la combinacion de otro tipo de agentes terapeuticos, un vehfculo y, opcionalmente, uno o mas ingredientes adicionales. 55 En general, las formulaciones se pueden preparar con un vehfculo lfquido, un vehfculo solido finamente dividido o ambos y, a continuacion, si es necesario, dando forma al producto.
Las formulaciones para administracion oral pueden ser en forma de capsulas, sellos, pfldoras, comprimidos, grageas (usando una base con sabor, normalmente sucrosa y acacia o tragacanto), polvo, granulos, o como una solucion o 60 una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso, o como una emulsion de aceite en agua o agua en aceite, o
como un elixir o un jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sucrosa y acacia) y/o enjuagues bucales y similares, todas ellas conteniendo una cantidad predeterminada del agente polipeptfdico que nos ocupa como ingrediente activo. Las suspensiones, ademas de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspension tales como alcoholes isoestearflicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de 5 sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto y mezclas de los mismos.
En las formas de dosificacion solidas para administracion oral (capsulas, comprimidos, pfldoras, grageas, polvos, granulos y similares) se pueden mezclar uno o mas agentes terapeuticos polipeptfdicos de la presente divulgacion 10 con uno o mas vehfculos farmaceuticamente aceptables, tales como citrato sodico o fosfato dicalcico y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o diluyentes, tales como feculas, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol y/ acido silfcico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, alginatos de carboximetilcelulosa, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como el glicerol; (4) agentes desintegrantes, tales como el agar-agar, carbonato calcico, fecula de patata o tapioca, acido algfnico, ciertos silicatos y carbonato sodico; (5) agentes retardadores de la 15 solucion, tales como la parafina; (6) acelerantes de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetflico y monoestearato de glicerilo; (8) absorbentes, tales como el caolfn y la arcilla bentonftica; (9) lubricantes, tales como talco, estearato calcico, estearato magnesico, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato sodico y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de las capsulas, comprimidos y pfldoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes 20 tamponadores. Tambien se pueden emplear composiciones solidas de un tipo similar como cargas en capsulas de gelatina duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o azucares de la leche, asf como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Entre las formas de dosificacion lfquidas para administracion oral se incluyen las emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del ingrediente activo, las formas de dosificacion lfquidas pueden contener diluyentes inertes habitualmente usados 25 en la tecnica, tales como agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato etflico, acetato etflico, alcohol bencflico, benzoato de bencilo, propilenglicol 1,3- butilenglicol, aceites (en concreto, aceites de semilla de algodon, cacahuete, mafz, germen, oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurflico, polietilenglicoles, esteres de acidos grasos de sorbitano y mezclas de los mismos. Ademas de diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes 30 humectantes, agentes de suspension y emulsionantes, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion parenteral pueden comprender uno o mas polipeptidos quimericos en combinacion con una o mas soluciones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles 35 farmaceuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos esteriles que se puedan reconstituir para dar soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, las cuales pueden contener antioxidantes, tamponadores, bacteriostaticos, solutos que hagan la formulacion isotonica con la sangre del destinatario previsto o agentes de suspension o espesantes. Entre los ejemplos de vehfculos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion se incluyen el agua, el 40 etanol, los polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como el aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como el oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
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Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la accion de los microorganismos se puede garantizar mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenolsorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro sodico 50 y similares en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede ser provocada por la inclusion de agentes que retardan la absorcion, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
Las formas inyectables de liberacion prolongada se fabrican mediante formacion de matrices de uno o mas agentes 55 terapeuticos polipeptfdicos encapsuladas en polfmeros biodegradables tales como el copolfmero polilactida- poliglicolida. La velocidad del farmaco se puede controlar dependiendo de la relacion entre farmaco y polfmero y de la naturaleza del polfmero concreto empleado. Entre los ejemplos de otros polfmeros biodegradables se incluyen los poliortoesteres y los polianhfdridos. Las formulaciones inyectables de liberacion prolongada tambien se preparan atrapando el farmaco en liposomas o microemulsiones compatibles con los tejidos celulares.
En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos de la presente divulgacion se formulan de acuerdo con procedimientos rutinarios en forma de una composicion farmaceutica adaptada para su administracion intravenosa a seres humanos. Cuando sea necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como la lidocafna para aliviar el dolor en el sitio de inyeccion. Cuando la composicion se va a 5 administrar mediante infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contenga agua o solucion salina esteril de grado farmaceutico. Cuando la composicion se va a administrar mediante inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o una solucion salina para que los ingredientes se mezclen antes de su administracion.
10 La cantidad de polipeptidos quimericos de la invencion que sera efectiva en el tratamiento de una enfermedad o afeccion relacionada con los tejidos (por ejemplo, la miopatfa miotubular) se puede determinar mediante tecnicas clfnicas estandar. Ademas, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vitro para ayudar a identificar los rangos de dosificacion optimos. La dosis exacta que se debe emplear en la formulacion tambien dependera de la via de administracion y de la gravedad de la afeccion, y debera ser decidida de acuerdo con el criterio del medico y las 15 circunstancias de cada sujeto. Sin embargo, los rangos de dosificacion adecuados para administracion intravenosa son generalmente de 20-5000 microgramos de polipeptido quimerico activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de dosificacion adecuados para administracion intranasal son generalmente de aproximadamente de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de las curvas dosis-respuesta obtenidas a partir de sistemas de ensayo in vitro o en modelos animales.
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En ciertos aspectos, los polipeptidos quimericos y las composiciones de la invencion, preparados farmaceuticos incluidos, son no pirogenicas. En otras palabras, en ciertos aspectos, las composiciones estan sustancialmente exentas de pirogenos. En un aspecto, las formulaciones de la invencion son formulaciones no pirogenicas que estan sustanciamente exentas de endotoxinas y/o sustancias pirogenicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas 25 que estan confinadas en el interior de un microorganismo y se liberan solo cuando los microorganismos se descomponen o mueren. Las sustancias pirogenicas tambien incluyen sustancias termoestables, inductoras de fiebre (glicoprotefnas) procedentes de la membrana externa de bacterias y otros microorganismos. Estas sustancias pueden provocar fiebre, hipotension y shock si se administran a humanos. Debido a su potencial efecto nocivo, se deben eliminar incluso las cantidades bajas de endotoxinas de las soluciones de farmacos farmaceuticos 30 administrados intravenosamente. La Administracion de Alimentos y Medicamentos ("FDA") ha establecido un lfmite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dosis y kilogramo de peso corporal en un unico periodo de una hora para las aplicaciones de farmacos intravenosos (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Cuando se administran protefnas terapeuticas en dosificaciones relativamente altas y/o a lo largo de un periodo de tiempo prolongado (por ejemplo, tal como durante toda la vida del paciente), incluso 35 cantidades pequenas de endotoxinas nocivas y peligrosas podrfan resultar peligrosas. En ciertos aspectos, los niveles de endotoxina y pirogeno en la composicion son inferiores a 10 EU/mg, o inferiores a 5 EU/mg, o inferiores a 1 EU/mg, o inferiores a 0,1 EU/mg, o inferiores a 0,01 EU/mg, o inferiores a 0,001 EU/mg.
Lo anterior se aplica a cualquiera de los polipeptidos quimericos, composiciones y metodos descritos en el presente 40 documento. La invencion contempla especfficamente cualquier combinacion de las caracterfsticas de tales polipeptidos quimericos, composiciones y metodos (solos o combinados) con las caracterfsticas descritas para las diversas composiciones farmaceuticas y vfas de administracion descritas en esta seccion.
IX. Modelos animales de MTM
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Ratones que poseen una inactivacion especffica del gen MTM1 (MTM1 KO) nacen en una distribucion submendeliana que por lo demas parece normal. Sin embargo, en las primeras semanas de vida los ratones MTM1 KO empiezan a perder masa muscular que rapidamente progresa a colapso respiratorio y muerte a una edad media de 7 semanas (14 semanas maximo). Las miofibras de los ratones MTM KO parecen hipotroficas y vacuoladas con 50 nucleos localizados centralmente rodeados de mitocondria y glicogen, aunque hay muy poco dano al sarcolema y no hay signos de apoptosis o inflamacion. Ultraestructuralmente, la protefna MTM1 aparece en las submembranas y vesfculas del citoplasma; y las trfadas del sistema de tubulos T del musculo esqueletico (Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5). Como la deficiencia de MTM1 en el musculo esqueletico solo se justifica por el fenotipo de los ratones MTM1 KO, se puede evaluar la eficacia terapeutica de los constructos 55 descritos en el presente documento usando el modelo de raton MTM1 KO. Ademas, los ratones que poseen una inactivacion parcial especffica del gen MTM1 tambien pueden servir como sistema modelo adecuado para la presente divulgacion. Tales modelos de raton son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en ratones MTM164, el exon 4 esta sustituido por un sitio loxP y el alelo Cre esta ausente (Buj-Bello et al., 2002, PNAS 99(23):15060- 15065).
En consecuencia, en ciertos aspectos, la presente divulgacion contempla metodos de prospeccion de mejoras en el fenotipo de la enfermedad usando los constructos de MTM1 (por ejemplo, los polipeptidos quimericos que comprenden MTM1) descritos en el presente documento en un modelo de MTM de raton. Los estudios llevados a cabo en ratones deficientes en MTM1 demuestran diferencias fenotfpicas marcadas entre el tipo salvaje y los 5 ratones deficientes en MTM1 (vease, por ejemplo, Buj-Bello et al., 2002, PNAS 99(23):15060-15065). Por ejemplo, se puede ver una clara divergencia en la ganancia de peso entre los ratones normales y los ratones deficientes en MTM1 a las ~3 semanas de edad. (Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12; 99(23): 15060-5) Tambien, las pruebas de evaluacion de suspension indican una dramatica diferencia entre el comportamiento durante la suspension de ratones con deficiencia de MTM1 y ratones normales. Adicionalmente, los ratones 10 deficientes en MTM1 muestran un deterioro significativo de la fuerza de agarre (por ejemplo, agarre con la extremidad anterior) en comparacion con los ratones normales. Ademas, tal y como determina el analisis de la marcha, en comparacion con los ratones normales que practicamente no manifiestan arrastre de pies, los ratones con deficiencia de MTM1 muestran mayor arrastre de patas. En el presente documento se describen protocolos de evaluacion del efecto de los polipeptidos quimericos que comprenden MTM1 en este modelo animal (Ejemplo 4).
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En consecuencia, tras administracion (por ejemplo, intravenosa) a ratones deficientes en MTM1, la capacidad del conjugado qufmico y/o genetico de un polipeptido quimerico que comprende MTM1 (por ejemplo, el polipeptido quimerico 3El0-hMTM1 descrito en los ejemplos) para mejorar uno o mas sfntomas en ratones deficientes en MTM1 (por ejemplo, aumentar el peso corporal y la esperanza de vida, disminuir el arrastre de pies, mejorar la fuerza de 20 agarre de la extremidad anterior, mejorar la capacidad de los ratones tratados para mantenerse a si mismos en contra de la fuerza de la gravedad). Experimentos adicionales pueden tambien evaluar cualquier mejora en la fuerza de contraccion isometrica de los musculos esqueleticos seleccionados, el aumento del area transversal de las miofibras, la reduccion de nucleos centrales, la morfometrfa, la microscopfa optica/de fluorescencia, la actividad espontanea, la miograffa ex vivo y la normalizacion de la tincion NADH-TR. Los niveles de 3E10-hMTM1 en el suero 25 y los tejidos, asf como el desarrollo de cualquier anticuerpo anti-3E10-hMTM1 tambien se evaluaran usando metodos de deteccion inmunologicos.
Asimismo, una vez que se ha establecido que la fusion genica de 3E10*MTM1 o MTM1 (por ejemplo, 3E10-GS3- hMTM1 o 3E10-GSTS-hMTM1) resulta en una mejora del fenotipo, se puede definir un estudio farmacocinetico 30 completo para determinar la dosis efectiva, la velocidad de eliminacion, el volumen de distribucion y la semivida del 3E10-MTM1. La farmacocinetica del 3E10-MTM1 probablemente seguira un modelo multicompartimental en el que varios tejidos exhibiran diferentes grados de eliminacion y la simple evaluacion de la semivida en suero no proporcionara informacion suficiente para calcular una tasa de dosificacion terapeutica. Por lo tanto, en ultima instancia, el calculo de una dosis y una tasa de dosificacion provendra de observaciones empfricas de la 35 farmacocinetica, farmacodinamica y toxicologfa de una dosis dada de 3E10-MTM1; y la velocidad y el grado en el que se observan, por ejemplo, un aumento de peso, del tiempo de suspension en el alambre, de la fuerza de agarre de la extremidad anterior, del arrastre de pies, de la actividad espontanea, del diametro de las miofibras y de la esperanza de vida. La dosis y tasa de dosificacion del 3E10-MTM1 determinadas en un estudio farmacocinetico posterior se puede usar como estandar comparativo para evaluar lotes optimizados de 3E10-MTM1 recombinante. A 40 continuacion, se examinara el PK/PD/TK del producto final en animales de mayor tamano como ratas, perros y primates.
Los modelos de raton anteriores proporcionan un sistema de modelo animal adecuado para la evaluacion de la actividad y efectividad de los polipeptidos quimericos que nos ocupan. Ademas, estos modelos estan fuertemente 45 correlacionados con la MTM y proporcionan un modelo adecuado para la MTM. La actividad del polipeptido se puede evaluar en estos modelos de raton y se pueden comparar los resultados con los observados en los animales control de tipo salvaje y en animales no tratados con los polipeptidos quimericos. Los resultados se pueden evaluar mediante examen de los ratones, asf como mediante examen de la ultraestructura de sus celulas musculares. De forma similar, los polipeptidos quimericos que nos ocupan se pueden evaluar usando celulas en cultivo, por ejemplo, 50 celulas preparadas a partir de ratones mutantes.
En otros aspectos, tambien se puede usar un modelo animal de gran tamano para evaluar la actividad y efectividad de los polipeptidos quimericos que nos ocupan. A modo de ejemplo, un modelo de perro puede ser un sistema particularmente util para el estudio de la MTM. El perro afectado lleva un gen deficiente en MTM1 y, por lo tanto, los 55 estudios descritos en el presente documento para un modelo de raton se aplican de forma similar a un modelo de perro. La dosis de evaluacion del 3E10 conjugado qufmicamente o geneticamente a hMTM1 liberado en perros deficientes en MTM1 se determinara empfricamente.
X. Otros modelos adecuados
Entre otros metodos adecuados para la evaluacion de la actividad de los polipeptidos quimericos de la invencion se incluyen los ensayos sin celulas y con celulas. Los polipeptidos quimericos poseeran dos actividades: una bioactividad del MTM1 y una actividad de penetracion celular del grupo internalizante que favorece la transferencia a traves de las membranas celulares al interior de las celulas. Los modelos adecuados permiten la evaluacion de una 5 o ambas de estas actividades.
A modo de ejemplo, los polipeptidos quimericos se pueden evaluar en cuanto a la penetracion celular usando celulas primarias en cultivo o una lfnea celular. Las celulas se ponen en contacto con el polipeptido quimerico y se ensayan para determinar si el polipeptido quimerico ha entrado en la celula y en que cantidad. Por ejemplo, se puede usar 10 IHQ para evaluar si el polipeptido quimerico ha entrado en la celula y se pueden comparar los resultados con un control adecuado. En ciertos aspectos en los que se cree que la transferencia al interior de las celulas ocurre por medio de un transportador ENT2, las celulas se pueden examinar en presencia o ausencia de un inhibidor del transportador ENT2.
15 Ademas, tal y como se describe en el presente documento, los polipeptidos quimericos de la presente divulgacion se pueden usar para ensayar la funcionalidad en ensayos con celulas. En un aspecto ejemplar, se pueden usar celulas musculares primarias de ratones deficientes en MTM1 (por ejemplo, MTM164) para determinar si el tratamiento con polipeptidos quimericos descrito en el presente documento puede mejorar la deficiencia de fusion de los mioblastos deficientes en miotubularina. Los metodos detallados se ejemplifican en el presente documento.
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A modo de ejemplo, se puede medir la bioactividad del MTM1 en ensayos sin celulas, por ejemplo, para confirmar que el polipeptido quimerico retiene la capacidad de union a ligandos adecuados y/o retiene la actividad fosfatasa. Se pueden realizar ensayos similares en celulas primarias en cultivo o en una lfnea celular en cultivo.
25 XI. Kits
En ciertos aspectos, la invencion tambien proporciona un envase o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes llenos con al menos un polipeptido quimerico de la invencion. Entre los recipientes ejemplares se incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, jeringas previamente llenadas, bolsas IV y envases blister (que 30 comprenden una o mas pfldoras). Opcionalmente, asociada a dicho(s) recipiente(s) puede haber una nota, de la forma prescrita por una agencia gubernamental, que regule la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o biologicos, nota que refleja (a) la homologacion por parte de la agencia de la fabricacion, uso o venta para administracion humana, (b) instrucciones de uso o ambas.
35 EJEMPLIFICACION
La invencion que se esta describiendo de modo general, se entendera mas facilmente haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen unicamente con el proposito de ilustrar ciertos aspectos y aspectos de la presente divulgacion, y no pretenden limitar la invencion. Por ejemplo, los constructos y disenos experimentales 40 concretos descritos en el presente documento representan herramientas y metodos ejemplares para la validacion de la funcion adecuada. Como tal, resultara facilmente evidente que cualquiera de los constructos y planes experimentales especfficos descritos se pueden sustituir dentro del alcance de la presente divulgacion.
Ejemplo 1 Conjugacion qulmica de 3E10 y hMTM1 (mAb3E10*hMTM1)
45
Conjugacion qulmica
El anticuerpo monoclonal 3E10 es del subtipo IgG2a y deriva de la fusion de celulas esplencias de un raton MRL/lpr/mpj con celulas de hibridoma FOX-Ny (Mankodi A et al., Mol Cell. 2002 Jul;10(1):35-44). Se conjugan 50 covalentemente diez miligramos (10 mg) de mAb 3E10 a MTM1 humano recombinante (AbNova) en una proporcion molar 1/1 usando dos reactivos heterobifuncionales diferentes, 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo y trans-4- (maleimidilmetil)ciclohexano-l-carboxilato de succinimidilo. Esta reaccion modifica los residuos de lisina del mAb 3E10 a tioles y anade grupos maleimida tiol reactivos al MTM1 (Weisbart RH, et al., J Immunol. 2000 Jun 1;164(11):6020-6). Tras la desproteccion, las protefnas modificadas se hacen reaccionar entre ellas para crear un 55 enlace tioeter estable. La conjugacion qulmica se ha realizado y los productos se fraccionan mediante cromatograffa de filtracion en gel. La composicion de las fracciones se evalua mediante electroforesis nativa y SDS-PAGE en ambientes reductores y no reductores. Las fracciones que contienen la mayor proporcion de conjugado qufmico mAb 3E10*hMTM1 a mAb 3E10 libre y hMTM1 libre se agrupan y seleccionan para su uso en estudios posteriores.
60 Se fabrican de forma similar conjugados qufmicos adicionales para su ensayo posterior. A modo de ejemplo no
limitante: (a) hMTM1*3E10, (b) Fv3E10*hMTM1, (c) hMTM1*Fv3E10. Notese que a lo largo de todo el ejemplo, la abreviatura Fv se usa para hacer referencia a un Fv de cadena sencilla del 3E10. De forma similar, se usan mAb 3E10 y 3E10 indistintamente. Estos y otros polipeptidos quimericos se pueden ensayar en cuanto a actividad enzimatica y funcionalidad usando, por ejemplo, los ensayos detallados en el presente documento. Cualquier 5 polipeptido quimerico que comprenda una porcion MTM1 y un grupo internalizante se puede ensayar de forma similar para confirmar que el polipeptido quimerico mantiene la actividad del MTM1 y la actividad de penetracion celular del grupo internalizante. La referencia a cualquier polipeptido quimerico concreto en estos ejemplos es unicamente a modo de ejemplo. En ciertos aspectos, se ensaya un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 11, o la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 11 en 10 ausencia de uno o ambos epftopos marcadores, mediante uno o mas de estos ensayos descritos en cualquiera de los ejemplos. En ciertos aspectos, se ensaya un polipeptido quimerico en el que el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 4 y que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 2. En otros aspectos, se ensaya un polipeptido quimerico en el que el grupo internalizante comprende un 15 anticuerpo o fragmento de union al antfgeno que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% identica a la SEC ID N°: 4 y que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% identica a la SEC ID N°: 2.
20 Actividad PI(3)P y PI(3,5)P fosfatasa in vitro del mAb3E10*hMTM1
Se evalua la actividad fosfatasa de diluciones equimolares que abarcan 5 log de 1) mAb3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente, 2) la mezcla sin conjugar de mAb 3E10 y hMTM1 3) mAb 3E10 por si solo, o 4) hMTM1 por si solo de acuerdo con las instrucciones del kit de ensayo de fosfatasa con verde de malaquita (Echelon Biosciences, Inc.) y tal 25 y como describen Schaletzky, J. et al. (Current Biology 13:504-509, 2003; Supplemental Data, S1-S3). Se evalua la actividad fosfatasa para determinar si el constructo de 3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente retiene la actividad enzimatica. Se evalua la actividad fosfatasa tanto en un sistema sin celulas como en celulas BHK en cultivo (por ejemplo, en celulas BHK tratadas con los conjugados y comparadas con celulas BHK tratadas con controles). La evaluacion de la actividad fosfatasa tanto en sistemas sin celulas como con celulas resulta util porque la evaluacion 30 de la actividad fosfatasa en las celulas puede verse complicada por el hecho de que existan otras protefnas con actividad PI(3)P y PI(3,5)P fosfatasa (varias protefnas relacionadas con la MTM1 (MTMR) que tienen actividad PI(3)P y PI(3,5)P fosfatasa incluidas). En consecuencia, y dado que las celulas BHK puede que no proporcionen un contexto claro para el ensayo de la actividad PI(3)P o PI(3,5)P fosfatasa de estos constructos, la actividad de los constructos se evaluara usando tanto sistemas sin celulas como con celulas. Los criterios de actividad incluyen, por 35 ejemplo, una actividad demostrada del MTM1 por sf solo del 50 % (en peso) o una actividad demostrada del 50 % de los niveles publicados (vease, por ejemplo, la Figura S1 de Supplemental Data by Schaletzky, J. et al.).
Aunque los presentes ejemplos usan especfficamente PIP3 (tambien conocida como "PI(3)P") y PI(3,5)P como sustratos para el MTM1, un experto entendera facilmente que tambien se pueden usar otros sustratos 40 fosfoinosftidos, tal y como se describe en el presente documento, como sustratos para ensayos in vitro.
Entrada en las celulas del mAb3E10*hMTM1 y asociacion con la oroteina endosomal Vps34
1. Se transfectan celulas BHK con el ADNc que codifica hVps34 y/o el ADNc para el transportador ENT2 que 45 media la captacion celular del mAb 3E10 (Hansen JE et al., J Biol Chem. 2007 Jul 20;282(29):20790-3). Dos dfas despues (48 horas despues de la transfeccion) se aplica mAb3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente o una mezcla de mAb 3E10 y hMTM1 sin conjugar a las celulas transfectadas, se realizan inmunoprecipitaciones con anti-Vps34, anti-hMTM1, o anti-mAb3E10 y se detectan mediante inmunoelectrotransferencia el mAb 3E10, hVps34, y hMTM1. Se realizan inmunoprecipitaciones inversas como controles. Las celulas BHK son 50 inmunologicamente negativas para la MTM1 humana (hMTM1), y Vps34 humana (hVps34) (Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067). Se verificara la entrada en las celulas del mAb3E10*hMTM1 por medio del transportador ENT2 tratando las celulas transfectadas con un inhibidor de ENT2 (NBMPR) antes de la adicion del material conjugado y sin conjugar. Se sabe que la MTM1 humana inmunoprecipita hVps34 y hVps15 (Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067), y la inmunoprecipitacion de hVps15 se puede usar como validacion posterior de una 55 asociacion endosomal o como una alternativa a la hVps34 para su uso en inmunoprecipitaciones. Dado que las celulas BHK son inmunologicamente negativas para hMTM1 y hVps34, cualquier indicio de coinmunoprecipitacion de hVps34 y hMTM1, seguida de adicion de material conjugado, pero no sin conjugar, resulta consistente con la conclusion de que se libero hMTM1 en las celulas y retuvo su capacidad de asociacion con la hVps34.
o Sfntesis de ADNc humano para Vps34 y ENT2: El ADNc para hVps34 y el transportador ENT2 son tal y como se ha publicado previamente (Hansen JE et al., J Biol Chem. 2007 Jul 20;282(29):20790-3; Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067). Cada ADNc se clona en un casete de expresion de mamfferos basado en CMV y se fabricaran preparaciones a gran escala usando el kit de 5 purificacion EndoFree Plasmid Mega de Qiagen.
o Transfecciones: Se transfectan diez microgramos del plasmido pCMV hVps34 y/o pCMV ENT2 en un 80 % de celulas BHK confluentes usando reactivos de transfeccion disponibles en el mercado. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion se aplica mAb3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente o una mezcla de mAb 3E10 sin conjugar y hMTMl libre a las celulas. De cuatro a 6 10 horas despues se lavan las celulas, lo que limpia los contenidos citoplasmaticos a la vez que mantiene
las estructuras celulares intactas (Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067). Para hacer un seguimiento de la eficiencia de transfeccion, se realizan transfecciones duplicadas con plasmidos que codifican un reportero adecuado tal como beta-galactosidasa o GFP. o Inmunoprecipitacion e inmunoelectrotransferencias: Las inmunoprecipitaciones se llevan a 15 cabo tal y como se ha descrito previamente (Weisbart RH et al., Mol Immunol. 2003 Mar;39(13):783-9;
Cao C et al., Traffic 2007; 8: 1052-1067) con anti-hMTM1, anti-hVps34, y anticuerpo anti-mAb3E10, seguido de deteccion por inmunoelectrotransferencia del hMTM1, hVps34, y mAb3E10 coinmunoprecipitados. Tambien se realizan inmunoprecipitaciones inversas como controles. Cuando no se emplean epftopos marcadores, la presencia de una banda inmunorreactiva de —190 kDa 20 coincidente con anti-3E10 y anti-MTM1 en celulas tratadas con mAb3E10*hMTM1 frente a controles
de 3E10 por si solo y hMTM1 por si solo supondra una penetracion correcta del 3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente. Si el conjugado qufmico mAb3E10*hMTM1 permanece intacto despues de la penetracion celular, deberfa inmunoprecipitar la hVps34 transfectada y del mismo modo la hVps34 deberfa inmunoprecipitar hMTM1 y 3E10. La deteccion de tubulina se usa como control de carga.
25 o Inhibicion ENT2: Para verificar la especificidad del mAb3E10*MTM1 por el transportador ENT2, se
trataran todos los grupos con el inhibidor de ENT2 nitrobencilmercaptopurina ribosido (NBMPR) durante 1 hora antes de la adicion del mAb3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente o una mezcla de mAb 3E10 recombinante libre y hMTM1 libre, y de 4 a 6 horas mas tarde se recogen el medio y las celulas para las inmunoprecipitaciones antes descritas.
30
2. Las celulas musculares primarias se disocian en paralelo a partir de Mtm164 (y/o a partir de otros ratones deficientes en MTM1) y camadas de ratones de tipo salvaje siguiendo el metodo establecido. Brevemente, se recogen musculos esqueleticos, finamente picados y digeridos usando dispasa II y colagenasa D. Se cultivan celulas miogenicas primarias en un medio de crecimiento (MC: F10 20 % FBS, 10 ng/ml 3/4-FGF, 1 % 35 penicilina/estreptomicina) en placas recubiertas de colageno y se transfieren cuando alcanzan aproximadamente el 70 % de confluencia.
Las celulas se tratan con Fv3E10-MTM1 recombinante en un rango de dosificacion y se fijan por inmunodeteccion, o se recogen los lisados celulares en una secuencia temporal de variables. Cuando esta presente, el marcador myc o 40 6His de la protefna Fv3E10-MTM1 recombinante, tal como la protefna descrita en la SEC ID N°: 11, se utiliza para inmunodeteccion y posterior determinacion de captacion intracelular y localizacion interna. Tambien se utilizan anticuerpos marcadores anti Fv3E10-MTM1 para coinmunoprecipitar la Fv3E10-MTM1 intracelular, para detectar la presencia de protefnas de union y para ensayar la actividad enzimatica (usando el kit de ensayo de fosfatasa con verde de malaquita descrito en el presente documento) de la protefna Fv3E10-MTM1 transportada internamente.
45
Correction del deficit de fusion en celulas musculares primarias
Las celulas musculares primarias se disocian en paralelo a partir de Mtm164 (y/o a partir de otros ratones deficientes en MTM1) y camadas de ratones de tipo salvaje siguiendo el metodo establecido. Brevemente, se recogen musculos 50 esqueleticos, finamente picados y digeridos usando dispasa II y colagenasa D. Se cultivan celulas miogenicas primarias en un medio de crecimiento (MC: F10 20 % FBS, 10 ng/ml 3/4-FGF, 1 % penicilina/estreptomicina) en placas recubiertas de colageno y se transfieren cuando alcanzan aproximadamente el 70 % de confluencia. Para evaluar las diferencias en proliferacion celular, se siembran en placa el mismo numero de celulas primarias de Mtm164 (y/o de otros ratones deficientes en MTM1) y mioblastos de tipo salvaje. Los cultivos se siguen diariamente 55 durante aproximadamente 2 semanas, con o sin adicion de MTM1 o Fv3E10-MTM1 recombinantes.
Para determinar si el tratamiento con protefna recombinante mejora la deficiencia de 'fusion' de los mioblastos deficientes en miotubularina, se siembran en placa celulas primarias en una placa de 12 pocillos a una concentracion de 2x105celulas/pocillo. Las celulas se mantienen en un medio de diferenciacion constituido por DMEM 60 suplementado con un 2 % de suero de caballo durante 7 dfas y se cambia en medio diariamente. Se monitoriza la
formacion de miotubos y se documenta mediante adquisicion de imageries microscopicas diariamente. Se calcula el indice de fusion en los cultivos celulares control y deficientes en miotubularina como la proporcion de nucleos fusionados en los miotubos del numero de nucleos totales. Los indices de fusion se comparan en los cultivos control, mutante y tratado usando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Estas evaluaciones indican si las celulas 5 tratadas difieren en contenido, proliferacion y capacidad de diferenciacion.
Despues de los ensayos o tratamientos, las miofibras o miotubos diferenciados de FDB en cultivo se hacen crecer en placas, se fijan en metanol, se bloquean en 10 % FBS/0,1 % Triton X-100 y se incuban con anticuerpos monoclonales de raton contra cadenas pesadas de desmina o miosina tipo 1, tipo 2a, o tipo 2b, tal y como se ha 10 descrito anteriormente Se cuentan las fibras positivas y se realizan medidas punto a punto del diametro MinFeret usando un microscopio Nikon Eclipse 90i que usa un software NIS-Elements-AR (Nikon, Melville, NY).
Ejemplo 2 Constructo genico de fv 3E10 y hMTM1 (Fv3E10-GS3-hMTM1 y Fv3E10-GSTS-hMTM1)
15 Se generan vectores de expresion de mamiferos que codifican una fusion genica de Fv3E10 y hMTM1 (fv3E10-GS3- hMTM1, que comprende el scFv del mAb 3E10 fusionado a hMTM1 mediante el conector GS3 - SEC ID N°: 3; fv3E10-GSTS-hMTM1 que comprende el scFv del mAb 3E10 fusionado a hMTM1 mediante el conector "GSTS" - SEC ID N°: 10). Se proporciona una secuencia ejemplar para un polipeptido quimerico fv3E10-GSTS-hMTM1 en la SEC ID N°: 11. Por tanto, los polipeptidos quimericos de la invencion incluyen un polipeptido quimerico que 20 comprende la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 11, en presencia o ausencia de los epitopos marcadores (por ejemplo, la SEC ID N°: 11 contiene internamente un marcador myc y un marcador 6x-His en el extremo terminal C).
Despues de la transfeccion, se inmunoprecipitan las celulas para verificar que la fusion genica retiene la capacidad 25 de asociacion con las proteinas endosomales, tal y como se describe en el Ejemplo 1. El medio acondicionado se somete a inmunoelectrotransferencia para detectar secrecion de 3E10 y hMTM1 al medio de cultivo. Despues de concentrar el medio de cultivo, se mide la actividad fosfatasa contra, por ejemplo, PI(3)P o PI(3,5)P, y se aplica el material concentrado a celulas BHK que expresan Vps34 y ENT2 para validar posteriormente que la fusion hMTM1 secretada entra a las celulas y retiene la capacidad de asociacion con las proteinas endosomales. Notese que 30 tambien se hace referencia a estas fusiones genicas como conjugados recombinantes o conjugados producidos recombinantemente.
Se fabricaran de forma similar conjugados producidos recombinantemente adicionales para su ensayo posterior. A modo de ejemplo no limitante: (a) hMTM1-GS3-3E10, (b) 3E10-GS3-hMTM1, (c) hMTM1-GS3-Fv3E10, (d) hMTM1- 35 3E10, (e) 3E10-hMTM1 (f) hMTM1-Fv3E10. Notese que a lo largo de todo el ejemplo, la abreviatura Fv se usa para hacer referencia a un Fv de cadena sencilla del 3E10. De forma similar, se usan mAb 3E10 y 3E10 indistintamente. Estos y otros polipeptidos quimericos se pueden ensayar usando, por ejemplo, los ensayos detallados en el presente documento.
• Sfntesis de ADNc para hMTM1 y Fv3E10: Se sintetiza el ADNc para MTM1 humana (numero de acceso: NP 40 000243.1) y el ADNc para la cadena ligera variable Fv3E10 de raton conectada a la cadena pesada del 3E10 con
sitios de restriccion flanqueantes que facilitan la clonacion a vectores de expresion adecuados. Para maximizar la expresion, cada ADNc tendra codones optimizados para la expresion en mamiferos, Pichia y/o E. coli. El ADNc de la MTM1 humana tiene tres secuencias consenso de glicosilacion que pueden modificarse tras la secrecion. El ADNc que codifica una cadena ligera variable Fv3E10 ejemplar de raton conectada a la cadena pesada del 3E10 para su 45 uso en el presente documento contiene una mutacion que mejora la capacidad de penetracion celular del fragmento Fv, que se produce en la posicion 31 (D31Q) de la secuencia completa del 3E10 de raton (Zack DJ et al., J Immunol. 1996 Sep 1;157(5):2082-8), y es la variante usada en los ejemplos. El ADNc resultante se clonara en un casete de expresion de mamffero, o en otro casete de expresion adecuado, y se fabricaran preparaciones a gran escala del plasmido pCMV-Fv3E10-GS3-hMTM1 usando el kit de purificacion EndoFree Plasmid Mega de Qiagen. Las 50 secuencias ejemplares de 3E10 VH de raton y 3E10 VL de raton se representan por las SEC ID N°: 2 y 4, respectivamente.
• Transfecciones: Se transfectan diez microgramos del plasmido pCMV-hMTM1, pCMV-Fv3E10-GS3-hMTM1, pCMV ENT2 o pCMV en un 80 % de celulas BHK confluentes usando reactivos de transfeccion disponibles en el mercado. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, se recoge y concentra el medio acondicionado y se
55 lavan y tratan las celulas con saponina tal y como se describe en el Ejemplo 1. Para hacer un seguimiento de la eficiencia de transfeccion se realizan transfecciones duplicadas con plasmidos que codifican un reportero adecuado tal como beta-galactosidasa o GFP.
• Actividad PIP3 fosfatasa de las fusiones de la hMTMIconjugada geneticamente: Se recogen lisados celulares y medio acondicionado concentrado a partir de celulas BHK transfectadas con fusion pCMV-hMTM1, pCMV- hMTM1
60 tal y como se describe en el presente documento o pCMV y se evalua la actividad fosfatasa, por ejemplo contra
PI(3)P o PI(3,5)P de cada transfeccion siguiendo las instrucciones del kit de ensayo de fosfatasa con verde de malaquita (Echelon Biosciences, Inc). La descripcion general de los grupos experimentales y los resultados esperados para ciertos grupos de control se indican en la Tabla 1. Las celulas marcadas como "?" indican resultados que se deben obtener. Los grupos de control 13-16 (vease la Tabla 1) incluiran la aplicacion de mAb3E10*MTM1 5 conjugado qufmicamente a las celulas transfectadas a pCMV (simuladas) seguida un dfa mas tarde de evaluacion de la actividad fosfatasa en lisados celulares y medio acondicionado concentrado. Al dfa siguiente (24 horas despues) se examina la actividad fosfatasa en los lisados celulares y el medio acondicionado concentrado. Por ejemplo, no se espera observar actividad fosfatasa en el lisado del grupo 13 que ha sido pretratado con inhibidor de ENT2 (Grupo 13 de la Tabla 1). Los grupos de control adicionales 17-18 tendran una actividad conocida del mAb3E10*MTM1 10 conjugado qufmicamente enriquecido en los lisados celulares y medio acondicionado concentrado de celulas transfectadas pCMV (simuladas) y servira como control positivo y curva estandar para la actividad fosfatasa.
Tabla 1. Diseno experimental para evaluar la actividad PIP3 fosfatasa, la asociacion endosomal y la
secrecion de Fv3E10-GS3-MTM1
Tabla 1: Estrategia para evaluar la actividad PIP3 fosfatasa, la asociacion endosomal y la secrecion de Fv3E10- GS3-MTM1 conjugado geneticamente.___________________________________________________________
Grupo
ADNc transfectados Anticuerpo de inmunoprecipitacion ^Tambien ha inmunoprecipitado la siguiente protefna? ^Actividad PIP3 en las inmunoprecipitaciones?
Vps34
hMTM1 3E10 Lisado* Medio acondicionado
1
pCMV hMTM1 + CMV hVps34 anti-hMTM1 Sf Sf No Sf No
2
anti-hVps34 Sf Sf No Sf No
3
anti-3E10 No No No Sf No
4
pCMV hMTM1 + CMV anti-hMTM1 No Sf No Sf No
5
anti-hVps34 No No No Sf No
6
anti-3E10 No No No Sf No
7
pCMV 3E10- GS3-hMTM1 + CMV hVps34 anti-hMTM1 ? Sf Sf ? ?
8
anti-hVps34 Sf ? ? ? ?
9
anti-3E 10 ? Sf Sf ? ?
10
pCMV 3E10- GS3-hMTM1 + CMV anti-hMTM1 No Sf Sf ? ?
11
anti-hVps34 No No No ? ?
12
anti-3E10 No Sf Sf ? ?
15
Grupo
ADNc transfectados Inhibidor ENT2: Aplicacion de mAb3E10*hMTM1 a las celulas ^Actividad PIP3 en las inmunoprecipitaciones?
Lisado*
Medio acondicionado
13
CMV + CMV ENT2 + + No Sf
14
- + Sf Sf
15
CMV + + ? Sf
16
- + ? Sf
17
CMV - - Si, enriquecido No
18
- - No Si, enriquecido
*, las actividades PIP3 fosfatasa seran funcion de la actividad endogena y dependiente de hMTM1. Los grupos del 13 al 16 son controles para mostrar que el ENT2 controla la captacion celular de conjugados qufmicos de 3E10*hMTM1, y los grupos 17 y 18 son controles para la deteccion de actividad fosfatasa de la MTM1 en lisados celulares y medio acondicionado_________________________________________________________________
Captacion celular de hMTM1 conjugada geneticamente: El mAb3E10*hMTM1 conjugado qufmicamente y el medio acondicionado concentrado de celulas BHK transfectadas con fusion pCMV hMTM1 o pCMV se aplica a las celulas BHK transfectadas 48 horas antes con pCMV ENT2 o pCMV Tabla 2. A continuacion se procedera con las 20 inmunoprecipitaciones como en el Ejemplo 1. El tratamiento de grupos duplicados con el inhibidor NBMPR del transportador verificara que la captacion de 3E10 es especffica al transportador ENT2.
Tabla 2. Diseno experimental para evaluar si Fv3E10-GS3-hMTM1 entra en las celulas por medio del ENT2 y ____________________________se asocia con las proteinas endosomales___________________________
Tabla 2: Estrategia para evaluar si Fv3E10-GS3- hMTM1 entra en las celulas por medio del ENT2 y se asocia con las proteinas endosomales
Celulas tratadas con SALINA antes de la proteina recombinante Celulas tratadas con NBMPR antes de la proteina recombinante
^Tambien ha inmunoprecipitado la siguiente proteina?
^Tambien ha inmunoprecipitado la siguiente proteina?
Grupo
ADNc transfectado Fuente de 3E10- hMTM1 Anticuerpo IP Vps34 hMTM1 3E10 Vps34: hMTM1: 3E10
1
pCMV hVps34 + pCMV ENT2 3E10+hMTM1 mezclados sin conjugar anti- hMTM1 No No No No No No
2
anti- hVps34 Si No No Si No No
3
anti-3E10 No No Si No No No
4
pCMV hVps34 + pCMV anti- hMTM1 No No No No No No
5
anti- hVps34 Si No No Si No No
6
anti-3E10 No No ? No No No
7
pCMV + pCMV ENT2 anti- hMTM1 No No No No No No
8
anti- hVps34 No No No No No No
9
anti-3E10 No No Si No No No
10
pCMV hVps34 + pCMV ENT2 mAb 3E10* hMTM1 (conjugados quimicamente) anti- hMTM1 Si* Si Si No No No
11
anti- hVps34 Si Si* Si* Si No No
12
anti-3E10 Si* Si Si No No No
13
pCMV hVps34 + pCMV anti- hMTM1 Si* Si Si No No No
14
anti- hVps34 Si Si* Si* Si No No
15
anti-3E10 Si* Si Si No No No
16
pCMV + pCMV ENT2 anti- hMTM1 No Si Si No No No
17
anti- hVps34 No No No No No No
18
anti-3E10 No Si Si No No No
19
pCMV hVps34 + pCMV ENT2 Medio acondicionado concentrado de la transfeccion pCMV Fv3E10- GS3-hMTM1 (conjugado geneticamente) anti- hMTM1 ? ? ? No No No
20
anti- hVps34 Si ? ? Si No No
21
anti-3E10 ? ? ? No No No
22
pCMV hVps34 + pCMV anti- hMTM1 ? ? ? No No No
23
anti- hVps34 Si ? ? Si No No
24
anti-3E10 ? ? ? No No No
25
pCMV + pCMV ENT2 anti- hMTM1 No ? ? No No No
26
anti- hVps34 No No No No No No
27
anti-3E10 No ? ? No No No
28
pCMV Vps34 + pCMV 3E10 Medio acondicionado concentrado de anti- hMTM1 Si** Si Si Si** Si Si
29
anti- Si Si** Si** Si Si** Si**
- GS3- la transfeccion hVps34
30
hMTM1 pCMV simulada anti-3E10 Si** Si Si Si** Si Si
*, inmunoprecipitado y detectado mediante inmunoelectrotransferencia solo si ha inmunoprecipitado en el objetivo especffico 1 de la tabla 2, grupos 10 al 18.**, asume que el conjugado genetico no tiene defectos de asociacion entre Vps34 y hMTM1.__________________________________________________________________________
Ejemplo 3 Production recombinante de fusiones de hMTM1 y verification de la actividad PIP3 fosfatasa, la penetration celular y la asociacion endosomal con Vps34
5 El 3E10-GS3-hMTM1 o 3E10-GSTS-hMTM1 recombinante se produce usando el sistema de expresion de protefnas en levadura Pichia (Invitrogen, RCT). Pichia exhibe una excelente expresion proteica, altas densidades celulares, procedimientos controlables, estabilidad de generacion, durabilidad y procesamiento del producto similar al de las celulas de mamfferos. Se producen tanto las formas secretadas como no secretadas del 3E10-GS3-hMTM1. La secuencia hMTM1 contiene tres sitios NXS/T de glicosilacion potenciales que pueden afectar a la actividad biologica 10 de cualquier material secretado. En otros aspectos, los polipeptidos quimericos se producen en un sistema de expresion bacteriano (por ejemplo, E. coli) o en un sistema de expresion celular en mamfferos.
• Construccion de vectores de expresion proteica para Pichia: La construccion de plasmidos, transfeccion, seleccion de colonias y cultivos para Pichia usaran kits y manuales de instrucciones del
15 fabricante (Invitrogen). Los ADNc para hMTM1 conjugados geneticamente (3E10-GS3-hMTM1 o
3E10-GSTS-hMTM1 creados y validados en el Ejemplo 2 se clonan en dos plasmidos alternativos; PICZ para expresion intracelular y PICZalfa para expresion secretada. La expresion proteica a partir de cada plasmido es impulsada por el promotor AOX1. Las Pichia transfectadas se seleccionan con zeocina y se ensayan las colonias en busca de expresion de la fusion hMTM1 recombinante. Las que 20 mas se expresen se seleccionaran y escalaran para purificacion.
• Purificacion de la fusion de hMTM1 recombinante: las fusiones de ADNc con mAb 3E10 Fv se ligan en el vector de expresion de la levadura pPICZA que se electropora posteriormente en la cepa Pichia pastoris X-33. Las colonias se seleccionan con zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se identifican con anticuerpos anti-his6 (Qiagen Inc, Valencia, CA). Se hacen crecer las celulas X-33 en
25 matraces oscilantes de tres bocas con un medio atamponado de glicerol/metanol, y se induce la
sfntesis de protefnas con un 0,5 % de metanol de acuerdo con el protocolo del fabricante (EasySelect Pichia Expression Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA). Las celulas se lisan mediante dos pasos a traves de una prensa celular francesa a 20 000 lbs/in2, y se purifica la protefna recombinante a partir de sedimentos celulares solubilizados en 9 M de guanidina HCl y 2 % de NP40 mediante cromatograffa 30 de afinidad por iones metalicos inmovilizados (IMAC) en Ni-NTA-Agarosa (Qiagen, Valencia, CA). La
protefna ligada se eluye en 50 mM de NaH2PO4 que contiene 300 mM de NaCl, 500 mM de imidazol y un 25 % de glicerol. Muestras de las fracciones eluidas se someten a electroforesis SDS-PAGE en un gradiente del 4-20 % (NuSep Ltd, Frenchs Forest, Australia) y se identifican las protefnas recombinantes mediante Western blot a membranas de nitrocelulosa desarrolladas con anticuerpos de 35 raton especfficos a carga seguidos de anticuerpos de cabra conjugados con fosfatasa alcalina a IgG
de raton. Se mide la actividad fosfatasa alcalina mediante el sustrato cromogenico, cloruro de nitroblue tetrazolium/sal 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato de p-toluidina. Las protefnas se identifican en geles SDS-PAGE con reactivo de tincion azul GelCode (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). La protefna elufda esta concentrada, reconstituida con suero de ternera fetal al 5 % y sustituida mediante dialisis 40 por centuplicado en filtros para centrifugado 30 000 MWCO (Millipore Corp., Billerica, MA) contra
medio McCoy (Mediatech, Inc., Herndon, VA) que contiene un 5 % de glicerol.
• Expresion es bacteria: El polipeptido quimerico tambien se puede expresar en un sistema de expresion bacteriano, tal como el E. coli. En tales casos, el constructo de acido nucleico que codifica el polipeptido quimerico es de preferencia codonica optimizado para la expresion en E. coli. Para la
45 expresion en E. coli, se usa el vector pGEX-2T GST. Se pueden ensayar diferentes cepas de E. coli
para optimizar la expresion, tales como las cepas de E. coli WCA, BL21(DE3) y BL21(DE3) pLysE.
• Evaluacion de la calidad y formulacion: La inmunoelectrotransferencia contra 3E10 y hMTM1 se usara para verificar el tamano e identidad de las protefnas recombinantes, seguida de tincion con plata para identificar la pureza relativa de las preparaciones de fusion 3E10 MTM1 y hMTM1. Se formulara
50 material recombinante en un tampon y concentracion (~0,5 mg/ml) que sean consistentes con las
necesidades de las posteriores administraciones in vivo.
• Evaluacion in vitro del material recombinante: En base a los estudios del Ejemplo 2, se determina la cantidad de actividad fosfatasa (por ejemplo, contra PI(3)P o PI(3,5)P por mol de conjugado que existe en el medio acondicionado de celulas transfectadas de fusion hMTM1 y este valor se usa como
estandar para la evaluacion de la actividad fosfatasa de la fusion hMTM1 recombinante derivada de Pichia o E. coli. Tal y como se muestra en la Tabla 2, la actividad PIP3 fosfatasa relativa del conjugado qufmico, derivado de celula de mamffero y 3E10-GS3-hMTM1 recombinante derivado de Pichia en celulas BHK transfectadas con Vps34 se compara de forma similar.
5
Ejemplo 4 Evaluacion in vivo de hMTM1 dirigida al musculo en ratones MTM KO Seleccion de un modelo de raton para evaluacion
Ratones que poseen una inactivacion especffica del gen MTM1 (MTM1 KO) nacen en una distribucion submendeliana que por lo demas parece normal. Sin embargo, en las primeras semanas de vida los ratones MTM1 KO empiezan a perder masa muscular que rapidamente progresa a colapso respiratorio y muerte a una edad media de 7 semanas (14 semanas maximo) (Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23): 15060-5). El declive progresivo de los ratones MTM KO coincide con una atenuacion de la ganancia de peso, reduccion de la fuerza de agarre en la extremidad anterior, reduccion de la capacidad para soportarse a si mismos en contra de la fuerza de la gravedad y aumento del arrastre de pies (Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5). Las miofibras de los ratones MTM KO aparecen hipotroficas y vacuoladas con nucleos localizados centralmente rodeados de mitocondria y glicogen, aunque hay muy poco dano al sarcolema y no hay signos de apoptosis o inflamacion (Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5). Una ventaja del uso de ratones MTM1 KO es la capacidad de usar ELISA para hacer el seguimiento de los niveles sericos y en tejido de 3E10-GS3-MTM1, y sera necesaria para la posterior evaluacion farmacocinetica y las respuestas farmacodinamicas y toxicologicas respectivas. Para controlar si los niveles de MTM1 superiores a los fisiologicos resultan perjudiciales, se administrara 3E10-hMTM1 a ratones homocigoticos MTM1 de tipo salvaje (+/+).
25 A continuacion se describen ensayos ejemplares para la evaluacion de los ratones tratados. Ademas, la mejora en la afeccion de los ratones se evalua en base a la esperanza de vida (aumento de la esperanza de vida en los ratones tratados), peso y disminucion del arrastre de pies.
Seleccion de la dosis de 3E10-GS3-hMTM1
30
Se determina la dosis de evaluacion de 3E10 conjugado qufmicamente o geneticamente a hMTM1 liberado en los ratones MTM KO. Como punto de partida, para demostrar una respuesta terapeutica, se administra intravenosamente una dosis alta (por ejemplo 5,0 mg/kg) dos veces a la semana durante 20 semanas o hasta la muerte, lo que suceda primero. Se administra una dosis de 5 mg/kg de 3E10-GS3-MTM1 dos veces a la semana 35 durante 20 semanas a ratones MTM KO (Tabla 3), seguida de evaluacion de los cambios en los puntos finales de la enfermedad. Los controles incluyen ratones MTM1 +/+ heterocigoticos vehfculo y tratados y ratones MTM1 -/- tratados con el vehfculo. Tambien se monitoriza el desarrollo de anticuerpos anti-3E10-MTM1. Si establecemos que las fusiones genicas de 3E10*MTM1 o MTM1 intravenosas (por ejemplo, 3E10-GS3-hMTM1 o 3E10-GSTS-hMTM1) resultan en una mejora del fenotipo, se iniciaran evaluaciones de pK posteriores in vivo en ratones MTM KO para 40 identificar un regimen de dosificacion que favorezca el mayor efecto farmacodinamico con las menores consecuencias toxicologicas.
T abla 3. Plan de dosificacion in vivo para 3E10-MTM1 conjugado qufmicamente y geneticamente
Tabla 3: Plan de dosificacion in vivo para 3E10-MTM1 conjugado qufmicamente y geneticamente
Grupo
Cepa Edad (semanas) N.° de ratones Tratamiento Dosis (mg/kg)
1
MTM1 -/- 10 5 mAb 3E10* hMTM1 (conjugado qufmicamente) 5
2
MTM1 -/- 10 5 mAb 3E10 & hMTM1 (mezclados sin coniugar) 5
3
MTM11 - /- 10 5 Fv3E10-GS3-hMTM1 (conjugado geneticamente) 5
4
MTM1 -/- 10 5 Vehfculo NA
5
MTM1 +/+ 10 5 mAb 3E10* hMTM1 (conjugado qufmicamente)
5
6
MTM1 +/+ 10 5 mAb 3E10 & hMTM1 (mezclados sin conjugar) 5
7
MTM1 10 5 Fv3E10-GS3-hMTM1 5
10
15
20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
+/+ (conjugado geneticamente)
8
MTM1 +/+ 10 5 Vehnculo NA
Informacion sobre el intervalo temporal: Dosis dos veces a la semana durante 20 semanas.
Observaciones diarias. Recoleccion de sangre y tejidos para aislamiento de protemas IHQ, H&E
Fuerza de agarre: El dispositivo de evaluacion de la fuerza de agarre (Columbus Instruments) no requiere entrenamiento previo por parte del raton. En la prueba de tension corporal total empleada por otros (Bello AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):15060-5) se ata un animal por su cola a un transductor de fuerza, a continuacion, la cola se pellizca y se mide la tension ejercida a medida que el animal intenta escapar. Aparte de las implicaciones en materia de bienestar del animal al que se le induce dolor como condicion para obtener una respuesta, no esta claro como esta estandarizada la fuerza del pellizco o como se asegura correctamente la cola al transductor. Como alternativa aceptable, un ensayo de fuerza de agarre de la extremidad anterior, normalizado para el peso del raton, reproducina suficientemente las mediciones de la prueba de tension corporal total, sobrevivina al escrutinio de la IACUC y se puede realizar con un transductor de fuerza de facil disposicion (Columbus Instruments). El angulo en el que se tira del raton desde la rejilla metalica tendra un efecto proporcional en la fuerza medida. Por lo tanto, la prueba de fuerza de agarre esta estandarizada para que se tire del raton por la cola de forma paralela a la rejilla horizontal y en direccion contraria al transductor de fuerza a una velocidad de aproximadamente 5 cm/seg. Su usan cuatro tirones separados por ~20 segundos de descanso para medir cualquier fatiga.
Inyeccion de 3E10-MTM1 conjugado qufmicamente y geneticamente. Se formula una fusion genica de 3E10*hMTM1 o hMTM1 y se diluye en un tampon que sea consistente con la inyeccion intravenosa (por ejemplo, una solucion salina esteril o una solucion tamponada de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M). La cantidad de fusion genica 3E10*hMTM1 o hMTM1 dada a cada raton se calcula como sigue: dosis (mg/kg) x peso del raton (kg) x concentracion de reserva (mg/ml) = volumen (ml) de reserva por raton, c.s.p. 100 ul con vehnculo.
Toma de muestras de sangre. La sangre se recoge mediante puncion cardiaca en el momento en que los animales se sacrifican para la diseccion de tejidos. Se retira el suero y se congela a -80 °C. Para minimizar los efectos de la descongelacion y manipulacion, todos los analisis de fusion genica 3E10*MTM1 o MTM1 que circulan por la sangre se realizan en el mismo dfa.
Recogida y preparacion de tejidos. Los tejidos de muestra se dividen por inmunoelectrotransferencia, bloques de tejido fijados en formalina e integrados en parafina y secciones congeladas en OCT. Una mitad del corazon, hngado, pulmon, bazo, rinones, cuadriceps, EDL, soleo, diafragma y biceps se subdividira y congelara en tubos de plastico para posterior procesado por analisis de inmunoelectrotransferencia. La mitad restante del corazon, tngado, pulmon, bazo, rinones, cuadriceps, EDL, soleo, diafragma y biceps se subdividira, congelara en medio de seccionamiento de tejidos OCT o fijara en zinc-formaldehndo durante 24 a 48 horas a 4 °C y se integrara en parafina.
Evaluacion histologica. Se usa microscopfa de campo claro de las secciones HE para determinar el porcentaje de miofibras nucleadas centralmente y el area transversal de las miofibras a partir de cinco campos seleccionados al azar. Se cuentan al menos 200 fibras por raton y grupo muscular. Otras secciones se someten a tincion con NADH-TR. Tambien se realiza la puntuacion de las secciones ciegas para nucleos centrales, el area transversal de las miofibras y la normalizacion de la tincion con NADH-TR.
Inmunoelectrotransferencia. El aislamiento de protemas y la deteccion por inmunoelectrotransferencia de 3E10 y MTM1 se realiza tal y como se ha descrito anteriormente (Weisbart RH et al., Mol Immunol. 2003 Mar;39(13):783-9; Bello AB et al., Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 14; Lorenzo O et al., Journal of Cell Science 119, 2953-2959 2005).
Analisis de 3E10-hMTM1 circulante: Se ha desarrollado una tecnica ELISA espedfica para el 3E10- MTM1 y se ha validado usando anticuerpos anti-MTM1 humanos disponibles en el mercado. El 3E10- MTM1 recombinante se diluye y se usa para generar una curva estandar. Los niveles de 3E10-MTM1 se determinan a partir de diluciones de suero (normalizadas a ng/ml de suero) o extractos de tejido (normalizado a ng/ml de tejido).
Monitorizacion de respuestas de anticuerpos anti-3E10-hMTM1. El 3E10-MTM1 purificado usado para inyectar ratones MTM KO se siembra en placas ELISA de alta capacidad de enlace de 96 pocillos en 1 ug/ml de tampon de revestimiento (Pierce Biotech), al que se le permitio que revistiera durante la
noche, se bloquea durante 30 minutos en un 1 % de leche en polvo no grasa (Biorad) en TBS y se aclara tres veces en TBS. Se cargan diluciones dobles de sero procedente de animales inyectados con vehfculo y 3E10-MTM1 en pocillos, se les permite incubar durante 30 minutos a 37 °C, se lavan tres veces, se incuban con IgA, IgG e IgM de conejo anti-raton conjugadas con peroxidasa de rabano 5 picante (HRP), se dejan incubar durante 30 minutos a 37 °C, y se lavan tres veces. Los anticuerpos
anti-3E10-MTM1 de raton se detectan con sustrato lfquido TMB y se leen a 405 nm en un lector de placas ELISA. El MTM1 de conejo anti-raton policlonal (Bello AB et al., Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, No. 14), seguido de cabra anti-conejo conjugado con HRP sirve reaccion de anticuerpo de control positivo. Cualquier absorbancia a 405 nm superior a la de los ratones MTM1 KO tratados 10 con el vehfculo constituye una respuesta del anticuerpo anti-3E10-MTM1 positiva.
• Analisis estadfstico. La comparacion por pares empleara la prueba de t Student. Las comparaciones
entre multiples grupos emplearan ANOVA. En ambos casos, un valor de <0,05 se considerara estadfsticamente significativo.
15 Los anteriores ejemplos ayudan a ilustrar los experimentos que se pueden usar durante la fabricacion y ensayo de polipeptidos quimericos para uso en los metodos descritos en el presente documento. Los polipeptidos quimericos que comprenden una porcion MTM1 y un grupo internalizante se ensayan usando, por ejemplo, tres metodos. Cualquiera de los polipeptidos quimericos descritos en la memoria descriptiva se puede ensayar con facilidad. Cualquier polipeptido quimerico que comprenda una porcion MTM1 y un grupo internalizante se puede ensayar de 20 forma similar para confirmar que el polipeptido quimerico mantiene la actividad del MTM1 y la actividad de penetracion celular del grupo internalizante. La referencia a cualquier polipeptido quimerico concreto en estos ejemplos es unicamente a modo de ejemplo. En ciertos aspectos, se ensaya un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 11, o la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 11 en ausencia de uno o ambos epftopos marcadores, mediante uno o mas de los ensayos descritos en 25 cualquiera de los ejemplos. En ciertos aspectos, se ensaya un polipeptido quimerico en el que el grupo internalizante comprende un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 4 y que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 2. En otros aspectos, se ensaya un polipeptido quimerico en el que el grupo internalizante comprende un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno que comprende una cadena ligera que comprende una 30 secuencia de aminoacidos al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% identica a la SEC ID N°: 4 y que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% identica a la SEC ID N°: 2.
INFORMACION SOBRE SECUENCIAS
35
SEC ID N°: 1: secuencia de aminoacidos de la protefna MTM1 humana (NP_000243.1)
MASASTSKYNSHSLENESIKRTSRDGVNRDLTEAVPRLPGETLITDKEVIYICPFNGPI
KGRVYITN YRLYLRSLETDSSLILDVPLGVISRIEKMGG ATSRGENS Y GLDIT CKDMR
NLRFALKQEGHSRRDMFEILTRYAFPLAHSLPLFAFLNEEKFNVDGWTVYNPVEEYR
RQGLPNHHWRITFINKCYELCDTYPALLVVPYRASDDDLRRVATFRSRNRIPVLSWIH
PENK.TV1VRCSQPLVGMSGK.RNK.DDEKYLDVIRETNKQISKLT1YDARPSVNAVANK
ATGGGYESDDAYHNAELFFLDIHNIHVMRESLKXVKDIVYPNVEESHWLSSLESTHW
LEHIKLVLTGAIQVADKVSSGKSSVLVHCSDGWDRTAQLTSLAMLMLDSFYRSIEGF
EILVQKKWISFGHKFASRIGHGDKNHTDADRSPIFLQFIDCVWQMSKQFPTAFEFNEQ
FLIIILDHLYSCRFGTFLFNCESARERQKVTERTVSLWSLINSNKEKFKNPFYTKEINRV
LYPVASMRHLELWVNYYIRWNPRIKQQQPNPVEQRYMELLALRDEYlfCRLEELQLA
NSAfCLSDPPTSPSSPSQMIVfPH VQTHF
40 SEC ID N°: 2: cadena pesada variable del 3E10
EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSS
TIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTL
TVSS
SEC ID N°: 3: secuencia del conector "GS3"GGGGSGGGGSGGGGS 5 SEC ID N°: 4: cadena ligera variable del 3E10
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYL ESG VP ARFSGSGSGTDFHLNIHPVEEED AATYY CQHSREFP WTF GGGTKLELK
SEC ID N°: 5: secuencia de acido nucleico MTM1 humano (NM_000252.2)
10
agagggggcg
gagcagggcc
cccgagagtt
tccaggatgg
gaatgagtct
attaagagga
tcctcgactt
ccaggagaaa
caatggcccc
attaagggaa
ggaaacggat
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ctgaggttcg
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cggcagccga cttctgcatc cgtctcgaga cactaatcac gagtttacat tacttgatgt gaggagaaaa ctttgaaaca ttcccctggc at ggatggac attggagaat tggtggttcc gaaatcgaat gcagtcagcc at gttatcag gcgtaaatgc ataacgccga aaaaagtgaa agtctactca acaaagtttc
gcagcctggc aacttctaaa tggagt caat tgacaaagaa cacaaattat tcctctgggt ttcctatggt ggaaggccac tcacagtctg agtttacaat aacttttatt gtatcgtgcc tccagtgctg tcttgtcggt ggagactaat agtggccaac acttttcttc ggacattgtt ttggttagaa ttcagggaag
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tataattcac
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ctaaactcac
gaggaggata
ataatattca
tagaagaatc
tcgttttgac
ttgtgcattg

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Polipeptido quimerico que comprende: (i) un polipeptido de miotubularina (MTM1), o un fragmento del mismo y (ii) un grupo internalizante, donde el polipeptido quimerico tiene actividad fosfoinosftido fosfatasa; donde el
    5 grupo internalizante es un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo, donde dicho anticuerpo o fragmento de union al antfgeno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde el VH comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 2, o una variante humanizada de la misma, y el VL comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID 10 N°: 4, o una variante humanizada de la misma de la misma.
  2. 2. Polipeptido quimerico que comprende: (i) un polipeptido de miotubularina (MTM1), o un fragmento del mismo y (ii) un grupo internalizante, donde el polipeptido quimerico tiene actividad fosfoinosftido fosfatasa; donde el grupo internalizante es un anticuerpo humanizado o un fragmento de union al antfgeno del mismo, donde dicho
    15 anticuerpo o fragmento de union al antfgeno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde el VH comprende una variante humanizada de una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 2, y el VL comprende una variante humanizada de una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 4.
    20
  3. 3. Polipeptido quimerico de la reivindicacion 1 o 2, donde el grupo internalizante favorece el transporte de dicho polipeptido quimerico al interior de las celulas musculares.
  4. 4. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el polipeptido MTM1 25 comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 90 % identica a la SEC ID N°: 1.
  5. 5. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4, donde el polipeptido MTM1 comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 1, y donde el grupo internalizante es un Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoacidos
    30 descrita en SEC ID N°: 2 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 4, y donde el polipeptido MTM1 es C-terminal al scFv y esta conjugado al scFv por medio de un conector.
  6. 6. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el polipeptido MTM1 ademas 35 comprende una o mas porciones de polipeptido que mejoran una o mas de la estabilidad in vivo, la semivida in vivo,
    la captacion/administracion y/o la purificacion.
  7. 7. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-6, donde el anticuerpo o el fragmento de union al antfgeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia
    40 de aminoacidos identica a la SEC ID N°: 4, o una variante humanizada de la misma, y un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoacidos identica a la SEC ID N°: 2 o una variante humanizada de la misma.
  8. 8. Polipeptido quimerico de la reivindicacion 7, donde dicho anticuerpo o fragmento de union al antfgeno 45 del mismo es quimerico o humanizado.
  9. 9. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-6 y 8, donde dicho anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 98 % identica a la SEC ID N°: 4, o una variante humanizada de la misma, y
    50 un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 98 % identica a la SEC ID N°: 2, o una variante humanizada de la misma.
  10. 10. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde dicho anticuerpo o fragmento de union al antfgeno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera
    55 (VL), donde el VH comprende una variante humanizada de una secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 2, y el VL comprende una variante humanizada de una secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 4.
  11. 11. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el polipeptido MTM1 o fragmento del mismo esta conjugado o unido al grupo internalizante mediante un conector.
  12. 12. Polipeptido quimerico de la reivindicacion 11, donde el grupo internalizante esta conjugado al aminoacido N-terminal o C-terminal del polipeptido MTM1.
  13. 13. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el fragmento de union al 5 antfgeno del mismo es un Fv de cadena sencilla (scFv).
  14. 14. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-12, donde el grupo internalizante es un Fab'.
    10 15. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-12, donde el grupo internalizante
    es un fragmento F(ab')2.
  15. 16. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones es un anticuerpo de longitud completa.
    15
  16. 17. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones fragmento del mismo esta conjugado qufmicamente al grupo internalizante
  17. 18. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el polipeptido MTM1 se 20 expresa en celulas bacterianas.
  18. 19. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el polipeptido MTM1 esta subglicosado en comparacion con un polipeptido MTM1 nativo.
    25 20. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el polipeptido MTM1 no esta
    glicosado.
  19. 21. Constructo de acido nucleico, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido MTM1 o un fragmento del mismo, conectado operativamente a una secuencia de nucleotidos que
    30 codifica un grupo internalizante, donde el constructo de acido nucleico codifica un polipeptido quimerico que tiene actividad fosfoinosftido fosfatasa; y donde el grupo internalizante es un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo, donde dicho anticuerpo o fragmento de union al antfgeno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde el VH comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 2, o una variante 35 humanizada de la misma, y el VL comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos descrita en SEC ID N°: 4, o una variante humanizada de la misma de la misma.
  20. 22. Constructo de acido nucleico de la reivindicacion 21, donde el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de
    40 aminoacidos que es al menos un 98 % identica a la SEC ID N°: 4, o una variante humanizada de la misma, y un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 98 % identica a la SEC ID N°: 2, o una variante humanizada de la misma.
  21. 23. Constructo de acido nucleico de la reivindicacion 21, donde el anticuerpo o fragmento de union al 45 antfgeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una variante humanizada de
    una secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 2, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una variante humanizada de una secuencia de aminoacidos descrita en la SEC ID N°: 4.
  22. 24. Constructo de acido nucleico, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido 50 quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-20.
  23. 25. Constructo de acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 21-24, donde el fragmento de union al antfgeno del mismo es un Fv de cadena sencilla (scFv).
    55 26. Composicion que comprende el polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, y un
    vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  24. 27. Composicion de la reivindicacion 26, que ademas comprende un segundo agente que actua de forma
    aditiva o sinergica para uso en el tratamiento de la miopatfa miotubular.
    1-4 y 6-12, donde el grupo internalizante 1-4 y 6-10, donde el polipeptido MTM1 o
  25. 28. Polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 para uso en el tratamiento de la miopatfa miotubular en un sujeto con necesidad del mismo.
  26. 29. Uso in vitro del polipeptido quimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 para liberacion en el 5 interior de una celula muscular.
ES10790070.6T 2009-06-15 2010-06-15 Métodos y composiciones para el tratamiento de la miopatía miotubular usando polipéptidos quiméricos que comprenden polipéptidos de miotubularina 1 (mtm1) Active ES2630057T3 (es)

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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI1011236A2 (pt) 2009-06-15 2019-07-09 4S3 Bioscience Inc métodos e composições para tratamento de miopatia miotubular usando polipeptídeos quiméricos compreendendo polipeptídeos miotubularesih 1 (mtm1)
CN103874710B (zh) 2011-04-01 2018-03-27 耶鲁大学 细胞渗透型抗dna抗体和其抑制dna修复的用途
WO2013138662A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 4S3 Bioscience, Inc. Antisense conjugates for decreasing expression of dmpk
US9732146B2 (en) 2012-03-30 2017-08-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Antibody-mediated transduction of heat shock proteins into living cells
WO2013177428A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Valerion Therapeutics, Inc. Methods for increasing muscle contractility
EP2981551B1 (en) 2013-02-20 2020-06-03 Valerion Therapeutics, LLC Methods and compositions for treatment of pompe disease
US8957044B2 (en) 2013-03-01 2015-02-17 Wake Forest University Health Sciences Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM)
FR3004463A1 (fr) * 2013-04-11 2014-10-17 Genethon Systeme d'expression pour une therapie genique selective
EP3094646B1 (en) * 2014-01-13 2020-04-15 Valerion Therapeutics, LLC Internalizing moieties
CN106459186B (zh) * 2014-02-28 2021-02-02 美国卫生和人力服务部 针对hiv-1 v1v2 env区域的广谱中和性单克隆抗体
CA2989294A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of glycogen storage diseases and glycogen metabolism disorders
EP3186278A4 (en) 2014-08-27 2018-04-04 Valerion Therapeutics, LLC Internalizing moieties for treatment of cancer
US10383945B2 (en) 2015-02-18 2019-08-20 The United States of America as Represented by the Department of Verterans Affairs Methods for DNA-dependent targeting of a cell permeant antibody
AU2017286733B2 (en) 2016-06-15 2020-07-02 Yale University Antibody-mediated autocatalytic, targeted delivery of nanocarriers to tumors
EP3509614A4 (en) 2016-09-09 2020-04-22 Valerion Therapeutics, LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF LAFORA DISEASE
CN111032074A (zh) * 2017-07-03 2020-04-17 斯特拉斯堡大学 用于治疗肌病的用途的mtmr2-s多肽
CN115151275A (zh) * 2019-08-30 2022-10-04 耶鲁大学 用于向细胞递送核酸的组合物和方法
CA3212421A1 (en) * 2021-03-03 2022-09-09 Yale University Compositions and methods for treating skeletal muscle disease
GB202201713D0 (en) * 2022-02-10 2022-03-30 Univ Dundee An affinity directed phosphatase system for targeted protein dephosphorylation

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5622699A (en) 1995-09-11 1997-04-22 La Jolla Cancer Research Foundation Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
AU709503B2 (en) 1996-03-08 1999-09-02 Regents Of The University Of California, The Delivery system using mAb 3E10 and mutants and/or functional fragments thereof
US6329501B1 (en) 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6180084B1 (en) 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
JPH11151088A (ja) 1997-11-20 1999-06-08 Univ Tokyo 脱リン酸化反応を触媒する新規酵素
US6232287B1 (en) 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
US6174687B1 (en) 1999-02-26 2001-01-16 The Burnham Institute Methods of identifying lung homing molecules using membrane dipeptidase
US6303573B1 (en) 1999-06-07 2001-10-16 The Burnham Institute Heart homing peptides and methods of using same
US6551809B2 (en) 2001-03-20 2003-04-22 Applera Corporation Isolated human phosphatase proteins, nucleic acid molecules encoding human phophatase proteins, and uses thereof
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
KR20070026650A (ko) * 2004-05-27 2007-03-08 악셀레론 파마 인코포레이티드 케르베루스/코코 유도체 및 그의 용도
US20100143358A1 (en) 2007-01-22 2010-06-10 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Use of Antibody Conjugates
WO2008148063A1 (en) 2007-05-24 2008-12-04 The Regents Of The University Of California Intranuclear protein transduction through a nucleoside salvage pathway
CA2777486A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 4S3 Bioscience Inc. Methods and compositions for treatment of myotonic dystrophy
WO2010138769A1 (en) 2009-05-28 2010-12-02 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Amino acid sequences which enhance peptide conjugate solubility
BRPI1011236A2 (pt) 2009-06-15 2019-07-09 4S3 Bioscience Inc métodos e composições para tratamento de miopatia miotubular usando polipeptídeos quiméricos compreendendo polipeptídeos miotubularesih 1 (mtm1)
GB2476671B (en) 2010-01-04 2014-11-26 Plastic Logic Ltd Touch-sensing systems
JP5240316B2 (ja) 2010-10-26 2013-07-17 株式会社デンソー 車両乗員非操作運転システム
KR20140035357A (ko) 2011-04-05 2014-03-21 셰브런 오로나이트 컴퍼니 엘엘씨 저점도 선박 실린더 윤활유 조성물
WO2013177428A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Valerion Therapeutics, Inc. Methods for increasing muscle contractility

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